DE19514056A1 - Steuerbares Expressionssystem - Google Patents
Steuerbares ExpressionssystemInfo
- Publication number
- DE19514056A1 DE19514056A1 DE1995114056 DE19514056A DE19514056A1 DE 19514056 A1 DE19514056 A1 DE 19514056A1 DE 1995114056 DE1995114056 DE 1995114056 DE 19514056 A DE19514056 A DE 19514056A DE 19514056 A1 DE19514056 A1 DE 19514056A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- protein
- expression
- promoter
- gene
- acetate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/26—Klebsiella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein steuerbares Expressionssystem,
Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung.
Ein wichtiges Anwendungsgebiet der modernen Gentechnologie
ist die Produktion definierter Proteine unter Verwendung
rekombinanter Produktionssysteme. Solche rekombinanten Pro
duktionssysteme bestehen mindestens aus zwei Komponenten,
nämlich a) einem Wirt, der die zelluläre Maschinerie zur
Proteinproduktion zur Verfügung stellt, und b) einer rekom
binanten DNS, die für das zu produzierende Protein kodiert.
Bekannte Wirtssysteme sind z. B. Mikroorganismen, Tiere,
Pflanzen oder eukaryotische Zellkulturen. Zur Produktion
großer Mengen rekombinanter Proteine werden als Wirtssysteme
vorzugsweise Mikroorganismen wie Pilze oder Bakterien, be
sonders bevorzugt E. coli, verwendet.
Die rekombinante DNS, die die genetische Information zur
Produktion eines definierten Proteins enthält, kann in ein
Chromosom des Wirts integriert sein oder episomal, in Form
eines Plasmids, Cosmids oder Phagen, bzw. Virus vorliegen.
Neben der genetischen Information für das zu produzierende
Protein enthält die rekombinante DNS Regulationselemente,
sog. Promotoren, die für den ersten Schritt der Expression
von Strukturgenen, die Transkription der DNS-Sequenz in
RNS, nötig sind. Promotoren, definierte kurze DNS-Regio
nen, dienen dabei als Erkennungsstellen für RNS-Polymera
sen, Enzyme, die die Transkription von DNS-Sequenzen in
RNS katalysieren.
Promotoren sind häufig funktionell kombiniert mit DNS-
Regionen die als Erkennungs-, oder Bindestellen für eine
Gruppe von Proteinen dienen, die in Abhängigkeit von unter
schiedlichen Stimuli die Aktivität von Promotoren beeinflus
sen und daher als Regulatoren bezeichnet werden. Durch die
Bindung solcher Regulatoren an ihre Bindestellen können da
mit verbundene Promotoren aktiviert (Aktivatoren) oder
reprimiert (Repressoren) werden. In gentechnischen Systemen
zur Produktion rekombinanter Proteine werden solche Regula
tor/Promotor-Interaktionen verwendet, um die Produktion
von Zielproteinen zu steuern.
Beispiele für solche technisch verwendeten Systeme sind der
lac- und tac-Promotor, bei denen es sich um Promotoren han
delt, die durch Bindung des sog. lac-Repressorproteins inak
tiviert werden. Bei Zugabe von Laktose oder Laktoseanaloga
wie IPTG dissoziiert der Repressor von seiner Bindestelle
ab; es kommt zu einer Induktion der Expression von distal
zum Promotor gelegenen Genen.
Ein weiteres technisch verwendetes Regulationssystem besteht
aus der Kombination trp-Promotor und trp-Repressorprotein.
Nur in Anwesenheit von Tryptophan bindet der Repressor an
den Promotor und inaktiviert diesen.
Für eine technische Produktion von rekombinanten Proteinen
besitzen diese Systeme mehrere Nachteile. Die zur Induktion
oder Repression dieser Systeme verwendeten Substanzen sind
teuer und schwer handhabbar, besonders wenn es sich um meta
bolisierbare Substanzen wie Laktose oder Tryptophan handelt.
Das molare Verhältnis von Regulatorprotein und Promotor be
einflußt stark die Reprimierbarkeit des Expressionssystems.
Bei einem Überschuß des Promotors sind solche Systeme nicht
vollständig reprimierbar, da der Repressor austitriert wird.
Die vom lac-Repressor abhängigen Promotoren sind bei einem
molaren Überschuß des Repressors darüber hinaus nicht voll
ständig induzierbar.
In DE 39 26 076 A1 (entspricht CA-A-2015046) wird die Ver
wendung des pfl-Promotors zur Produktion rekombinanter Pro
teine beschrieben. Dieser E. coli-eigene Promotor wird in
Anwesenheit des Regulatorproteins FNR unter anaeroben Be
dingungen und durch Pyruvat induziert und durch Sauerstoff
reprimiert. Im Vergleich zum lac-, tac- oder trp-Promotor
besitzt der pfl-Promotor den Vorteil, daß er technisch ein
fach und billig zu induzieren ist. Die Regulation erfolgt
dadurch, daß zu Beginn der Fermentation die Aktivität des
Promotors durch die Zufuhr von Sauerstoff unterdrückt wird.
In der späten logarhitmischen Wachstumsphase tritt durch die
hohe Zellmasse automatisch eine Sauerstofflimitierung ein,
die fermentationstechnisch verstärkt oder reguliert werden
kann. Zusätzlich wird in dieser Wachstumsphase vom Wirtsor
ganismus Pyruvat gebildet, das die Expression verstärkt.
Gegebenenfalls kann extern weiteres Pyruvat zur Steigerung
der Induktion zugesetzt werden.
Trotz seiner Vorteile gegenüber den anderen Promotoren ist
dieser Promotor aus folgenden Gründen nur bedingt zur tech
nischen Produktion von rekombinanten Proteinen geeignet. Bei
Verwendung des pfl-Promotors ist es nicht möglich, die
Expression rekombinanter Proteine in Anwesenheit von Sauer
stoff zu induzieren. Es ist jedoch wünschenswert, die maxi
male Syntheseleistung des Wirts, die bei E. coli bei
aerobem Wachstum während der exponentiellen Wachstumsphase
vorliegt, zur Produktion von rekombinanten Proteinen zu
nutzen. Obwohl der pfl-Promotor unter aeroben Bedingungen
nicht induzierbar ist, besitzt er in Anwesenheit von Sauer
stoff eine Grundaktivität, d. h. der pfl-Promotor ist nicht
vollständig reprimierbar. Die minimale Restaktivität des
pfl-Promotors unter aeroben Bedingungen beträgt 5-10% der
Aktivität des Promotors unter optimalen Induktionsbe
dingungen (anaerob mit Pyruvat). Das Regulationssystem be
stehend aus FNR-Regulatorprotein und pfl-Promotor ist
damit ein System, das zwar technisch einfach und kostengün
stig zu steuern ist, das jedoch nicht vollständig reprimier
bar und nicht unter allen Wachstumsbedingungen induzierbar
ist. Wie alle anderen bekannten technisch verwendeten Promo
torsysteme ist damit auch der pfl-Promotor nur bedingt zur
Expression von Strukturgenen oder rekombinanten Genen geeig
net.
Von Blomquist et al. (J. Bact. (1993) Vol 175(5), S. 1392-
1404) wurde die DNS-Sequenz des 2,3-Butandiol Operons
(bud-Operon) aus Klebsiella terrigena beschrieben. Es ist
bekannt, daß in Klebsiella terrigena die Bildung von 2,3-
Butandiol durch einen niedrigen pH-Wert, die Gegenwart von
Acetat und bei Sauerstofflimitierung induziert wird. Blom
quist et al. zeigten, daß die Gene, die für die zur 2,3-
Butandiolbildung benötigten Proteine kodieren, ein Operon
bilden, dessen Transkription durch eine Sauerstofflimitie
rung induziert wird. Die Literaturstelle enthält keine Anga
be über eine Induktion des Promotors in Gegenwart von Sauer
stoff.
Aufgabe der Erfindung war es, ein Expressionssystem zur Ver
fügung zu stellen, das eine technisch einfach zu steuernde
Expression unter allen Wachstumsbedingungen des Wirtsorga
nismus erlaubt.
Gegenstand der Erfindung ist ein durch Acetat, pH-Wert und
Sauerstoff steuerbares Expressionssystem, umfassend ein in
trans wirkendes Regulatorprotein und einen von diesem Pro
tein aktivierbaren Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß das
Regulatorprotein eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens
75% homolog zu der Aminosäuresequenz Seq. ID-No:1 ist,
umfaßt und der Promotor, eine DNS-Sequenz umfaßt, die zu
mindestens 95% homolog zu den Basen 315 bis 397 der DNS-
Sequenz Seq. ID-No:2 ist.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem exprimiert beliebige
Strukturgene unter Kontrolle des Expressionssystems bei
einem Sauerstoffpartialdruck pO₂ von 0-5%, einem pH-Wert von
6,0-6,5 und in Gegenwart von Acetat in einer Konzentration
von 40-60 mM maximal.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem ermöglicht erstmals
eine technisch auch im großen Maßstab einfach durchführbare,
billige Regulation der Expression rekombinanter Genprodukte
unabhängig von der Wachstumsphase der Produzentenstämme und
dem O₂-Gehalt des Anzuchtmediums.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Regula
torprotein, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es bei
Sauerstofflimitierung und Anwesenheit von Acetat und einem
pH-Wert des Anzuchtmediums von pH 6,0 bis pH 6,5 eine opti
male Aktivierung des bud-Promotors aus Klebsiella terri
gena (DSM2687) bewirkt.
Unter Sauerstofflimitierung im oben verwendeten Sinn ist ein
Partialdruck pO₂ von 0-5% zu verstehen. Die Acetat-Konzen
tration beträgt bei diesen Bedingungen vorzugsweise 40-60
mM.
Vorzugsweise umfaßt das erfindungsgemäße Regulatorprotein
eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 75% homolog zu
der Aminosäuresequenz Seq ID-No: 1 ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die
Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Regulatorproteins
die Aminosäuresequenz Seq ID-No: 1. Ein solches Regulator
protein wird im Folgenden auch als BudR bezeichnet.
Der Promotor des Expressionssystems kann eine beliebige
DNS-Region umfassen, die unter BudR aktivierenden Bedingungen
zu einer BudR-abhängigen Initiation der Transkription der
unmittelbar ′downstream′ zu dieser Region gelegenen Gene
führt. Zu den physiologischen Bedingungen, bei denen BudR
maximal aktiviert wird, gehören ein Sauerstoffpartialdruck
pO₂ von 0-5%, die Gegenwart von Acetat in einer Konzentra
tion von 40-60 mM und ein pH-Wert von 6,0-6,5.
Vorzugsweise umfaßt der Promotor eine DNS-Sequenz, die zu
mindestens 95% homolog zu den Basen 315 bis 456 in der
DNS-Sequenz ID-No: 2 ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der
Promotor die DNS-Sequenz ID-No: 2 im Bereich der Basen 315
bis 397. Eine solche DNS-Region wird im Folgenden auch als
bud-Promotor bezeichnet.
Das Gen für das erfindungsgemäße Regulatorprotein kann ent
weder vollständig chemisch oder enzymatisch in vitro anhand
der in Seq. ID-No: 1 offenbarten Sequenz synthetisiert
werden oder es kann aus einem 2,3-Butandiol-bildenden
Mikroorganismus isoliert werden.
Das erfindungsgemäße Regulatorprotein erhält man vorzugs
weise durch Expression eines derartig erhältlichen Gens. Die
Erfindung betrifft daher ebenfalls Gene die für erfindungs
gemäße Regulatorproteine kodieren.
Die Klonierung eines Gens, das für ein erfindungsgemäßes
Regulatorprotein kodiert, erfolgt vorzugsweise unter Verwen
dung eines sogenannten Reporterstamms. Die Konstruktion von
Reporterstämmen für Transkriptions-Aktivatoren ist dem Fach
mann vertraut. Ein solcher Stamm enthält ein Gen für ein
vorzugsweise einfach nachzuweisendes Protein unter der
transkriptionellen Kontrolle des bud-Promotors. Ein Bei
spiel für einen Reporterstamm ist E.coli BL 142 (vergl. Bei
spiele 5 und 7).
Als Reportergen wird vorzugsweise das dem Fachmann bekannte
Gen für eine β-Galaktosidase auf Plasmid pRS552 (Simons et
al. (1987), Gene, Vol 53, p. 85-96 ) verwendet.
Zur Klonierung eines Gens, das für ein erfindungsgemäßes
Regulatorprotein kodiert, wird in einen solchen Reporter
stamm eine Genbank aus einem Mikroorganismus, der ein erfin
dungsgemäßes Regulatorprotein bildet, eingebracht. Die Kon
struktion einer Genbank und deren Isolierung ist dem Fach
mann ebenfalls vertraut.
Das Verfahren der Klonierung mittels Reporterstamm ist dem
Fachmann auch bekannt. Es kann beispielsweise auf die in
Casadaban & Cohen (1979) Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.76,
No.9, pp.4530-4533 beschriebene Weise erfolgen.
Zur Detektion von Klonen, die das gesuchte Protein bilden,
werden aus der Genbank solche Klone isoliert, bei denen das
Reportergen bei pH 6,5 und in Gegenwart von Acetat induziert
wird. Im Falle einer Verwendung von β-Galaktosidase als
Reportergen enthalten die Indikatorplatten beispielsweise
den Farbstoff X-Gal. Solche Klone, die im Falle einer Ver
wendung von β-Galaktosidase als Reportergen auf X-Gal-hal
tigen Indikatorplatten tief dunkelblau werden, enthalten ein
Gen für ein erfindungsgemäßes Regulatorprotein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das
Gen für das Regulatorprotein aus einer Genbank von Mikro
organismen der Gattungen Enterobacter oder Klebsiella, vor
zugsweise aus Klebsiella terrigena (käuflich erhältlich bei
der DSM-Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkul
turen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig unter
der Bezeichnung DSM2687), isoliert. Klebsiella terrigena ist
bei der Internationalen Hinterlegungsstelle unter der ge
nannten Anschrift unter der Eingangsnummer DSM 9883 gemäß
Budapester Vertrag hinterlegt.
Grundsätzlich kann das Gen für das Regulatorprotein aus
einem Mikroorganismus, beispielsweise aus einem 2,3-Butan
diol bildenden Mikroorganismus, inbesondere aus einem 2,3-
Butandiol bildenden Mikroorganismus aus der Familie der
Enterobacteriaceae isoliert werden.
Verfahren zur Herstellung eines für das Expressionssystem
geeigneten Promotors sind dem Fachmann geläufig und werden
daher nicht im Detail erläutert. Ein solches Verfahren zur
Herstellung eines DNS-Fragments, welches die Promotorakti
vität gemäß der Erfindung vermittelt, ist die chemische oder
enzymatische "de novo" Synthese unter Verwendung der in
Seq.ID.No.#2 angegebenen Sequenz information.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung des Promotors umfaßt
die Modifikation eines beliebigen DNS-Fragments mittels
dem Fachmann bekannter Mutagenesemethoden unter Verwendung
der in Seq.ID.No.#2 angegebenen Sequenzinformation.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung des Promotors umfaßt
die Isolation des Promotors aus einer Genbank eines 2,3-
Butandiol bildenden Mikroorganismus. 2,3-Butandiol bildende
Mikroorganismen sind allgemein bekannt und der Öffentlich
keit zugänglich. Beispiele sind Vertreter der Gattungen Ent
erobacter, Serratia, Erwinia und Klebsiella. Bei diesem
Verfahren wird zumindest die upstream-regulatorische
Region des bud-Operons, ein 5′ vor dem Strukturgen gelege
ner DNS-Bereich, der eine die Expression des Strukturgens
regulierende Funktion besitzt, aus einem solchen Organismus
in an sich bekannter Weise isoliert. Die mitisolierten Tei
le, die keine regulatorische Funktion besitzen, werden gege
benenfalls nach bekannten Methoden entfernt (vgl. Beispiel
14).
Vorzugsweise wird ein den Promotor enthaltendes DNS-Frag
ment aus einer Genbank eines Bakteriums der Gattung Entero
bacter oder Klebsiella, besonders bevorzugt aus einer Gen
bank von Klebsiella terrigena (DSM2687) isoliert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Expressions
kassette, die dadurch gekennzeichnet ist, daß ein für das
Expressionssystem geeigneter Promotor funktionell mit dem
Strukturgen eines zu exprimierenden, rekombinanten Proteins
verknüpft ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Expressionskassette
liegt zwischen Promotorregion und zu exprimierendem Struk
turgen ein transkribierter, aber untranslatierter Bereich,
der eine Ribosomenbindestelle enthält.
Eine erfindungsgemäße Expressionskassette läßt sich bei
spielsweise dadurch herstellen, daß der Promotor in einer
dem Fachmann bekannten Art und Weise vor das 5′-Ende eines
zu exprimierenden Strukturgens kloniert wird.
Die Erfindung betrifft ferner Mikroorganismen, welche eine
erfindungsgemäße Expressionskassette enthalten.
Die Expressionskassette kann dabei in das Genom des Mikroor
ganismus integriert sein, sie kann aber auch episomal auf
mindestens einem Vektor vorliegen. Vorzugsweise liegt die
Expressionskassette episomal auf mindestens einem Vektor
vor.
In der erstgenannten Ausführungsform wird die erfindungsge
mäße Expressionskassette mit bekannten Methoden in das Genom
des Wirtsorganismus integriert.
In der als Zweites genannten, bevorzugten Ausführungsform
liegt die Expressionskassette im Wirtsorganismus episomal
auf einem Vektor, dem sogenannten Expressionsvektor vor.
Die Integration der erfindungsgemäßen Expressionskasette in
einen Vektor erfolgt nach den üblichen, dem Fachmann bekann
ten Methoden. Geeignete Vektormoleküle sind dem Fachmann be
kannt. Ein Beispiel für einen solchen Vektor ist der dem
Fachmann bekannte Vektor pJF118 (Fürste et al. (1986), Gene
Vol 48, 119-131) und Derivate davon.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung
eines erfindungsgemäßen Expressionssystems, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß in einen beliebigen Mikroorganismus
ggf. mindestens ein Gen für ein erfindungsgemäßes Regulator
protein und/oder ggf. mindestens eine erfindungsgemäße Ex
pressionskassette eingebracht werden, so daß in dem jewei
ligen Mikroorganismus anschließend mindestens ein Gen für
ein erfindungsgemäßes Regulatorprotein und eine erfindungs
gemäße Expressionskassette vorhanden sind.
Die Erfindung betrifft daher auch Mikroorganismen, die ein
erfindungsgemäßes Expressionssystem enthalten.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem läßt sich beispiels
weise dadurch herstellen, daß in einen beliebigen Mikroorga
nismus, der mindestens ein Gen für ein erfindungsgemäßes
Regulatorprotein enthält, eine erfindungsgemäße Expressions
kassette eingebracht wird.
Vorzugsweise werden bei diesem Verfahren zur Herstellung des
erfindungsgemäßen Expressionssystems solche Mikroorganis
men verwendet, welche natürlicherweise ein Gen für ein er
findungsgemäßes Regulatorprotein enthalten.
Besonders bevorzugt werden bei diesem Verfahren Mikroorga
nismen der Gattungen Enterobacter oder Klebsiella, die ein
Gen für ein erfindungsgemäßes Regulatorprotein enthalten.
Besonders bevorzugt wird in diesem Verfahren Klebsiella ter
rigena (DSM2687) verwendet.
Ferner werden bei diesem Verfahren besonders bevorzugt
solche Mikroorganismen als Wirtsstämme für eine erfindungs
gemäße Expressionskassette verwendet, denen ein Gen für ein
erfindungsgemäßes Regulatorprotein in dem Fachmann bekannter
Weise zugeführt worden ist. Das zugeführte Gen, das für das
Regulatorprotein kodiert, kann dabei episomal vorliegen,
oder in das Chromosom des Wirts integriert sein.
Liegt das zugeführte Gen, das für das Regulatorprotein
kodiert, episomal vor, wird es vorzugsweise auf dem gleichen
Vektormolekül lokalisiert sein, das auch die Expressionskas
sette trägt. Daneben ist aber auch eine Anordnung bevorzugt,
bei der das zugeführte Gen für ein erfindungsgemäßes Regula
torprotein und die erfindungsgemäße Expressionskassette auf
zwei verschiedenen, aber komplementären Vektormolekülen, wie
sie dem Fachmann bekannt sind, gleichzeitig in einer Zelle
des Wirtsorganismus vorliegen.
In einer allgemeinen Ausführungsform werden für die Kon
struktion von Expressionssystemen, bei denen dem Wirtsstamm
ein Gen, das für das Regulatorprotein kodiert, zusätzlich
zugeführt worden ist, als Wirtsstämme gram-positive oder
gram-negative Bakterien verwendet.
Bevorzugt werden als Wirtsstämme für ein solches Expres
sionssystem Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, beson
ders bevorzugt solche der Gattungen Escherichia und Salmo
nella, verwendet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von
Escherichia coli als Wirtsstamm für ein solches Expressions
system.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von
Fnr-negativen Mikroorganismen als Wirtsstamm für ein er
findungsgemäßes Expressionssystem. Bevorzugterweise werden
natürlicherweise Fnr-negative Mikroorganismen verwendet.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von solchen Mikroor
ganismen als Wirtsstämme für ein erfindungsgemäßes Expres
sionssystem, bei denen das fnr-Gen durch dem Fachmann be
kannte Methoden, inaktiviert worden ist. Ein Beispiel für
einen solchen besonders bevorzugten Mikroorganismus ist E.
coli RM101 (Sawers und Suppmann, (1992), J. Bacteriol. Vol
174, S. 3473-3478) und alle davon abgeleiteten Derivate.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Fermentationsver
fahren zur Produktion von Proteinen mittels Mikroorganismen,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß Mikroorganismen, die
das erfindungsgemäße Expressionssystem enthalten, verwendet
werden.
Soll bei einer erfindungsgemäßen Fermentation ein maximaler
Induktionseffekt erreicht werden, wird ein ein erfindungsge
mäßes Expressionssystem enthaltender Mikroorganismus bei
pH-Werten < pH 7,0 unter aeroben Bedingungen ohne externe Zu
gabe von Acetat angezogen. Zu beliebigen Zeitpunkten ist es
dann möglich, die Expression eines Gens für ein rekombinan
tes Protein welches Teil der erfindungsgemäßen Expressionskas
sette ist, maximal zu induzieren, indem der Sauerstoffpar
tialdruck pO₂ auf Werte von 0 bis 5% begrenzt, der pH-Wert
des Mediums auf pH 6,0 bis 6,5 reguliert und Acetat auf eine
Endkonzentration von 40 mM bis 60mM zugegeben wird.
Durch geeignete Kombinationen verschiedenener Stellwerte
dieser drei Stimuli ist es darüberhinaus einfach möglich,
die Expression des Fusiongens in Zwischenstufen von sehr
schwach bis sehr stark abgestuft zu induzieren. Die Möglich
keit zu einer genau abgestuften Induktion ist in der Regel
sehr wünschenswert, denn dadurch ist es beispielsweise mög
lich den Expressionslevel so einzustellen, daß gerade die
Menge des Zielproteins gebildet wird, bei der das Protein
noch nicht als sog. Einschlußkörperchen ausfällt.
Eine Induktionsbedingung, die zu einer sehr schwachen Induk
tion führt, ist beispielsweise die Kombination pH-Wert < pH
6,5, externe Zugabe von Acetat (auf 40 mM) und die Gegenwart
von Sauerstoff mit einem Partialdruck pO₂ von mehr als 10%.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Expressionssystems ist es,
daß es auch in Gegenwart von Sauerstoff (pO₂ < 5%) durch
eine Reduktion des pH-Wertes des Anzuchtmediums auf pH 6,0
und die Zugabe von Acetat (40 bis 60 mM) eine starke Induk
tion der Expression entsprechender Fusionsgene ermöglicht.
Die folgenden Beispiele erläutern zusammen mit den
Zeichnungen die Erfindung weiter. In den Zeichnungen stellt
dar:
Fig. 1 Plasmidkarte von pBU1
Fig. 2 Plasmidkarte von pBTL142
Fig. 3 Nukleotidsequenz (Seq ID-No: 3) und
Aminosäuresequenz (Seq ID-No: 4) der budA′-lacZ′-
Übergangsstelle auf pBTL142 und pRBL2
Fig. 4 Plasmidkarte von pBAK1
Fig. 5 Plasmidkarte von pBAK14
Fig. 6 Plasmidkarte von pBAK16
Fig. 7A Größe und relative Orientierung der Gene des bud-
Regulons im Genom von Klebsiella terrigena (DSM2687)
Fig. 7B Auf pBAK14 und pBAK16 enthaltenes DNS-Fragment
Fig. 7C Die Lage der zur PCR-Amplifikation von
Klebsiella-DNS verwendeten Oligonukleotide (vgl. Beispiele
1 und 10)
Fig. 8 Plasmidkarte von pRBL2
Fig. 9 Konstruktion von pBUD100 (vgl. Beispiel 17)
Fig. 10 Nukleotidseguenz am Übergangsbereich bud-DNS-
CGTase-Strukturgen vor (pBUD100; Seq ID-No: 5) und nach
(pBUD200; Seq ID-No: 6) gerichteter Mutagenese.
Allgemeines zur Konstruktion der in den Beispielen
verwendeten Plasmide und den Expressionsstudien:
- 1. Alle anaeroben Anzuchten wurden nach Balch und Wolfe (1976), Appl. Environ. Microbiol. Vol. 32, p. 781-791 in Serumflaschen durchgeführt. Aerobe Anzuchten erfolgten in Erlenmeyerkolben unter starkem Schütteln (die Kolben wurden max. mit 1/10 des angegebenen Volumens gefüllt). Die Kulturen wurden bei 37°C inkubiert.
- 2. Medium für aerobe Anzuchten: TGYEP (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,4% Glukose, 100 mM K-Phosphat, pH-Werte mit 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer auf 6,0 bis 8,0 eingestellt); Medium für aerobe Anzuchten: TGYEP (pH wie oben beschrieben eingestellt); Zusatz des Induktors Na-Acetat auf 40 mM aus einer 1 M Stammlösung.
- Zur Arbeit mit k-Phagen wurden die Medien nach Kleckner et al. ((1978), Genetics Vol 90, p. 427-450) eingesetzt.
- 3. Antibiotika wurden in folgenden Konzentrationen zugege ben: Ampicillin, 100 µg/ml; Chloramphenicol, 30 µg/ml; Kana mycin, 50 µg/ml; Tetracyclin, 20 µg/ml bzw. 15 µg/ml für chromosomal kodierte Resistenzen:
- 4. Präparation von chromosomaler DNS erfolgte nach der Methode von Ausubel et al. ((1987), Current protocols in molecular biology, Vol 1, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York), Präparation von Plasmid-DNA nach der Methode von Holmes and Quigley ((1981), Anal. Bio chem Vol 114, S. 193-197).
- 5. Transformation der verwendeten Stämme mit Plasmid-DNA erfolgte, falls nicht anders angegeben, nach Standardproze duren (Maniatis et al. (1982), Molecular cloning, A Labora tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., S. 249-255).
- 6. Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität erfolgte nach Miller (1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,S. 352-355. Die Enzymaktivitäten sind in Miller units angegeben.
- 7. Die Erzeugung einer lac⁻-Mutante von Klebsiella terrigena DSM2687 erfolgte durch ungerichtete UV-Mutagenese nach Miller (1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. S. 121- 124. Die Bestrahlung erfolgte 80 Sekunden mit einer Intensi tät von 318 µW/cm2. Die Stabilität der Mutation wurde durch Inkubation mit Nitrosoguanidin (Miller (1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., S. 125-129) auf Reversionen getestet. Nach Kontrolle der für Klebsiella typischen Stoffwechsel reaktionen wurde für die weiteren Untersuchungen der Stamm KT14 ausgewählt.
- 8. Die Integration der budA-lacZ-Fusionen in das Chromosom von E. coli erfolgte gemäß der Methode von Simons et al. (1987), Gene Vol 53, S. 85-96. Ausgehend vom Stamm E. coli MC4100 (F-, araD139, D(argF-lac)U169, ptsF25, deoC1, relA1, flbB5301, rpsL150, l-) (Casadaban und Cohen (1979), Proc Nat Acad Sci USA, Vol 76, S. 4530-4533) wurden folgende Transduktanden erhalten: BL142, und BL1. Ausgehend vom Stamm E. coli RM101 (fnr-) (Sawers und Suppmann (1992) J. of Bacteriology 174, 11 pp. 3474-3478) wurde durch Transduk tion der Stamm BL12 erhalten.
- 9. Enzymatische in vitro-Reaktionen an DNS wurden, falls nicht anders angegeben, nach Maniatis et al. (1982), Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. S. 98-148 durchge führt.
- 1. pUC19 (Yanisch-Perron et al. (1985), Gene Vol 33, S.103-119),
- 2. pBR322 (Bolivar et al. (1977), Gene Vol 2, S. 95-113),
- 3. pRS552 (Simons et al. (1987), Gene Vol 53, S. 85-96),
- 4. pJF118HE (Fürste et al. (1986), Gene Vol 48, S. 119-131),
- 5. pCM100 (Binder et al. (1986), Gene Vol 47, S.
269-277),
Phagen:
kRS45 (Simons et al. (1987), Gene Vol 53, S. 85-96). - 10. Synthetische Oligonukleotide wurden von der Firma Toplab (Martinsried, Germany) bezogen. Die Nukleotidsequenzen der in den Beispielen verwendeten Oligonukleotide sind in Tab. 1 zusammengefaßt:
- 11. Enzyme zur Restriktion, Modifikation und Sequenzanalyse von DNA wurden von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim) Pharmacia (Freiburg), New England Biolabs (Schwalbach) und Perkin Elmer Cetus (Langen) bezogen.
Radioaktive Substanzen stammten von Amersham Buchler (Braun
schweig) oder NEN Du Pont (Dreieich).
Feinchemikalien waren von den Firmen Merck (Darmstadt),
Sigma (München), Serva (Heidelberg), Fluka (Neu-Ulm) und
Biomol (München).
Mit Hilfe der Oligonukleotide Oligo1 und Oligo2 (Tabelle
1), deren Nukleotidsequenz aus der von Blomquist et al. (J.
Bact. (1993) Vol 175(5), S. 1392-1404) veröffentlichten
Sequenz des bud-Operons aus Klebsiella terrigena abgelei
tet wurde, wurde ein 223 bp großes Fragment aus chromosoma
ler DNA aus Klebsiella terrigena (DSM2687) durch symmetri
sche PCR amplifiziert (Annealing: 30 s bei 58°C; Kettenver
längerung: 60 s bei 72°C; Strangtrennung: 30 s bei 94°C;
25 Zyklen). Das erhaltene Fragment erstreckt sich über die
Positionen 247 bis 456 der Nukleotidsequenz Seq ID-No:2 und
enthält die Sequenzinformation für die 10 N-terminalen
Aminosäurereste von BudA (vgl. Fig. 7A), sowie 178 strom
aufwärts vom budA-Startcodon gelegene Nukleotide, welche
den funktionell aktiven Promotor des bud-Operons enthal
ten.
Unter Verwendung der durch die PCR-Startnukleotide Oligo 1
und Oligo 2 eingeführten BamHI-Restriktionserkennungsstel
len wurde nach Spaltung des PCR-Produkts mit BamHI ein 219
bp großes DNS-Fragment isoliert und in den mit BamHI ge
schnittenen Vektor pUC19 kloniert. Die korrekte Nukleotid
sequenz, sowie die Orientierung des Inserts wurde durch dop
pelsträngige Sequenzanalyse (Sanger et al. (1977)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(12), pp.5463-5467) überprüft.
Das hieraus resultierende Konstrukt wurde pBU1 (Fig. 1) ge
nannt.
Zur Kombination des bud-Promotors auf pBU1 mit dem lacZ-
Gen als Reportergen für eine Promotoraktivität wurde das
BamHI-Fragment aus pBU1 in die BamHI-Schnittstelle des
Promotortest-Vektors pRS552 umkloniert. Das erhaltene
Konstrukt, Plasmid pBTL142 (Fig. 2), kodiert für ein
Fusionsprotein, bestehend aus den 10 N-terminalen Aminosäu
re-Resten von BudA und daran über einen Linker aus 2 Amino
säureresten anschließend LacZ ab dem 9. Aminosäurerest (Fig.
3, Seq ID-No: 3 und 4), dessen Transkription nur von den in
den 158 bp vor budA enthaltenen Regulationselementen gesteu
ert werden kann.
Zur funktionellen Untersuchung des bud-Promotors auf pBTL142
in Klebsiella terrigena (homologes System) wurde Klebsiella
terrigena KT14 (lacZ-) durch Elektroporation (Fiedler und
Wirth (1988) Analytical Biochemistry 170, pp.38-44) mit
pBTL142 transformiert. Für Expressionsstudien wurde ein da
bei erhaltener Transformand (Klebsiella terrigena
KT14/pBTL142) unter den in Tab. 2 dargestellten Bedingungen
angezogen. Die dabei gebildeten β-Galaktosidase-Aktivitä
ten (Tab. 2), welche nach Miller aus Zell-Lysaten bestimmt
wurden, sind ein direktes Maß für die Aktivität des bud-
Promotors unter den jeweiligen Bedingungen.
Fermentertyp: Biostat ED (B. Braun Biotech, Melsungen,
Deutschland).
Füllvolumen: 7 l
Medium: KH₂PO₄: 1,5 g/l; (NH₄)₂SO₄: 5,0 g/l; NaCl: 0,5 g/l; FeSO₄ × 2H₂O: 0,075 g/l; Na₃Citrat × 2H₂O: 1,0 g/l; Trypton (Oxoid): 5 g/l; Hefeextrakt (Oxoid): 2,5 g/l; Glukose: 12 g/l; Kanamycin: 50 mg/l pH des Mediums: Konstant 6,0 (Korrektur mit 6N NH₄OH, bzw. 4N H₃PO₄)
Temperatur: 30°C.
Medium: KH₂PO₄: 1,5 g/l; (NH₄)₂SO₄: 5,0 g/l; NaCl: 0,5 g/l; FeSO₄ × 2H₂O: 0,075 g/l; Na₃Citrat × 2H₂O: 1,0 g/l; Trypton (Oxoid): 5 g/l; Hefeextrakt (Oxoid): 2,5 g/l; Glukose: 12 g/l; Kanamycin: 50 mg/l pH des Mediums: Konstant 6,0 (Korrektur mit 6N NH₄OH, bzw. 4N H₃PO₄)
Temperatur: 30°C.
Belüftung: Die Anzuchten wurden über den gesamten Fermenta
tionsverlauf konstant mit 4 l Luft pro Minute belüftet. Bis
zum Erreichen einer optischen Dichte von OD₆₀₀ = 20 wurde
ein konstanter Sauerstoff-Partialdruck von pO₂ = 40% durch
Rühren mit Geschwindigkeiten zwischen 450 bis 900 rpm einge
halten. Bei Erreichen von OD600 = 20 wurde innerhalb einer
Stunde der pO₂ durch Reduktion der Rührgeschwindigkeit auf
pO₂ = 0% eingestellt und für 48 h gehalten.
Induktion: Bei Erreichen von pO₂ = 0% wurde den zu induzie
renden Fermentern Acetat zu einer Endkonzentration von 40 mM
zugesetzt.
Die β-Galaktosidase-Aktivitäten wurden 24h und 48h nach
Induktion ermittelt.
Nach Transformation von E. coli FM420 mit pBTL142 wurden bei
anschließenden Expressionsstudien die in Tabelle 4 darge
stellten Werte ermittelt.
Im heterologen System ist keine signifikante Induktion des
bud-promotors erkennbar. E. coli besitzt nicht die zur
vollen Expression und Regulation erforderlichen Transkrip
tionsfaktoren, d. h. die auf pBTL142 vorhandenen, cis-
wirksamen Faktoren sind alleine nicht ausreichend, um das in
Klebsiella terrigena (Bsp. 2) beobachtete Expressionsverhal
ten in E. coli zu vermitteln.
Die Integration der budA′-′lacZ-Fusion in das Chromosom
erfolgte gemäß der Methode von Simons et al. ((1987), Gene
Vol 53, S. 85-96). Durch Transformation von pBTL142 in E.
coli MC4100 und anschließender Infektion mit kRS45 wurde die
Translationsfusion in das Chromosom von E. coli MC4100 inte
griert. Erfolgreiche Integration wurde anhand der transdu
zierten Kanamycin-Resistenz überprüft. Nach UV-Bestrahlung
erhaltene Lysate von kBTL142 (gereinigte Phagenlinie) wurden
zur erneuten Transduktion von E. coli MC4100 benutzt und der
so konstruierte Stamm als E. coli BL142 bezeichnet.
Alle Anzuchten wurden bei pH 6,5 durchgeführt.
Unter den angegebenen Wachstumsbedingungen ist eine geringe
Grundexpression, aber keine signifikante Induktion durch
Anaerobiose und Acetat-Zugabe zu erkennen.
Chromosomale DNA aus Klebsiella terrigena DSM 2687 wurde
isoliert und mit Sau3A partiell verdaut (0,02 units/µg DNA,
20 min bei 37°C). Fragmente zwischen 3 und 10 kb wurden
nach elektrophoretischer Auftrennung isoliert und in den mit
BamHI linearisierten Vektor pBR322 ligiert. Der nach Trans
formation von E. coli JM109 und anschließender Präparation
erhaltene Plasmid-Pool wurde als Genbank von Klebsiella ter
rigena benutzt.
Zur Identifikation von Plasmiden, die für einen den bud-
Promotor in Gegenwart von Acetat aktivierenden, in trans
wirksamen Faktor kodieren wurde E. coli BL142 mittels
Elektroporation mit der Genbank aus Klebsiella terrigena
transformiert (Fiedler und Wirth (1988) Analytical Bio
chemistry 170, pp. 38-44). Die Transformationsansätze
wurden auf sogenannte Indikatorplatten ( Kaliumphosphat
gepufferter TGYEP-Agar (pH 6,5) mit 0,4% Glukose, 40 mM
Acetat, 1 mM X-Gal und Ampicillin (100 µg/ml)) ausgebracht
und bei 37°C inkubiert. E. coli BL142 bildet auf diesen
Indikatorplatten aufgrund seiner sehr schwachen β-Galakto
sidase-Aktivität (Tab. 5) hellblaue Kolonien. Ein Klon
bildete dagegen nach der Transformation eine tiefdunkelblaue
Kolonie. Er enthielt das Plasmid pBAK1 (Abb. 4), welches ein
ca. 1,8 kb großes Sau3A-Fragment aus Klebsiella terrigena
trägt. Für die weiteren Analysen wurde ein 1,8 kB großes
HindIII-Fragment aus pBAK1 (vgl. Abb. 4), welches ein 350
bp großes Fragment des Vektors pBR322 und ein 1,45 kb großes
Fragment aus Klebsiella terrigena enthält, isoliert; die
überhängenden Enden des Fragments wurden mit Klenow-
Polymerase aufgefüllt. Anschließend wurde das Fragment in
beiden Orientierungen in das mit 5mal linearisierte Plasmid
pUC19 ligiert. Die daraus entstandenen Plasmide, die auf
Indikatorplatten ebenfalls eine Blaufärbung von Kolonien von
E. coli BL142 vermitteln, wurden als pBAK14 und pBAK16 (Abb.
5 und 6) bezeichnet.
Zur Sequenzanalyse des Inserts auf pBAK14 und pBAK16 nach
Sanger et al. ((1977), Proc Natl Acad Sci USA Vol 74, S.
5463-5467) wurden die Inserts jeweils mittels Exonuklease
III verkürzt. Als Vektorschutz diente die Restriktion mit
SacI, Exonuklease-Angriff erfolgte an einer Asp718-Schnitt
stelle der multiplen Klonierungs-site in pUC19 (Henikoff
(1984), Gene Vol 28, S. 351-359). Die Sequenzreaktionen
mit T7-DNA-Polymerase (Pharmacia, Freiburg) wurden parallel
mit dGTP und dITP durchgeführt, um starke Kompressionen zu
vermeiden. Ein für pUC-Vektoren spezifisches, käuflich er
hältliches Universal-Sequenzierstartoligonukleotid wurde
verwendet. Für das DNS-Insert aus Klebsiella terrigena auf
pBAK14 und pBAK16 wurde die folgende Nukleotidsequenz (Seq
ID-No: 2) ermittelt:
Aus der ermittelten Nukleotidsequenz (Seq ID-No: 2) konnte
ein offener Leserahmen (Nukleotid 385 bis 1254) abgeleitet
werden, der für ein Protein (Seq ID-No: 1), bestehend aus
290 Aminosäuren, kodiert. Die aus diesem offenen Leserahmen
abgeleitete Aminosäuresequenz lautete wie folgt:
Aufgrund seiner die Aktivität des bud-Promotors regulie
renden Aktivität wurde dieses Protein als BudR (Bud-Regula
tor) bezeichnet. Die Transkriptionsrichtung von budR ist
gegenläufig zu der des bud-Operons, allerdings befindet
sich zwischen bud-Operon und budR nur eine intergene
Region von lediglich 106 bp (Nukleotid 279 bis 384 in Seq
ID-No: 2). bud-Operon und budR bilden damit ein divergent
orientiertes Regulon für die Synthese der an der Bildung von
2,3-Butandiol beteiligten Enzyme (Fig. 7).
Die Induzierbarkeit der chromosomal codierten budA′-′lacZ-
Fusion durch Plasmide der Genbank, die einen lac+ Phänotyp
(Blaufärbung) hervorrufen, soll an folgendem Beispiel demon
striert werden. Alle Anzuchten erfolgten bei pH 6,5.
Mit Hilfe der Oligonukleotide Oligo1 und Oligo3 (Tab. 1)
wurde über symmetrische PCR aus pBAK16 (pUC19-Derivat) ein
1027 bp großes Fragment amplifiziert (Abb. 7). Unter Verwen
dung der durch die PCR-Startnukleotide Oligo1 und Oligo3
eingeführten BamHI-Restriktionserkennungsstellen wurde
nach Spaltung des PCR-Produkts mit BamHI ein 1023 bp
großes DNS-Fragment isoliert und in den mit BamHI ge
schnittenen Vektor pRS552 kloniert. Die korrekte Orientie
rung des Inserts wurde durch Sequenzanalyse Sanger et al.
((1977), Proc Natl Acad Sci USA Vol 74, p. 5463-5467)
überprüft. Das hieraus resultierende Konstrukt wurde pRBL2
(Fig. 8) genannt.
Plasmid pRBL2 enthält das vollständige Gen für BudR, die
komplette intergene Region zwischen budR und budA sowie das
Gen, kodierend für ein Fusionsprotein, bestehend aus den 10
N-terminalen AS-Resten von BudA und daran über einen
Linker aus 2 Aminosäureresten anschließend LacZ ab dem 9.
Aminosäurerest, das auch auf pBTL142 enthalten ist (Fig.
3)
Die Integration der budA′-′lacZ Fusion mit der zusätzlichen
Sequenz von budR auf Plasmid pRBL2 in das Chromosom von E.
coli MC4100 erfolgte gemäß der Methode von Simons et al.
(1987), Gene Vol 53, p. 85-96. Durch Transformation von
pRBL2 in E. coli MC4100 und anschließender Infektion mit
kRS45 von E. coli MC4100/pRBL2 wurden die Fusion in das
Chromosom von E. coli MC4100 integriert. Erfolgreiche Inte
gration wurde anhand der transduzierten Kanamycin-Resistenz
überprüft. Die nach UV-Bestrahlung erhaltenen Lysate von
RBL2 (gereinigte Phagenlinien) wurden zur erneuten Transduk
tion von E. coli MC4100 benutzt und der so konstruierte
Stamm E. coli BL2 genannt.
Die durch die einfache Kopie von budR auf die Expression des
budA′-lacZ′-Fusionsgens im Chromosom von E. coli erzielte
Regulation ist in Tabelle 7 dargestellt. Alle Anzuchten
erfolgten im TGYEP-Medium bei pH 6,5.
Die Induktion des plasmidcodierten budA′-lacZ′-Fusiongens
durch das chromosomal codierte BudR ist in Tabelle 8 darge
stellt.
Um den minimalen Nukleotidbereich des bud-Promotors zu er
mitteln der noch eine durch budR aktivierbare Promotorakti
vität besitzt, wurde der auf Plasmid pBTL142 vorhandene Pro
motor von seiner 5′-Seite aus stufenweise verkürzt. Dazu
wurde pBU1 durch Restriktion mit EcoRI am 5′-Ende des
Inserts linearisiert und mit Bal31-Exonuklease (Boehringer
Mannheim) bei 30°C inkubiert (0,3 Units/µg DNA) (Schaffner
et al., 1976). Die 5′-überhängenden DNA-Enden wurden durch
das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt und mit
EcoRI-Linkern (Oligo4 (Tab. 1)) versehen. Nach Restriktion
mit EcoRI und BamHI wurden die Fragmente elektrophoretisch
aufgetrennt, Fragmente der geeigneten Länge wurden eluiert
und in den mit EcoRI und BamHI vorbehandelten Vektor pRS552
eingeführt. Die 5′-Enden der Inserts in den Deletionskon
strukten wurden durch Sequenzanalyse bestimmt. Ausgewählte
Klone (pBTL6 bis pBTL124) sind in Tabelle 9 aufgelistet.
Expressionsstudien mit den Verkürzungsklonen wurden in
Klebsiella terrigena KT14 als Wirtsstamm durchgeführt. Alle
Anzuchten erfolgten bei pH 6,5:
Um den Einfluß des E. coli eigenen Induktors des anaeroben
Stoffwechsels, Fnr, auf die BudR-abhängige Aktivierung des
bud-Promotors zu untersuchen, wurde budR sowie die budA′-
lacZ′-Translationsfusion auf Plasmid pRBL2 (Fig. 8) über
Transduktion mit kRS45 analog der Vorgehensweise aus Bsp. 11
in das Chromosom des fnr-negativen E. coli RM101 integriert.
Der dabei erhaltene Stamm wurde als E. coli BL12 bezeichnet.
Um mögliche Fnr-Effekte zu untersuchen, wurde E.
coli BL12 zusätzlich mit dem ein funktionelles fnr-Gen
tragenden Plasmid pUFR1 (Sawers und Suppmann (1992) J. of
Bacteriology 174, 11 pp. 3474-3478) transformiert.
Für die Konstruktion des CGTase-Expressionsplasmides
pBUD200 wurden die in Tabelle 1 dargestellten Oligonukleoti
de Oligo5 bis Oligo9 verwendet.
Ein das vollständige budR-Gen und den budA-Promotor ent
haltendes DNS-Fragment (Nukleotide 281 bis 1300 in SEQ ID-
No: 2) wurde mit Hilfe der Oligonukleotide Oligo5 und Oligo6
(Tab. 1) unter Verwendung von Plasmid pBAK16 als Vorlagen-
DNS mittels PCR amplifiziert und mit den Restriktions
endonukleasen NruI und NcoI gespalten.
Für die Amplifikation des Strukturgens der alpha-CGTase aus
Klebsiella oxytoca M5a1 wurden die Oligonukleotide Oligo7
und Oligo8 (Tab. 1) als Startoligonukleotide, sowie Plasmid
pCM100 (Binder et al. (1986), Gene Vol 47, p. 269-277) als
Vorlagen-DNS verwendet. Das amplifizierte DNS-Fragment
wurde mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und EcoRI ge
spalten.
Die beiden PCR-Fragmente wurden zusammen in den mit NruI
und EcoRI gespaltenen Vektor pJF118HE ligiert (Fig. 9). Das
dabei entstandene Plasmid wird als pBUD100 bezeichnet.
Um eine effektive Translation des alpha-CGTase-Gens auf
pBuD100 zu ermöglichen, wurden drei Punktmutationen, welche
bei der Konstruktion von pBUD100 erzeugt worden sind, um
über eine NcoI-Erkennungsstelle den budA-Promotor und
das alpha-CGTase-Strukturgen verknüpfen zu können,
revertiert (Fig. 10).
Durch gerichtete Mutagenese nach Deng & Nickoloff (1992),
Anal. Biochem. Vol. 200, p. 81 ff wurde unter Verwendung von
Oligo9 (Tab. 1) als Mutageneseoligo die DNS-Sequenz im Be
reich des Übergangs an die Originalsequenz von budA bzw.
alpha-CGTase angepaßt. Die Positionen der mutagenisierten
Basen sind Fig. 10 (Seq ID.No: 5 und 6) zu entnehmen. Das
mutagenisierte Plasmid wird als pBUD200 bezeichnet.
Die Bestimmung der Aktivität von CGTasen erfolgte nach der
von Candussio et al. in Eur. J. Biochem. (1990) 191, S.
177-185 beschriebenen Methode.
Jeweils 2 Einheiten pro Gramm Stärke einer zu testenden
CGTase wurden mit einer 5%-igen (w/v) Lösung einer lös
lichen Stärke (Merck, Darmstadt) in einem Puffer bestehend
aus 20 mM Tris/Cl pH 7,2 und 5 mM CaC12 für eine definierte
Zeit bei 45°C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion
durch die Zugabe von 1,5 Volumenteilen Methanol beendet.
Nicht umgesetzte Reststärke wurde durch eine einstündige
Inkubation bei 4°C gefällt und durch Zentrifugation (10 min,
12000 × g ) abgetrennt. Die entstandenen Produkte wurden
über HPLC an einer Nukleosil 10-NH2-Säule (Macherey & Nagel,
Düren) bestimmt, wobei definierte Cyclodextrine (Wacker-
Chemie, München) als Standard dienten.
Zur durch Sauerstoff, pH-Wert und/oder Acetat steuerbaren
Produktion von alpha-CGTase wurde das in Bsp. 16
beschriebene Expressionsplasmid pBUD200 in einen E. coli-
Sekretionsstamm transformiert. Als E. coli-Sekretionsstamm
wurde E. coli WCM105 verwendet. Dieser Stamm wurde wie in EP
338410 beschrieben aus E. coli DS410 hergestellt.
Zum Nachweis der steuerbaren alpha-CGTase-Produktion wurde
E. coli WCM105/pBUD200 bei 37°C in Kaliumphosphat
gepuffertem Vollmedium (TGYEP mit pH 6,5 bzw. pH 8,0; Begg
et al. (1977), FEMS Microbiol. Lett. Vol 2, p. 47-50)
unter Zusatz von 0,4% Glukose (w/v) und ggf. 40 mM
Natriumacetat angezogen. Anaerobe Kultivierung erfolgte in
Serumflaschen nach der Technik von Balch und Wolfe (1976).
Bei einer OD600 zwischen 0,8 und 1,0 wurden die Zellen durch
Zentrifugation bei 5000 × g abgetrennt. Der zellfreie
Kulturüberstand wurde, wie in Bsp. 15 beschrieben, zur
Bestimmung der darin enthaltenen alpha-CGTase-Aktivität
verwendet. Die Resultate sind in Tab.12 zusammengefaßt:
Claims (11)
1. Durch Acetat, pH-Wert und Sauerstoff steuerbares Expres
sionssystem, umfassend ein in trans wirkendes Regulator
protein und einen von diesem Protein aktivierbaren Pro
motor, dadurch gekennzeichnet, daß das Regulatorprotein
eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 75% homolog zu
der Aminosäuresequenz Seq. ID-No: 1 ist, umfaßt und der
Promotor eine DNS-Sequenz umfaßt, die zu mindestens 95%
homolog zu den Basen 315 bis 397 der DNS-Sequenz Seq. ID
No: 2 ist.
2. Expressionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß es beliebige Strukturgene unter Kontrolle des
Expressionssystems bei einem Sauerstoffpartialdruck pO₂
von 0-5%, einem pH-Wert von 6,0-6,5 und in Gegenwart von
Acetat in einer Konzentration von 40-60 mM maximal ex
primiert.
3. Regulatorprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es bei
Sauerstofflimitierung und Anwesenheit von Acetat und
einem pH-Wert des Anzuchtmediums von pH 6,0 bis pH 6,5
eine optimale Aktivierung des bud-Promotors aus Kleb
siella terrigena (DSM2687) bewirkt.
4. Regulatorprotein nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich
net, daß es eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu min
destens 75% homolog zu der Aminosäuresequenz Seq. ID-
Mo.1 ist.
5. Gen kodierend für ein Protein gemäß Anspruch 3 oder 4.
6. Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, daß ein
Promotor, der eine DNS-Sequenz umfaßt, die zu mindestens
95% homolog zu den Basen 315 bis 397 der DNS-Sequenz
Sequenz ID-No: 2 ist, funktionell mit dem Strukturgen
eines zu exprimierenden, heterologen Proteins verknüpft
ist.
7. Mikroorganismen enthaltend mindestens eine Expressions
kassette gemäß Anspruch 6.
8. Mikroorganismen enthaltend mindestens ein Expressions
system gemäß Anspruch 1.
9. Fermentationsverfahren zur Produktion von Proteinen,
mittels Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß
Mikroorganismen gemäß Anspruch 7 oder 8 verwendet wer
den.
10. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus gemäß
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in einen belie
bigen Mikroorganismus gegebenenfalls mindestens ein Gen
für ein Regulatorprotein gemäß Anspruch 4 oder 5
und/oder gegebenenfalls mindestens eine Expressionskas
sette gemäß Anspruch 7 eingebracht werden.
11. Verwendung von Fnr-negativen Mikroorganismen als
Wirtsstamm für ein Expressionssystem gemäß Anspruch 1.
Priority Applications (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995114056 DE19514056A1 (de) | 1995-04-13 | 1995-04-13 | Steuerbares Expressionssystem |
US08/614,686 US5830692A (en) | 1995-03-24 | 1996-03-12 | Expression system which can be regulated |
CA002171668A CA2171668A1 (en) | 1995-03-24 | 1996-03-13 | Expression system which can be regulated |
DK96104475.7T DK0733704T3 (da) | 1995-03-24 | 1996-03-21 | Styrbart ekspressionssystem |
JP8064602A JP2810016B2 (ja) | 1995-03-24 | 1996-03-21 | 制御可能な発現系、調節タンパク質、これをコードする遺伝子、発現カセット、それを含有する微生物、タンパク質の製造方法及び微生物の製造方法及び宿主株 |
AT96104475T ATE159290T1 (de) | 1995-03-24 | 1996-03-21 | Steuerbares expressionssystem |
EP96104475A EP0733704B1 (de) | 1995-03-24 | 1996-03-21 | Steuerbares Expressionssystem |
DE59600031T DE59600031D1 (de) | 1995-03-24 | 1996-03-21 | Steuerbares Expressionssystem |
CZ96875A CZ87596A3 (en) | 1995-03-24 | 1996-03-22 | CONTROLLABLE EXPRESSION SYSTEM, CONTROL PROTEIN, GENE, ENCODING PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, MICRO-ORGANISMS CONTAINING THE EXPRESSION SYSTEM, FERMENTATION AND PRODUCTION PROCESS OF PROTEINS AS WELL AS THE USE OF Fnr-NEGATIVE MICRO-ORGANISMS |
FI961323A FI961323A (fi) | 1995-03-24 | 1996-03-22 | Ohjattava ilmentämisjärjestelmä |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995114056 DE19514056A1 (de) | 1995-04-13 | 1995-04-13 | Steuerbares Expressionssystem |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19514056A1 true DE19514056A1 (de) | 1996-10-17 |
Family
ID=7759666
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1995114056 Withdrawn DE19514056A1 (de) | 1995-03-24 | 1995-04-13 | Steuerbares Expressionssystem |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19514056A1 (de) |
-
1995
- 1995-04-13 DE DE1995114056 patent/DE19514056A1/de not_active Withdrawn
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0334841B1 (de) | Microorganismen and plasmide für die 2,4-dichlorphenoxyessigsäure (2,4-d)-monooxigenase - bildung und verfahren zur herstellung dieser plasmide und stämme | |
Zhang et al. | Cloning, sequencing, mutagenesis, and functional characterization of draT and draG genes from Azospirillum brasilense | |
WO2001081597A1 (de) | Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine durch gram-negative bakterien | |
EP0798384A1 (de) | Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Biotin | |
Huang et al. | Analysis of two gene regions involved in the expression of the imipenem-specific, outer membrane porin protein OprD of Pseudomonas aeruginosa | |
EP0722500B1 (de) | Gene für den butyrobetain/crotonobetain-l-carnitin-stoffwechsel und ihre verwendung zur mikrobiologischen herstellung von l-carnitin | |
CH640268A5 (en) | Process for the preparation of filamentous hybrid phages, novel hybrid phages and their use | |
EP0733704B1 (de) | Steuerbares Expressionssystem | |
DE60014640T2 (de) | Genetische kaskaderegulierte expression von klonierten genen | |
EP0285152B1 (de) | Rekombinante DNA zur reprimierbaren und induzierbaren Expression von Fremdgenen | |
DE3927061C2 (de) | Uricase-codierende DNA-Sequenzen und Verfahren zur Herstellung von Uricase | |
EP0504798B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Glutarylacylase in grossen Mengen | |
DE19514056A1 (de) | Steuerbares Expressionssystem | |
DE4024158A1 (de) | Klonierung und ueberexpression von glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus leuconostoc dextranicus | |
EP0393684B1 (de) | Rekombinante DNA und Expressionsvektor | |
EP0524604B1 (de) | Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von S-(+)-2,2-Dimethylcyclopropancarboxamid mittels Mikroorganismen | |
DE3530935C2 (de) | ||
DE19536506B4 (de) | Neues Creatin-Amidinohydrolase-Gen, neue rekombinante DNA und Verfahren zur Herstellung von Creatin-Amidinohydrolase | |
DE4231764A1 (de) | Verfahren zur chromosomalen Integration eines Produkt-Gens | |
DE69233447T2 (de) | Biotin-Operon | |
DE60032630T2 (de) | Gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reduktasegene aus arabidopsis | |
EP0307730B1 (de) | Expression von Mutarotase | |
DE60012451T2 (de) | Mutante Kanamycin-Nukleotidyltransferase und deren Verwendung zum screening thermophiler Bakterien | |
EP0726320B1 (de) | Mikrobielle Herstellung von 5-Ketogluconat | |
DE4118450C2 (de) | DNA-Fragment enthaltend ein Sucrosephosphorylase-Gen und Verfahren zur Herstellung von Sucrosephosphorylase |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |