DE69233447T2

DE69233447T2 - Biotin-Operon

Info

Publication number: DE69233447T2
Application number: DE69233447T
Authority: DE
Inventors: Ohji Yokohama-shi Ifuku; Shinitiro Yokohama-shi Haze; Jiro Yokohama-shi Kishimoto; Kazuo Nagaokakyo-shi Nakahama
Original assignee: Shiseido Co Ltd; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-09-11
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2012-09-12
Also published as: ATE282698T1; KR100250692B1; US5885792A; KR930006156A; EP0532426A2; EP0532426B1; EP0532426A3; DE69233447D1; CA2078043A1; CA2078043C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Escherichia coli und insbesondere eine DNA-Sequenz vom Biotin-Operon, in welchem ein Basenpaar von entweder einer Nukleotidsequenz der Regulatorregion des Biotin-Operons von Escherichia coli oder einer Nukleotidsequenz in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons im Vergleich mit demjenigen in ihrem Wildtyp-Stamm mutiert ist. Gemäß einer derartigen DNA-Sequenz kann ein System für ein hoch exprimierendes Biotin-Operon konstruiert werden.
2. Beschreibung des Stands der Technik
Für die Herstellung von Biotin, das ein für Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen benötigtes Vitamin ist, wurden zur Substitution chemischer Syntheseverfahren, die komplizierte Schritte beinhalten, wirksame Verfahren unter Verwendung eines Fermentationsverfahrens, welches durch gentechnische Methoden etc. verbesserte Mikroorganismen einsetzt, entwickelt (siehe zum Beispiel die ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 61–149091 und die EP-A-0316229).
Als hoch produzierende Stämme, bei denen ein Mikroorganismus zur Steigerung der Produktivität einer spezifisch nützlichen Substanz im Fall eines vorhandenen Rückkopplungs-Repressions-Mechanismus durch das Endprodukt für ein Enzym-Synthesesystem verbessert wird, können durch Mutation hergestellte Repressor- und Operator-Mutanten genannt werden. Es wurden auch Stämme vorgeschlagen, bei denen die Promotor-Aktivität an sich in dem Enzym-Synthesesystem verstärkt worden war. Falls von der Technologie gentechnischer Veränderungen in vollem Umfang Gebrauch gemacht wird, gibt es auch Verfahren, bei denen ein Enzym-Synthesesystem an einen vom Originalpromotor verschiedenen hoch exprimierenden Promotor ligiert wird. Die Biotin-Hochproduktionsstämme betreffenden Repressor-Mutanten schließen beispielsweise den DRK 332-Stamm (FERM P-8585, ungeprüfte japanische Veröffentlichung (Kokai) Nr. 155 081) ein, und ein Beispiel für die Verwendung eines hoch exprimierenden Promotors mithilfe gentechnischer Technologie ist ein Stamm, bei dem nur das bioB-Gen unter Gebrauch eines P_L-Promotors verstärkt ist (Ungeprüfte Japanische Veröffentlichung (Kokai) Nr. 61–149 091), etc.
Obwohl sämtliche der oben aufgeführten Mikroorganismen, die für den Zweck der Biotinproduktivitäts-Steigerung verbessert worden sind, ihre gewünschten Ziele erreicht haben, ist weiterhin Raum für eine Verbesserung, und eine Erfordernis für eine Bereitstellung weiter verbesserter Stämme mit hoher Biotin-Produktivität ist nach wie vor vorhanden, um die Produktivität von Biotin durch Fermentationsmethoden zu erhöhen. Im Biotin-Operon von Escherichia coli werden 5 zur Biotinsynthese beitragende Gene codiert: bioA, bioB, bioF, bioC und bioD. Die Regulatorregion, die ihre Expression steuert, liegt zwischen bioA und bioB, und bioA ist in der linken Kette codiert, während bioB, bioF, bioC und bioD in der rechten Kette codiert sind. Sie sind jeweils einer Transkription in reverser Richtung unterworfen, und die Transkription in beide Richtungen ist durch einen Operator gesteuert. Der Transkriptionsmechanismus in beide Richtungen ist auch ein Grund, warum der Wechsel zu einem hoch exprimierenden Promotor mithilfe der Gentechnik-Technologie nicht vereinfacht werden kann. Ungeachtet dessen ist es zur Steigerung der Biotin-Produktivität wichtig, eine hohe Expression des Biotin-Operons zu erreichen. Mehrere Berichte zur Mutation des Operators wurden erstellt (Nature, 276, 689 (1978), Gene, 13, 89 (1981)), aber es gibt dort keinen Hinweis zur Biotin-Produktivität. In einigen Fällen ist die Promotoraktivität, die mit der Operator-Region überlappt, deutlich vermindert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein hoch exprimierendes System eines Biotin-Operons zu konstruieren, indem eine Mutation verursacht wird, die von der konventionellen Mutation an der Position der Regulatorregion des Biotin-Operons oder der dazu benachbarten Position völlig verschieden ist, und einen diese besitzenden Biotin-Hochproduktionsstamm bereitzustellen.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben wiederholt nach einem Weg gesucht, um Escherichia coli zur Erhöhung der Biotin-Produktivität zu verbessern. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass, wenn eine Mutation an einer Position, die völlig verschieden von der der konventionellen Position innerhalb der Regulatorregion des Biotin-Operons oder der dazu benachbarten Position ist, induziert wird, ein hoch exprimierendes Biotin-Operonsystem konstruiert werden kann. Insbesondere wenn Antimetabolite, die Biotin-Analoga sind, verwendet werden, und Mutanten, die Resistenz gegen diese Analoga aufweisen, selektiert werden, werden Mutanten mit signifikant erhöhter Produktivität von Biotin-Vitameren unter diesen Mutanten mit großer Häufigkeit gefunden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass aus diesen Mutanten diejenigen, bei denen Mutationen an der Regulatorregion des Biotin-Operons oder einer spezifischen dazu benachbarten Region induziert worden waren, in einer noch höheren Frequenz bzw. Häufigkeit erhalten werden können und erreicht werden können. Darüber noch hinausgehend wurde festgestellt, dass diese Mutationen eine hohe Expression des Biotin-Operons promovieren können, was in einer signifikanten Steigerung der Produktivität von Biotin-Vitameren resultiert, und dadurch wird diese Erfindung zustande gebracht.
Das bedeutet, es wird eine DNA-Sequenz bereitgestellt, in der eine Nukleotidsequenz der Biotin-Operon-Regulatorregion oder einer spezifischen in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons liegenden Region im Vergleich mit derjenigen ihres Wildtyp-Stamms mutiert worden ist. Diese Sequenz ist durch die Tatsache charakterisiert, dass mindestens ein Basenpaar von entweder einer Nukleotidsequenz der Pribnow-Box zur Rechten (bioB-Seite) der Regulatorregion des Biotin-Operons von Escherichia coli oder einer Nukleotidsequenz in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons im Vergleich zu demjenigen in ihrem Wildtypstamm mutiert wird, wobei sich die Mutation bei der -53-sten oder -5-ten Position stromaufwärts oder innerhalb des Bereichs der 3-ten bis 5-ten stromabwärts befindet, wobei A von ATG des bioB-Initiationscodons als die erste Position angenommen wird. Genauer gesagt befindet sich die Mutation innerhalb des Operators, oder zumindest ein Basenpaar an einer Mehrzahl von Positionen vor und nach dem bioB-Initiationscodon ist mutiert worden. Solch ein Operon führt zur Entstehung einer hohen Biotin-Expression.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Biotin bereitgestellt, gekennzeichnet durch Kultivierung in einem Nährmedium von zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismen, die mit rekombinantem Plasmid, welches die DNA-Sequenz, die wie oben beschrieben mutiert worden ist, trägt, transformiert wurden und Sammlung des in der Kultivierungsbrühe akkumulierten Biotins.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue DNA-Sequenz, die vorteilhaft zur Herstellung von Biotin-Vitameren verwendet werden kann, bereitgestellt, von der ausgehend Mikroorganismen mit diesen Biotin-Operons und mit verbesserter Produktivität von Biotin- Vitameren erhalten werden können. Diese Mikroorganismen werden mit dem rekombinanten Plasmid, enthaltend das Biotin-Operon, transformiert; ist es darin enthalten, können sie vorteilhaft für die Herstellung von Biotin-Vitamer verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezug auf die der Beschreibung beigefügten Zeichnungen erläutert.
Die 1 zeigt die Nukleotidsequenz in oder nahe der Biotin-Operon-Regulatorregion und ihre charakteristische Stelle.
Die 2 zeigt eine Nukleotidsequenz der Biotin-Operon-Operatorregion.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM [KONKRETE AUSFÜHRUNGSFORMEN UND FUNKTION]
Das Biotin-Operon gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Biotin-Operon von Escherichia coli und besitzt ein Cluster von fünf Genen von Enzymen der Biotin-Biosynthese, d.h., bioA, bioB, bioF, bioC und bioD. Der Ausdruck „Biotin-Operon-Regulatorregion" ist als Sequenz Nr. 1 (SEQ ID NO:1) in der Sequenzauflistung niedergelegt und zeigt die rechte Kette, die zwischen bioA und bioB liegt, und bezeichnet spezifischer eine Region von dem -1-sten Nukleotidpaar bis zu dem 86-sten Basenpaar, wobei A des bioB-Initiationscodons, ATG, als die erste Position in der in 1 gezeigten Basensequenz angenommen wird. In ähnlicher Weise bezeichnet der Begriff „Region in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons" eine Region von dem ersten Basenpaar bis zu dem sechsten Basenpaar, wobei A des bioB-Initiationscodons, ATG, als die erste Position angenommen wird.
Die „Biotin-Operatorregion" des Biotin-Operons korrespondiert zu einer Region von der -43-sten bis zur -82-sten Position der 1 und bildet eine nicht perfekte Palindromstruktur wie in 2 gezeigt. Diese Region ist eine so genannte Repressorprotein-Bindungsregion, welche, in dem Zustand des Einzelstrangs, eine stabile Sekundärstruktur bildet, durch die die von den oberen und unteren Linien hervorgehobenen Basen GC- und AT-Paare ausbilden, als im Zentrum befindliche mit * gekennzeichnete Base. Es kann erwartet werden, dass eine Mutation des Basenpaars in diesem Bereich, insbesondere des Basenpaars, das den durch die oberen und unteren Linien hervorgehobenen Stammteil einnimmt, stärker bevorzugt des GC- oder CG-Basenpaars in ein beliebiges anderes Basenpaar, der Sekundärstruktur in dem Zustand des Einzelstrangs eine Veränderung erlaubt, um die Bindungsaffinität zu dem Repressorprotein zu vermindern, was dazu führt, dass die Repression der Expression nachlässt, um die Transkriptionsaktivität zu steigern.
Die Tab. 1 zeigt die berechnete minimale Freie Energie der Bildung der Sekundärstruktur im Zustand des Einzelstrangs innerhalb der Operatorregion, wenn, im Vergleich mit einer in ihrem Wildtyp, eine Basenpaarkonversion am G (GC-Paar im Zustand des Doppelstrangs) und C (CG-Paar im Zustand des Doppelstrangs) bewirkt wird, von denen angenommen wird, dass sie ein GC-Paar oder CG-Paar mit besonders hoher Bindungsstärke ausbilden. Die Werte für die minimale Freie Energie wurden mithilfe der Software GENETYX-CD (Version 0.5, hergestellt von Software Kaihatsu Kabushiki Kaisha) zum Prozessieren genetischer Information erhalten. Die Mutation ist als ein Paar in dem Zustand des Doppelstrangs repräsentiert.
Tabelle 1
Im Hinblick auf die Mutation innerhalb der Operatorregion wurden die Umwandlung des -77-sten GC-Paars in ein AT-Paar, die Umwandlung des -65-sten GC-Paars in ein TA-Paar, und die Umwandlung des -48-sten CG-Paars in ein TA-Paar berichtet (Nature, 276, 689 (1978), Gene, 13, 89 (1981)). Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, hat jedoch die GC → AT- Umwandlung an dem -53-sten Basenpaar die größte minimale Freie Energie und ist somit am effektivsten als die Operator-Mutation.
Darüber hinaus überlappt diese Region mit dem rechtwärtigen (bioB Promotor und insbesondere einer so genannten -35-Region (TTGTAA von der -79-sten bis zur -74-sten Position der rechten Kette in 1) und der -10-Region (auch Pribnow-Box genannt, TAGGTT von der -56-sten bis zur -51-sten Position der rechten Kette in 1), die spezielle, mit der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase assoziierte Nukleotidsequenzen und von besonderer Wichtigkeit sind. Vom Gesichtspunkt des Ausmaßes der Intensität der Promotoraktivität her ist als Regel die Sequenz an der -35-Region vorzugsweise so ähnlich wie die Sequenz von TTGACA.
Obwohl die Umwandlung des -77-sten GC-Paars in ein AT-Paar als die Mutation in dieser Region berichtet wurde, ist eine solche Mutation nicht zu bevorzugen, weil von dieser Mutation erwartet wird, dass sie die Promotoraktivität signifikant vermindert. Als nächste ist, als Regel, die Sequenz der Pribnow-Box vorzugsweise so ähnlich wie die Sequenz von TATAAT. Im Zusammenhang mit der Effizienz der Mutation des Operators betrachtet, ist die Mutation des -54-sten GC-Paars in ein TA-Paar und jene des -53-sten GC in ein AT-Paar zu bevorzugen. Unter diesen ist die Mutation des -53-sten G → A stärker zu bevorzugen als jene des -54-sten G → T, wenn man den Beitrag zur Zunahme der Promotor-Aktivität in Betracht zieht.
Wie oben beschrieben und aus Tabelle 1 ersichtlich ist, ist die Mutation des -53-sten GC → AT, welches die größte minimale Freie Energie besitzt, als die Operator-Mutation am effektivsten und in gleicher Weise am effektivsten im Hinblick auf die Steigerung der Aktivität des oben beschriebenen rechtwärtigen (bioB) Promotors.
Die Sequenz von GGAG von dem -11-ten bis zum -8-ten Bereich, die durch Unterstreichung in 1 angezeigt ist, wird eine SD-Sequenz (Shine-Dalgarno-Sequenz) genannt. Diese Sequenz ist eine Stelle, an der die Ribosomen auf einem mRNA-Niveau gebunden werden, und die Translation des bioB-Gens startet von dem Initiationscodon ATG an der ersten Position. Es kann die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass der Bereich von der -6-ten bis zur 6-ten Position, stromabwärts zur SD-Sequenz gelegen, eine starke Sekundärstruktur (eine Stamm-und Loop-Struktur) ausbildet und dadurch die Bindung des Ribosoms an die SD-Sequenz und die Initiationseffizienz der Translation von ATG aus erniedrigt.
Aus diesem Grunde kann erwartet werden, dass, indem man den Stamm-Anteil, gebildet durch die Sequenzen von AGCC von der -6-ten bis zur -3-ten Position und GGCT von der 3-ten bis zur 6-ten Position, mithilfe von Mutation verändert, die bioB-Translationsaktivität verstärkt wird. Da die Position des Stop-Codons und der Bereich in der Nachbarschaft des Initiationscodons in den bioB-, bioF- und bioC-Genen überlappt sind, kann erwogen werden, dass, wenn die Translationseffizienz von bioB erhöht ist, die Translationseffizienzen von bioF und bioC ebenfalls erhöht sind.
Wenn man bedenkt, dass das GC-Paar in einem Einzelstrang-Zustand sehr stark ist, da das an der -5-ten Position befindliche G, C an der -4-ten Position, C an der -3-ten Position oder ATG des Initiationscodons aufrecht erhalten werden müssen, kann die Veränderung der Stammstruktur in diesem Bereich effizienter durch einen Austausch von G an der 4-ten Position, C an der 5-ten Position oder dergleichen in andere Basen erreicht werden. Was hierin festgestellt ist, ist, dass eine Mutation in dem bioB-Strukturgen, d.h. in diesem Fall die Mutation der Basen von der 4-ten bis zur 6-ten Position, gelegentlich den Austausch von Aminosäuren verursacht. Das Ereignis, bei dem dieses Einfluss auf die Aktivität des bioB-Genprodukts selbst hat oder dieses mit der Stabilität des Proteins (intrazelluläre Lebensdauer) assoziiert ist, kann in Erwägung gezogen werden, und daher sollte die Mutationsposition unter Überlegung derartiger Vorgänge ausgewählt werden.
Erfindungsgemäßes Verfahren zum Erhalten der DNA-Sequenz vom Biotin-Operon
Die Mikroorganismen, die verwendet werden, um das Biotin-Operon, in dem eine Mutation erfindungsgemäß an einer spezifischen Position induziert ist, zu erhalten, sind Biotinproduzierende Bakterien von Escherichia coli, d. h. Mikroorganismen, die ein enzymatisches System für die Biotin-Biosynthese besitzen und deren Nukleotidsequenz der Biotin-Operon-Regulatorregion und der Nukleotidsequenz in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons in 1 gezeigt sind. Sie sind nicht in spezifischer Weise eingeschränkt, so lange wie sie im Einklang mit dem Ziel der vorliegenden Erfindung sind, sogar, wenn sie irgendwelche andere Eigenschaften besitzen. Um genau zu sein, ein beliebiger, zu Escherichia coli gehörender Mikroorganismus kann vorteilhafterweise zur Biotinherstellung herangezogen werden, möglicherweise einer, welcher eine andere Arzneistoffresistenz und gleichzeitig andere Effizienz-Charakteristika, z. B. das im Fachgebiet bekannte Charakteristikum einer entfernten Rückkopplungs-Repression durch Biotin, aufweist.
Dementsprechend kann als ein Elternstamm eines derartigen Mikroorganismus irgendein zu Escherichia coli gehörender Mikroorganismus verwendet werden, solange er einen Biotinbiosynthetischen Stoffwechselweg für Biotin hat. Vorzugsweise können Stämme, die vorausgehend mutiert worden sind, um geeignet für das Herstellen von Biotin zu sein, zum Beispiel DRK 3323 (FERM BP-2116), hergestellt durch die gegenwärtigen Erfinder, bei welchem die Rückkopplungs-Repression durch Biotin losgelöst worden ist (siehe WO 89/4365), erwähnt werden.
Die erfindungsgemäße Biotin-Operon-DNA-Sequenz kann aus dem obigen Elternstamm unter Verwendung des nachstehenden Selektionsmediums und -verfahrens zur Selektion der gewünschten Mutante erhalten werden. Beispielsweise kann ein Prozess zum Erhalten der DNA-Sequenz über die Mutante mit einer Resistenz gegenüber einem Antimetaboliten, welcher ein Biotinanaloges ist, erwähnt werden. Das hierin zu verwendende Biotinanaloge ist eine Verbindung mit einer biotinähnlichen Struktur, und es kann irgendein Biotinanaloges verwendet werden, solange es Biotin antagonisiert und das Wachstum der erfindungsgemäßen Mikroorganismen inhibiert. Beispiele schließen Actithiazinsäure (Acidomycin, hierin im Folgenden mit „ACM" abgekürzt), α-Dehydrobiotin, 5-(2-Thienyl)-valeriansäure (hierin im Folgenden mit „TVA" abgekürzt), α-Methyldesthiobiotin, α-Methylbiotin, Amicrenomycin, 4-Imidazolidon-capronsäure, Homobiotin, Norbiotin und dergleichen ein, aber die Biotinanaloga sind nicht darauf beschränkt, und beliebige andere Substanzen, welche das Ziel dieser Erfindung treffen, können gebraucht werden. Sie können einzeln verwendet werden oder als Kombination von zweien oder mehreren.
Darüber hinaus können als diese Substanzen entweder jene, die aus einer Kultur von Actinomycetes, welche diese Substanzen produzieren und akkumulieren, isoliert werden, oder jene, welche chemisch synthetisiert werden, verwendet werden. Zum Beispiel kann ACM entsprechend der Methode synthetisiert werden, die bei Clark, R. K., Arch. Biochem. Biophys., 40, 270 (1952), beschrieben ist, und TVA kann entsprechend der bei Melville D. B., J. Biol. Chem., 146, 487 (1942) beschriebenen Methode synthetisiert werden.
Für das für die Selektion von Mutanten, die Resistenz gegen diese Biotinanaloge, z. B. ACM und TVA besitzen, verwendete Medium, ist es wünschenswert, ein Minimalmedium zu verwenden, in dem Substanzen, die leicht durch die Mikroorganismen metabolisiert werden, um als Energiequellen oder zellaufbauende Komponenten zu dienen, beispielsweise Saccharide und Glycerin als Kohlenstoffquellen, und organische Substanzen wie Peptone und Hefeextrakte als Stickstoffquellen, in limitierter Weise verwendet werden. Wenn ein geeignetes Minimal-Medium verwendet wird, kann nicht nur ACM sondern auch TVA beträchtliche antimetabolisierende Wirksamkeit entfalten (zu Einzelheiten über TVA siehe die japanische Patentanmeldung Nr. 2–235903), um die minimale inhibitorische Konzentration für die zu der üblichen Escherichia-Gattung gehörenden Mikroorganismen festzulegen.
Auf ein Selektionsmedium (Agarplatten-Medium), in dem ACM und TVA zu einem solchen Minimalmedium in höheren als den minimalen inhibitorischen Konzentrationen zugesetzt sind, werden zur Gattung Escherichia gehörende Mikroorganismen, die einer allgemeinen Mutagenesebehandlung mit einem Mutagen wie N-Methyl-N'-nitroso-N-nitrosoguanin unterzogen worden sind, aufgebracht und kultiviert. Die resultierende Mutantenkolonie, die Resistenz gegenüber ACM und TVA besitzt, wird mit einer Platinöse gesammelt, auf ein geeignetes, Biotin produzierendes Medium transferiert und dann kultiviert. Die Menge von auf diese Weise hergestellten und akkumulierten Biotin-Vitameren wurde beispielsweise mithilfe eines Bioassays, welcher Lactobacillus plantarum als Indikator-Organismen verwendet, quantifiziert. Dieser wird erhalten, indem man eine Mutante selektiert, die eine gesteigerte Kapazität für die Herstellung von Biotin-Vitameren im Vergleich mit dem Elternstamm hat. Die Basensequenz der Biotin-Operon-Regulatorregion dieser Mutante oder derjenigen in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons dieser Mutante wird sequenziert und selektiert, indem sie mit der Nukleotidsequenz von derjenigen in ihrem Wildtyp-Stamm verglichen wird, wodurch eine gewünschte DNA erhalten werden kann.
Die Bestimmung der Nukleotidsequenz in diesem Bereich kann durch Amplifikation dieser Region mithilfe der PCR (Polymerasekettenreaktion)-Methode unter Verwendung der chromosomalen DNA der Mutante, erhalten mithilfe der obigen Methode, als Matrize und unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primers, welcher komplementär zur zugehörigen (+)-Kette und (–)-Kette synthetisiert wurde, und welcher die Nukleotidsequenz der Biotin-Regulatorregion oder in der Nachbarschaft zum bioB-Initiationscodon interponiert, und indem man die amplifizierte Region mittels einer Didesoxymethode sequenziert [Messing, J.; Methods Enzymol., 101, 20 (1983)]. Alternativ kann die Nukleotidsequenz an diesem Bezirk mittels der Didesoxy-Kettenterminations-Methode bestimmt werden, nachdem das Biotin-Operon, enthaltend die Nukleotidsequenz der Biotin-Operon-Regulatorregion oder des Nachbarbereichs des bioB-Initiationscodons, ganz oder teilweise vorausgehend kloniert wurde.
Konkrete Beispiele von Mikroorganismen mit der erfindungsgemäßen Biotin-Operon-DNA-Sequenz (hierin im Folgenden als „DRAT-Stamm" abgekürzt) und erhalten wie oben beschrieben, sind Escherichia coli DRAT 9-, DRAT 6- und DRAT 7-Stämme, welche bei dem Patentmikroorganismen-Hinterlegungszentrum der Fermentationsforschungsinstituts-Agentur der Industriewissenschaft und -technologie, in Japan, am 24. Juli 1990 als FERM P-12378, P-12376 und P-12377 hinterlegt wurden, und anschließend wurden sie in deren Internationale Hinterlegungsbehörde transferiert und unter dem Budapester Vertrag als FERM BP-3990, BP-3988, bzw. BP-3989 hinterlegt.
Außerhalb der obigen Verfahren kann die vorliegende Erfindung auch erreicht werden, indem man ein rekombinantes Plasmid, das ein vorausgehend kloniertes Biotin-Operon, z. B. pXBA 312 oder pKHN 31, besitzt, erhalten durch eine an sich bekannte Plasmidextraktionsmethode aus z. B. Escherichia coli DRK-3323 [pXBA 312] (FERM BP-2117) oder DRK-332 [pKHN 31] (FERM BP-2114), verwendet, um eine synthetisierte DNA zu präparieren, die eine Nukleotidsequenz der Biotin-Operon-Regulatorregion oder in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt.
In diesem Fall ist es erwünscht, dass die synthetisierte DNA so entworfen ist, dass sie leicht umgewandelt und insertiert werden kann, wenn man von einer geeigneten, in dem Biotin-Operon vorliegenden Restriktionsenzym-Schnittstelle Gebrauch macht. Die synthetisierte DNA kann vorteilhaft entweder durch eine Phosphoamidid-Methode oder durch eine Phosphotriester-Methode hergestellt werden. Die Synthese durch einen DNA-Synthese-Automaten, welcher die Phosphoamidid-Methode verwendet, ist gebräuchlich. Weil die DNA als Einzelstrang synthetisiert wird, wird die komplementäre Kette immer synthetisiert und annealt, um die DNA als Doppelstrang zu verwenden. Darüber hinaus kann unter Verwendung des oben beschriebenen klonierten Biotin-Operons das Biotin-Operon dieser Erfindung auch mithilfe einer ortsgerichteten Mutagenese [Kramer, W. et al.; Method in Enzymol., 154, 350 (1987)] mit einem synthetisierten Oligonukleotid, in das die erfindungsgemäße Mutation eingeführt wird, erhalten werden.
Man ist nicht auf die Punktmutation in der erfindungsgemäßen Biotin-Operon-DNA-Sequenz beschränkt und kann eine Doppelmutation oder noch umfassendere Mutationen durch die obigen oder andere Verfahren konstruieren. Zum Beispiel können das Biotin-Operon, kloniert aus dem DRAT 9-Stamm, und das Biotin-Operon, kloniert aus dem DRAT 6-oder DRAT 7-Stamm, in einfacher Weise unter Verwendung der Acc1-Restriktionsenzymschnittstelle, lokalisiert in der in 1 dargestellten Biotin-Operon-Regulatorregion, rekombiniert werden, um ein doppeltmutiertes Biotin-Operon auszubilden.
In Anbetracht der Verfügbarkeit in der Industrie kann die erfindungsgemäße Biotin-Operon-DNA-Sequenz als ein rekombinantes Plasmid genutzt werden, welches eine DNA-Sequenz aufweist, die aus einem DRAT-Stamm erhalten wird, der ein Mikroorganismus ist, enthaltend das erfindungsgemäße Biotin-Operon, welches in die Vektor-DNA insertiert wird, um in irgendeinen der zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismen einzuführen, die vorteilhaft als Wirt zur Herstellung von Biotin verwendet werden können. Diese Transformante zeigt generell hohe Biotin-Produktivität. Als Folge kann ein weiterer Aspekt dieser Erfindung bereitgestellt werden, d. h., ein Verfahren zur Herstellung von Biotin, gekennzeichnet durch die Kultivierung von zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismen, welche mit dem obigen Plasmid transformiert worden sind, und Sammlung von Biotin aus der Kultivierungsbrühe.
Als zur Gattung Escherichia gehörende Mikroorganismen, die als Wirt verwendet werden, können beliebige verwendet werden, solange dies die Expression des Biotin-Operons gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nachteilig beeinflusst; die Verwendung eines Stammes der vorausgehend der Mutation unterzogen wurde, um dadurch für die Biotinherstellung geeignet zu sein, zum Beispiel der oben erwähnte Mikroorganismus, der DRAT-Stamm, oder DRK 3323 (FERM BP-2116), dessen Rückkopplungsrepression durch Biotin losgelöst wurde, und der durch die gegenwärtigen Erfinder präpariert wurde, ist zu bevorzugen. Dieser wird verwendet, um ein Biotinherstellungsverfahren vorzusehen.
Jeder üblicherweise angewendete Vektor kann als der hierin verwendete Vektor eingesetzt werden, wie etwa Plasmid vom pBR 322-Typ, Plasmid vom Colicin(Col)E1-Typ, oder vom lambda-Phagen-Typ, wobei Escherichia coli als Wirt dient. Da das erfindungsgemäße Biotin-Operon ein Hochexpressions-System ist, kann ein Plasmid-Vektor mit einer niedrigeren Anzahl von Kopien, die mit einer derartig hohen Expression korrespondiert, verwendet werden, z. B. pMW 119 (hergestellt von Nippon Gene Inc.), etc., um eine sinnlose Belastung des Wirts auszusparen, wodurch ein Prozess zur vorteilhafteren Biotinherstellung vorgesehen wird als das herkömmliche Verfahren.
Durch die Kultivierung in einem derartigen Nährmedium unter solchen Bedingungen, wie sie generell zur Kultivierung eines zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus angewendet werden, können die wie oben beschrieben erhaltenen Mikroorganismen eine beachtliche Biotinmenge in der Kultur ansammeln. Zum Beispiel kann als das Nährmedium irgendeines der synthetisierten Medien und natürlichen Medien, enthaltend in an sich bekannter Weise Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsubstanzen, eingesetzt werden. Als Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate wie Glucose, Glycerin, Fructose, Sucrose, Maltose, Stärken, flüssige Sirupe von hydrolysierter Stärke oder dergleichen benutzt werden. Die verwendete Menge liegt vorzugsweise bei etwa 0,1 bis 5,0%.
Als Stickstoffquellen können verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat und Stickstoffquellen natürlichen Ursprungs, wie Aminosäuren, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Mais-Einweichlaugen, Produkte aus hydrolysiertem Kasein, entfettetes Sojabohnenpulver und verdaute Produkte davon, und dergleichen eingesetzt werden. Die Stickstoffquellen natürlichen Ursprungs dienen in vielen Fällen als Kohlenstoffquellen, zusätzlich zu den Stickstoffquellen.
Als die Mineralsubstanzen können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Kupfersulfat, Eisen(II)sulfat, Manganchlorid, Kobalthlorid, Ammoniummolybdat, Borsäure und dergleichen genutzt werden.
Die in EP-A-0316229 beschriebene Alaninzugabe ist ebenso bei dem Mikroorganismus dieser Erfindung verfügbar. Die dem Medium zuzusetzende Menge ist geeigneter Weise in dem Bereich von 1 bis 10 g/l, und stärker bevorzugt in dem Bereich von 3 bis 7 g/l. Alanin kann am Anfang auf einmal oder in mehreren Portionen zugesetzt werden.
In dem Fall, wenn dem präparierten Mikroorganismus Antibiotikaresistenz verliehen wird, kann es die Einführung des korrespondierenden Antibiotikums in das Medium ermöglichen, die Aufnahme kontaminierender Bakterien zu unterdrücken. Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen vorgenommen wie durch Schüttelkultur oder Belüftungskultur. Die Kultivierungstemperatur ist geeigneter Weise 25 bis 37°C, und das pH-Niveau wird während der Kultivierung vorzugsweise um das neutrale pH-Niveau herum aufrechterhalten. Üblicherweise beträgt die Kultivierungsdauer ungefähr 24 bis 72 Stunden. Wenn Biotin-Vitamere nach der Vervollständigung der Kultivierung aus der Kulturbrühe gesammelt werden, können verschiedene Eigenschaften von Biotin-Vitameren wie Biotin und Desthiobiotin herangezogen werden, um irgendeine der diversen Methoden, die für Extraktion und Reinigung aus allgemeinen natürlichen Materialien gebraucht werden, anzuwenden. Zum Beispiel werden Zellen aus der Kulturbrühe entfernt, Biotin-Vitamere werden auf Aktivkohle adsorbiert, gefolgt davon, dass sie eluiert und mit einem Ionenaustauscher-Harz abgetrennt und gereinigt werden. Alternativ kann das Kulturbrühenfiltrat direkt mit einem Ionenaustauscher-Harz behandelt werden, zwecks Abtrennung und Reinigung und Umkristallisation aus Wasser oder einem Alkohol. Dies ist in der Lage, Biotin-Vitamere wie Biotin und Desthiobiotin zu gewinnen.
BEISPIEL
Diese Erfindung wird nun unter Bezug auf das nachstehende Beispiel genauer beschrieben, womit allerdings nicht beabsichtigt ist, die vorliegende Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1
(1) Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration von ACM und TVA
Escherichia coli-Stamm DRK-3323 (FERM BP-2116) wurde mit einer Platinöse von einem Aufbewahrungsmedium aus Agar in ein Brenztraubensäure-Minimalmedium (8,8 g/l Natriumdihydrogenphosphat (12-Hydrat), 1,2 g/l Dikaliumhydrogenphosphat, 1,0 g/l Ammoniumsulfat, 0,1 g/l Magnesiumsulfat (7-Hydrat), 0,1 g/l Natriumpyruvat, eingestellt auf pH = 7,0) überführt und durch Schütteln bei 37°C für 16 bis 18 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation gesammelt, wiederholt mit dem Brenztraubensäure-Minimalmedium gewaschen und danach in demselben Medium erneut suspendiert, um eine Bakteriensuspension zur Animpfung zuzubereiten. Die Suspension wurde inokuliert mit einem Brenztraubensäure-Minimalmedium, dem ACM oder TVA in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt worden waren, und bei 37°C für 24 Stunden in Kultur genommen. Die Menge der gewachsenen Zellen wurde über die Trübung quantifiziert (OD 660), um die ACM- und TVA-Effekte auf die Wachstumsinhibierung zu bestimmen. Die Resultate sind in Tabelle 2 und Tabelle 3 dargestellt. ACM inhibierte das Wachstum von DRK-3323 bei der zugesetzten Konzentration von 0,1 g/l, und TVA inhibierte das Wachstum von DRK-3323 bei der zugesetzten Konzentration von 2 g/l.
Tabelle 2
Tabelle 3
(2) Präparation von Stämmen mit Resistenz gegenüber ACM und TVA
Escherichia coli-Stamm DRK-3323 (FERM BP-2116) wurde durch Schütteln in einem Brenztraubensäure-Minimalmedium bei 37°C für 4 Stunden kultiviert. Nachdem die Zellen während einer logarithmischen Wachstumsphase gesammelt und gewaschen worden waren, wurden sie in einem TM-Puffer (0,61% Trisbase, 0,5% Maleinsäure, eingestellt auf pH 6,0), enthaltend 100 μg/l N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, suspendiert, und die Mutagenese wurde bei 37°C für 30 Minuten ausgeführt. Die gesammelten und gewaschenen Zellen wurden einer Rückgewinnungskultur in dem Brenztraubensäure-Minimalmedium unterzogen, und nach dem Sammeln und Waschen wurde die Suspension auf ein Agar-Platten-Brenztraubensäure-Minimalmedium, enthaltend 0,1 g/l ACM und 2 g/l TVA, derart aufgetragen, dass die Anzahl der Zellen etwa bei 10⁷ pro Petrischale lag. Nach 48-stündiger Kultur bei 37°C wurde eine ACM-resistente Mutantenkolonie, die erschien, mit einer Platinöse gesammelt, und in ein L-Medium (10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt, 1 g/l Glucose, 5 g/l Natriumchlorid, eingestellt auf pH = 7,0) eingeimpft und für 48 Stunden bei 37 °C in Kultur genommen. Die Menge von produziertem und in der Kulturbrühe zusammen gekommenem Biotin wurde durch einen Bioassay quantifiziert, bei dem Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) eingesetzt wurde. Als ACM-resistente und TVA-resistente Stämme mit vermehrter Biotinproduktion und -Akkumulationsfähigkeit wurden vier Stämme erhalten, d. h., DRAT 6, DRAT 7, DRA 8 und DRAT 9.
(3) Klonierung von Biotin-Operon aus ACM-resistenten und TVA-resistenten Stämmen
a) Präparation von chromosomaler DNA
Jeder der wie oben beschrieben erhaltenen ACM-resistenten und TVA-resistenten Stämme wurde durch Schütteln in einem L-Medium ((10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt, 1 g/l Glucose, 5 g/l Natriumchlorid) bei 37°C für 48 Stunden kultiviert. Nachdem die Zellen bei einer logarithmischen Wachstumsphase gesammelt und gewaschen worden waren, wurden sie extrahiert und gereinigt unter Anwendung einer üblichen DNA-Extraktionsmethode gemäß einem Phenolverfahren (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)), um eine chromosomale DNA zu erhalten.
b) Herstellung von Vektor-DNA
Escherichia coli DDK-3323 [pXBA 312] (FERM BP-2117) wuchs ausreichend in einem L-Medium, das 10 μg/ml dazu gegebenes Tetracyclin enthielt, bei 37°C, und Plasmid pXBA 312 wurde mit einem üblichen alkalischen Extraktionsverfahren [Nucleic acid Research, 7, 1513 (1979)] erhalten. Nachdem es vollständig mit dem Restriktionsenzym PstI verdaut worden war, wurde das vorliegende Plasmid einer Elektrophorese in 1 %igem Agarose-Gel unterworfen, wobei Agarose von Niedertemperaturschmelzqualität (hergestellt von Biorad) eingesetzt wurde. Nach der Anfärbung mit Ethidiumbromid wurde das DNA-Segment von etwa 3,6 kb herausgeschnitten, auf 70°C für 5 Minuten erhitzt, wonach ein Phenol-gesättigter TE-Puffer (10 mM Tris-chlorwasserstoffsäure, pH 8,0, 1 mM EDTA) in einer etwa gleich großen Menge zugefügt wurde. Die Mischung wurde gründlich durchmischt und anschließend zum Erhalt einer wässrigen Phase zentrifugiert. Eine Vektor-DNA wurde mittels Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen.
c) Präparation von rekombinantem Plasmid
Jede der im obigen Abschnitt (i) präparierten chromosomalen DNAs wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym PstI geschnitten, einer Agarose-Elektrophorese unterworfen, und DNA mit einer Größe von etwa 5,5 kb wurde in der selben Weise gewonnen wie der der oben erwähnten. Im Anschluss wurde die DNA an die Vektor-DNA, erhalten im Abschnitt (ii) mithilfe eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert.
d) Screening
Jede der in dem obigen Abschnitt (iii) hergestellten Ligationslösungen wurde in den BR-4-Stamm, der ein Biotin benötigender Stamm ist, mutiert aus Escherichia coli JA 221, beschrieben in der Ungeprüften Japanischen Patent-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 62-155081, mithilfe eines konventionellen Calcium-Verfahrens eingebracht [Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53, 109 (1970)]. Die auf einem Minimal-Agarplattenmedium mit dazu zugesetztem Tetracyclin von 10 μg ohne Zugabe von Biotin (0,5% Glucose, 0,4% Ammoniumsulfat, 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,4% vitaminfreie Casaminosäure, 0,002% Tryptophan, 1,5% Agar) gewachsene Kolonie, wuchs ausreichend in einem L-Medium mit 10 μg/ml dazu zugesetztem Tetracyclin bei 37°C, und jede der Plasmid-DNAs wurde mit einer gebräuchlichen Alkali-Methode erhalten.
Von jedem der extrahierten Plasmide wurde, nachdem sie mit zwei Typen von Restriktionsenzymen, NcoI und EcoRI, vollständig verdaut worden waren, das Plasmid mit derselben Richtung des Biotin-Operon-Inserts wie jene von pXBA 312 selektiert, indem sein Agarose-Elektrophorese-Muster beachtet wurde, wodurch das rekombinante Plasmid pAMP 64, abstammend aus DRAT 6, das rekombinante Plasmid pAMP 72, abstammend aus DRAT 7, das rekombinante Plasmid pAMP 82, abstammend aus DRAT 8 bzw. das rekombinante Plasmid pAMP 912, abstammend aus DRAT 9, erhalten wurde.
(4) Nukleotidbestimmung
Die DNA-Sequenzen der Biotin-Operator-Regulatorregion und in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons wurden durch eine Didesoxy-Kettenterminations-Methode [(Messing, J., Methods Enzymol., 101, 20 (1983)] ermittelt. In jede der BamHI- und SphI-Restriktionsenzymschnittstellen von M13 mp18 RF DNA und M13 mp19 RF DNA (eingekauft von Takara Shuzo) wurde jedes der BamHI- und SphI-Schnittstellenfragmente von etwa 3,8 kb von jedem der rekombinanten Plasmide, pAMP 64, pAMP 72, pAMP 82 und pAMP 912, enthaltend eine DNA-Region der Biotin-Operator-Regulatorregion und in der Nachbarschaft des bioB-Initiationscodons, insertiert. Escherichia coli JM 105-Zellen, die mit jedem der resultierenden rekombinanten Phagen infiziert worden waren, wurden ausreichend in einem 2 × YT-Medium (1,6% bact-Tripton, 1% bact-Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid) bei 37°C gezüchtet. Zu dem Überstand wurden 17 Vol.-% von 20% PEG (Polyethylenglycol 6 000)-2,5N-Natrtriumchloridlösung zugesetzt, um Phagen zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde in einem TE-Puffer gelöst, mit Phenol behandelt, und die wässrige Phase wurde mit Ethanol präzipitiert. Nach der Zentrifugation wurde bzgl. der Einzelstrang-DNA, verfestigt durch trocknen, die Reaktion durch die Didesoxy-Kettenterminations-Methode ausgeführt, wobei ein von Takara Shuzo hergestellter M 13-Sequenzierungskit und [α-32-P]-dCTP (14,8 Tbq/mmol), hergestellt von Amersham benutzt wurden. Die Kurzdarstellung dieser Reaktion ist wie folgt:
Die 17 b-Primer-DNA (5'-CAGATATGGCGTTGGTC-3'), die zu einem Teil der für bioA codierenden Region des Escherichia coli-Biotin-Operons korrespondiert, wurde an die oben erwähnte Einzelstrang-DNA (M13 mp 19-Typ) annealt.
Getrennt davon wurde in ähnlicher Weise die 17 b-Primer-DNA (5'-ATTCTGTGACTTGCGAC), korrespondierend zu einem Teil der für bioB codierenden Region des Escherichia coli-Biotin-Operons, an die Einzelstrang-DNA vom M13 mp 18-Typ annealt. Diese zwei Primer sind genau in der Form, in der sie die Biotin-Operon-Regulatorregion dazwischenstellen. Die DNA-Verlängerungsreaktion von dem Primer aus wurde unter Verwendung eines Klenow-Enzyms ausgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wurde [α-32-P]-dCTP eingebaut, um mit einem Radioisotop zu markieren. Darüber hinaus wurden Reaktionssysteme zum Zweck der Kettentermination, wobei jedes ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP enthielt, zubereitet, und dann wurden sie reagieren gelassen. Ein Satz, zusammengesetzt aus vier Reaktionsflüssigkeiten, jede versetzt mit den Didesoxynucleotiden, wurde einer Elektrophorese mit einem 8%-igen Polyacrylamidgel (40 cm, 0,3 mm dick), enthaltend 7,5 M Harnstoff, bei einer konstanten Spannung von 200 V unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel an ein Whatman 3MM-Papier adhäriert, in einem von Biorad hergestellten Geltrockner getrocknet und autoradiographiert. Es wurde danach bei Raumtemperatur über Nacht unter Verwendung eines Röntgenstrahl-Films, produziert von Fuji Film, exponiert und anschließend entwickelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Von den obigen Ergebnissen her kann verstanden werden, dass die Biotin-Operons, die aus DRAT 6, DRAT 7 und DRAT 9 stammen, die Biotin-Operons in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind.
Beispiel 2
Herstellung von Biotin-Vitameren
Die oben genannten DRAT-Stämme und BR-4-Stämme, die rekombinantes pAMP-Plasmid enthielten, wurden von einem Agar-Aufbewahrungsmedium mit einer Platinöse in ein L-Medium (mit 20 μg/ml dazu zugesetztem Tetracyclin im Falle eines bakteriellen Stammes, der das rekombinante Plasmid enthält) überführt, um bei 37°C für 8–12 Stunden als eine Vorkultur in Kultur genommen zu werden. 0,2 ml von jeder vorkultivierten Lösung wurden in einen 500 ml-Kolben überimpft, der 20 ml H-Medium (17,6 g Dinatriumhydrogenphosphat (12-Hydrat), 2,4 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 4,0 g/l Ammoniumsulfat, 10 g/l Hefeextrakt, 10 g Pepton, 0,1 g/l Eisen(II)sulfat (7-Hydrat), 0,05 g/l Manganchlorid (4-Hydrat), 0,1 g/l Magnesiumsulfat (7-Hydrat), 5,0 g/l Glucose, 5,0 g/l DL-Alanin, eingestellt auf pH=7,0) enthielt, und eine Schüttelkultur wurde bei 37°C über 24 Stunden ausgeführt, wonach die Messung der Menge der bakteriellen Zellen und der Menge des produzierten und akkumulierten Biotins erfolgten. Die Resultate sind in Tabelle 5 dargestellt.

Claims

DNA-Sequenz eines Biotin-Operons, durch die Tatsache gekennzeichnet, dass wenigstens ein Basenpaar, von entweder einer Nukleotidsequenz der Pribnow-Box des Promoters zur Rechten (bioB-Seite) der Regulatorregion des Biotin-Operons von Escherichia coli, oder einer Nukleotidsequenz in der Nachbarschaft des bioB-Initiationskodons, im Vergleich zu demjenigen in ihrem Wildtyp-Stamm, mutiert wird, wobei sich die Mutation bei der -53-sten oder -5-ten Position stromaufwärts oder innerhalb des Bereichs der 3-ten bis 5-ten Position stromabwärts befindet, wobei A von ATG des bioB-Initiationskodons als die erste Position angenommen wird.
Die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, wobei sich die Mutation wenigstens an einer der -53-sten oder -5-ten Position stromaufwärts und an der 4-ten Position stromabwärts befindet, wobei A von ATG des bioB-Initiationskodons als die erste Position angenommen wird.
Die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2, wobei wenigstens eines der GC-Paare in ein AT-Paar bei der -53-sten oder -5-ten Position stromaufwärts oder bei der 4-ten Position stromabwärts mutiert ist, wobei A von ATG des bioB-Initiationskodons als die erste Position angenommen wird.
Verfahren zur Herstellung von Biotin, gekennzeichnet durch Kultivierung von zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismen in einem Nährmedium, die mit rekombinanten, die DNA-Sequenz von Anspruch 1 tragendem Plasmid transformiert wurden, und Sammlung von Biotin von der Kultivierungsbrühe.