DE69732327T2

DE69732327T2 - Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin

Info

Publication number: DE69732327T2
Application number: DE69732327T
Authority: DE
Inventors: Akio Machida-shi Ozaki; Takeshi Hofu-shi Shibasaki; Hideo Machida-shi Mori; Akihiko Maruyama; Hiroaki Yokohama-shi Motoyama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1996-09-03
Filing date: 1997-09-03
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2017-09-04
Also published as: DE69732327D1; CN1178245A; EP0826773B1; JP3739143B2; CN1333074C; JPH1075788A; CA2209889C; KR100591499B1; DK0826773T3; EP0826773A2; KR19980024241A; TW581813B; KR100591500B1; EP0826773A3; CA2209889A1; ATE287959T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin unter Verwendung einer nicht menschlichen Transformante, die ein Gen enthält, das als L-Proln-4-hydroxylase beteiligt ist und eine verstärkte Prolin-Biosynthese-Aktivität besitzt. Trans-4-Hydroxy-L-prolin ist als eine Ausgangsverbindung für Arzneimittel wie Carbapenem-Antibiotika und N-Acetylhydroxyprolin zur Verwendung als Antiphlogistikum und als ein Nahrungsmittelzusatz verwendbar.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die folgenden Verfahren sind als Herstellungsverfahren für trans-4-Hydroxy-L-prolin bei Verwendung von Mikroorganismen bekannt:

1) Ein Verfahren, bei dem trans-4-Hydroxy-L-prolin aus 4-Hydroxy-2-oxoglutarsäure unter Verwendung von Mikroorganismen des Genus Escherichia hergestellt wird (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 266,995/91).
2) Ein Verfahren, bei dem trans-4-Hydroxy-L-prolin direkt durch Fermentation unter Verwendung von Bakterien oder Pilzen hergestellt wird ( EP 0 547 898 A2 und ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nrn. 236,980/93 und 245,782/94).
3) Ein Verfahren, bei dem trans-4-Hydroxy-L-prolin aus L-Prolin unter Verwendung von Mikroorganismen des Genus Streptomyces hergestellt wird (J. Biol. Chem., 254, 6684 (1979), Biochem. Biophys. Res. Comm., 120, 45, (1984), Tetrahedron Letters, 34, 7489 (1993), und Tetrahedron Letters, 35, 4649 (1994)).
4) Ein Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin durch Umwandlung von L-Polin in der Gegenwart einer Enzymquelle, die sich von einem Mikroorganismus ableitet, der zu dem Genus Dactylosporangium oder Amycolatopsis gehört und der die Hydroxylierung von L-Prolin in trans-4-Hydroxy-L-prolin, einem bivalenten Ion und 2- Ketoglutarsäure katalysiert (Europäische Patentveröffentlichung Nr. EP 0641862 ).
5) Ein Verfahren zur Herstellung von 4-Hydroxy-L-prolin durch die Umwandlung von 4-Hydroxy-2-oxoglutarsäure in einem wässrigen Medium in der Gegenwart eines Aminogruppenspenders und einer Enzymquelle, die zu dem Genus Escherichia gehört und die zur Umwandlung von 4-Hydroxy-2-oxoglutarsäure in 4-Hydroxy-L-prolin fähig ist (Europäische Patentveröffentlichung Nr. EP 0555475 ).
Schließlich wird ein Verfahren beschrieben, bei dem ein neuer Mikroorganismus des Genus Serratia zur Herstellung von L-Prolin verwendet wird (Europäische Patentveröffentlichung Nr. EP 0146929 ).

Die herkömmlichen Verfahren können nur schwer in einer industriellen Größenskala aus den folgenden Gründen durchgeführt werden:

1) Ein Substrat zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin wie 4-Hydroxy-2-oxoglutarsäure ist zu teuer und zu schwierig zu erhalten.
2) Die Produktivität von trans-4-Hydroxy-L-prolin ist niedrig.
3) Die Aktivität der Enzyme, die bei der Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin beteiligt sind, ist relativ schwach.

Bezüglich des Enzyms, das die Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin katalysiert, wurde berichtet, dass L-Prolin-4-hydroxylasen aus Dactylosporangium sp. RH1 (ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 322,885/95) und ein Mikroorganismus des oben erwähnten Genus Streptomyces aufgereinigt worden sind (Biochem. J., 313, 185 (1966)).
Es wurde auch berichtet, dass das Gen, das für L-Prolin-4-hydroxylase kodiert und das die Aktivität zur Umwandlung von freiem L-Prolin in trans-4-Hydroxy-L-prolin in der Gegenwart von 2-Ketoglutarsäure besitzt, von dem oben erwähnten Dactylosporangium sp. RH1 kloniert wurde; dass das Plasmid pRH71, das das L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält, erhalten wurde; dass das Plasmid pTr2-4OH, das zur Expression von L-Prolin-4-hydroxylase unter der Kontrolle des Tryptophan-Tandem-Promotors fähig ist, konstruiert wurde und dass das Gen in E. coli exprimiert wurde (The Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochem., Konferenz 1996, Collected Abstracts of Lecture, S. 257).
Es besteht ein Bedarf an einem Verfahren, bei dem trans-4-Hydroxy-L-prolin in industriell vorteilhafter Weise unter Verwendung von L-Prolin-4-hydroxylase mit einem hohen Aktivitätsspiegel hergestellt wird.
Andererseits wurde das Enzym, das im Prolin-Biosynthese-Weg beteiligt ist und das Gen, das für dieses Enzym kodiert, in E. coli, etc. beschrieben (J. Gen. Microbiol., 118, 287 (1980); Biochim. Biophys. Acta., 104, 397 (1965)).
Es war auch bekannt, dass die Prolin-Biosynthese durch γ-Glutamylkinase reguliert ist, welches das erste Enzym ist, das im Prolin-Biosynthese-Weg beteiligt ist und einer Feedback-Inhibition mit Prolin in E. coli, etc. ausgesetzt ist (Biochim. Biophys. Acta., 192, 462 (1969)).
Darüber hinaus war bekannt, dass GK, die gegenüber der Feedback-Inhibition mit Prolin desensibilisiert war, durch Mutieren des Gens, proB, das für GK kodiert, konstruiert wurde und dass ein Mikroorganismus, der L-Prolin in effektiver Weise herstellt, unter Verwendung des mutierten Gens erhalten wurde (Mol. Gen. genet., 182, 82 (1981); J. Bateriol., 156, 1249 (1983); J. Bateriol., 164, 1088 (1985)). Als das mutierte proB-Gen war proB74 bekannt. Es war bekannt, dass eine Mutation von proB74 durch Substitution von G, welches das 319. Nukleotid der 5' terminalen kodierenden Region von proB ist, mit A, was einer Substitution von Asparaginsäure, welche die 107. Aminosäure des N-Terminus des proB Proteins ist, zu Asparagin entspricht, durchgeführt werden kann (Gene, 64, 199 (1988)).
Die Enzyme, die beim Abbau von Prolin beteiligt sind, die Gene, die für diese Enzyme kodieren und die Regulation dieser Gene sind auch aufgrund der fortgeschrittenen Forschung in E. coli, dem Genus Salmonella, etc. bekannt (J. Bacteriol., 146, 895 (1981); J. Mol. Biol., 148, 895 (1981)).
Allerdings war ein Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der eine verstärkte Prolin-Biosynthese-Aktivität aufweist, nicht bekannt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein effizientes Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin auf einer industriell anwendbaren Basis bereitzustellen und die zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine neue nicht menschliche Transformante bereitzustellen, welche die Hydroxylierung von L-Prolin an der 4-Position von L-Prolin katalysiert und die für das oben genannte Verfahren verwendbar ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine nicht menschliche Transformante bereitzustellen, die eine rekombinante DNA trägt, die ein Gen enthält, das für L-Prolin-4-hydroxylase kodiert und die zur Expression des Gens mit einer hohen Wirksamkeit fähig ist und die eine verstärkte Prolin-Biosynthese-Aktivität zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin in industriell vorteilhafter Weise in einem Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin, das in effizienter Weise L-Prolin-4-hydroxylase verwendet, aufweist sowie ein Verfahren zur industriellen Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin unter Verwendung der Transformante bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine nicht menschliche Transformante mit einem Vektor, der ein DNA-Fragment umfasst, das ein Gen enthält, das für ein Protein kodiert, das die enzymatische Aktivität zur Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin besitzt und das auf freies L-Prolin in der Gegenwart von 2-Ketoglutarsäure und bivalenten Eisen-Ionen wirkt, um trans-4-Hydroxy-L-prolin herzustellen und wobei die Transformante eine erhöhte Anzahl von Kopien eines Gens umfasst, das für ein Enzym kodiert, das an der Biosynthese von L-Prolin beteiligt ist, wobei ein Prolin-Biosynthese-Gen, das für ein Enzym kodiert, das einer Feedback-Inhibition mit Prolin ausgesetzt ist, mutiert wurde, um die Feedback-Inhibition mit Prolin zu verringern oder wobei die Prolinabbauaktivität in dem Wirt ausgeschaltet wurde, um die Prolin-Biosynthese-Aktivität zu verstärken, und ein Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin, das die Kultivierung der Transformante in einem Medium; das Ermöglichen von L-Prolin mit 2-Ketoglutarsäure, einem bivalenten Eisen-Ion in der Gegenwart von Zellen der kultivierten Transformante als Enzymquelle nebeneinander vorzuliegen, um L-Prolin in trans-4-Hydroxy-L-prolin umzuwandeln; und das Entfernen von trans-4-Hydroxy-L-prolin aus dem wässrigen Medium, umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Plasmids pTr2-4OHΔ. In der Zeichnung bezeichnen die fettgedruckten, ausgefüllten schwarzen Linien einen Teil, der ein L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält. Ap bezeichnet ein pBR322-abgeleitetes Ampicillin-Resistenzgen; und Ptrpx2 bezeichnet einen Promotor, der aus zwei hin tereinandergeschalteten Promotoren des von Escherichia coli abgeleiteten Tryptophanoperons zusammengesetzt ist (Tryptophan-Tandem-Promotor). Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
2 zeigt die Schritte zur Herstellung des Plasmids pWFH1. In der Zeichnung bezeichnen die fettgedruckten, schraffierten Linien jeweils eine Stelle, in der ein mit Hind III und Sal I behandeltes amplifiziertes PCR-Fragment eingeführt wird. Die fettgedruckten, ausgefüllten schwarzen Linien bezeichnen jeweils einen Teil, der ein von Dactylosporangium sp. RH1 abgeleitetes L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält. Ap bezeichnet ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-Resistenzgen; und Ptrpx2 bezeichnet einen Promotor, der aus zwei hintereinandergeschalteten Promotoren des von Escherichia coli abgeleiteten Tryptophanoperons zusammengesetzt ist (Tryptophan-Tandem-Promotor). Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
3 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Plasmids pBAB51. In der Zeichnung bezeichnen die fettgedruckten, schraffierten Linien jeweils die Prolin-Biosynthese-Gene proB74 und proA. Ap bezeichnet ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-Resistenzgen; lacZ bezeichnet ein β-Galaktosidase-α-Fragment-Konstruktionsgen; und Tc bezeichnet ein von pBR322 abgeleitetes Tetracyclin-Resistenzgen. Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
4 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Plasmids pPRO74. In der Zeichnung bezeichnen die fettgedruckten, schraffierten Linien jeweils die Prolin-Biosynthese-Gene proB74 und proA. Die dicken, ausgefüllten schwarzen Linien in den fettgedruckten, schraffierten Linien bezeichnen das proB74 Gen, das ein Basenpaar enthält, das sich von dem proB Gen unterscheidet. Tc bezeichnet ein von pBR322 abgeleitetes Tetracyclin-Resistenz-Gen. Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
5 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Plasmids pPF1. In der Zeichnung bezeichnen die fettgedruckten, schraffierten Linien jeweils die Prolin-Biosynthese-Gene proB74 und proA. Cm^r bezeichnet ein von Tn9 abgeleitetes Chloramphenicol-Resistenzgen; pACYC.ori bezeichnet einen von pACYC184 abgeleiteten Replikationsorigin; Plac bezeichnet einen lac-Promotor; lacZ bezeichnet ein β-Galaktosidase-α-Fragment-Konstruktionsgen; und lacZ.Nterm-proB74 bezeichnet das Gen, das für ein Protein kodiert, das die N-terminalen Aminosäuren des β-Galactosidase-α-Fragments mit einem durch proB74 kodiertes Protein vereinigt. Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
6 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Plasmids pBII-4OH. In der Zeichnung bezeichnen die fettgedruckten, ausgefüllten schwarzen Linien jeweils einen Teil, der ein L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält. Ap bezeichnet ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-Resistenzgen; und lacZ bezeichnet ein β-Galaktosidase-α-Fragment-Konstruktionsgen. Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
7 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Plasmids pBII-4OHBA. In der Zeichnung bezeichnen die fettgedruckten, ausgefüllten schwarzen Linien jeweils einen Teil, der ein L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält. Ap bezeichnet ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-Resistenzgen; und lacZ bezeichnet das β-Galaktosidase-α-Fragment-Konstruktionsgen. Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
8 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Plasmids pWFP1. In der Zeichnung bezeichnen die fettgedruckten, ausgefüllten schwarzen Linien jeweils einen Teil, der ein L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält. Die fettgedruckten, schraffierten Linien bezeichnen jeweils die Prolin-Biosynthese-Gene proB74 und proA. Ap bezeichnet ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-Resistenzgen; und lacZ bezeichnet das β-Galaktosidase-α-Fragment-Konstruktionsgen. Ptrpx2 bezeichnet einen Promotor, der aus zwei hintereinandergeschalteten Promotoren des von Escherichia coli abgelei teten Tryptophanoperons zusammengesetzt ist (Tryptophan-Tandem-Promotor). Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
9 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Plasmids pTr2-4OH. In der Zeichnung bezeichnet die fettgedruckte, ausgefüllte schwarze Linie einen Teil, der ein L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält. Ap bezeichnet ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-Resistenzgen; und Ptrpx2 bezeichnet einen Promotor, der aus zwei hintereinandergeschalteten Promotoren des von Escherichia coli abgeleiteten Tryptophanoperons zusammengesetzt ist (Tryptophan-Tandem-Promotor). Die Pfeile bezeichnen jeweils die Richtung, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Zeichnung sind nur solche Restriktionsenzymstellen gezeigt, die bei der Konstruktion des Plasmids eine Rolle spielen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die L-Prolin-4-hydroxylasen sind Enzyme, welche die Umsetzung, bei der freies L-Prolin hydroxyliert ist, in der Gegenwart von 2-Ketoglutarsäure und einem bivalenten Ion katalysieren, um trans-4-Hydroxy-L-prolin zu erzeugen.
Als Plasmide, die die DNA enthalten, die für die L-Prolin-4-hydroxylase kodieren, können beispielsweise pRH71, etc. genannt werden. Escherichia coli SOLR/pRH71, welches Escherichia coli SOLR entspricht, welches pRH71 enthält, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology of the Agency of Industrial Science and Technology in 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan am 2. März 1995 unter FERM BP-5025 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.
Um das so erhaltene L-Prolin-4-hydroxylase-Gen in dem Wirt zu exprimieren, wird das DNA-Fragment, welches das L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält, zuerst durch eine Restriktions-Endonuclease oder einer anderen Desoxyribonuclease gespalten, um ein DNA-Fragment mit einer geeigneten Länge zu erzeugen, welches das L-Prolin-4-hydroxylase-Gen enthält. Das so gebildete DNA-Fragment wird in einen Expressionsvektor an der stromabwärtsgelegenen Position des darin gelegenen Promotors eingeführt und danach wird der Expressionsvektor mit der so eingeführten DNA in eine Wirtszelle eingeführt, die für den Expressionsvektor geeignet ist.
Es kann jede Wirtszelle verwendet werden, solange das bestimmte Gen in der Wirtszelle exprimiert werden kann. Beispiele solcher Wirtszellen sind mikrobielle Zellen eines Mikroorganismus, der zu dem Genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas und Bacillus etc. angehört, sowie Hefestämme, Tierzellstämme etc.
Es kann ein Expressionsvektor, der in der oben erwähnten Wirtszelle autonom replizierbar ist oder der zur Insertion in ein Chromosom fähig ist und der einen Promotor an der Position enthält, an der das L-Prolin-4-hydroxylase-Gen transkribiert werden kann, verwendet werden.
Wenn Mikroorganismen wie Escherichia coli oder dergleichen als Wirtszelle verwendet werden, ist es ratsam, dass der Expressionsvektor autonom in den Mikroorganismen repliziert wird und aus einem Promotor, einer Ribosomenbindungssequenz wie einer Shine-Dargarno-Sequenz, einem L-Prolin-4-hydroxylase-Gen und einer Transkriptionsterminationssequenz besteht. Es kann ein Regulations-Gen darin enthalten sein.
Als Beispiele des Expressionsvektors werden pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (alle kommerziell erhältlich von Boehringer Manheim Co.); pKYP10 (siehe ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 110600/83); pKYP200 (siehe Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)); pLSA1 (siehe Agric. Biol. Chem, 53, 277 (1989)); pGEL1 (siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 4306 (1985)); pBluescript (hergestellt von STRATAGENE Co.); pTrs30 (hergestellt von Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407); pTrs32 (hergestellt von Escherichia coli JM109/pTrs32 (FERM BP-5408)), etc. genannt.
Als Promotor ist jeder beliebige Promotor geeignet, der zur Expression in Wirten wie Escherichia coli fähig ist. Zum Beispiel werden Promotoren, die von Escherichia coli, Phage, etc. stammen, wie trp-Promotor (Ptrp), lac-Promotor (Plac), P_L-Promotor und P_R-Promotor genannt. Auch sind artifiziell entworfene und modifizierte Promotoren verwendbar wie Ptrpx2, der hergestellt wird, indem zwei Ptrps in Reihe geschaltet werden sowie der tac-Promotor (ptac).
Als die Ribosomenbindungssequenz kann jede beliebige verwendet werden, die fähig ist, in Wirten wie Escherichia coli exprimiert zu werden. Jedoch ist es wünschenswert, Plasmide zu verwenden, die eine Ribosomenbindungssequenz und ein Initiati onscodon besitzen, die mit ausreichenden Intervallen voneinander getrennt sind (z.B. durch 6 bis 18 Basen).
Das L-Prolin-4-hydroxylase-Gen umfasst ein beliebiges und jedes Gen, das für eine L-Prolin-4-hydroxylase kodiert. Jedoch ist es wünschenswert, dass die Basen, welche die DNA-Sequenz des Gens ausmachen, in geeigneter Weise substituiert sind, so dass die substituierte DNA-Sequenz aus Codons zusammengesetzt ist, die zur Expression in den verwendeten Wirtsorganismen am meisten geeignet sind. Als Beispiele für L-Prolin-4-hydroxylase-Gene, bei denen die konstitutiven Basen substituiert worden sind, um sie in Codons zu modifizieren, die am besten für deren Expression geeignet sind, ist die Nukleotidsequenz der Sequenz Nr. 1 etc. genannt.
Transkriptionsterminationssequenzen sind für die Expression der erfindungsgemäßen Gene nicht immer notwendig. Jedoch ist es wünschenswert, dass eine Transkriptionsterminationssequenz unmittelbar nach dem Struktur-Gen angeordnet ist.
Beispiele von Wirtszellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli Nr. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, etc.
Wenn ein Hefestamm als Wirtszelle verwendet wird, können z.B. YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), etc. als Expressionsvektor verwendet werden.
Als Promotor kann jeder beliebige Promotor verwendet werden, der in der Wirtszelle des Hefestamms exprimiert werden kann. Als Beispiele für Promotoren können Promotoren von glykolytischen Genen wie Hexosekinase, gall-Promotor, gal 10-Promotor, Hitzeschockproteinpromotor, MFα1-Promotor und CUP 1-Promotor verwendet werden.
Als Beispiele von Wirtszellen können Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans und Schwanniomyces alluvius etc. genannt werden.
Wenn Tierzellen als Wirtszellen in vitro verwendet werden, können beispielsweise pcDNA I/Amp, pcDNA I und pcDM8 (alle kommerziell erhältlich von Funakosi Co.) etc. als Expressionsvektor verwendet werden.
Als Promotor kann jeder beliebige Promotor verwendet werden, der in der Wirtszelle der Tierzellen exprimiert werden kann. Zum Beispiel kann ein Promotor eines IE-(immediate early)-Gens des humanen CMVs etc. verwendet werden. Es kann ein Enhancer des IE-Gens des humanen CMV zusammen mit dem Promotor verwendet werden.
Als Beispiele für Wirtszellen können Namalwa, HBT5637 (japanische ungeprüfte veröffentlichte Patentanmeldung Nr. 299/88), COS-Zellen, CHO-Zellen, etc. verwendet werden.
Zur Einführung von DNA in Tierzellen in vitro kann ein beliebiges und jedes Verfahren hierbei eingesetzt werden, das zur Einführung von DNA in Tierzellen fähig ist. Zum Beispiel sind Elektroporationsverfahren (siehe Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133 (1990)), Calciumphosphatverfahren (siehe japanische ungeprüfte veröffentlichte Patentanmeldung Nr. 227075/90), Lipofektionsverfahren (siehe Philip L. Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)) etc. einsetzbar. Die entstehenden Transformanten können gesammelt werden und entsprechend den in der japanischen ungeprüften veröffentlichten Patentanmeldung Nr. 227075/90 und 257891/90 beschriebenen Verfahren kultiviert werden.
Um die Prolin-Biosynthese-Aktivität der Wirte zu verstärken, sind Mittel zum Erhöhen der Anzahl der Kopien des Gens, das für ein Enzym kodiert, das bei der Biosynthese von L-Prolin beteiligt ist (hier als „Prolin-Biosynthese-Gen" bezeichnet) in den Wirten, ein Mittel zur Mutation eines Prolin-Biosynthese-Gens, das einer Feedback-Inhibition mit Prolin ausgesetzt werden soll, um ein mutantes Gen zu erzeugen, das für ein Enzym kodiert, das bei der Prolin-Biosynthese beteiligt ist und bei dem die Feedback-Inhibition mit Prolin stark reduziert ist (hier als „Prolinbiosynthetase" bezeichnet) gefolgt von der Einführung des entstehenden Mutanten- Gens in die Wirte, ein Mittel zum Entfernen der Prolinabbauaktivität von den Wirten und auch eine Kombination beliebiger dieser Mittel einsetzbar.
Das Prolin-Biosynthese-Gen oder das mutante Gen, das für eine Prolinbiosynthetase kodiert, kann auf den Chromosomen der Wirte vorkommen oder kann auch in den Vektoren wie Plasmiden in den Wirten vorkommen.
Es kann jedes beliebige Gen verwendet werden, so lange das Gen für eine Prolinbiosynthetase kodiert. Das Gen, das für ein Prolinbiosynthetaseenzym kodiert, das stark aufgrund der Feedback-Inhibition mit Prolin desensibilisiert ist, kann beispielsweise ein Gen proB74, wie das oben erwähnte, ein Gen DHP^TproB (Gene, 39, 109 (1984)) etc. umfassen. Im Fall einer Koexistenz eines beliebigen Prolin-Biosynthese-Gens und des mutanten Gens, das für eine Prolinbiosynthetase kodiert, und einem L-Prolin-4-hydroxylase-Gen in Vektoren wie Plasmide in dem selben Wirt können die Gene entweder auf einem einzelnen Plasmid oder auf mehreren, koexistierbaren Plasmiden vorkommen.
Bei den Plasmiden von E. coli umfasst beispielsweise die Kombination solcher koexistierbaren Plasmide ein Plasmid der Colicin-E1-Familie (z.B. pBR322) und ein Plasmid der pACYC-Familie; ein Plasmid der Colicin-E1-Familie und ein Plasmid der F-Faktor-Familie; und ein Plasmid der Colicin-Familie E1 und ein Plasmid der R-Faktor-Familie.
Um das Prolin-Biosynthese-Gen in dem Wirt zu exprimieren, ist das selbe Verfahren wie das oben zur Expression des L-Prolin-4-hydroxylase-Gens erwähnte einsetzbar.
Der Wirt, der eine Prolinabbauaktivität verliert, kann erhalten werden, indem der Stamm, der weiße Kolonien auf der Pro-TTC-Platte bildet (Appl. Environ. Microbiol., 33, 434 (1977)) nach dem Verarbeiten des Wirts mit dem Mutagen ausgewählt wird.
Es ist bekannt, dass E. coli dessen Fähigkeit zur Assimilation von Prolin verlieren soll, wenn ein Transposon in eine geeignete Stelle von dessen put-Gen eingeführt wird (Genetics, 92, 741 (1979)). Bei E. coli wird daher ein Transposon darin eingeführt und ein mutantes E. coli, das dessen Prolinabbauaktivität verloren hat, kann auch über einen chemischenResistenztest und einem Zellwachstumstest auf einer Pro-TTC-Platte ausgewählt werden.
Die Mutante, die ihre Prolinabbauaktivität aufgrund der Einführung eines Transposons darin verloren hat, kann einer P1-Transduktion ausgesetzt werden (A Short Course In Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Esherichia coli and Related Bacteria, J. H. Miller, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1922, Laboratory Manual, Seiten 263), um dadurch dessen charakteristisches Fehlen einer Prolinabbauaktivität in einen anderen Stamm zu übertragen.
Die nicht menschliche Transformante, die aus Wirtszellen mit einer verstärkten Prolin-Biosynthese-Aktivität erhalten wird, wird durch ein herkömmliches Kultivierungsverfahren kultiviert.
Das Medium zum Kultivieren dieser mikrobiellen Transformanten wie Escherichia coli, Hefestämme oder dergleichen können beliebige natürliche Medien oder synthetische Medien sein, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze etc. enthalten, die von den Mikroorganismen assimiliert werden können.
Es können beliebige Kohlenstoffquellen, die von den Mikroorganismen assimiliert werden können, verwendet werden. Beispiele solcher Kohlenstoffquellen umfassen Kohlenhydrate wie Glukose, Fruktose, Saccharose, Melasse, die diese Bestandteile enthält, Stärke und Stärkehydrolysate; organische Säuren wie Essigsäure und Propionsäure und Alkohole wie Ethanol und Propanol.
Als Stickstoffquellen können Ammonium, Ammoniumsalze von anorganischen und organischen Säuren wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumazetat und Ammoniumphosphat, andere Stickstoff enthaltende Verbindungen, Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Getreidebrei, Caseinhydrolysate, Sojabohnenplätzchen, Sojabohnenplätzchenhydrolysate, kultivierte fermentierte Zellen, deren verdaute Produkte, etc. verwendet werden.
Als anorganische Salze können Kaliumdihydrogenphosphate, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumcarbonat etc. verwendet werden.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z.B. als Schüttelkultur oder als mit Luft eingeblasene Rührkultur. Die Temperatur der Kultivierung beträgt 15 bis 40°C. Der Zeitraum für die Kultivierung beträgt gewöhnlicher Weise 16 bis 100 Stunden. Während der Kultivierung wird der pH des Mediums auf 3,0 bis 9,0 gehalten. Der pH wird unter Verwendung von anorganischen oder organischen Salzen, alkalischen Lösungen, Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammonium oder dergleichen angepasst.
Antibiotika wie Ampicillin, Tetracyclin oder dergleichen können dem Medium während der Kultivierung falls notwendig zugesetzt werden. Zur Kultivierung der Mikroorganismen, die mit dem Expressionsvektor unter Verwendung des induzierbaren Promotors transformiert worden sind, können dem Medium falls notwendig Inducer zugesetzt werden. Zum Beispiel kann zur Kultivierung von Mikroorganismen, die mit dem Expressionsvektor unter Verwendung des lac-Promotors transformiert worden sind, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) dem Medium zugesetzt werden. Zur Kultivierung von Mikroorganismen, die mit dem Expressionsvektor unter Verwendung des trp-Promotors transformiert worden sind, kann Indolylacrylsäure (IAA) dem Medium zugesetzt werden.
Als Medium zur Kultivierung der nicht menschlichen Transformanten, die unter Verwendung der Tierzellen als Wirtszelle erhalten wurden, wird gewöhnlicher Weise RPMI1640-Medium und Eagle's MEM-Medium verwendet oder es können Kulturmedien verwendet werden, die fötales Kälberserum enthalten. Die Kultivierung der Zellen wird in Gegenwart von 5% CO₂ durchgeführt. Die Temperatur der Kultivierung beträgt vorzugsweise 35 bis 37°C und der Zeitraum für die Kultivierung beträgt gewöhnlicher Weise 3 bis 7 Tage.
Antibiotika wie Kanamycin, Penicillin oder dergleichen können dem Medium während der Kultivierung falls notwendig zugesetzt werden.
Es wird eine beträchtliche Menge an L-Prolin-4-hydroxylase in den so kultivierten Transformanten im Vergleich zu rekombinantem E. coli, der pTr2-4OH enthält und dem Mikroorganismusstamm, der als Genquelle verwendet wurde, wie Dactylosporangium sp. RH1 oder dergleichen, hergestellt und angehäuft. Daher kann die Isolierung und Aufreinigung des Enzyms oder die Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin aus L-Prolin unter Verwendung des Enzyms weit effizienter durchgeführter werden im Vergleich zu der Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin aus L-Prolin unter Verwendung von nicht genetisch modifizierten Mikroorganismen als Genquelle wie Dactylosprangium sp. RH1 oder dergleichen.
Die Herstellung von L-Prolin-4-hydroxylase in den Transformanten kann durchgeführt werden, indem die Kultur oder die Zellen zu einem wässrigen Medium zugesetzt werden, das für die enzymatische Reaktion zusammen mit L-Prolin, einem bivalenten Eisenion und 2-Ketoglutarsäure geeignet ist und indem ein Überstand oder ein organisches Lösungsmittel falls notwendig zugesetzt wird, um zu bestimmen, dass trans-4-Hydroxy-L-prolin hergestellt worden ist. Bezüglich der Aktivität der L-Prolin-4-hydroxylase, die in der Zelle gebildet wird, wird die Aktivität des Enzyms zur Herstellung von 1 nmol trans-4-Hydroxy-L-prolin für eine Minute unter den folgenden Bedingungen als eine Einheit (E) definiert. Es wird auf die Mikroorganismuszellen und die Tierzellen hier als Zellen Bezug genommen.
MESSUNG DER L-PROLIN-4-HYDROXYLASE-AKTIVITÄT:
Die Zellen, die behandelten Zellen oder die Enzympräparation werden zu 240 mM MES (2-(N-morphorino)ethansulfonsäure)-Puffer, enthaltend 12 mM L-Prolin, 24 mM 2-Ketoglutarsäure, 4 mM Eisensulfat und 8 mM L-Ascorbinsäure zugesetzt, um insgesamt 250 μl herzustellen. Das Gemisch wird bei 35°C für 10 Minuten gehalten. Das Reaktionsgemisch wird auf 100°C für 2 Minuten erhitzt, um die Reaktion zu stoppen und die Menge an hergestelltem trans-4-Hydroxy-L-prolin in dem Reaktionsgemisch wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (hier als HPLC bezeichnet) bestimmt.
Zur Bestimmung kann ein beliebiges Verfahren, das zur Bestimmung der Menge an trans-4-Hydroxy-L-prolin geeignet ist, eingesetzt werden. Zum Beispiel ist im Allgemeinen ein Nachsäulenderivatisierungsverfahren verwendbar, bei dem trans-4-Hydroxy-L-prolin in dem Reaktionsgemisch aufgetrennt wird und unter Verwendung einer Liganden-Austauschchromatographiesäule wie SUMCHIRAL OA5000, hergestellt von Sumika Chemical Analysis Service Limited, eluiert werden etc. und danach wird trans-4-Hydroxy-L-prolin mit 7-chlor-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (hier als NBD bezeichnet) derivatisiert und dann wird derivatisiertes trans-4-Hydroxy-L-prolin nachgewiesen; sowie einem Vorsäulenderivatisierungsverfahren bei dem die zu bestimmende Verbindung in dem Reaktionsgemisch zuvor mit NBD umgesetzt worden ist, um dessen NBD-Derivat zu bilden, wobei das Derivat durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung von HPLC aufgetrennt wird und das so aufgetrennte Derivat nachgewiesen wird (Analytical Biochemistry, 138, 390 (1984)) verwendbar. Der Nachweis des NBD-Derivats wird durchgeführt, indem die Fluoreszenz von dessen NBD-Derivat (Anregungswellenlänge: 503 nm, Emissionswellenlänge: 541 nm) gemessen wird.
Die kultivierten Transformantenzellen, bei denen festgestellt wurde, dass sie darin hergestellte L-Prolin-4-hydroxylase enthalten, können unter den selben Bedingungen wie oben, bei denen die Transformantenzellen kultiviert worden sind, kultiviert werden, um die Zellen dazu zu bringen, dass sie trans-4-Hydroxy-L-prolin in den Zellen herstellen und anhäufen. Das so hergestellte trans-4-Hydroxy-L-prolin kann aus der Kultur gewonnen werden.
Wenn erwünscht können 2-Ketoglutarsäure und bivalente Eisenionen zu den Medien während der Kultivierung der Transformantenzellen zugesetzt werden.
Das durch die vorliegende Erfindung hergestellte trans-4-Hydroxy-L-prolin kann quantitativ durch das oben erwähnte Nachsäulenderivatisierungsverfahren oder das Vorsäulenderivatisierungsverfahren quantitativ bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer beschrieben.
BEISPIEL 1: KONSTRUKTION EINES HOCHEXPRESSIONSPLASMIDS FÜR L-PROLIN-4-HYDROXYLASE
Es wurden eine DNA wie in Sequenz Nr. 2 bezeichnet und eine DNA wie in Sequenz Nr. 3 bezeichnet unter Verwendung eines DNA-Synthetisiergerätes 380A (hergestellt von Applied Biosystems Co.) synthetisiert. Diese DNA wurden so entworfen, dass deren 3' terminalen 25 bp komplementär zueinander sind. Diese DNA haben jeweils eine Nukleotidsequenz, die für die N-terminale Stelle von Dactylosporangium sp. RH1 abgeleiteten L-Prolin-4-hydroxylase-Protein kodiert, in dem die Nukleotidsequenz stellespezifisch substituiert wurde, um ein Codon zu erzeugen, das zu deren Expression in Escherichia coli am besten geeignet ist.
Unter Verwendung dieser synthetischen DNA als Primer und Matrices wurde eine PCR durchgeführt. Die Reaktion wurde unter Verwendung von 20 μl eines Reaktionsgemisches enthaltend 0,5 E Pfu DNA Polymerase (hergestellt von STRATAGENE Co.), 2 μl 10 × Puffer für Pfu DNA Polymerase, 2 μl DMSO, 1 μl 2,5 mM dNTP, 2 μM der synthetischen DNA mit der Sequenz Nr. 2 und 2 μM der synthetischen DNA der Sequenz Nr. 3 durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 96°C für 5 Minuten inkubiert. Danach wurde eine dreistufige Inkubation, nämlich bei 96°C für 2 Minu ten, bei 50°C für eine Minute und bei 75°C für eine Minute insgesamt 35 mal wiederholt.
Nachdem das entstandene Reaktionsgemisch einer 15%igen Polyacrylamidgeleletrophorese ausgesetzt wurde, wurde die Bildung eines amplifizierten 107 bp-Fragments beobachtet.
Das amplifizierte Fragment wurde aus dem Gel unter Verwendung von da Vinci Kun (Pen Touch Recovery NB-7000 Modell), hergestellt von Nippon Eido K.K., gewonnen. Dann wurden die beiden Termini des so gewonnenen 107 bp-DNA-Fragments mit Hind III und Sal 1 gespalten und das so verarbeitete Fragment wurde unter Verwendung von MERmaid Kit (hergestellt von Bio, Inc.) gewonnen.
Die Menge der so gewonnenen Flüssigkeit betrug 16 μl.
Plasmid pTr2-4OH-DNA, die gemäß dem in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Verfahren konstruiert wurde, wurde mit Bam H1 und Pvu II gespalten. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, durch die die Bildung von zwei Fragmenten beobachtet wurde. Von diesen wurde das längere Fragment mit dem Struktur-Gen der L-Prolin-4-hydroxylase unter Verwendung von Prep-A-Gene (hergestellt von Biorad Co.) isoliert und dessen Termini wurden unter Verwendung eines blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) blunt-endig gemacht und dann unter Verwendung eines Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) zyklisiert.
Mit dem so erhaltenen Plasmid wurde der E. coli JM109-Stamm in gewohnter Weise transformiert und die entstandenen Transformantenzellen wurden auf LB-Agar-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthält, ausgebreitet und dann darauf über Nacht bei 37°C kultiviert.
Ein Plasmid wurde aus den gewachsenen Kolonien der Transformantenzellen auf gewöhnliche Weise extrahiert und dessen Struktur wurde durch Verdau mit Restriktionsenzym bestimmt.
Als Ergebnis des oben genannten wurde ein Plasmid pTr2-4OHΔ erhalten, bei dem ein Teil der Sequenz von pTr2-4OH fehlt (siehe 1).
Plasmid pTr2-4OHΔ-DNA wurde mit Hind III und Sal I gespalten.
Das PCR-amplifizierte Fragment, das mit Hind III und Sal I auf die oben genannte Weise verarbeitet worden ist, wurde in die Hind III-Sal I-Spaltungsstelle des Plasmids unter Verwendung eines Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) eingeführt.
Mit dem so erhaltenen Plasmid wurde der E. coli XL1-Blue MRF'-Strang auf gewöhnliche Weise transformiert und die entstandenen Transformantenzellen wurden auf LB-Agar-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin ausgebreitet und dann darauf über Nacht bei 37°C kultiviert.
Ein Plasmid, pWFH1 wurde von den gewachsenen Kolonien der Transformantenzellen auf gewöhnliche Weise isoliert.
Dessen Struktur wurde über Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen bestimmt. Der Teil des Plasmids, in dem das PCR-amplifizierte Fragment eingeführt worden ist, wurde unter Verwendung eines Basen-Sequenzier-Kits (TagDyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit, hergestellt von Applied Biosystems Co.) sequenziert, um dessen Nukleotidsequenz zu bestimmen. Die bestimmte Nukleotidsequenz ist in Sequenz Nr. 1 gezeigt.
Als Ergebnis des oben Genannten wurde herausgefunden, dass das Plasmid pWFH1, das das DNA-Fragment des Struktur-Gens enthält, das eine vollständig übereinstimmende Aminosäuresequenz mit der Dactylosporangium sp. RH1 abgeleiteten L-Prolin-4-hydroxylase in der selben Richtung wie die Transkriptionsrichtung von Ptrpx2 hat, außer dass sich am 5'-Terminus die Sal I-Stelle des Struktur-Gens teilweise von der von Dactylosporangium sp. RH1 abgeleiteten Nukleotidsequenz unterscheidet (siehe 2).
Wie in der Tabelle 1 unten gezeigt, produzierten die Transformanten 1400 mal mehr L-Prolin-4-hydroxylase pro Zelle als der Dactylosporangium sp. RH1-Stamm der als Gen-Quelle verwendet worden ist und ungefähr 5,4 mal mehr pro Zelle im Vergleich zu der Transformanten, die pTr2-4OH enthält.
Tabelle 1
BEISPIEL 2: KONSTRUKTION EINES STAMMES, DEM DIE PROLINABBAUAKTIVITÄT FEHLT:
Ein Gen putA, das in dem Prolinabbau in E. coli ATCC12435 beteiligt ist, wurde gemäß dem unten erwähnten Verfahren zerstört, um einen Stamm zu erzeugen, dem die Prolinabbauaktivität fehlt.
Zellen eines Stock-Stammes E. coli ME8395 [F :pyrD34, trp-45, his-68, thyA25, thi deoR33, galK35, xyl-7, mtl-2, malA1, rpsL118, λ R (λ), appA1, putA::Tn5 (Mu⁺)] erhältlich von dem Nationalen Institut für Genetik wurden in einem LB-Medium enthaltend 35 μg/ml Kanamycin geimpft und über Nacht kultiviert.
Dann wurden 100 μl einer Lösung von P1-Phage zugesetzt und mit 100 μl der resultierenden Kultur vermischt und für 5 Minuten stehen gelassen.
Das resultierende Gemisch wurde mit 3 ml LB-Weich-Agar-Medium, das 10 mM CACl₂ enthält, vermischt und dann über ein LB-Agar-Medium, das 10 mM CaCl₂ enthält, beschichtet und bei 37°C für 7 Stunden kultiviert.
Nach der Kultivierung wurde das so auf der Oberfläche des Agar-Mediums gebildete Phagenlysat in 2 ml LB-Medium, das 10 mM CaCl₂ enthält, gesammelt.
Zu der so gesammelten Flüssigkeit wurden 0,5 ml Chloroform zugesetzt, damit unter Verwendung eines Vortex-Mischers vermischt und dann bei 3000 Upm für 15 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde als P1-Phagenlysat verwendet.
Dann wurden 50 μl der P1-Phagenlysatflüssigkeit mit 100 μl einer Kultur von E. coli ATCC12435, die in LB-Medium, das 10 mM CaCl₂ enthält, kultiviert worden ist, vermischt und darin bei 37°C für 20 Minuten stehen gelassen.
Das entstandene Flüssigkeitsgemisch wurde mit 3 ml F-top-Citrat (enthaltend 8,5 g/l NaCl, 100 mM Dinatrium-Citrat und 0,7% Agar) vermischt, auf einem LB-Agar-Medium, das 35 μg/ml Kanamycin enthält, aufgetragen und bei 37°C für einen Tag kultiviert.
Die so durch die Kultivierung gewachsenen Kanamycin-resistenten Zellen wurden in 0,85% NaCl suspendiert, dann auf einer Pro-TTC-Platte (umfassend 7 g/l K₂HPO₄, 3 g/l KH₂PO₄, 0,1 g/l MgSO₄, 2 g/l Proteosepepton, 0,025 g/l 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, 2 g/l L-Prolin und 15 g/l Agar, pH 7,2) aufgetragen und bei 37°C für ein bis zwei Tage kultiviert.
Der Stamm, der durch die Kultivierung weiße Kolonien auf der Pro-TTC-Platte produziert hatte, wurde als Stamm ausgewählt, dem die Aktivität zum Abbau und Assimilation von Prolin fehlt. Auf diese Weise wurde ein Stamm E. coli WT1 erhalten, dem die Prolinabbauaktivität fehlt.
Der Stamm WT1 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology at 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan vom 7. August 1996 unter FERM BP-5618 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.
BEISPIEL 3: KONSTRUKTION DES PLASMIDS, DER DIE BIOSYNTHETISCHEN PROLIN-GENE PROB74 UND PROA EXPRIMIERT:
Ein Plasmid pPF1 wurde gemäß dem unten erwähnten Verfahren unter Verwendung des Plasmids, das ein Mutanten-Gen proB74 exprimiert (dies entsprach einer mutierten Form eines von E. coli abgeleiteten Gens proB, das für γ-Glutamylkinase kodiert, was gegenüber der Feedback-Inhibition mit Prolin desensibilisiert wurde) unter einem von E. coli abgeleiteten Gen proA, das für γ-Glutamylphosphatat-Reduktase kodiert, konstruiert.
Ein Plasmid pPRO-1, enthaltend die von E. coli abgeleiteten Gene proA und proB (dieses wurde aus einem E. coli K83-Stamm (FERM BP-2807) erhalten), wurde mit Eco RV gespalten und dann einer Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, aus der ein DNA-Fragment von ungefähr 1 kb unter Verwendung eines Prep-A-Gen-DNA-Aufreinigungssystems (hergestellt von BIO-RAD Co.) erhalten wurde, das einen Teil des proB-Gens enthält.
Das DNA-Fragment wurde mit pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo Co.), das mit SmaI gespalten wurde, ligiert, um ein Plasmid pBAB51 zu erhalten (siehe 3).
Das proB-Gen, das in dem Plasmid vorlag, wurde gemäß dem unten beschriebenen Verfahren in ein bekanntes, mutantes Gen proB74 mutiert, das gegenüber der Feedback-Inhibition mit Prolin desensibilisiert war (A.M. Dandekar and S.L. Uratsu, J. Bacteriol. 170, 5943 (1988)).
Ein Oligonukleotid A1, wie in Sequenz Nr. 4 bezeichnet und ein Oligonukleotid A2, wie in Sequenz Nr. 5 bezeichnet, wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisiergerätes, 380A Modell (hergestellt von Applied Biosystems Co.) synthetisiert.
Eine Teilsequenz des Mutanten-Gens proB74, das aus proB mutiert worden ist, wurde über PCR unter Verwendung eines Primer-Paars, Oligonukleotid A1 und M13-Primer M3 (hergestellt von Takara Shuzo Co – Katalog Nr. 3831) und unter Verwendung von pBAB51 als Matrize amplifiziert.
Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von 20 μl eines Reaktionsgemisches umfassend 0,1 μg pBAB51, 2 μM Oligonukleotid A1, 2 μM M13-Primer M3, 1 E Taq DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo Co.), 1,6 μl dNTP-Gemisch (hergestellt von Takara Shuzo Co. – Katalog Nr. 4030) und 2 μl eines Zusatzpuffers. Eine dreistufige Inkubation, nämlich bei 94°C für 30 Sekunden, bei 52°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 1 Minute wurde insgesamt 30 mal wiederholt. Schließlich wurde das so inkubierte System weiter bei 72°C für 5 Minuten inkubiert.
Auf die selbe Weise wie oben wurde eine Teilsequenz des Mutanten-Gens proB durch PCR unter Verwendung eines Primer-Paars, Oligonukleotid A2 und M13-Primer RV (hergestellt von Takara Shuzo Co. – Katalog Nr. 3830A) und unter Verwendung von pBAB51 als Matrize amplifiziert.
Diese zwei DNAs, die durch eine solche PCR amplifiziert worden sind, wurden einer Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt ausgesetzt und dann unter Verwendung eines Prep-A-Gen-DNA-Aufreinigungssystems (hergestellt von BIO-RAD Co.) aufgereinigt.
Auf die selbe Weise wie oben, außer dass ein Gemisch der zwei reinen DNA-Fragmente als Matrize zusammen mit M13-Primer M3 und M13-Primer RV als Primer verwendet wurden, wurde ein DNA-Fragment von ungefähr 1 kb, das eine Nukleotidsequenz von proB74 enthält, über die PCR und Aufreinigung erhalten.
Das DNA-Fragment wurde mit Eco O65I und Sac II gespalten, um ein mit Eco O65I-Sac II-gespaltenes Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde mit einem DNA-Fragment (ungefähr 6,8 kbp), das aus pPRO-1 über einen Verdau mit Eco O65I und Sac II gehalten wurde, ligiert, um ein Plasmid pPRO74 zu konstruieren, was sich von pPRO-1 dadurch unterscheidet, dass das proB-Gen von pPRO-1 mit dem desensibilisierten proB74-Gen ersetzt worden ist (siehe 4).
Ein Oligonukleotid p1 der Sequenz Nr. 6 und ein Oligonukleotid p2 der Sequenz Nr. 7 wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisiergerätes, 380A Modell (hergestellt von Applied Biosystems Co.) synthetisiert.
proB74 und proA wurden durch PCR unter Verwendung dieser p1 und p2 als Primer und unter Verwendung von pPRO74 als Matrize amplifiziert.
Die PCR wurde unter Verwendung von 20 μl eines Reaktionsgemisches umfassend 0,1 μg pPRO74, 2 μM p1, 2 μM p2, 1 E Takara EX Taq (hergestellt von Takara Shuzo Co. – Code RR001Q und 1,6 μl dNTP-Gemisch (hergestellt von Takara Shuzo Co. – Katalog Nr. 4030) durchgeführt. Eine dreistufige Inkubation, nämlich bei 94°C für eine Minute, bei 42°C für 2 Minuten und bei 73°C für 3 Minuten wurde insgesamt 30 mal wiederholt.
Das entstehende Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, über die ein amplifiziertes Fragment mit 2370 bp, das proB74 und proA enthält, auf gewöhnliche Weise extrahiert wurde und das DNA-Fragment wurde unter Verwendung von GENECLEAN II KIT (hergestellt von BIO 101, Inc.) gewonnen. Das so gewonnene DNA-Fragment mit 2370 bp wurde mit Hind II und Bam HI gespalten und dann wurde ein Ethanol-Präzipitat durch Ethanol-Präzipitation erhalten. Das Ethanol-Präzipitat wurde in 5 μl TE gelöst und als ein Fragment mit proB74 und proA verwendet.
Das Fragment mit proB74 und proA wurde einem DNA-Fragment, das durch Verdau eines Plasmids pSTV29 (hergestellt von Takara Shuzo Co.) mit Hind III und Bam HI erhalten wurde, unter Verwendung eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) ligiert, um ein Plasmid mit proB74 und proA zu konstruieren.
Der E. coli JM109 Stamm wurde mit dem oben erhaltenen Plasmid auf gewöhnliche Weise transformiert und die entstehenden Transformantenzellen wurden auf einem LB-Agar-Medium, das 30 μg/ml Chloramphenicol und 0,1 mM IPTG, 40 μg/ml X-Gal umfasst, ausgebreitet und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Ein Plasmid wurde auf gewöhnliche Weise aus dem Stamm, der weiße Kolonien durch Kultivierung erzeugt hatte, extrahiert und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdau mit einem Restriktionsenzym bestimmt.
Nach dem oben erwähnten Verfahren wurde ein Plasmid pPF1 mit einem desensibilisierten Gen erhalten, das in einem fusionierten Protein beteiligt ist, das aus γ-Glutamylkinase mit N-Terminus, 8 Aminosäurenresten (lacZ.Nterm) des α-Fragments von β-Galactosidase, das an dessen N-Terminus positioniert ist, zusammengesetzt ist und ein Gen proA unter der Kontrolle von Plac aufweist (siehe 5).
Die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des Struktur-Gens (lacZ.NtermproB74) des fusionierten Proteins sind in Sequenz Nr. 8 gezeigt.
BEISPIEL 4: HERSTELLUNG VON TRANS-4-HYDROXY-L-PROLIN DURCH EINE TRANSFORMANTE MIT EINEM PROLIN-BIOSYNTHESE-GEN EXPRIMIERENDEN PLASMID:
Der in Beispiel 2 hergestellte E. coli Stamm WT1 wurde mit dem in Beispiel 3 konstruierten Plasmid pPF1 transformiert, um eine E. coli Transformante WT1/pPF1 zu erhalten. Der in Beispiel 2 hergestellte Stamm WT1 wurde mit dem in Beispiel 1 konstruierten Prolin-4-hydroxylase-exprimierenden Plasmid pWFH1 transformiert, um eine E. coli Transformante WT1/pWFH1 zu erhalten.
Kompetente Zellen der E. coli Transformante WT1/pWFH1 wurden gemäß dem Calciumchloridverfahren hergestellt, in die das Plasmid pPF1, das in Beispiel 3 hergestellt worden ist, eingeführt wurde. Somit wurde eine E. coli Transformante WT1/pWFH1/pPF1 mit den zwei Plasmiden über die Selektion der Kolonien, die auf einem LB-Medium, das 30 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Ampicillin enthält, wachsen, erhalten.
Die Stämme WT1, WT1/pPF1, WT1/pWFH1 und WT1/pWFH1/pPF1 wurden separat in einem LB-Medium, jedes umfassend 37,5 μg/ml Kanamycin, 100 μg/ml Ampicillin, 30 μg/ml Chloramphenicol oder 100 μg/ml Ampicillin und 30 μg/ml Chloramphenicol bei 37°C für 16 Stunden kultiviert.
Dann wurden 100 μl von jeder Kultur in ein Testgefäß (∅ 20 × 200 mm), das mit 10 ml eines Med7-Mediums (umfassend 2% Glukose, 1% Ammoniumsulfat, 0,1% K₂HPO₄, 0,2% NaCl, 0,05% MgSO₄, 0,0278% FeSO₄, 0,0015% CaCl₂ und 0,8% Pepton), das 2% (w/v) Calciumcarbonat enthält, gefüllt war, geimpft und bei 30°C für 24 Stunden kultiviert.
Die Menge an L-Prolin und trans-4-Hydroxy-L-prolin im Kulturüberstand sind in der Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Aufgrund der oben genannten Daten ist bekannt, dass die Transformanten mit dem Prolin-Biosynthese-Gen-exprimierenden Plasmid pPF1 eine größere Menge an L-Prolin herstellten als die anderen und dass die Transformante sowohl mit dem L-Prolin-4-hydroxylase-exprimierenden Plasmid pWFH1 als auch mit dem Prolin-Biosynthese-Gen-exprimierenden Plasmid pPF1 eine größere Menge an trans-4-Hydroxy-L-prolin herstellte als die Transformante, die nur das L-Prolin-4-hydroxylase-exprimierende Plasmid pWFH1 besaß.
BEISPIEL 5: KONSTRUKTION DES PLASMID, DAS DAS L-PROLIN-4-HYDROXYLASE-GEN UND DIE PROLIN-BIOSYNTHESE-GENE PROB74 UND PROA EXPRIMIERT:
Ein Plasmid pWFP1 wurde gemäß dem unten erwähnten Verfahren konstruiert, wobei das Plasmid fähig ist, ein Dactylosporangium sp. RH1 abgeleitetes L-Prolin-4-hydroxylase-Gen und die Gene proB74 und proA zu exprimieren.
Das Struktur-Gen von L-Prolin-4-hydroxylase wurde durch eine PCR unter Verwendung von pWFH1, das in Beispiel 1 erzeugt worden ist, als Matrize amplifiziert.
Bei der Reaktion wurden 20 μl eines Reaktionsgemisches umfassend 0,1 μg pWFH1, 0,5 E Pfu-DNA-Polymerase (hergestellt von STRATAGENE Co.), 2 μl 10 × Puffer für Pfu-DNA-Polymerase (hergestellt von STRATAGENE Co.), 2 μl DMSO, 1 μl 2,5 mM dNTP, 2 μM der synthetischen DNA, wie sie in Sequenz Nr. 9 gezeigt ist und 2 μM der synthetischen DNA, wie sie in Sequenz Nr. 10 gezeigt ist, verwendet. Vor der nachfolgenden Zyklusreaktion wurde das Reaktionsgemisch bei 96°C für 5 Minuten präinkubiert. Eine dreistufige Inkubation, nämlich bei 96°C für 2 Minuten, bei 58°C für eine Minute und bei 75°C für 3 Minuten wurde insgesamt 30 mal wiederholt.
Nach dieser Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, durch die ein amplifiziertes Fragment von ungefähr 800 bp mit einem L-Prolin-4-hydroxylase-Gen auf gewöhnliche Weise extrahiert wurde. Das DNA-Fragment wurde unter Verwendung von GENECLEAN II KIT (hergestellt von BIO 101, Inc.) gewonnen.
Das so gewonnene DNA-Fragment wurde mit Hind III und Eco RI gespalten und dann einer Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, über die ein DNA-Fragment unter Verwendung von GENECLEAN II KIT (hergestellt von BIO 101, Inc.) gewonnen wurde.
Das so gewonnene L-Prolin-4-hydroxylase-Gen-Fragment wurde mit einem DNA-Fragment, das über einen Verdau eines Plasmid pBluescriptII KS(+) (hergestellt von STRATAGENE Co.) mit Hind III und Eco RI erhalten worden ist unter Verwendung eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) ligiert, um ein Plasmid pBII-4OH mit einem darin eingeführten L-Prolin-4-hydroxylase-Fragment zu konstruieren (siehe 6).
Die Gene proB74 und proA wurden durch PCR unter Verwendung von pPRO74, das in Beispiel 3 hergestellt worden ist, als Matrize amplifiziert.
Bei der Reaktion wurden 20 μl eines Reaktionsgemisches umfassend 0,1 μg pPRO74, 1 E Takara Ex Taq (hergestellt von Takara Shuzo Co. – Code RR001Q), 2 μl 10 × Puffer von Takara Ex Taq (hergestellt von Takara Shuzo Co.), 1,6 μl 2,5 mM dNTP, 2 μM der synthetischen DNA der Sequenz Nr. 11 und 2 μM der synthetischen DNA mit der Sequenz Nr. 12 verwendet. Eine dreistufige Inkubation, nämlich bei 94°C für eine Minute, bei 42°C für 2 Minuten und bei 75°C für 3 Minuten wurde insgesamt 30 mal wiederholt.
Nach dieser Reaktion wurde das Reaktionsgemisch an Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, über die ein amplifiziertes Fragment von ungefähr 2,3 kbp mit den Genen proB74 und proA auf gewöhnliche Weise extrahiert wurde. Das DNA-Fragment wurde unter Verwendung von GENECLEAN II KIT (hergestellt von BIO 101, Inc.) gewonnen. Das so gewonnene DNA-Fragment wurde mit Bam HI und Eco RI gespalten, dann mit Phenol/Chloroform behandelt und mit Ethanol präzipitiert und das DNA-Fragment wurde gewonnen. Das so gewonnene DNA-Fragment mit den Genen proB74 und proA wurde mit einem DNA-Fragment, das durch Verdau des Plasmids pBII-4OH mit Hind II und Eco RI erhalten wurde, unter Verwendung eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) ligiert, um ein Plasmid pBII-4OHBA mit einem L-Prolin-4-hydroxylase-Gen und den Genen proB74 und proA zu konstruieren (siehe 7).
Das Plasmid pBII-4OHBA wurde mit Hind III und Bam HI gespalten und dann einer Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, über die ein DNA-Fragment von ungefähr 3,16 kpb mit einem L-Prolin-4-hydroxylase-Gen und den Genen proB74 und proA isoliert wurde. Des weiteren wurde pWFH1, das in Beispiel 1 hergestellt worden ist, mit Hind III und Bam HI gespalten und dann einer Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, über die ein DNA-Fragment von ungefähr 2,6 kbp mit einem L-Prolin-4-hydroxylase-Gen, aber ohne Replikations-Startpunkt isoliert wurde. Diese zwei so erhaltenen DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) ligiert, um dadurch ein Plasmid pWFP1 zu konstruieren, das zur Expression von L-Prolin-4-hydroxylase, proB74-Protein und proA-Protein unter der Kontrolle eines Tryptophan-Tandem-Promotors fähig ist (siehe 8).
BEISPIEL 6: HERSTELLUNG VON TRANS-4-HYDROXY-L-PROLIN DURCH E. COLI TRANSFORMANTEN WT1/pWFH1/pPF1 UND E. COLI WT1/pWFP1
Die Transformante WT1/pWFH1/pPF1 wurde in 50 ml eines Med4G-Mediums (umfassend 2% Glukose, 1% Polypepton (hergestellt von Nippon Seiyaku KK), 0,5% Hefeextrakt (hergestellt von Difco Co.), 1% NaCl, 2% Calciumcarbonat, pH 7,0) enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 30 μg/ml Chloramphenicol, angeimpft und die Transformante WT1/pWFP1 wurde in 50 ml eines Med4G-Mediums enthaltend 100 μg/ml Ampicillin angeimpft und bei 30°C für 16 Stunden unter Schütteln kultiviert.
Die entstehenden Kulturen wurden als Keimkulturen getrennt verwendet und in 5-Liter-Gefäß-Fermentern, die mit 2 Liter Med7-Medium gefüllt waren, angeimpft. Bei der Transformante WT1/pWFH1/pPF1 wurden 100 μg/ml Ampicillin und 30 μg/ml Chloramphenicol zugesetzt und bei der Transformante WT1/pWFP1 wurden 100 μg/ml Ampicillin zugesetzt. Die Transformanten in der Kultur wurden unter der Bedingung von 400 Upm und 1 vvm bei 30°C kultiviert.
Bei der Transformante WT1/pWFH1/pPF1 wurde 8 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung IPTG zu dem Medium zugesetzt, um so eine IPTG-Konzentration von 0,2 mM zu erhalten.
Bei beiden Transformanten wurden 24 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung Ampicillin und Chloramphenicol zu dem Medium zugesetzt, um eine Ampicillin-Konzentration von 100 μg/ml und eine Chloramphenicol-Konzentration von 30 μg/ml zu erreichen.
Während der Kultivierung wurde Glukose zu dem Medium in geeigneter Weise zugesetzt, um eine Glukosekonzentration von ungefähr 1% zu erreichen und die unterste Grenze des pHs des Mediums wurde bei 6,5 gehalten, indem NH₄OH zu dem Medium zugesetzt wurde. Fünf Stunden nach dem Beginn der Kultivierung wurde die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Kultur kontrolliert, so dass sie ein 1/15 von der zum Beginn der Kultivierung betrug, indem die Rührgeschwindigkeit innerhalb eines Bereichs von 250 Upm und 700 Upm variiert wurde.
99 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung wurde die Kultur zentrifugiert und die Menge an trans-4-Hydroxy-L-prolin wurde in den Überständen quantitativ bestimmt. Bei dem Überstand der E. coli Kultur WT1/pWFH1/pPF1 wurden 156 mM (20,5 g/l) trans-4-Hydroxy-L-prolin hergestellt und angehäuft. Bei einem Überstand der E. coli Kultur WT1/pWFP1 wurde 191 mM (25,0 g/l) trans-4-Hydroxy-L-prolin hergestellt und angehäuft.
BEISPIEL 7: HERSTELLUNG VON TRANS-4-HYDROXY-L-PROLIN DURCH EINE TRANSFORMANTE MIT EINEM PLASMID ZUR EXPRESSION VON L-PROLIN-4-HYDROXYLASE-GEN UND PROLIN-BIOSYNTHESE-GEN
Der E. coli Stamm WT1 wurde wie in Beispiel 2 hergestellt und mit dem Plasmid pWFP1 wie in Beispiel 5 konstruiert, transformiert, um eine E. coli Transformante WT1/pWFP1 zu erhalten.
Die E. coli Transformante WT1/pWFP1 wurde in einem LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, bei 37°C für 16 Stunden kultiviert. Dann wurden 100 μl der Kultur in ein Testgefäß überimpft (∅ 20 × 200 mm), das mit 10 ml eines Med7-Mediums, enthaltend 2% (w/v) Calciumcarbonat gefüllt war und darin bei 30°C für 24 Stunden kultiviert.
Die Menge an L-Prolin in einem Überstand der Kultur betrug 0,56 g/l und die von trans-4-Hydroxy-L-prolin betrug in demselben 2,4 g/l.
BEISPIEL 8: UMWANDLUNG VON L-PROLIN ZU TRANS-4-HYDROXY-L-PROLIN MIT TRANSFORMANTENZELLEN:
Zellen der E. coli Transformante ATCC12435/pTr2-4OH wurden in 3 ml eines LB-Mediums, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin angeimpft und darin über Nacht bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Die Kultur wurde zentrifugiert, um Nass-Zellen von E. coli ATCC12435/pTr2-4OH zu gewinnen.
Die E. coli Transformante ATCC12435/pWFH1 wurde in 100 ml eines Med4-Mediums (umfassend 1% Polypepton (hergestellt von Nippon Seiyaku KK), 0,5% Hefeextrakt (hergestellt von Difco Co.), 0,5% NaCl], das 100 μg/ml Ampicillin enthält, angeimpft und darin bei 30°C für 16 Stunden unter Schütteln kultiviert.
Die entstehenden Kulturen wurden getrennt in 5-Liter-Gefäß-Fermentern, die mit 2 Litern Med7-Medium (umfassend 2% Glukose, 1% Ammoniumsulfat, 0,1% K₂HPO₄, 0,2% NaCl, 0,05% MgSO₄, 0,0278% FeSO₄, 0,0015% CaCl₂ und 0,8% Peptone) angeimpft, zu dem 200 mM L-Pro zugesetzt worden ist und unter der Bedingung von 1 vvm bei 33°C für 48 Stunden kultiviert.
Wenn die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Kultur ein 1/15 im Vergleich zu der zu Beginn der Kultivierung betrug, wurde die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Kultur so kontrolliert, dass sie 1/15 zu der zu Beginn der Kultivierung betrug, indem die Rührgeschwindigkeit beim Grundzustand 400 Upm/min und bei der Obergrenze 700 Upm/min betrug.
Während der Kultivierung wurde Glukose in geeigneter Weise zu dem Medium zugesetzt, so dass Glukose nicht fehlte; L-Prolin wurde in geeigneter Weise zu dem Medium zugesetzt, so dass die L-Prolin-Konzentration ungefähr 50 mM betrug und die Untergrenze des pHs des Mediums wurde bei 6,5 gehalten, indem NH₄OH zu dem Medium zugesetzt wurde.
Die Kulturen wurden zentrifugiert, um Nass-Zellen von E. coli ATCC12435/pTr2-4OH und E. coli ATCC12435/pWFH1 zu gewinnen.
Wenn erwünscht, wurden beide Zellen gefroren und bei –20°C gelagert und vor Verwendung aufgetaut.
Die Zellen wurden getrennt zu 250 μl eines Reaktionsgemisches (umfassend 12 mM L-Prolin, 24 mM 2-Ketoglutarsäure, 4 mM Eisensulfat und 8 mM L-Ascorbinsäure in 240 mM MES-Puffer, pH 6,5) bei 4% (w/v) unter Bezugnahme auf die Nass-Zellen zugesetzt und bei 35°C für 10 Minuten umgesetzt. Die Aktion wurde gestoppt, indem das Reaktionsgemisch auf 100°C für 2 Minuten erhitzt wurde.
Nachdem die Reaktionsgemische zentrifugiert worden sind, wurde die Menge an trans-4-Hydroxy-L-prolin, das in einem Überstand angehäuft wurde, quantitativ bestimmt. In dem Überstand von E. coli ATCC12435/pTr2-4OH wurden 3 mM/l trans-4-Hydroxy-L-prolin hergestellt und in dem Überstand von E. coli ATCC12435/pWFH1 wurden 16 mM/l trans-4-Hydroxy-L-prolin hergestellt. Die L-Prolin-4-hydroxylase-Aktivität dieser Zellen betrug 7,5 bzw. 40 E/mg Nass-Zellen.
VERGLEICHSBEISPIEL 1: KONSTRUKTION DES EXPRESSIONSPLASMIDS VON L-PROLIN-4-HYDROXYLASE
Ein Sinnstrang-DNA-Primer, der in Sequenz Nr. 13 gezeigt ist und ein Anti-Sinnstrang-DNA-Primer, der in Sequenz Nr. 14 gezeigt ist, wurden durch ein DNA-Syntheseapparat 380A, hergestellt von Applied Biosystems, synthetisiert. Die PCR wurde durchgeführt, indem die synthetischen DNAs als Primer und pRH71 [erhalten von Escherichia coli SOLR/pRH71 (FERM BP-5025), das diesen Plasmid enthält] als Matrize verwendet wird.
Die PCR wurde durchgeführt, indem 20 μl eines Reaktionsgemisches verwendet wurden, das 0,1 μg pRH71, 2 μM Sinn-Strang-DNA-Primer, 2 μM Anti-Sinn-Strang-DNA-Primer, 0,125 E Pfu-DNA-Polymerase (hergestellt von STRATAGENE Co.), 10% DMSO, 20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 6 mM Ammoniumsulfat, 2 mM MgCl₂, 0,1% TritonX-100 und 10 ng/μl Rinder-Serumalbumin enthält. Nachdem das Reaktionsgemisch bei 96°C für 5 Minuten inkubiert worden ist, wurde eine dreistufige Inkubation, nämlich bei 96°C für 2 Minuten, 58°C für eine Minute und 75°C für eine Minute insgesamt 30 mal wiederholt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese ausgesetzt. Nachdem feststand, dass ein amplifiziertes Fragment von 844 bp gebildet wurde, das für das Struktur-Gen kodiert, das bei der L-Prolin-4-hydroxylase beteiligt ist, wurde das amplifizierte Fragment aus dem Agarose-Gel auf gewöhnliche Weise extrahiert und unter Verwendung von Prep-A-Gen, hergestellt von Biorad Co., gewonnen. Beide Enden des gewonnenen 844 bp-DNA-Fragments wurden mit Hind III und Bam HI gespalten und es wurde dann ein Ethanol-Präzipitat durch Ethanol-Präzipitation erhalten. Das Ethanol-Präzipitat wurde in 5 μl TE aufgelöst. Ein ATG-Vektor, pTrS32, der durch Kombination eines synthetischen Linkers und des Plasmids pKYP200 gebildet wurde, und der aus dem Grundplasmid pBR322, zusammen mit zwei Promotoren Ptrps, die hintereinander geschaltet sind (Ptrpx2), aufgebaut ist, wurden mit Hind III und Bam HI gespalten.
Das Hind III-Bam HI-Fragment, dass das Struktur-Gen enthält, das bei der L-Prolin-4-hydroxylase beteiligt ist, wurde in die Hind III-Bam HI-Spaltstelle des Vektors unter Verwendung eines Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co.) eingeführt.
Mit dem so erhaltenen Plasmid wurde der E. coli XL1-Blue MRF'-Stamm auf gewöhnliche Weise transformiert. Die Transformante wurde auf einem LB-Agar-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthält, ausgebreitet und dann darauf über Nacht bei 37°C kultiviert. Das Plasmid wurde von den wachsenden Kolonien der Transformantenzellen auf gewöhnliche Weise extrahiert und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdau mit Restriktionsenzymen bestimmt. Der Teil des Struktur-Gens von L-Prolin-4-hydroxylase wurde sequenziert, um dessen Nukleotidsequenz, unter Verwendung eines Basen-Sequenzier-Kits (Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit, hergestellt von Applied Biosystems Co.) zu bestimmen. Die bestimmte Nukleotidsequenz des Struktur-Gens ist in Sequenz Nr. 15 gezeigt.
Als ein Ergebnis wurde das Plasmid pTr2-4OH, in dem das DNA-Fragment, das für das Struktur-Gen kodiert, das bei der L-Prolin-4-hydroxylase beteiligt ist, in die selbe Richtung wie die Transkriptionsrichtung von Ptrpx2 eingeführt worden ist, erhalten und ist in 9 gezeigt.
VERGLEICHSBEISPIEL 2: HERSTELLUNG VON TRANS-4-HYDROXY-L-PROLIN DURCH DACTYLOSPORANGIUM SP. RH1:
SR3-Medium, umfassend 1,0% Glukose, 1,0% lösliche Stärke, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Trypton, 0,3% Fleischextrakt und 0,05% Magnesiumphosphat wurde auf pH 7,2 mit 6N NaOH eingestellt und in Testgefäße mit einer Menge von jeweils 10 ml überführt und bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert. Eine Öse mit Dactylosporangium sp. RH1-Zellen, die auf HAT-Agar-Platten-Medium wachsen gelassen worden sind, wurde in dem oben erwähnten SR3-Medium in jedes Testgefäß angeimpft und bei 28°C für 2 Tage unter Schütteln kultiviert. Die entstandene Kultur wurde als eine Keimkultur in den folgenden Schritten verwendet.
DF1-Medium, umfassend 5% lösliche Stärke, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,05% Monokaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat-7-Hydrat und 0,5% Calciumcarbonat, eingestellt auf pH 7,0 mit 6N NaOH wurden getrennt in Testgefäße überführt (Durchmesser 25 mm × Länge 200 mm) bei einer Menge von jeweils 10 ml und bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert. 1 ml der oben erwähnten Keimkultur wurde in das Medium von jedem Testgefäß unter keimfreien Bedingungen angeimpft und bei 28°C für 2 Tage unter Schütteln kultiviert.
Die so erhaltene Kultur wurde bei 8000 × g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die so getrennten Zellen wurden mit 80 mM TES [N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure]-Puffer (pH 7,5) gewaschen und dann erneut zentrifugiert.
In 1,5 ml eines Reaktionsgemisches, das durch Hinzufügen von 1,4% (v/v) Nymeen-Lösung (hergestellt durch Zusatz von 4 g Nymeen S-215 (hergestellt von Nippon Oils & Fats Co.) zu 10 ml Xylen] zu 80 mM TES-Puffer (pH 7,5), enthaltend 4 mM L-Prolin, 8 mM 2-Ketoglutarsäure, 4 mM L-Ascorbinsäure und 2 mM Eisensulfat wurden 150 mg der so erhaltenen Nass-Zellen suspendiert und dem Gemisch wurde es ermöglicht bei 30°C für 30 Minuten zu stehen, um die enzymatische Reaktion durchzuführen.
Nach der Reaktion wurden die Zellen aus dem Reaktionsgemisch durch Zentrifugation entfernt und die Menge an trans-4-Hydroxy-L-prolin, das sich in dem Überstand anhäufte, wurde bestimmt.
Als ein Ergebnis der Bestimmung wurde festgestellt, dass 84 μmol/l trans-4-Hydroxy-L-prolin in dem Reaktionsgemisch hergestellt worden sind. Die L-Prolin-4-hydroxylase-Aktivität von diesen Zellen betrug 0,028 E/mg Nass-Zellen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nicht-menschliche Transformante mit einem Vektor, der ein DNA-Fragment umfasst, das ein Gen enthält, das für ein Protein kodiert, das die enzymatische Aktivität zur Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin besitzt und das auf freies L-Prolin in der Gegenwart von 2-Ketoglutarsäure und divalenten Eisenionen wirkt, um trans-4-hydroxy-L-Prolin zu erzeugen und wobei die Transformante eine erhöhte Anzahl von Kopien eines Gens umfasst, das für ein Enzym kodiert, das an der Biosynthese von L-Prolin beteiligt ist, wobei ein Prolin-Biosynthese-Gen, das für ein Enzym kodiert, das einer Feedback-Inhibition mit Prolin ausgesetzt ist, mutiert wurde, um die Feedback-Inhibition mit Prolin zu verringern oder wobei die Prolin-Abbau-Aktivität von dem Wirt entfernt wurde, um die Prolin-Biosynthese-Aktivität zu verstärken.
Transformante nach Anspruch 1, wobei das Gen, das für ein Enzym kodiert, das an der Biosynthese von L-Prolin beteiligt ist, proB oder proA ist.
Transformante nach Anspruch 1, wobei das Gen, das für ein Enzym kodiert, das einer Feedback-Inhibition mit Prolin ausgesetzt ist, von E. coli abgeleitetes proB74 ist.
Biologisch reine Kultur von Escherichia coli WT1, hinterlegt unter Ferm BP-5618.
Verfahren zur Herstellung von trans-4-hydroxy-L-Prolin, umfassend das Kultivieren einer Transformante nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 in einem Medium, das Ermöglichen, dass L-Prolin mit 2-Ketoglutarsäure und divalenten Eisenionen in einem wässrigen Medium in der Gegenwart der kultivierten Transformante als eine Enzymquelle koexistiert, das Umwandeln von L-Prolin in trans-4-hydroxy-L-Prolin und das Gewinnen des entstehenden trans-4-hydroxy-L-Prolins aus dem wässrigen Medium.
Verfahren zur Herstellung von trans-4-hydroxy-L-Prolin nach Anspruch 5, wobei das wässrige Medium ein Kulturmedium ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei ein oberflächenaktives Mittel oder ein organisches Lösungsmittel zu dem wässrigen Medium zugegeben wird.
Nicht-menschliche Transformante nach Anspruch 1 mit einem Vektor, der ein DNA-Fragment umfasst, der ein DNA-Fragment umfasst, das ein Gen enthält, das für ein Protein kodiert, das die enzymatische Aktivität zur Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin besitzt und das auf freies L-Prolin in der Gegenwart von 2-Ketoglutarsäure und divalenten Eisenionen wirkt, um trans-4-hydroxy-L-Prolin zu erzeugen, wobei die Transformante eine Fähigkeit besitzt 1,2 g/l L-Prolin zu erzeugen, wenn sie in LB-Medium bei 37°C für 16 Stunden kultiviert wird.