TW581813B - Preparation of trans-4-hydroxy-L-proline - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（》) 〔發明之詳細説明〕 〔發明所羼之技術領域〕 本發明為鼷於工業性地製造被利用作為消炎两之U-乙 醯羥基脯胺酸、作為卡巴配念（Carbapenai)条抗生素等 翳藥品之合成原料或食品添加物之有用的反-4-羥基- L-脯胺酸之方法，及含有該方法中有用之L·-脯胺酸第4位 羥化酶基因並且脯胺酸合成条之活性為經強化之轉形 體。 〔先前之技術〕 使用微生物製造反-4-羥基-L-脯胺酸之方法已知有 1) 使用颶於埃希氏薗屬之微生物、由4-羥基-2-氣戊二 酸製造反-4-羥基-L-脯胺酸之方法（特開平3-266995)、 2) 使用細薗和徽菌類直接醭酵生産之方法（歐洲専利申 錆案 EP 0547898 A2、待開平 5-236980、特開平 6-245782)、 3) 使用属於鏈徽菌屬之撖生物，由L-脯胺酸製造之方法 [Journal of Biological-Cheaistry ( J · B i ο 1 . Che臟 ,254卷、6684-6690頁（1979年）、Biochemical and Biopbsical Research Co鼸蘿unication (Biocheft·

Biophys· Res. Coil·)、120卷、45〜51頁（1984年）、 Tetrahedron Letters,34卷、7489〜7492頁（1993年）、 Tetrahedron Letters. 35卷、4649-4652頁（1994年）〕β 先前之反-4-羥基-L-脯胺酸之製造方法，僳因為 1)4-羥基氣戊二酸等之用於製造反-4-羥基-L-脯 胺酸之受質為昂貴且取得困難、2)反-4-羥基-L-脯胺 本紙》八度遢用中國困家樣準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（> ) 酸之生産性低、3>參與反-4-羥基-L-脯胺酸製造之酵 素活性極為微弱等理由，而難以工業化。R於參舆反 -4-羥基-L-脯胺酸之製造之酵素，已有令卜脯胺酸第 4位經化88由指狀孢子囊菌種mi(Dactylosporangiui sp. RH1)純化之報告（待開平7- 32 288 5 )、及由屬於前逑 鏈徽薗屬之微生物純化之報告〔Biochemical Journal (Biochei· J·)、313卷、185-191 頁（ 1 966年）〕。又， 已有於2-氣戊二酸及二價鐵離子存在下，具有令游離之 L-脯胺酸變換成反-4-羥基-L·-脯胺酸活性之L-脯胺酸 第4位羥化酶之鏞碼基因，由前述之指狀孢子囊鰌種RH-1 (D a c t y 1 〇 s ρ 〇 r a n g i U1 s ρ · R Η 1)選殖，並取得含有 L -脯 胺酸第4位羥化酶基因之質腰PRH71,再構築於色胺酸 縱排啓動基因控制下，表現L-鋪胺酸第4位羥化酶基因 之質醱pTr 2-40Η,並於大腸桿鱔表現活性之報告（日本 農藉化學會1 996年度大會，演講要旨集2 5 7頁>。 至今需求使用活性髙的L-脯胺酸第4位羥化酶，工業 性有利地製造反-4-羥基-L-臃胺酸之方法。 另一方面，鼷於脯胺酸生物合成路徑之酵素及其基 因為已於大腸桿菌等中黼明〔Journal of General M i c r o b i ο 1 o g y ( J · G e η · M i c r o b i ο 1 · ) , 11 8 卷、2 8 7 - 2 9 3 頁（1980年}、及 Biochiiica Biophysica Acta(Biochi臟· Biophys· Acta)、1(M卷、3 9 7 〜4 0 4頁（ 1 9 6 5年）〕。又 ，已知脯胺酸之生物合成例如在大腸桿68等中，生物合 成路徑之第一酵素y -穀胺酵激酶（GU為受到産物脯胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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581813 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（> ) 酸之反嫌抑制所蔺節〔Biochiii ca Biophysics Acta (Biochi腫· Biophys· Acta)、 192卷、462〜467頁（1969 年）〕。 再者，已知藉由令縝碼GK之基因pro B産生變異，生 成令脯胺酸之反饋抑制顯著減少之GK,則可造成脯胺酸 高生産株〔Μ ο 1 e c u 1 a r G e n e r a 1 6 e n e t i c s (Η ο 1 · G e η · Genet·)、182卷、82-86頁（1981年）、Journal of Bacteriology(J.Bacteriol·)， 156卷、1249-1262頁 ( 1 983年）、及 Journal of Bacteriology ( J . Bacteriol) 、164卷、1 088- 1 0 9 3 頁（ 1 985年）〕。令該 pro B 引起變 異之基因已知為pro B74,已知pro B74之變異點為藉由 令pro B之编碼區域「終端開始之第319®G以A取代， 而使Pbo B蛋白質N終端開始第10 7值之天冬胺酸變化成 天冬醯胺〔6ene, 64卷、1 9 9- 2 0 5頁（ 1 988年）〕。 蘭於脯胺酸分解之酵素条、编碼其之基因、基因条之 控制，亦已熟知以大腸桿齠、沙門氏«等進行研究〔 Journal of Bacteriology (J· Bacteriol·)、 146卷、 8 9 5 - 9 0 1 頁（1981年）x Journal of Moleculoar Biology (J· Mol. Biol·)、148卷、21-44頁（1981年）〕。 使用脯胺酸生物合成条之活性經活化株之反-4-羥 基-L-脯胺酸之製法則為未知。 〔發明所欲解決之課題〕 本發明之課題為在使用L-脯胺酸第4位羥化_，並效 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 Φ 本纸張尺度適用中國國家襻♦ CNS M4化格（210X297公釐） 581813 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（，） coli S0LR/PRH71為在平成7年3月2日於工業技術院 生命工學工業技術研究所、日本茨城縣築波市東1 丁目 1-3號（郵遞區號305 )以FERM BP- 5025寄存。又於中華民國86年 9月1日寄存於食品工業發展硏究所，寄存編號CCRC 9401 74 ° 為了令L-脯胺酸第4位羥化酶基因於宿主中表現，首 先，令含L -脯胺酸第4位羥化酶基因之DNAH段，以限 制酶類或DN A分解酶類，作成含有L-脯胺酸第4位翔化 酶基因之適當長度的DNAH段後，於表現載體中之啓動 基因之下游插入。其次將插入上逑DNA之表現載體，導 入至表現載體所適合之宿主中。可表現目的基因者全部 均可使用作為宿主。例如，除了屬於埃希氏菌屬、沙雷 氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌羼、假單胞_屬、桿菌屬 等之徹生物薗株以外，可列舉酵母菌株和動物細胞宿主 等。 表現載體為使用可在上逑宿主中獨立複製者或為使用 可重組至染色體中，並在L -脯胺酸第4位羥化酶基因可 轉錄位置中含有啓動基因者。 若以大腸桿菌等之撤生物作為宿主時，L-脯胺酸第4 位羥化酶表現載體宜為可在撤生物中镯立複製且同時由 啓動基因、核糖體結合序列、L -脯胺酸第4位羥化酶基 因、轉錄终止序列所構成者為較佳。亦可含有控制啓動 基因之基因。 表現載體可例示例如，PBTrp2、pBTrpl、ρΒΤγΡ2(均 由 Boehringer Mannheim公司市售）、pKYP10(恃開昭 58- 本紙張尺度適用中國國家椋準（CNS ) Λ4規格（210 X 297公焚) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 581813 A7 B7 五、發明説明U ) 110600)、 pKYP200 C Agricultural Biological C h e hi i s t r y ( A g r i c · B i ο 1 · C h e 道·）、4 8 卷、6 6 9 - 6 7 5 頁 (1984年）〕、pLSAl 〔Agricultural Biological C h e i s t r y ( A g r i c · B i o 1 · C h e · )、5 3 卷、2 7 7 頁（1 9 8 9 年）〕、pGELl C Proceeding of the National Academy of Science (Proc· Natl. Acad. S c i . , USA)、82卷、 4306頁（1985年）〕、pBluecript (STRATAGEN公司）、 pTrs30〔由大腸桿菌 JM109/pTrs30(FERM BP-5407)調 製〕及 pTrs32 〔由大腸桿菌 JM109/pTrs32(FERM BP-5408) 調製〕等。 啓動基因只要可在大腸桿菌等宿主中表現者則均可使 用，可列舉例如trp啓動基因（Ptrp)、lac啓動基因（Plac) 、啓動基因1^啓動基因等之來自大腸桿菌和噬菌體等 之啓動基因。又，亦可使用令Ptrp為呈兩値直列之啓動 基因（PtrpX2), tac啓動基因之經人為設計改變之啓動 基因等。 核糖體結合序列只要可在大腸桿菌等宿主中表現者則 均可使用，而以使用將核糖體結合序列與起始密碼子之 間調節至適當距離（例如6〜18傾鹺基）之質體為較佳。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

L-脯胺酸第4位羥化酶基因只要编碼L-脯胺酸第4位羥 化酶之基因則均可使用，而為了令該基因之DN A序列成為 ^宿主撤生物中表現之最適當的密碼組，可藉由使用齡 基取代而達成高表現化。以大腸桿菌作為宿主，並鹸基 取代成為表現上最適當密碼組之L-脯胺酸第4位羥化酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 581813 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（7 ) 基因之具髖例，可列舉序列编號1所示之齡基序列等。 於本基因之表現上，並非一定餺要轉綠終止序列，但 期望適當地於構造基因正下方配置轉錄終止序列。 宿主可列舉大腸桿菌XLl-Blue、大腸桿薗XL2-Blue、 大腸桿龆DH1、大腸桿SlMClOflO、大腸桿«ΚΥ3 2 7 6、大 腸桿菌W1 48 5、大腸桿0JM1O9、大腸桿0HB1O1、大腸 桿菌No.49、大腸桿SW3110、大腸桿齄HY49、枯草桿齠 、醱粉液化桿菌（Bacillus a臟yloliquefacines}、 Brevibacteriu麗 i騰重ariophilu· ATCC 1 40 68、耱分解 性短桿菌(B f e v i b a c t e r i uh saccharo lyt iciii) ATCC 1 4 0 6 6 、黃色短桿菌（B r e v i b a c t e r i u i f 1 a v u i) A T C C 1 4 0 6 7、 Ml 酸酵短擇菌(Brevibacter iua lactoferientu 麗)ATCC 1 3 8 6 9、链胺酸棒狀桿菌（C o r y n e b a c t e r i u g 1 u t a i c u ) ATCC 13032、唾乙酵醋酸棒狀桿 ®(Corynebacteriu· a c e t o a c i d o p h i 1 u 胆）A T C 1 3 8 7 0、喃氣微捍菌（M i c r o b a c t e r i u 麗 a 霣 i ο n i a p h i 1 u *) A T C C 1 5 3 5 4 等 〇 若以酵母菌作為宿主，其表現載體可例示例如YEP13 (ATCC 37115)、 YEp24(ATCC 37051)、 YCp50(ATCC 37419 )等〇 啓動基因只要可在酵母0株宿主中表現者則均可使用 。可列舉例如己糖激_等之解糖条基因之啓動基因， gal 1啓動基因、gal 10啓動基因、熱燦破蛋白質啓動 基因、MFal啓動基因、CUP1啓動基因等之啓動基因。 宿主可列舉薄酒酵母® (Saccharoiyces cerevisae) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21〇X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 _B7_ 五、發明説明（ί ) 、稷酒裂殖酵母菌（Schizosaccharoiyces p〇Bbe)、 K 1 u y v e r 〇 塑 y c e s 1 a c t i s、支鏈截粉毛孢子睹（T r i c h o s p o r ο η pullulans)^ Schwannioiyces a 11 uv i us^ 〇 若以動物細胞作為宿主，其表現載膿可例示例如PCDNAI /A麗p、pcDNAI, pcDM8(均由 Funacosy公司市售）等〇 啓動基因只要可在動物細胞之宿主中表現者則均可使用 。可列舉例如，人類CMV之IE(iuediate early)基因之 啓動基因等之啓動基因β又，人類CMV之IE基因的增強 基因亦可與啓動基共同使用。宿主可列舉Naftalva細胞 、HBT 5 6 3 7 (待開昭 6 3 - 2 99 )、COS 細胞、CH0 細胞等 β 對於動物細胞導入DNA之方法，只要可將DNA導入至動 物細胞則任何方法均可使用。例如可使用«穿孔法 〔Miyaji等：Cytotechnology,3, 133(1990)〕、镑酸 鈣法（特開平 2 - 2 2 7 0 7 5 )、Lipofection法〔Philip L· Feigner等:Proceeding of the Nationial Academy of Science ( P r o c . Natl. Acad. S c i . 9 U S A )9 84 , 7 4 1 3 ( 1 987 )等。轉形株之取得及培餐可依特開平2 - 2 2 7 07 5或 待開平2-257891記載之方法進行。 為了令宿主作為脯胺酸生物合成条之活性經強化者， 可藉由1)令宿主中之脯胺酸合成条基因之複製數增加、 2>為令受到經由脯胺酸反餓抑制之_胺酸合成糸酵素之 编碼基因産生變異，將受到脯胺酸反餓抑制為顯着減少 之酵素之编碼基因導入宿主、3)令脯胺酸之分解活性失 活、4)將彼等組合而達成。 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 丨* -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（9 ) 脯胺酸合成条基因或編碼受到脯胺酸反餓抑制為顯著 減少之脯胺酸合成条酵素之基因，可於宿主之染色體上 存在，亦可於質體等宿主中之載體上存在。 受到脯胺酸反饋抑制為顯箸減少之脯胺酸合成条酵素 之編碼基因，可列舉ΡΓΟΒ74基因、DHPrproB基因〔Gene 、39卷、109-112頁、（ 1 9 8 4年）〕等之受到脯胺酸反饋 抑制為顯箸減少之脯胺酸合成条酵素之编碼基因。 又，脯胺酸合成条基因或受到脯胺酸反饋抑制為顯著 減少之脯胺酸合成条酵素之编碼基因，於被令與脯胺酸 第4位羥化酶基因共同存在於質體等宿主中之載體上之 情形中，兩基因可於一値質體上存在，且亦可於另外之 可共存之質體上存在。 可共存之質體，例如於大腸桿菌中，可列舉大腸桿菌 素E1之質體（例如PBR32 2 )和PACYC条之質體 '大腸桿菌 素E1糸之質體和F因子糸之質體、大腸桿薗素E1条之質 體和R因子条之質體等。 令脯胺酸生物合成条基因於宿主中表現，可採用與前述以 乙_脯胺酸第4位羥化酶基因表現之相同方法。 為令宿主之腩胺酸分解活性失活，可使用變異劑處理 宿主後，經由選出例如於細菌等為在1^0-111^平板（APPlied and Environmental Microbiology (Appl· Environ. Microbiol·), 33卷、434-444頁（1977年）〕上形成白色 菌落者而取得。 再者，因為已知於大腸桿菌等為在Put基因之適當位置 -1 1 - 本紙張尺度遏d *家*MM CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7__ 五、發明説明（⑺） 插入轉因子，則喪失脯胺酸之餐化性〔Genetics、92卷 、7 4 1 - 7 4 7頁（ 1 9 7 9年）〕故於插入轉因子之後，經由B _性及前述之Pro-TTC平板，則亦可取得脯胺酸分解缺失 活性株。 又，由轉因子所造成之腩胺酸分解缺失活性株，令 其經由 P1 轉導作用〔A Short Course In Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Esherichia coli and Related Bactevia, J . H. Miller ，冷泉港實驗室印刷，1 9 2 2 ,實驗室手冊，2 6 3頁〕亦 可在S外之@株，将脯胺酸分解活性缺失予以轉形。 使用如上述處理之脯胺酸生物合成条活性經強化之宿 主所取得之轉形醱的培餐，可依據通常之培餐方法進行。 培餐使用大腸桿菌和酵母®等微生物作為宿主之轉形 體之培餐基，為含有撤生物可利用之硪源、氮源、無檐 鹽類等，且若為可有效率地進行轉形體培餐之培餐基， 則以天然培餐基、合成培餐基之任一者均可。 硪源若為各锢微生物可利用者即可，且可使用葡萄糖、 果糖、蔗糖、含彼等之糖蜜，澱粉或澱粉水解物等之磺 水化合物、醋酸、丙酸等之有機酸、乙酵、丙酵等之酵 類。 氮源可使用氨、氯化銨、硫酸銨、醑酸銨、磷酸銨等 各種無機酸、和有機酸之软鹽、其他之含氮化合物、及 蛋白諫、肉萃取物、酵母萃取物、玉米漿、酪蛋白水 解物、大豆渣及大豆渣水解物、各種醱酵菌臞及其消化 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 素 生 抗 等 。素 日徽 -7* 3 、 為素 常徽 通庚 間將 時可 養亦 培要 且需 ，視 Ο 佳中中 為養基 °c培養 37於培 ^ ，至 5 ^ I 3 又加 為添 581813 A7 ______ B7___ 五、發明説明（) 物等。 無機物可使用磷酸亞鉀、磷酸鉀、磷酸鎂、硫酸錢、 氣化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鏑、硪酸鈣等。 培養為在振盪培養或深部通氣攪拌培養等之好氣性條 件下進行。培養溫度為15〜40 °C為佳，且培養時間通常 為16〜100小時❶培養中之pH保持於3·0〜9·0β pH之調 整為使用無機或有機酸、齡性溶液、尿素、碩酸好、氨 等予以進行。 又，於培養中視需要亦可將安比西林和四璟徽素等抗 生素添加至培養基中。 於培養經在使用誘導性啓動基因作為啓動基因之表現 載體中轉形之微生物時，亦可視需要而將誘發劑添加至 培養基中。例如，於培養經在使用lac啓動基因之表現 載體中轉形之微生物時，亦可在培養基中添加異丙基 -冷-卜硫代半乳糖甘（IPTG),於培養經在使用trp啓動 基因之表現載體中轉形之撤生物時，亦可在培養基中培 養吲呤丙烯酸（I AA)。 培養使用動物細胞作為宿主之轉形體之培養基，可採 用一般所使用之RPMI 1 6 4 0培養基，Eagle之MEM培養基 或於此等培養基中添加牛胎兒血清等之培養基等。 培養為在5% (：02存在下等之條件下進行。培養溫度 本紙張尺度適用中國國家標準（（'w Mil轎210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 __B7_ 五、發明説明（^ ) 於如此培餐所得之轉形膿中，與使用作為基因來蹶之 微生物酺株，例如指狀孢子囊囍種RH-1等及具有ΡΤΓ2-4 OH之重组大腸桿麴相比較，則L-脯胺酸第4位羥化酶 為以顯箸量生成蓄積，且脯胺酸生物合成活性亦強，而 於反-4-羥基-L-脯胺酸之製造上，與使用作為基因來 源之撖生物菌株，例如指狀孢子囊菌種RH-1等及具有 pTr 2-40H之重组大腸桿薗之情形相比較，則可逮為有 效地進行。 藺於該轉形體中生成胺酸第4位羥化酶，可藉由 將培餐物、®醭或其處理物，於適合酵素反應之水性介 質中，舆L-脯胺酸、二價鐵離子、2-氣戊二酸共同加入 ，且視霈要添加界面活性劑和有機溶劑，經由檢澜出生 成之反-4-羥基-L-脯胺酸而得知。所生成之L-脯胺酸 第4位羥化_之活性，為在下逑消（定條件下，以1分鐘 生成1 ϋ·ο1反-4-羥基-L-脯胺酸之活性視為1犟位（L) 予以表示。尚，此處，微生物除鯖體之外，包含動物細 胞均稱為豳鼸。 L-脯胺酸第4位羥化_活性之測定： 於含有12·Μ L-脯胺酸、24·Μ 2-氣戊二酸、4«Μ硫酸 亞鐵及8·Μ L-抗壊血酸之2 4 0 ·Μ MES〔2-(N-嗎啉基）乙 烷磺酸〕緩衝液（PH6.5)中•添加菌釅、菌體處理物或 酵素樣品等並且合計作成250^1,於35°C反應10分鐘。 將反應液於l〇〇°C加熱2分鐘停止反應後，使用高速液 膿層析（以下，簡稱為HPLC)定逢反應液中生成之反-4-羥基-L-脯胺酸。 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

581813 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 定董上，若為可定量反-4-羥基-L-腩胺酸之方法則 何種方法均可使用。可列舉例如，將反應液中之反 羥基脯胺酸使用配位體交換層析柱，例如住化分析 中心股份有限公司製之SUMICHIRAL 0A 5 0 0 0等，以HPLC 分離溶出後，經由卜氮-4-硝基苯並-2-丨S -1,3-二畦（以 下，簡稱NBD)之後柱（post-coluin)衍生物化而檢拥之 方法（後柱衍生物化法 >、或者將反應液中之目的化合物 事先NBD衍生物化，並令其以使用HPLC之逆相層析分離 出HBD衍生物化物予以檢測之方法〔Willia· J.Lindblad and Robert F·Diege 1 豔ann， Analytical Biochemistry 、138卷、390〜395頁、1984年〕（前柱（pre-coluin)衍 生物化法）等。NBD衍生物化物之檢拥均可依其螢光（檄 發波長5 0 3 ΠΒ、螢光波長541η·)测定而進行。 令如上述處理之培餐菌體中被確認L-腩胺酸第4位羥 化酶生成之轉形體，於輿前述轉形醱之培餐條件之相同 條件下進行培餐，令反-4-羥基-L-脯胺酸生成蓄積， 並由該培餐物採集反-4-羥基-L-脯胺酸，則可製造反 -4-羥基-L-脯胺酸。 於該培餐中，視痛要亦可將2-氣戊二酸及二價鐵離子 添加至培餐液中。 依據本發明所製造之反-4-羥基-L-_胺酸，可經由 前述之後柱衍生物化法和前柱衍生物化法，予以定量分 析。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29，i·着 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（•斗） 〔實施例〕 實施例1 L-脯胺酸第4位羥化_离表現質釀之溝築 令序列縝M2記載之DH A和序列编號/記載之DNA，使 用Applied Biosysteis公司裂380A DNA合成檐予以合 成。 該合成DN A之3·終端25b P為設計成相互為互補之序列 。再者，於該合成DNA中，含有編碼來自指狀孢子囊鯖 種RH1之L-脯胺酸第4位羥化_蛋白N終端部分之餘基 序列，而該齡基序列中，來自指狀孢子囊菌種RH1之鐮 基序列為被按照作成在大腸桿菌中之表現上最適當密碼 组地施行部分專一性的鐮基取代。 以該合成DNA作為引子及棋板，進行PCR。 PCR為使用含有Pfu DNA聚合酶（STRATAGENE公两製） 0.50、Pfu DNA聚合酶用X10鑀衝液（STRATAGENE公司製） 2#1、DMS0 2#1、各 2·5ιΜ dNTP液 1#1、序列编號 2 記 載之合成DN A和序列纗號3記載之合成DN A各2// Μ之反應 液20#1,於9β°0培餐5分鐽後，於96*0 - 2分鐘、50*0-1分鐘、75eC- 1分鐘之培餐工程重覆35次之條件下進行。 反應終了後，將該反應液令以15%聚丙烯醯胺隳（Atoy 股份有限公司製、Pjel NPU-15L)電泳、確認107bp放大 Η段之生成。 該107b ρ之放大Η段使用日本Eadoy股份有限公司製之 D a v i n c h i k u n ( P e n t 〇 u c h R e c 〇 v e r y - N B - 7 0 0 0 型）回收後， 将該lfl7bp之DNAH段的兩終端以Hind III及Sal I切斷。 -16- 各紙度4用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（β ) 該 Hind Ill-Sal I切斷 Η 段使用 Bio, Inc.製 MERiaid K i t回收。囲收液量為16/ile 依參考例1記載之方法所作成之質« PTT2-40H DNA, 以Ba*HI及Pvu II切斷後，反應液令以瓊脂糖膠電泳， 確認生成2值Η段〇該片段内，含有L-脯胺酸羥化酶構 造基因之長片段使用Bio-Rad公爾製之Prep-A-gene回收 ，並使用寶酒造公司製之Blunting Kit將終蟥平》化後 ,使用寶酒造公司製之Ligation Kit予以連結環狀化。 使用該連結琛狀化之質齷，依常法轉形至大腸桿菌JM 1B9株，並將該轉形釀塗布至含有50>ug/Bl安比西林之 LB洋菜培餐基後，於37eC下培餐1晩。 依常法由生長之轉形體菌落萃取出質醱，並以限制酶 切割確認其構造。 以上之結果，取得_除pTr 2-40H部分序列之質體pTr 2-40Η△(第 1 圖）。 令取得之質體pTr2-40HADNA以Hind III及Sal I切斷 後，於該切斷部位，使用寳酒造公司之Ligation Kit, 将Hind III及Sal I處理之上述PCR放大片段插入· 使用所得之質體，依常法轉形至大腸捍鹧XLI-Blue MRF’株，並將該轉形體塗布至含有50>ug/Bl安比西林之 LB洋菜培養基後，於37°C下培餐1晩。 依常法由生長之轉形體菌落萃取出質體，取得質釀 pwFHl(第 2 圖 該質體之構造以限制酶予以確認。關於PC R放大Μ段 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 ______ B7 五、發明説明（4 ) 插入部分，使用Applied Biosystens公司製之鹼基序列 決定組件（Taq DyeDeoxy™ Ter艱inator Cycle Sequencing Kit)，決定基鹼基序列。該鹸基序列示於序列编號1。 該質體除了於構造基因之5·終端開始之Sal I部位與 來自指狀孢子囊菌種RH1之鹼基序列部分不同以外，為 编碼與來自指狀孢子囊薗種RH-1之L-脯胺酸第4位羥化 酶完金相同胺基酸序列之構造基因DNAH段，為具有與 Ptrpx 2之轉錄方向相同方向插入之構造（第2圖）。 如表1所示，具有PWFH1之轉形體為比使用作為基因 來源之指狀孢子囊菌種RH1株，生産1400倍之L -脯胺酸 翔化酶，且比具有ΡΤΓ2-40Η之轉形體，生産約5·4倍之 L-脯胺酸羥化酶。 表1 菌種 薗體活性1 相對活性2 指狀孢子菌種RH1 3 0.028 1 . 0 大腸捍薗ATCC12435 3 . 7 132 /pTr2-R0H 4 大腸捍菌ATCC12435 40 1400 /PWFH 1 4 1):菌體活性為以每lmg濕菌體之酵素活性（ϋ/iag濕細 胞）表示。1 ϋ為每1分鐘生成1 n m ο 1反-4 -羥基 -L-脯胺酸之酵素活性。 -18- 本紙張尺度適用中國國家#· : CNS ) A4ill格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

_裝· 訂 Φ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（7 ) 2):相對活性為以指狀孢子囊齠種RH1株之生産酵素 活性視為1而示於表中。 3>:由參考例2記載之反-4-羥基-L-腩胺酸之産量 算出菌龌活性。 4):由實施例8記載之反-4-羥基-L-論胺酸之産董 算出菌體活性。 實施例2脯胺酸分解条缺損株之作成 令大腸榫鯖ATCC 1 2 4 3 5之參舆脯胺酸分解之基因putA ，依以下之方法破壊，作成_胺酸分解条缺損株β 将國立遣傳學研究所保存菌株之大腸桿菌Μ Ε8 39 5株 C F- : pyr D34 trp-45 his-68 thyA 25 thi deoR33 gelK 35 xyl-7 itl-2 nalAl r p s L118 Λ R (λ ) 一 appAl putA : Tn5(Mu+ )〕《{菌至含有35//g/*l康徽素之LB培 養基，並遇夜培養。 於該培養液1〇〇#1中，添加混合P1噬菌體液1〇〇#1, 並放置5分鐘。 令該放置液舆含有1〇·Μ CaCl2之3·1 LB軟洋菜培餐 基混合，並於含有lGiM CaCl2之LB洋菜培餐基上疊靥 後，於3 7 °C下培餐7小時。 培養後，将所得洋菜培餐基表面之溶囍産物，回收至 含有10iM CaCl2之2il LB培餐基中。 於該回收液中添加〇.5»1氦仿，使用渦流混合器予以混 合後，於3000rp·下離心15分鐘，並將所得之上清液使用作 為Ρ1噬菌醱溶菌産物。令該噬薗産物溶液50// 1舆在含有10·Μ -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4g ( 210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

581813 A7 _B7_ 五、發明説明（、〇

CaCl22LB培養基中培養之大腸桿®ATCC 12435培養液 ΙΟΟ/il混合，並於含有35/ig/ml，康徽素之LB洋菜培養 基上塗布後，於37 °C下培養1曰。 令經由該培養生長之康徽素耐性株於0.85%之NaCl中 懸浮後，塗布於 Pro-TTC 平板（K2 HP〇4 7g/l、KH2 P〇4 3g/l、MgS〇4 〇.lg/l、腫蛋白脖 2g/l、氯化 2,3,5 -三 苯基四唑鏹 0.025g/l、 L-Pro 2g/l、洋菜 15g/l、 ρΗ7·2) ，並於3 7 °C下培養1〜2日。 將經由該培養基而在Pro-TTC平板上形成白色菌落之 国株，選出作為喪失分解營養化脯胺酸能力之菌株，且 因而取得脯胺酸分解活性缺損大腸桿菌WT1株。該菌株 為在平成8年8月7日於工業技術院生命工學工業技術 硏究所、日本茨城縣筑波市東1 丁目1-3號(郵遞區號305)以FERM BP-5618寄存。 又於中華民國86年9月1日寄存於食品工業發展硏究所，寄存編號CCRC 910082。 實施例3脯胺酸生物合成基因proB74及proA表現質體之 構築 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依以下之方法，構築將編碼來自大腸桿菌y-榖胺醯 激酶之proB基因，變換成對於脯胺酸反饋抑制脱敏性之 變異型基因之ΡΓΟΒ74基因，及编碼來自大腸捍菌7-穀 胺醯磷酸還原酶之proA基因的表現質體PPF1。 令含有來自大腸桿菌之pboB及pboA基因之質體P P R 〇 - 1 〔由大腸桿_K83株（FERM BP-2807)所取得〕以EcoRV切 開，且於瓊脂糖膠電泳後，以P r e p - A - g e n e D N A Purification System(BI0-RAD公司製）取得含有部分 _ 2 0 -本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（巧） proB基因之約lkb之DNAH段〇 将該DUA片段舆PDC19(||湎造公司製）之Snal切開物連 結，取得質體PBAB51(第3圖）。 令孩質體中之pr〇B基因，依以下之方法，變換成公知 C A .M.Dandekar and S.L.Oratsu, J . Bacterio 1 . 1 70, 5 9 7 3 ( 1 988 )〕之對於脯胺酸反餓抑制脱敏性之變異型基 因 proB74〇 令序列編號4所示之寡核甘酸A 1及序列编號5所示之 寡核甘酸A2,使用Applied Biosysteis公司製之380A DNA合成機予以合成。 將寡核甘酸A1和M13引子M3(寶酒造公司製、目錄Ηο· 38 3 1 )作為一組引子，並使用ΡΒΑΒ51作為模板，經由PCR 法令變異型proB基因之ΡΓΟΒ74基因的部分序列予以放大c PCR為使用含有0.1/ig PBAB51、各2//M之寡核甘酸A1 和M13引子H3、1ϋ之Taq DNA聚合酶（簀酒造公司製）、 1.6#1之dNTP混合物（寶酒造公司製、目錄NO.4030)、 内附之鍰衝液2//1之反鼴液20#1,重覆30次94·〇-30秒 鐘、52°C-3Q秒鐘、WC-1分鐘之培餐工程•且最後於 72 °C培餐5分鐘下進行。 以同樣之方法，將寡核甘酸A2和H13引子RV(寶酒造公 司製、目錄NO. 38 3 0A)作為一組引子，並使用PBAB51作 為模板，經由PCR法令變異型proB基因之部分序列予以 放大。 經由PC R法所放大之該2種DNA,分別令以瓊脂糖隳 電泳後，使用 Prep-A-gene DUA Purificatoin Systea -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7_ 五、發明説明（/ ) (BIO-RAD公司製）予以純化。 以該2種純化DNAH段之混合物作為棋板•並使用M13 引子M3及M13引子RV作為引子，依據上述同樣之方法， 進行PCR及鈍化，取得含有ΡΓ〇Β基因鐮基序列之約lkb之 DNA片段。 該 DNAH 段以 Eco 0 6 5 1 及 Sac II 切開，取得 Eco 0 6 5 1 -Sac I I切開片段。 将該切開片段輿PPR0-1之Eco 0 6 5 1 -Sac II切開DNA片 段（約6.8fcbp)建结，製作PPR0-1之proB基因變換成脱敏 型ΡΓΟΒ74基因之質龌pPR074 (第4園）。 令序列鏞號6所示之寡核甘酸pi及序列鑕號7所示之 寡核甘酸P2,使用Applied BiosysteBS公司製380A DNA 合成機予以合成。 以該Pi、P2作為引子，並使用質Ι1ρΡγο74作為模板， 經由PCR法令ΡΓΟΒ74及？1*(^基因予以放大。 PCR 為使用含有 0.1/zg 之 PPR074 ·各 2//M 之 pi、pi、 III之TakaRa Ex Taq(寶酒造公司製、編號RR001Q)、 1.6//1之dNTP混合物（寶酒造公司製、目錄No.4030)之 反應液20#1,重覆30次之94eC-l分艟、42°C- 2分鐘、 72°C - 3分鐘之培餐工程而進行。 將該反應液令以瓊脂糖膠《泳，依常法举取出含有 ΡΓΟΒ74 及 proA 之 2 3 7flbp 放大片段，並使用（SOECLEAH II ΚΙΤ(ΒΙ0 101, INC·製）回收該DNA片段。回收之2 3 7 0 bp DNAH段以Hind III及Ban HI切斷後，以酒精沈澱法取 得酒精沈澱物。將該酒精沈醱物溶解於5>ul之TE中，並 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（Η ) 使用作為ΡΓΟΒ74及proAM段。 將該ΡΓΟΒ74及ΡΓ〇Α片段，和質釀pSTV29(寶酒造公司 製）之Hind III-Ba»HI切開DNAH段，使用賫酒迪公司製 之DNA Ligation Kit連結，並構築proB74及proA片段之 插入質體。 該質體依常法轉形至大腸桿株後，於含有30 #g/il 氣徽素，〇·1·Μ IPTG、40/ig/al X-Gal 之 LB 洋菜 培餐基上塗布，並於37°C下培餐一晩。 將經由該培養形成白色®落之菌株，依常法萃取出質 體，並以限制酶切割確認該質鼸之構造。 依據上述之方法，取得编碣在脱敏型毅胺醛激路 之U终端結合以冷-半乳糖甘_之《-片段N終端8 «胺 參 基酸殘基（1&〇2.»^61'1〇之融合蛋白質之基因、及？1*(^基 因為在Plac支配下存在之質醱PPF1(第5圏）。 該融合蛋白質之構造基因（lacZ.Nter«-proB7〇之鐮 基序列和胺基酸序列示於序列鏞號8。 實施例4經由含有躕胺酸生物合成条基因表現質鼸之轉 形醱生産反-4-羥基論胺酸 使用實施例3所構築之質體PPF1,轉形實施例2所取 得之大腸桿_WT1株，並取得轉形株大腸桿«WT1/PPF1。 以實施例1所構築之脯胺酸第4位羥化_表現質鼸 PWFH1,轉形實施例2所取得之WT1株，並取得大腸桿菌 WT1/ PWFH10 由該轉形株大腸桿®WTl/pWFHl依氯化0法，製作受 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

581813 A7 B7 五、發明説明（》) 容細胞，並導入實施例3所製作之質髏PPF1,且具有兩 質體之轉形株大腸桿菌WTl/pWFHl/pPFl,經由選出可 在含有30# g/ml氯徽素和50# g/ml安比西林之LB培養基 上生長之菌落而取得。 令 WT1、 WTl/pPFl、 WTl/pWFHl 及 WTl/pWFHl/pPFl 分別 於含有康徽素37.5#g/ffll、安比西林10/zg/ial、氯微素 30//g/ml、安比西林 100//g/ml及氣徽素 30//g/ml之 LB 培養基中，3 7 °C下培養1 6小時。 令該培養液各1〇〇#1,於裝入含有2%(W/v)碩酸鈣之 1 0 Μ 1 M e d 7培養基（葡萄糖2 %、硫酸銨1 %、K 2 Η P 0 4 0.1%、NaCl 0.2%、MgSO 4 0 . 0 5 % x FeSO 4 0.0 2 7 8 % CaCl2 0·0015%、蛋白腺0.8%)之寬型試管M20X 200mm)中植薗，並於30 °C下培養24小時。 該培養上清液中之L-脯胺酸及反-羥基-卜脯胺酸 含量示於表2。 第2表 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

聚· 訂

菌株 L-Pro 反· 4 ·羥基-L- (g/1) 脯胺酸（g/1) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 大腸捍菌WT 1 0.0 5 0.0 0 大腸桿菌 WTl/pPFl 1.20 0.00 大腸桿菌 WTl/pWFHl 0.05 0.07 大腸桿 gWTl/pWFHl/pPFl 0.20 0.67 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -24- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7__ 五、發明説明（—） 於具有脯胺酸生物合成糸基因表現質體pPF1菌株中， L-脯胺酸之生成為顯箸增加，將卜脯胺酸第4位經化酶 表現質體PWfH1及脯胺酸生物合成条基因表現質體pPF1 之共存轉形體，與單獨保持L-脯胺酸第4位羥化酶表現 質體之轉形體相比較，可確認反-4_翔基-L-脯胺酸之 産量為顯箸增加❶ 實施例5 L -脯胺酸第4位羥化酶和脯胺酸生物合成条基 因proB74及proA表現質體之構築 將來自指狀孢子囊菌種RH1之L-脯胺酸第4位翔化酶 基因、脯胺酸生物合成条基因ProB&ProA全部基因保持 於單一質體上，並令其表現之表現質體P»FP1，依以下 之方法構築。 將實施例1作成之PtfFH1作為模板，並依PCR法將L -脯 胺酸第4位羥化酶之構造基因予以放大。 PCR為使用含有〇.l#g PWFH1質體、0.5U Pfu DNA聚 合酶（Stratagene公司製）、2# 1之Pfu DNA聚合酶用X 10 缓衝液（S T R A T A G E N E 公司製）、2 1 D M S 0、1 1 之各 2.5mM dNTP液、序列编號9記載之合成DNA和序列编號 10記載之合成DNA各2 Μ之反應液20 1，於96°C培養5 分鐘後，於9 6 °C - 2分鐘、5 8 °C - 1分鐘、7 5 °C - 3分鐘之培 養工程重覆3 0次之條件下進行。 反應終了後，將該反應液令以瓊脂糖膠電泳，且依常 法萃取出含有L-脯胺酸第4位羥化酶基因之約8 0 0 bp之 放大 Η 段，並使用 GENECLEAN II KIT(BI0 101, INC 製） -25- 表紙认遘用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

581813 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（μ ) 回收孩DNAH段。 該回收之DNAH段以Hind III及Eco RI切斷後，令以瓊 脂糖膠霄泳，並使用 6ENECLEAN 11 KIT(BI0 101，IHC 製）回收具有L-脯胺酸第4位羥化酶基因之該Hind III-Eco RI切斷DHA片段。 該L-脯胺酸第4位羥化酶基因片段、和質體pBluescript 11 K S (t) ( s t r a t a g e n e 公司製）之 H i n d 111 - E c 〇 R I 切開 D N A 片段，使用賽酒造公司製之DNA Ligation Kit予以連綰， 構築插入L-脯胺酸第4位羥化Μ片段之質龌PBII-40H (第6圖）。 將實施例3作成之PPR0 7 4作為模板，並依PCR法将 ΡΓ〇Β74及proA基因予以放大〇 PCR 為使用含有 〇.l#g PPR074 質體、1ϋ TakaRa Ex Taq(寶酒造公司製、電碼RR001Q)、2#1之TakaRa Ex Taq 用xlO緩衝液（賫酒造公司製）、1·6β1之各2·5*Μ dNTP 液、序列编號11記載之合成DNA和序列编號12記載之合 成DNA各2>uM之反應液20>ul,於94°C-1分鐘、42°C-2分 鐘、75°C -3分鐘之培餐工程重覆30次之條件下進行。 反應終了後，將該反應液令以瓊脂糖膠霉泳·且依常 法萃取出含有proB74及proA基因之約2.3kbp之放大片段 ,並使用 GENECLEAU II ΚΙΠΒΙ0 101· INC·製）回收該 DNAH段。回收之DNA片段以Bai HI及Eco RI切斷後，進 行酚/氦仿處理、酒精沈澱•並回收該DHAH段。令此 含有ΡΓΟΒ74及？1^(^基因之0^片段、和上述質膿？811-4(^ -26- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 _B7__ 五、發明説明（< ) 之Hind III-Eco RI切開DNAH段，使用寳酒造製之DHA Ligation Kit予以連結，構築含有L-腩胺酸第4位羥化 酶基因、proB74及proA之質釀pBII-4 0HBA(第7園>« 將質«ρΒΙΙ-4 OH BA以Hind III及Bai HI切開，並令 以瓊脂糖謬電泳，取得含有L-脯胺酸第4位理化_基因 、proB74及proA之約3.16kbp之DNAH段。又，将實施例 1所作成之PWHF1以Hind III及Ban HI切開，並令以瓊 脂耱膠電泳，取得不含有L-脯胺酸第4位羥化_基因且 含複製起黏之約2.6kbp之DNA片段。將所取得之2偵DHA Η段，使用竇酒造公司製之UNA Ligation Kit予以連結 ，構築於色胺酸縱排啓動基因下方，表現L-脯胺酸第4 位羥化酶、ΡΓΟΒ74蛋白質、proA蛋白質之質鼸PWFP1(第 8圏）〇 實施例β使用轉形體大腸桿齠¥1：1/0¥?81〇?卩1及大腸桿 菌WTl/pWFfPl生産反-4-羥基-L-脯胺酸 令轉形株WTl/pWFHl/pPFl株於含有安比西林100# g/*l 及氯徽素30#g/Bl之50ftl Med 4G培餐基〔葡萄糖2%, 聚蛋白諫（日本製藥公司製U%、酵母萃取物（Difco公 司製）0·5%、NaCl 1%、硪酸鈣2%、ρΗ7·0〕、轉形株 WTl/pWFPl株於含有安比西林100/ig/蘭1之δ〇Βΐ Med 4G 培餐基中，分別植菌後，於30Ό下振盪培餐16小時β 以該培餐液作為種培餐液，並分別於裝入2公升Med 7培餐基之5公升醱酵缸中植_，且於WTl/pWFHl/pPFl 株之培餐中，再添加安比西林100>ug/il及氯徽素30>ug/*l ，於WTl/pWFPl株之培餐中，再添加安比西林100>ug/Bil -27- 本紙張尺度適用中鼴鼸家梂導（CNS)A4規格（ 210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 ______B7_ 五、發明説明（4 ) ,並於培餐粗度3〇·〇、攪拌數400迺轉/分、通氣董1 公升/培餐液1公升/分之條件下培餐。 又，於¥Tl/p¥FHl/pPFl之培餐中，在培餐之第8小時 ，添加 0 · 2ιΜ之 IPT6。 再者，兩醣株均在培餐之第24小時，添加與培養開始 時同種，同濃度之抗生素。 於培餐中，葡萄糖為以大約1%之濃度適時添加至培 餐液，並使用NH4OH將下限制於ρΗ6·5β又，於培餐5 小時以後，令攪拌數變化至250〜7 0 0 ΓΡ»,使培餐液之 溶氣濃度控制為培餐開始時之1/15。 於99小時培養後，將該培餐液離心分離，並定量所得 上清液中之反-4-羥基-L-脯胺酸含置，結果確認在 WTl/pWFHl/pPFl株中生成替積 156nM(20.5g/U 之反 -4-羥基-L-脯胺酸，於WTl/pWFPl株中生成蓄積191騰Μ (25.0g/l)之反-4-羥基脯胺酸。 實施例7經由含L-脯胺酸第4位羥化酶基因及脯胺酸生 物合成条基因表現質體之轉形體生産反- 4-羥基-L-脯胺酸 使用實施例5所構築之質體PWFP1,轉形實施例2所 取得之大腸桿菌WT1株，並取得轉形株大腸桿鍤WT1/ pWFPle 将WTl/pWFPl於含有安比西林100/1 g/*l之LB培餐中 下培養16小時。將該培餐液100# 1,於裝入含有 2%(w/v)磺酸鈣之lOnl Med 7培養基之寬型試管（於20 -2 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 _____B7__ 五、發明説明（V ) X200rom)中植薗，並於3〇°C下培養24小時。 該培養上清液中之L-脯胺酸為〇.56g/L,反_4_羥基 -L-脯胺酸為2.4g/Le 實施例8使用轉形體之薗體生産反-4-羥基-L-脯胺酸 將轉形體大腸桿菌ATCC 12435/pTr2-40H於含有50//g/ml 安比西林之3nl LB培養基中植菌並於30X：振盪培養一晚 後，離心分離該培養液，取得大腸桿jgATCC 1 2 4 3 5/pTr2 -40H之濕菌體。 將轉形體大腸桿薗ATCC 12435/pWFHl於含有安比西 林100#g/ail之100ml Med4培養基〔聚蛋白膀（日本製藥） 1%、酵母萃取物（Difco)0.5%、NaCl 1%〕中植薗， 並於3 Q°C下振盪培養1 6小時。 該培養液於裝入2公升Med 7培養基（葡萄糖2%、硫 酸銨 1%、K 2 ΗΡ 0 4 0.1 %. NaC 1 0.2%. MgSO 4 0.0 5 % 、FeS〇4 0·0278%、 CaCl2 0.0015%、蛋白腺 0·4%) 之5公升醱酵缸中植薗後，添加200ιηΜ之L-Pro，並於培 養溫度33 X：、通氣量1公升/培養液1公升/分之條件 下培養48小時。 於溶氣濃度為到達初值之I〆15時，藉由以攪拌數400 迴轉/分作為基準，且以700迴轉/分作為上限，變化 攪拌數，則可將溶氧濃度控制於初值之1 / 1 5。 於培養中，令葡萄糖不可變無之情形下，將L-脯胺酸 以約50mM適時地添加，並使用NHaOH,將下限控制於 p Η 6 . 5 〇 -2 9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 雒（：!〜297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 581813 A7 B7 _ 五、發明説明（W ) 將經由該培養所取得之培養液離心分難，取得大腸桿 菌 ATCC 12435/ΡΤΓ2-40Η及大腸桿 0ATCC 12435/pWFHl 之濕菌體。 該兩菌體之濕菌體視霈要可在-20 T!下冷凍保存，且 可在使用時解凍使用。 於反窿液〔 2 4 0 mM之MES緩衝液（ρΗ6·5)中，含有12bM L-脯胺酸、24iaM 2-氣戊二酸、4aM硫酸亞鐵及8mM L-抗 壞血酸〕250>ul中，加入4%(w/v)之濕菌體量，並於 35 °C下反應10分鐘。令反應液於1GQ°C加熱2分鐘而停 止反應。 將該反應停止液離心分離，並定量所得上清液中之反 4_羥基-卜脯胺酸含量，結果確認在大腸桿菌八1(^ 12 435/ pTr2-40H株中，生産 3mmol/l之反-4 -羥基- L-脯胺酸，於大腸桿薗ATCC 1 2 4 3 5 /pWFHl株中，生産16 ranol/1之反_4·羥基-L-脯胺酸。相對於1-脯胺酸第4 位羥化酶之菌體活性分別為7 · 5及40 U/ mg濕細胞。 參考例1 L-脯胺酸第4位羥化酶表現質體之構築 令序列编號13記載之意義股DNA引子、和序列编號14 記載之反意義股DNA引子，使用Applied Biosystems公 司製之380 A DNA合成機予以合成。以該合成DNA作為引 子，並以PRH71〔由含有該質體之大腸桿_S0LR/PRH71 (FERM BP- 5 0 2 5)依常法取得〕作為模板，進行PCR。 PCR為使用含有之PRH71、意義股及反意義股DNA 引子各 2/iM、Pfu DNA 聚合酶（STRATAGENE 公司製）0.125 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 _B7_ 五、發明説明（巧） Μ/μ K DMSO 10% x Tris-HC 1 (ρΗ8.2)20·Μ, KC1 10·Μ 、硫酸銨6nM、氛化钱2iM、Triton X- 1 0 0 0、1%牛血淸 白蛋白10ng/>ul之反應液20/zl，於96°0培餐5分鐘後 ，並於96°C-2分鐘、58°C-1分鐘、75°C-1分鏟之培 餐工程重覆30次之條件下進行^ 反應終了後，将該反應液令以璜脂糖膠電泳，確認生 成编碼卜脯胺酸第4位羥化酶構造基因之844bp放大Η段〇 將該844b ρ之放大Η段依常法由璜脂糖膠中萃取出來， 並使用Bio-Rad公司製之Prep-A-gene回收Η段。回收之 844bp DNA片段之兩終端以Hind III及Ba· HI切躕後， 經由酒精沈澱法，取得酒精沈鎩物。將該酒精沈澱物溶 解於5// 1之TE中。 將PBR 3 2 2作為基醱，且具有Ptrp為以2傾直列之啓動 基因 Ptrpx 2之質嫌 pKYP200 〔 Agricultural Biological Cheiistry (Agric. Biol· Che麗·）， 48卷，669〜675頁 ( 1 98 4年）〕舆合成連結子組合所製作之ATG製龌PTrS32 〔由大腸桿菌 JM109/pTrS32(FERU BP- 5408)網製〕，以 Hind III及Ban HI切斷。於該切斷部位中，使用賨酒造 公司製之Ligation Kit,插入經以Hind III及Ba» HI切 斷處理之上述L-脯胺酸第4位羥化_構造基因片段β 使用所取得之質體，依常法轉形大腸桿菌XLl-Blue MRF«株，並將該轉形體於含有50>ug/*l安比西林之LB洋 菜培養基上塗布後，於37°C下培養1晩。 依常法由可生長之轉形龌菌落萃取出質體t並以限制 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公麟 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（* ) 酶切割確涊其構造。鼷於構造基因部分，使用Applied Biosystens公苛裂之_基序列決定組件（Taq DyeDeoxy™ Terninator Cycle Sequencing Kit),決定鹼基序列， 確認為序列编號15所示之鐮基序列。 經由該方法，取得於Ptrpx 2之轉錄方向同方向插入 编碼L-脯胺酸第4位羥化酶構造基因之DNAH段之質體 ΡΤΓ2-40Η (第 9 圖）。 參考例2使用指狀孢子囊豳種之菌體生産反-4-羥基 -L-脯胺酸 將SR3培餐基（含有葡萄糖1.0%,可溶性澱粉1·〇%、 酵母萃取物0.5%、胰蛋白諫0.5%、肉萃取物0.3%及 磷酸鎂0.05%,並以6Ν NaOH調整至pH 7.2之培養基） 於試管中分注lOal,並於120eC殺菌20分鐘。於此培餐 基中，将HT洋菜平板培養基中生長之指狀孢子囊豳種 (Pactylosporangiu祖 sp.)RHl植人一白金耳，並於 28°C 振盪培餐2日，且使用作為種培餐液。 將Dfl培餐基（含有可溶性澱粉5¾、大豆粉1.5%,磷 酸-鉀0.05%、硫酸鎂七水*0.05%及碩酸鈣0.5%,並 以6N Na0H(辋整至pH7.()之培養基）於試管中分注1〇·1, 並於120 °(3殺_20分鐘。於此培養基中，無鯖接種入上逑 之種培餐液111,並於28 ·0振盪培餐2日。 所得之培餐液以8000γρβ、10分鐘、4°C下離心分離， 取得薗體。 該薗體以80iM T?S〔N-三（羥甲基）甲基-2-胺基乙烷 磺酸〕緩衝液（PH7.5)洗淨後，離心分離，取得濕菌臁。 -32- 本紙》度4 *1中*國穹鏢率（CNS )八4規格（21〇χ297公釐） I— i —.1— ϋ— Li I 丨_ V I -- I- - I n 1 ....... I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7_ 五、發明説明（W ) 1 \ \ 將該濕菌體150*g，於1·5»1之反應液〔於含有4·Μ L-脯胺酸、8»Μ 2-氣戊二酸、4·Μ L-抗壤血酸、2·Μ硫 酸亞雄之80·Μ TES緩衝液（ρΗ7·5)中添加1·4%(ν/ν) Haiiin溶液（Naiiin S-215(日本油脂股份有限公司製） 4克溶解於二甲苯10·1)〕中懸浮，並於30*0進行反應 30分鐘。 反應終了後，將該反應液離心分離，並定量所得上清 液中之反-4-羥基-L-腩胺酸含董，結果確認生産84 #«〇1/1之反-4-羥基-L-脯胺酸。該薗株對於L-脯胺 酸第4位羥化酶之菌體活性為0.028U/ig濕細胞。 〔發明之效果〕 若依據本發明，則可提供工業性地製造作為醫藥品之 合成原料或食品添加物之有用的反-4-羥基-L-脯胺酸 之方法，及提供該方法中含有有用的L-脯胺酸羥化酶基 因、且脯胺酸合成条之活性經強化之轉形體〇 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

581813 A7 B7 五、發明説明（^ ) 〔序列表〕 序列编號：1 序列長度：8 1 6 序列類型：核酸 股數：雙股 拓蹼學；直鏈狀 序列種類；其他核酸 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 序列： ATG CTG ACC CCG ACC GAA CTG AAA CAG TAT CGT GAA GCG GGC TAT CTG 48 Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gin Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu 1 5 10 15 CTG ATT GAA GAT GGC CTG GGC CCG CGT GAA GTC GAC TGC CTG CGC CGG 96 Leu lie Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg 20 25 30 GCG GCG GCG GCC CTC TAC GCG CAG GAC TCG CCG GAC CGC ACG CTG GAG 144 Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gin Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu Glu 35 40 45 AAG GAC GGC CGC ACC GTG CGC GCG GTC CAC GGC TGC CAC CGG CGC GAC 192 Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg Asp 50 55 60 CCG GTC TGC CGC GAC CTG GTC CGC CAC CCG CGC CTG CTG GGC CCfi GCG 240 Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala 65 70 75 80 ATG CAG ATC CTG TCC GGC GAC GTG TAC GTC CAC CAG TTC AAG ATC AAC 288 Met Gin lie Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gin Phe Lys lie Asn 85 90 95 GCG AAG GCC CCG ATG ACC GGC GAT GTC TGG CCG TGG CAC CAG GAC TAC 336 Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gin Asp Tyr 100 105 110 本紙張尺度適用中國國家梯聾) “圪格（210X297公釐） •34- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 _ B7___ 五、發明説明（〇 ) ATC TTC TGG GCC IGA GAG GAC GGC ATG GAC CGT CCG CAC GTG GTC AAC 384 lie Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His Val Val Asn 115 120 125 GTC GCG GTC CTG CTC GAC GAG GCC ACC CAC CTC AAC GGG CCG CTG TTG 432

Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr llis Leu Asn Gly Pro Uu Leu 130 135 140 TTC GTG CCG GGC ACC CAC GAG CTG GGC CTC ATC GAC GTG GAG CGC CGC 480

Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu lie Asp Val Glu Arg Arg 145 150 155 160 GCG CCG -GCC GGC GAC GGC GAC GCG CAG TGG CTG CCG CAG CTC AG(JCC 528

Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gin Trp Leu Pro Gin Leu Ser Ala 165 170 175 GAC CTC GAC TAC GCC ATC GAC GCC GAC CTG CTG GCC CGG CTG ACG GCC 576

Asp Leu Asp Tyr Ala lie Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala 180 185 190 GGG CGG GGC ATC GAG TCG GCC ACC GGC CCG GCG GGC TCG ATC CTG CTG 624

Gly Arg Gly lie Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser lie Leu Leu 195 200 205 TTC GAC TCC CGG ATC GTG CAC GGC TCG GGC ACG AAC ATG TCG CCG CAC 672

Phe Asp Ser Arg lie Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro His 210 215 220 CCG CGC GGC GTC GTC CTG GTC ACC TAC AAC CGC ACC GAC AAC GCC CTG 720

Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu 225 230 235 240 CCG GCG CAG GCC GCT CCG CGC CCG GAG TTC CTG GCC GCC CGC GAC GCC 768

Pro Ala Gin Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala 245 250 255

ACC CCG CTG GTG CCG CTG CCC GCG GGC TTC GCG CTG GCC CAG CCC GTC 81G

Thr Pro Leu Val Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Uu Ala Gin [〕ro Val 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —35 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

581813 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7__五、發明説明（Μ ) 260 265 270 序列编號：2 序列長度：6 4 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： TGAGGAAAGC TTATGCTGAC CCCGACCGAA CTGAAACAGT ATCGTGAAGC 50 GGGCTATCTG CTGA 64 序列编號：3 序列長度：6 6 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DHA 序列： CCGGAATTCG TCGACTTCAC GCGGGCCCAG GCCATCTTCA ATCAGCAGAT 50 AGCCCGCTTC ACGATA 66 序列编號：4 序列長度：2 2 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成D N A 序列： GACCCGTGCT AATATGGAAG AC 22 序列編號：5 序列長度：2 2 本紙張尺度適用中國國家#準（CNS ) Μ規格 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（％ ) 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： GTCTTCCAT A TTAGCACGGG TC 22 序列编號：6 序列長度：3 3 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： GGCAAAGCTT CATGAGTGAC AGCCAGACGC TGG 33 序列编號：7 序列長度：3 3 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： TTTGCAGGAT CCGGTTTTAT TTACGCACGA ATG 33 序列编號：8 序列長度：1 1 2 5 序列類型：核酸 鎖數：雙股 拓蹼學；直鏈狀 序列種類；其他之核酸 序列： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格0¾¾¾7公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

581813 A7 __B7 五、發明説明（4 ) ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTC ATG AGT GAC AGC CAG ACG CTG GTG 48

Met Thr Met lie Thr Pro Ser Phe Met Ser Asp Ser Gin Thr Lou Val 15 10 15 GTA AAA CTC GGC ACC AGT GTG CTA ACA GGC GGA TCG CGC CGT ΠΈ ΛΛΙ： %

Val Lys Leu Gly Thr Ser Val Leu Thr Gly Gly Ser Arg Arg Leu Asn 20 25 30 CGT GCC CAT ATC GTT GAA CTT GTT CGC CAG TGC GCG CAG TTA CAT GCC 144

Arg Ala His lie Val Glu Leu Val Arg Gin Cys Ala Gin Leu His Ala .35 40 45 GCC GGG CAT CGG ATT GTT ATT GTG ACG TCG GGC GCG ATC GCC GCC GGA 192

Ala Gly His Arg lie Val lie Val Thr Ser Gly Ala lie Ala Ala Gly* 50 55 60 CGT GAG CAC CTG GGT TAC CCG GAA CTG CCA GCG ACC ATC GCC TCG AAA 240

Arg Glu His Leu Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Ala Thr lie Ala Ser Lys 65 70 75 80 CAA CTG CTG GCG GCG GTA GGG CAG AGT CGA CTG ATT CAA CTG TGG GAA 288

Gin Leu Leu Ala Ala Val Gly Gin Ser Arg Leu lie Gin Leu Trp Glu 85 90 95 CAG CTG TTT TCG ATT TAT GGC ATT CAC GTC GGG CAA ATG CTG CTG ACC 336

Gin Leu Phe Ser He Tyr Gly lie His Val Gly Gin Met Leu Leu Thr 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 100 105 110 CGT GCT ΛΑΤ ATG GAA GAC CGT GAA CGC TTC CTG AAC GCC CGC GAC ACC 384

Arg Ala Asn Met Glu Asp Arg Glu Arg Phe Leu Asn Ala Arg Asp Thr 115 、 120 125 CTG CGA GCG TTG CTC GAT AAC AAT ATC GTT CCG GTA ATC ΛΑΤ GAG AAC 432

Leu Arg Ala Leu Leu Asp Asn Asn lie Val Pro Val lie Asn Glu Asn 130 135 140 GAT GCT GTC GCT ACG GCA GCG ATT AAG GTC GGC GAT AAC GAT AAC CTT 480 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（y)

Asp Ala Val Ala Thr Ala Ala lie Lys Val Gly Asp Asn Asp Asn Leu 145 150 155 160 TCT GCG CTG GCG GCG ATT CTT GCG GGT GCC GAT ΛΛΛ CTG TTG CTG CTG 528

Ser Ala Leu Ala Ala lie Leu Ala Gly Ala Asp Lys Leu Leu Leu Leu 165 170 175 ACC GAT CAA AAA GGT TTG TAT ACC GCT GAC CCG CGC AGC AAT CCG CAG 576

Thr Asp Gin Lys Gly Leu Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ser Asn Pro Gin 180 185 190 GCA GAA CTG ATT AAA GAT GTT TAC GGC ATT GAT GAC GCA CTG CGC GCG 624

Ala Glu Leu lie Lys Asp Val Tyr Gly lie Asp Asp Ala Leu Arg Ala 195 200 205 ATT GCC GGT GAC AGC GTT TCA GGC CTC GGA ACT GGC GGC ATG AGT ACC· 672 lie Ala Gly Asp Ser Val Ser Gly Leu Gly Thr Gly Gly Met Ser Thr 210 215 220 AAA TTG CAG GCC GCT GAC GTG GCT TGC CGT GCG GGT ATC GAC ACC ATT 720

Lys Leu Gin Ala Ala Asp Val Ala Cys Arg Ala Gly lie Asp Thr lie 225 230 235 240 ATT GCC GCG GGC AGC AAG CCG GGC GTT ATT GGT GAT GTG ATG GAA GGC 768 lie Ala Ala Gly Ser Lys Pro Gly Val lie Gly Asp Val Met Glu Gly 245 250 255 ATT TCC GTC GGT ACG CTG TTC CAT GCC CAG GCG ACT CCG CTT GAA AAC 816 lie Ser Val Gly Thr Leu Phe His Ala Gin Ala Thr Pro Leu Glu Asn 260 265 270 CGT ΑΛΑ CGC TGG ATT TTC GGT GCG CCG CCG GCG GGT GAA ATC ACG GTA 864

Arg Lys Arg Trp lie Phe Gly Ala Pro Pro Ala Gly Glu lie Thr Val 275 280 285 GAT GAA GGG GCA ACT GCC GCC ATT CTG GAA CGC GGC AGC TCC CTG TTG 912

Asp Glu Gly Ala Thr Ala Ala lie Leu Glu Arg Gly Ser Ser Leu Leu 290 295 300 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本氓张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -39- 581813 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（^ ) CCG AAA GGC ΛΤΤ ΑΛΑ AGC GTG ACT GGC ΛΛΤ TTC TCG CGT GGT GAA GTC 960 Pro Lys Gly lie Lys Ser Val Thr Gly Asn Phe Ser Arg Gly Glu Val 305 310 315 320 ATC CGC ATT TGC AAC CTC GAA GGC CGC GAT ATC GCC CAC GGC GTC AGT 1008 lie Arg lie [ys Asn Leu Glu Gly A「g Asp lie Ala llis Gly Val Sn「 325 330 335 CGT TAC AAC AGC GAT GCA ΤΤΛ CGC LGT ATT GCC GGA UAL UAU TUG UAA 1ϋ[)ϋ Arg Tyr Asn Ser Asp Ala Leu Arg Arg lie Ala Gly flis His Ser Gin 340 345 350 GAA ATT GAT GCA ΑΤΛ CTG GGA TAT GAA TAC GGC CCG GTT GCC GTT CAC 1104 Glu Me Asp Ala lie Leu Gly Tyr Glu Tyr Gly Pro Val Ala Val His 355 360 365 CGT GAT GAC ATG ATT ACC CGT 1仍 Arg Asp Asp Met Ile Thr Arg 370 375 序列编號：9 序列長度：3 7 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： TATCGATAAG CTTATGCTGA CCCCGACCGA ACTGAAA 3 7 序列编號：1 〇 序列長度：3 3 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA -4 0 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 _B7 _ 五、發明説明（Μ ) 序列： GGCAGAATTC TAGACGGGCT GGGCCAGCGC GAA 33 序列编號：1 1 序列長度：3 8 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： AAAATT6AAT TCCAGAGAAT CATGAGTGAC AGCCAGAC 38 序列编號：12 序列長度：3 6 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： ACCCGGATCC ATTTACGCAC GAATGGTGTA ATCACC 36 序列编號：1 3 序列長度：3 7 序列類型：核酸 拓蹼學；單股 序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： GTGAGGAAAG CTTATGCTGA CCCCGACGGA GCTCAAG 37 序列编號：14 序列長度：3 6 -41- 本紙張尺t K中《 * (標準（CNS ) A4規格（210 X ：297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

581813 經濟部中央標準局貝工消費合作社印褽 A7 B7__五、發明説明（# ) 序列類型··核酸拓蹼學；單股序列種類；其他之核酸、合成DNA 序列： GCCTGCGGGA TCCTAGACGG GCTGGGCCAG CGCGAA 36 序列编號：15 序列長度：8 1 6 序列類型：核酸 股數：雙股 序列種類；基因組DHA 起源 生物名：指狀孢子囊薗種 株名：R Η 1 決定特徽之方法：Ε 序列： ATGCTGACCC CGACGGAGCT CAAGCAGTAC CGCGAGGCGG GCTATCTGCT-CATCGAGGAC 60 GGCCTCGGCC CGCGGGAGGT CGACTGCCTG CGCCGGGCGG CGGCGGCCCT CTACGCGCAG 120 GACTCGCCCG ACCGCACGCT GGAGAAGGAC GGCCGCACCG TGCGCGCGGT CCACGGCTGC 180 CACCGGCGCG ACCCGGTCTG CCGCGACCTG GTCCGCCACC CGCGCCTGCT GGGCCCGGCG 240 ATGCAGATCC TGTCCGGCGA CGTGTACGTC CACCAGTTCA AGATCAACGC GAAGGCCCCG 300 ATGACCGGCG ATGTCTGGCC GTGGCACCAG GACTACATCT TCTGGGCCCG AGAGGACGGC 360 ATGGACCGTC CGCACGTGGT CAACGTCGCG GTCCTGCTCG ACGAGGCCAC CCACCTCAAC 420 GGGCCGCTGT TGTTCGTGCC GGGCACCCAC GAGCTGGGCC TCATCGACGT GGAGCGCCGC 480 GCGCCGGCCG GCGACGGCGA CGCGCAGTGG CTGCCGCAGC TCAGCGCCGA CCTCGACTAC 540 GCCATCGACG CCGACCTGCT GGCCCGGCTG ACGGCCGGGC GGGGCATCGA GTCGGCCACC 600 GGCCCGGCGG GCTCGATCCT GCTGTTCGAC TCCCGGATCG TGCACGGCTC GGGCACGAAC 660 ATGTCGCCGC ACCCGCGCGG CGTCGTCCTG GTCACCTACA ACCGCACCGA CAACGCCCTG 720 CCGGCGCAGG CCGCTCCGCG CCCGGAGTTC CTGGCCGCCC GCGACGCCAC CCCGCTGGTG 780 CCGCTGCCCG CGGGCTTCGC GCTGGCCCAG CCCGTC 816 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2i〇x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7_ 五、發明説明（41 ) 〔圖式之簡單說明〕 〔第1圖〕 第1圖為示出質體ΡΤΓ2-40Η△之作成工程之圈示· _中，以塗黑粗線表示之部分為示出含L-脯胺酸第4 位羥化酶基因。Ap為表示來自PBR3 2 2之安比西林耐性基 因，PtrPX2為表示令來自大腸桿菌之色胺酸操縱子之啓 動基因為以2値直列之啓動基因（縱排色胺酸啓動基因） 。箭頭為表示基因之轉錄及轉譯之方向❶尚，圖中僅示 出與質醱之作成有闢你之限制_部位。 〔第2圖〕 第2圖為示出質體PWFH1之作成之工程之圖示β 圖中，以網狀粗線表示之部分為示出經Hind III及 Sal I處理之PC R放大片段的插入部分。以塗黑組線表示 之部分為示出含有來自指狀孢子囊菌種RH1之L-脯胺酸 第4位羥化酶基因之部分β Ap為表示來自PBR322之安比 西林耐性基因，Ptrpx 2為表示令來自大腸桿菌之色胺 酸操縱子之啓動基因為以2值直列之啓動基因（縱排色 胺酸啓動基因筋頭為表示基因之轉錄及轉譯之方向 。尚，圖中僅示出與質龌之作成有藺之限制酶部位· 〔第3圖〕 第3圖為示出質體PBAB51之作成工程之示。 圖中，黑色網狀表示之部分為含有脯胺酸合成条酵素 基因？1'〇874及？1'(^之部分。八？為表示來自？811322之安比 西林耐性基因，lacZ為表示彡-半乳糖甘酶α Η段構造 基因。Tc為表示來自PBR 3 2 2之四琛徽素耐性基因。箭頭 -4 3 - 本紙張尺度適用中國國家標涞（CVS ) Λ4呒蝽（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（#) 為表示基因之轉錄及轉譯之方向。尚，圖中僅示出與質 體之作成有两你之限制酶部位《 〔第4園〕 第4圖為示出質體PPR074之作成工程之國示。 圖中，黑色網狀表示之部分為含有脯胺酸合成糸酵素 基因proB74及proA之部分。塗黑之部分為示出含有proB 74及proB唯一不同_基對之ΡΓΟΒ74基因之一部分。Tc為 表示來自PBR 3 2 2之四環徽素耐性基因。箭頭為表示基因之 轉錄及轉譯之方向·尚，圖中僅示出輿質體之作成有蘭 係之限制_部位。 〔第5圖〕 第5圖為示出質體pPFl之作成工程之圖示。 圖中，塗黑粗線表示之部分為示出含有脯胺酸合成条 酵素基因ΡΓΟΒ74及proA之部分。C*r為表示含有來自Tn9 之氦徽素耐性基因之部分❶PACYC· ori為表示來自PACYC 184之複製起始基點，P lac為表示lac啓動基因，lacZ為 表示/S-半乳糖甘酶αΗ段構造基因。lacZ.Nteri-proB 7 4為表示/8-半乳糖甘酶《片段構造基因之H終端部分和 ΡΓΟΒ74基因之融合基因。箭頭表示基因之轉錄及轉譯之 方向。尚，圖中僅示出舆質龌之作成有蘭傺之限制酶部 位。 〔第6圖〕 第6圖為示出質體PBII-40H之作成工程之國示。 圜中，塗黑粗線表示之部分為示出含有L-脯胺酸第4 位羥化酶基因之部分❶Ap為表示來自PBR 3 2 2之安比西林 -4 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 581813 A7 B7 五、發明説明（β ) 耐性基因，lacZ為表示/?-半乳糖甘酶《片段構造基因。 筋頭為表示基因之轉錄及轉譯之方向。尚，圖中僅示出 舆質體之作成有鼷你之限制酶部位。 〔第7圖〕 第7圖為示出質體PBII-4 OBBA之作成工程之圏示。 圖中，塗黑粗線表示之部分為示出含有L-脯胺酸第4 位羥化酶基因之部分。黑色網狀部分為示出含有脯胺酸 合成条酵素基因ΡΓΟΒ74及proA之部分。Ap為表示來自 PBR322之安比西林耐性基因，lacZ為表示办-半乳糖甘 酶α片段構造基因。箭頭為表示基因之轉錄及轉繹之方向 。尚，圖中僅示出舆質體之作成有蘭僳之限制酶部位。 〔第8團〕 第8圖為示出質體pWFPl之作成工程之團示。 圖中，塗黑粗線表示之部分為示出含有L-脯胺酸第4 位羥化酶基因之部分。黑色網狀部分為示出含有脯胺酸 合成条酵素基因ΡΓΟΒ74及proA之部分。Ap為表示來自 PBR322之安比西林耐性基因，lacZ為表示半乳糖甘 酶cr片段構造基因。PtrpX2為表示令來自大腸桿菌之 色胺酸操縱子之啓動基因為以2個直列之啓動基因（縱 排色胺酸啓動基因）。箭頭為表示基因之轉錄及轉譯之 方向。尚，圖中僅示出與質體之作成有關傺之限制酶部 位。 〔第9圖〕 第9圖為示出質體pTr2-4 0H之作成工程之圖示。 -4 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)八4規格（2丨〇, V▲、蠓 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

581813 A7 B7 五、發明説明（钟） 圖中，塗黑粗線表示之部分為示出含有L-脯胺酸第4 位羥化酶基因之部分。Ap為表示來自PBR 3 2 2之安比西林 耐性基因，PtrpX2為表示令來自大腸桿菌之色胺酸操 縱子之啓動基因為以2個直列之啓動基因（縱排色胺酸 啓動基因）。箭頭為表示基因之轉錄及轉譯之方向。尚， 圖中僅示出與質體之作成有關偽之限制酶部位。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 -46- 衣紙张K度遢用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

1. 5 81^13 ，修iL 從7· 15補充 公告本 六、申請專利範圍 第861 12674號「反-4-羥基-L-脯胺酸之製法」專利案 (92年7月14日修正） 六申請專利範圍： 1.一種反-4-羥基-L-脯胺酸之製法，其係大腸桿菌 (E s c h e r 1 c h i a c ο 1 i )經強化之L -脯胺酸生物合成系活 性且含編碼L-脯胺酸第4位羥化酶活性DNA之轉形 體.，將此等轉形體在培養基上培養獲得培養物，以菌 體或此等處理物作爲酶源，於存在2 -氧戊二酸及二胃 鐵離子下，於水性介質中使L-脯胺酸轉變成反-4-經基 -L -脯胺酸，從該水性介質中採集所生成的反-4 -羥基. L-脯胺酸。 2·如申請專利範圍第1項之製法，其中L-脯胺酸生物合 成系之活性強化爲受到脯胺酸反饋抑制之脯胺酸合成 系酵素基因上產生變異、在宿主中導入編碼此種脯胺 酸反饋抑制顯著減少之酵素基因而達成。 3.如申請專利範圍第1項之製法，其中L-脯胺酸生物合 成系之活性強化爲經由L -脯胺酸生物合成相關酵素之 編碼基因的導入而達成。 4 .如申請專利範圍第3項之製法，其中基因爲來自大腸 桿菌之proB或proA基因。 5 ·如申請專利範圍第3項之製法，其中基因爲來自大腸 桿菌之proB74基因。 6 ·如申請專利範圍第1項之製法，其中水性介質爲培養液。