JPS60141284A - Ｌ―プロリンの製法 - Google Patents
Ｌ―プロリンの製法Info
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- JPS60141284A JPS60141284A JP58247867A JP24786783A JPS60141284A JP S60141284 A JPS60141284 A JP S60141284A JP 58247867 A JP58247867 A JP 58247867A JP 24786783 A JP24786783 A JP 24786783A JP S60141284 A JPS60141284 A JP S60141284A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- proline
- microorganism
- hybrid plasmid
- dna
- serratia
- Prior art date
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- Granted
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規微生物及びそれを用いるＬ−プロリンの製
法に関する。
法に関する。
Ｌ−プロリンは医薬、飼料添加物として有用なアミノ酸
であり・種々の微生物を用いて発酵法により生産されて
いる。
であり・種々の微生物を用いて発酵法により生産されて
いる。
しかしながらセラチア属に属する微生物はＬ−プロリン
分解酵素能が強く、かつＬ−プロリン生合成が代謝調節
をうけるため通常Ｌ−プロリンを生成蓄積しない。本発
明者らは先にかかるセラチア属微生物を変異誘導して得
られるＬ−プロリン分解酵素欠損性でかつプロリンアナ
ローブ及び／又はプリンアナローブに耐性な変異株、或
いはＬ−プロリン分解酵素欠損性でかつ高浸透圧下にプ
ロリンアナローブに耐性な変異株が優れたＬ−プロリン
生産能を有することを見出し、Ｌ−プロリンの製法とし
て特許出願を行なった（特開昭５８−６０９９５号及び
特願昭５７−１０７９４１号〕。
分解酵素能が強く、かつＬ−プロリン生合成が代謝調節
をうけるため通常Ｌ−プロリンを生成蓄積しない。本発
明者らは先にかかるセラチア属微生物を変異誘導して得
られるＬ−プロリン分解酵素欠損性でかつプロリンアナ
ローブ及び／又はプリンアナローブに耐性な変異株、或
いはＬ−プロリン分解酵素欠損性でかつ高浸透圧下にプ
ロリンアナローブに耐性な変異株が優れたＬ−プロリン
生産能を有することを見出し、Ｌ−プロリンの製法とし
て特許出願を行なった（特開昭５８−６０９９５号及び
特願昭５７−１０７９４１号〕。
本発明者らはより優れたＬ−プロリン生産能を有する微
生物を取得すべく史に研究を屯ねた結果、上記の微生物
の有するＬ−プロリン生産を司る染色体フラグメントを
切り出しベクタープラスミドに組み込んだのも・セラチ
ア属微生物に移入することにより、Ｌ−プロリンを極め
て効率よく生産する微生物を得ることに成功すると共に
、該微生物を用いることによりＬ−プロリンを工業的有
利に製造し得ることを見出し本発明を完成するに至った
。
生物を取得すべく史に研究を屯ねた結果、上記の微生物
の有するＬ−プロリン生産を司る染色体フラグメントを
切り出しベクタープラスミドに組み込んだのも・セラチ
ア属微生物に移入することにより、Ｌ−プロリンを極め
て効率よく生産する微生物を得ることに成功すると共に
、該微生物を用いることによりＬ−プロリンを工業的有
利に製造し得ることを見出し本発明を完成するに至った
。
即ち８本発明はＬ−プロリン生産能を有するセラ千了廖
に属する微生物から採取したＬ−プロリン生産を司る染
色体フラグメントを組み込んだハイブリッドプラスミド
をセラチ属に属する微生物に含有せしめた微生物並びに
該微生物を培地で培養して、培地中にＬ−プロリンを生
成蓄積せしめ。
に属する微生物から採取したＬ−プロリン生産を司る染
色体フラグメントを組み込んだハイブリッドプラスミド
をセラチ属に属する微生物に含有せしめた微生物並びに
該微生物を培地で培養して、培地中にＬ−プロリンを生
成蓄積せしめ。
、これを採取するＬ−プロリンの製法である。
（染色体ＤＮＡおよびその調製〕
本発明においてＬ−プロリン生産を司る染色体フラグメ
ント（以下、染色体ＤＮＡと称する）とはグルタミン酸
からプロリンを合成する酵素、即ち、グルタメートキナ
ーゼ、グルタメート・ホスフェートリダクターゼおよび
ピロリン・５・カルボキシレートリダクターゼのそれぞ
れの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸の１部又は全部を
含有するものを云い、とりわけグルタメートキナーゼの
遺伝情報を担うｏＮＡ（１２１，下＊ Ｐｒｏ Ｂと称
する）。
ント（以下、染色体ＤＮＡと称する）とはグルタミン酸
からプロリンを合成する酵素、即ち、グルタメートキナ
ーゼ、グルタメート・ホスフェートリダクターゼおよび
ピロリン・５・カルボキシレートリダクターゼのそれぞ
れの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸の１部又は全部を
含有するものを云い、とりわけグルタメートキナーゼの
遺伝情報を担うｏＮＡ（１２１，下＊ Ｐｒｏ Ｂと称
する）。
グルタメート・ホスフェートリダクターゼの遺伝情報を
担うＤＮＡ（以下＋ Ｐｒｏ Ａと称する）２よびビロ
リン・５・カルボキシレートリダクターゼの遺伝情報を
担うＤＮＡ（以下、 Ｐｒｏ Ｃと称する）を含む染色
体ＤＮＡ 、あるいはｐｒｏ Ｂ ＳよびＰｒ。
担うＤＮＡ（以下＋ Ｐｒｏ Ａと称する）２よびビロ
リン・５・カルボキシレートリダクターゼの遺伝情報を
担うＤＮＡ（以下、 Ｐｒｏ Ｃと称する）を含む染色
体ＤＮＡ 、あるいはｐｒｏ Ｂ ＳよびＰｒ。
Ａを含む染色体ＤＮＡが好ましい。又、ｐｒｏＢは上記
のいずれの染色体ＤＮＡに含まれる場合もフィー／ドパ
ツク調節から解除されている変異型であるのがとりわけ
好ましい。
のいずれの染色体ＤＮＡに含まれる場合もフィー／ドパ
ツク調節から解除されている変異型であるのがとりわけ
好ましい。
かかる染色体ＤＮ’Ａの供給源となる微生物としてはセ
ラチア属に属し、Ｌ−プロリン生産能を有する微生物で
あればいかなる微生物であってもよぐ２．とりわけＬ−
プロリン分解酵素欠損性でかつプロリンアナローブ及び
／又はプリンアナローブに耐性ｆｌセラ千アーマルセッ
センス、Ｌ−プロリン分解酵素欠屓性でかつ高浸透圧下
、にプロリンアとしては例えばセラチア マルセッセン
スＤＴｒ−１２（微工研条寄第１７１号）（Ｌ−プロリ
ンオキシダーゼ欠損性でかつ３．４−デヒドロ−〇Ｌ−
プロリンおよびＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸に耐
性な変異株）・セラチア マルセッセンス０Ａｒ−）３
Ｑ（微工研条寄第１７３号）（Ｌ−プロリンオキシダー
ゼ欠損性でかつ高濃度の塩化ナトリウム存在下でＬ−ア
ゼチジン−２−カルボン酸に耐性な変異株）等をあげる
ことができる。
ラチア属に属し、Ｌ−プロリン生産能を有する微生物で
あればいかなる微生物であってもよぐ２．とりわけＬ−
プロリン分解酵素欠損性でかつプロリンアナローブ及び
／又はプリンアナローブに耐性ｆｌセラ千アーマルセッ
センス、Ｌ−プロリン分解酵素欠屓性でかつ高浸透圧下
、にプロリンアとしては例えばセラチア マルセッセン
スＤＴｒ−１２（微工研条寄第１７１号）（Ｌ−プロリ
ンオキシダーゼ欠損性でかつ３．４−デヒドロ−〇Ｌ−
プロリンおよびＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸に耐
性な変異株）・セラチア マルセッセンス０Ａｒ−）３
Ｑ（微工研条寄第１７３号）（Ｌ−プロリンオキシダー
ゼ欠損性でかつ高濃度の塩化ナトリウム存在下でＬ−ア
ゼチジン−２−カルボン酸に耐性な変異株）等をあげる
ことができる。
これらの微生物から染色体ＤＮＡを採取する方法として
は例えば微生物の菌体をリゾチーム処理。
は例えば微生物の菌体をリゾチーム処理。
界面活性剤（ｓｎｓ・ザルコシル（Ｎ−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム）等Ｊで処理したのち、除蛋白しつ
いでエタノール沈殿せしめる常法〔Ｊ、 Ｍａｌ、Ｂｉ
ｏｌ、 、３ ．２０８ 、 （１９６１） 。
コシン酸ナトリウム）等Ｊで処理したのち、除蛋白しつ
いでエタノール沈殿せしめる常法〔Ｊ、 Ｍａｌ、Ｂｉ
ｏｌ、 、３ ．２０８ 、 （１９６１） 。
Ｈｌｏａｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、＋ ７λ
、６１９（１９６３）」により容易に実施できる。
、６１９（１９６３）」により容易に実施できる。
（ベクタープラスミドＤＮＡ：Ｂよびその調製）上記の
如くして得られる染色体ＤＮＡを組み込むベクタープラ
スミドとしてはセラチア属に属する微生物へ移入でき・
かつ移入微生物中で復製可能なプラスミドであればよく
特に限定されないが例えばｐ Ａ ＣＹ Ｃ１７７、ｐ
ｌ ５ Ａ ＣＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
如くして得られる染色体ＤＮＡを組み込むベクタープラ
スミドとしてはセラチア属に属する微生物へ移入でき・
かつ移入微生物中で復製可能なプラスミドであればよく
特に限定されないが例えばｐ Ａ ＣＹ Ｃ１７７、ｐ
ｌ ５ Ａ ＣＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１３４．１１４１（１９７８）コ、ｐＢＲ３２２ＣＧｅ
ｎｅ、２．９５Ｌ１９７７）Ｊ、ｐＢＲ３１３［Ｇｅｎ
ｅ、２．７５（１９７７）Ｊ、ｐＢＲ３；２５［Ｇｅｎ
ｅ 、、４．１２１ （１９７８）Ｊ 、ｐＭＢｌ（Ｆ
ｅｄ、Ｐｒｏａ、 、 ３５ 、２０３７ （１９７６
） Ｊ 、 ｐＫＰ１１５５ＣＦ’プラスミドのＥｃｏ
ＲＩｆ ５断片（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、、 Ａｃａｄ、
！１ｌｃｉ、 、７３．６４ 、（１９７６コール耐性
、スペクチｌマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性遺
伝子を結合したプラスミドコを含むミニＦ等を用いるこ
とができ、これらのプラん スミドはいった労セラチγ属微生物に移入したのち、常
法により抽出したものを用いればより好ましい結果が得
られる。
ｎｅ、２．９５Ｌ１９７７）Ｊ、ｐＢＲ３１３［Ｇｅｎ
ｅ、２．７５（１９７７）Ｊ、ｐＢＲ３；２５［Ｇｅｎ
ｅ 、、４．１２１ （１９７８）Ｊ 、ｐＭＢｌ（Ｆ
ｅｄ、Ｐｒｏａ、 、 ３５ 、２０３７ （１９７６
） Ｊ 、 ｐＫＰ１１５５ＣＦ’プラスミドのＥｃｏ
ＲＩｆ ５断片（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、、 Ａｃａｄ、
！１ｌｃｉ、 、７３．６４ 、（１９７６コール耐性
、スペクチｌマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性遺
伝子を結合したプラスミドコを含むミニＦ等を用いるこ
とができ、これらのプラん スミドはいった労セラチγ属微生物に移入したのち、常
法により抽出したものを用いればより好ましい結果が得
られる。
（ハイブリッドプラスミドの調製〕
上記で得られた染色体ＤＮＡとベクタープラスミドＤＮ
Ａからハイブリッドプラスミドを副長するには制限エン
ドヌクレアーゼ（例えばＨｌｎｄ［。
Ａからハイブリッドプラスミドを副長するには制限エン
ドヌクレアーゼ（例えばＨｌｎｄ［。
Ｐｓｔ １． ＢａｍＨ１等〕を用いて染色体ＤＮＡと
プラスミドＤＮＡ鎖を切断したのち、リガーゼ（例えば
＋Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ等）で処
理するか、或いはその切断末端によってはターミナルト
ランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等で処理したの
ちりガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する等の常法（
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎイ入 Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、 ６８ 、４１ （１９７９
） 、遺ヰ子操作実験法（高木康敬編著、講談社サイエ
ンティフィック）１３５〜１５９頁〕により実施する・
ことができる。
プラスミドＤＮＡ鎖を切断したのち、リガーゼ（例えば
＋Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ等）で処
理するか、或いはその切断末端によってはターミナルト
ランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等で処理したの
ちりガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する等の常法（
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎイ入 Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、 ６８ 、４１ （１９７９
） 、遺ヰ子操作実験法（高木康敬編著、講談社サイエ
ンティフィック）１３５〜１５９頁〕により実施する・
ことができる。
かくして得られたハイブリッドプラスミドはそのまま形
質転換に用いることもでき、又ハイブリッドプラスミド
を各種の変異を百する変異株に移入して目的とするハイ
ブリッドプラスミドを保持する菌株を予め選択したのち
該菌株からハイブリッドプラスミドを常法により抽出し
これを宿主微生物に移入するごともでき、か力）る方法
によるときは形質転換株の選択が容易であり好ましい。
質転換に用いることもでき、又ハイブリッドプラスミド
を各種の変異を百する変異株に移入して目的とするハイ
ブリッドプラスミドを保持する菌株を予め選択したのち
該菌株からハイブリッドプラスミドを常法により抽出し
これを宿主微生物に移入するごともでき、か力）る方法
によるときは形質転換株の選択が容易であり好ましい。
力１かる目的に用いる変異株としては例えばセラチア属
、ニジエリシア属に属する微生物であってプロリン生産
能を有しない微生物であるか、アンピシリン感受性、カ
ナマイシン感受性等の変異の一部又は全部を有する変異
株があげられる。
、ニジエリシア属に属する微生物であってプロリン生産
能を有しない微生物であるか、アンピシリン感受性、カ
ナマイシン感受性等の変異の一部又は全部を有する変異
株があげられる。
（宿主微生物）
ハイブリッドプラスミドを含有せしめる６主微生物とし
てはセラチア属に属し、形質転換可能な微生物であれば
よく６例えばセラチア・マルセッセンスの野生株の他、
前記染色体ＤＮＡの供給源として用いた微生物を好適に
用いることができる。
てはセラチア属に属し、形質転換可能な微生物であれば
よく６例えばセラチア・マルセッセンスの野生株の他、
前記染色体ＤＮＡの供給源として用いた微生物を好適に
用いることができる。
（ハイブリッドプラスミドによる形質転換）形質転換方
法は例えば低温下に宿主微生物細胞を塩化カルシウム溶
液で処理し、菌体の膜透過性を増大させ・ハイブリッド
ＤＮＡを１背主微生物中にとり込ませる方法（Ｊ、 Ｍ
ｏｌ、’ Ｂｉｏｌ、ｊ３．１５９（１９７０）Ｊ等の
常法を採用することができる。
法は例えば低温下に宿主微生物細胞を塩化カルシウム溶
液で処理し、菌体の膜透過性を増大させ・ハイブリッド
ＤＮＡを１背主微生物中にとり込ませる方法（Ｊ、 Ｍ
ｏｌ、’ Ｂｉｏｌ、ｊ３．１５９（１９７０）Ｊ等の
常法を採用することができる。
ハ）＜シて得られた形質転換法のうち、目的とするハイ
ブリッドプラスミドを含有する菌株の選択は生育したコ
ロニーのうちプロリン分泌能を符丁を菌株を釣菌・分離
することにより実施できる。
ブリッドプラスミドを含有する菌株の選択は生育したコ
ロニーのうちプロリン分泌能を符丁を菌株を釣菌・分離
することにより実施できる。
かくすることにより本発明に係る微生物、即ち、Ｌ−プ
０１１７生産能を有する微生物から採取したＬ−プロリ
ン生産を司る染色体フラグメントを組み入んだハイブリ
ッドプラスミドをセラチア属に属する微生物に含有せし
めた微生物を得ることができる。
０１１７生産能を有する微生物から採取したＬ−プロリ
ン生産を司る染色体フラグメントを組み入んだハイブリ
ッドプラスミドをセラチア属に属する微生物に含有せし
めた微生物を得ることができる。
かかる微生物として具体的には例えばセラチアマルセッ
センスＴ Ａ ５００６ （ｆ＆工研ｒＭ寄ｍ ７３６
３号１．セラチア マルセッセンスＴ Ａ５Ｑ０７（微
工研菌寄第７３６４号ン、セラチア マルセッセンスＴ
Ａ５００８（微工研菌寄第７３６５号）、セラチア マ
ルセッセンスＴＡ５００９（微工研菌第７３６６号）等
があげられる。
センスＴ Ａ ５００６ （ｆ＆工研ｒＭ寄ｍ ７３６
３号１．セラチア マルセッセンスＴ Ａ５Ｑ０７（微
工研菌寄第７３６４号ン、セラチア マルセッセンスＴ
Ａ５００８（微工研菌寄第７３６５号）、セラチア マ
ルセッセンスＴＡ５００９（微工研菌第７３６６号）等
があげられる。
〔Ｌ−プロリンの製法コ
本発明において使用するＬ−プロＩＩン生産用培地とし
ては、炭素源としてブドウ糖、シヨ糖、糖蜜の如き糖類
、コハク酸、クエン酸、フマール酸の如き有機酸、グリ
セロールの如き糖アルコール類等を１０〜２０呪、窒素
源としてフマール酸アンモニウム、コハク酸アンモニウ
ムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムの如き無機アンモニウム塩や尿素等を１〜
５％、有機栄養物としてコーンステイープリカー。
ては、炭素源としてブドウ糖、シヨ糖、糖蜜の如き糖類
、コハク酸、クエン酸、フマール酸の如き有機酸、グリ
セロールの如き糖アルコール類等を１０〜２０呪、窒素
源としてフマール酸アンモニウム、コハク酸アンモニウ
ムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムの如き無機アンモニウム塩や尿素等を１〜
５％、有機栄養物としてコーンステイープリカー。
ペプトン、酵母エキス等を０〜１％の範囲でそれぞれ適
当量含有し・他に無機物としてリン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸第一鉄を少量加えた培地が好適に使用
できる。
当量含有し・他に無機物としてリン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸第一鉄を少量加えた培地が好適に使用
できる。
これらの他に培地のｐＨを６〜８に床つために炭酸カル
シウム、アンモニア、クエンｆａ ｆｌＫ トラ必要に
応じて添加してもよい。更に・このような培地ＶＣＬＣ
ブーリン生合成の前駆＠寅となるようＬ−クルタミン酸
、Ｌ−アスパラギン酸などを適宜添加した培地も好適に
使用できる。
シウム、アンモニア、クエンｆａ ｆｌＫ トラ必要に
応じて添加してもよい。更に・このような培地ＶＣＬＣ
ブーリン生合成の前駆＠寅となるようＬ−クルタミン酸
、Ｌ−アスパラギン酸などを適宜添加した培地も好適に
使用できる。
本発明によれば、上記培地に本発明の微生物を接種し、
２５〜４０℃にて振とうあるいは通気かく拌の如き好気
的条件下で２〜６日間培養することによって培地中にＬ
−プロリンを著旦蓄漬せしめることができる。生成した
Ｌ−プロリンは培養終了後菌体その他の不溶物を除去し
たのち９例えばイオン交換樹脂に吸着せしめ、アンモニ
ア水テ溶離し、これを濃縮・結晶比するなどの通常の分
離精製操作によって容易に採取することができる。
２５〜４０℃にて振とうあるいは通気かく拌の如き好気
的条件下で２〜６日間培養することによって培地中にＬ
−プロリンを著旦蓄漬せしめることができる。生成した
Ｌ−プロリンは培養終了後菌体その他の不溶物を除去し
たのち９例えばイオン交換樹脂に吸着せしめ、アンモニ
ア水テ溶離し、これを濃縮・結晶比するなどの通常の分
離精製操作によって容易に採取することができる。
以下、実施例および参考例をあげて本発明を説明するが
、実施例中Ｌ−プロリンの確認はペーパーグロマトグラ
ムのニンヒドリン反応及びイ廿チン反応によって行ない
、その定量はロイコノストック・メゼンテロイデスＰ−
６９によるバイオアッセイによって行った。
、実施例中Ｌ−プロリンの確認はペーパーグロマトグラ
ムのニンヒドリン反応及びイ廿チン反応によって行ない
、その定量はロイコノストック・メゼンテロイデスＰ−
６９によるバイオアッセイによって行った。
実施例 １
（１）染色体ＤＮＡの調製
セラチア マルセッセンスＯＡ＋ｒ −８０（ａ工研条
寄第１７３号〕を１１のＬ−ブロス（ペプトン１％、酵
母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５幅・ｐＨ７，
２）に接種し・３０℃で４時間振とう培養し対数増殖期
の菌体を遠心分離により集めた。この菌体をリゾチーム
処理・ＳＤＳ処理して溶菌し、フェノール処理により除
蛋白したのちエタノール処理して染色体ＤＮＡを沈殿さ
せた。ついでＲＮ ａｓｅ （最終濃度１０μ９／ｉ
）を加え、３７℃で１時間処理して染色体ＤＮＡを積替
することにより染Ｑ体Ｄ Ｎ Ａ ８．６ｍｇを得た。
寄第１７３号〕を１１のＬ−ブロス（ペプトン１％、酵
母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５幅・ｐＨ７，
２）に接種し・３０℃で４時間振とう培養し対数増殖期
の菌体を遠心分離により集めた。この菌体をリゾチーム
処理・ＳＤＳ処理して溶菌し、フェノール処理により除
蛋白したのちエタノール処理して染色体ＤＮＡを沈殿さ
せた。ついでＲＮ ａｓｅ （最終濃度１０μ９／ｉ
）を加え、３７℃で１時間処理して染色体ＤＮＡを積替
することにより染Ｑ体Ｄ Ｎ Ａ ８．６ｍｇを得た。
（２） ベクタープラスミドＤＮＡの調製セラチア マ
ルセッセンス５ｒ４１の野生株８ｃ１００を文献Ｃ１（
ｏｌｅｃ−Ｇｅｎ、 Ｇｅｍｅｔ、、 １２４ ＋ １
９７（１９７３）Ｊ記載方法に準じて変異誘起処理し、
細胞外ヌクレアーゼ欠損性、制限エンドヌクレアーゼ欠
損性の変異株を何製する。ついでこの変異株をＮ−メヂ
ルーＮ′−ニトローＮ−ニトロソグアニジンで変異誘導
処理し、アンピシリン５μグ／−を含むＬ−ブロス寒天
培地にプレートあたり約１００コロニーが生じるように
塗布した。３０℃で１日培還したのち生じたコロニーに
ついてアンピシリン感受性を調べ・親株に比べてアンピ
シリン感受性の高い株を選択することにより細胞外ヌク
レアーゼ欠損性、制限エンドスフレアーゼ欠損性かつア
ンピシリン感受性の変異株を得た。ついでこれをＬ−ブ
ロス５０−に接種し３０℃で振とう培養して対数増殖期
まで生育せしめた菌体を集菌し、氷冷した０、１Ｍ塩化
カルシウム−０，５Ｍシヨ糖溶液２５ｒｎ！、にけん濁
した。０℃で３０分間放置したのち集菌し・氷冷した０
、１１７塩化カルシウム−０，５Ｍショ糖溶液５ｆｆ＋
／にけん濁した。この細胞けん濁液０．２ ｍ／にニジ
エリシア・コリに−１２から採取したプラスミドｐＫＰ
−１１５５のＤＮＡＩμグを加え、０℃で１時間放置し
た。４２℃で２分間処理したのち、Ｌ−ブロス２−を加
え３０℃で９０分間培養した。この培養液０１４−をア
ンピシリン５０ ｔ４１ｙｍｔを含むＬ−グロス寒天培
地に塗布し、３０℃で１日培養した。生じたコロニーを
釣菌分離することによりｐＫ’Ｐ１１５５を含有Ｔるセ
ラチア マルセツセンスを得り。
ルセッセンス５ｒ４１の野生株８ｃ１００を文献Ｃ１（
ｏｌｅｃ−Ｇｅｎ、 Ｇｅｍｅｔ、、 １２４ ＋ １
９７（１９７３）Ｊ記載方法に準じて変異誘起処理し、
細胞外ヌクレアーゼ欠損性、制限エンドヌクレアーゼ欠
損性の変異株を何製する。ついでこの変異株をＮ−メヂ
ルーＮ′−ニトローＮ−ニトロソグアニジンで変異誘導
処理し、アンピシリン５μグ／−を含むＬ−ブロス寒天
培地にプレートあたり約１００コロニーが生じるように
塗布した。３０℃で１日培還したのち生じたコロニーに
ついてアンピシリン感受性を調べ・親株に比べてアンピ
シリン感受性の高い株を選択することにより細胞外ヌク
レアーゼ欠損性、制限エンドスフレアーゼ欠損性かつア
ンピシリン感受性の変異株を得た。ついでこれをＬ−ブ
ロス５０−に接種し３０℃で振とう培養して対数増殖期
まで生育せしめた菌体を集菌し、氷冷した０、１Ｍ塩化
カルシウム−０，５Ｍシヨ糖溶液２５ｒｎ！、にけん濁
した。０℃で３０分間放置したのち集菌し・氷冷した０
、１１７塩化カルシウム−０，５Ｍショ糖溶液５ｆｆ＋
／にけん濁した。この細胞けん濁液０．２ ｍ／にニジ
エリシア・コリに−１２から採取したプラスミドｐＫＰ
−１１５５のＤＮＡＩμグを加え、０℃で１時間放置し
た。４２℃で２分間処理したのち、Ｌ−ブロス２−を加
え３０℃で９０分間培養した。この培養液０１４−をア
ンピシリン５０ ｔ４１ｙｍｔを含むＬ−グロス寒天培
地に塗布し、３０℃で１日培養した。生じたコロニーを
釣菌分離することによりｐＫ’Ｐ１１５５を含有Ｔるセ
ラチア マルセツセンスを得り。
かくして得られたセラチア マルセツセンスを４１のＬ
−ブロスに接種して３０℃で１８８時間振う培養した後
、菌体を遠心分離により集めた。
−ブロスに接種して３０℃で１８８時間振う培養した後
、菌体を遠心分離により集めた。
ついで得られた菌体をリゾチーム処理、ＳＯ３処理して
溶菌させた後、最終ＩＭとなるように塩化ナトリウムを
加えて１０今０，０００ｘＦ、３０分の遠心分離を行な
った。ついで上清を採取しフェノール処理した後エタノ
ールを加え遠心分離してＤＮＡを沈殿させた。沈殿した
ＤＮＡを１０ｆｉＭトリス塩酸−１ｍＭｇＤＴＡ溶液（
ｐＨ７，５）に溶解し、塩化セシウム・エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心法により分離精製することによ
り０．２ηのｐＫＰ１１５５プラスシトＤＮＡを得た。
溶菌させた後、最終ＩＭとなるように塩化ナトリウムを
加えて１０今０，０００ｘＦ、３０分の遠心分離を行な
った。ついで上清を採取しフェノール処理した後エタノ
ールを加え遠心分離してＤＮＡを沈殿させた。沈殿した
ＤＮＡを１０ｆｉＭトリス塩酸−１ｍＭｇＤＴＡ溶液（
ｐＨ７，５）に溶解し、塩化セシウム・エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心法により分離精製することによ
り０．２ηのｐＫＰ１１５５プラスシトＤＮＡを得た。
（３）ハイブリッドプラスミドの調装
前記は）で得た染色体ＤＮＡ□μグ、上記（２）で得た
ベクタープラスミドＤＮＡ１μ７の各々に制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍＨ工を通常の条件で作用させＤＮＡ鎖
を完全に切断した。６５℃、１０分間の熱処理後２両反
応液を混合しＴ４ファージ白来のＤＮ Ａ ｌガーゼを
通常の条件下で作用させてＤＮＴ錯を連結させた。
ベクタープラスミドＤＮＡ１μ７の各々に制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍＨ工を通常の条件で作用させＤＮＡ鎖
を完全に切断した。６５℃、１０分間の熱処理後２両反
応液を混合しＴ４ファージ白来のＤＮ Ａ ｌガーゼを
通常の条件下で作用させてＤＮＴ錯を連結させた。
（４） ハイブリッドプラスミドの選択ｆａ＋ グルタ
メート・ホスフェートリダクターゼ欠損性かつ制限エン
ドヌクレアーゼ欠損性のニジエリシア・コリＨＢＩＱ１
（ＡＴＣＣ３３６９４）をＬ−ブロス５０ｍ１．に接種
し、３７℃で振とう培養しその対数増殖期の中期まで生
育せしめた菌体を集菌しＴこ。ついで水冷した。、ｉＭ
塩化マグネシウム溶液５０−にけん濁したのち集菌し、
水冷し１こ０． Ｉ Ｍ塩化カルシウム溶液２５ｒｎｌ
にけん蜀した。０℃で３０分間放置したのち集菌し・氷
冷した０、１Ｍ塩化カルシウム溶液５ｍ１．にけん濁し
た。この細砲けん濁液に（３）で得たＤＮＡ溶液を加え
て３０分間水冷した後・４２℃で２分間熱処理すること
によりＤＮＡを細胞内にとりこませた。ついでこのけん
濁液にＬ−ブロス５０−を加え３７℃で１時間振とう培
養して遠心分離し、菌体を生理食塩水５−にけん濁した
。このけん菌液の少量を培地（グルコース０．５幅、リ
ンｌ！ｌＰ＠ニカリウム０．７％、リン酸第−カリウム
０．２％・硫酸アンモニウムｏ、 ｉ ％ −ｍ酸マグ
ネシウム・７水和物０，０１％。
メート・ホスフェートリダクターゼ欠損性かつ制限エン
ドヌクレアーゼ欠損性のニジエリシア・コリＨＢＩＱ１
（ＡＴＣＣ３３６９４）をＬ−ブロス５０ｍ１．に接種
し、３７℃で振とう培養しその対数増殖期の中期まで生
育せしめた菌体を集菌しＴこ。ついで水冷した。、ｉＭ
塩化マグネシウム溶液５０−にけん濁したのち集菌し、
水冷し１こ０． Ｉ Ｍ塩化カルシウム溶液２５ｒｎｌ
にけん蜀した。０℃で３０分間放置したのち集菌し・氷
冷した０、１Ｍ塩化カルシウム溶液５ｍ１．にけん濁し
た。この細砲けん濁液に（３）で得たＤＮＡ溶液を加え
て３０分間水冷した後・４２℃で２分間熱処理すること
によりＤＮＡを細胞内にとりこませた。ついでこのけん
濁液にＬ−ブロス５０−を加え３７℃で１時間振とう培
養して遠心分離し、菌体を生理食塩水５−にけん濁した
。このけん菌液の少量を培地（グルコース０．５幅、リ
ンｌ！ｌＰ＠ニカリウム０．７％、リン酸第−カリウム
０．２％・硫酸アンモニウムｏ、 ｉ ％ −ｍ酸マグ
ネシウム・７水和物０，０１％。
クエン酸ナトリウム０．０５＜、Ｌ−グルタミン酸ナト
リウム０．０１１シ、Ｌ−ロイシン０．００１１シ。
リウム０．０１１シ、Ｌ−ロイシン０．００１１シ。
Ｌ−メチオニンＱ、ＱＱｌｌＪ、Ｌ−リジン０．００１
Ｍ、チアミン０．０００５％、アンピッ９フ２０同様に
してハイブリッドプラスミドを精製分離した。
Ｍ、チアミン０．０００５％、アンピッ９フ２０同様に
してハイブリッドプラスミドを精製分離した。
（ｂｌ ？ｒｌ記（２）と同様にして得たセラチア マ
ルセツセンスの細胞外ヌクレアーゼ欠損性，制限エンド
ヌクレアーゼ欠損性で．かつアンピシリン感受性変異株
に上記＋ａｌで得られたＤＮＡをｔａ）と同様に処゛理
してとり込ませる。ついでアンピシリン５０ｓ／−を含
むＬ−ブロス寒天培地〔寒天１．５％〕に塗布し・３０
℃で２４時間培養した。生じたコロニーを釣菌分離しプ
ロリン生成能を有する菌株を選択し，得られる菌株力）
ら前記（２）と同様Ｖこしてノ１ス イブリっドプラ港ミドＤ ＩＩ Ａ 、 Ｔ Ａ ５
Ｑ ５を精製分離した。
ルセツセンスの細胞外ヌクレアーゼ欠損性，制限エンド
ヌクレアーゼ欠損性で．かつアンピシリン感受性変異株
に上記＋ａｌで得られたＤＮＡをｔａ）と同様に処゛理
してとり込ませる。ついでアンピシリン５０ｓ／−を含
むＬ−ブロス寒天培地〔寒天１．５％〕に塗布し・３０
℃で２４時間培養した。生じたコロニーを釣菌分離しプ
ロリン生成能を有する菌株を選択し，得られる菌株力）
ら前記（２）と同様Ｖこしてノ１ス イブリっドプラ港ミドＤ ＩＩ Ａ 、 Ｔ Ａ ５
Ｑ ５を精製分離した。
（５）形質転換株の調装
上記で得られたハイブリッドプラスミドＤＮＡア
形質転換株を副動し，カンピシリン５００μ’ｉ／ｍｌ
を含むし一ブロス寒天培地で培養することにより目的と
する形ａ転換株セラチア マルセッセンスＴＡ５００６
（微工１４升菌寄第７３６３号）を得た。
を含むし一ブロス寒天培地で培養することにより目的と
する形ａ転換株セラチア マルセッセンスＴＡ５００６
（微工１４升菌寄第７３６３号）を得た。
又．ハイブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５Ｑ転換株を
副動下ることにより目的とする形質転換株セラチア マ
ルセッセンスＴＡ５００７（微工研閃寄７３６４号）を
得た。
副動下ることにより目的とする形質転換株セラチア マ
ルセッセンスＴＡ５００７（微工研閃寄７３６４号）を
得た。
上記の微生物の含有するハイブリツドブラスミドＤＮＡ
ｌ） Ｔ Ａ ５ ０ ６にＰｒｏ Ｂ及びＰｒｏＡ
が組み込まれていることを確認するため，ＴＡ５００６
及Ｔ（ＥＩＯＩにとり込ませた。その結果，得られた形
質転換株はプロ１１ン生成能を有し、ＴＡ５００６及び
Ｔ Ａ３００７の各微生物に含まれるハイブリッドプラ
スミドにはＰｒｏ Ｂ 、 Ｐｒｏ Ａが組み込まれて
いることが確認された。
ｌ） Ｔ Ａ ５ ０ ６にＰｒｏ Ｂ及びＰｒｏＡ
が組み込まれていることを確認するため，ＴＡ５００６
及Ｔ（ＥＩＯＩにとり込ませた。その結果，得られた形
質転換株はプロ１１ン生成能を有し、ＴＡ５００６及び
Ｔ Ａ３００７の各微生物に含まれるハイブリッドプラ
スミドにはＰｒｏ Ｂ 、 Ｐｒｏ Ａが組み込まれて
いることが確認された。
実施例２
（１） ハイブリッドプラスミドの調すｔｅｌ 実施例
１−１１）と同様にして得た染色体ＤＮＡ６μり及び実
施例］、 −＋２１と同様にし′″ｒ得たベクタープラ
スミドｐＡｃＹＣ１７７ＤＮＡｌμグの各々に制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔｌ：を１常の条件で作用させＤＮ
Ａ鎖を完全に１２］断した。６５℃、１０分間の熱処理
後１両反応液を混合しＴ４ファージ由来のＤＮ’Ａリガ
ーゼ％通常の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた
。
１−１１）と同様にして得た染色体ＤＮＡ６μり及び実
施例］、 −＋２１と同様にし′″ｒ得たベクタープラ
スミドｐＡｃＹＣ１７７ＤＮＡｌμグの各々に制限エン
ドヌクレアーゼＰｓｔｌ：を１常の条件で作用させＤＮ
Ａ鎖を完全に１２］断した。６５℃、１０分間の熱処理
後１両反応液を混合しＴ４ファージ由来のＤＮ’Ａリガ
ーゼ％通常の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた
。
ｔｂｌ ニジエリシア・コリ０６００（ＡＴＣＣ３３５
２５）をＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグア
ニジンで変異誘導処理し、プロリン要求性変異株を取１
称シた。ついでこのプロリン要求性変異株のうち、ピロ
リン・５・カルボキシレートリダクターゼ活性を持たな
い株を選択した。
２５）をＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグア
ニジンで変異誘導処理し、プロリン要求性変異株を取１
称シた。ついでこのプロリン要求性変異株のうち、ピロ
リン・５・カルボキシレートリダクターゼ活性を持たな
い株を選択した。
（Ｃ１上記（ａｌで得られたハイフリットプラスミドＤ
ＮＡを上記（ｂｌで得られたピロリン・５・カルボキシ
レートリダクターゼ欠損性変異株とを実施例１−（４）
と同様にして塩化カルシウム処理してハイブリッドプラ
スミドＤＮＡを細胞内にとり込ませた。
ＮＡを上記（ｂｌで得られたピロリン・５・カルボキシ
レートリダクターゼ欠損性変異株とを実施例１−（４）
と同様にして塩化カルシウム処理してハイブリッドプラ
スミドＤＮＡを細胞内にとり込ませた。
培地（グルコース０．５％、リンｅ第二カリウム０゜７
鴫、リン酸第−カリウムＱ、 ２％、硫酸アンモニウム
０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１％、ク
エン酸ナトリウム０．０５％、Ｌ−ロイシン０．００１
Ｍ、Ｌ−スレオニン０．００１Ｍ、チアミン０．０００
５％、寒天１．５％）で選択した菌株から実施例１−（
２＋と同様にしてハイブリッドプラスミドＤＮＡを精製
分離した。
鴫、リン酸第−カリウムＱ、 ２％、硫酸アンモニウム
０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１％、ク
エン酸ナトリウム０．０５％、Ｌ−ロイシン０．００１
Ｍ、Ｌ−スレオニン０．００１Ｍ、チアミン０．０００
５％、寒天１．５％）で選択した菌株から実施例１−（
２＋と同様にしてハイブリッドプラスミドＤＮＡを精製
分離した。
ｉｄｌ 実施例１−［２１と同様にして得たセラチアマ
ルセッセンスの細胞外ヌクレアーゼ欠損性、制限エンド
ヌクレアーゼ欠損性力１つアンピシリンｔｒ 受性の変
異株に上記ＦＣ＋で得られたハイブリッドプラスミドＤ
ＮＡをとり込ませ、アンピシリン耐性含有する菌株を得
た。この菌株から実施例１−（２１と同、様にしてハイ
ブリッドプラスミドＤＮＡを分離・精製することにより
ハイブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５Ｑ７を得た。
ルセッセンスの細胞外ヌクレアーゼ欠損性、制限エンド
ヌクレアーゼ欠損性力１つアンピシリンｔｒ 受性の変
異株に上記ＦＣ＋で得られたハイブリッドプラスミドＤ
ＮＡをとり込ませ、アンピシリン耐性含有する菌株を得
た。この菌株から実施例１−（２１と同、様にしてハイ
ブリッドプラスミドＤＮＡを分離・精製することにより
ハイブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５Ｑ７を得た。
（８）上記（ｄ）で得たｐＴＡ５Ｑ７ＤＮＡ１μｍ及び
実施例１−１４１ｆｂｌで得たｐＴＡ５Ｑ６ＤＮＡ１μ
ｍの各々に制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ｌ［とＦ
ｌａｏＲＩ を通常の条件で作用させＤＮＡ鎖を完全に
切断した。
実施例１−１４１ｆｂｌで得たｐＴＡ５Ｑ６ＤＮＡ１μ
ｍの各々に制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ｌ［とＦ
ｌａｏＲＩ を通常の条件で作用させＤＮＡ鎖を完全に
切断した。
６５℃、１０か間の熱処理後・両反応液を混合しＴ４７
アージ由来のＤＮＡリガーゼを通常の条件下で作用させ
てＤＮＡ鎖を連結させた。
アージ由来のＤＮＡリガーゼを通常の条件下で作用させ
てＤＮＡ鎖を連結させた。
（２）ハイブリッドプラスミドの選択
ｔａｌ 上記ｆｌ） −ｔｂｌと同様にして得られたニ
ジエリシア・コリのピロリン・５・カルボキシレートリ
ダクターゼ欠損性変異株に上記ｆ１＋ −ｔｅｌで得ら
れたＤＮＡ／ｇ液をとり込ませ・前記（１） −＋ＣＩ
の培地にアンピシリン２０μｐ−を加えた培地で生じた
コロニーのうちプロリン生成能を有する株を得た。この
菌株から実施例１−（２）と同様にしてハイブリッドプ
ラスミドＤＮＡを分離精製した。
ジエリシア・コリのピロリン・５・カルボキシレートリ
ダクターゼ欠損性変異株に上記ｆ１＋ −ｔｅｌで得ら
れたＤＮＡ／ｇ液をとり込ませ・前記（１） −＋ＣＩ
の培地にアンピシリン２０μｐ−を加えた培地で生じた
コロニーのうちプロリン生成能を有する株を得た。この
菌株から実施例１−（２）と同様にしてハイブリッドプ
ラスミドＤＮＡを分離精製した。
ｔｂｌ 実施例１−＋２１と同様にして得たセラチア
マルセッセンスの細胞外ヌクレアーゼ欠ｍ性、 制御ｔ
ｆｆｌエンドヌクレアーゼ欠損性かつアンピシリン感受
性の変異株に上記（ａｔで得られたＤＮＡをとり込ませ
、得られる菌株から実施例１−（２１と同様にしてハイ
ブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５９８を精製分離した
。
マルセッセンスの細胞外ヌクレアーゼ欠ｍ性、 制御ｔ
ｆｆｌエンドヌクレアーゼ欠損性かつアンピシリン感受
性の変異株に上記（ａｔで得られたＤＮＡをとり込ませ
、得られる菌株から実施例１−（２１と同様にしてハイ
ブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５９８を精製分離した
。
（３）形質転換株の調製
（ａｌ 上記で得られたハイブリッドプラスミドＤＮＡ
ｐＴＡ５Ｑ３をセラチア マルセッセンスＤＴｒ−１２
（微工研条寄第１７１号）にとり込ませ、アンピシリン
５００μ？ＡＩを含有するＬ−ブロス寒天培地で培養す
ることにより日向とする形質転換株ＴＡ５００８ （微
工研閑寄第７３６５号）を得た。
ｐＴＡ５Ｑ３をセラチア マルセッセンスＤＴｒ−１２
（微工研条寄第１７１号）にとり込ませ、アンピシリン
５００μ？ＡＩを含有するＬ−ブロス寒天培地で培養す
ることにより日向とする形質転換株ＴＡ５００８ （微
工研閑寄第７３６５号）を得た。
又、ハイブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５Ｑ８とセラ
チア マルセッセンスｏＡｒ−８０（１工研条寄第１７
３号〕とを上記と同様に処理することにより形質転換株
セラチア マルセッセンスＴＡ５００９（微工研菌寄第
７３６６号）を得た。
チア マルセッセンスｏＡｒ−８０（１工研条寄第１７
３号〕とを上記と同様に処理することにより形質転換株
セラチア マルセッセンスＴＡ５００９（微工研菌寄第
７３６６号）を得た。
上記の微生物の含有するハイブリッドプラスミドＤＮＡ
ｐＴＡ５０８にＰｒｏＢ 、 ＰｒｏＡ及びＰｒｏＣが
組み込まれていることを確認するため、ＴＡ５００８及
びＴ Ａ３００９の微生物よりハイブリッドプラスミド
ＤＮＡを抽出・分離した。ついでこのハイブリッドプラ
スミドＤＮＡをピロリン・５・カルボキシレートリダク
ターゼ欠損性変異株とニジエリシア・コリーＨＢＩＯＩ
にとり込ませた。
ｐＴＡ５０８にＰｒｏＢ 、 ＰｒｏＡ及びＰｒｏＣが
組み込まれていることを確認するため、ＴＡ５００８及
びＴ Ａ３００９の微生物よりハイブリッドプラスミド
ＤＮＡを抽出・分離した。ついでこのハイブリッドプラ
スミドＤＮＡをピロリン・５・カルボキシレートリダク
ターゼ欠損性変異株とニジエリシア・コリーＨＢＩＯＩ
にとり込ませた。
その結果、得られた形質転換株はいずれもプロリン生成
能を有し、ＴＡ５００８及び’ｒＡ５００９の各微生物
に含まれるハイブリッドプラスミドにはＰｒｏ Ｂ 、
ＰｒｏＡ ＊ Ｐｒｏ Ｃ−が組み込まれているこ゛
とが確認された。
能を有し、ＴＡ５００８及び’ｒＡ５００９の各微生物
に含まれるハイブリッドプラスミドにはＰｒｏ Ｂ 、
ＰｒｏＡ ＊ Ｐｒｏ Ｃ−が組み込まれているこ゛
とが確認された。
実施例 ３
実施例１及び２で得た本発明の微生物セラチアフルセラ
センスＴＡｆｉ００６およびＴＡ５ＱＱ８をアンピシリ
ン５００μ７〜を含むＬ−ブロス培、硫酸マグネシウム
・７水和物００５幅、硫酸第一鉄、７水和物０．０００
２％、コーンステイープリカー〇貧喘、炭酸カルシウム
３％を蒸留水にとかした゛溶液１５−を５００ｒｎｌ容
振とうコルベンに注入し加熱滅菌したもの（但し、ショ
糖は別途滅菌後、培地に添加）（ｐＨ７，０）Ｊに一白
金耳植菌した。又、対照微生物としてセラチア マルセ
ッセンスＤ’？！ｒ −１２（微工研条寄１７１号）を
ブイヨン斜面培地で３０℃、１夜培養したのち上記と同
じ発酵培地に一白金耳植菌した。ついでそれぞれの菌体
を３０℃、１４０回転／分・振幅７ｃｍの条件で７２時
間培養したとき。培地中のＬ−プロリン生成器は下記第
１表の通りであった。
センスＴＡｆｉ００６およびＴＡ５ＱＱ８をアンピシリ
ン５００μ７〜を含むＬ−ブロス培、硫酸マグネシウム
・７水和物００５幅、硫酸第一鉄、７水和物０．０００
２％、コーンステイープリカー〇貧喘、炭酸カルシウム
３％を蒸留水にとかした゛溶液１５−を５００ｒｎｌ容
振とうコルベンに注入し加熱滅菌したもの（但し、ショ
糖は別途滅菌後、培地に添加）（ｐＨ７，０）Ｊに一白
金耳植菌した。又、対照微生物としてセラチア マルセ
ッセンスＤ’？！ｒ −１２（微工研条寄１７１号）を
ブイヨン斜面培地で３０℃、１夜培養したのち上記と同
じ発酵培地に一白金耳植菌した。ついでそれぞれの菌体
を３０℃、１４０回転／分・振幅７ｃｍの条件で７２時
間培養したとき。培地中のＬ−プロリン生成器は下記第
１表の通りであった。
第１表
実施例 ４
実施例１及び２で得た本発明の微生物セラチアフルセラ
センスＴＡ５００７及び’１’Ａ３００９をアンピシリ
ン５００μＶ−を含有するＬ−ブロス培地で一夜培養し
た後１発酵培地〔ショ糖２５％、尿素２．８幅、第二リ
ン酸カリウムｏ、１幅、硫酸マグネシウム・７水和物０
．０５％、硫酸第１鉄・７ 水和物０．０００２％、コ
ーンステイープリカー〇、５％、炭酸カルシウム３％を
蒸留水にとかした溶液１５−を５０ ｏ ｍｅ容振とぅ
コルベンに注入し加熱滅菌したもの（但し、ショ糖は別
途滅菌後。
センスＴＡ５００７及び’１’Ａ３００９をアンピシリ
ン５００μＶ−を含有するＬ−ブロス培地で一夜培養し
た後１発酵培地〔ショ糖２５％、尿素２．８幅、第二リ
ン酸カリウムｏ、１幅、硫酸マグネシウム・７水和物０
．０５％、硫酸第１鉄・７ 水和物０．０００２％、コ
ーンステイープリカー〇、５％、炭酸カルシウム３％を
蒸留水にとかした溶液１５−を５０ ｏ ｍｅ容振とぅ
コルベンに注入し加熱滅菌したもの（但し、ショ糖は別
途滅菌後。
培地に添加） （ｐＨ７，Ｑ ） 、］に−白金耳植菌
した。
した。
又・対照微生物としてセラチア マルセッセンスＯＡｒ
−８Ｑをブイヨン斜面培地で３０℃、１夜培養した後
、上記ど同じ発酵培地に１白金耳植菌した。ついでそれ
ぞれの菌体を３０℃、１４０回転／汁、振幅７αの条件
で１．２０時間培養したとき、培地中のＬ−プロリン生
成量は下記第２表の通りであった。
−８Ｑをブイヨン斜面培地で３０℃、１夜培養した後
、上記ど同じ発酵培地に１白金耳植菌した。ついでそれ
ぞれの菌体を３０℃、１４０回転／汁、振幅７αの条件
で１．２０時間培養したとき、培地中のＬ−プロリン生
成量は下記第２表の通りであった。
第 ２ 表
実施例５
実施例４で得られた’Ｉ’ Ａ３００７の微生物の培養
液１１を集めて熱処理した後、ろ過して不溶物を除去し
た。ついでろ液を陽イオン交換樹脂アンバーライトＩ
Ｒ−１２０８（Ｈ＋）を充填したカラムに導通した。水
洗後吸着したＬ−プロリンを５呪アンモニア水で溶出し
溶出液を減圧濃縮した。
液１１を集めて熱処理した後、ろ過して不溶物を除去し
た。ついでろ液を陽イオン交換樹脂アンバーライトＩ
Ｒ−１２０８（Ｈ＋）を充填したカラムに導通した。水
洗後吸着したＬ−プロリンを５呪アンモニア水で溶出し
溶出液を減圧濃縮した。
濃縮液を冷却し析出品をろ取することによりＬ−プロリ
ン５６．８５１’を得た。
ン５６．８５１’を得た。
自発手続補正書
昭和１０年８月二左日
１、事件の表示
２ 発明の名称
事Ｐ１との関係 特許出願人
大阪府大阪市東区Ｊり修町３丁目２１番地（〒５４１）
（２９５）［ｎ辺製薬株式会社 代表者松原一部 ４、代理人 大阪府大阪市淀川区力ｎ島３丁目１６番８９号（〒５３
２）５、補正により増加する発明の数 補正の内容 １、 明細書第１頁６行目乃至第３頁１行目の特許請求
の範囲の欄を下記の通り訂正する。
（２９５）［ｎ辺製薬株式会社 代表者松原一部 ４、代理人 大阪府大阪市淀川区力ｎ島３丁目１６番８９号（〒５３
２）５、補正により増加する発明の数 補正の内容 １、 明細書第１頁６行目乃至第３頁１行目の特許請求
の範囲の欄を下記の通り訂正する。
ｒ （１１Ｌ−プロリン生産能を有するセラチア属に属
する微生物から採取したＩ、−プロリン生産を司る染色
体フラグメントを組み込んだハイブリッドプラスミドを
セラチア属に属する微生物に含有せしめた微生物。
する微生物から採取したＩ、−プロリン生産を司る染色
体フラグメントを組み込んだハイブリッドプラスミドを
セラチア属に属する微生物に含有せしめた微生物。
（２）染色体フラグメントを組み込んだハイブリッドプ
ラスミドがグルタメートキナーゼおよびグルタメート・
ホスフェートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリ
ボ核酸またはグルタメートキナーゼ、グルタメート・ホ
スフェートリダクターゼおよびピロリン・５・カルボキ
シレー１〜リダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ
核酸と、セラチア属に属する微生物中において複製可能
なベクタープラスミドとからなるハイブリッドプラスミ
ドである特許請求の範囲第１項記載の微生物。
ラスミドがグルタメートキナーゼおよびグルタメート・
ホスフェートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリ
ボ核酸またはグルタメートキナーゼ、グルタメート・ホ
スフェートリダクターゼおよびピロリン・５・カルボキ
シレー１〜リダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ
核酸と、セラチア属に属する微生物中において複製可能
なベクタープラスミドとからなるハイブリッドプラスミ
ドである特許請求の範囲第１項記載の微生物。
（３） グルタメートキナーゼおよびグルタメート・ホ
スフェートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ
核酸とヘククーｐＫＰ１］５↓とからなるハイブリッド
プラスミドを含有せしめた微生物である特許請求の範囲
第１項又は第２項記載のＩＮｋ生物。
スフェートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ
核酸とヘククーｐＫＰ１］５↓とからなるハイブリッド
プラスミドを含有せしめた微生物である特許請求の範囲
第１項又は第２項記載のＩＮｋ生物。
（４） グルタメートキナーゼ、グルタメート・ポスフ
ェートリダクターゼおよびピロリン・５・カルボキシレ
ートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸と
ヘクターｐＫＰ１１５↓とからなるハイブリッドプラス
ミドを含有せしめた微生物である特許請求の範囲第１項
又は第２項記載の微生物。
ェートリダクターゼおよびピロリン・５・カルボキシレ
ートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸と
ヘクターｐＫＰ１１５↓とからなるハイブリッドプラス
ミドを含有せしめた微生物である特許請求の範囲第１項
又は第２項記載の微生物。
（５）Ｌ−プロリン生産能を有するセラチア属に属する
微生物から採取したし一プロリン生産を司る染色体フラ
グメントを組み込んだハイブリッドプラスミドをセラチ
ア属に属する微生物に含有せしめた微生物を培地で培養
して、培地中にＬ−プロリンを生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするし一プロリンの製法。」２、
同第７真下から６行目、同第１４頁下から９行目及び
下から３行目、同第１５真下から９行目の ｒＫＰ１１５５Ｊを ｒＫＰ１１５４Ｊ に訂正する。
微生物から採取したし一プロリン生産を司る染色体フラ
グメントを組み込んだハイブリッドプラスミドをセラチ
ア属に属する微生物に含有せしめた微生物を培地で培養
して、培地中にＬ−プロリンを生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするし一プロリンの製法。」２、
同第７真下から６行目、同第１４頁下から９行目及び
下から３行目、同第１５真下から９行目の ｒＫＰ１１５５Ｊを ｒＫＰ１１５４Ｊ に訂正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）Ｌ−プロリン生産能を有するセラチア属に属する
微生物から採取したＬ−プロリン生産を司る染色体フラ
グメントを組み込んだハイブリッドプラスミドをセラチ
ア属に属する微生物に含有せしめた微生物。 （２） 染色体フラグメントを組み込んだハイブリッド
プラスミドがグルタメートキナーゼおよびグルタメート
・ホスフェートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシ
リボ核酸またはグルタメートキナーゼ、グルタメート・
ホスフェートリダクターゼＢよびピロリン・５・カルボ
キシレートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ
核酸と・セラチア胆に属する微生物中において複製可能
なベクタープラスミドとからなるハイブリッドプラスミ
ドである特許請求の範囲第１項記載の微生物。 （３） グルタメートキナーゼおよびグルタメートホス
フェートリダクターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核
酸とベクターｐＫＰ１１５５とからなるハイブリッドプ
ラスミドを含有せしめた微生物である特許請求の範囲第
１頌又は第２項記載の微生物。 （７１） グルタメートキナーゼ、り゛ルタメート・ホ
スフェートリダクターゼおよびビロリン・５・カルボキ
シレートリダクターゼの遺伝情報を担つデオキシリボ核
酸とベクターｐＫＰ１１５５とからなる −、゛ ハイ
ブリッ ドプラスミドを含有せしめた微生物である特許請求の範
囲第１項又は第２項記載の微生物。 ＋５１ Ｌ−プロリン生産能を有するセラチア属に漠す
る微生物から採取したＬ−プロリン生産を司る染色体フ
ラグメントを、徂み込んだハイブリッドプラスミドをセ
ラチア属に１属する微生物に含有せしめた微生物を培地
で培養して、培地中にＬ−プロリンを生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とするＬ−プロリンの製法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58247867A JPS60141284A (ja) | 1983-12-28 | 1983-12-28 | Ｌ―プロリンの製法 |
| EP84115897A EP0146929A3 (en) | 1983-12-28 | 1984-12-20 | Microorganism of the genus serratia containing a hybrid plasmid and process for preparing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58247867A JPS60141284A (ja) | 1983-12-28 | 1983-12-28 | Ｌ―プロリンの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60141284A true JPS60141284A (ja) | 1985-07-26 |
| JPH059063B2 JPH059063B2 (ja) | 1993-02-03 |
Family
ID=17169811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58247867A Granted JPS60141284A (ja) | 1983-12-28 | 1983-12-28 | Ｌ―プロリンの製法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0146929A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60141284A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5173418A (en) * | 1985-05-10 | 1992-12-22 | Benzon Pharma, A/S | Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases |
| JP3739143B2 (ja) * | 1996-09-03 | 2006-01-25 | 協和醗酵工業株式会社 | トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 |
| WO2022161914A1 (en) * | 2021-01-26 | 2022-08-04 | Basf Se | High temperature fermentation process and microorganisms |
| CN114081107B (zh) * | 2021-12-16 | 2023-08-04 | 河北省农林科学院滨海农业研究所 | 一种提高蛋鸡免疫力和产蛋品质的饲料添加剂及制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56144093A (en) * | 1980-04-14 | 1981-11-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-proline by fermentation |
| JPS5813599A (ja) * | 1981-07-08 | 1983-01-26 | シエ−リング・アクチエンゲゼルシヤフト | プラスミド、その製法、ｅ・コリ−突然変異体、ｌ−プロリンの製法及び新規菌株物の製法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4455372A (en) * | 1981-10-06 | 1984-06-19 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Method for fermentative production of L-proline |
-
1983
- 1983-12-28 JP JP58247867A patent/JPS60141284A/ja active Granted
-
1984
- 1984-12-20 EP EP84115897A patent/EP0146929A3/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56144093A (en) * | 1980-04-14 | 1981-11-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-proline by fermentation |
| JPS5813599A (ja) * | 1981-07-08 | 1983-01-26 | シエ−リング・アクチエンゲゼルシヤフト | プラスミド、その製法、ｅ・コリ−突然変異体、ｌ−プロリンの製法及び新規菌株物の製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0146929A3 (en) | 1987-06-03 |
| EP0146929A2 (en) | 1985-07-03 |
| JPH059063B2 (ja) | 1993-02-03 |
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