JPS61271981A - 新規微生物及びそれを用いるｌ−ヒスチジンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規微生物及びそれを用いるＬ−ヒスチジンの
製法に関する。

（従来技術） Ｌ−ヒスチジンは医薬品１食品添加物あるいは飼料添加
物として有用なアミノ酸である。Ｌ−ヒスチジンを醗酵
法によって製造する方法としては種々の微生物の変異株
を用いる方法が知られており、セラチア属微生物を用い
る方法としては各種の変異株１例えばＬ−ヒスチジン分
解酵素欠損性でかつヒスチジン代謝拮抗物質に耐性な変
異株が知られている（特公昭５Ｏ−３７２７９）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、これら変異株のし−ヒスチジン生産能は
工業的に充分高いとはいえず、よりＬ−ヒスチジン生産
能の高い？１ＩＨＥ物を用いてより効率的にＬ−ヒスチ
ジンを生産する方法が望まれていた。

〔構成及び効果〕

本発明者らは、かかる課題を解決すぺ（更に研究を重ね
た結果、Ｌ−ヒスチジン生産能を有するセラチア属に属
する微生物の有するＬ−ヒスチジン生産を司るデオキシ
リポ核＃Ｉ（以下ＤＮＡと称する）を切り出しベクター
プラスミドに組み込んだのち、セラチア属微生物に移入
することによりＬ−ヒスチジン生産能の高い微生物の調
製に成功するとともに、該微生物を用いることによりＬ
−ヒスチジンを工業的に有利に製造し得ることを見出し
１本発明を完成するに至った。

即ち１本発明はＬ−ヒスチジン生産能を有するセラチア
属に属する微生物から採取したＬ−ヒスチジン生産を司
る染色体フラグメントをベクタープラスミドに組み込ん
だハイブリッドプラスミドをセラチア属に属する微生物
に含有せしめた微生物ならびに該微生物を培地で培養し
て培地中にＬ−ヒスチジンを生成蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とするＬ−ヒスチジンの製法である。

〔本発明微生物の調製〕

（染色体ＤＮＡ及びその調製） 本発明において使用できるＬ−ヒスチジン生産を司る染
色体フラグメント（以下染色体ＤＮＡと称する）として
は、セラチア属に属し、Ｌ−ヒスチジン生産能を有する
微生物から採取された染色体ＤＮＡであればいかなる微
生物から採取されたＤＮＡであってもよい。

又、し−ヒスチジンの生合成には。

ＡＴＰフォスフォリポシルトランスフエラーゼ。

フォスフォリポジルーＡＴＰピロフォスフォヒドロラー
ゼ。

フォスフォリポジルーＡＭＰシクロヒドロラーゼ。

フォスフォリポジル　フォルムイミノ−５−アミノ−１
−フォスフォリポジルー４−イミダゾールカルボキサミ
ド　リボタイド　イソメラーゼ。

グルタミン　アミドトランスフェラーゼ。

シクラーゼ。

イミダゾールグリセロール　フォスフェート　デヒドラ
ターゼ。

ヒスチジノール　フォスフェート　　アミノトランスフ
ェラーゼ。

ヒスチジノール　フォスフェート　フォスファターゼ。

ヒスチジノール　デヒドロゲナーゼ の各酵素が関与することが知られているが１本発明にお
いてはこれら各酵素の構造遺伝子の１部又は全部を含む
ものであってもよい。とりわけＡＴＰフォスフォリボシ
ルトランスフェラーゼはヒスチジン生合成における律速
段階であり、この酵素活性をあげることによりヒスチジ
ン生合成を効率よく行なえるので、該酵素の構造遺伝子
を含む染色体ＤＮＡが好ましい、更に上記の如き染色体
フラグメントはヒスチジンによるフィードバック阻害か
ら解除されているものが最も好ましい。

かかる染色体ＤＮＡの供給源となる微生物としては１例
えば、セラチア　マルセッセンス（ＳｅｒｒａＬｉａ　
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）　　Ａ　ＴＣＣ３１０２６（
ｍ工研菌寄第２１２０号）、セラチア　マルセフセンス
（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）　Ｈ［
−２６０４〔アプライド　アンド　エンバイロンメンタ
ルマイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、３４，４６５　（１９７７））
あるいはセラチア　マルセフセンス（５ｅｒｒａＬｉａ
　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）ＭＰｒ９０　（参考例２）
等があげられる。

これらの微生物から染色体ＤＮＡを採取するには２例え
ば微生物菌体をリゾチーム処理、界面活性剤（ＳＤＳ、
ザルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）
等〕処理したのち、除蛋白し、ついでエタノール沈殿せ
しめる常法〔ジャーナル　オプ　モレキュラー　バイオ
ロジー（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、　　３．　２０８　（１９
６１）　　；ビオシミ　エト　ビオフィシ　アクタ　（
Ｂｉｏｃｈｉｓ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　）、　　７２．　６１
９　（１９６３）　）により容易に実施することができ
る。

（ベクタープラスミドＤＮＡ及びその調製）上記の如く
して得られる染色体ＤＮＡを組み込むベクタープラスミ
ドとしては、セラチア属に属する微生物へ移入でき、か
つ移入微生物中で複製可能なプラスミドであればよく特
に限定されないが１例えばｐｓｃｌｏｌ　　（プロシー
ディンゲスオブ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエ
ンシス　ニーニスエイ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、Ｔｏ、３２４０　（１９７３））、ｐｔ、ｃ３
３９〔ジーン（Ｇｅｎｅ、）、１８．　３３２　　（１
９８２））、ｐＢＲ３２２（ジーン、主、　　９５　　
（１９７７））、Ｉ）ＢＲ３２５（ジーン、↓、１２１
　　（１９７８））、ｐＡｃＹｃ１７？　　（ジャーナ
ルオブ　バクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、）１主４．１１４１　　（１９７８））、ｐＫＰ１１
５４　（ＦプラスミドのＥｃｏＲＩ　ｆ　５断片（プロ
シーディンゲス　オブ　ナショナル　アカデミ−オブサ
イエンシス　ニーニスエイ、７３．６４　（１９７６）
〕から複製開始点を含むＢ、Ｃ，Ａ２断片を切り出し、
これにアンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール
耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子及びストレ
プトマイシン耐性遺伝子を結合したプラスミド；モレキ
ュラー　アンドジェネラル　ジエネテイクス（Ｍｏ１．
　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

）、１９１，２３１　（１９８３））あるいはｐＫＰＴ
１１２４（上記ｐＫＰ１１５４のスペクチノマイシン耐
性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子及びクロラム
フェニコール耐性遺伝子の一部を含むＢａ５ＨＩ　−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を、ｐＫＴ２４０（ジーン、２６，２３７
　　（１９８３））のカナマイシン耐性遺伝子を含むＢ
ａｍＨｌ　−ＥｃｏＲＩ断片でおきかえたプラスミド；
昭和５９年日本農芸化学会大会公演要旨集１００頁〕を
用いることができる。これらのプラスミドはこれらを保
持するニジエリシア　コリの菌株からクリヤード　ライ
ゼート（ｃｌｅａｒｅｄ　　１ｙｓａｔａ　）法〔遺伝
子操作実験法１２５頁（高木康敬著、講談社、１９８０
）；モレキュラー　クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、８６頁（Ｍａｎｉａ’ｓ等コール
ド　スプリングハーバ−ラボトリー（Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　）出
版、１９８２））などの常法によって調製することがで
きる。

（ハイブリッドプラスミドＤ　Ｎ　Ａの調製）上記で得
られた染色体ＤＮＡとベクタープラスミドＤＮＡからハ
イブリッドプラスミドＤＮＡを調製するには制限エンド
ヌクレアーゼ（例えば。

Ｈｉｎｄ　ｍ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ等）
を用いて染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡ鎖を切断した
のち、リガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ。

大腸菌ＤＮＡリガーゼ等）で処理するか、あるいはその
切断末端によってはターミナルトランスフェラーゼ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ等で処理したのちりガーゼを作用させ
てＤ　Ｎ　Ａ　１１を結合する等の常法〔メソンズ　イ
ン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　　）　　、　　　６８．　　４１　　
　（１９７９）、遺伝子操作実験法１３５頁（高木康敬
著。

講談社、１９８０））により実施することができる。

かくして得られたハイブリッドプラスミドＤＮＡはその
まま形質転換に用いることもでき、又ハイブリッドプラ
スミドＤＮＡを各種の変異を有する変異株に移入して目
的とするハイブリッドプラスミドＤＮＡを保持する菌株
を予め選択したのち該菌株からハイブリッドプラスミド
を常法により抽出しこれを宿主微生物に移入することも
でき。

かかる方法によるときは形質転換株の選択が容品であり
好ましい。かかる目的に用いる変異株としては１例えば
セラチア属、ニジエリシア属に属する微生物であってＬ
−ヒスチジン生産能を有しない微生物、あるいは前記Ｌ
−ヒスチジンの生合成に関与する酵素のうち、目的とす
る酵素を欠損した微生物であるか、アンピシリン感受性
、カナマイシン感受性等の変異の一部又は全部を有する
変異株があげられる。具体的には１例えばニジエリシア
　コリＵＴＨ８６０，ニジエリシア　コリｐＡ３４０．
　　ニジエリシア　コリに一１２Ｃ６００ｒ−ｍ−（Ａ
ＴＣＣ３３５２５）を好適に用いることができる。

（宿主微生物） ハイブリッドプラスミドＤＮＡを含有せしめる宿主微生
物としては、セラチア属に属し、形質転換可能な微生物
であればよく、具体的には前記染包体ＤＮＡの供与微生
物として例示したものをいずれも用いることができる。

とりわけ、ヒスチジン分解酵素欠損性のものが好ましい
。

（ハイブリッドプラスミドＤＮＡによる形質転換）形質
転換方法は例えば低温下に宿主微生物細胞を塩化カルシ
ウム溶液で処理し、菌体の膜透過性を増大させ、ハイブ
リッドプラスミドＤＮＡを宿主微生物中にとり込ませる
方法〔ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジー
　５３，１５９（１９７０））等の常法を採用すること
ができる。

かくして得られた形質転換株のうち、目的とするハイブ
リッドプラスミドを含有する菌株の選択は生育したコロ
ニーのうちＬ−ヒスチジン分泌能を有する菌株を釣菌分
離することにより実施できる。

かくすることにより本発明に係る微生物、即ち。

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する微生物から採取したＬ−
ヒスチジン生産を司る染色体フラグメントをベクタープ
ラスミドに組み込んだハイブリ・ノドプラスミドをセラ
チア属に属する微生物に含有せしめた微生物を得ること
ができる。

かかる微生物としては具体的には例えばセラチア　マル
セソセンス（５ｅｒｒａＬｉａ　ｔｒｒａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓ　）ＴＡ５０１４．セラチア　マルセフセンス（Ｓ
ｅｒｒａＬｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）　Ｔ　Ａ　
５０１５　、セラチアマルセッセンス（５ｅｒｒａｔｉ
ａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）　Ｔ　Ａ　５０１６等が
あげられる。

セラチアマルセッセンス（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ）ＴＡ５０１４及びＴＡ５０１５はセラチ
ア　マルセソセンス（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓ
ｃｅｎｓ　）　Ｈｄ　−１６（６４４Ｍｌ）を、又、セ
ラチア　マルセソセンス（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ　）　Ｔ　Ａ　５０１６はセラチア　マル
セソセンス（５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
　）Ｌ１２０（参考例３）をそれぞれ親株として、Ｌ−
ヒスチジン生産を司る染色体ＤＮＡをベクタープラスミ
ドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含有せしめた
微生物であり、Ｒ株と同じ形態学的特徴を有し、親株に
対しそれぞれ１００倍以上、１２０倍以上、約１．５倍
のＬ−ヒスチジン生産能を有する。

（し−ヒスチジンの製法） かくして得られた微生物を培地で培養し、培地中に生成
蓄積せしめたＬ−ヒスチジン採取することによりＬ−ヒ
スチジンを製することができる。

本発明において使用されるＬ−ヒスチジン生産用培地と
しては、炭素源としてブドウ糖、Ｐ糖。

糖蜜の如きｔａｗ４．　フマール酸、クエン酸、コハク
酸の如き有機酸、グリセロールの如きアルコール類等を
１０〜２０％、窒素源として酢酸アンモニウムの如き有
機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ムの如き無機アンモニウム塩。

尿素等を２〜３％、有機栄養物としてコーンステイープ
リカー、ペプトン、酵母エキス等を０〜１％の範囲でそ
れぞれ適当量含有する培地を好適に用いることができる
。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム等を
少量加え、更に培地のｐｌ（を６〜８に保つため炭酸カ
ルシウムあるいは必要に応じアンモニアを添加してもよ
い。

本発明によれば、上記培地に本発明の微生物を接種し、
２５〜４０℃にて振とうあるいは通気かく拌の如き好気
的条件下で２〜６日間培養することによって培地中にＬ
−ヒスチジンを著１１Ｍ積せしめることができる。生成
したＬ−ヒスチジンは培養終了後菌体その他の不溶物を
除去したのち。

例えばイオン交換樹脂に吸着せしめ、アンモニア水で溶
離し、これをｆ３縮・結晶化するなどの通常の分離精製
操作によって容易に採取することができる。

以下、実施例および参考例をあげて本発明を説明するが
、実施例中のＬ−ヒスチジンの確認はペーパークロマト
グラムのニンヒドリン反応及びパウリ−反応によって行
ない、その定量はロイコノストック・メゼンテロイデス
Ｐ−６０によるバイオアッセイによって行なった。

実施例　１ （１）　　染色　ＤＮＡの調１１ セラチア　マルセフセンスＭ　Ｐ　ｒ　９０　（Ｉ考例
２）をＬ−７’ロス（ペプトン１％、酵母エキス０゜５
％、塩化ナトリウム０．５％、　ｐＨ７，２）　　１１
に接種し、３０℃で４時間振とう培養し、対数増殖期の
菌体をリゾチーム処理、ＳＤＳ処理して溶菌しフェノー
ル処理により除蛋白したのちエタノール処理して染色体
ＤＮＡを沈殿させた。　ついでＲＮａｓｅ　　（最終濃
度１０ｐ７／ｍ９）を加え、３７℃で１時間処理して染
色体ＤＮＡを精製することによって染色体ＤＮＡ７．５
■を得た。

（２）　　ベクタープラスミドＤＮＡの調、１ニジユリ
シア　コリに一１２Ｃ６００ｒ−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３
５２５）にプラスミドｐＫＰＴ１１２４（昭和５９年農
芸化学会大会公演要旨集１００頁〕を含有させた菌株を
グルコース０．２％を含有するし一プロス４１に接種し
、３７℃で７時間振とう培養した後、菌体を遠心分離に
より集めた。ついで得られた菌体をリゾチーム処理、Ｓ
ＤＳ処理して溶菌させた後、最終ＩＭとなるように塩化
ナトリウムを加えて１００，０ＯＯＸ＃、３０分の遠心
分離を行った。ついで上清を採取しフェノール処理した
後、エタノールを加え遠心分離してＤＮＡを沈殿させた
。沈殿したＤＮＡを１ｍＭトリス塩酸−１ｍ？ＩＥＤＴ
Ａ溶液（ｐＨ７，５）に溶解、シ、塩化セシウム・エチ
ジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法により分離精製す
ることによって。

ベクタープラスミドｐＫＰＴ１１２４ＤＮＡ０．６■を
得た。

（３）　　ハイブリッドプラスミドＤＮＡのｉ′前記（
１）で得た染色体ＤＮＡ２　ＯＮに制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩを通常条件で作用させＤＮＡ′ｕｉを部
分的に切断した。又、上記（２）で得たベクタープラス
ミド１０４にＥｃｏＲＩを通常条件で作用させてＤ　Ｎ
　Ａ　ｔＪｉを完全に切断した。６５℃、１０分間の熱
処理後１両反応液を混合しＴ４ファージ由来のＤＮＡリ
ガーゼを通常条件で作用させてＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪｆを連
結させた。

（４）　　ハイブリッドプラスミドＤＮＡの′ＡＴＰフ
ォスフォリボシルトランスフェラーゼ欠損性のニジエリ
シア　コリに一１２ｐＡ３４０（ジャーナル　オプ　バ
クテリオロジー、９７゜１４３１　（１９６９））をＬ
−プｏスｓｏ、Ｂ：接種し、３７℃で振とう培養し、そ
の対数増殖期の中期まで生育せしめた菌体を集菌した。

ついで。

氷冷した０、　１　Ｍ塩化カルシウム溶液５−にけん濁
した。この細胞けん濁液に（３）で得たＤＮＡ溶液を加
え３０分間水冷した後、４２℃で２分間熱処理すること
によりＤＮＡを細胞内にとりこませた。

ついでこのけん濁液にＬ−ブロス５０ｒＩ＆を加え３７
℃で１時間振とう培養して遠心分離し、菌体を生理食塩
水５＋！ｌにけん濁した。このけん濁液の少量を培地（
グルコース０．５％、リン酸二カリウム０．７％、リン
酸−カリウム０，３％、硫酸アンモニウム０．１％、硫
酸マグネシウム・７水和物０．０１％、Ｌ−スレオニン
Ｏ，ＯＯＩＭ、Ｌ−ロイシン０゜００１Ｍ、Ｌ−アルギ
ニン塩酸塩０．００１Ｍ、グルタミン酸ナトリウム０．
ＱＯＩＭ、　チアミン塩酸塩０．０００５％、硫酸カナ
マイシン０．０１％、寒天１．５％）に塗布、３７℃で
３日間培養した。生じたコロニーを釣菌分離し、ハロー
法〔アプライド　アンド　エンバイロンメンタル　マイ
クロバイオロジー（八ｐｐ１．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　　３４゜４６５　（１９７７）
）によりヒスチジン分泌能を有する菌株を選択した。か
（して得られた菌株から前記（２）と同様にしてハイプ
リントプラスミドＤＮＡを抽出し精製・分離した。

（５）　　ノ　転　株のラ　１ 上記（４）で得たハイブリッドプラスミドＤＮＡと細胞
外ヌクレアーゼ欠損性、制限エンドヌクレアーゼ欠損性
のセラチア　マルセッセンスＴＴ３９２〔ジャーナル　
オブ　バクテリオロジー、１６土、１　　（１９８５）
）を（４）と同様に処理してハイブリ、ドブラスミドＤ
ＮＡをＴＴ３９２にとり込ませた。ついでこの菌株を硫
酸カナマイシン１゜Ｏｉ４／、＆を含むＬ−ブロス寒天
培地で培養し、生じたコロニーを釣菌分離した。この菌
株をグルコース０．２％を含むし一ブロス４１に接種後
、前記（２）と同様に処理することによりハイブリッド
プラスミドＤＮＡ　（ｐＴＡ５１０）０．５■を得た。

得られたｐＴＡ５１０をヒスチジン分解酵素欠損性を有
しヒスチジン生産能を有しない変異株セラチア　マルセ
ッセンスＨｄ−１６（参考例１）に形質転換し、硫酸カ
ナマイシン１００ｐｌ／ｄｌ含有のし一ブロス寒天培地
で培養することにより目的のヒスチジン生産能を有する
セラチア　マルセフセンスＴＡ５０１４を得た。

（６）Ｌ−ヒスチジン生産　の！ 上記で得られたセラチア　マルセソセンスＴＡ５０１４
を硫酸カナマイシン１００Ｐ＆／−含有Ｌ−プロス斜面
培地に一夜培養したのち醗酵培地（尿素２％、リン酸二
カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０
５％、コーンステイープリカー０．７％及び炭酸カルシ
ウム２％を含む溶液１５！ｌを５００−容振とうフラス
コに注入し加熱滅菌したものにシ！！糖を１５％となる
ように別に加熱ｗｔ菌して添加したもの、）に−白金耳
植菌した。

又、親株たるセラチア　マルセフセンスＨｄ−１６を上
記と同様の栄養培地に植菌した。それぞれ菌株を３０℃
で９６時間往復振とう培養したときの培地中におけるＬ
−ヒスチジン生産量は下記第１表の通りであった。

尚、上記で得られたＴＡ５０Ｌ４の菌体を前記（２）と
同様に処理して該菌体からハイブリッドプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、ＥｃｏＲＩで切断したのち生じたＤＮＡ断
片を７ガロースゲル電気泳動法で調べた。その結果、こ
のハイブリッドプラスミドＤＮＡには、ベクターｐＫＰ
Ｔ１１２４をＥｃｏＲＩで切断した特注じるＤＮＡ断片
の他に、ＡＴＰフォスフォリボシルトランスフェラーゼ
の構造遺伝子を含む染色体ＤＮＡが組み込まれているこ
とが確認された。

実施例　２ ＋１１　　ハイブリッドプラスミドＤＮＡの＃）１１実
施例１−（１）で調製した染色体ＤＮＡ２０４に制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨ１及びＥｃｏＲＩを通常条件
で作用させて部分的に切断した。一方。

実施例１−（２１で調製したベクタープラスミドＤＮＡ
１０４に制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１及びＥｃｏ
ＲＩを通常条件で作用させて完全に切断した。

６５℃、１０分間の熱処理後１両反応液を混合し実施例
１−（３）と同様な方法で連結させた。

（２）ハイブリッドプラスミドＤＮＡの゛沢ニジエリシ
ア　コリに−１２の変異株で、ヒスチジン生合成に関与
する全酵素の構造遺伝子を欠損している変異株ＵＴＨ８
６０（ジエネティツクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、　６６
、２３１　（１９７０）　）と前記ｔ１）で得られたＤ
ＮＡ溶液を用いて、実施例１−（４１と同様に処理し、
生じたコロニーの中でヒスチジン分泌能を有する菌株を
選択した。かくして得られた菌株から実施例１−（２）
と同様にしてハイブリッドプラスミドを抽出し、精製分
離した。

ここで得られたハイブリッドプラスミドを実施例１−（
５）と同様にしてセラチア　マルセフセンスの細胞外ヌ
クレアーゼ欠損性及び制限エンドヌクレアーゼ欠損性の
株ＴＴ３９２（ジャーナル　オブバクテリオロジー、１
６１．ｌ　　（１９８５））にとり込ませ、ついでこの
菌株より実施例１−＋２１と同様にして、ハイブリッド
プラスミドＤＮＡ　（ｐＴＡ５１　Ｌ）０．４ｗを得た
。

（３）　　ノ　転Ｉ株のＵ ハイブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５１１をヒスチジ
ン分解酵素欠損性でヒスチジン生産能を有しない変異株
セラチア　マルセソセンスＨｄ−１６（参考例１）に形
質転換し、目的のＬ−ヒスチジン生産能を有するセラチ
ア　マルセッセンスＴＡ５０１５を得た。

坦一旦ニ且ス工乏Ｚ生童皿（２）亘疼 上記（３）で得られたセラチア　マルセッセンス１゛Ａ
３０１５を実施例１−＋６）と同様にしてＬ−ヒスチジ
ン生産能を調べたところ第２表の通りであった。

第２表 尚、上記で得られたＴＡ５０１５の菌体を実施例１−（
２）と同様に処理して該菌体からハイブリッドプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、Ｂａｍ１（ＩとＥｃｏＲ■で二重切
断したのち生じたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動
法で調べた。その結果、このハイブリッドプラスミドＤ
ＮＡはベクター由来のＤＮＡ断片の他に、ヒスチジン生
合成に関与する１０個の酵素の構造遺伝子を含む染色体
ＤＮＡが組み込まれていることが確認された。

実施例　３ 実施例１−１５）で得たｐＴＡ５１０と後記参考例３で
得たセラチア　マルセッセンスＬ１２０を実施例１−（
５１と同様に形質転換し、硫酸カナマイシン１００μＩ
／−含有Ｌ−プロス寒天培地で培養することにより目的
とする形質転換株セラチア　マルセッセンスＴＡ５０１
６を得た。

得られたセラチア　マルセンセンスＴＡ５０１６及び親
株たるセラチア　マルセッセンスＬ１２０を、それぞれ
硫酸カナマイシン１００４／−含有Ｌ−ブロス斜面培地
に一夜培養したのち醗酵培地〔ショ８１２０％、尿素３
．５％、リン酸二カリウム０．１％、リン酸ニアンモニ
ウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％
、コーンステイープリカー０．７％、酵母エキス０．２
％、カザミノ酸０．５％、ポリペプトン０．３％及び炭
酸カルシウム２％を含む溶液１５−を５００．＆ｌｌ容
色うフラスコに注入し加熱滅菌したもの。但しシ５ｔＪ
ｉは別に加熱滅菌して添加したもの。〕に−白金耳植菌
し。

菌株を３０℃で１２０時間往復振とう培養したときの培
地中におけるＬ−ヒスチジン生産量は下記第３表の通り
であった。

第３表 実施例　４ 実施例３で得られたＴＡ５０１６の培養液１ｚを集めて
熱処理したのち、ろ過して不溶物を除去した。ついでろ
液を陽イオン交換樹脂（商品名：アンバーライトＩＲ−
１２０Ｂ　（Ｈ”型））を充填したカラムに導通した。

水洗後吸着したＬ−ヒスチジンを５％アンモニア水で溶
出した。溶出液を減圧下に濃縮し、濃縮液を冷却し、析
出晶をろ取することによりＬ−ヒスチジン３１．４＃を
得た。

参考例　１ セラチア　マルセッセンスＨｄ−１６の調−１セラチア
　マルセソセンスＨｄ−１６はアプライド　アンド　エ
ンバイロンメンタル　マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ
　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　）、　　３４
　。

４６５　（１９７７）記載の方法によって調製できる。

即ち、セラチア　マルセフセンス５ｒ４１（微工研条寄
第４８７号）をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン
で変異誘起処理し、硫酸アンモニウム０．０００５％を
追加したコハク酸ナトリウムーＬ−ヒスチジン最小平板
培地〔コハク酸ナトリウム０．５％、Ｌ−ヒスチジン塩
酸塩０．２％。

リン酸二カリウム０．７％、リン酸−カリウム０．３％
、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１％、寒天１．５
％〕に塗布し、３０℃にて３日間培養した。

生じたコロニーのうち小さいコロニーを釣菌分離するこ
とによりヒスチジン分解酵素欠損性の菌株セラチア　マ
ルセッセンスＨｄ−１６を選択した。

参考例　２ セラチア　マルセンセンスＭＰｒ９０のｆ′セラチア　
マルセッセンスＭＰｒ９０はアプライド　アンド　エン
バイロンメンタル　マイクロバイオロジー（八ｐｐｌ　
Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）　、↓工。

４３（１９８４）記載の方法によって調製できる。

即ち、セラチア　マルセッセンスＨｄ−１６（参考例１
）からＨｄＴｒ　１４２株およびＨｄ　Ｍ　Ｈｒ１３１
株を調製し、形質転換したファージＰＳ２０〔ザ　ジャ
パニーズ　ジャーナル　オブ　マイクロバイオロジー（
Ｊｐｎ、　ＪｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）＋土工。

４７３　（１９７３））とともに両菌株をアプライド　
アンド　エンバイロンメンタル　マイクロバイオロジー
（Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）　
、　　３　Ｌ４６５　（１９７７）記載の方法によって
形質転換してＨＴ−２８９２株を調製した。該菌株をＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジンで変異誘起処理し
、６−メチルプリン０．５ｍＭを含有する最小培地［グ
ルコース０，５％、硫酸アンモニウム０．１％。

リン酸二カリウム０．７％、リン酸−カリウム０．３％
、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、ｐＨ７゜０
〕に塗布し、３０℃にて２日間培養した。生じたコロニ
ー（約２Ｘ１０”）についてハロー法によりヒスチジン
分泌能を有する菌株を選択し、セラチア　マルセッセン
スＭＰｒ９０を１）た。

参考例　３ セラチア　マルセソセンスＬ１２０の１１セラチア　マ
ルセソセンスＭ　Ｐ　ｒ　９０　　（参ｊＨＭ２）をＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジンで変異誘起処理し
、グリセロールを炭素源とする最小培地〔グリセロール
０．５％、リン酸二カリウム０．７％、リン酸−カリウ
ム０．３％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、
寒天１．５％〕に１平板あたり１００〜５００個のコロ
ニーが生じるように塗布した。３０℃にて３日間培養後
に生じたコロニーのうち相対的に大きなコロニーについ
て。

炭素源をソルビトールとするハロー法〔アプライド　ア
ンド　エンバイロンメンタル　マイクロバイオロジー、
４８．４３　（１９８４））にてこれらの菌体のヒスチ
ジン分泌能を調べた。ヒスチジン分泌能の良好な菌株に
ついてヒスチジン生産能を実施例１−（６）に準じて検
討し、最大のヒスチジン生産能を有し、かつセラチア　
マルセッセンスＭＰ　ｒ　９０株の変異を保持する菌株
セラチア　マルセッセンスＬ１２０を選択した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　Ｌ−ヒスチジン生産能を有するセラチア属に属する
   微生物から採取したＬ−ヒスチジン生産を司る染色体フ
   ラグメントをベクタープラスミドに組み込んだハイブリ
   ッドプラスミドをセラチア属に属する微生物に含有せし
   めた微生物。 ２　ハイブリッドプラスミドがＡＴＰフォスフォリボシ
   ルトランスフェラーゼの遺伝情報を含むデオキシリボ核
   酸をベクタープラスミドに組み込んだハイブリッドプラ
   スミドである特許請求の範囲第１項記載の微生物。 ３　Ｌ−ヒスチジン生産能を有するセラチア属に属する
   微生物から採取したＬ−ヒスチジン生産を司る染色体フ
   ラグメントをベクタープラスミドに組み込んだハイブリ
   ッドプラスミドをセラチア属に属する微生物に含有せし
   めた微生物を培地に培養して、培地中にＬ−ヒスチジン
   を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ
   −ヒスチジンの製法。