JPH01104160A - 遺伝子組換え大腸菌及びそれを用いるｌ‐フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換え大腸菌（エスシエリキア・コリＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）菌株を用いてＬ−フェニル
アラニンを製造する方法に関する。より詳しくは、本発
明はＬ−フェニルアラニン生産遺伝子を含有する新規な
大腸菌菌株、ならびにこの新菌株を用いてＬ−フェニル
アラニンを製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸の一種であり、甘
味剤であるアスパルテーム（登録商標）の合成に使用さ
れる。各種の微生物を使用することによりＬ−フェニル
アラニンを製造する方法は既に多く知られている。例え
ば特開昭３７−６３４５、同６０−１６０８９０号公報
にはチロシン要求株であるプレビバクテリュウム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌株又はコリネバクテ
リュウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌株
を使用してＬ−フェニルアラニンを製造スる方法が記載
されている。特開昭５５−１６５７９７号公報には、同
様な方法としてチロシン要求株であり、かつトリプトフ
ァン類縁化合物に対して耐性を示す大腸菌菌株を用いる
方法が示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、以上挙げた従来技術における各方法はＬ−フェ
ニルアラニンを工業的規模で製造するには適した方法と
は云えなかった。さらに、これらの方法でのＬ−フェニ
ルアラニンの生産収率はいずれも低かった。

そのため、成る一つの生成物を製造する従来技術の方法
においては、遺伝子工学による特定な方法で、これに関
与する律速酵素（ｒａｔｅ　−ｌｉｍｉｔｉｎｇ酵素）
をコードする遺伝子のコピー数を増幅させる手段が採ら
れていることが知られている。しかし、細胞中で遺伝子
が過剰に発現されて、プラスミド中の遺伝子の欠失や、
細胞死滅をきたす細胞の溶解が起る場合が多かった。プ
ラスミドの発現を制御する方法としては、多くの手段が
ある、例えば、ＩＰＴＧ　（イソプロビルチオーガラク
トシフド）のような誘導物質がｊ２ａｃオペレーター系
において用いられ、ｌａｃオペロンやアルカリホスファ
ターゼ遺伝子の制御に利用されている（Ａ、イタクマら
、ｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｊ　、　１９８巻、１０５６頁
（１９７７）　：及びＡ、ミャノハラら、ｒ　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ　ｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、八、、４
８０巻、１頁（１９８３）　；参照〕 ファージの温度感受性レプレッサーｃＩ８５７を用いる
温度シフト（ｓｈｕｔ）法も知られている。レプレッサ
ーは普通、３７℃で活性を示し、そしてオペレーターを
阻害するので転写が起らないが、３７℃より高い温度で
は、レプレッサーは活性を失なうので阻害作用を発揮す
ることができなくなり、このためにレプレッサーの制御
下で遺伝子の発現が行われることになる。

〔課題を解決するための手段〕

従って、本発明の要旨の一つは、フェニルアラニンを生
産でき且つそのフェニルアラニンの生産能が３０℃〜３
５℃、特に３０℃〜３２℃の温度で最適になるようなフ
ェニルアラニン生産性の新規な大腸菌形質転換株を提供
することにある。この大腸菌はＬ−フェニルアラニンの
生合成経路における酵素を生産する遺伝子を含有するプ
ラスミドにより形質転換できるものである。そのような
形質転換に用いるプラスミドは温度域受性のレプレッサ
ーを含有することができ、しかもそのレプレッサーは、
該レプレッサーにより前記プラスミドの最適発現が、従
来法でのものが３８℃より高い温度下のものであったの
に比べ、３０〜３５℃の温度下で達成することのできる
ものである。このプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝
子と、ｐｈｅ　Ａ遺伝子と、ａｒｏ　Ｆ遺伝子とを含有
するプラスミドｐＭＫ　２０でありうる。このプラスミ
ドの調製には、制限酵素ＰｓｔＩ、　ＥｃｏＲＩ及び旧
ｎｄ　Ｉ［［が使用できる。その他の制限酵素＋　Ａｆ
ｊ２　　ＩＩＩ　１ｌａｅ　Ｌ　Ｂａｍ　　ＩＩＩ　Ｂ
ｇｊ２　　ＩＩ、Ｄｒａ　ｍなども、前記プラスミドの
調製に使用できる。本発明における好ましい大腸菌菌株
としては、大腸菌Ｋ　−１２，肺ＰＥＣ１３−６０株（
韓国の寄託所［ＫへＩＳＴ　Ｊ−に１９８７年３月２５
日、ｒＫＣＴＣ８２３７ＰＪとして寄託し；また米国の
アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションに１９
８７年７月９日にｒＡＴＣＣ６７４５９Ｊとして寄託済
）又はその変異株が挙げられ、これらはいずれも本発明
の好ましいフェニルアラニン生産株である。この大腸菌
に−１２、ＭＷＰＥＣ１３，−６０株の形態学性性状は
通常の大腸菌のそれと同じであるが、遺伝子学的性質が
異なるものである。

更に、本発明は、大腸菌を形質転換するのに使用すると
、温度３０℃〜３５℃で最適なフェニルアラニン生産能
を示す大腸菌形質転換菌株を作成できるような複製可能
な組換えプラスミドも要旨の一つとする。この本発明の
プラスミドは、好ましくはｐｈｅ　Ａ遺伝子と、ａｒｏ
　Ｆ遺伝子と、これらの遺伝子の発現を制御する温度感
受性プロモーターとを含有するものである。

また更に、本発明は、本発明に係る前記のフェニルアラ
ニン生産能を有する大腸菌菌株を培地中に培養してフェ
ニルアラニンを製造する方法をも要旨の一つとする。

この本発明の方法における大腸菌の培養は３０℃〜３５
℃、好ましくは３０°Ｃ〜３２℃の温度下にて行なうの
がよい。この培地には第一次栄養源として塘及びその他
の主要な栄養源を含有させる。この糖としてはブドウｔ
Ｉ！（グルコース）であることができ、あるいはグルコ
ース、−果糖及び蔗糖を含む加水分解混合物であること
ができる。本発明の方法には、さらヒ、培地の通気、攪
拌工程や、培養液からのフェニルアラニンの回収工程を
含めることができる。このフェニルアラニンの精製工程
を含めてもよい。

以下に更に詳細な説明を行って、本発明のその他の目的
やその適用の範囲を明らかにする。以下の詳細な説明な
らびに具体的な実施例は、本発明の好ましい態様に関す
るものであるが、これらはあくまで例示的なものであり
、本発明の要旨を変更しない範囲で、多くの変形や修飾
のあり得ることは当業者にとって自明なことである。す
なわち、本発明は後記の説明と、添付図面によりさらに
よく理解できるであろう。添付図面において；第１図は
、本発明に用いるに好ましい大腸菌に−１２゜ＭＷＰＥ
Ｃ１３−６０株に組込まれたプラスミドの作成に用いら
れる組換えプラスミドｐＭＷ　１２の調製方法を示す図
式図と、各種プラスミドの制限酵素地図を示し、また第
３図は同様に°−ミ゛ 病品用いられる組換えプラスミドｐＭＷ　１３の調製方
法を示す図式図と、各種プラスミドの制限酵素地図を示
す。

Ｌ−フェニルアラニンの製造に用いられる本発明の大腸
菌形質転換株の作成のため形質転換に使用される前記ａ
ｒｏ　Ｆ遺伝子及びｐｈｅ、Ａ遺伝子は大腸＠ＭＷＥｃ
　１０１−５（韓国のｒＫＡＩＳＴ　Ｊに１９８７年３
月２５日、ｒＫＣＴＣ８２３４ｐＪとして寄託）からシ
ョットガン法により調製される。この際には、大腸菌Ｍ
Ｗ［ＩＣ１０１−５は、生合成代謝の制御からデプレス
（ｄｅｐｒｅｓｓ）されている。また、この際、ラムダ
（Ｌａｍｂｄａ）ファージのｐｍ　−ｐｔプロモーター
はプラスミドの発現増大のプロセスに利用される。

次に、本発明を説明するに関連して、生物体、特に大腸
菌におけるフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸の生合
成の代謝経路及び及び機構を図式的に表示する生合成経
路チャートを以下に示す。

上記チャートにおいて、記号（１）〜（Ｖ）は次の意味
を示すニー （１）はａｒｏ　Ｆ遺伝子（チロシン　抑制）によりコ
ードされるＤＡＨＰシンターゼｉｓｏｅｎｚｙｍｅを表
わす。

（■）はａｒｏ　Ｇ遺伝子（フェニルアラニン抑制）に
よりコードされるＤＡＨＰシンターゼｉｓｏｅｎｚｙｍ
ｅを表わす。

（Ｉ［［）はａｒｏ　Ｈ遺伝子（トリプトファン抑制）
によりコードされるＤＡＨＰシンターゼｉｓｏｅｎｚｙ
ｍｅを表わす。

（ＩＶ）はコリスメート　ムターゼＰ−プレフェナート
　デハイドラターゼを表わす。

（Ｖ）はコリスメート　ムターゼＴ−プレフェナート　
デバイドロゲナーゼを表わす。

・・・・・・・・・Ｏはフィードバック阻害。

・・・・・・・・・・はフィードバック抑制上記のチャ
ートについて、組換えプラスミドを用いる場合にＬ−フ
ェニルアラニンの生成行程は、大腸菌菌株の細胞中の酵
素の作用で制御される。

その反応を制御する酵素の一つとして挙げられるものは
、コリスミ酸ムターゼＰ−プレフエナートデヒドラター
ゼである。また、反応を制御するその他の酵素の一つと
しては、３−デオキシ−Ｄ−アラビノへプチュロソナー
トー７−ホスフエートシンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ
）が挙げられる。このＤＡＨＰシンターゼはａｒｏ　Ｆ
　、　ａｒｏ　Ｇ及びａｒｏ　Ｈ遺伝子によってそれぞ
れコードされる３種のイソ酵素（ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ）
として存在する。

添付図面の第１図及び第２図には、各種のプラスミドの
調製方法が図式的に示されるが、プラスミドの調製法の
具体的な手法は、文献ｒ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎ−ａｎｔ　
ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　Ｊ　　（Ｊｏ−Ａｎ
ｎｅ、　Ｒ，Ｄｉｌｌｉｏｎ。

Ａｎｗａｒ　Ｎａ５１ｍ、　Ｅａｒｌｅ　Ｒ，Ｎｅｓｔ
ｍａｎｎ）及びｒ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
　Ｊ　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ＋　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１
ｔｓｃｈ、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ）の記載に従って行
われた。

本発明のフェニルアラニン生産能を有する大腸菌形質転
換株の一例である新菌株大腸菌Ｋ　−１２゜ＭＷＰＥｃ
　１３−６０（ＡＴＣＣ６７４５９）は次の通り調製さ
れたものである。

大腸面に−１２ＭＷＥＣ１０１−５株（韓国のｒＫＡＩ
ｓＴＪにＫＣＴＣ８２３４Ｐとして寄託）をＬＢ培地（
バタトトリプトン１％、バクトイ−ストエキストラクト
０．５％、塩化ナトリウム１％、ｐＨ７，４）中で３７
℃、１５時間培養してから、この菌株の細胞を採取する
。

単離したプラスミドをアルカリ抽出法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣ１ｏｎｉｎｇ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ　（１９８２））ならびにＣ５ｃｔ密度勾配
遠心法により処理して染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ
）　ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を１潤製する。次いでこのｃＤ
ＮＡをブタノール処理と透析により精製する（添付図面
第１図参照）。

他方、第１図に示されて本発明で組換えプラスミドの作
成に使用される大腸菌ＨＢＩＯＩ由来のプラスミドρＢ
Ｒ３２２、大腸菌由来のプラスミドｐＰＬＣ２８３３、
大腸菌ＩＩＢＩＯＩ由来のプラスミドｐＴＲ２６２及び
大腸菌ＨＢ　Ｌｏｔ由来のプラスミドｐＭＫ　２０の各
プラスミドＤＮＡも、上述の方法にて採取、精製する。

なお大腸菌ＭＷＥＣ１０１−５株から得られた前記の染
色体ｃＤＮＡは、制限酵素を含む緩衝液（塩化ナトリウ
ム５０ｍＭ、トリス（ｐＨ７，５）１０ｍＭ、塩化マグ
ネシウム１０ｍＭ、ジチオスレイトール１　ｍＭ）中で
制限酵素ＥｃｏＲｒを用いて、３７℃、１時間かけて消
化、切断する。通常の方法で制限酵素を不活性化し、さ
らにＥｃｏＲＩ切断后のｃＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ　　
’Ｉで切断する。その反応液から４〜？ｋｂの大きさの
フラグメントを回収（０，７％（重量）、アガロースゲ
ルを使用）し、このフラグメントをターゲットとして採
取すべき遺伝子とする。前記のプラスミドｐＢＲ３２２
も上記の制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔ　Ｉで切断する。

この切断后のプラスミドｐＢＲ３２２と、大腸菌ＭＷＥ
Ｃ１０１−５株から得られた前述の４−７ｋｂ遺伝子フ
ラグメントとを１＝３の量比で混合する。切断后のプラ
スミドｐＢＲ３２２の断片と大腸菌ＭＷＥＣ１０１−５
染色体遺伝子ＤＮＡの切断フラグメントとをＴ、ＤＮＡ
リガーゼ緩衝液〔トリス（ｐｊ１７．４）０．５Ｍ、塩
化マグネシウム０．１Ｍ１ジチオ−スレイトール０．１
Ｍ、スペル　ミジン１０酵、＾ＴＰ　１０ｍＭ、ウシ血
清アルブミン１ｍｇ／ｍｊり中で、１２−１４℃で１２
時間連結反応にかける。

こうして連結された組換えプラスミドを含有する連結反
応混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍ１ｘｔｕｒｅ）を用い
て、Ｎｏｇａｒｄの塩化カルシウム法で大腸菌フェニル
アラニン栄養要求変異株（ａｕｘｏｔｒｏｐｈ）　（ｐ
ｈｅ　Ａ−欠失株）ＭＷＥＣ２０３−７株を形質転換す
る。こうして得られた形質転換株を、聞培地（グルコー
スＬｏｇ、硫酸アンモニウム４ｇ、リン酸カリウム２ｇ
１硫酸マグネシウム０．５　ｇ　、塩化第一鉄２０■、
塩化マンガン１０■、チアミン塩酸塩１呵、フマール酸
０．５ｇ１蒸溜水１１　、ｐＨ７，４）中で、３７℃、
１時間保持する。このように処理された菌株を、テトラ
サイクリン（１５μｇ７ｙｄ”）を含有する寒天培地に
塗抹、植菌し、１０日間培養する。■培地で生育できた
組換え菌株を、選択、採取する。この選択された菌株か
ら、次にプラスミドｐＭＷ　１０を単離し、これを制限
酵素旧ｎｄ、ｎ［で切断し、さらに、制限酵素ＰｓｔＩ
で部分的に切断してから、この制限酵素を不活性化する
。その反応混合物から、目的とするｐｈｅＡ遺伝子及び
ａｒｏ　Ｆ遺伝子含有の遺伝子フラグメントを、電気泳
動法（０，７％　アガロース　ゲル使用）で分離して回
収する。

このようにして得られた組換えプラスミドに対しＴ４Ｏ
ＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰとの混合溶液（ｄＡＴＰ２
５ｍＭ、ｄＧＴＰ２５ｍＭ、ｄｃＴＰ２５ｍＭ及びｄＴ
ＴＰ２５ｍＭを含有）を加えてプラスミドの接着性末端
をプラント末端に変換する。

他方、カナマイシン耐性遺伝子（ｆｕｎ）を含有するプ
ラスミドｐＭＫ　２０をＰｓｔ　　ｒで処理し、その切
断反応液を上記のＴ、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰと
の混合溶液に加えて、そのプラスミドの接着性末端をプ
ラント末端に変える。

前述のｐｈｅ　Ａ欠失菌株である大腸菌ＭＷＥ２０３−
７株は、これを上述と同様にして形質転換する。得られ
た組換えプラスミドＰＭＷ　１１は、カナマイシン５０
μｇ／−含有する聞−寒天培地中でＭ誓ＥＣ２０３−７
株を増殖させた細胞株から前記と同様にして分離して回
収され、る。

前記のプラスミドｐＰＬｃ２８３３は、ｐｔ、プロモー
ターを含有するものであるが、このプラスミドｐＰＬｃ
２８３３は制限酵素１１ａｍ　　Ｈｒ、Ｈａｅ　ＩＩで
処理し、その切断反応混合物から０．２ｋｂの大きさの
ＰＬフラグメントを２％アガロースゲル泳動法で分離、
回収する。

前記の如く得られた組換えプラスミドｐＨ１１は、これ
を酵素ＡｆＡｎで切断し、次いでＤＮＡポリメラーゼで
処理して両端にプラント末端を形成する。

このように処理した後のプラスミドｐＭＷ　１１に前記
のＰＬフラグメントを加え、連結（ｌｉｇａｔｅ）反応
を行って、別の組換えプラスミドを作る。このよ′うに
して作られた組換えプラスミドを用いて大腸菌ｐｈｅ　
Ａ欠失株のＭＷＥＣ２０３−７株を形質転換する。

この形質転換された株から、組換えプラスミドｐＭＷ　
１２を分離、回収する。この組換えプラスミドｐＭＷ　
１２の大きさは、プラスミドｐＭＷ　１１に比べ０．２
ｋｂだけ大きい。

別途、温度域受性レプレッサー（ＣＩ　ａｓ、）とプロ
モーター（ｐ＊　）を含有するプラスミドを有するバク
テリアｐＴＲ２６２を、第２図に図式的に示されるよう
に、ヒドロキシルアミン塩酸塩処理（ＨＡ）と紫外線（
ＵＶ）照射により遺伝学的に変異させる。この処理され
た菌株から、゛温度感受性菌株のみを単離、回収する。

このように処理した后に回収されたプラスミドを用いて
、大腸菌ＭＷＥＣ１０１−６株（韓国のｒＫＡＩＳＴ　
ＪにＫＣＴＣ８２３５Ｐとして寄託法）を形質転換する
。

このように形質転換された菌株を、テトラサイタリン１
５μｇ７ｍｌを含有するＬＢ寒天培地中で、３３℃で培
養する。増殖したコロニーを選別し、ＬＢ寒天培地に移
し、２８℃で２４時間培養する。これで増殖しなかった
大腸菌菌株から、次いで、温度感受性レプレッサーを含
有するプラスミドｐＴＲ２６２−１０を分離、回収する
。

次に、第２図に図式的に示されるように、前記の組換え
プラスミドｐＭＷ　１２は、これを酵素Ｄｒａ　Ｉ［Ｉ
で切断して、次に、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼを作用させ
てプラント末端を形成する。また前記のプラスミドｐＴ
Ｒ２６２−１０を酵素Ｐｓｔ　　ＩとＢｇｊ２１１で切
断して温度域受性レプレッサー（ｃＩ）とプロモーター
（Ｐｉ　）をもつフラグメントを得る。

このｃＩとＰ、ｌを含むフラグメントを、０．９％（重
ｉｔ）アガロース　ゲル泳動法で回収してから、ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理により両端にプラント末端を形成する
（大腸菌のフレノウ（１（ｌｅｎｏｗ）フラグメントの
生成）このようにポリメラーゼ処理した上記フラグメン
トにＴ４ＤＮＡリガーゼを加えると、組換えプラスミド
ｐＭＷ　１３が生成される。このプラスミドｐＭＷ　１
３を用いてＮｏｒｇａｒｄ法で宿主菌、大腸菌ＭＷＥＣ
１０１−６株を形質転換する。かくして得られた形質転
換菌株をカナマイシン（５０μｓ／ｄ）を含有するＬＢ
寒天培地で培養すると、増殖したコロニーから新菌株と
して大腸菌に−１２，肚ＰＥＣ１３−６０（ＡＴＣＣ６
７４５９）が分離、選別できる。この新菌株はＬ−フェ
ニルアラニンの生産能を有し本発明でフェニルアラニン
の製造に使用できる。この新菌株、大腸菌に−１２，Ｍ
ＷＰＥＣ１３−６０株はアメリカン・タイプ・カルチュ
ア・コレクシラン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にブタベスト条約に
もとすいて１９８７年７月１４日に寄託し、寄託番号Ａ
ＴＣＣ６７４５９号が付された。

大腸菌に−１２，Ｍ畦ＥＣ１３−６０株の菌学的性状は
宿主菌株の大腸菌ＭＷＥＣ１０１−６株のそれと同じで
ある。しかし、宿主菌株ＭＷＥＣ１０１−６に比較して
、変異株ＭＷＰＥＣ１３−６０のＬ−フェニルアラニン
の生産収量と、その安定性は下記の通り高い値を示す（
後記の表１及び■参照）。

表　　　■ 上記データーは実施例２の手順に従って得た。

表　　　■ 夫々の供試大腸菌菌株をＬＢ培地にて培養してから、試
料を採取し、それぞれＬＢ寒天培地及びカナマイシン（
カナマイシン５０μｇ／ｍ）含有ＬＢ寒天培地上に植菌
し、２４時間培養後にコロニー数を数えて生存率を算定
した。

次に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、
これらの実施例はあくまで例示的なものであって本発明
を何ら限定するものではない。

実施例Ｉ （八）使用菌株 大腸菌に−１２，ＭＷＰＥＣ１３−６０（本発明の一菌
株例） （Ｂ）　　種培地の組成 グルコース　　　　　　　　　　　５　％バタトートリ
プトン　　　　　　　１　％バクトー酵母抽出物　　　
　　　１　％塩化ナトリウム　　　　　　　　　０．１
％カナマイシン　　　　　　　　　１０■／７！ｐＨ７
，０ （Ｃ）　　発酵生産培地の組成 グルコース　　　　　　　　　　　６　％硫酸カルシウ
ム　　　　　　　　０．０４％硫酸アンモニウム　　　
　　　　　２　％クエン酸ナトリウム　　　　　　　０
．０５％フマル酸　　　　　　　　　　　　０．０５％
塩化マグネシウム　　　　　　　　０．０５％リン酸カ
リウム（−塩基）０．１％ ／リン酸カリウム（二基基） バクト酵母抽出物　　　　　　　０．１％グルタミン酸
　　　　　　　　　　０．０５％塩化コバルト　　　　
　　　　　０．１■／ｌ硫酸亜鉛　　　　　　　　　　
　　１　■／１塩≠ 塩化カルシカルシウム　　　　　５　■／ｌチアミン塩
酸塩　　　　　　　　１０　　ｍｇ／ｌニコチン酸　　
　　　　　　　１０　　ｒｒｃ／ｊ！ｐＨ７，０ （Ｄ）　　発酵によるＬ−フェニルアラニンの生産試験
。

５００−各試験フラスコに種培地ＣＢ）の５Ｑｍｊ！を
入れ、１２０℃で２０分間加熱した。本発明による新菌
株、大腸菌に−１２，ｗｔｐｚｃ　１３−６０（＾ＴＣ
ＣＮａ　６７４５９）をこのフラスコに入れ、３０℃で
１２Ｏｒｐｍの回転速度で１６時間培養して種培養物を
得た。他方、発酵生産培地（Ｃ）を上述の組成で調製し
た。

炭酸カルシウム（５％）を、上記の発酵生産培地（Ｃ）
に入れ、これに上記の種培養物’ｌ　ｍｌを加え、３２
℃で３５時間攪拌培養させた。発酵終了後、Ｌ−フェニ
ルアラニンの収量は測定すると１２．４６ｇ／　１であ
った。

スＪｌＩＬ影 使用される大腸菌菌株（Ａ）、種培地（Ｂ）及び発酵生
産培地（Ｃ）は実施例１と同じである。

発酵によるＬ−フェニルアラニンの生産試験を次の通り
行った。

５０〇−容のフラスコに種培地（Ｂ）の５０−を入れ、
１２０℃で２０分間加熱した。新菌株の大腸菌に〜１２
゜ＭＷＰＨＣ１３−６０（ＡＴＣＣ６７４５９）をこの
フラスコに入れ、３０℃で１６時間培養して種培養物を
得た。発酵生産培地（Ｃ）の２０１を発酵槽に入れた。

上記の種培養液をこれに接種して３２℃で５５時間培養
した。（４００ｒｐｍで攪拌？０．７５　ＶＶＩＩ＋酸
素供給率）。

培養中は、グルコース濃度が１％以下に下ったら発酵槽
に水酸化アンモニウムと６０％グルコース溶液をフィー
ドしく２回）　、ｐＨを７．０〜７．２に保った。

培養中に用いられるグルコースの総量は１６０ｇ／ｌで
あった。かくてＬ−フェニルアラニンが収量として４２
．８ｇ／　１の濃度で得られた。発酵液１１を通常の方
法、即ちイオン交換樹脂で吸着処理し、水酸化アンモニ
ウムでの抽出により精製を行うと、Ｌ−フェニルアラニ
ンが粗結晶（３８，５２ｇ／　ｌ　）として得られた。

天−権■主 グルコースの代りに、蔗糖のインベルターゼ加水分解物
、すなわちグルコース、果糖、蔗糖を含有する糖混合物
を用いる以外は実施例１と同様に培養を行なった。Ｌ−
フェニルアラニンの収量は４３．７ｇ／　１２であった
。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は夫々に、本発明に用いるのに好まし
い新菌株の大腸菌に−１２，ＭＷＰＥＣ１３−１６株に
組込まれたプラスミドの作成に用いられる組換えプラス
ミドｐＭＷ　１２及びプラスミドｐＭＷ　１３の調製方
法を示す図式図と、各種プラスミドの制限酵素地図を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フェニルアラニン生産能を有し、かつそのフェニル
   アラニン産生最適温度が３０℃〜３５℃であることを特
   徴とする大腸菌菌株。 ２、フェニルアラニンの生合成経路に関与する酵素を生
   産する遺伝子を含有するプラスミドで形質転換された請
   求項１記載の大腸菌菌株。 ３、フェニルアラニン産生最適温度が３０℃〜３２℃で
   ある請求項１記載の大腸菌菌株。 ４、大腸菌Ｋ−１２、ＭＷＰＥＣ１３−６０株（ＡＴＣ
   Ｃ６７４５９）又はその変異株である請求項１記載の大
   腸菌菌株。 ５、請求項２記載のプラスミドがカナマイシン耐性遺伝
   子、ｐｈｅＡ遺伝子及びａｒｏＦ遺伝子を含有するプラ
   スミドｐＭＫ２０である請求項２記載の大腸菌菌株。 ６、請求項２記載のプラスミドは制限酵素Ｐｓｔ I 、
   ＥｃｏＲ I 及びＨｉｎｄIIIを用いて調製されたのであ
   る請求項２記載の大腸菌菌株。 ７、請求項２記載のプラスミドは制限酵素ＡｆｌII、Ｈ
   ａｅII、ＢａｍＨ I 、ＢｇｌII及びＤｒａIIIを用いて
   調製されたものである請求項２記載の大腸菌菌株。 ８、大腸菌を形質転換するのに用いると、フェニルアラ
   ニン産生最適温度が３０℃〜３５℃であるフェニルアラ
   ニン産生能を有する大腸菌形質転換株を作成できる複製
   可能な組換えプラスミド。 ９、ｐｈｅＡ−及びａｒｏＦ遺伝子を含有し、さらに遺
   伝子の発現を制御する温度感受性プロモーターを含有す
   る請求項８記載のプラスミド。 １０、請求項１記載の大腸菌菌株を培地中で培養するこ
   とを特徴とする、フェニルアラニンの製造方法。 １１、大腸菌菌株を温度３０℃〜３５℃で培養する請求
   項１０記載の方法。 １２、培養温度が３０℃〜３２℃である請求項１０記載
   の方法。 １３、糖の存在下で培養を行なう請求項１０記載の方法
   。 １４、請求項１３記載の糖がブドウ糖、果糖、蔗糖から
   なる加水分解混合物である請求項１３記載の方法。 １５、培養物からＬ−フェニルアラニンを回収する工程
   を含む請求項１０記載の方法。 １６、培地の通気、攪拌を行なう請求項１０記載の方法
   。 １７、回収されたフェニルアラニンを精製する工程を含
   む請求項１６記載の方法。