MX2013001071A - Microorganismos y metodos para la biosintesis de aromaticos, 2, 4-pentadienoato y 1, 3-butadieno. - Google Patents

Microorganismos y metodos para la biosintesis de aromaticos, 2, 4-pentadienoato y 1, 3-butadieno.

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Abstract

La invención proporciona organismos microbianos que no ocurren de manera natural teniendo una ruta de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2, 4-pentadienoato, 3-buten-lol o 1, 3-butadieno. La invención proporciona adicionalmente métodos para usar tales organismos para producir tolueno, benceno, p-toluato, ter e ft a lato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)f osfonato, benzoato, estireno, 2, 4-pentadienoato, 3-buten-lol o 1, 3-butadieno.

Description

MICROORGANISMOS Y MÉTODOS PARA LA BIOSINTESIS DE AROMÁTICOS, 2.4-PENTADIENOATO Y 1 ,3-BUTADIENO Antecedentes de la invención La presente invención se refiere en general a procesos biosintéticos, y más específicamente a organismos que tienen capacidad biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
El tolueno es un solvente común que ha reemplazado al benceno debido a la mayor carcinogenicidad del benceno y es una materia prima industrial y se usa en la manufactura de TNT, espuma de poliuretano, benzaldehído y ácido benzoico. El tolueno es un derivado en la manufactura de gasolina y existe en pequeñas concentraciones en petróleo crudo.
El benceno es a menudo usado como un intermediario para elaborar otros químicos. Su mayoría de derivados ampliamente producidos incluyen estireno, el cual se usa para elaborar polímeros y plásticos, fenol para resinas y adhesivos, vía eumeno y ciclohexano, el cual se usa en la manufactura de Nylon. El benceno es también usado para elaborar algunos tipos de cauchos, lubricantes, tintes, detergentes, fármacos, explosivos, napalm y pesticidas. La producción de benceno en la industria del petróleo se hace por varios procesos intensivos de energía que incluyen, reformación catalítica, hidrodesalquilación de tolueno, desproporcionamiento de tolueno y craqueo de vapor.
El estireno es el precursor para poliestireno y numerosos copoiímeros. Los productos a base de estireno incluyen, acrilonitrilo 1,3-butadieno estireno (ABS), caucho de estireno-1 ,3-butadieno (SBR), látex de estireno-1 ,3-butadieno, SIS (estireno-isopreno-estireno), S-EB-S (estireno-etileno/butileno-estireno), estireno-divinilbenceno (S-DVB), y poliésteres insaturados. Estos materiales son usados en caucho, plástico, aislamiento, fibra de vidrio, tuberías, partes de automóviles y barcos, contenedores de alimentos, y reversos de alfombras.
El estireno es principalmente comúnmente producido por la deshidrogenacion catalítica de etilbenceno. El etilbenceno es mezclado en la fase gaseosa con 10-15 veces su volumen en vapor a alta temperatura, y pasado sobre un lecho catalizador sólido. La mayoría de los catalizadores de deshidrogenacion de etilbenceno se basan en óxido de hierro (III), promovido por varios porcentajes de óxido de potasio o carbonato de potasio. El vapor sirve varios papeles en esta reacción. Es la fuente de calor para energizar la reacción endotérmica, y remueve el coque que tiende a formarse en el catalizador de óxido de hierro a través de la reacción de cambio de gas de agua. El promotor de potasio mejora esta reacción de descoquización. El vapor también diluye el reactivo y productos, cambiando la posición del equilibrio químico hacia los productos. Una planta de estireno típica consiste de dos o tres reactores en serie, los cuales operan bajo vacío para mejorar la conversión y selectividad. Las conversiones por paso típicas son aproximadamente de 65% para dos reactores y 70-75% para tres reactores.
Más de 25 millones de libras (55 millones de kilogramos) de 1 ,3-butadieno (o solo butadieno o BD) son producidas anualmente y se aplican en la manufactura de polímeros tales como cauchos sintéticos y resinas de ABS, y químicos tales como hexametilendiamina y 1,4-butanodiol. El 1 ,3-butadieno es típicamente producido como un derivado del proceso de craqueo de vapor para conversión de materias primas de petróleo tales como nafta, gas de petróleo licuado, etano o gas natural a etileno y otras olefinas. La capacidad para manufacturar 1 ,3-butadieno de materias primas alternativas y/o renovables podría representar un mayor avance en la cuestión de procesos de producción química más sostenibles.
Una forma posible para producir 1 ,3-butadíeno de manera renovable involucra fermentación de azúcares u otras materias primas para producir dioles, tales como 1 ,4-butanodiol ó 1 ,3-butanodiol, los cuales son separados, purificados, y después deshidratados a 1,3-butadieno en una segunda etapa que involucra catálisis a base de metal. La producción fermentativa directa de 1 ,3-butadieno de materias primas renovables podría obviar la necesidad de etapas de deshidratación y el gas de 1 ,3-butadieno (pb -4.4°C) podría ser emitido continuamente del fermentador y fácilmente condensado y recolectado. Desarrollar un proceso de producción fermentativa podría eliminar la necesidad de 1,3-butadieno a base de fósil y podría permitir ahorros sustanciales en costo, energía y residuos peligrosos y emisiones con relación al 1,3-butadieno petroquímicamente derivado.
El 2,4-Pentadienoato es un derivado de butadieno sustituido útil en su propio derecho y un intermediario valioso en ruta a otros derivados de 1 ,3-butadieno sustituidos, que incluyen, por ejemplo, 1-carbamoil-1 ,3-butadienos los cuales son accesibles vía reacomodos Curtius. Los derivados 1 ,3-butadieno N-protegidos resultantes pueden ser usados en reacciones Diels alder para la preparación de anilinas sustituidas. El 2,4-pentadienoato puede ser usado en la preparación de varios polímeros y copolímeros.
El tereftalato (también conocido como ácido tereftálico y PTA) es el precursor inmediato de tereftalato de polietíleno (PET), usado para elaborar ropas, resinas, botellas de plástico y aún como un aditivo alimenticio para aves de corral. Casi todo el PTA es producido de para-xileno por oxidación en aire en un proceso conocido como el Proceso de Mediados de Siglo. Esta oxidación es conducida a alta temperatura en un solvente de ácido acético con un catalizador compuesto de sales de cobalto y/o manganeso. El para-xileno se deriva de fuentes petroquímicas y está formado por reformación catalítica de alta severidad de la nafta. El xileno es también obtenido de la corriente de pirólisis de gasolina en un craqueador de vapor de nafta por desproporcionamiento de tolueno.
Los métodos redituables para generar PTA renovable aún no han sido desarrollados a la fecha. El PTA, tolueno y otros precursores aromáticos son naturalmente degradados por algunas bacterias. Sin embargo, estas trayectorias de degradación típicamente involucran monooxigenasas que operan irreversiblemente en la dirección degradativa. Por lo tanto, las trayectorias biosintétícas para PTA son severamente limitadas por las propiedades de enzimas conocidas a la fecha.
Un precursor prometedor para PTA es p-toluato, también conocido como p-metilbenzoato. El p-toluato es un intermediario en algunos procesos industriales para la oxidación de p-xileno a PTA. Es también un intermediario para estabilizadores poliméricos, pesticidas, compuestos sensibles a la luz, suplementos de forraje animal y otros químicos orgánicos. Solamente ligeramente soluble en solución acuosa, el p-toluato es un sólido a temperaturas fisiológicas, con un punto de fusión de 275°C. Los catalizadores microbianos para sintetizar este compuesto de materias primas de azúcar aún no han sido descritos a la fecha.
De este modo, existe una necesidad de métodos alternativos para producir efectivamente cantidades comerciales de compuestos tales como estireno, 2,4-pentadienoato, 1 ,3-butadieno, p-toluato, tereftalato, benceno y tolueno. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relativas también.
Breve descripción de la invención La invención proporciona organismos microbianos que no se originan naturalmente que tienen una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. La invención adicionalmente proporciona métodos para usar tales organismos para producir tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidrox¡-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
La invención también proporciona organismos microbianos que no se originan naturalmente que tienen una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (2H3M40P), una trayectoria de p-toluato, una trayectoria de tereftalato, una trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato (2H40P), y/o una trayectoria de benzoato. La invención adicionalmente proporciona métodos para usar tales organismos para producir (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, o benzoato.
Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra la conversión de fenilalanina a tolueno vía fenilacetato. Las enzimas son A. fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), B. fenilpiruvato descarboxilasa, C. fenilacetaldehído deshidrogenasa y/u oxidasa, D. fenilacetato descarboxilasa, E. fenilacetaldehído descarbonilasa, y F. fenilpiruvato oxidasa.
La Figura 2 muestra la conversión de fenilalanina a benceno por benceno-Masa de fenilalanina.
La Figura 3 muestra trayectorias para estireno a partir de benzoil-CoA. Las enzimas son: A. benzoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-???-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, C. benzoil-acetato descarboxilasa, D. acetofenona reductasa y E. 1 -feniletanol deshidratasa, F. fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, G. benzoil-acetato quinasa.
La Figura 4 muestra la conversión de estereoisómeros de muconato a 1 ,3-butadieno. Las enzimas son A. trans, frans-muconato descarboxilasa, B. c/s, rrans-muconato c/s-descarboxilasa, C. c/'s, trans-muconato frans-descarboxilasa, D. c/'s, c/'s-muconato descarboxilasa, E. fra/7s-2,4-pentadienoato descarboxilasa, F. c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa.
La Figura 5 muestra una representación esquemática de una trayectoria ejemplar a (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (2H3M40P) de gliceraldehído-3-fosfato y piruvato. G3P es gliceraldehído-3-fosfato, DXP es 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato y 2 E4P es C-metil-D-eritritol-4-fosfato. Las enzimas son (A) DXP sintasa; (B) DXP reductoisomerasa; y (C) 2ME4P deshidratasa.
La Figura 6 muestra una representación esquemática de una trayectoria de shikimato alterna ejemplar a p-toluato. Las enzimas son: (A) 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; (B) 3-deshidroquinato sintasa; (C) 3-deshidroquinato deshidratasa; (D) shikimato deshidrogenasa; (E) Shikimato quinasa; (F) 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; (G) corismato sintasa; y (H) corismato liasa. Los compuestos son: (1) (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato; (2) 2,4-dihidroxi-5-metil-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato; (3) 1,3-dihidroxi-4-metil-5-oxociclohexan-1 -carboxilato; (4) 5-hidroxi-4-metil-3-oxociclohex-1-eno-1-carboxilato; (5) 3,5-dihidroxi-4-metilciclohex-1 -eno-1-carboxilato; (6) 5-hidroxi-4-metil-3-(fosfonooxi)ciclohex-1-eno-1 - carboxilato; (7) 5-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -il)oxi]-4-metil-3- (fosfonooxi)ciclohex-l -eno-1 -carboxilato; (8) 3-[(1 -carboxiet-1 -en-1-il)ox¡]-4-metilciclohexa-1 ,5-d¡eno-1 -carboxilato; y (9) p-toluato.
La Figura 7 muestra una trayectoria ejemplar para conversión de p-toluato a ácido tereftálico (PTA). Las reacciones A, B y C son catalizadas por p-toluato metil-monooxigenasa reductasa, deshidrogenasa de alcohol 4-carboxibencílico y deshidrogenasa de 4-carboxibencil aldehido, respectivamente. Los compuestos mostrados son (1) ácido p-toluico; (2) alcohol 4-carboxibencílico; (3) 4-carboxibenzaldehído y (4) ácido tereftálico.
La Figura 8 muestra una trayectoria ejemplar a (2-hidrox¡-4-oxobutoxí)fosfonato de eritrosa-4-fosfato. Las enzimas son: A. eritrosa-4-fosfato deshidratasa, B. (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa. Los compuestos son: (1) eritrosa-4-fosfato, (2) (2,4-dioxobutoxi)fosfonato y (3) (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato.
La Figura 9 muestra una trayectoria de shikimato alterna de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato a benzoato. Las enzimas son: A. 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa, B. 3-deshidroquinato sintasa, C. 3-deshidroquinato deshidratasa, D. shikimato deshidrogenasa, E. shikimato quínasa, F. 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa, G. corismato sintasa, H. corismato Masa. Los compuestos son: 1. (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, 2. 2,4-dihidroxi-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato, 3. 1 ,3-dihidroxi-5-oxociclohexan-1-carboxilato, 4. 5-hidroxi-3-oxociclohex-1 -eno-1 -carboxilato, 5. 3,5-dihidroxiciclohex-1-eno-1-carboxilato, 6. 5-hidroxi-3-(fosfonooxi)ciclohex-1 -eno-1 -carboxilato, 7. 5- [(1-carboxiet-1 -en-1-il)oxi]-3-(fosfonooxi)ciclohex-1-eno-1-carbox¡lato, 8. 3-[(1 -carboxiet-1-en-1-il)oxi]ciclohexa-1 ,5-dieno-1-carboxilato, 9. benzoato.
La Figura 10 muestra trayectorias de benzoato y benzoil-CoA a benceno. Las enzimas son A. benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, B. benzoato reductasa, C. benzaldehído descarbonilasa, D. benzoil-CoA reductasa, E. benzoato descarboxilasa, F. fosfotransbenzoilasa, G. (benzoiloxi)fosfonato reductasa (desfosforilación), H. benzoato quinasa.
La Figura 11 muestra trayectorias de p-toluato (también llamado ácido p-toluico) y p-metilbenzoil-CoA a tolueno. Las enzimas son A. p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, B. p-toluato reductasa, C. p-metilbenzaldehído descarbonilasa, D. p-metilbenzoil-CoA reductasa, E. p-toluato descarboxilasa, F. fosfotrans-p-metilbenzoilasa, G. (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa (desfosforilación), H. p-toluato quinasa.
La Figura 12 muestra trayectorias a 2,4-pentadienoato de piruvato. Las enzimas son A. 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, B. 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, C. 2-oxopentenoato reductasa, D. 2-hidroxipentenoato deshidratasa, E. 4-hidroxi-2-oxovalerato reductasa, F. 2,4-dihidroxipentanoato 2-deshidratasa, G. 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa y H. 2,4-dihidroxipentanoato 4-deshidratasa.
La Figura 13 muestra trayectorias de alanina y ornitina a 2,4-pentadienoato. Las enzimas son A. AKP tiolasa, B. AKP desaminasa, C. acetilacrilato reductasa, D. 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, E.
AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, F. 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratasa, G. 2,4-dihidroxipentanoato 2-deshidratasa, H. 2,4-dioxopentanoato 2-reductasa, I. 2-hidroxi-4-oxopentanoato reductasa, J. AKP reductasa, K. 2,4-dioxopentanoato 4-reductasa, L. 2-amino-4-hidroxipentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, M. ornitina 4,5-aminomutasa, N. 2,4-diaminopentanoato 4-aminotransferasa y/o 4-deshidrogenasa. AKP es 2-amino-4-oxopentanoato.
La Figura 14 muestra trayectorias adicionales de ornitina a 2,4-pentadienoato. Las enzimas son A. ornitina 2,3-aminomutasa, B. 3,5-diaminopentanoato desaminasa, C. 5-aminopent-2-enoato desaminasa, D. 3,5-diaminopentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, E. 3-amino-5-oxopentanoato desaminasa, F. 5-oxopent-2-enoato reductasa, G. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, H. 5-aminopent-2-enoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, I. 3-amino-5-oxopentanoato reductasa, J. 3-amino-5-hidroxipentanoato desaminasa.
Figure 15 muestra trayectorias de 3-hidroxipropanoil-CoA y/o acrilil-CoA a 2,4-pentadienoato. Las enzimas son A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, L. 3-oxo-5-hidrox¡pentanoil-CoA deshidratase, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, Q. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, R. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA deshidratasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa. 3-HP-CoA es 3-hidroxipropanoil-CoA.
La Figura 16 muestra la formación de butadieno de 3-hidroxipent-4-enoato (3HP4) por 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa.
Figure 17 muestra la formación de butadieno de 3,5-dihidroxipentanoato por 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa y 3-buteno-1-ol deshidratasa. La deshidratación de 3-buteno-1 -ol a butadieno también puede ocurrir vía catálisis química.
La Figura 18 muestra la formación del intermediario 3-hidroxipent-4-enoato (3HP4) de 2,4-pentadienoato vía 2,4-pentadienoato hidratasa.
La Figura 19 muestra trayectorias a butadieno, 3-hidroxipent-4-enoato (3HP4), 2,4-pentadienoato y 3-buteno-1 -ol de 3-HP-CoA y/o acrilil-CoA. Las enzimas son A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5- dihidroxipentanoato deshidratasa, K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoM-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, Q. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, R. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA deshidratasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa, W. 3-buteno-1 -ol deshidratasa (o conversión química), X. 2,4-pentadieno descarboxilasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa. 3-HP-CoA es 3-hidroxipropanoil-CoA.
La Figura 20 muestra trayectorias a 3-hidroxipent-4-enoato (3HP4), 2,4-pentadienoato y butadieno de succinil-CoA. Las enzimas son A. succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa, B. 3-oxoadipil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, C. 3-oxoadipato deshidrogenase, D. 2-fumarilacetato descarboxilasa, E. 3-oxopent-4-enoato reductasa, F. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa, G. 3-oxoadipil-CoA reductasa, H. 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, I. 3-hidroxiadipato deshidrogenasa, J. 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa, K. 3-oxoadipato reductasa, L. 2-fumarilacetato reductasa., M. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa, N. 2,4-pentadienoato descarboxilasa.
La Figura 21 muestra trayectorias a 3-buteno-1 -ol, butadieno y 2,4-pentadienoato de malonil-CoA y acetil-CoA. Las enzimas para transformación de los sustratos identificados a productos incluyen: A. malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa, B. 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona), C. 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido), D. 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa, E. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, F. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratase, G. 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol), H. 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido), I. 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido), J. 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa, K. 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol), L. 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona), M. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa, N. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa, O. 3-buteno-1 -ol deshidratasa (o conversión química), P. 2,4-pentadieno descarboxilasa.
La Figura 22 muestra el ciclo TCA reverso para fijación de C02 en carbohidratos como sustratos. Las transformaciones enzimáticas se llevan a cabo por las enzimas como se muestra.
La Figura 23 muestra la trayectoria para el ciclo TCA reverso acoplado con deshidrogenada de monóxido de carbono e hidrogenasa para la conversión de gas de síntesis o syngas a acetil-CoA.
La Figura 24 muestra Western blots de 10 microgramos de extractos celulares de ACS90 (línea 1), ACS91 (Iínea2), Mta98/99 (líneas 3 y 4) con estándares de tamaño (línea 5) y controles de proteínas CODH (Moth_1202/1203) o Mtr (Moth_1197) de M. thermoacetica (50, 150, 250, 350, 450, 500, 750, 900, y 1000 ng).
La Figura 25 muestra resultados de ensayo de oxidación de CO. Las células {M. thermoacetica o E. coli con el operón CODH/ACS; ACS90 o ACS91 o vector vacío: pZA33S) se hicieron crecer y se prepararon extractos. Los ensayos se realizaron a 55 °C a varios tiempos en el día que los extractos fueron preparados. La reducción de metilviológeno fue seguida a 578 nm durante un curso de tiempo de 120 seg.
Descripción detallada de la invención La presente invención se dirige, en parte, al diseño y producción de células y organismos que tienen capacidades de producción biosintética para tolueno, benceno, estireno, 2,4-pentadienoato y 1 ,3-butadieno. Las rutas a tolueno y benceno, Figuras 1 y 2, comienzan con el aminoácido que se origina naturalmente fenilalanina y, de este modo, la mayoría de los organismos serán capaces de servir como un hospedero para la construcción de un organismo que no se origina naturalmente para la producción de tolueno y benceno. Las estrategias para mejorar la producción de fenilalanina se conocen en la técnica (Yakandawala et al., App. Microbio!. Biotech. 78:283-291 (2008); Lee et al., Patente Estadounidense 5,008,190).
La ruta a estireno depende de un organismo para generar benzoil-CoA, como se indica en la Figura 3. El benzoil-CoA es un intermediario metabólico clave de numerosas trayectorias biosintéticas y de degradación. El benzoil-CoA es un precursor clave de productos naturales aromáticos tales como antibióticos, aromas y señales de defensa. Las trayectorias biológicas de la biosíntesis de benzoil-CoA se conocen en la técnica (Boatright ef al., Plant Phvsiol 135:1993-2011 (2004); Xiang et al., J Bacteriol. 185:399-404 (2003); Moore et al, J Nat.Prod 65:1956-1962 (2002)). El benzoil-CoA es también un intermediario común de trayectorias de degradación de compuestos aromáticos aeróbicos y anaeróbicos (Gescher ef al., J Bacteriol. 184:6301-6315 (2002); Philipp et al., FEMS Microbiol Lett. 212:139-143 (2002); Koch et al., Eur.J Biochem. 205:195-202 (1992)).
Esta invención también se dirige, en parte, a microorganismos que no se originan naturalmente que expresan genes que codifican enzimas que catalizan la producción de 1 ,3-butadieno, como se muestra en la Figura 4. En algunas modalidades, las trayectorias para la producción de muconato se derivan de precursores metabólicos centrales. El muconato es un producto de degradación común de diversos compuestos aromáticos en microbios. Varias estrategias biocatalíticas para elaborar cis, c/'s-muconato han sido desarrolladas. Se han diseñado cepas de E. coli diseñadas por ingeniería que producen muconato de glucosa vía enzimas de la trayectoria de shikimato en el laboratorio Frost (Patente Estadounidense 5,487,987 (1996); Niu et al., Biotechnol Proq., 18:201-211 (2002)). Estas cepas son capaces de producir 36.8 g/L de cis, c/s-muconato después de 48 horas de cultivo bajo condiciones termentadoras de alimentación por lotes (22% del rendimiento teórico máximo de glucosa). El muconato también ha sido producido biocatalíticamente de materiales de partida aromáticos tales como tolueno, ácido benzoico y catecol. Las cepas que producen muconato de benzoato logran tituladores de 13.5 g/L y productividad de 5.5 g/L/hr (Choi ef al., J. Ferment. Bioeng. 84:70-76 (1997)). El muconato también ha sido generado de los efluentes de una planta de producción de monómero de estireno (Wu et al., Enzyme and Microbioloav Technology 35:598-604 (2004)).
Esta invención también se dirige, en parte, a microorganismos que no se originan naturalmente que expresan genes que codifican enzimas que catalizan la producción de 2,4-pentadienoato, como se muestra en la Figuras 12-15. Cualquiera de estas trayectorias puede alimentarse en una trayectoria de 1 ,3-butadieno adicional por inclusión de la 2,4-pentadienoato descarboxilasa requisito. La Figura 12 muestra la conversión total de piruvato a 2,4-pentadienoato por tres trayectorias. La Figura 13 muestra la conversión total de ornitina o alanina a 2,4-pentadienoato vía el intermediario común 2-amino-4-cetopentanoato (AKP). La Figura 13 muestra seis rutas a 2,4-pentadienoato de AKP, tres de las cuales interceptan intermediarios mostrados en la Figura 12. La Figura 14 muestra cuatro rutas adicionales a 2,4-pentadienoato de ornitina. La Figura 15 muestra numerosas rutas a 2,4-pentadienoato de 3-hidroxipropanoil-CoA (3-HP-CoA) y acriloil-CoA.
La invención también se dirige, en parte, a microorganismos microbianos que no se originan naturalmente que expresan genes que codifican enzimas que catalizan la producción de 1 ,3-butadieno, como se muestra en la Figuras 16-17 y 19-21. La Figura 16 muestra la deshidratación descarboxilativa de 3-hidroxipent-4-enoato (3HP4) a 1,3-butadieno, donde 3HP4 está disponible vía trayectorias mostradas en las Figuras 15 y 19. 3HP4, es importante en su propio derecho, se muestra en la Figura 18 vía el intermediario 2,4-pentadienoato vía hidratación, así como también la vía de las trayectorias de las Figuras 15, 19, y 20. Del mismo modo, la Figura 17 muestra la deshidratación descarboxilativa en serie y eliminación (deshidratación adicional) del intermediario 3,5-dihidroxipentanoato, el cual es el mismo accesible a través de las trayectorias mostradas en la Figura 15, 19, y 21.
La Figura 19 muestra trayectorias a 1 ,3-butadieno e intermediarios de 1 ,3-butadieno de 3-HP-CoA y acrilil-CoA. La Figura 20 muestra trayectorias a 1 ,3-butadieno e intermediarios de 1 ,3-butadieno de succinil-CoA. El succinil-CoA requisito es un intermediario metabólico central, el rendimiento del cual puede ser mejorado vía un ciclo TCA reductiva como se describe además en la presente. Finalmente, la Figura 21 muestra trayectorias a 1 ,3-butadieno e intermediarios de 1,3-butadieno a partir de la condensación de malonil-CoA y acetil-CoA, el último también beneficiándose del rendimiento incrementado vía trayectorias de TCA reductivas descritas en la presente.
La presente invención también se dirige al diseño y producción de células y organismos que tienen capacidades de producción biosintética para p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, tolueno, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, o benceno. Los resultados descritos en la presente indican que las trayectorias metabólicas pueden ser diseñadas y recombinantemente elaboradas por ingeniería para lograr la biosíntesis de p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, tolueno, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, o benceno en Escherichia coli y otras células u organismos. La producción biosintética de p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, tolueno, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, o benceno puede ser confirmada por construcción de cepas que tienen el genotipo metabólico diseñado. Estas células metabólicamente diseñadas por ingeniería u organismos también pueden ser sometidas a evolución adaptiva para aumentar además la biosíntesis de p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, tolueno, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, o benceno, incluyendo bajo condiciones de procedimiento teórico de máximo crecimiento.
La trayectoria de la biosíntesis de shikimato en E. coli convierte eritrosa-4-fosfato a corismato, un intermediario importante que conduce a la biosíntesis de muchos metabolitos esenciales que incluyen 4-hidroxibenzoato. El 4-hidroxibenzoato es estructuralmente similar a p-toluato, un precursor industrial de ácido tereftálico, y benceno. Como se describe en la presente, las enzimas de la trayectoria de shikimato son utilizadas para aceptar el sustrato alterno, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (2H3M40P), y transformarlo a p-toluato o tolueno, o el sustrato alterno (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato (2H40P) y transformarlo a benzoato o benceno. Además, se usa una trayectoria para sintetizar el precursor 2H3M40P o 2H40P usando enzimas de las trayectorias no de mevalonato para biosíntesis de isoprenoide.
Descritas en la presente están estrategias para diseñar por ingeniería un microorganismo para producir p-toluato, tereftalato (PTA), tolueno, benzoato, o benceno renovable a partir de materias primas de carbohidratos. En las series de tolueno, gliceraldehído-3-fosfato (G3P) y piruvato son convertidos a 2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (2H3M40P) en tres etapas enzimáticas (véase Ejemplo III y Figura 5). El intermediario 2H3M40P es subsecuentemente transformado a p-toluato por enzimas en la trayectoria de shikimato (véase Ejemplo IV y Figura 6). El p-toluato puede ser además convertido a PTA por un microorganismo (véase Ejemplo V y Figura 7). En las series de benceno, 2H40P es preparado por deshidratación y reducción de eritrosa-4-fosfato (véase Ejemplo VI y Figura 8). El intermediario 2H40P es subsecuentemente transformado a benzoato por enzimas en la trayectoria de shikimato (véase Ejemplo VI y Figura 9). El benzoato y p-toluato son convertidos a benceno y tolueno, respectivamente (véase Ejemplo VII, y Figuras 10 y 11).
La conversión de G3P a p-toluato requiere un ATP, dos equivalentes de reducción (NAD(P)H), y dos moléculas de fosfoenolpiruvato, de conformidad con la reacción pura siguiente.
G3P + 2 PEP + ATP +2 NAD(P)H + 2 H' p-Toluato + 4 Pi + ADP + 2 NAD(P)+ + CO-2 + H20 Una ATP adicional se requiere para sintetizar G3P de glucosa. El rendimiento máximo teórico de p-toluato es 0.67 mol/mol (0.51 g/g) de glucosa menos carbono requeridos para energía. Bajo la presunción de que 2 ATPs son consumidas por molécula sintetizada de p-toluato, el rendimiento pronosticado de p-toluato de glucosa es 0.62 mol/mol (0.46 g/g) p-toluato.
Si el p-toluato es además convertido a PTA por enzimas como se describe en el Ejemplo III, el rendimiento de PTA pronosticado de glucosa es 0.64 mol/mol (0.58 g/g). En este caso, la oxidación de p-toluato a PTA genera un equivalente de reducción puro adicional de conformidad con la reacción pura: p-toluato + 02 + NAD+ PTA + NADH + 2 H+ Los candidatos de enzima para catalizar cada etapa de las trayectorias anteriores son descritos en las siguientes secciones. Las trayectorias exitosamente diseñadas por ingeniería para la producción de tolueno, benceno, estireno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato o 1,3-butadieno implica identificar una serie apropiada de enzimas con actividad y especificidad suficiente, clonando sus genes correspondientes en un hospedero de producción, optimizando la expresión de estos genes en el hospedero de producción, optimizando las condiciones de fermentación, y ensayando para formación del producto después de la fermentación.
Como se usa en la presente, el término "que no se origina naturalmente" cuando se usa con referencia a un organismo microbiano o microorganismo de la invención se pretende por significar que el organismo microbiano tiene al menos una alteración genética no encontrada normalmente en una cepa que se origina naturalmente de las especies referenciadas, incluyendo las cepas de tipo nativo de las especies referencias. Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones introduciendo ácidos nucleicos expresables que codifican polipéptidos metabólicos, otras adiciones de ácidos nucleicos, supresiones de ácidos nucleicos y/o otras alteraciones funcionales del material genético del organismo microbiano. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, regiones codificantes y fragmentos funcionales de las mismas, para polipéptidos heterólogos, homólogos o tanto heterólogos como homólogos para las especies referenciadas. Modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las cuales las modificaciones alteran la expresión de un gene u operón. Polipéptidos metabólicos ejemplares incluyen enzimas o proteínas dentro de una trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, tolueno, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, o 1,3-butadieno.
Una modificación metabólica se refiere a una reacción bioquímica que es alterada de su estado que se origina naturalmente. Por lo tanto, microorganismos que no se originan naturalmente pueden tener modificaciones genéticas a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos metabólicos, o fragmentos funcionales de los mismos. Modificaciones metabólicas ejemplares son descritas en la presente.
Como se usa en la presente, el término "aislado" cuando se usa con referencia a un organismo microbiano está propuesto por significar un organismo que está sustancialmente libre de al menos un componente ya que el organismo microbiano referenciado se encuentra en la naturaleza. El término incluye un organismo microbiano que es removido de algunos o todos los componentes como se encuentran en su ambiente natural. El término también incluye un organismo microbiano que es removido de algunos o todos los componentes ya que el organismo microbiano se encuentra en ambientes que no se originan naturalmente. Por lo tanto, un organismo microbiano aislado es parcialmente o completamente separado de otras sustancias como se encuentra en la naturaleza o como es su crecimiento, almacenamiento o subsistencia en ambientes que no se originan naturalmente. Ejemplos específicos de organismos microbianos aislados incluyen microbios parcialmente puros, microbios sustancialmente puros y microbios cultivados en un medio que no se origina naturalmente.
Como se usa en la presente, los términos "microbiano," "organismo microbiano" o "microorganismo" están propuestos para significar cualquier organismo que existe como una célula microscópica que se incluye dentro de los dominios de arcae, bacteria o eucaria. Por lo tanto, el término está propuesto para abarcar células procarióticas o eucarióticas u organismos que tienen un tamaño microscópico e incluyen bacterias, arcaes y eubacterias de todas las especies así como también microorganismos eucarióticos tales como levaduras y hongos. El término también incluye cultivos celulares de algunas especies que pueden ser cultivadas para la producción de un bioquímico.
Como se usa en la presente, el término "CoA" o "coenzima A" está propuesto por significar un cofactor orgánico o grupo prostético (porción sin proteína de una enzima) cuya presencia es requerida para la actividad de muchas enzimas (la apoenzima) para formar un sistema de enzima activa. La Coenzima A funciona en ciertas enzimas de condensación, actúa en acetilo u otro transferencia de grupo acilo y en síntesis de ácido graso, y oxidación, oxidación de piruvato y en otra acetilación.
Como se usa en la presente, el término "(2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato," abreviado en la presente como 2H3M40P, tiene la fórmula química como se muestra en la Figura 5. Tal compuesto también puede ser descrito como 3-hidroxi-2-metil butanal-4-fosfato.
Como se usa en la presente, el término "(2-h¡drox¡-4-oxobutoxi)fosfonato," abreviado en la presente como 2H40P, tiene la fórmula química como se muestra en la Figura 8 (compuesto 3). Tal compuesto también puede ser descrito como 3-hidroxibutanal-4-fosfato.
Como se usa en la presente, el término "p-toluato," que tiene la fórmula molecular ?8?702" (véase Figura 6, compuesto 9)(nombre IUPAC 4-metilbenzoato) es la forma ionizada de ácido p-toluico, y se entiende que p-toluato y ácido p-toluico pueden ser usados intercambiablemente a través de esta para referirse al compuesto en cualquiera de sus formas neutral o ionizadas, que incluyen cualquiera de las formas de sal de los mismos. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que la forma específica dependerá del pH.
Como se usa en la presente, el término "benzoato," que tiene la fórmula molecular C7He02 (véase Figura 9, compuesto 9) es la forma ionizada de ácido benzoico, y se entiende que benzoato y ácido benzoico pueden ser usados de manera intercambiable a través de esta para referirse al compuesto en cualquiera de sus formas neutrales o ionizadas, que incluyen cualesquiera formas de sal de los mismos. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que la forma específica dependerá del pH.
Como se usa en la presente, el término "tereftalato," que tiene la fórmula molecular C8H4CV2 (véase Figura 7, compuesto 4)(nombre IUPAC tereftalato) es la forma ionizada de ácido tereftálico, también referido como ácido p-ftálico o PTA, y se entiende que tereftalato y ácido tereftálico pueden ser usados de manera intercambiable a través de esta para referirse al compuesto en cualquiera de sus formas neutral o ionizada, que incluyen cualesquiera formas de sal de los mismos. Se entiende por aquellos expertos de habilidad que la forma específica dependerá del pH.
Como se usa en la presente, el término "sustancialmente anaeróbico" cuando se usa con referencia a un cultivo o condición de crecimiento se entiende por significar que la cantidad de oxígeno es menor de aproximadamente 10% de saturación para oxígeno disuelto en medio líquido. El término también está propuesto para incluir cámaras selladas de medio líquido o sólido mantenido dentro de una atmósfera de menos de aproximadamente 1% de oxígeno.
"Exógeno" como se usa en la presente se pretende por significar que la molécula referenciada o la actividad referenciada son introducidas en el organismo microbiano hospedero. La molécula puede ser introducida, por ejemplo, por introducción de un ácido nucleico que codifica en el material genético hospedero tal como por integración en un cromosoma hospedero o como material genético no cromosomal tal como un plásmido. Por lo tanto, el término como se usa en referencia a expresión de un ácido nucleico codificante se refiere a la introducción del ácido nucleico codificante en una forma expresable en el organismo microbiano. Cuando se usa con referencia a una actividad biosintética, el término se refiere a una actividad que es introducida en el organismo de referencia hospedero. La fuente puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico codificante homólogo o heterólogo que expresa la actividad referenciada después de la introducción en el organismo microbiano hospedero. Por lo tanto, el término "endógeno" se refiere a una molécula referenciada o actividad que está presente en el hospedero. De manera similar, el término cuando se usa con referencia a expresión de un ácido nucleico codificante se refiere a la expresión de un ácido nucleico codificante contenido dentro del organismo microbiano. El término "heterólogo" se refiere a una molécula o actividad derivada de una fuente distinta de las especies referenciadas mientras "homólogo" se refiere a una molécula o actividad derivada del organismo microbiano hospedero. Por consiguiente, la expresión exógena de un ácido nucleico codificante de la invención puede utilizar cualquiera o tanto un ácido nucleico codificante heterólogo u homólogo.
Se entiende que cuando más de un ácido nucleico exógeno es incluido en un organismo microbiano que más de un ácido nucleico exógeno se refiere al ácido nucleico codificante referenciado o actividad biosintética, como se discute anteriormente. Se entiende además, como se describe en la presente, que tal más de un ácido nucleico exógeno puede ser introducido en el organismo microbiano hospedero en moléculas de ácido nucleico separadas, en moléculas de ácido nucleico policistrónicas, o una combinación de los mismos, y todavía ser considerados como más de un ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, como se describe en la presente un organismo microbiano puede ser diseñado por ingeniería para expresar dos o más ácidos nucleicos exógenos que codifican una enzima o proteína de trayectoria deseada. En el caso donde dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una actividad deseada son introducidos en un organismo microbiano hospedero, se entiende que los dos ácidos nucleicos exógenos pueden ser introducidos como un ácido nucleico único, por ejemplo, en un plásmido único, en plásmidos separados, pueden ser integrados en el cromosoma hospedero en un sitio único o sitios múltiples, y todavía ser considerados como dos ácidos nucleicos exógenos. De manera similar, se entiende que más de dos ácidos nucleicos exógenos pueden ser introducidos en un organismo hospedero en cualquier combinación deseada, por ejemplo, en un plásmido único, en plásmidos separados, pueden ser integrados en el cromosoma hospedero en un sitio único o sitios múltiples, y todavía ser considerados como dos o más ácidos nucleicos exógenos, por ejemplo tres ácidos nucleicos exógenos. De este modo, el número de ácidos nucleicos exógenos referenciados o actividades biosintéticas se refiere al número de ácidos nucleicos codificantes o al número de actividades biosintéticas, no al número de ácidos nucleicos separados introducidos en el organismo hospedero.
Los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención pueden contener alteraciones genéticas estables, las cuales se refieren a microorganismos que pueden ser cultivados por más de cinco generaciones sin pérdida de la alteración. En general, alteraciones genéticas estables incluyen modificaciones que persisten más de 10 generaciones, modificaciones particularmente estables persistirán por más de aproximadamente 25 generaciones, y más particularmente, modificaciones genéticas estables serán mayores de 50 generaciones, incluyendo indefinidamente.
Aquellos expertos en la técnica entenderán que las alteraciones genéticas, que incluyen modificaciones metabólicas ejemplificadas en la presente, son descritas con referencia a un organismo hospedero adecuado tal como E. coli y sus reacciones metabólicas correspondientes o un organismo de fuente adecuado para material genético deseado tal como genes para una trayectoria metabólica deseada. Sin embargo, dado el secuenciamiento del genoma completo de una amplia variedad de organismos y el alto nivel de habilidad en el área de genómica, aquellos expertos en la técnica fácilmente serán capaces de aplicar las enseñanzas y guías proporcionadas aquí para esencialmente todos los otros organismos. Por ejemplo, las alteraciones metabólicas de E. coli ejemplificadas en la presente pueden fácilmente ser aplicadas a otras especies incorporando el mismo o análogo ácido nucleico codificante de especies distintas de las especies referenciadas. Tales alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, alteraciones genéticas de homólogos de especies, en general, y en particular, desplazamientos de genes ortólogos, parálogos o no ortólogos.
Un ortólogo es un gene o genes que están relacionados por descendencia vertical y son responsables de sustancialmente las mismas o idénticas funciones en diferentes organismos. Por ejemplo, la epóxido hidrolasa de ratón y epóxido hidrolasa humana pueden ser considerados ortólogos para la función biológica de la hidrólisis de epóxidos. Los genes están relacionados por descendencia vertical cuando, por ejemplo, portan similitud de secuencia de cantidad suficiente para indicar que son homólogos, o relacionados por evolución de un ancestro común. Los genes también pueden ser considerados ortólogos si portan estructura tri-dimensional pero no necesariamente similitud de secuencia, de una cantidad suficiente para indicar que han evolucionado a partir de un ancestro común en la magnitud de que la similitud de secuencia primaria no es identificable. Los genes que son ortólogos pueden codificar proteínas con similitud de secuencia de aproximadamente 25% a 100% de identidad de secuencia de aminoácido. Genes que codifican proteínas que portan una similitud de aminoácido de menos de 25% también pueden ser considerados por haberse originado por descendencia vertical si su estructura tridimensional también muestra similitudes. Miembros de la familia de serina proteasa de enzimas, que incluyen activador de plasminógeno del tejido y elastasa, son considerados por tener origen por descendencia vertical de un ancestro común.
Los ortólogos incluyen genes o sus productos de gene codificados que a través de, por ejemplo, evolución, han divergido en estructura o actividad total. Por ejemplo, donde una especie que codifica un producto de gene que presenta dos funciones y donde tales funciones han sido separadas en distintos genes en una segunda especie, los tres genes y sus productos correspondientes son considerados por ser ortólogos. Para la producción de un producto bioquímico, aquellos expertos en la técnica entenderán que el gene ortólogo que alberga la actividad metabólica a ser introducida o interrumpida es elegido para construcción del microorganismo que no se origina naturalmente. Un ejemplo de ortólogos que presentan actividades separables es donde actividades distintas han sido separadas en productos de gene distintos entre dos o más especies o dentro de una especie única. Un ejemplo específico es la separación de proteólisis de elastasa y proteólisis de plasminógeno, dos tipos de actividad de serina proteasa, en moléculas distintas como activador de plasminógeno y elastasa. Un segundo ejemplo es la separación de 5'-3' exonucleasa del micoplasma y actividad de polimerasa III de DNA de Drosophila. La polimerasa de DNA de la primera especie puede ser considerada un ortólogo a cualquiera o ambos de la exonucleasa o la polimerasa de la segunda especie y vice versa.
Por el contrario, los parálogos son homólogos relacionados mediante, por ejemplo, duplicación seguida por divergencia evolucionaría y tienen funciones similares o comunes, pero no idénticas. Los parálogos pueden originarse o derivarse de, por ejemplo, las mismas especies o de especies diferentes. Por ejemplo, la epóxido hidrolasa microsomal (epóxido hidrolasa I) y epóxido hidrolasa soluble (epóxido hidrolasa II) pueden ser considerados parálogos debido a que representan dos enzimas distintas, co-evolucionadas de un ancestro común, que catalizan reacciones distintas y tienen funciones distintas en las mismas especies. Los parálogos son proteínas de las mismas especies con similitud de secuencia significante entre sí sugiriendo que son homólogos, o relacionados a través de co-evolución de un ancestro común. Grupos de familias de proteínas parálogas incluyen homólogos de HipA, genes de luciferasa, peptidasas y otros.
Un desplazamiento de gene no ortólogo es un gene no ortólogo de una especie que se puede sustituir por una función de gene referenciado en una especie diferente. La sustitución incluye, por ejemplo, ser capaz de realizar sustancialmente la misma o similar función en las especies de origen comparadas con la función referenciada en las especies diferentes. Aunque en general, un desplazamiento de gene no ortólogo será identificable como estructuralmente relacionado con un gene conocido que codifica la función referenciada, genes menos estructuralmente relacionados pero funcionalmente similares y sus productos de genes correspondientes no obstante todavía caerán dentro del significado del término como se usa en la presente. Similitud funcional requiere, por ejemplo, al menos alguna similitud estructural en el sitio activo o región de unión de un producto de gene no ortólogo comparado con un gene que codifica la función buscada para ser sustituida. Por lo tanto, un gene no ortólogo incluye, por ejemplo, un parálogo o un gene no relacionado.
Por lo tanto, en la identificación y construcción de los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención que tiene capacidad biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, aquellos expertos en la técnica entenderán con aplicación de las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente a una especie particular, que la identificación de modificaciones metabólicas puede incluir identificación e inclusión o inactivación de ortólogos. En la magnitud de que los desplazamientos de genes parálogos y/o no ortólogos están presentes en el microorganismo referenciado que codifica una enzima que cataliza una reacción metabólica similar o sustancialmente similar, aquellos expertos en la técnica también pueden utilizar estos genes evolutivamente relacionados.
Desplazamientos de genes ortólogos, parálogos y no ortólogos pueden ser determinados por métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la inspección de secuencias de ácido nucleico o aminoácido de dos polipéptidos revelará la identidad de secuencia y similitudes entre las secuencias comparadas. Con base en tales similitudes, un experto en la técnica puede determinar si la similitud es suficientemente alta para indicar que las proteínas están relacionadas a través de la evolución de un ancestro común. Los algoritmos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, tales como Align, BLAST, Clustal W y otros comparan y determinan una similitud de secuencia pura o identidad, y también determinan la presencia o significancia de hendiduras en la secuencia la cual puede ser asignada a un peso o calificación. Tales algoritmos también se conocen en la técnica y son similarmente aplicables para determinar la similitud o identidad de secuencia de nucleótido. Los parámetros para suficiente similitud para determinar el parentesco son computados con base en métodos bien conocidos para calcular similitud estadística, o la oportunidad de hallar un apareamiento similar en un polipéptido aleatorio, y la significancia del apareamiento determinado. Una comparación en computadora de dos o más secuencias puede, si se desea, también ser optimizada visualmente por aquellos expertos en la técnica. Productos o proteínas de genes relacionados pueden esperarse tengan una alta similitud, por ejemplo, 25% a 100% de identidad de secuencia. Proteínas que no están relacionadas pueden tener una identidad la cual es esencialmente la misma como podría esperarse ocurra por oportunidad, si una base de datos de tamaño suficiente es explorada (aproximadamente 5%). Secuencias entre 5% y 24% pueden o no pueden representar suficiente homología para concluir que las secuencias comparadas están relacionadas. Análisis estadístico adicional para determinar la significancia de tales apareamientos dando el tamaño de la serie de datos se puede llevar a cabo para determinar la relevancia de estas secuencias.
Parámetros ejemplares para determinar el parentesco de dos o más secuencias usando el algoritmo BLAST, por ejemplo, pueden ser como se expone abajo. Brevemente, los alineamientos de secuencia de aminoácido pueden ser realizados usando BLASTP versión 2.0.8 (Enero-05-1999) y los siguientes parámetros: Matriz: 0 BLOSUM62; apertura de hendidura: 11; extensión de hendidura: 1; x_dropoff: 50; esperado: 10.0; tamaño de palabra: 3; filtro: encendido. Los alineamientos de secuencia de ácido nucleico pueden ser realizados usando BLASTN versión 2.0.6 (Sept-16-1998) y los siguientes parámetros: Apareamiento: 1; desapareamiento: -2; apertura de hendidura: 5; extensión de hendidura: 2; x_dropoff: 50; esperado: 10.0; tamaño de palabra: 11; filtro: apagado. Aquellos expertos en la técnica sabrán que se pueden hacer modificaciones a los parámetros anteriores para ya sea incrementar o disminuir la rigurosidad de la comparación, por ejemplo, y determinar el parentesco de dos o más secuencias.
En alguna modalidad, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de tolueno la cual incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno expresada en una cantidad suficiente para producir tolueno. La trayectoria de tolueno se selecciona de (A) 1) una o ambas de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, y 3) fenilacetaldehído descarbonilasa; (B) 1) una o más de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, 3) una o más de fenilacetaldehído deshidrogenase y fenilacetaldehído oxidasa, y 4) fenilacetato descarboxilasa; y (C) una o más de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desanimación); 2) fenilpiruvato oxidasa, y 3) fenilacetato descarboxilasa, como se muestra en las trayectorias alternas en la Figura 1.
El organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene la trayectoria de tolueno puede incluir dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno, tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno, cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno, o cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente ejemplar que tiene tres ácidos nucleicos exógenos puede incluir un organismo que tiene genes que codifican 1) fenilalanina aminotransferasa y/o oxidorreductasa (desanimación), 3) fenilpiruvato oxidasa, y 5) fenilacetato descarboxilasa. Un organismo que no se origina naturalmente ejemplar que tiene cuatro ácidos nucleicos exógenos puede incluir un organismo que tiene genes exógenos que codifican 1) fenilalanina aminotransferasa, 2) fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 3) fenilpiruvato descarboxilasa, y 4) fenilacetaldehído descarbonilasa. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente ejemplar que tiene cinco ácidos nucleicos exógenos puede incluir un organismo que tiene genes que codifican 1) fenilalanina aminotransferasa, 2) fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 3) fenilpiruvato descarboxilasa, 4) fenilacetaldehído deshidrogenasa y/u oxidasa, y 5) fenilacetato descarboxilasa. De este modo, en modalidades particulares, un organismo microbiano que no se origina naturalmente puede tener una trayectoria de tolueno completa de cada gene que codifica cada enzima en una trayectoria de tolueno completa. En algunas modalidades el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de tolueno puede incluir al menos un ácido nucleico exógeno que es un ácido nucleico heterólogo. Finalmente, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de tolueno puede estar en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de benceno la cual incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benceno expresada en una cantidad suficiente para producir benceno. La trayectoria de benceno puede incluir una fenilalanina benceno-Masa como se muestra en la Figura 2. Al menos un ácido nucleico exógeno puede ser fenilalanina benceno-liasa misma o un ácido nucleico que afecta la producción de su precursor fenilalanina. En algunas modalidades el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de benceno tiene al menos un ácido nucleico exógeno que es un ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de benceno está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de estireno la cual incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de estireno expresada en una cantidad suficiente para producir estireno. La trayectoria de estireno se puede seleccionar de (A) 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) una o más de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa, e hidrolasa, 3) benzoil-acetato descarboxilasa, 4) acetofenona reductasa, y 5) 1 -feniletanol deshidratasa; y (B) 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) fosfotrans-3-???-3-fenilpropionilasa, 3) benzoil-acetato quinasa, 4) benzoil-acetato descarboxilasa, 5) acetofenona reductasa, y 6) 1 -feniletanol deshidratasa, como se indica por las trayectorias alternas en la Figura 3.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de estireno puede incluir dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, seis ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, y así sucesivamente. Un organismo que no se origina naturalmente ejemplar que tiene cinco ácidos nucleicos exógenos puede incluir un organismo que tiene genes exógenos que codifican 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) uno de 3-oxo-3-fen¡lprop¡on¡l-CoA sintetasa, transferasa, e hidrolasa, 3) benzoil-acetato descarboxilasa, 4) acetofenona reductasa, y 5) 1-feniletanol deshidratasa. Un organismo que no se origina naturalmente ejemplar que tiene seis ácidos nucleicos exógenos puede incluir un organismo que tiene genes exógenos que codifican 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, 3) benzoil-acetato quinasa, 4) benzoil-acetato descarboxilasa, 5) acetofenona reductasa, y 6) 1-feniletanol deshidratasa. En algunas modalidades el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de estireno tiene al menos un ácido nucleico exógeno que es un ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de estireno está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno la cual incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1 ,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno. La trayectoria de 1 ,3-butadieno se puede seleccionar de (A) 1) trans, frans-muconato descarboxilasa y 2) trans-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (B) 1) cis, frans-muconato cis-descarboxilasa y 2) frans-2, 4-pentadienoato descarboxilasa; (C) 1) cis, írans-muconato frans-descarboxilasa 2) c/s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; y (D) 1) cis, c/s-muconato descarboxilasa y 2) c/'s-2,4- pentadienoato descarboxilasa, como se indica en las trayectorias alternas en la Figura 4.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno puede incluir dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno. De este modo, los dos ácidos nucleicos exógenos pueden codificar una serie seleccionada de (A) 1) trans, frans-muconato descarboxilasa y 2) fraris-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (B) 1) c/s, frans-muconato c/s-descarboxilasa y 2) trans2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) 1) c/s, frans-muconato trans-descarboxilasa 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; y (D) 1) c/s, c/'s-muconato descarboxilasa y 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa, que corresponden a las trayectorias completas mostradas en la Figura 4. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno tiene al menos un ácido nucleico exógeno que es un ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas capaces de convertir AKP a 2,4-pentadienoato seleccionadas de (A) 1) una 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, 2) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, 3) una 2-oxopentenoato reductasa, y 4) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa, como se muestra en las etapas A-D de la Figura 12, (B) 1) una desaminasa AKP, 2) una acetilacrilato reductasa, y 3) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas B-D de la Figura 13, (C) 1) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenase, 2) una 2,4-dioxopentanoato-2-reductasa, 3) una 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratasa, 4) una acetilacrilato reductasa, y 5) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas E, H, F, C, y D de la Figura 13, (D) 1) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 2) una 2,4-dioxopentanoato-4-reductasa, 3) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, 4) una 2-oxopentenoato reductasa, y 5) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa, como se muestra en las etapas E y K Figura 13, junto con las etapas B-D de la Figura 12, y (E) 1) una AKP reductasa, 2) una 2-amino-4-hidroxipentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 3) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, 4) una 2-oxopentenoato reductasa, y 5) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa, también mostradas en las etapas J y L de la Figura 13, junto con las etapas B-D de la Figura 12. En algunas modalidades, las trayectorias de la Figura 13 que incluyen el intermediario 4-hidroxi-2-oxovalerato, mostrado en la Figura 12, también se pueden dirigir a través de las trayectorias de 2,4-dihidroxipentanoato mostradas en la Figura 12 para proporcionar 2,4-pentadienoato. Por ejemplo, de 4-hidroxi-2-oxovalerato, las trayectorias a 2,4-pentadienoato pueden incluir las enzimas en las etapas E, H, y D o etapas E, F, y G, en la Figura 12.
En algunas modalidades, la presente invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de (A) 1) 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, 2) 4-hidroxi-2-oxovalerato reductasa, 3) 2,4-dihidroxipentanoato 2-deshidratasa, y 4) 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas A, E, F, y G de la Figura 12 y (B) 1) 4-h id roxi-2-oxovalerato aldolasa, 2) 4-hidroxi-2-oxovalerato reductasa, 3) 2,4-dihidroxipentanoato 4-deshidratasa y 4) 2-hidroxipentenoato deshidratasa, como se muestra en las etapas A, E, H, y D de la Figura 12.
En algunas modalidades, la presente invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de (A) 1) AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 2) 2,4-dioxopentanoato 2-reductasa, 3) 2-hidroxi-4-oxopentanoato reductasa, 4) 2,4-dihidroxipentanoato 2-deshidratasa, y 5) 4-h¡droxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas E, H, I, G, y D de la Figura 13, y (B) 1) AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 2) 2,4-dioxopentanoato 2-reductasa, 3) 2-hidroxi-4-oxopentanoato reductasa, junto con 4) 2,4-dihidroxipentanoato-2-deshidratasa y 5) 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa o 4) 2,4-dihidroxipentanoato-4-deshidratasa y 5) 2-hidroxipentenoato deshidratasa, como se muestra en las etapas E, H, y I de la Figura 13, junto con las etapas F y G o H y D de la Figura 12, respectivamente. Es decir, la deshidratación doble de 2,4-dihidroxipentanoato se puede realizar en cualquier orden.
En algunas modalidades, la presente invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de AKP que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima de AKP expresada en una cantidad suficiente para producir AKP. La trayectoria de AKP incluye una ornitina 4,5-aminomutasa y una 2,4-diaminopentanoato 4-aminotransferasa y/o 4-deshidrogenasa, como se muestra en las etapas M y N de la Figura 13. En algunas modalidades, el organismo microbiano que tiene una trayectoria de AKP incluye dos enzimas exógenas que codifican una ornitina 4,5-aminomutasa y una 2,4-diaminopentanoato 4-aminotransferasa o 2,4-diaminopentanoato 4-deshidrogenasa. En algunas modalidades, esta trayectoria de AKP se puede agregar a cualquiera de las trayectorias de 2,4-pentadienoato mencionadas anteriormente y como se indica en la Figura 13. Alternativamente, AKP puede ser accesada de alanina por adición de una AKP tiolasa, como se muestra en la etapa A de la Figura 13, y alimentar en las varias trayectorias de 2,4-pentadienoato descritas en la presente y mostradas en la Figura 13, junto con Figura 12.
En algunas modalidades, la presente invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de (A) 1) ornitina 2,3-aminomutasa, 2) 3,5-diaminopentanoato desaminasa, y 3) 5-aminopent-2-enoato desaminasa, como se muestra en las etapas A-C de la Figura 14, (B) 1) ornitina 2,3-aminomutasa, 2) 3,5-diaminopentanoato desaminasa, 3) 5-aminopent-2-enoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 4) 5-oxopent-2-enoato reductasa, y 5)- 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas A, B, H, F, y G de la Figura 14, (C) 1) ornitina 2,3-aminomutasa, 2) 3,5-diaminopentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 3) 3-amino-5-oxopentanoato desaminasa, 4) 5-oxopent-2-enoato reductasa, y 5) 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa como se muestra en las etapas A, D, E, F, y G de la Figura 14, y (D) 1) ornitina 2,3-aminomutasa, 2) 3,5-diaminopentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 3) 3-amino-5-oxopentanoato reductasa, y 4) 3-amino-5-hidroxipentanoato desaminasa, y 5) 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa como se muestra en las etapas A, D, I, J, y G de la Figura 14.
En algunas modalidades, la presente invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de cualquiera de las numerosas trayectorias mostradas en la Figura 15 partiendo de 3-HP-CoA o acriloil-CoA.
Trayectorias ejemplares de 3-HP-CoA incluyen las siguientes series de enzimas (A) 1) 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, 2) 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, 3) 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, 4) 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, y 5) pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, como se muestra en las etapas A-E de la Figura 15, y (B) 1) 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, 2) 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, 3) 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, 4) 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, y 5) 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas A, F, I, J, y Q de la Figura 15. Un experto en la técnica reconocerá que las series de enzimas que definen las trayectorias (A) y (B) de 3-HP-CoA pueden ser mezcladas vía enzimas reversibles 3,5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, como se muestra en la etapa G en la Figura 15, y 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, como se muestra en la etapa H en la Figura 15. De este modo, una trayectoria 3-HP-CoA a 2,4-pentadienoato puede incluir las enzimas en las etapas A, B, G, J, y Q, o etapas A, B, C, H, y Q, o etapas A, B, G, J, H, D, y E, o etapas A, F, I, G, C, D, y E, o etapas, A, F, I, G, C, H, y Q, o etapas A, F, I, J, H, D, y E, cada una mostrada en la Figura 15.
Trayectorias ejemplares de acriloil-CoA incluyen las siguientes series de enzimas (C) 1) acriloil-CoA acetiltransferasa, 2) 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, 3) 3-oxopent-4-enoato reductasa, 4) 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas M, O, P, y S en la Figura 15 y (D), 1) acriloil-CoA acetiltransferasa, 2) 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, 3) 3-hidroxipent-4-enoil-CoA deshidratasa, y 4) pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, como se muestra en las etapas M, N, R, y E. Un experto en la técnica reconocerá que las series de enzimas que definen las trayectorias (A) y (B) de 3-HP-CoA y (C) y (D) de acriloil-CoA pueden ser mezcladas vía enzimas reversibles 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, como se muestra en la etapa K de la Figura 15, y 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, como se muestra en la etapa L de la Figura 15. De este modo, la etapa K se puede agregar a cualquiera de las trayectorias enumeradas a partir de acriloil-CoA a 2,4-pentadienoato proporcionando trayectorias de 2,4-pentadienoato tales como etapas K, M, N, R, y E o etapas K, M, O, P, y S. La etapa K también puede ser usada como una alternativa de conexión a la etapa A para proporcionar 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA de 3-HP-CoA vía etapas K, M, y L. De este modo, cualquiera de las trayectorias mencionadas anteriormente que utiliza la enzima de la etapa A puede utilizar las enzimas de las etapas K, M, y L, en su lugar. El mismo intermediario 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA puede ser accesado de acriloil-CoA por trayectorias vía las enzimas de las etapas K y A o M y L de la Figura 15. De este modo, acriloil-CoA se puede usar para acceder a todas las trayectorias enumeradas que podrían ser accesibles de 3-HP-CoA. De este modo, por ejemplo, una trayectoria de acriloil-CoA a 2,4-pentadienoato puede incluir enzimas de las etapas K, A, B, C, D, y E, o etapas K, A, F, I, J y Q, o etapas K, A, B, G, J, y Q, o etapas K, A, B, G, J, H, D, y E, o etapas K, A, B, C, H, y Q, o etapas K, A, F, I, G, C, D, y E, o etapas K, A, F, I, G, C, H, Q, o etapas K, A, F, I, J, H, D y E, o etapas M, L, B, C, D, y E, o etapas M, L, F, I, J y Q, o etapas M, L, B, G, J, y Q, o etapas M, L, B, G, J, H, D, y E, o etapas M, L, B, C, H, y Q, o etapas M, L, F, I, G, C, D, y E, o etapas M, L, F, I, G, C, H, Q, o etapas M, L, F, I, J, H, D y E, todas como se muestran en la Figura 15. De manera similar, 3-HP-CoA puede alimentarse en las trayectorias de acriloil-CoA enumeradas vía el intermediario 3-oxopent-4-enoil-CoA usando la enzima de la etapa L. De este modo, una trayectoria de 3-HP-CoA a 2,4-pentadienoato puede incluir enzimas de las etapas A, L, N, R, y E o etapas A, L, O, P, y S, cada trayectoria es mostrada en la Figura 15.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato la cual incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de: 1) A. 3-hidrox¡propano¡l-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 2) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 3) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 4) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 5) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent- 2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 6) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 7) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 8) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 9) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2',4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 10) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 11) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 12) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 13) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, R. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 14) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil- CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y 15) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; 16) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, R. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 17) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y 18) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención que tiene al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención incluye además una 2,4-pentadieno descarboxilasa para convertir 2,4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno.
En algunas modalidades, un organismo microbiano que no se origina naturalmente incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno la cual incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1 ,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno. La trayectoria de 1 ,3-butadieno tiene una serie de enzimas seleccionadas de: 1) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 2) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 3) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 4) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, O. 3-oxopent-4-enoM-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 5) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 6) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención incluye dos, tres, cuatro, o cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención incluye al menos un ácido nucleico exógeno que es un ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno la cual incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1-ol expresada en una cantidad suficiente para producir 3-buteno-1 -ol. La trayectoria de 3-buteno-1 -ol tiene una serie de enzimas seleccionadas de: 1) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 2) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 3) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 4) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 5) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 6) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 7) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 8) . acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 9) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hldroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 10) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 11) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 12) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3- hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoM-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 13) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 14) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 15) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 16) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 17) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3- oxo-5-h¡droxipentano¡l-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 18) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 19) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 20) . 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete, ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1 -ol. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención tiene al menos un ácido nucleico exógeno que es un ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención incluye además una 3-buteno-1 -ol deshidratasa para convertir 3-buteno-1 -ol a 1 ,3-butadieno.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede incluir dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede incluir tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. Por ejemplo, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede incluir tres ácidos nucleicos exógenos que codifican i) una desaminasa AKP, ii) una acetilacrilato reductasa, y iii) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, de este modo proporcionando una trayectoria accesable de alanina u ornitina a 2,4-pentadienoato vía AKP. Un experto en la técnica reconocerá que esto es solamente ejemplar y que tres ácidos nucleicos exógenos pueden ser la base de cualquier organismo que no se origina naturalmente que produce 2,4-pentadienoato en cualquiera de las trayectorias enumeradas de la Figura 12-15.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención microbiano puede incluir cualesquiera cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. Por ejemplo, un organismo microbiano que no se origina naturalmente puede incluir cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican i) una 4-hidrox¡-2-oxovalerato aldolasa, ii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iii) una 2-oxopentenoato reductasa, y iv) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa, de este modo definiendo una trayectoria completa de piruvato a 2,4-pentadienoato, como se muestra en la Figura 12. Un experto en la técnica reconocerá que esto es solamente ejemplar y que cuatro ácidos nucleicos exógenos pueden ser la base de cualquier organismo que no se origina naturalmente que produce 2,4-pentadienoato en cualquiera de las trayectorias enumeradas de la Figura 12-15.
En todavía modalidades adicionales, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede incluir cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención ejemplar que tiene cinco ácidos nucleicos exógenos puede incluir enzimas que codifican (A) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenase, ii) una 2,4-dioxopentanoato-2-reductasa, iii) una 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratasa, iv) una acetilacrilato reductasa, y v) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas E, H, F, C, y D en la Figura 13, o (B) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-4-reductasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa, como se muestra en las etapas E y K de la Figura 13, junto con las etapas B, C, y D de la Figura 12, o i) una AKP reductasa, ii) una 2-amino-4-hidroxipentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa, como se muestra en las etapas J y L de la Figura 13, junto con las etapas B, C, y D de la Figura 12. Un experto en la técnica reconocerá que esto es solamente ejemplar y que cinco ácidos nucleicos exógenos pueden ser la base de cualquier organismo que no se origina naturalmente que produce 2,4-pentadienoato en cualquiera de las trayectorias enumeradas de la Figura 12-15. De este modo, en algunas modalidades dos, tres, cuatro, cinco, seis, hasta todas las enzimas en una trayectoria de 2,4-pentadienoato pueden ser inserción proporcionadas de ácidos nucleicos exógenos. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención que tiene al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. Más aún, en algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención se puede proporcionar en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede además incluir una 2,4-pentadienoato descarboxilasa expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno por conversión de 2,4-pentadienoato a 1,3-butadieno. De este modo, cualesquiera trayectorias de 2,4-pentadienoato de la Figura 12 pueden formar las bases de producción adicional de 1,3 butadieno, como se indica por la conversión de cis o trans 2,4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno en la Figura 4.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, en donde el organismo microbiano que no se origina naturalmente comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto. Por ejemplo, en una trayectoria de tolueno (Figura 1), tal sustrato a producto se selecciona del grupo que consiste de fenilalanina a fenilpiruvato, fenilpiruvato a fenilacetaldehído, fenilpiruvato a fenilacetato, fenilacetaldehído a fenilacetato, fenilacetaldehído a tolueno, y fenilacetato a tolueno. En una trayectoria de estireno (Figura 3), tal sustrato a producto se selecciona del grupo que consiste de benzoil-CoA a 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA a [(3-oxo-3-fenilpropionil)oxi] fosfonato, [(3-oxo-3-fenilpropionil)oxi] fosfonato a benzoil-acetato, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA a benzoil-acetato, benzoil-acetato a acetofenona, acetofenona a 1-feniletanol, y 1 -feniletanol a estireno. En una trayectoria de 1 ,3-butadieno (Figura 4), tal sustrato a producto se selecciona de trans, frans-muconato a trans-2,4-pentadienoato, cis, írans-muconato a frans-2,4-pentadienoato, cis rans-muconato a c/'s-2,4-pentadienoato, cis, c/s-muconato a c/'s-2,4-pentadienoato, trans-2, 4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno, y c s-2,4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno. Un experto en la técnica entenderá que estos son solamente ejemplares y que cualesquiera de los pares de sustrato-producto descritos en la presente adecuados para producir un producto deseado y para los cuales una actividad apropiada está disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica con base en las enseñanzas de la presente.
En una trayectoria de 2,4-pentadienoato, tal sustrato a producto se selecciona de piruvato a 4-hidroxi-2-oxovalerato, 4-hidroxi-2-oxovalerato a 2-oxopentenoato, 2-oxopentenoato a 2-hidroxipentenoato, 2-hidroxipentenoato a 2,4-pentadienoato, AKP a acetilacrilato, acetilacrilato a 4-hidroxipent-2-enoato, 4-hidroxipent-2-enoato a 2,4-pentadienoato, AKP a 2,4-dioxopentanoato, 2,4-dioxopentanoato a 4-h¡droxi-2-oxovalerato, AKP a 2-amino-4-hidroxipentanoato, 2-amino-4-hidroxipentanoato a 4-hidrox¡-2-oxovalerato, ornitina a 2,4-diaminopentanoato, 2,4-diaminopentanoato a AKP, alanina a AKP, y así sucesivamente.
La invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato expresada en una cantidad suficiente para producir (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, la trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa (véase Ejemplo III y Figura 5, la etapa C). Un organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato puede comprender además 1 -desoxixilulosa-5-fosfato sintasa o 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (véase Ejemplo III y Figura 5, etapas A y B). De este modo, a (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato puede comprender 5 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa, 1-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa y 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa.
La invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de p-toluato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria p-toluato expresada en una cantidad suficiente para producir p-toluato, la trayectoria de p-toluato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenase; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; o corismato Masa (véase Ejemplo IV y Figura 6, etapas A-H). Un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de p-toluato puede comprender además una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (Figura 5). Una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato puede comprender, por ejemplo, 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa, 1 -desoxixilulosa-5-fosfato sintasa o 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (Figura 5).
La invención adicionalmente proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de tereftalato comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tereftalato expresada en una cantidad suficiente para producir tereftalato, la trayectoria de tereftalato comprende p-toluato metil-monooxigenasa reductasa; deshidrogenasa de alcohol 4-carboxibencílico; o deshidrogenasa de 4-carboxibencil aldehido (véase Ejemplo V y Figura 7). Tal organismo que contiene una trayectoria de tereftalato puede comprender adicionalmente una trayectoria de p-toluato, en donde la trayectoria de p-toluato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratase; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; o corismato Nasa (véase Ejemplos IV y V y Figuras 6 y 7). Tal organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de tereftalato y una trayectoria de p-toluato puede comprender además una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (véase Ejemplo III y Figura 5). Una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato puede comprender, por ejemplo, 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa, 1 -desoxixilulosa-5-fosfato sintasa o 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (véase Ejemplo III y Figura 5).
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de tolueno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno expresada en una cantidad suficiente para producir tolueno. La trayectoria de tolueno se selecciona de una serie de enzimas de las trayectorias seleccionadas de: a) p-toluato descarboxilasa; b) p-toluato reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; c) p-toluato quinasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; d) (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o h id rol asa), fosfotrans-p-metilbenzoilasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; y e) (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), p-metilbenzoil-CoA reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato expresada en una cantidad suficiente para producir (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato. La trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato incluye eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi) fosfonato reductasa.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de benzoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benzoato expresada en una cantidad suficiente para producir benzoato. La trayectoria de benzoato incluye 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato liasa.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de benceno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benceno expresada en una cantidad suficiente para producir benceno. La trayectoria de benceno se selecciona de una serie de enzimas de las trayectorias seleccionadas de: a) benzoato descarboxilasa; b) benzoato reductasa y benzaldehído descarbonilasa; c) benzoato quinasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa; d) (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotransbenzoilasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa; y e) (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), benzoil-CoA reductasa y benzaldehído descarbonilasa.
En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, p-toluato, tereftalato, tolueno, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, o benceno, en donde el organismo microbiano que no se origina naturalmente comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto. Por ejemplo, en una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, los sustratos y productos se pueden seleccionar del grupo que consiste de gliceraldehído-3-fosfato y piruvato a 1-desoxi-D- xilulosa-5-fosfato; 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato a C-metil-D-eritritol-4-fosfato; y C-metil-D-eritritol-4-fosfato a (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (véase Ejemplo III y Figura 5). En otra modalidad, una trayectoria de p-toluato puede comprender sustratos y productos seleccionados de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato a 2,4-dihidroxi-5-metil-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato; 2,4-dihidroxi-5-metil-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato a 1 ,3-dihidroxi-4-metil-5-oxociclohexan-1 -carboxilato; 1 ,3-dihidrox¡-4-metil-5-oxociclohexan-1 -carboxilato a ácido 5-hidroxi-4-metil-3-oxociclohex-1 -eno-1 -carboxílico; ácido 5-hidroxi-4-metil-3-oxociclohex-1-eno-1-carboxílico a 3,5-dihidroxi-4-m et i Ici cío hex-1 -eno-1 -carboxilato; 3,5-dihidroxi-4-metilc¡clohex-1 -eno-1 -carboxilato a 5-hidroxi-4-met¡ l-3-(fosfonooxi)ciclo hex-1 -eno-1 -carboxilato; 5-h id roxi-4-metil-3-(fosfonoox i) ciclo hex-1 -eno-1 -carboxilato a 5-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -il)oxi]-4-metil-3-(fosfonooxi)ciclohex-1-eno-1-carboxilato; 5-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -i l)oxi]-4-met i 1-3- (fosfonooxi) cid ohex-1 -eno-1 -carboxilato a 3-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -i l)ox i] -4-met i Ici cío hexa-1 ,5-d ie no- 1 -carboxilato; y 3-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -il)oxi]-4-metilciclohexa-1 ,5-dieno-1-carboxilato a p-toluato (véase Ejemplo IV y Figura 6). En todavía otra modalidad, una trayectoria de tereftalato puede comprender sustratos y productos seleccionados de p-toluato a alcohol 4-carboxibencílico; alcohol 4-carboxibencílico a 4-carboxibenzaldehído; y 4-carboxibenzaldehído a y ácido tereftálico (véase Ejemplo V y Figura 7). En otra modalidad, una trayectoria de tolueno puede comprender sustratos y productos seleccionados de p-toluato a tolueno; p-toluato a p-metil benzoil-CoA; p-metil benzoil-CoA a p-metilbenzoiloxi fosfato o p- metilbenzaldehído; p-met¡lbenzo¡lox¡ fosfonato a p-metilbenzaldehído; y p-metilbenzaldehído a tolueno (véase Ejemplo VII y Figura 11). En otra modalidad, una trayectoria de 2H40P puede comprender sustratos y productos seleccionados de eritrosa-4-fosfato a (2,4-dioxobutoxi)fosfonato; y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato a 2H40P (véase Ejemplo VI y Figura 8). En otra modalidad, una trayectoria de benzoato puede comprender sustratos y productos seleccionados de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato a 2,4-dihidroxi-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato; 2,4-dihidroxi-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato a 1,3-dihid roxi-5-oxocicl oh exan-1 -carboxilato; 1 ,3-dihidroxi-5-oxociclohexan-1-carboxilato a 5-hidroxi-3-oxociclohex-1 -eno-1 -carboxilato; 5-hidroxi-3-oxoci cío hex-1 -eno-1 -carboxilato a 3,5-dihidroxiciclohex-1 -eno-1 -carboxilato, 3, 5-dihidroxiciclohex-1 -eno-1 -carboxilato a 5-hidroxi-3-(fosfonooxi)ciclohex-l -eno-1 -carboxilato; 5-hidroxi-3-(fosfonooxi)ciclohex-l -eno-1 -carboxilato a 5-[(1-carboxiet-1-en-1-il)oxi]-3-(fosfonooxi)ciclohex-1 -eno-1 -carboxilato; 5-[(1 -carboxiet-1 -en-1 - i I )o x i ] -3-(fosfonooxi)ciclohex-1 -eno-1 -carboxilato a 3-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -il)oxi]ciclohexa-1 , 5-dien o- 1 -carboxilato; y 3-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -il)oxi]ciclohexa-1 ,5-dieno-1-carbox¡lato a benzoato (véase Ejemplo VI y Figura 9). En otra modalidad, una trayectoria de benceno puede comprender sustratos y productos seleccionados de benzoato a benceno; benzoato a benzoil-CoA, (benzoiloxi)fosfonato o benzaldehído; benzoil-CoA a (benzoiloxi)fosfonato o benzaldehído; (benzoiloxi)fosfonato a benzaldehído; y benzaldehído a benceno. Un experto en la técnica entenderá que estos son solamente ejemplares y que cualesquiera de los pares de sustrato-producto descritos en la presente adecuados para producir un producto deseado y para los cuales una actividad apropiada está disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica con base en las enseñanzas de la presente.
Como se describe en la presente, una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato se ejemplifica en la Figura 5 (véase Ejemplo III). Por lo tanto, además de un organismo microbiano que contiene una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato que produce (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, la invención adicionalmente proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, donde el organismo microbiano produce un intermediario de la trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, por ejemplo, 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato o C-metil-D-eritritol-4-fosfato. De manera similar, la invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que contiene una trayectoria de p-toluato que produce p-toluato, en donde el organismo microbiano que no se origina naturalmente comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de p-toluato, donde el organismo microbiano produce un intermediario de la trayectoria de p-toluato, por ejemplo, 2,4-dihidroxi-5-metil-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato, 1 ,3-dihidroxi-4-metil-5-oxociclohexan-1 -carboxilato, 5-hidroxi-4-metil-3-oxociclohex-1- en o-1 -car boxi lato, 3,5-dihidrox¡-4-met¡lciclohex-1 -eno-1 -carboxilato, 5-hidroxi-4-metíl-3-(fosfonooxi)ciclohex-1 -eno-1 -carboxilato, 5-[(1-carboxiet-1 -en-1-il)oxi]-4-metil-3-(fosfonooxi)ciclohex-1 -eno-1 -carboxilato, o 3-[(1-carboxiet-1 -en-1 -il)oxi]-4-metilciclohexa-1 ,5-dieno-1-carboxilato. Además, la invención adicionalmente proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que contiene una enzima de la trayectoria de tereftalato, donde el organismo microbiano produce una intermediario de la trayectoria de tereftalato, por ejemplo, alcohol 4-carboxibencílico o 4-carboxibenzaldehído.
De manera similar, la invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que contiene una trayectoria de tolueno que produce tolueno, en donde el organismo microbiano que no se origina naturalmente comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno, donde el organismo microbiano produce un intermediario de la trayectoria de tolueno, por ejemplo, p-metilbenzoil-CoA, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato, o p-metilbenzaldehído.
De manera similar, la invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que contiene una trayectoria de benceno que produce benceno, en donde el organismo microbiano que no se origina naturalmente comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benceno, donde el organismo microbiano produce una intermediario de la trayectoria de benceno, por ejemplo, benzoil-CoA, (benzoiloxi)fosfonato, y benzaldehído (Figura 10).
De manera similar, la invención también proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que contiene una trayectoria de benzoato que produce benzoato, en donde el organismo microbiano que no se origina naturalmente comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benzoato, donde el organismo microbiano produce un intermediario de la trayectoria de benzoato, por ejemplo, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, 2,4-dihidroxi-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato, 1 ,3-dihidroxi-5-oxociclohexan-1 -carboxilato, 5-hidroxi-3-oxociclohex-1 -eno-1-carboxilato, 3, 5-dihidroxiciclohex-1-eno-1 -carboxilato, 5-hidroxi-3-(fosfo noox i )ci el oh ex- 1 -e no- 1 -carboxilato, 5-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -il)oxi]-3-(fosfonooxi ) cid ohex-1 -en o-1 -carboxilato, y 3-[(1 -carboxiet-1 -en-1 -il)oxi]ciclohexa-1 ,5-dieno-1 -carboxilato (Figura 9).
De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que contiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, donde la enzima o proteína convierte los sustratos y productos de una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, tal como aquellas mostrados en la Figuras 1-11.
Mientras se describe en general en la presente como un organismo microbiano que contiene una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3- buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, se entiende que la invención adicionalmente proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2- idroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir un intermediario de una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidrox¡-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2- idroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Por ejemplo, como se describe en la presente, las trayectorias de tolueno, benceno, estireno y 1 ,3-butadieno son ejemplificadas en la Figuras 1-23. Por lo tanto, además de un organismo microbiano que contiene una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno que produce tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, la invención adicionalmente proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, donde el organismo microbiano produce un intermediario de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, por ejemplo, fenilpiruvato, fenilacetaldehído, fenilacetato, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA, [(3-oxo-3-fenilpropionil)oxi] fosfonato, benzoil-acetato, acetofenona, 1-feniletanol, DXP, 2ME4P, benzoil-CoA, (benzoiloxi)fosfonato, benzaldehído, trans-2,4-pentadienoato, y c/s-2,4-pentadienoato, así como también cualesquiera intermediario de la trayectoria de shikimato mostrado en la Figuras 6 y 9.
Se entiende que cualesquiera de las trayectorias descritas en la presente, como se describe en los Ejemplos y ejemplifica en las Figuras, que incluyen las trayectorias de la Figuras 1-11, pueden ser utilizados para generar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que produce cualesquiera intermediario de la trayectoria o producto, como se desee. Como se describe en la presente, tal organismo microbiano que produce un intermediario se puede usar en combinación con otro organismo microbiano que expresa corriente abajo enzimas de la trayectoria para producir un producto desead.o. Sin embargo, se entiende que un organismo microbiano que no se origina naturalmente que produce un intermediario de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno se puede utilizar para producir el intermediario como un producto deseado.
La invención se describe en la presente con referencia general a la reacción metabólica, reactivo o producto del mismo, o con referencia específica a uno o más ácidos nucleicos o genes que codifican una enzima asociada con o catalizante, o una proteína asociada con, la reacción, reactivo o producto metabólico referenciado. A menos que se declare expresamente de otro modo en la presente, aquellos expertos en la técnica entenderán que la referencia a una reacción también constituye la referencia a los reactivos y productos de la reacción. De manera similar, a menos que de otro modo se declare expresamente en la presente, la referencia a un reactivo o producto también hace referencia a la reacción, y la referencia a cualesquiera de estos constituyentes metabólicos también hace referencia al gene o genes que codifican las enzimas que catalizan o proteínas involucradas en la reacción, reactivo o producto referenciado. Del mismo modo, dado los campos bien conocidos de bioquímica metabólica, enzimología y genómicos, la referencia en la presente a un gene o ácido nucleico codificante también constituye una referencia a la enzima codificada correspondiente y la reacción se cataliza o una proteína asociada con la reacción así como también los reactivos y productos de la reacción.
Los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención se pueden producir introduciendo ácidos nucleicos expresables que codifican una o más de las enzimas o proteínas que participan en una o más trayectorias biosintéticas de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Dependiendo del organismo microbiano hospedero elegido para la biosíntesis, ácidos nucleicos de algunas o todas las trayectorias biosintéticas particulares de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, pueden ser expresados. Por ejemplo, si un hospedero elegido es deficiente en una o más enzimas o proteínas para una trayectoria biosintética deseada, entonces los ácidos nucleicos que se expresan para la(s) enzima(s) deficiente(s) o proteína(s) se introducen en el hospedero para supresión exógena subsecuente. Alternativamente, si el hospedero elegido exhibe expresión endógena de algunos genes de la trayectoria, pero es deficiente en otros, entonces un ácido nucleico codificante es necesario para las enzimas o proteínas deficientes para lograr la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. De este modo, un organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede ser producido introduciendo enzimas exógenas o actividades de proteína para obtener una trayectoria biosintética deseada o una trayectoria biosintética deseada se puede obtener introduciendo una o más enzimas exógenas o actividades de proteína que, junto con una o más enzimas o proteínas endógenas, produce un producto deseado tal como tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
Los organismos microbianos hospederos se pueden seleccionar de, y los organismos microbianos que no se originan naturalmente generar en, por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos, o cualesquiera de una variedad de otros microorganismos aplicables a los procesos de fermentación. Las bacterias ejemplares incluyen especies seleccionadas de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxidans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutilicum, Pseudomonas fluorescens, y Pseudomonas putida. Levaduras u hongos ejemplares incluyen especies seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Rhizopus arrhizus, Rhizobus oryzae, y similares. E. coli es un organismo hospedero particularmente útil puesto que es un organismo microbiano bien caracterizado adecuado para ingeniería genética. Otros organismos hospederos particularmente útiles incluyen levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae. Se entiende que cualesquiera organismo hospedero microbiano adecuado puede ser usado para introducir modificaciones metabólicas y/o genéticas para producir un producto deseado.
Dependiendo de los constituyentes de la trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3- met¡l-4-oxobutox¡)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno de un organismo microbiano hospedero seleccionado, los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención incluirán al menos un ácido nucleico que codifica la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butandieno exógenamente expresado y hasta todos los ácidos nucleicos que codifican para una o más trayectorias biosintéticas de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Por ejemplo, la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno se puede establecer en un hospedero deficiente en una enzima proteína de la trayectoria a través de la expresión exógena del ácido nucleico codificante correspondiente. En un hospedero deficiente en todas las enzimas o proteínas de una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, la expresión exógena de todas las enzimas o proteínas en la trayectoria pueden ser incluidas, aunque se entiende que todas las enzimas o proteínas de una trayectoria pueden ser expresadas aún si el hospedero contiene al menos una de las trayectorias de enzimas o proteínas. Por ejemplo, la expresión exógena de todas las enzimas o proteínas en una trayectoria para la producción de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede ser incluida, tal como fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), fenilpiruvato descarboxilasa, fenilacetaldehído deshidrogenasa y/u oxidasa, fenilpiruvato oxidasa, fenilacetato descarboxilasa, fenilacetaldehído descarbonilasa, fenilalanina benceno-Masa, benzoil-CoA acetiltransferasa, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, benzoil-acetato descarboxilasa, acetofenona reductasa, 1-feniletanol deshidratasa, fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, benzoil-acetato quinasa, trans, rrans-muconato descarboxilasa, cis, trans-muconato c/s-descarboxilasa, cis, frans-muconato frans-descarboxilasa, cis, c/'s-muconato descarboxilasa, frans-2, 4-pentadienoato descarboxilasa, y c/s-2,4-pentadienoato descarboxilasa.
Por ejemplo, todas las enzimas en una trayectoria de p-toluato pueden ser incluidas, tales como 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato Masa. Además, todas las enzimas en una trayectoria de tereftalato pueden ser incluidas, tales como p-toluato metil-monooxigenasa reductasa; deshidrogenasa de alcohol 4-carboxibencílico; y deshidrogenasa de 4-carboxibencil aldehido.
Además, todas las enzimas en una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato pueden ser incluidas, tales como 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa, 1 -desoxixilulosa-5-fosfato sintasa y 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa. Del mismo modo, todas las enzimas en una trayectoria de tolueno pueden ser incluidas, tales como p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, p-toluato reductasa, p-metilbenzaldehído descarbonilasa, p-metilbenzoil-CoA reductasa, p-toluato descarboxilasa, fosfotrans-p-metilbenzoilasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa (desfosforilación), y p-toluato quinasa.
Del mismo modo, todas las enzimas en una trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato pueden ser incluidas, tales como eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa.
Del mismo modo, todas las enzimas en una trayectoria de benzoato pueden ser incluidas, tales como 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa, 3-deshidroquinato sintasa, 3-deshidroquinato deshidratasa, shikimato deshidrogenasa, shikimato quinasa, 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa, corismato sintasa, y corismato Nasa.
Del mismo modo, todas las enzimas en una trayectoria de benceno pueden ser incluidas, tales como benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, benzoato reductasa, benzaldehído descarbonilasa, benzoil-CoA reductasa, benzoato descarboxilasa, fosfotransbenzoilasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa (desfosforilación), y benzoato quinasa.
Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos expertos en la técnica entenderán que el número de ácidos nucleicos codificantes para introducir en una forma expresable serán, al menos, paralelos a las deficiencias de la trayectoria del tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno del organismo microbiano hospedero seleccionado. Por lo tanto, un organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, es decir, hasta todos los ácidos nucleicos que codifican las enzimas o proteínas que constituyen una trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno descrita en la presente. En algunas modalidades, los organismos microbianos que no se originan naturalmente también pueden incluir otras modificaciones genéticas que facilitan u optimizan la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidrox¡-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno o que confieren otras funciones útiles sobre el organismo microbiano hospedero. Una de tales otras funcionalidades puede incluir, por ejemplo, aumento de la síntesis de uno o más de los precursores de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno tales como fenilalanina, fenilpiruvato, fenilacetaldehido, fenilacetato, benzoil-CoA, 3- oxo-3-fenilpropionil-CoA, [(3-oxo-3-fenilpropionil)oxi]fosfonato, benzoil acetato, acetofenona, 1 -feniletanol, trans, frans-muconato, cis rans-muconato, cis, c/'s-muconato, frans-2, 4-pentadienoato, c/s-2,4-pentadienoato, 4-hidroxi-2-oxovalerato, 2-oxopentenoato, 2-hidroxipentenoato, 2,4-dihidroxipentanoato, 4-hidroxipent-2-enoato, 2,4-diaminopentanoato, AKP, acetilacrilato, 2,4-dioxopentanoato, 2-hidroxi- 4- oxo-pentanoato, 2-amino-4-hidroxipentanoato, 3,5-diaminopentanoato, 5-aminopent-2-enoato, 3-amino-5-oxopentanoato, 5-oxopent-2-enoato, 5-hidroxipent-2-enoato, 3-amino-5-hidroxipentanoato, 3-HP-CoA, acriloil-CoA, 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA, 3-oxo-5-hidroxipentanoato, 3,5-dihidroxipentanoato, 3,5-dihidroxipentanoil-CoA, 5-hidroxipent-2-enoil-CoA, 2,4-pentadienoil-CoA, 3-oxopent-4-enoil-CoA, 3-hidroxipent-4-enoil-CoA, 3-oxopent-4-enoato, y 3-hidroxipent-4-enoato gliceraldehido-3-fosfato, piruvato, (2-h¡droxi-3-metil-4-oxobutox¡)fosfonato o p-toluato. Además, como se describe en la presente, trayectorias múltiples pueden ser incluidas en un organismo único tales como la trayectoria para producir p-toluato (Figura 6), tereftalato (Figura 7) tolueno (Figura 11) y (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (Figura 5), como se desee, o 2H40P (Figura 8), benzoato (Figura 9) y benceno (Figura 10).
En general, un organismo microbiano hospedero se selecciona de manera que produce el precursor de una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, ya sea como una molécula que se produce naturalmente o como un producto diseñado por ingeniería que ya sea proporciona producción cíe novo de un precursor deseado o producción incrementada de un precursor naturalmente producido por el organismo microbiano hospedero. Por ejemplo, cis, c/s-muconato se produce naturalmente en un organismo hospedero tal como E. coli. Como un ejemplo adicional, gliceraldehído- 3- fosfato y fosfoenolpiruvato son producidos naturalmente en un organismo hospedero tal como E. coli. Un organismo hospedero puede ser diseñado por ingeniería para incrementar la producción de un precursor, como se describe en la presente. Además, un organismo microbiano que ha sido diseñado por ingeniería para producir un precursor deseado se puede usar como un organismo hospedero y además diseñado por ingeniería para expresar enzimas o proteínas de una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidrox¡-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
En algunas modalidades, un organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención se genera de un hospedero que contiene la capacidad enzimática para sintetizar tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi- 4- oxobutoxí)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. En esta modalidad específica puede ser útil incrementar la síntesis o acumulación de un producto de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4- oxobutox¡)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno a, por ejemplo, llevar reacciones de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno hacia la producción de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. La síntesis incrementada o acumulación puede ser realizada mediante, por ejemplo, sobre expresión de ácidos nucleicos que codifican una o más enzimas o proteínas de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno mencionadas anteriormente. La sobre expresión de la enzima o enzimas y/o proteína o proteínas de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede ocurrir, por ejemplo, a través de la expresión exógena del gene o genes endógenos, o a través de la expresión exógena del gene o genes heterologos. Por lo tanto, los organismos que se originan naturalmente pueden ser fácilmente generados para ser los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención, por ejemplo, produciendo tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4- oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, a través de la sobreexpresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, es decir, hasta todos los ácidos nucleicos que codifican enzimas o proteínas de la trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-met¡l-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Además, un organismo que no se origina naturalmente puede ser generado por mutagénesis de un gene endógeno que resulta en un incremento en actividad de una enzima en la trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
En modalidades particularmente útiles, se emplea la expresión exógena de los ácidos nucleicos codificantes. La expresión exógena confiere la capacidad para ajustar habitualmente la expresión y/o elementos reguladores al hospedero y aplicación para lograr un nivel de expresión deseado que es controlado por el usuario. Sin embargo, la expresión endógena también se puede utilizar en otras modalidades tales como removiendo un efector regulador negativo o inducción del promotor del gene cuando se liga a un promotor inducible u otro elemento regulador. De este modo, un gene endógeno que tiene un promotor inducible que se origina naturalmente puede ser regulado ascendentemente proporcionando el agente inductor apropiado, o la región reguladora de un gene endógeno puede ser diseñada por ingeniería para incorporar un elemento regulador inducible, de este modo permitiendo la regulación de la expresión incrementada de un gene endógeno en un tiempo deseado. De manera similar, un promotor inducible puede ser incluido como un elemento regulador para un gene exógeno introducido en un organismo microbiano que no se origina naturalmente.
Se entiende que, en métodos de la invención, cualesquiera de uno o more ácidos nucleicos exógenos pueden ser introducidos en un organismo microbiano para producir un organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención. Los ácidos nucleicos pueden ser introducidos para así conferir, por ejemplo, una trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno sobre el organismo microbiano. Alternativamente, ácidos nucleicos codificantes pueden ser introducidos para producir un organismo microbiano intermediario que tiene la capacidad biosintética para catalizar algunas de las reacciones requeridas para conferir capacidad biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Por ejemplo, un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobuto i)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede comprender al menos dos ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas o proteínas deseadas, tales como la combinación de fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación) y fenilpiruvato descarboxilasa, fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación) y fenilacetaldehido deshidrogenase y/u oxidasa, fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación) y fenilpiruvato oxidasa, fenilpiruvato oxidasa y fenilacetato descarboxilasa, fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación) y fenilacetato descarboxilasa, fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación) y fenilacetaldehido descarbonilasa, fenilpiruvato descarboxilasa y fenilacetaldehido deshidrogenasa, fenilpiruvato descarboxilasa y fenilacetato descarboxilasa, fenilpiruvato descarboxilasa y fenilacetaldehido descarbonilasa, y fenilacetaldehido deshidrogenasa y/u oxidasa y fenilacetato descarboxilasa, en una trayectoria de tolueno. De manera similar, en una trayectoria de estireno la combinación de al menos dos ácidos nucleicos exógenos puede incluir benzoil-CoA acetiltransferasa y 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, benzoil-CoA acetiltransferasa y benzoil-acetato descarboxilasa, benzoil-CoA acetiltransferasa y acetofenona reductasa, benzoil-CoA acetiltransferasa y 1 -feniletanol deshidratasa, benzoil-CoA acetiltransferasa y fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, benzoil-CoA acetiltransferasa y benzoil-acetato quinasa, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa y benzoil-acetato descarboxilasa, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa y acetofenona reductasa, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa y 1 -feniletanol deshidratasa, y así sucesivamente.
De manera similar, en una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, una combinación de las enzimas expresadas puede ser una combinación de 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa y 1-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa, o 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa y 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa. En una trayectoria de p-toluato, una combinación de las enzimas expresadas puede ser una combinación de 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa y 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato quinasa y 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; shikimato quinasa y shikimato deshidrogenasa and, y similares. De manera similar, en una trayectoria de tereftalato, una combinación de las enzimas expresadas puede ser p-toluato metil-monooxigenasa reductasa y deshidrogenasa de alcohol 4-carboxibencílico; o deshidrogenasa de alcohol 4-carboxibencílico y deshidrogenasa de 4-carboxibencil aldehido, y similares. De este modo, se entiende que cualesquiera combinación de dos o más enzimas o proteínas de una trayectoria biosintética puede ser incluida en un organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención.
De manera similar, se entiende que cualesquiera combinación de tres o más enzimas o proteínas de una trayectoria biosintética puede ser incluida en un organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención, y así sucesivamente, como se desee, tan pronto como la combinación de enzimas y/o proteínas de la trayectoria biosintética deseada resulte en producción del producto deseado correspondiente. Tal combinación de tres enzimas puede incluir, por ejemplo, 3-deshidroquinato sintasa, shikimato deshidrogenasa y shikimato quinasa; shikimato quinasa, corismato sintasa y corismato Masa; 3-deshidroquinato deshidratasa, corismato sintasa y corismato Masa, y así sucesivamente, como se desee, tan pronto como la combinación de enzimas y/o proteínas de la trayectoria biosintética deseada resulte en producción del producto deseado correspondiente.
De manera similar, cualesquiera combinación de cuatro, cinco, seis, o más enzimas o proteínas de una trayectoria biosintética como se describe en la presente puede ser incluida en un organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención, como se desee, tan pronto como la combinación de enzimas y/o proteínas de la trayectoria biosintética deseada resulte en producción del producto deseado correspondiente.
Además de la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno como se describe en la presente, los organismos microbianos que no se originan naturalmente y métodos de la invención también se pueden utilizar en varias combinaciones con cada uno de los otros y con otros organismos microbianos y métodos bien conocidos en la técnica para lograr biosíntesis del producto por otras rutas. Por ejemplo, una alternativa para producir tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4- oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno distinto del uso de los productores de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno es a través de la adición de otro organismo microbiano capaz de convertir un intermediario de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno a tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Uno de tal procedimiento incluye, por ejemplo, la fermentación de un organismo microbiano que produce un intermediario de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutox¡)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. El intermediario de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede entonces ser usado como un sustrato para un segundo organismo microbiano que convierte el intermediario de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno a tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. El intermediario de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede ser agregado directamente a otro cultivo del segundo organismo o el cultivo original del productores intermediarios de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede ser agotado de estos organismos microbianos mediante, por ejemplo, separación celular, y después subsecuente adición del segundo organismo al caldo de fermentación se puede utilizar para producir el producto final sin etapas de purificación intermedias.
En otras modalidades, los organismos microbianos que no se originan naturalmente y métodos de la invención pueden ser ensamblados en una amplia variedad de subtrayectorias para lograr la biosíntesis de, por ejemplo, tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. En estas modalidades, las trayectorias biosintéticas para un producto deseado de la invención pueden ser segregadas en diferentes organismos microbianos, y los diferentes organismos microbianos pueden ser co-cultivados para producir el producto final. En tal esquema biosintético, el producto de un organismo microbiano en el sustrato para un segundo organismo microbiano hasta que el producto final es sintetizado. Por ejemplo, la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede ser realizada construyendo un organismo microbiano que contiene trayectorias biosintéticas para conversión de un intermediario de la trayectoria a otro intermediario de la trayectoria o el producto. Alternativamente, tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno también pueden ser biosintéticamente producidos de organismos microbianos a través del co-cultivo o co-fermentación usando dos organismos en el mismo recipiente, donde el primer organismo microbiano produce un intermediario de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno y el segundo organismo microbiano convierte el intermediario a tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos expertos en la técnica entenderán que existe una amplia variedad de combinaciones y permutaciones para los organismos microbianos que no se originan naturalmente y métodos de la invención junto con otros microorganismos microbianos, con el co-cultivo de otros organismos microbianos que no se originan naturalmente que tienen subtrayectorias y con combinaciones de otros procedimientos químicos y/o bioquímicos bien conocidos en la técnica para producir tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
Fuentes de ácidos nucleicos codificantes para una enzima o proteína de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno pueden incluir, por ejemplo, cualesquiera especies donde el producto de gene codificado es capaz de catalizar la reacción referenciada. Tales especies incluyen tanto organismos procarióticos como eucarióticos que incluyen, pero no se limitan a, bacterias, que incluyen archaea y eubacteria, y eucariotes, que incluyen levadura, plantas, insectos animales y mamíferos, que incluyen al hombre. Especies ejemplares de tales fuentes incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Agrobacterium tumefaciens, Bacillus subtilis, especies de Synechocystis, Arabidopsis thaliana, Zymomonas mobilis, Klebsiella oxytoca, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Lactobacullus collinoides, Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteuranum, Citrobacter freundii, Clostridium butyricum, Roseburia inulinivorans, Sulfolobus solfataricus, Neurospora crassa, Sinorhizobium fredii, Helicobacter pilori, Pyrococcus furiosus, Haemophilus influenzae, Erwinia chrysanthemi, Staphilococcus aureus, Dunaliella salina, Streptococcus pneumoniae, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans, Pneumocystis carinii, Streptomyces coelicolor, especies de los géneros Burkholderia, Alcaligenes, Pseudomonas, Shingomonas y Comamonas, por ejemplo, Comamonas testosteroni, así como también otras especies ejemplares descritas en la presente o disponibles como fuentes de organismos para genes correspondientes. Sin embargo, con la secuencia del genoma completo disponible para ahora más de 550 especies (con más de la mitad de estas disponibles en bases de datos públicas tales como la NCBI), que incluyen 395 genomas de microorganismos y una variedad de genomas de levadura, hongos, plantas y mamíferos, la identificación de genes que codifican la actividad biosintética requisito de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno para uno o más genes en especies relacionadas o distantes, que incluyen por ejemplo, desplazamientos de genes homólogos, ortólogos, parálogos y no ortólogos de genes conocidos, y el intercambio de alteraciones genéticas entre organismos es rutina y bien conocida en la técnica. Por consiguiente, las alteraciones metabólicas permiten la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno descritos en la presente con referencia a un organismo particular tal como E. coli pueden ser fácilmente aplicadas a otros microorganismos, que incluyen organismos procarióticos y eucarióticos semejantes. Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos expertos en la técnica sabrán que una alteración metabólica ejemplificada en un organismo puede ser aplicada igualmente a otros organismos.
En algunos casos, tales como cuando existe una trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno alternativa en una especie no relacionada, la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede ser conferida sobre las especies hospederas mediante, por ejemplo, la expresión exógena de un parálogo o parálogos de las especies no relacionadas que catalizan una reacción metabólica similar, aún no idéntica para reemplazar la reacción referenciada. Debido a que existen ciertas diferencias entre redes metabólicas entre diferentes organismos, aquellos expertos en la técnica entenderán que el empleo del gene actual entre diferentes organismos puede diferir. Sin embargo, dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos expertos en la técnica también entenderán que las enseñanzas y métodos de la invención pueden ser aplicadas a todos los organismos microbianos usando las alteraciones metabólicas cognatas a aquellos ejemplificados en la presente para construir un organismo microbiano en una especie de interés que sintetizará tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4- oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
Métodos para construir y probar los niveles de expresión de un hospedero que produce tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno que no se origina naturalmente pueden ser realizados, por ejemplo, por métodos de detección y recombinantes bien conocidos en la técnica. Tales métodos se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).
Secuencias de ácido nucleico exógenas involucradas en una trayectoria para la producción de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno pueden ser introducidas establemente o temporalmente en una célula hospedera usando técnicas bien conocidas en el arte que incluyen, pero no se limitan a, conjugación, electroporación, transformación química, transducción, transfección y transformación por ultrasonido. Para la expresión exógena en E. coli u otras células procarióticas, algunas secuencias de ácido nucleico en los genes o cDNAs de ácidos nucleicos eucarióticos pueden codificar señales de objetivo tales como una N-terminal mitocondrial u otra señal de objetivo, la cual puede ser removida antes de la transformación en células hospederas procarióticas, si se desea. Por ejemplo, la remoción de una secuencia líder mitocondrial conduce a expresión incrementada en E. coli (Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)). Para la expresión exógena el levadura u otras células eucarióticas, los genes pueden ser expresados en el citosol sin la adición de secuencia líder, o pueden ser dirigidos al mitocondrión u otros organelos, o dirigidos para secreción, por la adición de una secuencia objetivo adecuada tal como una señal de secreción u objetivo mitocondrial adecuada para las células hospederas. De este modo, se entiende que las modificaciones apropiadas a una secuencia de ácido nucleico para remover o incluir una secuencia objetivo pueden ser incorporadas en una secuencia de ácido nucleico exógena para impartir propiedades deseables. Además, los genes pueden ser sometidos a optimización del codón con técnicas bien conocidas en la técnica para lograr la expresión optimizada de las proteínas.
Un vector de expresión o vectores pueden ser construidos para incluir uno o más ácidos nucleicos que codifican la trayectoria biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrbxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno como se ejemplifica en la presente operablemente ligado a secuencias de control de expresión funcionales en el organismo hospedero. Los vectores de expresión aplicables para uso en los organismos hospederos microbianos de la invención incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores fagos, vectores virales, episomas y cromosomas artificiales, que incluyen vectores y secuencias o marcadores de selección operables para integración estable en un cromosoma hospedero. Adicionalmente, los vectores de expresión pueden incluir uno o más genes marcadores seleccionabas y secuencias de control de expresión apropiadas. Los genes marcadores seleccionabas también pueden ser incluidos que, por ejemplo, proporcionan resistencia a antibióticos o toxinas, deficiencias auxotróficas del complemento, o suministro de nutrientes críticos no en el medio de cultivo. Las secuencias de control de expresión pueden incluir promotores constitutivos e inducibles, intensificadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, y similares los cuales son bien conocidos en la técnica. Cuando dos o más ácidos nucleicos exógenos codificantes están siendo co-expresados, ambos ácidos nucleicos pueden ser insertados, por ejemplo, en un vector de expresión único o en vectores de expresión separados. Por vector de expresión único, los ácidos nucleicos codificantes pueden ser operacionalmente ligados a una secuencia de control de expresión común o ligados a diferentes secuencias de control de expresión, tales como un promotor inducible y un promotor constitutivo. La transformación de secuencias de ácido nucleico exógenas involucradas en una trayectoria metabólica o sintética puede ser confirmada usando métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, análisis de ácido nucleico tales como manchados Northern o amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de mRNA, o inmunomanchado para expresión de productos del gene, u otros métodos analíticos adecuados para probar la expresión de una secuencia de ácido nucleico introducida o su producto de gene correspondiente. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que el ácido nucleico exogeno es expresado en una cantidad suficiente para producir el producto deseado, y se entiende además que los niveles de expresión pueden ser optimizados para obtener suficiente expresión usando métodos bien conocidos en la técnica y como se describe en la presente.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir tolueno que incluye cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de tolueno. La trayectoria de tolueno incluye al menos un ácido nucleico exogeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno expresada en una cantidad suficiente para producir tolueno, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir tolueno. La trayectoria de tolueno se puede seleccionar de (A) 1) una o ambas de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, y 3) fenilacetaldehído descarbonilasa; (B) 1) una o más de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, 3) una o más de fenilacetaldehído deshidrogenasa y fenilacetaldehído oxidasa, y 4) fenilacetato descarboxilasa; y (C) 1) una o más de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato oxidasa, y 3) fenilacetato descarboxilasa, como se indica en las trayectorias alternas mostradas en la Figura 1. En algunas modalidades, el método incluye cultivar el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, métodos de la invención para producir tolueno incluyen cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que incluye dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno, tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno, cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno, cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una trayectoria de tolueno, y así sucesivamente. Organismos ejemplares que tienen cuatro ácidos nucleicos exógenos pueden codificar 1) fenilalanina aminotransferasa, 2) fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 3) fenilpiruvato descarboxilasa, y 4) fenilacetaldehído descarbonilasa. Organismos ejemplares que tienen cinco ácidos nucleicos exógenos pueden codificar 1) fenilalanina aminotransferasa, 2) fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 3) fenilpiruvato descarboxilasa, 4) fenilacetaldehído deshidrogenasa y/u oxidasa, y 5) fenilacetato descarboxilasa. En algunas modalidades, métodos de la invención para producir tolueno puede incluir cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que es un ácido nucleico heterólogo.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir benceno que incluye cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de benceno. La trayectoria de benceno puede incluir al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benceno expresada en una cantidad suficiente para producir benceno, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir benceno. La trayectoria de benceno puede incluir una fenilalanina benceno-liasa, como se muestra en la Figura 2. En algunas modalidades, al menos un ácido nucleico exogeno es la fenilalanina benceno-liasa misma, mientras en modalidades alternas, al menos un ácido nucleico exogeno puede afectar la producción del metabolito precursor de fenilalanina. En algunas modalidades al menos un ácido nucleico exogeno de la trayectoria de benceno es un ácido nucleico heterólogo. En algunas modalidades, métodos de la invención para producir benceno puede incluir cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir estireno que incluye cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de estireno. La trayectoria de estireno puede incluir al menos un ácido nucleico exogeno que codifica una enzima de la trayectoria de estireno expresada en una cantidad suficiente para producir estireno, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir estireno. La trayectoria de estireno se puede seleccionar de (A) 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) una o más de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa, e hidrolasa, 3) benzoil-acetato descarboxilasa, 4) acetofenona reductasa, y 5) 1-feniletanol deshidratase; y (B) 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, 3) benzoil-acetato quinasa, 4) benzoil-acetato descarboxilasa, 5) acetofenona reductasa, y 6) 1-feniletanol deshidratasa, como se indica en las trayectorias alternas en la Figura 3. En algunas modalidades, métodos de la invención para producir estireno puede incluir cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, métodos de la invención para producir estireno incluyen cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que incluye dos ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, tres ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, cuatro ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, cinco ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, seis ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno, y así sucesivamente. Un organismo ejemplar que tiene cinco ácidos nucleicos exogenos pueden codificar 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) uno de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa, e hidrolasa, 3) benzoil-acetato descarboxilasa, 4) acetofenona reductasa, y 5) 1-feniletanol deshidratasa. Un organismo ejemplar que tiene seis ácidos nucleicos exogenos codifica 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, 3) benzoil-acetato quinasa, 4) benzoil-acetato descarboxilasa, 5) acetofenona reductasa, y 6) 1-feniletanol deshidratasa. En algunas modalidades, métodos de la presente invención para producir estireno pueden incluir cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente en el cual al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir 1 ,3-butadieno que incluye cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 1.3- butadieno. La trayectoria de 1 ,3-butadieno incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1 ,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1,3-butadieno. La trayectoria de 1 ,3-butadieno se puede seleccionar de (A) 1) trans, frans-muconato descarboxilasa y 2) rrans-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (B) 1) c/'s, frans-muconato c/'s-descarboxilasa y 2) trans- 2.4- pentadienoato descarboxilasa; (C) 1) c/'s, frans-muconato trans-descarboxilasa 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; y (D) 1) c/'s, c/'s-muconato descarboxilasa y 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa, como se indica por las trayectorias alternas en la Figura 4. En algunas modalidades, e! método para producir 1 ,3-butadieno puede incluir cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, métodos de la invención pueden incluir cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno. Organismos ejemplares que tienen dos ácidos nucleicos exógenos puede incluir genes que codifican una serie de enzimas seleccionadas de (A) 1) trans, frans-muconato descarboxilasa y 2) fra7S-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (B) 1) c/'s, frans-muconato c/s-descarboxilasa y 2) írans-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) 1) c/'s, frans-muconato írans-descarboxilasa 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; y (D) 1) c/'s, c/s-muconato descarboxilasa y 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa. En algunas modalidades, métodos de la invención pueden incluir cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que es un ácido nucleico heterólogo.
La invención adicionalmente proporciona un método para producir (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, que comprende cultivar el organismo microbiano que no se origina naturalmente que contiene una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato. Tal organismo microbiano puede tener una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato expresada en una cantidad suficiente para producir (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, la trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratase (véase Ejemplo III y Figura 5, la etapa C). Una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato puede opcionalmente comprender además 1-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa y/o 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (véase Ejemplo III y Figura 5, etapas A y B).
En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir p-toluato, que comprende cultivar el organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende una trayectoria de p-toluato bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir p-toluato. Una trayectoria de p-toluato puede comprender al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de p-toluato expresada en una cantidad suficiente para producir p-toluato, la trayectoria de p-toluato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y/o corismato Masa (véase Ejemplo IV y Figura 6, etapas A-H). En otra modalidad, un método de la invención puede utilizar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende además una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (véase Ejemplo III y Figura 5). Tal trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato puede comprender 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa, 1-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa y/o 1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (véase Ejemplo III y Figura 5).
La invención además proporciona un método para producir tereftalato, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que contiene una trayectoria de tereftalato bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir tereftalato. Tal trayectoria de tereftalato puede comprender al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tereftalato expresada en una cantidad suficiente para producir tereftalato, la trayectoria de tereftalato comprende p-toluato metil-monooxigenasa reductasa; deshidrogenasa de alcohol 4-carboxibencílico; y/o deshidrogenasa de 4-carboxibencil aldehido. Tal organismo microbiano puede comprender además una trayectoria de p-toluato, en la trayectoria de p-toluato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y/o corismato Masa (véase Ejemplos IV y V y Figuras 6 y 7). En otra modalidad, el organismo microbiano que no se origina naturalmente puede comprender además una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (véase Ejemplo III y Figura 5). En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir tolueno, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de tolueno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno expresada en una cantidad suficiente para producir tolueno. La trayectoria de tolueno se puede seleccionar de una serie de enzimas de las trayectorias seleccionadas de: a) p-toluato descarboxilasa; b) p-toluato reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; c) p-toluato quinasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; d) (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotrans-p-metilbenzoilasa, (p- metilbenzo¡loxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; y e) (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), p-metilbenzoil-CoA reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa. El organismo microbiano que no se origina naturalmente puede ser cultivado bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir tolueno. En una modalidad particular, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente y métodos de uso, en los cuales el organismo microbiano contiene las trayectorias de p-toluato, tereftalato o tolueno, y (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir (2-hidroxi-4-oxobutoxi) fosfonato, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato expresada en una cantidad suficiente para producir (2-hidroxi-4-oxobutoxi) fosfonato. La trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato puede incluir eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir benzoato, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de benzoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benzoato expresada en una cantidad suficiente para producir benzoato. La trayectoria de benzoato incluye 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato Nasa. El método incluye cultivar el organismo que no se origina naturalmente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir benzoato.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir benceno, que comprende cultivar el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de benceno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benceno expresada en una cantidad suficiente para producir benceno. La trayectoria de benceno se selecciona de una serie de enzimas de las trayectorias seleccionadas de: a) benzoato descarboxilasa; b) benzoato reductasa y benzaldehído descarbonilasa; c) benzoato quinasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa; d) (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotransbenzoilasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa; y e) (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), benzoil-CoA reductasa y benzaldehído descarbonilasa. El organismo microbiano que no se origina naturalmente puede ser cultivado bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir benceno. En una modalidad particular, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente y métodos de uso, en los cuales el organismo microbiano contiene trayectorias de (2- hidroxi-4-oxobutoxi) fosfonato, benzoato, y benceno.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir 2,4-pentadienoato que incluye cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato. La trayectoria incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato seleccionadas de A) i) una 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, ii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iii) una 2-oxopentenoato reductasa, y iv) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa; B) i) una desaminasa AKP, ii) una acetilacrilato reductasa, y iii) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; C) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-2-reductasa, iii) una 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratasa, iv) una acetilacrilato reductasa, y v) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; D) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-4-reductasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa; y E) i) una AKP reductasa, ii) una 2-am¡no-4-hidroxipentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
En algunas modalidades, los métodos de la invención utilizan un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de (A) 1) 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, 2) 4-hidroxi-2-oxovalerato reductasa, 3) 2,4-dihidroxipentanoato 2-deshidratasa, y 4) 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas A, E, F, y G de la Figura 12 y (B) 1) 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, 2) 4-hidroxi-2-oxovalerato reductasa, 3) 2,4-dihidroxipentanoato 4-deshidratasa y 4) 2-hidroxipentenoato deshidratasa, como se muestra en las etapas A, E, H, y D de la Figura 12.
En algunas modalidades, los presentes métodos de la invención utilizan un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de (A) 1) AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 2) 2,4-dioxopentanoato 2-reductasa, 3) 2-hidroxi-4-oxopentanoato reductasa, 4) 2,4-dihidroxipentanoato 2-deshidratasa, y 5) 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas E, H, I, G, y D de la Figura 13, y (B) 1) AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 2) 2,4-dioxopentanoato 2-reductasa, 3) 2-hidroxi-4-oxopentanoato reductasa, junto con 4) 2,4-d¡h¡drox¡pentanoato-2-deshidratasa y 5) 4-hidroxipent-2-enoato deshidratase o 4) 2,4-dihidroxipentanoato-4-deshidratasa y 5) 2-hidroxipentenoato deshidratasa, como se muestra en las etapas E, H, y I de la Figura 13, junto con las etapas F y G o H y D de la Figura 12, respectivamente. Es decir, la deshidratación doble de 2,4-dihidroxipentanoato se puede realizar en cualquier orden.
En algunas modalidades, los métodos de la invención utilizan un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de AKP que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima de AKP expresada en una cantidad suficiente para producir AKP. La trayectoria de AKP incluye una ornitina 4,5-aminomutasa y una 2,4-diaminopentanoato 4-aminotransferasa y/o 4-deshidrogenasa, como se muestra en las etapas M y N de la Figura 13. En algunas modalidades, el organismo microbiano que tiene una trayectoria de AKP incluye dos enzimas exógenas que codifican una ornitina 4,5-aminomutasa y una 2,4-diaminopentanoato 4-aminotransferasa o 2,4-diaminopentanoato 4-deshidrogenasa. En algunas modalidades, esta trayectoria de AKP se puede agregar a cualquiera de las trayectorias de 2,4-pentadienoato mencionadas anteriormente y como se indica en la Figura 13. Alternativamente, AKP puede ser accesada de alanina por adición de una AKP tiolasa, como se muestra en la etapa A de la Figura 13, y alimentar en las varias trayectorias de 2,4-pentadienoato descritas en la presente y mostradas en la Figura 13, junto con Figura 12.
En algunas modalidades, los métodos de la invención utilizan un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de (A) 1) ornitina 2,3-aminomutasa, 2) 3,5-diaminopentanoato desaminasa, y 3) 5-aminopent-2-enoato desaminasa, como se muestra en las etapas A-C de la Figura 14, (B) 1) ornitina 2,3-aminomutasa, 2) 3,5-diaminopentanoato desaminasa, 3) 5-aminopent-2-enoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 4) 5-oxopent-2-enoato reductasa, y 5) 5-hidroxipent-2-enóato deshidratasa, como se muestra en las etapas A, B, H, F, y G de la Figura 14, (C) 1) ornitina 2,3-aminomutasa, 2) 3,5-diaminopentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 3) 3-amino-5-oxopentanoato desaminasa, 4) 5-oxopent-2-enoato reductasa, y 5) 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa como se muestra en las etapas A, D, E, F, y G de la Figura 14, y (D) 1) ornitina 2,3-aminomutasa, 2) 3,5-diaminopentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, 3) 3-amino-5-oxopentanoato reductasa, y 4) 3-amino-5-hidroxipentanoato desaminasa, y 5) 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa como se muestra en las etapas A, D, I, J, y G de la Figura 14.
En algunas modalidades, los métodos de la invención utilizan un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4- pentadienoato. La trayectoria de 2,4-pentadienoato tiene una serie de enzimas seleccionadas de cualquiera de las numerosas trayectorias mostradas en la Figura 15 partiendo de 3-HP-CoA o acriloil-CoA.
Trayectorias ejemplares de 3-HP incluyen las siguientes series de enzimas (A) 1) 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, 2) 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, 3) 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, 4) 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, y 5) pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, como se muestra en las etapas A-E de la Figura 15, y (B) 1) 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, 2) 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, 3) 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, 4) 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, y 5 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas A, F, I, J, y Q de la Figura 15. Un experto en la técnica reconocerá que las series de enzimas que definen las trayectorias (A) y (B) de 3-HP-CoA pueden ser mezcladas vía enzimas reversibles 3,5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, como se muestra en la etapa G en la Figura 15, y 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, como se muestra en la etapa H en la Figura 15. De este modo, una trayectoria de 3-HP-CoA a 2,4-pentadienoato puede incluir las enzimas en las etapas A, B, G, J, y Q, o etapas A, B, C, H, y Q, o etapas A, B, G, J, H, D, y E, o etapas A, F, I, G, C, D, y E, o etapas, A, F, I, G, C, H, y Q, o etapas A, F, I, J, H, D, y E, cada una mostrada en la Figura 15.
Trayectorias ejemplares de acriloil-CoA incluyen las siguientes series de enzimas (C) 1) acriloil-CoA acetiltransferasa, 2) 3- oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, 3) 3-oxopent-4-enoato reductasa, 4) 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa, como se muestra en las etapas M, O, P, y S en la Figura 15 y (D), 1) acriloil-CoA acetiltransferasa, 2) 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, 3) 3-hidroxipent-4-enoil-CoA deshidratasa, y 4) pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, como se muestra en las etapas M, N, R, y E. Un experto en la técnica reconocerá que las series de enzimas que definen las trayectorias (A) y (B) de 3-HP-CoA y (C) y (D) de acriloil-CoA pueden ser mezcladas vía enzimas reversibles 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, como se muestra en la etapa K de la Figura 15, y 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, como se muestra en la etapa L de la Figura 15. De este modo, la etapa K se puede agregar a cualquiera de las trayectorias enumeradas a partir de acriloil-CoA a 2,4-pentadienoato proporcionando trayectorias de 2,4-pentadienoato tales como etapas K, M, N, R, y E o etapas K, M, O, P, y S. La etapa K también puede ser usada como una alternativa de conexión a la etapa A para proporcionar 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA de 3-HP-CoA vía etapas K, M, y L. De este modo, cualquiera de las trayectorias mencionadas anteriormente que utiliza la enzima de la etapa A puede utilizar las enzimas de las etapas K, M, y L, en su lugar. El mismo intermediario 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA puede ser accesado de acriloil-CoA por trayectorias vía las enzimas de las etapas K y A o M y L de la Figura 15. De este modo, acriloil-CoA se puede usar para acceder a todas las trayectorias enumeradas que podrían ser accesibles de 3-HP-CoA. De este modo, por ejemplo, una trayectoria de acriloil-CoA a 2,4- pentadienoato puede incluir enzimas de las etapas K, A, B, C, D, y E, o etapas K, A, F, I, J y Q, o etapas K, A, B, G, J, y Q, o etapas K, A, B, G, J, H, D, y E, o etapas K, A, B, C, H, y Q, o etapas K, A, F, I, G, C, D, y E, o etapas K, A, F, I, G, C, H, Q, o etapas , A, F, I, J, H, D y E, o etapas M, L, B, C, D, y E, o etapas M, L, F, I, J y Q, o etapas M, L, B, G, J, y Q, o etapas M, L, B, G, J, H, D, y E, o etapas M, L, B, C, H, y Q, o etapas M, L, F, I, G, C, D, y E, o etapas M, L, F, I, G, C, H, Q, o etapas M, L, F, I, J, H, D y E, todas como se muestran en la Figura 15. De manera similar, 3-HP-CoA puede alimentarse en las trayectorias de acriloil-CoA enumeradas vía el intermediario 3-oxopent-4-enoil-CoA usando la enzima de la etapa L. De este modo, una trayectoria de 3-HP-CoA a 2,4-pentadienoato puede incluir enzimas de las etapas A, L, N, R, y E o etapas A, L, O, P, y S, cada trayectoria es mostrada en la Figura 15.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente usado en métodos de la invención puede incluir dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede incluir tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. Por ejemplo, el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede incluir tres ácidos nucleicos exógenos que codifican i) una desaminasa AKP, ii) una acetilacrilato reductasa, y iii) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratase, de este modo proporcionando una trayectoria accesable de alanina u omitiría a 2,4-pentadienoato vía AKP. Un experto en la técnica reconocerá que esto es solamente ejemplar y que tres ácidos nucleicos exógenos pueden ser la base de cualquier organismo que no se origina naturalmente que produce 2,4-pentadienoato en cualquiera de las trayectorias enumeradas de la Figura 12-15.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente usado en métodos de la invención microbiana puede incluir cualesquiera cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. Por ejemplo, un organismo microbiano que no se origina naturalmente puede incluir cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican i) una 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, ii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iii) una 2-oxopentenoato reductasa, y iv) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa, de este modo definiendo una trayectoria completa de piruvato a 2,4-pentadienoato, como se muestra en la Figura 12. Un experto en la técnica reconocerá que esto es solamente ejemplar y que cuatro ácidos nucleicos exógenos pueden ser la base de cualquier organismo que no se origina naturalmente que produce 2,4-pentadienoato en cualquiera de las trayectorias enumeradas de la Figura 12-15.
En todavía modalidades adicionales, el organismo microbiano que no se origina naturalmente usado en métodos de la invención puede incluir cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención ejemplar que tiene cinco ácidos nucleicos exógenos puede incluir enzimas que codifican (A) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenase, ii) una 2,4-dioxopentanoato-2-reductasa, iii) una 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratase, iv) una acetilacrilato reductasa, y v) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratase, como se muestra en las etapas E, H, F, C, y D en la Figura 13, o (B) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenase, ii) una 2,4-dioxopentanoato-4-reductasa, ¡ii) una 4-hidroxi-2-oxovalereto deshidratase, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratase, como se muestra en las etapas E y K de le Figure 13, junto con las etapas B, C, y D de la Figura 12, o i) una AKP reductasa, ii) una 2-amino-4-hidroxipentanoeto eminotransferasa y/o deshidrogenase, iii) une 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidrátese, como se muestra en las etapes J y L de la Figure 13, junto con les etepes B, C, y D de le Figure 12. Un experto en la técnica reconocerá que esto es solamente ejemplar y que cinco ácidos nucleicos exógenos pueden ser la base de cualquier organismo que no se origina naturalmente que produce 2,4-pentedienoeto en cuelquiere de les treyectories enumeredes de la Figura 12-15. De este modo, en elgunes modelidedes dos, tres, cuatro, cinco, seis, hasta todas las enzimes en une treyectoria de 2,4-pentedienoeto pueden ser inserción proporcionede de ácidos nucleicos exógenos. En elgunas modalidades, el organismo microbieno que no se origine neturelmente de le invención que tiene al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. Sin embargo, en algunas modalidades, los métodos que emplean el organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención pueden utilizar un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente usado en métodos de la invención puede además incluir una 2,4-pentadienoato descarboxilasa expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno por conversión de 2,4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno. De este modo, cualquiera de las trayectorias de 2,4-pentadienoato de la Figura 12 puede formar las bases de producción adicional de 1,3 butadieno, como se indica por la conversión de cis o trans 2,4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno en la Figura 4.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir 2,4-pentadienoato, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con las trayectorias mencionadas anteriormente descritas en la presente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato. En algunas de tales modalidades, el organismo microbiano incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. En algunas de tales modalidades, al menos un ácido nucleico exógeno Es un ácido nucleico heterólogo. En algunas de tales modalidades el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir 1 ,3-butadieno que incluye cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con las trayectorias mencionadas anteriormente descritas en la presente, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1,3-butadieno. En algunas de tales modalidades, el organismo microbiano incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1,3-butadieno. En algunas de tales modalidades, al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. En algunas de tales modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir 3-buteno-1 -ol la cual incluye cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la trayectoria mencionada anteriormente descrita en la presente, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 3-buteno-1-ol. En algunas de tales modalidades, el organismo microbiano incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1 -ol. En algunas de tales modalidades, al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. En algunas de tales modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico. En algunas de tales modalidades, métodos de la invención además incluyen la deshidratación química de 3-buteno-1-ol para proporcionar 1,3- butadieno. 3-buteno-1-ol puede ser químicamente deshidratado con formación de 1 ,3-butadieno, partiendo con 3-buteno-1 -ol aislado puro de la solución de fermentación o partiendo con soluciones acuosas u orgánicas de 3-buteno-1-ol, aislado en desarrollo de la solución de fermentación. Tales soluciones de 3-buteno-1 -ol también pueden ser concentradas antes de la etapa de deshidratación, por ejemplo por medio de destilación, opcionalmente en la presencia de un entrenador adecuado.
La reacción de deshidratación se puede llevar a cabo en fase líquida o en la fase gaseosa. La reacción de deshidratación se puede llevar a cabo en la presencia de un catalizador, la naturaleza del catalizador empleado dependiendo de si se lleva a cabo una reacción de fase gaseosa o fase liquida.
Catalizadores de deshidratación adecuados incluyen tanto catalizadores ácidos como catalizadores alcalinos. Os catalizadores ácidos, en particular pueden exhibir una tendencia reducida para formar oligómeros. El catalizador de deshidratación puede ser empleado como un catalizador homogéneo, un catalizador heterogéneo, o combinaciones de los mismos. Catalizadores heterogéneos pueden ser usados en conjunto con un material de soporte adecuado. Tal soporte puede el mismo ser ácido o alcalino y proporcionar el catalizador de deshidratación ácido o alcalino, o un catalizador puede ser aplicado a un soporte inerte.
Soportes adecuados los cuales sirven como catalizadores de deshidratación incluyen silicatos naturales o sintéticos tales como modernita, montmorillonita, zeolitas ácidas; soportes los cuales son recubiertos con ácidos inorgánicos monobásicos, dibásicos o polibásicos, tales como ácido fosfórico, o con sales ácidas de ácidos inorgánicos, tales como óxidos o silicatos, por ejemplo Al203, Ti02; óxidos y mezclas de óxidos tales como óxidos mezclados de ?-??203 y ZnO— Al203 de heteropoliácidos. Las sustancias alcalinas las cuales actúan tanto como catalizador de deshidratación como un soporte para material de soporte incluyen álcalis, alcalinotérreas, latano, lantoides, o combinaciones de los mismos como sus óxidos. Una clase adicional de materiales puede afectar la deshidratación son intercambiadores de iones los cuales pueden ser usados en ya sea forma alcalina o ácida.
Catalizadores de deshidratación homogéneos adecuados incluyen ácidos inorgánicos, tales como ácidos que contienen fósforo tales como ácido fosfórico. Ácidos inorgánicos pueden ser inmovilizados en el material de soporte por inmersión o impregnación.
En algunas modalidades, la reacción de deshidratación se lleva a cabo en la fase gaseosa usando aparatos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo reactores tubulares, intercambiadores de calor de cubierta y tubo y reactores los cuales comprenden termoplacas como intercambiadores de calor. En algunas modalidades, la deshidratación de fase gaseosa puede utilizar 3-buteno-1-ol aislado o soluciones de buteno-1-ol, el buteno-1-ol se introduce en un reactor con catalizadores de lecho fijo. La deshidratación térmica en la fase líquida se puede llevar a cabo en un intervalo de temperatura de entre 200 °C y 350 °C, y en algunas modalidades entre 250 y 300° C.
La purificación adecuada y/o ensayos para probar la producción de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno pueden ser realizados usando métodos bien conocidos. Réplicas adecuadas tales como cultivos triplicados se pueden hacer crecer para cada cepa diseñada por ingeniería a ser probada. Por ejemplo, se puede monitorear el producto y formación de derivado en el hospedero de producción diseñado por ingeniería. El producto final e intermediarios, y otros compuestos orgánicos, puede ser analizado por métodos tales como HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución), GC-MS (Cromatografía de Gas-Espectroscopia de Masas) y LC-MS (Cromatografía Liquida-Espectroscopia de Masas) o u otros métodos analíticos adecuados usando procedimientos de rutina bien conocidos en la técnica. La liberación del producto en el caldo de fermentación también puede ser probada con el sobrenadante del cultivo. Los derivados y glucosa residual pueden ser cuantificados por HPLC usando, por ejemplo, un detector de índice refractivo para glucosa y alcoholes, y un detector UV para ácidos orgánicos (Lin ef al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)), u otro ensayo adecuado y métodos de detección bien conocidos en la técnica. Las actividades individuales de la enzima o proteína de las secuencias de DNA exógenas también pueden ser ensayadas usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de fenilpiruvato descarboxilasa puede ser medida usando un ensayo fotométrico acoplado con alcohol deshidrogenasa como una enzima auxiliar como se describe por Weiss ef al. (Weiss ef al., Biochem, 27:2197-2205 (1988). Enzimas NADH- y dependientes de NADPH tales como acetofenona reductasa pueden ser seguidas espectrofotométricamente a 340 nm como se describe por Schiieben et al. (Schiieben et al., J. Mol. Biol.. 349:801-813 (2005)). Para métodos de ensayo de hidrocarburo típicos, véase Manual on Hydrocarbon Analysis (ASTM Manula Series, A.W. Drews, ed., 6th edition, 1998, American Society for Testing and Materials, Baltimore, Mariland. La actividad de p-toluato metil-monooxigenasa puede ser sometida a ensayo incubando la enzima purificada con NADH, FeS04 y el sustrato de p-toluato en un baño maría, deteniendo la reacción por precipitación de las proteínas, y análisis de los productos en el sobrenadante por HPLC (Locher ef al., J. Bacteriol. 173:3741-3748 (1991)).
El tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-met¡l-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadíenoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadíeno puede ser separado de otros componentes en el cultivo usando una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos de separación incluyen, por ejemplo, procedimientos de extracción así como también métodos que incluyen extracción continua líquido-líquido, pervaporación, filtración de membrana, separación de membrana, osmosis inversa, electrodiálisis, destilación, cristalización, centrifugación, filtración extractiva, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de adsorción y ultrafiltración. Todos los métodos anteriores son bien conocidos en la técnica.
Cualesquiera de los organismos microbianos que no se originan naturalmente descritos en la presente pueden ser cultivados para producir y/o secretar los productos biosintéticos de la invención. Por ejemplo, los productores de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno pueden ser cultivados para la producción biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
Para la producción de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, las cepas recombinantes son cultivadas en un medio con fuente de carbono y otros nutrientes esenciales. Es algunas veces deseable y puede ser altamente deseable mantener condiciones anaerobicas en el termentador para reducir el costo de los procesos totales. Tales condiciones pueden ser obtenidas, por ejemplo, dispersando primero el medio con nitrógeno y después sellar los matraces con un septo y tapa engarzada. Para cepas donde el crecimiento no se observa anaeróbicamente, las condiciones microaeróbicas o sustancialmente anaerobicas pueden ser aplicadas perforando el septo con un pequeño agujero para aireación limitada. Condiciones anaerobicas ejemplares han sido descritas previamente y son bien conocidas en la técnica. Condiciones aeróbicas y anaeróbicas ejemplares son descritas, por ejemplo, en la publicación Estadounidense 2009/0047719, presentada el 10 de Agosto de 2007. Las fermentaciones pueden ser realizadas en una manera por lotes, alimentación de lote o continua, como se describe en la presente.
Si se desea, el pH del medio puede ser mantenido a un pH deseado, en particular pH neutral, tal como un pH de aproximadamente 7 por adición de una base, tal como NaOH u otras bases, o ácido, como sea necesario para mantener el medio de cultivo a un pH deseable. La tasa de crecimiento puede ser determinada midiendo la densidad óptica usando un espectrofotómetro (600 nm), y el índice de absorción de glucosa monitoreando la depleción de la fuente de carbono con el tiempo.
El medio de crecimiento puede incluir, por ejemplo, cualesquiera fuentes de carbohidratos las cuales pueden suministrar una fuente de carbono al microorganismo que no se origina naturalmente. Tales fuentes incluyen, por ejemplo, azúcares tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, fructuosa, sacarosa y almidón. Otras fuentes de carbohidratos incluyen, por ejemplo, materias primas renovables y biomasa. Tipos ejemplares de biomasas que se pueden usar como materias primas en los métodos de la invención incluyen biomasa celulósica, biomasa hemicelulósica y materias primas de lignina o porciones de materias primas. Tales materias primas de biomasa contienen, por ejemplo, sustratos de carbohidratos útiles como fuentes de carbono tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, fructuosa y almidón. Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos expertos en la técnica entenderán que las materias primas renovables y biomasas distintas de aquellas ejemplificadas anteriormente también pueden ser usadas para cultivar los organismos microbianos de la invención para la producción de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
Además de materias primas renovables tales como aquellas ejemplificadas anteriormente, los organismos microbianos de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3- buten-1-ol o 1 ,3-butadieno de la invención también pueden ser modificados para crecimiento en syngas como su fuente de carbono. En esta modalidad específica, una o más proteínas o enzimas son expresadas en los organismos que producen el tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutox¡)fosfonato, (2-hidroxi- 4- oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno para proporcionar una trayectoria metabólica para utilización de syngas u otra fuente de carbono gaseoso.
El gas de síntesis, también conocido como syngas o gas productor, es el principal producto de gasificación del carbón vegetal y de materiales carbonáceos tales como materiales de biomasa, que incluyen residuos y cultivos agrícolas. El syngas es una mezcla principalmente de H2 y CO y puede ser obtenida de la gasificación de cualesquiera materia prima orgánica, que incluye pero no se limita a carbón vegetal, aceite de carbón vegetal, gas natural, biomasa y materia orgánica de desecho. La gasificación es en general llevada a cabo bajo una alta relación de combustible a oxígeno. Aunque en gran parte H2 y CO, el syngas también puede incluir C02 y otros gases en cantidades inferiores. De este modo, el gas de síntesis proporciona una fuente efectiva en costo de carbón gaseoso tal como CO y, adicionalmente, C02.
La trayectoria de Wood-LjungdahI cataliza la conversión de CO y H2 a acetil-CoA y otros productos tales como acetato. Organismos capaces de utilizar CO y syngas también en general tienen la capacidad de utilizar C02 y mezclas de C02/H2 a través de la misma serie básica de enzimas y transformaciones abarcadas por la trayectoria Wood-LjungdahI. La conversión dependiente de H2 de C02 a acetato por microorganismos se reconoció ampliamente antes de que se revelara que el CO también podría ser usado por los mismos organismos y que las mismas trayectorias fueron involucradas. Muchos acetógenos han sido mostrados por crecer en la presencia de C02 y producir compuestos tales como acetato tan pronto como el hidrógeno esté presente para suministrar los equivalentes de reducción necesarios (véase, por ejemplo, Drake, Acetoqenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994)). Esto puede ser resumido por la siguiente ecuación: 2 C02 + 4 H2 + n ADP + n Pi ? CH3COOH + 2 H20 + n ATP Por lo tanto, microorganismos que no se originan naturalmente que poseen la trayectoria Wood-LjungdahI pueden utilizar mezclas de C02 y H2 también para la producción de acetil-CoA y otros productos deseados.
La trayectoria Wood-Ljungdahl es bien conocida en la técnica y consiste de 12 reacciones las cuales pueden ser separadas en dos ramificaciones: (1) ramificación de metilo y (2) ramificación de carbonilo. La ramificación de metilo convierte el syngas a metil-tetrahidrofolato (metil-THF) mientras la ramificación de carbonilo convierte metil-THF a acetil-CoA. Las reacciones en la ramificación de metilo son catalizadas en orden por las siguientes enzimas o proteínas: ferredoxina oxidorreductasa, formiato deshidrogenase, formiltetrahidrofolato sintetasa, meteniltetrahidrofolato ciclodeshidratasa, metilenotetrahidrofolato deshidrogenasa y metilenotetrahidrofolato reductasa. Las reacciones en la ramificación de carbonilo son catalizadas en orden por las siguientes enzimas o proteínas: metiltetrahidrofolato:metiltransferasa de proteína corrinoide (por ejemplo, AcsE), proteína de hierro-azufre corrinoide, proteína de ensamble de proteína de níquel (por ejemplo, AcsF), ferredoxina, acetil-CoA sintasa, deshidrogenasa de monóxido de carbono y proteína de montaje de proteína de níquel (por ejemplo, CooC). Siguiendo las enseñanzas y guía proporcionada en la presente para introducir un número suficiente de ácidos nucleicos codificantes para generar una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, aquellos expertos en la técnica entenderán que el mismo diseño de ingeniería también puede ser realizado con respecto a introducir al menos los ácidos nucleicos que codifican las enzimas o proteínas Wood-Ljungdahl ausentes en el organismo hospedero. Por lo tanto, la introducción de uno o más ácidos nucleicos codificantes en los organismos microbianos de la invención de manera que el organismo modificado contiene la trayectoria completa Wood-Ljungdahl conferirá capacidad de utilización de syngas.
Adicionalmente, el ciclo de ácido tricarboxílico reductivo (reverso) acoplado con actividades de deshidrogenasa de monóxido de carbono y/o hidrogenasa también puede ser usado para la conversión de CO, C02 y/o H2 a acetil-CoA y otros productos tales como acetato. Organismos capaces de fijar carbono vía la trayectoria reductora de TCA pueden utilizar una o más de las siguientes enzimas: ATP citrato-liasa, citrato Masa, aconitasa, isocitrato deshidrogenasa, alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa, succinil-CoA sintetasa, succinil-CoA transferasa, fumarato reductasa, fumarasa, malato deshidrogenasa, NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, deshidrogenasa de monóxido de carbono, e hidrogenasa. Específicamente, los equivalentes reductores extraídos de CO y/o H2 por deshidrogenasa de monóxido de carbono e hidrogenasa son utilizados para fijar C02 vía el ciclo reductivo de TCA en acetil-CoA o acetato. El acetato puede ser convertido a acetil-CoA por enzimas tales como acetil-CoA transferasa, acetato quinasa/fosfotransacetilasa, y acetil-CoA sintetasa. El Acetil-CoA puede ser convertido a los precursores de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi- 4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, gliceralde ído-3-fosfato, fosfoenolpiruvato, y piruvato, por piruvato:ferredoxina oxidorreductasa y las enzimas de gluconeogénesis. Siguiendo las enseñanzas y guía proporcionada en la presente para introducir un número suficiente de ácidos nucleicos codificantes para generar una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, aquellos expertos en la técnica entenderán que el mismo diseño de ingeniería también puede ser realizado con respecto a introducir al menos los ácidos nucleicos que codifican las enzimas o proteínas de la trayectoria reductora de TCA ausentes en el organismo hospedero. Por lo tanto, la introducción de uno o más ácidos nucleicos codificantes en los organismos microbianos de la invención de manera que el organismo modificado contiene la trayectoria reductora completa de TCA conferirá capacidad de utilización de syngas.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1 ,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno, dicha trayectoria de 1,3-butadieno seleccionada de: (A) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (B) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (D) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (E) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (F) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3- hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (G) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; y (H) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa.
En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno. Por ejemplo, el organismo microbiano puede comprender ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (B) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; una 3-hidroxipent-4- enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (D) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (E) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (F) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (G) una succinil-CoA.acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; y (H) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratase; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente, en donde dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato Nasa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (iii) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos de la invención, el organismo microbiano que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos de la invención, el organismo microbiano que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente, en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato Masa, citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenase; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
En algunos aspectos, la invención proporciona tal organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe en la presente, en donde al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterologo. En otro aspecto, el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir 1 ,3-butadieno, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe en la presente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1 ,3-butadieno.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato, dicha trayectoria de 2,4-pentadienoato seleccionada de: (A) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; (B) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; (C) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-h¡droxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enod¡oato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratase; y (D) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa.
En algunos aspectos, el organismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, o seis ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. Por ejemplo, el organismo microbiano puede comprender ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; (B) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; (C) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y (D) una succin¡l-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenase; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente, en donde dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (iii) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato Masa, citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (Mi) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
En algunos aspectos, la invención proporciona tal organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente, en donde al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir 2,4-pentadienoato, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe en la presente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1 ,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno, dicha trayectoria de 1,3-butadieno seleccionada de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dlhidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutar¡l-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (F) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (G) una malonil-CoA.acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (H) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-h id roxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (I) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (J) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (K) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (L) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (M) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (N) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratase; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; y (O) una malonil-CoA.acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente, en donde dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno. Por ejemplo, en algunos aspectos, el organismo microbiano comprende ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidrox¡-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5- dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidrox¡-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidrox¡-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (F) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (G) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (H) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (I) una malonil- CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (J) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (K) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (L) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (M) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (N) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5- hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; y (O) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente, en donde dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (i¡) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (Mi) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenase, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato Masa, citrato liasa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenase; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe en la presente incluye, en donde al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir 1 ,3-butadieno, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe en la presente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1 ,3-butadieno.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato, dicha trayectoria de 2,4-pentadienoato seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratase; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente comprende dos, tres, cuatro, cinco o seis ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato. Por ejemplo, el organismo microbiano comprende ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxig lutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente, en donde dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato liasa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (iii) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato.ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende (¡i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
En algunos aspectos, el organismo microbiano como se describe anteriormente que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato liasa, citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe en la presente incluye, en donde al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir 2,4-pentadienoato, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 3-buteno-1 -ol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1 -ol expresada en una cantidad suficiente para producir 3-buteno-1 -ol, dicha trayectoria de 3-buteno-1 -ol seleccionada de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3- oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratase; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidrox¡-3-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (E) una malonil-CoA:acet¡l-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (F) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-h idroxi-5-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (G) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (H) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (I) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y (J) una malon¡l-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa.
En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente comprende dos, tres, cuatro o cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1 -ol. Por ejemplo, en algunos aspectos, el organismo microbiano comprende ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (F) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (G) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (H) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (I) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y (J) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa.
En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente, en donde dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (iii) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato liasa, citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe en la presente incluye, en donde al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. En algunos aspectos, el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir 3-buteno-1-ol, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente como se describe anteriormente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 3-buteno-1 -ol.
En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir 1 ,3-butadieno que comprende, cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que puede producir 3-buteno-1-ol como se describe anteriormente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 3-buteno-1-ol, y convertir químicamente tal 3-buteno-1-ol a 1 ,3-butadieno. Se entiende que métodos para convertir químicamente 3-buteno-1-ol a 1 ,3-butadieno son bien conocidos en la técnica.
Esta invención también se dirige, en parte a trayectorias biosintéticas diseñadas por ingeniería para mejorar el flujo de carbono a través de un intermediario del metabolismo central en ruta a 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -ol, o 1 ,3-butadieno. La presente invención proporciona organismos microbianos que no se originan naturalmente que tienen uno o más genes exógenos que codifican enzimas que pueden catalizar varias transformaciones enzimáticas en ruta a 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -ol, o 1 ,3-butadieno. En algunas modalidades, estas transformaciones enzimáticas son parte del ciclo del ácido tricarboxílico reductivo (RTCA) y son usadas para mejorar los rendimientos del producto, que incluyen pero no se limitan a, materias primas de carbono a base de carbohidratos.
En numerosas trayectorias diseñadas por ingeniería, la realización de rendimientos máximos de productos con base en la materia prima de carbohidratos es obstruida por equivalentes de reducción insuficientes o por pérdidas de equivalentes de reducción y/o carbono a derivados. De conformidad con algunas modalidades, la presente invención incrementa los rendimientos de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno mediante (i) mejoramiento de la fijación de carbono vía el ciclo reductivo de TCA, y/o (ii) accesando a equivalentes de reducción adicionales de fuentes de carbono gaseosas y/o componentes de syngas tales como CO, C02, y/o H2. Además del syngas, otras fuentes de tales gases incluyen, pero no se limitan a, la atmósfera, ya sea como se encuentra en la naturaleza o generada.
El ciclo de ácido tricarboxílico reductivo de fijación de C02 (RTCA) es una trayectoria anabólica endergénica de asimilación de C02 la cual usa equivalentes de reducción y ATP (Figura 22). Un cambio del ciclo de RTCA asimila dos moles de C02 en una mole de acetil-CoA, o cuatro moles de C02 en una mole de oxaloacetato. Esta disponibilidad adicional de acetil-CoA mejora el rendimiento teórico máximo de las moléculas del producto derivadas de materias primas de carbono a base de carbohidratos. Los carbohidratos ejemplares incluyen pero no se limitan a glucosa, sacarosa, xilosa, arabinosa y glicerol.
En algunas modalidades, el ciclo de TCA reductivo, acoplado con deshidrogenasa de monóxido de carbono y/o enzimas hidrogenasas, puede ser empleado para permitir la utilización de syngas, C02, CO, H2, y/o otras fuentes de carbono gaseoso por microorganismos. El gas de síntesis (syngas), en particular es una mezcla de principalmente H2 y CO, algunas veces incluyendo algunas cantidades de C02, que puede ser obtenidas vía gasificación de cualquiera de las materias primas orgánicas, tales como carbón vegetal, aceite de carbón vegetal, gas natural, biomasa o materia orgánica residual. Numerosos procesos de gasificación han sido desarrollados, y la mayoría de los diseños se basan en oxidación parcial, donde la limitación de oxígeno evita la completa combustión de materiales orgánicos a altas temperaturas (500-1500°C) para proporcionar syngas como una mezcla 0.5:1-3:1 de H2/CO. Además del carbón vegetal, la biomasa de muchos tipos se ha usado para la producción de syngas y representa una materia flexible y de bajo costo para la producción biológica de químicos y combustibles renovables. El dióxido de carbono puede ser proporcionado de la atmósfera o en forma condensada, por ejemplo, de un cilindro de tanque, o vía sublimación de C02 sólido. De manera similar, CO y el gas de hidrógeno pueden ser proporcionados en forma de reactivo y/o mezclados en cualquier relación deseada. Otras formas de carbono gaseoso pueden incluir, por ejemplo, metanol o solventes orgánicos volátiles similares.
Los componentes de gas de síntesis y/o otras fuentes de carbono pueden proporcionar suficiente C02, equivalentes de reducción y ATP para que opere el ciclo de TCA reductivo. Un cambio del ciclo de RTCA asimila dos moles de C02 en una mole de acetil-CoA y requiere 2 ATP y 4 equivalente de reducción. El CO y/o H2 pueden proporcionar equivalentes de reducción por medio de deshidrogenasa de monóxido de carbono e enzimas hidrogenases, respectivamente. Los equivalentes de reducción pueden venir en la forma de NADH, NADPH, FADH, quinonas reducidas, ferredoxinas reducidas, flavodoxinas reducidas y tiorredoxinas. Los equivalentes de reducción, particularmente NADH, NADPH, y ferredoxina reducida, pueden servir como cofactores para las enzimas del ciclo RTCA, por ejemplo, malato deshidrogenasa, fumarato reductasa, alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa (alternativamente conocidas como 2-oxoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa, alfa-cetoglutarato sintasa, o 2-oxoglutarato sintasa), piruvato:ferredoxina oxidorreductasa e isocitrato deshidrogenase. Los electrones de estos equivalentes de reducción pueden alternativamente pasar a través de una cadena de transporte de electrón produciendo un gradiente de ión donde son pasados a un aceptor tal como oxígeno, nitrato, iones de metal oxidado, protones, o un electrodo. El gradiente de ión puede entonces ser usado para generación de ATP vía una ATP sintasa o enzima similar.
El ciclo de TCA reductivo fue primero reportado en la bacteria fotosintética de azufre verde Chlorobium limicola (Evans et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 55:928-934 (1966)). Trayectorias similares han sido caracterizadas en algunos procariotas (proteobacteria, bacteria de azufre verde y bacteria termofílica Knallgas) y archaea dependiente del azufre (Hugler et al., J. Bacteriol. 187:3020-3027 (2005; Hugler et al., Environ. Microbiol. 9:81-92 (2007). En algunos casos, los ciclos TCA reductivos y oxidativos (Krebs) están presentes en el mismo organismo (Hugler et al., supra (2007); Siebers et al., J. Bacteriol. 186:2179-2194 (2004)). Algunos anaerobios obligados y metanógenos poseen ciclos de TCA oxidativos o reductivos incompletos que pueden funcionar para sintetizar los intermediarios biosintéticos (Ekiel et al., J. Bacteriol. 162:905-908 (1985); Wood et al., FEMS Microbiol. Rev. 28:335-352 (2004)).
Las enzimas de fijación de carbono claves del ciclo de TCA reductivo son alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa, p¡ruvato:ferredoxina oxidorreductasa e isocitrato deshidrogenasa. El carbono adicional puede ser fijado durante la conversión de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato por fosfoenolpiruvato carboxilasa o fosfoenolpiruvato carboxiquinasa carboxiquinasa o por conversión de piruvato a malato por enzima málica.
Muchas de las enzimas en el ciclo TCA son reversibles y pueden catalizar reacciones en las direcciones reductiva y oxidativa. Sin embargo, algunas reacciones del ciclo TCA son irreversibles in vivo y de este modo diferentes enzimas son usadas para catalizar estas reacciones en las direcciones requeridas para el ciclo TCA reverso. Estas reacciones son: (1) conversión de citrato a oxaloacetato y acetil-CoA, (2) conversión de fumarato a succinato, y (3) conversión de succinil-CoA a alfa-cetoglutarato. En el ciclo TCA, se forma citrato de la condensación de oxaloacetato y acetil-CoA. La reacción reversa, desdoblamiento de citrato a oxaloacetato y acetil-CoA, es dependiente de ATP y es catalizada por ATP-citrato liasa, o citril-CoA sintetasa y citril-CoA liasa. Alternativamente, citrato liasa puede ser acoplada a acetil-CoA sintetasa, una acetil-CoA transferasa, o fosfotransacetilasa y acetato quinasa para formar acetil-CoA y oxaloacetato de citrato. La conversión de succinato a fumarato es catalizada por succinato deshidrogenasa mientras la reacción reversa es catalizada por fumarato reductasa. En el ciclo TCA, se forma succinil-CoA de la descarboxilación dependiente de NAD(P)+ de alfa-cetoglutarato por el complejo alfa-cetoglutarato deshidrogenasa. La reacción reversa es catalizada por alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa.
Un organismo capaz de utilizar el ciclo del ácido tricarboxílico reverso para permitir la producción de productos derivados de acetil-CoA en 1) CO, 2) C02 y H2, 3) CO y C02, 4) gas de síntesis que comprende CO y H2, y 5) gas de síntesis u otras fuentes de carbono gaseosas que comprenden CO, C02, y H2 pueden incluir cualquiera de las siguientes actividades de enzimas: ATP-citrato Masa, citrato Nasa, aconitasa, isocitrato deshidrogenasa, alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa, succinil-CoA sintetasa, succinil-CoA transferasa, fumarato reductasa, fumarasa, malato deshidrogenasa, acetato quinasa, fosfotransacetilasa, acetil-CoA sintetasa, acetil-CoA transferasa, p¡ruvato:ferredox¡na oxidorreductasa, NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, deshidrogenasa de monóxido de carbono, hidrogenasa, y ferredoxina (véase Figura 23). Enzimas y los genes correspondientes requeridos para estas actividades son descritos en la presente anteriormente.
El carbono de syngas u otras fuentes de carbono gaseosas pueden ser fijados vía el ciclo TCA reverso y componentes de los mismos. Específicamente, la combinación de ciertos componentes de la trayectoria de utilización del gas de carbono con las trayectorias para la formación de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -ol, o 1 ,3-butadieno de acetil-CoA resulta en altos rendimientos de estos productos proporcionando un mecanismo eficiente para fijar el carbono presente en el dióxido de carbono, alimentado exógenamente o producido endógenamente de CO, en acetil-CoA.
En algunas modalidades, una trayectoria de 2,4- pentadienoato, 3-buteno-1 -ol, o 1 ,3-butadieno en un organismo microbiano que no se origina naturalmente de la invención puede utilizar cualquier combinación de (1) CO, (2) C02, (3) H2, o mezclas de los mismos para mejorar los rendimientos de las etapas biosintéticas que involucran reducción, que incluyen adición a accionar el ciclo de TCA reductivo.
En algunas modalidades un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA. Al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, citrato Nasa, una fumarato reductasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; y al menos una enzima exógena seleccionada de una deshidrogenasa de monóxido de carbono, una hidrogenase, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, y una ferredoxina, expresada en una cantidad suficiente para permitir la utilización de (1) CO, (2) C02, (3) H2, (4) C02 y H2, (5) CO y C02, (6) CO y H2, o (7) CO, C02, y H2.
En algunas modalidades un método incluye cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de a 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -ol, o 1 ,3-butadieno también que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA. Al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato liasa, citrato liasa, una fumarato reductasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredox¡na oxidorreductasa. Adicionalmente, tal organismo puede también incluye al menos una enzima exógena seleccionada de una deshidrogenasa de monóxido de carbono, una hidrogenasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, y una ferredoxina, expresada en una cantidad suficiente para permitir la utilización de (1) CO, (2) C02, (3) H2, (4) C02 y H2l (5) CO y C02, (6) CO y H2, o (7) CO, C02l y H2 para producir un producto.
En algunas modalidades un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye además al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA expresada en una cantidad suficiente para mejorar el flujo de carbono a través de acetil-CoA. Al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato liasa, citrato Masa, una fumarato reductasa, una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitasa y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa.
En algunas modalidades un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima expresada en una cantidad suficiente para mejorar la capacidad de equivalentes de reducción en la presencia de monóxido de carbono y/o hidrógeno, de este modo incrementando el rendimiento de productos rédox limitados vía materias primas de carbono a base de carbohidratos. Al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una deshidrogenasa de monóxido de carbono, una hidrogenasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, y una ferredoxina. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para mejorar la capacidad de equivalentes de reducción en la presencia de monóxido de carbono o hidrógeno de este modo incrementando el rendimiento de productos rédox limitados vía materias primas de carbono a base de carbohidratos, tales como azúcares o fuentes de carbono gaseosas, el método incluye cultivar este organismo microbiano que no se origina naturalmente bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -o I , o 1 ,3-butadieno.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye dos ácidos nucleicos exógenos, cada uno codificando una trayectoria reductora de la enzima TCA. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una trayectoria reductora de la enzima TCA. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente incluye tres ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato Nasa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente incluye tres ácidos nucleicos exógenos que codifican una citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa.
En algunas modalidades, los organismos microbianos que no se originan naturalmente que tienen una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno además incluyen un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, y combinaciones de las mismas.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de deshidrogenasa de monóxido de carbono, acetil-CoA sintasa, ferredoxina, NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa y combinaciones de las mismas.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno utiliza una materia prima de carbono seleccionada de (1) CO, (2) C02, (3) C02 y H2, (4) CO y H2, o (5) CO, C02, y H2. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno utiliza hidrógeno para equivalentes de reducción. En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno utiliza CO para equivalentes de reducción.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno utiliza combinaciones de CO e hidrógeno para equivalentes de reducción.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye además uno o más ácidos nucleicos que codifican una enzima seleccionada de una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una piruvato carboxilasa, y una enzima mélica.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye además uno o más ácidos nucleicos que codifican una enzima seleccionada de una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA sintetasa, y una succinil-CoA transferasa.
En algunas modalidades, el organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluye además al menos un ácido nucleico exógeno que codifica a citrato liasa, una ATP-citrato liasa, una citril-CoA sintetasa, una citril-CoA liasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, y una ferredoxina.
En algunas modalidades, las materias primas de carbono y otras fuentes de absorción celular tales como fosfato, amoníaco, sulfato, cloruro y otros halógenos pueden ser elegidas para alterar la distribución isotópica de los átomos presentes en 1 ,3-butadieno o cualquier intermediario de la trayectoria de 1 ,3-butadieno. Las varias materias primas de carbono y otras fuentes de absorción enumeradas anteriormente serán referidas en la presente, colectivamente, como "fuentes de absorción". Las fuentes de absorción pueden proporcionar enriquecimiento isotópico para cualquier átomo presente en la trayectoria del producto de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno o cualquier intermediario en la ruta de la misma. Las varias materias primas de carbono y otras fuentes de absorción enumeradas anteriormente serán referidas en la presente, colectivamente, como "fuentes de absorción". Las fuentes de absorción pueden proporcionar enriquecimiento isotópico para cualquier átomo presente en el intermediario de la trayectoria del producto de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno o tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno que incluye cualquiera de las impurezas de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4- oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno generadas en divergencia a distancia de la trayectoria en cualquier punto. El enriquecimiento isotópico puede ser logrado por cualquier átomo objetivo que incluye, por ejemplo, carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, cloruro u otros halógenos.
En algunas modalidades, las fuentes de absorción pueden ser seleccionadas para alterar las relaciones de carbono-12, carbono-13, y carbono-14. En algunas modalidades, las fuentes de absorción pueden ser seleccionadas para alterar las relaciones de oxígeno-16, oxígeno-17 y oxígeno-18. En algunas modalidades, las fuentes de absorción pueden ser seleccionadas para alterar las relaciones de hidrógeno, deuterio, y tritio. En algunas modalidades, las fuentes de absorción pueden ser seleccionadas para alterar las relaciones de nitrógeno-14 y nitrógeno-15. En algunas modalidades, las fuentes de absorción pueden ser seleccionadas para alterar las relaciones de azufre-32, azufre-33, azufre-34, y azufre-35. En algunas modalidades, las fuentes de absorción pueden ser seleccionadas para alterar las relaciones de fósforo-31, fósforo-32, y fósforo-33 ratios. En algunas modalidades, las fuentes de absorción pueden ser seleccionadas para alterar las relaciones de cloro-35, cloro-36, y cloro-37.
En algunas modalidades, una relación isotópica objetivo de una fuente de absorción puede ser obtenida vía enriquecimiento químico de la fuente de absorción. Tales fuentes de absorción isotópicamente enriquecidas pueden ser adquiridas comercialmente o preparadas en el laboratorio. En algunas modalidades, una relación isotópica objetivo de una fuente de absorción puede ser obtenida por elección de origen de la fuente de absorción en la naturaleza. En algunas de tales modalidades, una fuente de carbono, por ejemplo, se puede seleccionar de una fuente de carbono derivada de combustible fósil, la cual puede ser relativamente agotada de carbono-14, o una fuente de carbono ambiental, tal como C02, la cual puede poseer una cantidad más grande de carbono-14 que sus contrapartes derivadas de petróleo.
El enriquecimiento isotópico es fácilmente evaluado por espectrometría de masas usando técnicas conocidas en el arte tales como Espectrometría de Masas de Relación de Isótopo Estable (SIR S) y Fraccionamiento Isotópico Natural Específico del Sitio por Resonancia Magnética Nuclear (SNIF-NMR). Tales técnicas espectrales de masas pueden ser integradas con técnicas de separación tales como cromatografía líquida (LC) y/o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
En algunas modalidades, la presente invención proporciona tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-met¡l-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno o un intermediario de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxí-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno que tiene una relación de carbono-12, carbono-13, y carbono-14 que refleja una fuente de absorción de carbono atmosférico. En algunas de tales modalidades, la fuente de absorción es C02. En algunas modalidades, la presente invención proporciona intermediarios de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, que tienen una relación de carbono-12, carbono-13, y carbono-14 que refleja la fuente de absorción de carbono a base de petróleo. En algunas modalidades, la presente invención proporciona tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno o un intermediario de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno que tiene una relación de carbono-12, carbono-13, y carbono-14 que se obtiene por una combinación de una fuente de absorción de carbono atmosférico con una fuente de absorción a base de petróleo. Tal combinación de fuentes de absorción es un medio por el cual las relaciones de carbono-12, carbono-13, y carbono-14 pueden ser variadas.
Por consiguiente, dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos expertos en la técnica entenderán que un organismo microbiano que no se origina naturalmente puede ser producido que secreta los compuestos biosintetizados de la invención cuando se hace crecer en una fuente de carbono tal como un carbohidrato. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno y cualquiera de los metabolitos intermediarios en la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Todo lo que se requiere es diseñar por ingeniería una o más de las actividades de enzimas o proteínas requeridas para lograr la biosíntesis del compuesto o intermediario deseado que incluye, por ejemplo, inclusión de algunas o todas las trayectorias biosintéticas del tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Por consiguiente, la invención proporciona un organismo microbiano que no se origina naturalmente que produce y/o secreta tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno cuando se hace crecer en un carbohidrato u otra fuente de carbono y produce y/o secreta cualquiera de los metabolitos intermediarios mostrados en la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno cuando se hace crecer en un carbohidrato u otra fuente de carbono. Los organismos microbianos que producen tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno de la invención pueden iniciar la síntesis de un intermediario, por ejemplo, fenilalanina, fenilpiruvato, fenilacetaldehido, fenilacetato, benzoil-CoA, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA, [(3-oxo-3-fenilpropionil)oxi] fosfonato, benzoil acetato, acetofenona, 1-feniletanol, rrans.rrans-muconato, c/s, rrans-muconato, c/'s, c/'s-muconato, frans-2, 4-pentadienoato, y c/s-2,4-pentadienoato. Como un ejemplo adicional, un intermediario de la trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato puede ser 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato o C-metil-D-eritritol-4-fosfato (véase Ejemplo III y Figura 5). Una trayectoria del intermediario p-toluato puede ser, por ejemplo, 2,4-dihidroxi-5-metil-6-[(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato, 1 ,3-dihidroxi-4-metil-5-oxociclohexan-1 -carboxilato, 5-hidroxi-4-metil-3-oxociclohex-1 -eno-1 -carboxilato, 3, 5-dih id roxi-4-metilciclohex-1 -eno-1 -carboxilato, 5-hidroxi-4-m et i l-3-(f osf o nooxi ) ci cío hex-1 -en o-1 -carboxilato , 5-[(1-carboxiet-1-en-1-il)oxi]-4-metil-3-(fosfonooxi)ciclohex-1 -eno-1 -carboxilato, o 3-[(1-carboxiet-1 -en-1-il)oxi]-4-metilciclohexa-1 ,5-dieno-1 -carboxilato (véase Ejemplo IV y Figura 6). Un intermediario de tereftalato puede ser, por ejemplo, alcohol 4-carboxibencílico o 4-carboxibenzaldehído (véase Ejemplo V y Figura 7).
Como se describe en la presente, p-toluato y benzoato son intermediarios ejemplares que pueden ser el sujeto de un organismo microbiano que no se origina naturalmente. Tales carboxilatos pueden ocurrir en forma ionizada o forma completamente protonada. Por consiguiente, el sufijo "-ato," o la forma de ácido, puede ser usado de manera intercambiable para describir tanto la forma de ácido libre así como también cualquier forma desprotonada, en particular puesto que la forma ionizada se conoce por depender del pH en el cual el compuesto se encuentra. Se entiende que productos de propionato accesibles de conformidad con la presente invención incluyen formas de éster, tales como ésteres de O-carboxilato y S-carboxilato. O- y S-carboxilatos pueden incluir alquilo inferior, que son carboxilatos de cadena recta o ramificada, de C1 a C6. Algunos de tales O- o S-carboxilatos incluyen, sin limitación, O- o S-carboxilatos de metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, i-propilo, sec-butilo, y tere-butilo, pentilo, hexilo, cualquiera de los cuales puede poseer además una insaturación, proporcionando por ejemplo, O-o S-carboxilatos de propenilo, butenilo, pentilo, y hexenilo. Los O-carboxilatos pueden ser el producto de una trayectoria biosintética. O-carboxilatos ejemplares accesados vía trayectorias biosintéticas pueden incluir, sin limitación, metil propionato, etil propionato, y n-propil propionato. Otros O-propionatos biosintéticamente accesibles pueden incluir grupos de cadena media a larga, es decir ésteres .de O-propionato, de C7-C22, derivados de alcoholes grasos, tales como heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, laurilo, tridecilo, miristilo, pentadecilo, cetilo, palmitolilo, heptadecilo, estearilo, nonadecilo, araquidilo, heneicosilo, y alcoholes de behenilo, cualquiera de los cuales puede ser opcionalmente ramificado y/o contener insaturaciones. Los ésteres de O-propionato también pueden ser accesados vía procesos químicos o bioquímicos, tales como esterificación de un producto de ácido carboxílico libre o transesterificación de un O- u S-propionato. Los S-carboxilatos son ejemplificados por CoA S-ésteres, cisteinil S-ésteres, alquiltioésteres, y varios aril y heteroaril tioésteres.
Los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención son construidos usando métodos bien conocidos en la técnica como se ejemplifica en la presente para expresar exogenamente al menos un ácido nucleico que codifica una enzima o proteína de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno en cantidades suficientes para producir tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3- buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Se entiende que los organismos microbianos de la invención son cultivados bajo condiciones suficientes para producir tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil- 4- oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Siguiendo las enseñanzas y guía proporcionada en la presente, los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención pueden lograr biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno resultando en concentraciones intracelulares entre aproximadamente 0.1-200 mM o más. En general, la concentración intracelular de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno es entre aproximadamente 3-150 mM, particularmente entre aproximadamente 5-125 mM y más particularmente entre aproximadamente 8-100 mM, que incluye aproximadamente 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM, o más. Concentraciones intracelulares entre y aproximadamente en cada uno de estos rangos ejemplares también pueden lograrse de los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención.
En algunas modalidades, condiciones de cultivo incluyen condiciones de crecimiento o mantenimiento anaeróbico o sustancialmente anaeróbico. Condiciones anaerobicas ejemplares han sido descritas previamente y son bien conocidas en la técnica. Condiciones anaerobicas ejemplares para procesos de fermentación son descritas en la presente y se describen, por ejemplo, en la publicación Estadounidense 2009/0047719, presentada el 10 de Agosto de 2007. Cualesquiera de estas condiciones pueden ser empleadas con los organismos microbianos que no se originan naturalmente asi como también otras condiciones anaerobicas bien conocidas en la técnica. Bajo tales condiciones anaerobicas o sustancialmente anaerobicas, los productores de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidrox¡-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno pueden sintetizar tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno a concentraciones intracelulares de 5-10 mM o más asi como también todas las otras concentraciones ejemplificadas en la presente. Se entiende que, aún aunque la descripción anterior se refiere a concentraciones intracelulares, organismos microbianos que producen tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno pueden producir tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno intracelularmente y/o secretar el producto en el medio de cultivo.
Además de las condiciones de cultivo y fermentación descritas en la presente, las condiciones de crecimiento para lograr la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno pueden incluir la adición de un osmoprotector a las condiciones de cultivo. En ciertas modalidades, los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención pueden ser sostenidos, cultivados o fermentados como se describe en la presente en la presencia de una osmoprotector. Brevemente, un osmoprotector se refiere a un compuesto que actúa como un osmolito y ayuda a un organismo microbiano como se describe en la presente a sobrevivir el estrés osmótico. Los osmoprotectores incluyen, pero no se limitan a, betaínas, aminoácidos y el azúcar trehalosa. Ejemplos no limitantes de tales son glicina betaína, pralina betaína, dimetiltestaño, dimetilslfonioproprionato, 3-dimetilsulfonio-2-metilproprionato, ácido pipecólico, dimetilsulfonioacetato, colina, L-carnitina y ectoina. En un aspecto, el osmoprotector es glicina betaína. Se entiende para uno de habilidad ordinaria en la técnica que la cantidad y tipo de osmoprotector adecuado para proteger un organismo microbiano descrito en la presente de estrés osmótico dependerá del organismo microbiano usado. La cantidad de osmoprotector en las condiciones del cultivar puede ser, por ejemplo, no más de aproximadamente 0.1 mM, no más de aproximadamente 0.5 mM, no más de aproximadamente 1.0 mM, no más de aproximadamente 1.5 mM, no más de aproximadamente 2.0 mM, no más de aproximadamente 2.5 mM, no más de aproximadamente 3.0 mM, no más de aproximadamente 5.0 mM, no más de aproximadamente 7.0 mM, no más de aproximadamente 10mM, no más de aproximadamente 50mM, no más de aproximadamente 100mM o no más de aproximadamente 500mM.
Las condiciones de cultivo pueden incluir, por ejemplo, procedimientos de cultivo líquido así como también fermentación y otros procedimientos de cultivo a escala mayor. Como se describe en la presente, rendimientos particularmente útiles de los productos biosintéticos de la invención pueden ser obtenidos bajo condiciones de cultivo anaeróbicas o sustancialmente anaeróbicas.
Como se describe en la presente, una condición de crecimiento ejemplar para lograr la biosíntesis de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno incluye condiciones de fermentación o cultivo anaeróbicas. En ciertas modalidades, los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la invención puede ser sostenidos, cultivados o fermentados bajo condiciones anaeróbicas o sustancialmente anaeróbicas. Brevemente, las condiciones anaeróbicas se refieren a un ambiente desprovisto de oxígeno. Las condiciones sustancialmente anaeróbicas incluyen, por ejemplo, un cultivo, fermentación de lote o fermentación continua de manera que la concentración de oxígeno disuelto en el medio permanece entre 0 y 10% de saturación. Condiciones sustancialmente anaeróbicas también incluyen células que crecen o reposan en medio líquido o en un agar sólido dentro de una cámara sellada mantenida con una atmósfera de menos de 1% de oxígeno. El porcentaje de oxígeno puede ser mantenido mediante, por ejemplo, rociar el cultivo con una mezcla de N2/C02 mixture u otro gas o gases sin oxígeno adecuados.
Las condiciones de cultivo descritas en la presente puede ser escaladas y hacerse crecer continuamente para la manufacturacion de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Procedimientos de crecimiento ejemplares incluyen, por ejemplo, fermentación de alimentación por lotes y separación de lotes; fermentación de alimentación por lotes y separación continua, o fermentación continua y separación continua. Todos estos procesos son bien conocidos en la técnica. Procedimientos de fermentación son particularmente útiles para la producción biosintética de cantidades comerciales de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3- metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. En general, y como con procedimientos de cultivo no continuos, la producción continua y/o casi continua de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno incluirá cultivar un organismo que produce tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno que no se origina naturalmente de la invención en nutrientes y medios suficientes para sostener y/o casi sostener el crecimiento en una fase exponencial. El cultivo continuo bajo tales condiciones puede incluir, por ejemplo, creciendo por el día 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días o más. Adicionalmente, el cultivo continuo puede incluir periodos de tiempo prolongados de 1 semana, 2, 3, 4 ó 5 o más semanas y hasta varios meses. Alternativamente, organismos de la invención pueden ser cultivados por horas, si es adecuado para una aplicación particular. Se entiende que las condiciones de cultivo continuas y/o casi continuas también pueden incluir todos los intervalos de tiempo entre estos periodos ejemplares. Se entiende además que el tiempo de cultivo del organismo microbiano de la invención es por un periodo de tiempo suficiente para producir una cantidad suficiente de producto para un propósito deseado.
Los procedimientos de fermentación son bien conocidos en la técnica. Brevemente, la fermentación para la producción biosintética de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutox¡)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadíenoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno se puede utilizar en, por ejemplo, fermentación de alimentación por lotes y separación de lotes; fermentación de alimentación por lotes y separación continua, o fermentación continúa y separación continúa. Ejemplos de procedimientos de lotes y fermentación continua son bien conocidos en la técnica.
Además de los procedimientos de fermentación anteriores usando los productores de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno de la invención para la producción continua de cantidades sustanciales de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno, los productores de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno también pueden ser, por ejemplo, simultáneamente sometidos a procedimientos de síntesis química para convertir el producto a otros compuestos o el producto puede ser separado del cultivo de fermentación y secuencialmente sometido a conversión química para convertir el producto a otros compuestos, si se desea.
Para generar productores mejores, la modelación metabólica se puede utilizar para optimizar las condiciones de crecimiento. La modelación también puede ser usada para diseñar genes agénicos que adicionalmente optimizan la utilización de la trayectoria (véase, por ejemplo, publicaciones de Patentes US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/00291 9, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 y US 2004/0009466, y Patente Estadounidense No. 7,127,379). El análisis de modelación permite predicciones confiables de los efectos en el crecimiento celular de cambiar el metabolismo hacia la producción más eficiente de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno.
Un método computacional para identificar y diseñar alteraciones metabólicas para favorecer la biosíntesis de un producto deseado es el marco computacional OptKnock (Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)). OptKnock es un programa de simulación y modelación metabólica que sugiere estrategias de supresión o interrupción de gene que resultan en microorganismos genéticamente estales los cuales producen en exceso el producto objetivo. Específicamente, el marco examina las redes metabólicas y/o bioquímicas completas de un microorganismo para sugerir manipulaciones genéticas que fuerzan al bioquímico deseado para llegar a un derivado obligatorio del crecimiento celular. Acoplando la producción bioquímica con el crecimiento celular a través de supresiones de gene estratégicamente colocadas u otras alteraciones de gene funcional, las presiones de selección de crecimiento impuestas en las cepas diseñadas por ingeniería después de largos periodos de tiempo en un biorreactor conducen a mejoramientos en el desempeño como un resultado de la producción bioquímica acoplada al crecimiento por compulsión. Finalmente, cuando las supresiones del gene son construidas existe una posibilidad insignificante de que las cepas designadas reviertan a sus estados de tipo nativo debido a que los genes seleccionados por OptKnock están siendo completamente removidos del genoma. Por lo tanto, esta metodología computacíonal puede ser usada para ya sea identificar trayectorias alternativas que conduzcan a la biosíntesis de un producto deseado o usar en conjunto con los organismos microbianos que no se originan naturalmente para optimización adicional de la biosíntesis de un producto deseado.
Brevemente, OptKnock es un término usado en la presente para referirse a un método y sistema computacíonal para modelar el metabolismo celular. El programa OptKnock se refiere a un marco de modelos y métodos que incorporan restricciones particulares en los modelos de análisis de equilibrio de flujo (FBA). Estas restricciones incluyen, por ejemplo, formación cinética cualitativa, información reguladora cualitativa, y datos experimentales de microarreglo de DNA. El OptKnock también computa soluciones a varios problemas metabólicos mediante, por ejemplo, apretar los límites del flujo derivados a través de los modelos de equilibrio de flujo y probar subsecuentemente los límites de desempeño de las redes metabolicas en la presencia de adiciones o supresiones de gene. Los marcos computacionales de OptKnock permiten la construcción de formulaciones de modelo que permiten una consulta efectiva de los límites de desempeño y redes metabólicos y proporcionan métodos para resolver los problemas de programación lineal integrados-mezclados resultantes. Los métodos de modelación y simulación metabólica referidos en la presente como OptKnock son descritos en, por ejemplo, la Publicación Estadounidense 2002/0168654, presentada el 10 de Enero de 2002, Patente Internacional No. PCT/US02/00660, presentada el 10 de Enero de 2012, y publicación Estadounidense 2009/0047719, presentada el 10 de Agosto de 2007.
Otro método computacional para identificar y diseñar alteraciones metabólicas que favorecen la producción biosintética de un producto es un sistema de modelación y simulación metabólica llamado SimPheny®. Este método y sistema computacional se describe en, por ejemplo, la Publicación Estadounidense 2003/0233218, presentada el 14 de Junio de 2002, y en la Solicitud de Patente International No. PCT/US03/18838, presentada el 13 de Junio de 2003. SimPheny® es un sistema computacional que puede ser usado para producir un modelo de red in silico y simular el flujo de masa, energía o carga a través de las reacciones químicas de un sistema biológico para definir un espacio de solución que contiene alguna y todas las posibles funcionalidades de las reacciones químicas en el sistema, de este modo determinando un rango de actividades permitidas para el sistema biológico. Este procedimiento es referido como modelación a base de restricciones debido a que el espacio de solución es definido por restricciones tales como la estequiometria conocida de las reacciones incluidas así como también restricciones de capacidad y termodinámicas de reacción asociadas con flujos máximos a través de las reacciones. El espacio definido por estas restricciones puede ser interrogado para determinar las capacidades fenotípicas y comportamiento del sistema biológico o de sus componentes bioquímicos.
Estos procedimientos computacionales son consistentes con realidades biológicas debido a que los sistemas biológicos son flexibles y pueden alcanzar el mismo resultado en muchas formas diferentes. Los sistemas biológicos son diseñados a través de mecanismos evolucionarios que han sido restringidos por restricciones fundamentales que todos los sistemas vivos deben enfrentar. Por lo tanto, las estrategias de modelación a base de restricciones abarcan estas realidades generales. Además, la capacidad para imponer continuamente restricciones adicionales en un modelo de red vía el apriete de restricciones resulta en una reducción en el tamaño del espacio de solución, de este modo mejorando la precisión con la cual puede ser pronosticado el fenotipo o desempeño fisiológico.
Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos expertos en la técnica serán capaces de aplicar varias redes computacionales para modelación y simulación metabólica para diseñar e implementar la biosíntesis de un compuesto deseado en organismos microbianos hospederos. Tales métodos de modelación y simulación metabólica, por ejemplo, los sistemas computacionales ejemplificados anteriormente como SimPheny® y OptKnock. Para ilustración de la invención, algunos métodos son descritos en la presente con referencia al marco de computación OptKnock para modelación y simulación. Aquellos expertos en la técnica sabrán cómo aplicar la identificación, diseño e implementación de las alteraciones metabólicas usando OptKnock a cualquier de tales otras redes computaciones de modelación y simulación metabólica y métodos bien conocidos en la técnica.
Los métodos descritos anteriormente proporcionarán una serie de reacciones metabólicas para alterar. La eliminación de cada reacción dentro de la serie o modificación metabólica puede resultar en un producto deseado como un producto obligatorio durante la fase de crecimiento del organismo. Debido a que se conocen las reacciones, una solución al problema de binivel de OptKnock también proporcionará el gene o genes asociados que codifican una o más enzimas que catalizan cada reacción dentro de la serie de reacciones. La identificación de una serie de reacciones y sus genes correspondientes que codifican las enzimas que participan en cada reacción es en general un proceso automatizado, realizado a través de la correlación de las reacciones con una base de datos de reacción que tiene una relación entre enzimas y genes codificantes.
Una vez identificada, las series de reacciones que están siendo alteradas para lograr la producción de un producto deseado son implementadas en la célula u organismo objetivo por alteración funcional de al menos un gene que codifica cada reacción metabólica dentro de la serie. Un medio particularmente útil para lograr la alteración funcional de la serie de reacción es por supresión de cada gene codificante. Sin embargo, en algunos casos, puede ser benéfico alterar la reacción por otras aberraciones genéticas que incluyen, por ejemplo, mutación, supresión de regiones reguladoras tales como promotores o sitios de unión cis para factores reguladores, o por truncación de la secuencia codificante en cualquiera de un número de ubicaciones. Estas últimas aberraciones, resultan en menos de la supresión total de la serie de gene que puede ser útil, por ejemplo, cuando las evaluaciones rápidas del acoplamiento de un producto son deseadas o cuando la reversión genética es menos probable que ocurra.
Para identificar soluciones productivas adicionales al problema de OptKnock de binivel descrito el cual conduce a series adicionales de reacciones para alteración o modificaciones metabólicas que pueden resultar en la biosintesis, que incluye biosíntesis acoplada al crecimiento de un producto deseado, un método de optimización, cortes denominados entero, pueden ser implementadas. Este método procede resolviendo iterativamente el problema de OptKnock ejemplificado anteriormente con la incorporación de una restricción adicional con referencia a un corte entero en cada iteración. Las restricciones de corte interno efectivamente previenen el procedimiento de solución de elegir la misma serie exacta de reacciones identificadas en cualquier iteración previa que obligatoriamente acopla la biosíntesis del producto para crecimiento. Por ejemplo, si una modificación metabólica acoplada al crecimiento previamente identificada especifica las reacciones 1, 2 y 3 para alteración, entonces la siguiente restricción previene a las mismas reacciones de ser simultáneamente consideradas en soluciones subsecuentes. El método de corte entero es bien conocido en la técnica y se puede encontrar descrito en, por ejemplo, Burgard et al., Biotechnol. Proq. 17:791-797 (2001). Como con todos los métodos descritos en la presente con referencia a su uso en combinación con el marco computacional OptKnock para modelación y simulación metabólica, el método de corte entero para reducir la redundancia en análisis computacional iterativo, también puede ser aplicado con otros marcos computacionales bien conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, SimPheny®.
Los métodos ejemplificados en la presente permiten la construcción de células y organismos que biosintéticamente producen un producto deseado, que incluye el acoplamiento obligatorio de producción de un producto bioquímico objetivo para crecimiento de la célula u organismo diseñado por ingeniería para albergar las alteraciones genéticas identificadas. Por lo tanto, los métodos computacionales descritos en la presente permiten la identificación e implementación de modificaciones metabolicas que son identificadas por un método in silico seleccionado de OptKnock o SimPheny®. La serie de modificaciones puede incluir, por ejemplo, adición de una o más enzimas de la trayectoria biosintética y/o alteración funcional de una o más reacciones metabolicas, que incluyen, por ejemplo, alteración por supresión de gene.
Como se discute anteriormente, la metodología OptKnock se desarrolló con la premisa de que las redes microbianas mutantes pueden ser evolucionadas hacia sus fenotipos de máximo crecimiento computacionalmente predichos cuando se someten a largos periodos de selección de crecimiento. En otras palabras, el procedimiento aprovecha la capacidad del organismo para auto-optimizarse bajo presiones selectivas. El marco OptKnock permite la enumeración exhaustiva de combinaciones de supresión del gene que fuerzan un acoplamiento entre la producción bioquímica y el crecimiento celular basado en la estequiometria de la red. La identificación de gene óptimo/agénicos de reacción requiere la solución de un problema de optimización binivel que elige la serie de reacciones activas de manera que una solución al crecimiento óptimo para las redes resultantes produce en exceso el bioquímico de interés (Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)).
Un modelo estequiométrico in silico del metabolismo de E. coli puede ser empleado para identificar genes esenciales para trayectorias metabólicas como se ejemplifica previamente y describe en, por ejemplo, publicaciones de Patentes US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 y US 2004/0009466, y en la Patente Estadounidense No. 7,127,379. Como se describe en la presente, el marco matemático OptKnock puede ser aplicado a supresiones de gene preciso que conduce a la producción acoplada al crecimiento de un producto deseado. Además, la solución del problema de OptKnock de binivel proporciona solamente una serie de supresiones. Para enumerar todas las soluciones significantes, es decir, todas las series de agénicos que conducen a la formación de producción acoplada al crecimiento, una técnica de optimización, llamados cortes enteros, puede ser implementada. Esto vincula resolver iterativamente el problema de OptKnock con la incorporación de una restricción adicional referida como un corte entero en cada iteración, como se discute anteriormente.
Como se describe en la presente, un ácido nucleico que codifica una actividad deseada de una trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno puede ser introducido en un organismo hospedero. En algunos casos, puede ser deseable modificar una actividad de una enzima o proteína de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno para incrementar la producción de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadienoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Por ejemplo, mutaciones conocidas que incrementan la actividad de una proteína o enzima pueden ser introducidas en una molécula de ácido nucleico codificante. Adicionalmente, los métodos de optimización pueden ser aplicados para incrementar la actividad de una enzima o proteína y/o reducir una actividad inhibidora, por ejemplo, reducir la actividad de un regulador negativo.
Tal método de optimización es evolución dirigida. La evolución dirigida es un procedimiento poderoso que involucra la introducción de mutaciones dirigidas a un gene específico para mejorar y/o alterar las propiedades de una enzima. Las enzimas mejoradas y/o alteradas pueden ser identificadas a través del desarrollo e implementación de ensayos de selección de alto rendimiento sensibles que permiten la selección automatizada de muchas variantes de enzima (por ejemplo, >104). Rondas iterativas de mutagénesis y selección típicamente son realizadas para proporcionar una enzima con propiedades optimizadas. Los algoritmos computacionales que pueden ayudar a identificar áreas del gene para mutagénesis también han sido desarrollados y pueden reducir significantemente el número de variantes de enzima que necesitan ser generadas y seleccionadas. Se han desarrollado numerosas tecnologías de evolución dirigida (para revisiones, véase Hibbert et al., Biomol.Enq 22:11-19 (2005); Huisman y Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs. 717-742 (2007), Patel (ed.), CRC Press; Otten y Quax. Biomol. Enq 22:1-9 (2005).; y Sen et al., Appl Biochem.Biotechnol 143.212-223 (2007)) para ser efectivas en la creación de diversas bibliotecas variantes, y estos métodos han sido exitosamente aplicados al mejoramiento de un amplio rango de propiedades a través de muchas clases de enzimas. Las características de enzimas que han sido mejoradas y/o alteradas por tecnología de evolución dirigida incluyen, por ejemplo: selectividad/especificidad, para conversión de sustratos no naturales; estabilidad de temperatura, para procesamiento robusto de alta temperatura; estabilidad de pH, para bioprocesamiento bajo condiciones de pH superior o inferior; tolerancia del producto o sustrato, de manera que se pueden lograr altos tituladores del producto; unión (Km), que incluyen ampliación de enlace del sustrato para incluir sustratos no naturales; inhibición (K¡), para remover la inhibición por productos, sustratos, o intermediarios claves, actividad (kcat), para incrementar los índices de reacción enzimática para lograr el flujo deseado; niveles de expresión, para incrementar los rendimientos de proteína y flujo de trayectoria total; estabilidad de oxígeno, para operación de enzimas sensibles al aire bajo condiciones aeróbicas; y actividad anaeróbica, para operación de una enzima aeróbica en la ausencia de oxígeno.
Se han desarrollado un número de métodos ejemplares para la mutagénesis y diversificación de genes para dirigir las propiedades deseadas de enzimas específicas. Tales métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Cualquiera de estos pueden ser usados para alterar y/u optimizar la actividad de una enzima o proteína de la trayectoria de tolueno, benceno, p-toluato, tereftalato, (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxí)fosfonato, (2-hidroxi-4-oxobutoxí)fosfonato, benzoato, estireno, 2,4-pentadíenoato, 3-buten-1-ol o 1 ,3-butadieno. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a EpPCR, el cual introduce mutaciones de punto aleatorio reduciendo la fidelidad de polimerasa de DNA en reacciones de PCR (Pritchard eí al., J. Theor.Biol. 234:497-509 (2005)); La Amplificación de Círculo Rodante propenso a Error (epRCA), la cual es similar a epPCR excepto porque un plásmido circular completo es usado como la plantilla y 6-meros aleatorios con enlaces de tiofosfato resistentes a exonucleasa en los últimos 2 nucleotidos son usados para amplificar el plásmido seguido por transformación en células en las cuales el plásmido es re-circulado en repeticiones en serie (Fujii et al., Nucleic Acids Res. 32:e145 (2004); y Fujii eí al., Nat. Protoc. 1:2493-2497 (2006)); el DNA o Transposición de familia, lo cual típicamente involucra digestión de dos o más genes variantes con nucleasas tales como Dnase I o EndoV para generar una combinación de fragmentos aleatorios que son reensamblados por ciclos de apareamiento y extensión en la presencia de polimerasa de DNA para crear una biblioteca de genes quiméricos (Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 91:10747-10751 (1994); y Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)); Extensión Escalonada (StEP), la cual vincula cebación de plantilla seguida por ciclos repetidos de 2 etapas de PCR con desnaturalización y duración muy corta de apareamiento/extensión (tan corta como 5 seg) (Zhao et al., Nat. Biotechnol. 16:258-261 (1998)); Recombinación de Cebación Aleatoria (RPR), en la cual los cebadores de secuencia aleatoria son usadas para generar muchos fragmentos de DN cortos complementarios a diferentes segmentos de la plantilla (Shao eí al., Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998)).
Métodos adicionales incluyen Recombinación Heteroduplos, en la cual el DNA de plásmido linealizado es usado para formar heteroduplos que son reparados por reparación de desapareamiento (Volkov ef al., Nucleic Acids Res. 27:e18 (1999); y Volkov et al., Métodos Enzymol. 328:456-463 (2000)); Quimeragénesis Aleatoria en Plantillas Temporales (RACHITT), el cual emplea fragmentación de Dnase I y fraccionamiento de tamaño de DNA de filamento único (ssDNA) (Coco ef al., Nat. Biotechnol. 19:354-359 (2001)); Extensión Recombinada en plantillas Truncadas (RETT), la cual vincula cambios de plantillas de filamentos de cebadores que crecen unidireccionalmente en la presencia de fragmentos de ssDNA unidireccionales usado como una combinación de plantillas (Lee ef al., J. Molec. Catalysis 26:119-129 (2003)); Transposición de gene de Oligonucleótido Degenerado (DOGS), en la cual los cebadores degenerados son usados para controlar la recombinación entre moléculas; (Bergquist y Gibbs, Métodos Mol. Biol. 352:191-204 (2007); Bergquist et al., Biomol. Ena. 22:63-72 (2005); Gibbs et al., Gene 271:13-20 (2001)); Truncación de Incremento para la Creación de Enzimas Híbridas (ITCHY), la cual crea una biblioteca combinatorial con 1 supresión de par base de un gene o fragmento de gene de interés (Ostermeier eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96:3562-3567 (1999); y Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17:1205-1209 (1999)); Truncación de Tio-lncremento para la Creación de Enzimas Híbridas (THIO-ITCHY), la cual es similar a ITCHY excepto que se usan fosfotioatos dNTPs para generar truncaciones (Lutz ef al., Nucleic Acids Res. 29:E16 (2001)); SCRATCHY, el cual combina dos métodos para recombinar genes, ITCHY y transposición de DNA (Lutz ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 98:11248-11253 (2001)); Mutagénesis de Deriva Aleatoria (RNDM), en la cual las mutaciones hechas vía epPCR son seguidas por tamizado/selección para aquellas que retienen la actividad utilizable (Bergquist ef al., Biomol. Enq. 22:63-72 (2005)); Mutagénesis de Saturación de Secuencia (SeSaM), un método de mutagénesis aleatoria que genera una combinación de fragmentos de longitud aleatoria usando incorporación aleatoria de un fosfotioato nucleótido y desdoblamiento, el cual se usa como una plantilla para extenderse en la presencia de bases "universales" tales como inosina, y la replicación de un complemento que contiene inosina proporciona incorporación de base aleatoria y, consecuentemente, mutagénesis (Wong et al., Biotechnol. J. 3:74-82 (2008); Wong er al., Nucleic Acids Res. 32:e26 (2004); y Wong er al., Anal. Biochem. 341:187-189 (2005)); Transposición Sintética, la cual usa oligonucleótidos traslapantes diseñados para codificar "toda la diversidad genética en objetivos" y permite una diversidad muy alta para la progenie transpuesta (Ness et al., Nat. Biotechnol. 20:1251-1255 (2002)); Tecnología de Escisión e Intercambio de Nucleótido NexT, la cual explota una combinación de incorporación de dUTP seguida por tratamiento con glicosilasa de DNA uracilo y después piperidina para realizar fermentaciones de DNA de punto final (Muller ef al., Nucleic Acids Res. 33:e117 (2005)).
Métodos adicionales incluyen Recombinación de Proteína Independiente de la Homología de Secuencia (SHIPREC), en la cual un enlazador es usado para facilitar la fusión entre dos genes no relacionados o distantemente relacionados, y un rango de quimeras se genera entre los dos genes, resultando en bibliotecas de híbridos de cruza única (Sieber er al., Nat. Biotechnol. 19:456-460 (2001)); Gene Site Saturation Mutagénesis™ (GSSM™), en la cual los materiales de partida incluyen un plásmido de DNA de filamento doble superenrrollado (dsDNA) que contiene un inserto y dos cebadores los cuales son degenerados en el sitio de mutaciones deseados (Kretz ef al., Métodos Enzymol. 388:3-11 (2004)); Mutagénesis de Cartucho Combinatoria! (CCM), la cual involucra el uso de cartuchos de oligonucleótido corto para reemplazar regiones limitadas con un gran número de posibles alteraciones de secuencia de aminoácido (Reidhaar-Olson et al. Métodos Enzymol. 208:564-586 (1991); y Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988)); Mutagénesis de Cartucho Múltiple Combinatorial (CMCM), la cual es esencialmente similar a CCM y usa epPCR a una tasa de mutación alta para identificar manchas de calor y regiones de calor y después extensión por CMCM para cubrir una región definida de espacio de secuencia de proteína (Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591 (2001)); la técnica de Cepas Mutadoras, en la cual los plásmidos mutadores ts condicionales, utilizan el gene mutD5, el cual codifica una subunidad mutante de polimerasa de DNA III, para permitir incrementos de 20 a 4000-X en frecuencia de mutación natural y aleatoria durante la selección y acumulación en bloque de mutaciones deletéreas cuando la selección no se requiere (Selifonova eí al., Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649 (2001)); Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680 (1996)).
Métodos ejemplares adicionales incluyen Mutagénesis A través de Look (LTM), el cual es un método de mutagénesis multidimensional que evalúa y optimiza mutaciones combinatoriales de aminoácidos seleccionados (Rajpal ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 102:8466-8471 (2005)); Remontaje del gene, el cual es un método de transposición de DNA que puede ser aplicado a genes múltiples en. un tiempo o para crear una biblioteca grande de quimeras (mutaciones múltiples) de un gene único (Tecnología de Tunable GeneReassembly (TGR™) suministrada por Verenium Corporation), en Automatización de Diseño de Proteína ¡n Silico (PDA), el cual es un algoritmo de optimización que ancla la estructura de proteína estructuralmente definida que posee un pliegue particular, y busca espacios de secuencia para sustituciones de aminoácido que pueden estabilizar el pliegue y energéticos de proteína total, y en general funcional muy efectivamente en proteínas con estructuras tri-dimensionales (Hayes ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 99:15926-15931 (2002)); y Mutagénesis de Saturación Iterativa (ISM), la cual involucra el uso del conocimiento de estructura/función para elegir un sitio probable para mejoramiento de la enzima, realizando mutagénesis de saturación en el sitio elegido usando un método de mutagénesis tal como Stratagene QuikChange (Stratagene; San Diego CA), tamizado/selección para propiedades deseadas, y, usando clon(es) mejorados, partiendo de un sitio a otro y continuar repitiendo hasta que se logra una actividad deseada (Reetz et al., Nat. Protoc. 2:891-903 (2007); y Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751 (2006)).
Cualquiera de los métodos para mutagénesis mencionados anteriormente puede ser usado solo o en cualquier combinación. Adicionalmente, uno cualquiera o la combinación de los métodos de evolución digeridos pueden ser usados en conjunto con técnicas de evolución adaptivas, como se describe en la presente.
Ejemplo I Trayectorias a benceno y Tolueno Este ejemplo muestra trayectorias de fenilalanina a tolueno, fenilalanina a benceno y benzoil-CoA a estireno.
Trayectorias para la conversión enzimática de fenilalanina se muestran en la Figura 1. La primera etapa contempla conversión de fenilalanina a fenilpiruvato, una transformación que puede ser realizada por una aminotransferasa o una desaminación de oxidorreductasa. Fenilpiruvato es entonces descarboxilado a fenilacetaldehído en la Etapa B de la Figura 1. El tolueno puede ser producido directamente de fenilacetaldehído por descarbonilación (Figura 1, etapa E), o indirectamente vía un intermediario de fenilacetato (Figura 1, Etapas C y D). El fenilacetato puede ser oxidado a fenilacetato (Figura 1, etapa C) por ya sea una fenilacetaldehído deshidrogenasa o una fenilacetaldehído oxidasa. Una trayectoria alterna es la descarboxilación oxidativa directa de fenilpiruvato a fenilacetato por fenilpiruvato oxidasa (Figura 1 , etapa F).
Una trayectoria de una etapa para conversión enzimática de fenilalanina a benceno se muestra en la Figura 2. La conversión de fenilalanina y agua a benceno, piruvato y amoníaco es catalizada por una enzima con actividad de fenilalanina benceno-Masa.
Las trayectorias enzimáticas a estireno de benzoil-CoA se muestran en la Figura 3. Benzoil-CoA es un intermediario metabólico común de numerosas trayectorias de degradación y biosintéticas. Las trayectorias que involucran la biosíntesis de benzoil-CoA, y también la generación de benzoil-CoA como un producto de degradación, se conocen en la técnica. En las trayectorias de estireno propuestas, benzoil-CoA y acetil-CoA son primero convertidos a 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA por una beta-cetotiolasa (Figura 3, etapa A). La porción CoA de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA es entonces liberada por una CoA hidrolasa, transferasa o sintasa (Figura 3, etapa B). Alternativamente, 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA es convertido a benzoil-acetato en dos etapas enzimáticas por una fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa y benzoil-acetato quinasa (Figura 3, Etapas F y G). Una vez formado, el benzoil-acetato es descarboxilado, reducido y deshidratado para formar estireno (Figura 3, Etapas C, D y E).
Las enzimas para catalizar las transformaciones mostradas en las Figuras 1-3 son categorizadas por el número EC (Tabla 1) y descritas además abajo. 1.1.1.a Oxidorreductasa (oxo a alcohol): La reducción de acetofenona a 1-feniletanol (Etapa D de la Figura 3) es catalizada por una cetona reductasa con actividad de acetofenona reductasa. Enzimas con esta actividad han sido caracterizadas en numerosos organismos, y la formación del producto es en general estereoselectiva. Una enzima ejemplar con esta actividad es la deshidrogenasa/reductasa de cadena corta especifica de R de Lactobacillus brevis, la cual ha sido extensivamente estudiada, estructuralmente caracterizada y re-diseñada por ingeniería para preferir NADH a NADPH como un co-sustrato (Schlieben eí al., J. Mol.Biol. 349:801-813 (2005)). Enzimas adicionales con actividad de acetofenona reductasa son codificadas por adhF1 de Pseudomonas fluorescens (Hildebrandt et al., Appl. Microbiol Biotechnol. 59:483-487 (2002)), adh de Thermus thermophilus (Pennacchio eí al., Appl. Environ. Microbiol 74:3949-3958 (2008)) y LSADH de Leifsonia sp. S749 (Inoue et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 70:418-426 (2006)). Una enzima específica de S se caracteriza en la trayectoria de degradación de etilbenceno de la bacteria desnitrificante Aromatoleum aromaticum EbN1 (Kniemeyer et al., Arch. Microbiol. 176:129-135 (2001)). Esta enzima, codificad por ped, favorece la dirección reductiva a pH bajo (4), mientras la dirección oxidativa es favorecida a pH neutral.
Una variedad de enzimas de alcohol deshidrogenasa catalizan la reducción de un grupo funcional cetona a un alcohol. Estas enzimas son también adecuadas para catalizar la reducción de acetofenona. Dos de tales enzimas en E. coli son codificadas por malato deshidrogenasa {mdh) y lactato deshidrogenasa {IdhA). La lactato deshidrogenasa de Ralstonia eutropha ha sido mostrada por demostrar altas actividades en 2-cetoácidos de varias longitudes de cadena que incluyen lactato, 2-oxobutirato, 2-oxopentanoato y 2-oxoglutarato (Steinbuchel ef al., Eur. J. Biochem. 130:329-334 (1983)). La conversión de alfa-cetoadipato en alfa-hidroxiadipato puede ser catalizada por 2-cetoadipato reductasa, una enzima reportada por ser encontrada en ratas y en placenta humana (Suda et al., Arch. Biochem. Biophys. 176:610-620 (1976); Suda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:586-591 (1977)). Una oxidorreductasa adicional es la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa {bdh) mitocondrial del corazón humano el cual ha sido clonado y caracterizado (Marks et al., J. Biol. Chem. 267:15459-15463 (1992)). Enzimas de alcohol deshidrogenasa de C. beijerinckü (Ismaiel et al., J.Bacteriol. 175:5097-5105 (1993)) y 7. brockii (Lamed et al., Biochem. J. 195:183-190 (1981); Peretz et al., Biochemistrv 28:6549-6555 (1989)) convierten acetona a isopropanol. La metil etil cetona reductasa, o alternativamente, 2-butanol deshidrogenasa, cataliza la reducción de MEK para formar 2-butanol. Enzimas de MEK reductasa ejemplares pueden ser encontradas en Rhodococcus ruber (Kosjek et al., Biotechnol Bioeng. 86:55-62 (2004)) y Pyrococcus furiosus (van der eí al., Eur. J. Biochem. 268:3062-3068 (2001)). 1.2.1. a Oxidorreductasa (aldehido a ácido): La oxidación de fenilacetaldehído a fenilacetato es catalizada por fenilacetaldehído deshidrogenasa (Etapa C de la Figura 1), una enzima en la clase EC 1.2.1. Enzimas de fenilacetaldehído deshidrogenases dependientes de NAD+ (EC 1.2.1.39) han sido caracterizadas en E. coli, Pseudomonas putida y Antirrhinum majus (Long et al., Plant J 59:256-265 (2009); Arias et al., Environ.Microbiol 10:413-432 (2008); Ferrandez eí al., FEBS Lett. 406:23-27 (1997)). Enzimas aldehido deshidrogenasas dependientes de NAD+- con alta actividad en fenilacetaldehído también han sido caracterizadas en mamíferos tales como Sos taurus, Rattus norvegicus y Homo sapiens (Klyosov, Biochemistry 35:4457-4467 (1996a); Lindahl eí al., J Biol.Chem. 259:11991-11996 (1984)). Dos aldehido deshidrogenasas encontradas en hígado humano, ALDH-1 y ALDH-2, tienen amplios rangos de sustrato para una variedad de aldehidos alifáticos, aromáticos y policíclicos con actividad demostrada en fenilacetaldehído (Klyosov, Biochemistry 35:4457-4467 (1996b)). La benzaldehído deshidrogenasa dependiente de NADP* de Pseudomonas putida codificada por badh también demostró actividad en fenilacetaldehído (Yeung et al., Biochim.Biophys.Acta 1784:1248-1255 (2008)). Enzimas aldehido deshidrogenasas dependientes de NAD+ con alta actividad en fenilacetaldehído también han sido caracterizadas en mamíferos tales como Sos taurus, Rattus norvegicus y Homo sapiens (Klyosov, Biochemistry 35:4457-4467 (1996a); Lindahl et al., J Biol.Chem. 259:11991-11996 (1984)). Dos aldehido deshidrogenasas encontradas en hígado humano, ALDH-1 y ALDH-2, tienen amplios rangos de sustrato para una variedad de aldehidos alifáticos, aromáticos y policíclicos con actividad demostrada en fenilacetaldehído (Klyosov, Biochemistry 35:4457-4467 (1996b)). 1.2.3.a Aldehido oxidasa: Una enzima aldehido oxidasa dependiente de 02 puede ser empleada para convertir fenilacetaldehído o fenilpiruvato a fenilacetato (Etapas C y F de la Figura 1). Las enzimas de fenilacetaldehído oxidasa convierten fenilacetaldehído, agua y 02 a fenilacetato y peróxido de hidrógeno. Enzimas de fenilacetaldehído oxidasa ejemplares se encuentran en Metilobacillus sp., Pseudomonas sp., Streptomyces moderatus, Cavia porcellus y Zea mays (Koshiba et al., Plant Physiol 110:781-789 (1996)). Las dos aldehido oxidasas que contienen flavina y molibdeno de Zea mays son codificadas por zmAO-1 y zmAO-2 (Sekimoto et al., J Biol.Chem. 272:15280-15285 (1997)). La actividad de fenilacetaldehído oxidasa también se ha demostrado en la indol-3-acetaldehído oxidasa (EC 1.2.3.7) de Avena sativa, aunque los genes asociados con esta actividad no han sido identificados a la fecha y no portan homología significante a los genes de aldehido oxidasa de Zea mays (Rajagopal, Physiol.Plant 24:272-281 (1971)). Fenilacetaldehído oxidasas adicionales pueden ser inferidas por homología de secuencia a los genes de Z. mays y se muestran abajo.
Enzimas de fenilpiruvato oxidasa convierten fenilpiruvato y 02 a fenilacetato, C02 y agua (Etapa F de la Figura 1). La 4-hídroxifenilpiruvato oxidasa (EC 1.2.3.13) de Arthrobacter globiformis se mostró que cataliza la oxidación de fenilpiruvato dependiente de 02 un fenilacetato durante el catabolismo de tírosina (Blakley, Can.J Microbiol 23:1128-1139 (1977)). Esta actividad enzimática se demostró en extractos celulares; sin embargo, el gene que codifica esta enzima no se ha identificado a la fecha. 1.4.1.a Oxidorreductasa (desanimación): La oxidación de fenilalanina dependiente de NAD(P)+ a fenilpiruvato (Etapa A de la Figura 1) es catalizada por fenilalanina oxidorreductasa (desanimación), también llamada fenilalanina deshidrogenasa. Las enzimas de fenilalanina deshidrogenases dependientes de NAD+ codificadas por genes pdh han sido caracterizadas en Bacillus badius, Lysinibacillus sphaericus y Thermoactinomyces intermedius (Yamada et al., Biosci.Biotechnol.Biochem. 59:1994-1995 (1995); Takada ef al., J Biochem. 109:371-376 (1991); Okazaki ef al., Gene 63:337-341 (1988)). 2.3.1.a Aciltransferasa (fosfotransacilasa): Una enzima con actividad de fosfotransbenzoilasa se requiere para fosforilar 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA a [(3-oxo-3-fenilpropionil)oxi]fosfoato (Etapa F de la Figura 3). Una enzima con esta actividad no ha sido caracterizada a la fecha. Aciltransferasas de transferencia de fosfato ejemplares incluyen fosfotransacetilasa (EC 2.3.1.8) y fosfotransbutirilasa (EC 2.3.1.19). El gene pta de E. coli codifica a fosfotransacetilasa que convierte reversiblemente acetil-CoA en acetil-fosfato (Suzuki, Biochim.Biophys.Acta 191:559-569 (1969)). Las enzimas fosfotransacetilasas en varios organismos también catalizan la conversión de propionil-CoA a propionilfosfato. Tales enzimas incluyen los productos del gene pta de E. coli (Hesslinger et al., Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)), Bacillus subtilis (Rado et al., Biochim.Biophys.Acta 321:114-125 (1973)), Clostridium kluyveri (Stadtman, 1:596-599 (1955)), y Thermotoga marítima (Bock et al., J Bacteriol. 181:1861-1867 (1999)). el gene ptb de C. acetobutilicum codifica fosfotransbutirilasa, una enzima que convierte reversiblemente butiril-CoA en butiril-fosfato (Wiesenborn et al., Appl Environ.Microbiol 55:317-322 (1989); Walter et al., Gene 134:107-111 (1993)). Genes ptb adicionales se encuentran en bacterias que producen butirato L2-50 (Louis et al., J. Bacteriol. 186:2099-2106 (2004)) y Bacillus megaterium (Vázquez et al., Curr.Microbiol 42:345-349 (2001)). 2.3.1. b Beta-cetotiolasa. Una enzima beta-cetotiolasa se requiere para convertir benzoil-CoA y acetil-CoA a 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA (Etapa A de la Figura 3). Esta transformación no se sabe que ocurra naturalmente. Enzimas beta-cetotiolasa adecuadas incluyen 3-oxoadipil-CoA tiolasa (EC 2.3.1.174), 3-oxopimeloil-CoA:glutaril-CoA aciltransferasa (EC 2.3.1.16), 3-oxovaleril-CoA tiolasa y acetoacetil-CoA tiolasa (EC 2.1.3.9). 3-Oxoadipil-CoA tiolasa (EC 2.3.1.174) convierte beta-cetoadipil-CoA a succinil-CoA y acetil-CoA, y es una enzima clave para la trayectoria de beta-cetoadipato para degradación de compuestos aromáticos. La enzima es extendida en bacterias y hongos del suelo que incluyen Pseudomonas putida (Harwood et al., J Bacteriol. 176:6479-6488 (1994)) y Acinetobacter calcoaceticus (Doten et al., J Bacteriol. 169:3168-3174 (1987)). Los productos del gene codificados por pcaF en la cepa de Pseudomonas B13 (Kaschabek et al., J Bacteriol. 184:207-215 (2002)), phaD en Pseudomonas putida U (Olivera et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S. A 95:6419-6424 (1998)), paaE en Pseudomonas fluorescens ST (Di et al., Arch.Microbiol 188:117-125 (2007)), y paaJ de E. coli (Nogales et al., Microbiology 153:357-365 (2007)) también catalizan esta transformación. Varias beta-cetotiolasas exhiben actividades significantes y selectivas en la dirección de formación de oxoadipil-CoA que incluye bkt de Pseudomonas putida, pcaF y bkt de Pseudomonas aeruginosa PA01, bkt de Burkholderia ambifaria AMMD, paaJ de E. coli, y phaD de P. putida. 3-Oxopimeloil-CoA tiolasa catalizan la condensación de glutaril-CoA y acetil-CoA en 3-oxopimeloil-CoA (EC 2.3.1.16). Una enzima que cataliza esta transformación es codificada por genes bktB y bktC en Ralstonia eutropha (anteriormente conocida como Alcaligenes eutrophus) (Slater et al., J. Bacterio!. 180:1979-1987 (1998); Haywood et al., FEMS Microbiology Letters 52:91-96 (1988)). La secuencia de la proteína BktB se conoce pero la secuencia de la proteína BktC no se ha reportado a la fecha. El operón pim de Rhodopseudomonas palustris también codifica una beta-cetotiolasa, codificada por pimB, predicha por catalizar esta transformación en la dirección degradativa durante la degradación de benzoil-CoA (Harrison et al., Microbiology 151:727-736 5 (2005)). Una enzima beta-cetotiolasa en S. aciditrophicus se identificó por homología de secuencia a bktB (43% de identidad, valor e = 1e-93). l-> Enzimas de beta-cetotiolasa que catalizan la formación de 3-oxovalerato de acetil-CoA y propionil-CoA también pueden ser capaces de catalizar la formación de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA. Zoogloea ramigera posee dos cetotiolasas que pueden formar ß- cetovaleril-CoA de propionil-CoA y acetil-CoA y R. eutropha tiene una ß- 0 oxidación de cetotiolasa que es también capaz de catalizar esta transformación (Gruys ef al., (1999)). Las secuencias de estos genes o sus proteínas traducidas no han sido reportadas, pero varios genes en R. eutropha, Z. ramigera, u otros organismos pueden ser identificados con base en la homología de secuencia a bktB de R. eutropha y se listan 5 abajo.
Enzimas adicionales incluyen beta-cetotiolasas que se conocen por convertir dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA (EC 2.1.3.9). Enzimas de acetoacetil-CoA tiolasa ejemplares incluyen los productos del gene de atoB de E. coli (Martin eí al., Nat.Biotechnol 21:796-802 (2003)), thIA y thlB de C. acetobutilicum (Hanai eí al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Winzer eí al., J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541 (2000)), y ERG10 de S. cerevisiae (Hiser eí al., J.Biol.Chem. 269:31383-31389 (1994)). 2.6.1.a Aminotransferasa: Una fenilalanina aminotransferasa o transaminasa en la clase EC 2.6.1 se requiere para convertir fenilalanina a fenilpiruvato (Etapa A de la Figura 1). Una variedad de enzimas catalizan esta transformación, que incluyen fenilacetato aminotransferasa, aminotransferasa de aminoácido aromático, triptofano aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, aminotransferasa de aminoácido de cadena ramificada y otras. Enzimas con actividad de fenilalanina aminotransferasa en E. coli son codificadas por tyrB, ilvE y aspC (Lee-Peng et al., J Bacteriol. 139:339-345 (1979); Powell et al., Eur.J Biochem. 87:391-400 (1978)). Enzimas ejemplares con actividad de fenilalanina aminotransferasa en otros organismos incluyen la aminotransferasa de aminoácido aromático de S. cerevisiae codificada por AR09 (Iraquí et al., Mol.Gen.Genet. 257:238-248 (1998)) y la triptofano aminotransferasa de Arabidopsis thaliana, codificada por TAA 1 (Tao et al., Cell 133:164-176 (2008)). 2.7.2.a Fosfotransferasa: Enzimas de fosfotransferasa en la clase EC 2.7.2 convierten ácidos carboxílicos a ácidos fosfonicos con hidrólisis concurrente de un ATP. En la Etapa G de la Figura 3, una fosfotransferasa se requiere para convertir [(3-oxo-3-fenilpropionil)oxi]fosfonato y ADP a benzoil-acetato y ATP. Una enzima con esta actividad exacta no ha sido caracterizada a la fecha. Enzimas ejemplares incluyen butirato quinasa (EC 2.7.2.7), isobutlrato quinasa (EC 2.7.2.14), aspartoquinasa (EC 2.7.2.4), acetato quinasa (EC 2.7.2.1) y gamma-glutamil quinasa (EC 2.7.2.11). Aspartoquinasa catalizan la fosforilación dependiente de ATP de aspartato y participa en la síntesis de varios aminoácidos. La enzima aspartoquinasa III en E. coli, codificada por lysC, tiene un amplio rango de sustrato que incluye el compuesto aromático éster 1-bencílico del ácido aspártico, y los residuos catalíticos involucrados en la especificidad del sustrato han sido elucidados (Keng et al., Arch.Biochem.Biophys. 335:73-81 (1996)). Dos quinasas adicionales en E. coli incluyen acetato quinasa y gamma-glutamil quinasa. La acetato quinasa de E. coli, codificada por ackA (Skarstedt et al., J.Biol.Chem. 251:6775-6783 (1976)), fosforila a propionato además de acetato (Hesslinger et al., Mol. Microbio! 27:477-492 (1998)). La gamma-glutamil quinasa de E. coli, codificada por proB (Smith et al., J.Bacteriol. 157:545-551 (1984)), fosforila el grupo de ácido carbónico gamma de glutamato. La butirato quinasa realiza la conversión reversible de butiril-fosfato a butirato durante la acidogénesis en C. acetobutilicum (Cary er al., Appl.Environ. Microbio! 56:1576-1583 (1990)). Esta enzima es codificada por cualquiera de los dos productos del gene buk (Huang et al., J Mol. Microbio! Biotechnol 2:33-38 (2000)). Otras enzimas de butirato quinasa se encuentran en C. butyricum y C. tetanomorphum (TWAROG et al., J Bacteriol. 86:112-117 (1963)). Una enzima relacionada, isobutirato quinasa de Thermotoga maritime, fue expresada en E. coli y cristalizada (Diao et al., J Bacteriol. 191:2521-2529 (2009); Diao et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 59:1100-1102 (2003)). 2.8.3.a CoA transferasa: CoA transferasas catalizan la transferencia reversible de una porción de CoA de una molécula a otra. La etapa B de la Figura 3 es catalizada por una enzima con actividad de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA transferasa. En esta transformación, benzoil-acetato se forma de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA por la transferencia del CoA a un aceptor de CoA tal como acetato, succinato u otros. Enzimas de CoA transferasas ejemplares que reaccionan con sustratos similares incluyen cinamoil-CoA transferasa (EC 2.8.3.17) y bencilsuccinil-CoA transferasa. Cinamoil-CoA transferasa, codificada por fldA en Clostridium sporogenes, transfiere una porción de CoA de cinamoil-CoA a una variedad de sustratos de ácido aromático que incluyen fenilacetato, 3-fenilpropionato y 4-fenilbutirato (Dickert et al., Eur.J Biochem. 267:3874-3884 (2000)). Bencilsuccinil-CoA transferasa utiliza succinato o maleato como el aceptor de CoA, formando bencilsuccinato de bencilsuccinil-CoA. Esta enzima se caracteriza en la dirección reversa en la desnitrificación de la bacteria Thauera aromática, donde es codificada por bbsEF (Leutwein et al., J Bacteriol. 183:4288-4295 (2001)).
Enzimas CoA transferasa adicionales con diversos rangos de sustrato incluyen succinil-CoA transferasa, 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, butiril-CoA transferasa, glutaconil-CoA transferasa y acetoacetil-CoA transferasa. Los productos del gene de catl , cat2, y cat3 de Clostridium kluyveri han sido mostrados por presentar actividad de succinil-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA, y butiril-CoA transferasa, respectivamente (Seedorf et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S. A 105:2128-2133 (2008); Sohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)). Actividades similares de CoA transferasa están también presentes en Trichomonas vaglnalis (van Grinsven et al., J.Biol.Chem. 283:1411-1418 (2008)) y Trypanosoma brucei (Riviere et al., J.Biol.Chem. 279:45337-45346 (2004)). La glutaconil-CoA-transferasa (EC 2.8.3.12) de la bacteria anaeróbica Acidaminococcus fermentans reacciona con glutaconil-CoA y 3-butenoil-CoA (Mack eí al., Eur.J.Biochem. 226:41-51 (1994)). Los genes que codifican esta enzima son gctA y gctB. Esta enzima presenta actividad reducida pero detectable con varios sustratos alternos que incluyen glutaril-CoA, 2-hidroxiglutaril-CoA, adipil-CoA, crotonil-CoA y acrilil-CoA (Buckel ef al., Eur.J Biochem. 118:315-321 (1981)). La enzima ha sido clonada y expresada en E. coli (Mack ef al., Eur.J. Biochem. 226:41-51 (1994)). La actividad de Glutaconato CoA-transferasa también se ha detectado en Clostridium sporosphaeroides y Clostridium symbiosum. Acetoacetil-CoA transferasa utiliza acetil-CoA como el donador de CoA. Esta enzima es codificada por los genes atoA (subunidad alfa) y atoD (subunidad beta) de E. coli (Korolev er al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 58:2116-2121 (2002); Vanderwinkel ef al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908 (1968)). Esta enzima tiene un amplio rango de sustrato (Sramek et al., Arch. Biochem. Biophys. 171:14-26 (1975)) y se ha mostrado por transferir la porción CoA de acetil-CoA a una variedad de sustratos, que incluyen isobutirato (Matthies ef al., Appl Environ. Microbio! 58:1435-1439 (1992)), valerato y butanoato (Vanderwinkel ef al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908 (1968)). Existen enzimas similares en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Duncan ef al., Appl. Environ. Microbiol 68:5186-5190 (2002)), Clostridium acetobutilicum (Cary ef al., Appl. Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990); Wiesenborn ef al., Appl. Environ. Microbiol 55:323-329 (1989)), y Clostridium saccharoperbutilacetonicum (Kosaka ef al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)). 3.1.2.a CoA hidrolasa: 3-Oxo-3-fenilpropionil-CoA puede ser hidrolizada a su ácido correspondiente por una CoA hidrolasa o tioesterasa en la clase EC 3.1.2 (Etapa B de la Figura 3). Tioésteres CoA ejemplares que hidrolizan sustratos aromáticos incluyen benzoil- CoA hidrolasa, 4-hidroxibenzoil-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.23) y fenilacetil-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.25). el gene orfl de Azoarcus evansii codifica una enzima con actividad de benzoil-CoA hidrolasa que participa en el metabolismo de benzoato (Ismailo, Arch.Microbiol 190:451-460 (2008)). Esta enzima, cuando es expresada heterólogamente en E. coli, demuestra actividad en un número de sustratos alternos. Enzimas adicionales de benzoil-CoA hidrolasa se identificaron en agrupamientos del gene de degradación de benzoato de Magnetospirillum magnetotacticum, Jannaschia sp. CCS1 y Sagittula stellata E-37 por similitud de secuencia (Ismailo, Arch.Microbiol 190:451-460 (2008)). La 4-hidroxibenzoil-CoA hidrolasa de Pseudomonas sp. CBS3 presenta actividad en los sustratos alternos benzoil-CoA y p-metilbenzoil-CoA, y ha sido expresada heterólogamente y caracterizada en E. coli (Song eí al., Bioorg.Chem. 35:1-10 (2007)). Enzimas adicionales con actividad de aril-CoA hidrolasa incluyen la palmitoil-CoA hidrolasa de Mycobacterium tuberculosis (Wang eí al., Chem.Biol. 14:543-551 (2007)) y la acil-CoA hidrolasa de E. coli codificada por entH (Guo et al., Biochemistry 48:1712-1722 (2009)).
Varias CoA hidrolasas adicionales con amplios rangos de sustratos son adecuadas para hidrolizar benzoil-CoA y/o p-metilbenzoil- CoA. Por ejemplo, la enzima codificada por acot12 de cerebro de Rattus norvegicus (Robinson et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 71:959-965 (1976)) puede reaccionar con butiril-CoA, hexanoil-CoA y malonil-CoA. La tioesterasa de ácido dicarboxílico humana, codificada por acote, presenta actividad en glutaril-CoA, adipil-CoA, suberil-CoA, sebacil-CoA, y dodecanodioil-CoA (Westin et al., J.Biol.Chem. 280:38125-38132 (2005)). El homólogo más cercano de E. coli a esta enzima, tesB, también puede hidrolizar un rango de CoA tiolésteres (Naggert er al., J Biol Chem 266:11044-11050 (1991)). Una enzima similar también ha sido caracterizada en el hígado de rata (Deana R., Biochem Int 26:767-773 (1992)). Enzimas adicionales con actividad de hidrolasa en E. coli incluyen ybgC, paal, y ybdB ( uznetsova, er al., FEMS Microbiol Rev, 2005, 29(2):263-279; Song er al., J Biol Chem, 2006, 281 (16): 11028-38). 4.1.1a. Carboxi-liasa: Enzimas descarboxilasas en la clase EC 4.1.1 son requeridas para catalizar varias transformaciones en la Figuras 1-3. La conversión de fenilpiruvato a fenilacetaldehído (Etapa B de la Figura 1) es catalizada por una ceto-ácido descarboxilasa. La descarboxilación de fenilacetato a tolueno (Etapa D de la Figura 1) es catalizada por una enzima con actividad de fenilacetato descarboxilasa. Una 3-oxoácido descarboxilasa se requiere para descarboxilar benzoil-acetato a acetofenona (Etapa C de la Figura 7). Las descarboxilasas (también conocidas como carboxi Masas) catalizan la pérdida de dióxido de carbono de un compuesto orgánico o un metabolito celular que posee una función de ácido carboxílico. Las descarboxilasas son prevalentes en la naturaleza y pueden requerir ya sea piruvato o fosfato piridoxal como un co-factor, aunque muchas requieren co-factores no unidos. Más de 50 enzimas descarboxilasas han sido reportadas y caracterizadas por métodos bioquímicos y/o analíticos.
Una fenilacetato descarboxilasa se requiere para catalizar la descarboxilación de fenilacetato a tolueno (Etapa D de la Figura 1). Tal actividad no se ha detectado en enzimas descarboxilasas caracterizadas a la fecha. Una enzima que cataliza una reacción similar es 4-hidroxifenilacetato descarboxilasa (EC 4.1.1.83), la cual naturalmente descarboxila 4-hidroxifenilacetato a p-cresol. Las enzimas 4-hidroxifenilacetato descarboxilasas caracterizadas de Clostridium difficile y Clostridium scatologenes están compuestas de dos subunidades y requieren activación por una enzima de activación específica (Yu et al., Biochemistry 45:9584-9592 (2006); Andrei ef al., Eur.J Biochem. 271:2225-2230 (2004)). Estas enzimas, codificadas por csdABC en C. scatologenes y hpdABC en C. difficile, han sido homólogamente expresadas en E. coli. Otra enzima adecuada es la arilmalonato descarboxilasa (EC 4.1.1.76) de Enterobacter cloacae, la cual tiene actividad en el sustrato estructuralmente relacionado, 2- fenilpropionato (Yatake et al., Appl.Microbiol Biotechnol. 78:793-799 (2008)). La secuencia de esta enzima está disponible en la publicación por Yatake ef al; sin embargo esta enzima no se le ha asignado un número de Acceso a GenBank a la fecha. Una enzima relacionada de Bordetella bronchiseptica (98% de identidad de aminoácido) codificada por AMDA_BORBR fue recientemente cristalizada (Kuettner ef al., J Mol.Biol. 377:386-394 (2008)).
La conversión de fenilpiruvato a fenilacetaldehído (Figura 1 , la etapa B) es catalizada por una enzima con actividad de fenilpiruvato descarboxilasa. Varias enzimas de ceto-ácido descarboxilasas han demostrado actividad en fenilpiruvato que incluye fenilpiruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.43), piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1), alfa- cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada (EC 4.1.1.72) y bencilformiato descarboxilasa (EC 4.1.1.7). Una fenilpiruvato descarboxilasa ejemplar es codificada por el gene ipdC de Azospirillum brasilense (Spaepen eí al., J Bacterio!. 189:7626-7633 (2007)). Fenilpiruvato es el sustrato favorecido de esta enzima. Las enzimas de Saccharomyces cerevisiae codificadas por los genes PDC1, PDC5, PDC6 y ARO10 también presentan actividad de fenilpiruvato descarboxilasa (Dickinson eí al., J Biol.Chem. 278:8028-8034 (2003)). Otras enzimas con actividad de fenilpiruvato descarboxilasa incluyen la enzima piruvato deshidrogenasa de Zygosaccharomyces bisporus (Neuser eí al., Biol.Chem. 381:349-353 (2000)), las enzimas de 2- oxoácido descarboxilasas de cadena ramificada de Mycobacterium tuberculosis H37Rv y Lactococcus lactis (Gocke eí al., Adv. Synth. Catal. 349:1425-1435 (2007); Werther eí al., J Biol.Chem. 283:5344-5354 (2008)), y la enzima de bencilformiato descarboxilasa de Pseudomonas putida (Siegert eí al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). Otra enzima adecuada es la piruvato descarboxilasa de Zymomonas mobilus, ya que esta enzima tiene un amplio rango de sustrato y ha sido un sujeto de estudios de ingeniería dirigidos para alterar la especificidad del sustrato (Siegert eí al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)).
La descarboxilación de benzoil-acetato a acetofenona (Etapa C de la Figura 3) es catalizada por una enzima con actividad de benzoil-acetato descarboxilasa. Una enzima dependiente de ATP con esta actividad, acetofenona carboxilasa, opera en la dirección reversa (carboxilación) durante la degradación de etilbenceno en Aromatoleum aromaticum EbN1 (Rabus et al., Arch. Microbio! 178:506-516 (2002)). Esta enzima está compuesta de cinco subunidades codificadas por apd- 5 y es dependiente de ATP (formando AMP) en la dirección de carboxilación. Enzimas similares se encuentran por homología de secuencia en Azotobacter vinelandii y Rubrobacter xilanophilus.
Alternativamente, una 3-oxoácido descarboxilasa puede convertir benzoil-acetato a acetofenona. Una 3-oxoácido descarboxilasa ejemplar es acetoacetato descarboxilasa (EC 4.1.1.4), la cual naturalmente convierte acetoacetato en acetona y C02. La enzima de Clostridium acetobutilicum, codificada por adc, tiene un amplio rango de sustrato y se ha mostrado por catalizar la descarboxilacion deseada de benzoil-acetato a acetofenona (Rozzel et al., J.Am.Chem.Soc. 106:4937- 4941 (1984); Benner et al., J.Am.Chem.Soc. 103:993-994 (1981); Autor et al., J Biol.Chem. 245:5214-5222 (1970)). Una acetoacetato descarboxilasa relacionada ha sido caracterizada en Clostridium beijerinckii (Ravagnani et al., Mol. Microbio! 37:1172-1185 (2000)). La acetoacetato descarboxilasa de Bacillus polymyxa, caracterizada en extractos libres de célula, también tiene una amplia especificidad de sustrato para 3-ceto ácidos y puede descarboxilar 3-oxopentanoato (Matiasek et al., Curr.Microbiol 42:276-281 (2001)). el gene que codifica esta enzima no se ha identificado a la fecha y la secuencia genómica de B. polymyxa aún no está disponible. Otro adc se encuentra en Clostridium saccharoperbutilacetonicum ( osaka, ef al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)). Genes adicionales en otros organismos, que incluyen Clostridium botulinum y Bacillus amiloliquefaciens FZB42, pueden ser inferidos por homología de secuencia. 4.1.99.a Descarbonilasa: Una enzima de descarbonilasa se requiere para convertir fenilacetaldehído a tolueno (Etapa E de la Figura 1). Enzimas de descarbonilasa catalizan la etapa final de la biosíntesis de alcano en plantas, mamíferos, insectos y bacterias (Dennis et al., Arch.Biochem.Biophys. 287:268-275 (1991)). Descarbonilasas no oxidativas transforman aldehidos en aléanos con la liberación concurrente de CO, mientras las descarboxilasas oxidativas son enzimas del citocromo P450 que utilizan NADPH y 02 como cofactores y liberan C02, agua y NADP\ Enzimas ejemplares de descarbonilasa incluyen octadecanal descarbonilasa (EC 4.1.99.5), esterol desaturasa y aldehido descarbonilasa graso. Una descarbonilasa que contiene cobalto-porfirina se purificó y caracterizó en las algas Botryococcus braunii; sin embargo, ningún gene está asociado con esta actividad a la fecha (Dennis ef al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89:5306-5310 (1992)). Una descarbonilasa que contiene cobre de Pisum sativum también se purificó y caracterizó (Schneider-Belhaddad ef al., Arch.Biochem.Biophys. 377:341-349 (2000)). el gene CER1 de Arabidopsis thaliana codifica una descarbonilasa de ácido graso involucrada en la formación de cera epicuticular (US 6,437,218). Las descarbonilasas de ácido graso adicionales se encuentran en Medicago truncatula, Vitis vinifera y Oryza sativa (Solicitud de Patente Estadounidense 2009/0061493).
Enzimas oxidativas de descarbonilasa son codificadas por los productos del gene CYP4G2v1 y CYP4G1 de Musca domestica y Drosophila melanogaster (Solicitud de Patente Estadounidense 2010/0136595). Enzimas adicionales con actividad oxidativa de descarbonilasa pueden ser identificadas en otros organismos, por ejemplo Mamestra brassicae, Helicoverpa zea y Acyrthosiphon pisum, por homología de secuencia. 4.1.99.D Liasa: La conversión de fenilalanina a benceno en la Figura 2 es catalizada por una enzima con actividad de fenilalanina benceno-Masa. La nueva actividad requerida es similar a aquella de tirosina fenol-liasa (EC 4.1.99.2), la cual reversiblemente interconvierte tirosina y fenol, con liberación concomitante de piruvato y amoníaco. La enzima de Pantoea agglomerans (anteriormente Erwinia herbicola), codificada por tutA, reacciona con un rango de derivados sustituidos que incluyen dihidroxifenilalanina (Foor et al., Appl.Environ.Microbiol 59:3070-3075 (1993)). Esta enzima fue heterólogamente expresada en E. coli y utilizada para sintetizar dihidroxifenilalanina de catecol, piruvato y amoníaco. Enzimas adicionales de tirosina fenol-liasa incluidas se encuentran en Citrobacter intermedius (Nagasawa et al., Eur.J Biochem. 117:33-40 (1981)), Citrobacter freundii (Phillips et al., Biochim.Biophys.Acta 1647:167-172 (2003)) y Symbiobacterium thermophilum (Hirahara et al., Appl.Microbiol Biotechnol. 39:341-346 (1993)). La enzima Citrobacter freundii ha sido estructuralmente caracterizada y se identificaron residuos involucrados en el enlace del sustrato (Milic et al., J Biol.Chem. 283:29206-29214 (2008)). La fenilalanina no es un sustrato natural de cualquier enzima de tirosina fenol-Masa caracterizada; preferentemente se ha mostrado por actuar como inhibidor de algunas enzimas. La evolución dirigida u otros procedimientos de ingeniería de proteína bien conocidos en la técnica probablemente serán requeridos para ganar esta actividad y mejorar el 5 desempeño. l-> Una enzima que cataliza una reacción similar es triptofano indol-liasa (EC 4.1.99.1), también llamada triptofanasa, la cual convierte triptofano y agua a indol y piruvato. Enzimas ejemplares de triptofano indol-liasa incluyen los productos del gene tnaA de E. coli, tnal de Symbiobacterium thermophilum y tnaA de Enterobacter aerogenes 0 (Kogan et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 60:2073-2075 (2004); Kawasaki et al., Biosci.Biotechnol.Biochem. 59:1938-1943 (1995); Suzuki et al., Agrie. Biol.Chem. 55:3059-3066 (1991)). 4.2.1. a Deshidratase: La Etapa E de la Figura 3 emplea una deshidratase (EC 4.1.2.-) para convertir 1 -feniletanol a estireno. Enzimas ejemplares para catalizar esta reacción incluyen fumarasa (EC 4.2.1.2), citramalato hidratasa (EC 4.2.1.34) y dimetilmaleato hidratase (EC 4.2.1.85). Enzimas de fumarasa naturalmente catalizan la deshidratación reversible de malato a fumarato. Aunque la adecuabilidad de 1 -feniletanol como un sustrato para enzimas de fumarasa no se ha descrito en la literatura a la fecha, una riqueza de la información estructural está disponible para esta enzima y los investigadores han diseñado por ingeniería de manera exitosa la enzima para alterar la actividad, inhibición y localización (Weaver, 61:1395-1401 (2005)). E. coli tiene tres fumarasas: FumA, FumB, y FumC que son reguladas por condiciones de crecimiento. FumB es sensible al oxígeno y solamente activa bajo condiciones anaeróbicas. FumA es activa bajo condiciones microanaeróbicas, y FumC es la única enzima activa durante el crecimiento aeróbico (Tseng et al., 183:461-467 (2001); Woods et al., 954:14-26 (1988); Guest et al., J Gen Microbio! 131:2971-2984 (1985)). Enzimas adicionales se encuentran en Campilobacter jejuni (Smith et al., Int.J Biochem.Cell Biol 31:961-975 (1999)), Thermus thermophilus (Mizobata er al., Arch.Biochem.Biophys. 355:49-55 (1998)) y Rattus norvegicus (Kobayashi et al., 89:1923-1931 (1981)). Enzimas similares con alta homología de secuencia incluyen fum1 de Arabidopsis thaliana y fumC de Corynebacterium glutamicum. La fumarasa mmcBC de Pelotomaculum thermopropionicum es otra clase de fumarasa con dos subunidades (Shimoyama et al., 270:207-213 (2007)). Citramalato hidroliasa naturalmente deshidrata 2-metilmalato a mesaconato. Esta enzima ha sido estudiada en Methanocaldococcus jannaschii en el contexto de la trayectoria de piruvato a 2-oxobutanoato, donde se ha mostrado por tener una amplia especificidad de sustrato (Drevland ef al., J Bacterio!. 189:4391-4400 (2007)). Esta actividad enzimática también se detectó en Clostridium tetanomorphum, Morganella morganii, Citrobacter amalonaticus donde se piensa participa en la degradación de glutamato (Kato y Asano, Arch. Microbiol 168:457-463 (1997)). La secuencia de proteína M. jannaschii no porta homología significantes a genes en estos organismos. La dimetilmaleato hidratasa es una enzima sensible al oxígeno y dependiente de Fe2+ reversible en la familia aconitasa que hidrata dimetilmaleato para formar (2R,3S)-2,3-dimetilmalato. Esta enzima es codificada por dmdAB en Eubacterium barkeri (Alhapel et al., supra; Kollmann-Koch ef al., Hoppe Seilers.Z.Physiol Chem. 365:847-857 (1984)). 6.2.1. a Ácido-tiol ligasa: La conversión de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA a benzoil-acetato (Etapa B de la Figura 3) puede ser catalizada por una CoA sintetasa o Ácido-tiol ligasa en la clase EC 6.2.1. Las CoA sintetasas que forman ATP que catalizan esta transformación exacta no han sido caracterizadas a la fecha; sin embargo, varias enzimas con amplias especificidades de sustrato se han descrito en la literatura. La acetil-CoA sintetasa que forma ADP (ACD, EC 6.2.1.13) de Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1211, se mostró por operar en una variedad de sustratos de cadena lineal y ramificada que incluyen isobutirato, isopentanoato, y fumarato (Musfeldt et al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). Un segundo ACD reversible en Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1983, también se mostró por tener un amplio rango de sustrato con alta actividad en compuestos aromáticos fenilacetato e indolacetato (Musfeldt et al., supra). La enzima de Haloarcula marismortui, anotada como una succinil-CoA sintetasa, acepta propionato, butirato y ácidos de cadena ramificada (isovalerato e isobutirato) como sustratos, y se mostró por operar en las direcciones hacia adelante y hacia atrás (Brasen et al., Arch. Microbio! 182:277-287 (2004)). La ACD codificada por PAE3250 de crenarchaeon hipertermofílica de Pyrobaculum aerophilum mostró el rango de sustrato más amplio de todas las ACDs caracterizadas, que reaccionan con acetil-CoA, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetil-CoA (Brasen y Schonheit, Arch.Microbiol 182:277-287 (2004)). La evolución dirigida o ingeniería puede ser usada para modificar esta enzima para operar a la temperatura fisiológica el organismo hospedero. Las enzimas de A. fulgidus, H. marismortui y P. aerophilum todas han sido clonadas, funcionalmente expresadas, y caracterizadas en E. coli (Brasen y Schonheit, Arch.Microbiol 182:277-287 (2004); Musfeldt y Schonheit, J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). Una enzima adicional es codificada por sucCD en E. coli, la cual naturalmente catalizan la formación de succinil-CoA de succinato con el consumo concomitante de una ATP, una reacción la cual es reversible in vivo (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)). La acíl CoA ligasa de Pseudomonas putida ha sido demostrada por funcionar en varios sustratos alifáticos que incluyen ácidos acético, propiónico, butírico, valérico, hexanoico, heptanoico y octanoico y en compuestos aromáticos tales como ácidos fenilacético y fenoxiacético (Fernandez-Valverde ef al., Appl.Environ.Microbiol. 59:1149-1154 (1993)). Una enzima relacionada, malonil CoA sintetasa (6.3.4.9) de Rhizobium leguminosarum podría convertir varios diácidos, es decir, etil-, propil-, alil-, isopropil-, dimetil-, ciclopropil-, ciclopropilmetileno-, ciclobutil-, y bencil-malonato en sus monotioésteres correspondientes (Pohl et al., J.Am.Chem.Soc. 123:5822-5823 (2001)). emplo II Trayectorias a 1 ,3-butadieno de Isómeros de Muconato Este ejemplo muestra trayectorias de isómeros de muconato 1 ,3-butadieno.
La Figura 4 muestra la conversión de isómeros de muconato a 1 ,3-butad¡eno por enzimas descarboxilasas. Cis.cis-muconato, cis.trans-muconato o trans.trans-muconato son primero descarboxilados a ya sea cis-2,4-pentadienoato o trans-2,4-pentadienoato (Etapas A, B, C y D de la Figura 4). 2,4-Pentadienoato es subsecuentemente descarboxilado para formar 1 ,3-butadieno (Etapas E, F de la Figura 4).
Se entiende que la descarboxilación de cualquier isómero de muconato puede servir como parte de una trayectoria a 1 ,3-butadieno. La producción biológica de cis.cis-muconato es bien conocida en la técnica (Draths y Frost. J Am Chem Soc. 116:399-400 (1994); Niu et al. Biotechnol Prog. 18:201-211 (2002); Bang y Choi. J Ferm Bioeng. 79(4):381-383 (1995)). Los isómeros de muconato pueden ser interconvertidos por las enzimas de muconato isomerasa en la clase EC 5.2.1.
Se entiende además que la descarboxilación de cualquier isómero de 2,4-pentadienoato formará 1 ,3-butadieno. Los isómeros de 2,4-pentadienoato pueden alternativamente ser formados de materiales de partida distintos de muconato (por ejemplo, introducción de un segundo enlace doble vía deshidrogenación de pent-2-enoato o pent-4-enoato; remoción de CoA de 2,4-pentadienoil-CoA vía una hidrolasa, sintetasa, o transferasa, deshidrogenación de 2,4-pentadienal o 2,4-pentadienol vía una aldehido o aldehido/alcohol deshidrogenase, respectivamente). Los isómeros de 2,4-pentadienoato pueden ser interconvertidos por enzimas isomerasas en la clase EC: 5.2.1.
Numerosas enzimas descarboxilasas han sido caracterizadas y mostradas para descarboxilar sustratos estructuralmente similares a isómeros de muconato o 2,4-pentadienoato. Enzimas ejemplares incluyen descarboxilasa de ácido sórbico, aconitato descarboxilasa (EC 4.1.1.16), 4-oxalocrotonato descarboxilasa (EC 4.1.1.77), cinamato descarboxilasa y descarboxilasa de ácido ferúlico. Estas enzimas son aplicables para uso en la presente invención para descarboxilar muconato y/o 2,4-pentadienoato como se muestra en la Figura 4.
Una enzima descarboxilasa con función estrechamente relacionada es descarboxilasa de ácido sórbico la cual convierte ácido sórbico a 1 ,3-pentadieno. La descarboxilación de ácido sórbico por Aspergillus niger requiere tres genes: padA1, ohbA1, y sdrA (Plumridge et al. Fung. Genet. Bio, 47:683-692 (2010). PadA1 es anotada como una descarboxilasa de ácido fenilacrílico, ohbA1 es una descarboxilasa putativa de ácido 4-hidroxibenzoico, y sdrA es un regulador de descarboxilasa de ácido sórbico. Especies adicionales también se han mostrado por descarboxilar ácido sórbico que incluye varias especies fúngicas y de levadura (Kinderlerler y Hatton, Food Addit Contam., 7(5):657-69 (1990); Casas et al., Int J Food Micro., 94(1):93-96 (2004); Pinches y Apps, Int. J. Food Microbiol. 116: 182-185 (2007)). Por ejemplo, Aspergillus oryzae y Neosartorya fischeri se han mostrado por descarboxilar ácido sórbico y tener homólogos cercanos a padA1, ohbA1, y sdrA.
Aconitato descarboxilasa es otra enzima útil para esta invención. Esta enzima cataliza la etapa final en la biosíntesis de ¡taconato en una cepa de Candida y también en el hongo filamentoso Aspergillus terreus. (Bonnarme et al. J Bacterio!. 177:3573-3578 (1995); Willke y Vorlop, Appl Microbio!. Biotechnol 56:289-295 (2001)). La aconitato descarboxilasa ha sido purificada y caracterizada de Aspergillus terreus. (Dwiarti et al., J. Biosci. Bioeng. 94(1): 29-33 (2002)) el gene y secuencia de proteína para la enzima de descarboxilasa de ácido cis-aconítico (CAD) fueron reportados previamente (EP 2017344 A1; WO 2009/014437 A1), junto con varios homólogos cercanos listados en la tabla siguiente. 4-Oxalocronato descarboxilasa cataliza la descarboxilacion de 4-oxalocrotonato a 2-oxopentanoato. Esta enzima ha sido aislada de numerosos organismos y caracterizada. Genes que codifican esta enzima incluyen dmpH y dmpE en Pseudomonas sp. (cepa 600) (Shingler ef al., 174:711-724 (1992)), xilll y xillll de Pseudomonas putida (Kato eí al., Arch.Microbiol 168:457-463 (1997); Stanley et al., Biochemistry 39:3514 (2000); Lian et al., J.Am.Chem.Soc. 116:10403-10411 (1994)) y Reut_B5691 y Reut_B5692 de Ralstonia eutropha JMP134 (Hughes et al., 158:79-83 (1984)). Los genes que codifican la enzima de Pseudomonas sp. (cepa 600) se han clonado y expresado en E. coli (Shingler ef al., 174:711-724 (1992)).
Finalmente, una clase de descarboxilasas ha sido caracterizada que cataliza la conversión de cinamato (fenilacrilato) y derivados de cinamato sustituidos a sus derivados de estireno correspondientes. Estas enzimas son comunes en una variedad de organismos y genes específicos que codifican estas enzimas que se han clonado y expresado en E. coli incluyen: pad 1 de Saccharomyces cerevisae (Clausen et al., Gene 142:107-112 (1994)), pdc de Lactobacillus plantarum (Barthelmebs ef a/., 67:1063-1069 (2001); Qi ef al., Metab Eng 9:268-276 (2007); Rodríguez ef a/., J. Agrie. Food Chem. 56:3068-3072 (2008)), pofK (pad) de Klebsiella oxytoca (Uchiyama ef al., Biosci.Biotechnol.Biochem. 72:116-123 (2008); Hashidoko ef al., Biosci.Biotech.Biochem. 58:217-218 (1994)), Pedicoccus pentosaceus (Barthelmebs ef al., 67:1063-1069 (2001)), y padC de Bacillus subtilis y Bacillus pumilus (Shingler ef al., 174:711-724 (1992)). Una descarboxilasa de ácido ferúlico de Pseudomonas fluorescens también ha sido purificada y caracterizada (Huang et al., J.Bacteriol. 176:5912- 5918 (1994)). Enzimas en esta clase son estables y no requieren ya sea co-factores exógenos o internamente unidos, de este modo haciendo estas enzimas idealmente adecuadas para biotransformaciones (Sariaslani, Annu.Rev.Microbiol. 61:51-69 (2007)).
Cada una de las descarboxilasas listadas anteriormente representa una enzima adecuada posible para las transformaciones deseadas mostradas en la Figura 4. Si la actividad o productividad deseada de la enzima no se observa en las conversiones deseadas (por ejemplo, muconato a 2,4-pentadienoato, 2,4-pentadienoato a butadieno), las enzimas descarboxilasas pueden ser evolucionadas usando métodos de ingeniería de proteína conocidos por lograr el desempeño requerido. De manera importante, se mostró a través del uso de enzimas quiméricas que la región C-terminal de descarboxilasas parece ser responsable por especificidad del sustrato (Barthelmebs, L; Divies, C; Cavin, J.-F. 2001. Expression in Escherichia coli of Native and Chímeric Fenolic Acid Decarboxilases with Modified Enzymatic Activities and Method for Screening Recombinant E. coli Strains Expressing These Enzymes, Appl. Environ. Microbiol. 67, 1063-1069.). Por consiguiente, experimentos de evolución dirigida para ampliar la especificidad de descarboxilasas para ganar actividad con muconato o 2,4-pentadienoato pueden ser enfocados en la región C-terminal de estas enzimas.
Algunas de las descarboxilasas requeridas para catalizar las transformaciones en la Figura 4 pueden presentar actividad superior en isómeros específicos de muconato o 2,4-pentadienoato. Las enzimas de isomerasa pueden ser aplicadas para convertir isómeros menos deseables de muconato y 2,4-pentadienoato en isómeros más deseables para la descarboxilación. Isomerasas ejemplares que catalizan transformaciones similares y de este modo representan enzimas adecuadas para esta invención incluyen maleato cis-trans isomerasa (EC 5.2.1.1), maleilacetona cis-trans isomerasa (EC 5.2.1.2) e cis-trans isomerasa de ácido graso. Maleato cis-trans isomerasa convierte fumarato a maleato. Esta enzima es codificada por el gene maiA de Alcaligenes faecalis (Hatakeyama, et al., 1997, Gene Cloning and Characterization of Maléate cis-trans Isomerase of Alcaligenes faecalis, Biochem. Biophys. Research Comm. 239, 74-79) o Serratia marcescens (Hatakeyama et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:1477-1485 (2000)). Genes similares que pueden ser identificados por homología de secuencia incluyen aquellos de Geobacillus stearothermophilus, Ralstonia pickettii 12D, y Ralstonia eutropha H16. Enzimas de isomerasa adicionales de maleato cis-trans son codificadas por las enzimas cuyas secuencias de aminoácido son proporcionadas como ID 1 a 4 de secuencias en ref (Mukouyama et al., Patente Estadounidense 6,133,014). Maleilacetona cis, frans-isomerasa cataliza la conversión de 4-maleil-acetoacetato a 4-fumaril-acetilacetato, una conversión cis a trans. Esta enzima es codificada por maiA en Pseudomonas aeruginosa (Fernandez-Canon et al., J Biol.Chem. 273:329-337 (1998))) y Vibrio cholera (Seltzer, J Biol.Chem. 248:215-222 (1973)). Una enzima similar se identificó por homología de secuencia en E. coli 0157. El producto del gene cti cataliza la conversión de ácidos grasos insaturados cis (UFA) a trans- UFA. La enzima ha sido caracterizada en P. putida (Junker et al., J Bacteriol. 181:5693-5700 (1999)). Enzimas similares se encuentran en Shewanella sp. MR-4 y Vibrio cholerae.
Ejemplo III Trayectoria Ejemplar para producir (2-Hidroxi-3-metil-4- oxobutoxi)fosfonato Este ejemplo describe una trayectoria ejemplar para producir (2-h¡droxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato (2H3M40P) precursor de ácido tereftálico (PTA).
El precursor a las trayectorias de p-toluato y PTA es 2H3M40P. Este químico puede ser derivado de metabolitos centrales gliceraldehído-3-fosfato (G3P) y piruvato en tres etapas enzimáticas como se muestra en la Figura 5. Las primeras dos etapas son nativas a E. coli y otros organismos que utilizan la trayectoria de metileritritol fosfato (sin-mevalonato) para la biosíntesis isoprenoide. El piruvato y G3P son primero condensados para formar 1 -desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) por DXP sintasa. El reacomodo y reducción subsecuente de la estructura de carbono es catalizada por reductoisomerasa de DXP. Finalmente, una nueva diol deshidratasa transforma 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato al precursor de p-toluato 2H3M40P.
A. 1- Desoxixilulosa-5-fosfato (DXP) sintasa, Piruvato y G3P son condensados para formar DXP por DXP sintasa (EC 2.2.1.7). Esta enzima cataliza la primera etapa en la trayectoria sin mevalonato de biosíntesis de isoprenoide. La enzima requiere tiamina difosfato como un cofactor, y también requiere FAD reducida, aunque no existe un cambio rédox puro. Una estructura cristalina de la enzima de E. coli está disponible (Xiang eí al., J. Biol. Chem. 282:2676-2682 (2007)). Otras enzimas han sido clonadas y caracterizadas en M. tuberculosis (Bailey et al., Glycobiology 12:813-820 (2002) y Agrobacterium tumefaciens (Lee eí al., J. Biotechnol. 128:555-566 (2007)). Enzimas DXP sintasa de B. subtilis y Synechocystis sp. PCC 6803 fueron clonadas en E. coli (Harker y Bramley, FEBS Lett. 448:115-119 (1999)).
B. 1-Desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (EC 1.1.1.267). La reducción y reacomodo dependiente de NAD(P)H- de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (DXP) una 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato es catalizada por DXP reductoisomerasa (DXR, EC 1.1.1.267) en la segunda etapa de la trayectoria sin mevalonato para biosíntesis isoprenoide. La enzima de E. coli dependiente de NADPH es codificada por dxr (Takahashi eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:9879-9884 (1998)). Una enzima recombinante de Arabidopsis thaliana fue funcionalmente expresada en E. coli (Carretero-Paulet et al., Plant Physiol. 129:1581-1591 (2002)). Enzimas DXR de Zymomonas mobilis y Mycobacterium tuberculosis han sido caracterizada y las estructuras cristalinas están disponibles (Grolle et al., FEMS Microbiol. Lett. 191:131-137 (2000)); Henriksson et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 62:807-813 (2006)). Enzimas DXR muy caracterizadas son estrictamente dependientes de NADPH, pero las enzimas de A. thaliana y M. tuberculosis reaccionan con NADH a una relación reducida (Argyrou y Blanchard, Biochemistry 43:4375-4384 (2004)); Rohdich et al., FEBS J. 273:4446-4458 (2006)).
C. 2-C-Metil-D-eritritol-4-fosfato deshidratasa. Una diol deshidratasa se requiere para convertir 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato en el precursor de p-toluato (Altmiller y Wagner, Arch. Biochem. Biophys. 138:160-170 (1970)). Aunque esta transformación no ha sido demostrada experimentalmente varias enzimas catalizan transformaciones similares que incluyen dihidroxi-ácido deshidratasa (EC 4.2.1.9), propanodiol deshidratasa (EC 4.2.1.28), glicerol deshidratasa (EC 4.2.1.30) y mio-inositosa deshidratasa (EC 4.2.1.44).
Enzimas de diol deshidratasa o propanodiol deshidratasa (EC 4.2.1.28) capaces de convertir el diol secundario 2,3-butanodiol a 2-butanona son excelentes candidatos para esta transformación. Diol deshidratadas dependientes de adenosilcoalamina contienen subunidades alfa, beta y gama, las cuales son todas requeridas para la función enzimática. Candidatos de gene ejemplares se encuentran en Klebsiella pneumoniae (Tobimatsu et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:1774-1777 (1998); Toraya et al.,. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69:475-480 (1976)), Salmonella typhimurium (Bobik et al., J. Bacteriol. 179:6633-6639 (1997)), Klebsiella oxytoca (Tobimatsu et al., J. Biol. Chem. 270:7142-7148 (1995)) y Lactobacillus collinoides (Sauvageot et al., FEMS Microbio!. Lett. 209:69-74 (2002)). Métodos para aislar candidatos de gel de diol deshidratasa en otros organismos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,686,276).
Enzimas en la familia glicerol deshidratasa (EC 4.2.1.30) también pueden ser usadas para deshidratar 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato. Candidatos de gene ejemplares codificados por gldABC y dhaB123 en Klebsiella pneumoniae (WO 2008/137403) y (Toraya eí al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 69:475-480 (1976)), dhaBCE en Clostridium pasteuranum (Macis eí al., FEMS Microbiol Lett. 164:21-28 (1998)) y dhaBCE en Citrobacter freundii (Seyfried eí al., J. Bacteriol. 178:5793-5796 (1996)). Variantes de la diol deshidratasa dependientes de B12 de K. pneumoniae con actividad mejorada 80 a 336 veces fueron recientemente diseñadas por ingeniería introduciendo mutaciones en dos residuos de la subunidad beta (Qi et al., J. Biotechnol. 144:43-50 (2009)). Enzimas de diol deshidratasa con cinéticas de inactivación reducidas fueron desarrolladas por DuPont usando PCR propensa a error (WO 2004/056963).
Si se utiliza una diol deshidratasa dependiente de B12, la expresión heteróloga del factor de reactivación correspondiente es recomendada. Las diol deshidratasas dependientes de B12 son sometidas a activación suicida a base de mecanismos por sustratos y algunos productos corriente abajo. La inactivación, causada por una estrecha asociación con cobalamina inactiva, puede ser parcialmente superada por factores que reactivan la diol deshidratase en un proceso dependiente de ATP. La regeneración del cofactor B12 requiere una ATP adicional. Los factores de regeneración de diol deshidratasa son proteínas de dos subunidades. Candidatos ejemplares se encuentran en Klebsiella oxytoca (Mori ef al., J. Biol. Chem. 272:32034-32041 (1997)), Salmonella typhimurium (Bobik et al., J. Bacteriol. 179:6633-6639 (1997); Chen ef al., J. Bacteriol. 176:5474-5482 (1994)), Lactobacillus collinoides (Sauvageot et al., FEMS Microbiol. Lett. 209:69-74 (2002)), y Klebsiella pneumonía (WO 2008/137403).
Enzimas diol deshidratasas independientes de B12 utilizan S-adenosilmet¡on¡na (SAM) como un cofactor, funcionando bajo condiciones estrictamente anaeróbicas, y requieren activación por una enzima de activación específica (Frey ef al., Chem. Rev. 103:2129-2148 (2003)). La glicerol deshidrogenase y factor de activación correspondiente de Clostridium butyricum, codificados por dhaB1 y dhaB2, han sido bien caracterizados (O'Brien eí al., Blochemistry 43:4635-4645 (2004); Raynaud ef al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 100:5010-5015 (2003)). Esta enzima fue recientemente empleada en una cepa que produce en exceso 1 ,3-propanodiol de E. coli y fue capaz de lograr tituiadores muy altos de producto (Tang eí al., Appl. Environ. Microbiol. 75:1628-1634 (2009)). Una enzima diol deshidratasa independiente de B12 y factor de activación de Roseburia inulinivorans se mostró por catalizar la conversión de 2,3-butanodiol a 2-butanona (Publicación Estadounidense 2009/09 55870).
Dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD, EC 4.2.1.9) es una enzima independiente de B12 que participa en la biosíntesis del aminoácido de cadena ramificada. En su papel nativo, convierte 2,3- dihidroxi-3-metilvalerato a 2-ceto-3-metil-valerato, un precursor de isoleucina. En la biosíntesis de valina, la enzima cataliza la deshidratación de 2,3-dihidroxi-isovalerato a 2-oxoisovalerato. La DHAD de Sulfolobus solfataricus tiene un amplio rango de sustrato, y la actividad de una enzima recombinante expresada en E. coli se demostró en una variedad de ácidos aldónicos (Kim y Lee, J. Biochem. 139:591-596 (2006)). La enzima S. solfataricus es tolerante de oxígeno distinta de muchas enzimas de diol deshidratasa. La enzima de E. coli, codificada por ilvD, es sensible al oxígeno, el cual inactiva su agrupamiento de hierro-azufre (Flint ef al., J. Biol. Chem. 268:14732-14742 (1993)). Enzimas similares han sido caracterizadas en Neurospora crassa (Altmiller y Wagner, Arch. Biochem. Biophys. 138:160-170 (1970)) y Salmonella typhimurium (Armstrong et al., Biochim. Biophys. Acta 498:282-293 (1977)).
La diol deshidratasa mio-inososa-2-deshidratasa (EC 4.2.1.44) es otro candidato ejemplar. Mio-inososa es un anillo de seis elementos que contiene grupos de alcohol adyacentes. Una enzima purificada que codifica la funcionalidad de mio-inososa-2-deshidratasa ha sido estudiada en Klebsiella aerogenes en el contexto de la degradación de mio-inositol (Berman y Magasanik, J. Biol. Chem. 241:800-806 (1966)), pero no se ha asociado con un gene a la fecha. La mio-inososa-2-deshidratasa de Sinorhizobium fredii se clonó y funcionalmente expresó en E. coli (Yoshida et al., Biosci.Biotechnol. Biochem. 70:2957-2964 (2006)). Una enzima similar de B. subtilis, codificada por iolE, también ha sido estudiada (Yoshida et al., Microbiology 150:571-580 (2004)).
Ejemplo IV Trayectoria Ejemplar para la Síntesis de p-toluato de (2-Hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato por las enzimas de la trayectoria de shikimato Este ejemplo describes trayectorias ejemplares para la síntesis de p-toluato usando las enzimas de la trayectoria de shikimato.
La estructura química de p-toluato se asemeja estrechamente a p-hidroxibenzoato, un precursor de la ubiquinona del portador de electrón. 4-Hidroxibenzoato es sintetizado de precursores metabólicos centrales por enzimas en la trayectoria de shikimato, encontrada en bacterias, plantas y hongos. La trayectoria de shikimato está comprendida de siete etapas enzimáticas que transforman D-eritrosa-4-fosfato (E4P) y fosfoenolpiruvato (PEP) a corismato. Las enzimas de la trayectoria incluyen 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato (DAHP) sintasa, deshidroquinato (DHQ) sintasa, DHQ deshidratasa, shikimato deshidrogenasa, shikimato quinasa, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa y corismato sintasa. En la primera etapa de la trayectoria, eritrosa-4-fosfato y fosfoenolpiruvato se unen por DAHP sintasa para formar 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato. Este compuesto es entonces desfosforilado, deshidratado y reducido para formar shikimato. El shikimato es convertido a corismato por las acciones de tres enzimas: shikimato quinasa, 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa y corismato sintasa. La conversión subsecuente de corismato a 4-hidroxibenzoato es catalizada por corismato liasa.
La síntesis de p-toluato procede en una manera análoga como se muestra en la Figura 6. La trayectoria origina con PEP y 2H3M40P, un compuesto análogo a E4P con un grupo metilo en lugar del grupo 3-hidroxilo de E4P. El grupo hidroxilo de E4P no participa directamente en la química de la trayectoria de las reacciones de shikimato, así el precursor 2H3M40P metilo-sustituido se espera reaccione como un sustrato alterno. La evolución dirigida o adaptiva puede ser usada para mejorar la preferencia para 2H3M40P y derivados corriente abajo como sustratos. Tales métodos son bien conocidos en la técnica.
Estrategias de ingeniería de cepas para mejorar la eficiencia del flujo a través de las enzimas de la trayectoria de shikimato también son aplicables aquí. La disponibilidad del PEP precursor de la trayectoria puede ser incrementada alterando los sistemas de transporte de glucosa (Yi et al., Biotechnol. Prog. 19:1450-1459 (2003)). Se diseñaron por ingeniería cepas que producen en exceso 4-hidroxibenzoato para mejorar el flujo a través de la trayectoria de shikimato por medio de la sobre expresión de una isozima insensible a la retroalimentación de 3-desoxi-D-ácido arabinoheptulosónico-7-fosfato sintasa (Barker y Frost, Biotechnol. Bioeng. 76:376-390 (2001)). Adicionalmente, los niveles de expresión de las enzimas de la trayectoria de shikimato y corismato liasa fueron mejorados. Estrategias similares pueden ser empleadas en una cepa para sobreproducción de p-toluato.
A. 2-Deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa (EC 2.5.1.54). La condensación de eritrosa-4-fosfato y fosfoenolpiruvato es catalizada por 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato (DAHP) sintasa (EC 2.5.1.54). Tres isozimas de esta enzima son codificadas en el genoma de E. coli por aroG, aroF y aroH y son sometidas a inhibición por retroalimentación por fenilalanina, tirosina y triptofano, respectivamente. En células de tipo nativo que crecen en medio mínimo, los productos del gene aroG, aroF y aroH contribuyen a 80%, 20% y 1% de la actividad de DAHP sintasa, respectivamente (Hudson y Davidson, J. Mol. Biol. 180:1023-1051 (1984)). Dos residuos de AroG se encontraron por aliviar la inhibición por fenilalanina (Kikuchi eí al., Appl. Environ. Microbiol. 63:761-762 (1997)). La inhibición de retroalimentación de AroF por tirosina se removió por un cambio de par base único (Weaver y Herrmann, J. Bacteriol. 172:6581-6584 (1990)). La DAHP sintasa insensible a tirosina fue sobre expresada en una cepa de E. coli que sobre expresa 4-hidroxibenzoato (Barker y Frost, Biotechnol. Bioeng. 76:376-390 (2001)). El producto del gene aroG se mostró por aceptar una variedad de sustratos alternos de 4 y 5 carbonos de longitud (Sheflyan er al., J. Am. Chem. Soc. 20(43): 11027-11032 (1998); Williamson ef al., Bioorg. ed. Chem. Lett. 15:2339-2342 (2005)). La enzima reacciona eficientemente con (3S)-2-desoxieritrosa-4-fosfato, un sustrato análogo a eritrosa-4-fosfato pero carece del alcohol en la posición 2 (Williamson er al., supra 2005). Enzimas de Helicobacter pilori y Pyrococcus furiosus también aceptan este sustrato alterno (Schofield et al., Biochemistry 44:11950-11962 (2005)); Webby ef al., Biochem. J. 390:223-230 2005)) y han sido expresadas en E. coli. Una variante evolucionada de DAHP sintasa, que difiere .de la enzima AroG de E. coli de tipo nativa por 7 amino ácidos, se mostró por presentar un ambiente de 60-partes en Kcat/KM (Ran y Frost, J. Am. Chem. Soc. 129:6130-6139 (2007)).
B. 3-Deshidroquinato sintasa (EC 4.2.3.4). La desfosforilación del sustrato (2)(2,4-dihidroxi-5-metil-6- [(fosfonooxi)metil]oxan-2-carboxilato) al sustrato (3)(1 , 3-dih ¡droxi-4-metilcilohex-1 -eno-1 -carboxilato) como se muestra en la Figura 2 es análogo a la desfosforilación de 3-desoxi-arabino-heptulonato-7-fosfato por 3-deshidroquinato sintasa. La enzima ha sido caracterizada en E. coli (Mehdi et al., Métodos Enzymol. 142:306-314 (1987), B. subtilis (Hasan y Nester, J. Biol. Chem. 253:4999-5004 (1978)) y Mycobacterium tuberculosis H37Rv (de Mendonca ef al., J. Bacteriol. 189:6246-6252 (2007)). La enzima de E. coli es sometida a inhibición por L-tirosina (Barker y Frost, Biotechnol. Bioeng. 76:376-3902001)).
C. 3-Deshidroquinato deshidratasa (EC 4.2.1.10). 3-Deshidroquinato deshidratasa, también llamada 3-deshidroquinasa (DHQase), naturalmente cataliza la deshidratación de 3-deshidroquinato a 3-deshidroshikimato, análogo a la etapa C en la trayectoria de p-toluato de la Figura 2. Enzimas de DHQase pueden ser divididas en dos clases con base en el mecanismo, estereoquímica y homología de secuencia (Gourley et al., Nat. Struct. Biol. 6:521-525. (1999)). En general las enzimas tipo 1 están involucradas en la biosíntesis, mientras las enzimas de tipo 2 operan en la dirección reversa (degradativa). Las enzimas tipo 1 de E. coli (Kinghorn eí al., Gene 14:73-80. 1981)), Salmonella typhi (Kinghorn et al., supra 1981; Servos et al., J. Gen. Microbiol: 137:147-152 (1991)) y B. subtilis (Warburg eí al., Gene 32:57-66 1984)) han sido clonadas y caracterizadas. Enzimas 3-deshidroquinato deshidratase tipo I! ejemplares se encuentran en Mycobacterium tuberculosis, Streptomyces coelicolor (Evans et al., FEBS Lett. 530:24-30 (2002)) y Helicobacter pilori (Lee et al., Proteins 51:616-7 (2003)).
D. Shikimato deshidroqenasa (EC 1.1.1.25). S h i k i m a t o deshidrogenasa cataliza la reducción dependiente de NAD(P)H de 3- deshidroshikimato a shikimato, análogo a la Etapa D de la Figura 2. El genoma de E. coli codifica dos parálogos de shikimato deshidrogenasa con diferentes especificidades del cofactor. La enzima codificada por aroE es específica de NADPH, mientras el producto del gene ydiB es una quinato/shikimato deshidrogenasa la cual puede utilizar NADH (preferida) o NADPH como un cofactor (Michel et al., J. Biol. Chem. 278:19463-19472 (2003)). Enzimas dependientes de NADPH de Mycobacterium tuberculosis (Zhang et al., J. Biochem. Mol. Biol. 38:624-631 (2005)), Haemophilus influenzae (Ye ef al., J. Bacterio!. 185:4144-4151 (2003)) y Helicobacter pilori (Han et al., FEBS J. 273:4682-4692 (2006)) han sido funcionalmente expresadas en E. coli.
E. Shikimato quinasa (EC 2.7.1.71). Shikimato quinasa cataliza la fosforilación dependiente de ATP del grupo 3-hidroxil de shikimato análogo a la Etapa E de la Figura 2. Dos enzimas de shikimato quinasa son codificadas por aroK (SK1) y aroL (SK2) en E. coli (DeFeyter y Pittard, J. Bacterio!. 165:331-333 (1986); Lobner-Olesen y Marinus, J. Bacterio!. 174:525-529 (1992)). La Km de SK2, codificada por aroL, es 100-veces inferior que aquella de SK1, indicando que esta enzima es responsable de la biosíntesis aromática (DeFeyter et al., supra 1986). Enzimas de shikimato quinasa adicionales de Mycobacterium tuberculosis (Gu et al., J. Mol. Biol. 319:779-789 (2002)); Oliveira et al., Protein Expr. Purif. 22:430-435 (2001 )(doi:10. 006/prep.2001.1457, doi;S 1046-5928(01)91457-3, pii), Helicobacter pilori (Cheng et al., J. Bacterio!. 187:8 56-8163 (2005)) y Erwinia chrysanthemi (Krell ef al., Protein Sci. 10:1137-1149 (2001)) han sido clonadas en E. coli.
F. 3-Fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa (EC 2.5.1.19). 3-Fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa, también conocida como 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), cataliza la transferencia de la porción enolpiruvil de fosfoenolpiruvato al 5-hidroxilo de shikimato- 3-fosfato. La enzima es codificada por aroA en E. coli (Anderson et al., Biochemistry 27:1604-1610 (1988)). EPSPS enzimas de Mycobacterium tuberculosis (Oliveira et al., Protein Expr. Purif. 22:430-435 (2001)), Dunaliella salina (Y¡ et al., J. Microbiol. 45:153-157 (2007)) y Staphilococcus aureus (Priestman et al., FEBS Lett. 579:728-732 (2005)) han sido clonadas y funcionalmente expresadas en E. coli.
G. Corismato sintasa (EC 4.2.3.5). Corismato sintasa es la séptima enzima en la trayectoria de shikimato, que cataliza la transformación de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato a corismato. La enzima requiere mononucleótido de flavina reducida (FMN) como un cofactor, aunque la reacción pura de la enzima no involucra un cambio rédox. Contrario a la enzima encontrada en plantas y bacterias, la corismato sintasa en hongos es también capaz de reducir FMN a la expensa de NADPH (Macheroux et al., Planta 207:325-334 (1999)). Enzimas monofuncionales representativas son codificadas por aroC de E. coli (White et al., Biochem. J. 251:313-322 (1988)) y Streptococcus pneumoniae (Maclean y Ali, Structure 11:1499-1511 (2003)(doi:S0969212603002648, pii). Enzimas fúngicas bifuncionales se encuentran en Neurospora crassa (Kitzing ef al., J. Biol. Chem. 276:42658-42666 (2001)) y Saccharomyces cerevisiae (Jones et al., Mol. Microbiol. 5:2143-2152 (1991)).
H. Corismato liasa (EC 4.1.3.40). Corismato Masa cataliza la primera etapa comprometida en la biosíntesis de ubiquinona: la remoción de piruvato de corismato para formar 4-hidroxibenzoato. La reacción enzimática es limitada de la velocidad por la liberación lenta del producto de 4-hidroxibenzoato (Gallagher et al., Proteins 44:304-311 (2001)), el cual se piensa juega un papel en el suministro de 4-hidroxibenzoato a enzimas unidas a la membrana corriente abajo. La corismato liasa de E. coli se clonó y caracterizó y la enzima ha sido cristalizada (Gallagher et al., supra 2001; Siebert et al., FEBS Lett. 307:347-350 (1992)). Estudios estructurales implican al residuo G90 como contribuyente a la inhibición del producto (Smith et al., Arch. Biochem. Biophys. 445:72-80 (2006)). La modificación de dos residuos de cisteína activos de la superficie reduce la agregación de la proteína (Holden et al., Biochim. Biophys. Acta 1594:160-167 (2002)). Una forma recombinante de la corismato liasa de Mycobacterium tuberculosis se clonó y caracterizó en E. coli (Stadthagen et al., J. Biol. Chem. 280:40699-407062005)).
B-F. Proteina AROM Multifuncional. En la mayoría de las bacterias, las enzimas de la trayectoria de shikimato son codificadas por polipéptídos separados. En eucariotas microbianos, cinco funciones enzimáticas son catalizadas por una proteína polifuncional codificada por un supergene pentafuncional (Campbell et al., Int. J. Parasitol. 34:5-13 (2004)). El complejo multifuncional AROM de proteína cataliza reacciones análogas a las reacciones B-F de la Figura 2. El complejo de proteína AROM ha sido caracterizada en hongos que incluyen Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae y Pneumocystis carinii (Banerji et al., J. Gen. Microbiol, 139:2901-2914 (1993); Charles et al., Nucleic Acids Res. 14:2201-2213 (1986); Coggins et al., Métodos Enzymol. 142:325-341 (1987); Duncan, K. , Biochem. J. 246:375-386 (1987)). Varios componentes de AROM se han mostrado por funcionar independientemente como polipéptidos individuales. Por ejemplo, la deshidroquinato sintasa (DHQS) forma el dominio amino-terminal de AROM, y puede funcionar independientemente cuando es clonada en E. coli (Moore et al., Biochem. J. 301 (Pt 1):297-304 (1994)). Varias estructuras cristalinas de componentes de AROM de Aspergillus nidulans proporcionan una visión en el mecanismo catalítico (Carpenter et al., Nature 394:299-302 (1998)).
Ejemplo V Trayectoria Ejemplar para la Transformación Enzimatica de p-toluato a Ácido Tereftálico Este ejemplo describe trayectorias ejemplares para conversión de p-toluato a ácido tereftálico (PTA).
P-toluato puede ser además transformado a PTA por oxidación del grupo metilo a un ácido en tres etapas enzimáticas como se muestra en la Figura 3. La trayectoria está comprendida de una p- toluato metil-monooxigenasa reductasa, una deshidrogenasa de alcohol 4-carboxibencílico y una deshidrogenasa de 4-carboxibencil aldehido. En la primera etapa, p-toluato metil-monooxigenasa oxida p-toluato a alcohol 4-carboxibencílico en la presencia de 02 La enzima Comamonas testosteroni (tsaBM), la cual también reacciona con 4-tolueno sulfonato como un sustrato, ha sido purificada y caracterizada (Locher et al., J. Bacteriol. 173:3741-3748 (1991)). Alcohol 4-carboxibencílico es subsecuentemente convertido a un aldehido por deshidrogenasa de alcohol 4-carboxibencílico (tsaC). La transformación de aldehido a ácido es catalizada por 4-carboxibenzaldehído deshidrogenasa (tsaD). Las enzimas que catalizan estas reacciones se encuentran en Comamonas testosteroni 1-2, un organismo capaz de utilizar p-toluato como la única fuente de carbono y energía (Junker ef al., J. Bacteriol. 179:919-927 (1997)). Genes adicionales para transformar p-toluato a PTA pueden ser encontrados por homología de secuencia, en particular a proteobacteria en los géneros Burkholderia, Alcaligenes, Pseudomonas, Shingomonas y Comamonas (Patente Estadounidense No. 6,187,569 y Publicación Estadounidense 2003/0170836). Los ID de ¡dentificadores de GenBank asociados con las enzimas de Comamonas testosteroni se listan abajo.
Ejemplo VI Síntesis de benzoato de 2H40P Este ejemplo muestra la síntesis de benzoato de 2H40P por las enzimas de la trayectoria de shikimato (Figura 9) y una trayectoria ejemplar para producir el 2H40P precursor de la trayectoria de benzoato (Figura 8).
Como el p-toluato, la estructura química de benzoato se asemeja a p-hidroxibenzoato, un producto de la trayectoria de shikimato descrita anteriormente en el Ejemplo IV. En este ejemplo las enzimas de la trayectoria de shikimato son utilizadas para sintetizar benzoato del precursor de la trayectoria (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato (2H40P) por la trayectoria mostrada en la Figura 9. La reactividad de las enzimas de la trayectoria de shikimato en 2H40P y los sustratos alternos usados en la formación de benzoato son opcionalmente optimizados por evolución dirigida o adaptiva para mejorar la preferencia para 2H40P y derivados corriente abajo como sustratos. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y descritos en la presente.
Una trayectoria nueva y ejemplar para sintetizar la trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato (2H40P) precursor del benzoato se müestra en la Figura 8. En esta trayectoria, 2H40P se deriva del metabolito central eritrosa-4-fosfato en dos etapas enzimáticas. En la primera etapa, una diol deshidratasa transforma eritrosa-4-fosfato a (2,4-dioxobutoxi)fosfonato (24DBP). El grupo 2-ceto de 24DBP es subsecuentemente reducido al alcohol de 2H40P por una oxidorreductasa con actividad de 24DBP reductasa. Enzimas ejemplares para las Etapas A y B de la Figura 8 se representan abajo.
A. Eritrosa-4-fosfato deshidratasa: Enzimas Diol deshidratasa en la clase EC 4.2.1 son usadas para convertir eritrosa-4-fosfato en 24DBP (Figura 4, la etapa A). Aunque las enzimas que catalizan esta transformación no se han indicado, varias enzimas catalizan transformaciones similares que incluyen dihidroxi-ácido deshidratasa (EC 4.2.1.9), propanodiol deshidratasa (EC 4.2.1.28), glicerol deshidratasa (EC 4.2.1.30) y mio-inositosa deshidratasa (EC 4.2.1.44). Enzimas diol deshidratasa ejemplares son descritas anteriormente en el Ejemplo III.
Enzimas diol deshidratasa o propanodiol deshidratasa (EC 4.2.1.28) capaces de convertir el diol 2,3-butanodiol secundario a 2-butanona pueden ser usadas para esta transformación. Diol deshidratasas dependientes de B-12 o adenosilcobalamina- contienen subunidades alfa, beta y gamma, todas las cuales son usadas para la función enzimática. Genes ejemplares se encuentran en Klebsiella pneumoniae (Tobimatsu et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:1774- 1777 (1998); Toraya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 69:475-480 (1976)), Salmonella typhimurium (Bobik et al., J. Bacteriol. 179:6633-6639 (1997)), Klebsiella oxytoca (Tobimatsu eí al., J. Biol. Chem. 270:7142-7148 (1995)) y Lactobacillus collinoides (Sauvageot eí al., FEMS Microbiol. Lett. 209:69-74 (2002)). Métodos para aislar genes de diol deshidratasa en otros organismos son bien conocidos en la técnica como se ejemplifica en la Patente Estadounidense No. 5,686,276, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Enzimas en la familia gliceroi deshidratasa (EC 4.2.1.30) también pueden ser usadas para deshidratar eritrosa-4-fosfato. Genes ejemplares incluyen gldABC y dhaB123 en Klebsiella pneumoniae (WO 2008/137403) y (Toraya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 69:475-480 (1976)), dhaBCE en Clostridium pasteuranum (Macis eí al., FEMS Microbio! Lett. 164:21-28 (1998)) y dhaBCE en Citrobacter freundii (Seyfried eí al., J. Bacteriol. 178:5793-5796 (1996)). Variantes de la diol deshidratasa dependiente de B12 de K. pneumoniae con 80- a 336-veces la actividad mejorada fueron recientemente diseñadas por ingeniería para introducir mutaciones en dos residuos de la subunidad beta (Qi eí al., J. Biotechnol. 144:43-50 (2009)). Enzimas diol deshidratasa con cinéticas de inactivación reducida fueron desarrolladas por DuPont usando PCR propensa a error (WO 2004/056963).
Si una diol deshidratasa dependiente de B12 se utiliza, la expresión heteróloga del factor de reactivación correspondiente se emplea. Diol deshidratasas dependientes de B12 son sometidas a activación suicida a base de mecanismos por sustratos y algunos productos corriente abajo. La inactivación, causada por una estrecha asociación con cobalamina inactiva, puede ser parcialmente superada por factores de reactivación de diol deshidratasa en un proceso dependiente de ATP. La regeneración del cofactor B12 es dependiente de ATP. Factores de regeneración de diol deshidratasa son proteínas de dos sub-unidades. Genes ejemplares se encuentran en Klebsiella oxytoca (Mori et al., J. Biol. Chem. 272:32034-32041 (1997)), Salmonella typhimurium (Bobik ef al., J. Bacteriol. 179:6633-6639 (1997); Chen et al., J. Bacteriol. 176:5474-5482 (1994)), Lactobacillus collinoides (Sauvageot et al., FEMS Microbiol. Lett. 209:69-74 (2002)), y Klebsiella pneumonía (WO 2008/137403).
Enzimas diol deshidratasas dependientes de B12 utilizan S-adenosilmetionina (SAM) como un cofactor, funcionan bajo condiciones estrictamente anaeróbicas, y requieren activación por una enzima de activación específica (Frey eí al., Chem. Rey. 103:2129-2148 (2003)). La glicerol deshidrogenase y factor de activación correspondiente de Clostridium butyricum, codificada por dhaB1 y dhaB2, han sido bien caracterizados (O'Brien ef al., Biochemistry 43:4635-4645 (2004); Raynaud ef al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 100:5010-5015 (2003)). Esta enzima fue recientemente empleada en una cepa de E. coli que sobre produce 1 ,3-propanodiol y fue capaz de lograr tituladores muy altos de producto (Tang ef al., Appl. Environ. Microbiol. 75:1628-1634 (2009)). Una enzima diol deshidratasa independiente de B12 adicional y factor de activación de Roseburia inulinivorans se mostró por catalizar la conversión de 2,3-butanodiol a 2-butanona (Publicación Estadounidense 2009/09155870).
Dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD, EC 4.2.1.9) es una enzima independiente de B12 que participa en la biosíntesis de aminoácido de cadena ramificada. En su papel nativo, convierte 2,3-dihidroxi-3-metilvalerato a 2-ceto-3-metil-valerato, un precursor de isoleucina. En la biosíntesis de valina, la enzima cataliza la deshidratacion de 2,3-dihidroxi-isovalerato a 2-oxoisovalerato. La DHAD de Sulfolobus solfataricus tiene un amplio rango de sustrato, y la actividad de una enzima recombinante expresada en E. coli se demostró en una variedad de ácidos aldónicos (Kim y Lee, J. Biochem. 139:591-596 (2006)). La enzima de S. solfataricus es tolerante al oxígeno distinto de muchas enzimas diol deshidratasas. La enzima de E. coli, codificada por ilvD, es sensible al oxígeno, el cual inactiva su agrupamiento de hierro-azufre (Flint et al., J. Biol. Chem. 268:14732-14742 (1993)). Enzimas similares han sido caracterizadas en Neurospora crassa (Altmiller y Wagner, Arch. Biochem. Biophys. 138:160-170 (1970)) y Salmonella typhimurium (Armstrong et al., Biochim. Biophys. Acta 498:282-293 (1977)).
La diol deshidratasa mio-inososa-2-deshidratasa (EC 4.2.1.44) es otra enzima ejemplar. Mio-inososa es un anillo de seis elementos que contiene grupos de alcohol adyacentes. Una enzima purificada que codifica la funcionalidad de mio-inososa-2-deshidratasa ha sido estudiada en Klebsiella aerogenes en el contexto de la degradación de mio-inositol (Berman y Magasanik, J. Biol. Chem. 241:800-806 (1966)), pero no se ha asociado con a gene a la fecha. La mio-inososa-2-deshidratasa de Sinorhizobium fredii se clonó y funcionalmente expresó en E. coli (Yoshida et al., Biosci.Biotechnol. Biochem. 70:2957-2964 (2006)). Una enzima similar de B. subtilis, codificada por iolE, también ha sido estudiada (Yoshida ef al., Microbiology 150:571-580 (2004)).
B. (2,4-Dioxobutoxi)fosfonato reductasa: Una enzima con actividad de (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa es usada para convertir 24DBP a 2H40P. Aunque este compuesto no es un sustrato conocido de enzimas de alcohol deshidrogenasa, varias enzimas en la clase EC 1.1.1 catalizan reacciones similares. Enzimas ejemplares que reducen cetonas de sustratos fosforilados incluyen glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8), 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (EC 1.1.1.95) y eritronato-4-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.290). Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa cataliza la reducción dependiente de NAD(P)H de dihidroxiacetona-fosfato a glicerol-3-fosfato. Esta enzima es codificada por gpsA de E. coli (Kito ef al., J Biol. Chem. 244:3316-3323 (1969)). 3-Fosfoglicerato deshidrogenasa cataliza la primera etapa de la biosíntesis de serina en varios organismos que incluyen E. coli, donde es codificada por el gene serA (Tobey ef al., J Biol.Chem. 261:12179- 12183 (1986)). Eritronato-4-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.290) cataliza la reducción reversible de 2-oxo-3-hidroxi-4-fosfobutanoato a eritronato-4-fosfato. Esta enzima, codificada por pdxB de E. coli, normalmente opera en la dirección reversa en el contexto de la biosíntesis de S'-fosfato piridoxal (Sc oenlein et al., J Bacteriol. 171:6084-6092 (1989)). Una enzima similar codificada por pdxB en Pseudomonas aeruginosa ha sido caracterizada y heterólogamente expresada en E. coli (Ha ef al., Acta Crystallogr.Sect.F.Struct.Biol.Cryst.Commun. 62:139-141 (2006)).
Una amplia variedad de enzimas de alcohol deshidrogenasa catalizan la reducción de un grupo funcional cetona a un alcohol. Dos de tales enzimas de E. coli son codificadas por malato deshidrogenasa {mdh) y lactato deshidrogenasa (IdhA). Lactato deshidrogenasa de Ralstonia eutropha ha sido mostrada por demostrar altas actividades en 2-cetoácidos de varias longitudes de cadena que incluyen lactato, 2- oxobutirato, 2-oxopentanoato y 2-oxoglutarato (Steinbuchel ef a/., Eur.J.Biochem. 130:329-334 (1983)). La conversión de alfa-cetoadipato en alfa-hidroxiadipato puede ser catalizada por 2-cetoadipato reductasa, una enzima reportada por ser encontrada en ratas y en placenta humana (Suda ef al., Arch.Biochem.Biophys. 176:610-620 (1976); Suda et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 77:586-591 (1977)). Una oxidorreductasa adicional es la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa {bdh) mitocondrial del corazón humano la cual ha sido clonada y caracterizada (Marks ef al., J.Biol.Chem. 267:15459-15463 (1992)). Enzimas de alcohol deshidrogenasa de C. beijerinckii (Ismaiel et al., J. Bacterio!. 175:5097-5105 (1993)) y T. brockii (Lamed et al., Biochem.J. 195:183- 190 (1981); Peretz et al., Biochemistry. 28:6549-6555 (1989)) convierten acetona a isopropanol. Metil etil cetona reductasa, o alternativamente, 2-butanol deshidrogenasa, catalizan la reducción de MEK para formar 2- butanol. Enzimas ejemplares pueden ser encontradas en Rhodococcus ruber (Kosjek ef al., Biotechnol Bioeng. 86:55-62 (2004)) y Pyrococcus furiosus (van der et al., Eur.J.Biochem. 268:3062-3068 (2001)).
Un número de organismos pueden catalizar la reducción de 4-hidroxi-2-butanona a 1 ,3-butanodiol, que incluyen aquellos que pertenecen ai género Baciilus, Brevibacierium, Candida, y Klebsieüa entre otros, como se describe por Matsuyama et al. ((1995)). Una Rhodococcus fenilacetaldehído reductasa (Sar268) mutada y una alcohol deshidrogenasa de Leifonia también se han mostrado por catalizar esta transformación a altos rendimientos (Itoh eí al., Appl.Microbiol Biotechnol. 75:1249-1256 (2007)).
Homoserina deshidrogenasa (EC 1.1.1.13) cataliza la reducción dependiente de NAD(P)H de aspartato semialdehído a homoserina. En muchos organismos, que incluyen E. coli, la homoserina deshidrogenasa es una enzima bifuncional que también cataliza la conversión dependiente de ATP de aspartato a aspartil-4-fosfato (Starnes eí al., Biochemistry 11:677-687 (1972)). Los dominios funcionales son catalíticamente independientes y conectados por una región enlazadora (Sibilli eí al., J Biol.Chem. 256:10228-10230 (1981)) y ambos dominios son sometidos a inhibición alostérica por treonina. El dominio de homoserina deshidrogenasa en la enzima de E. coli, codificada por thrA, se separó del dominio de aspartato quinasa, caracterizó y encontró por presentar alta actividad catalítica e inhibición reducida por treonina (James ef al., Biochemistry 41:3720-3725 (2002)). Esto puede ser aplicado a otras treoninas quinasas bifuncionales que incluyen, por ejemplo, hom1 de Lactobacillus plantarum (Cahyanto ef al., Microbiology 152:105-112 (2006)) y Arabidopsis thaliana. Las homoserinas deshidrogenasas monofuncionales codificadas por hom6 en S. cerevisiae (Jacques ef al., Biochim.Biophys.Acta 1544:28-41 (2001)) y borní en Lactobacillus plantarum (Cahyanto ef al., Microbiology 152:105-112 (2006)) han sido funcionalmente expresadas y caracterizada en E. coli.
Ejemplo VII Trayectorias a benceno y Tolueno Este ejemplo muestra trayectorias de benzoato y benzoil- CoA a benceno, y p-toluato y p-metilbenzoil-CoA a tolueno.
Trayectorias para la producción enzimática de benceno de benzoato o benzoil-CoA se muestran en la Figura 10. Benzoato y benzoil-CoA son intermediarios metabólicos que se originan naturalmente comunes a diversas trayectorias de degradación aromática. El benzoato también puede ser producido por la ruta de la trayectoria alterna de shikimato descrita en la presente. Varias rutas de benzoato y/o benzoil-CoA a benceno se muestran en la Figura 10. Primero, el benceno puede ser producido directamente de benzoato vía la descarboxilación (Figura 10, trayectoria E). Alternativamente, la porción de ácido puede ser reducida a un aldehido ya sea directamente por una reductasa del ácido benzoico (Figura 10, Trayectoria B) o indirectamente vía intermediarios de benzoil-CoA y/o (benzoiloxi)fosfonato (Figura 10, trayectorias A y D, Trayectoria B, Trayectoria H y G, o trayectorias A, F, y G). El benzaldehído puede ser subsecuentemente descarbonilado para formar benceno (Figura 10, Trayectoria C).
Trayectorias similares para la producción enzimática de tolueno de p-toluato y/o p-metilbenzoil-CoA se muestran en la Figura 11. p-Toluato puede ser producido por la vía de la trayectoria alterna de shikimato como se describe en la presente. Las rutas para convertir p-toluato (también conocido como p-metilbenzoato) y/o p-metilbenzoil-CoA a tolueno son análogas a la transformación de benzoato o benzoil-CoA a benceno, descrita anteriormente. Enzimas para catalizar las transformaciones mostradas en las Figuras 10 y 11 son categorizadas por el número EC y descritas además abajo. 1.2.1. b Oxidorreductasa (acil-CoA a aldehido): Una enzima con actividad de benzoil-CoA reductasa es usada para convertir benzoil-CoA en benzaldehído (Trayectoria D de la Figura 10). De manera similar, La reducción de p-metilbenzoil-CoA a p-metilbenzaldehído (también llamada p-tolualdehído) es catalizada por una enzima con actividad de p-metilbenzoil-CoA reductasa (Trayectoria D de la Figura 11). Aunque las enzimas con estas actividades no han sido caracterizadas, una enzima que cataliza una reacción similar es cinamoil-CoA reductasa (EC 1.2.1.44). Esta enzima cataliza la reducción dependiente de NAD(P)H de cinamoil-CoA y derivados aromáticos sustituidos tales como cumaroil-CoA y feruloil-CoA. La enzima ha sido caracterizada en organismos que incluyen Arabidopsis thaliana (Lauvergeat et al., Phytochemistry 57:1187-1195 (2001)), Triticum aestivum (Ma, J Exp.Bot. 58:2011-2021 (2007)) y Panicum virgatum (Escamilla-Trevino et al., New Phytol. 185:143-155 (2010)). Las enzimas de A. thaliana y P. virgatum fueron caracterizadas y heterólogamente expresadas en E. coli.
Varias otras acil-CoA reductasas bien caracterizadas reducen una acil-CoA a su aldehido correspondiente. Enzimas ejemplares incluye acil-CoA reductasa grasa (EC 1.2.1.50), succinil-CoA reductasa (EC 1.2.1.76), acetil-CoA reductasa (EC 1.2.1.10) y butiril- CoA reductasa. Enzimas acil-CoA reductasas grasas ejempl-ares son codificadas por acrl de Acinetobacter calcoaceticus (Reiser eí al., 179:2969-2975 (1997)) y Acinetobacter sp. M-1 (Ishige eí al., Appl.Environ. Microbio!. 68:1192-1195 (2002)). Enzimas con actividad de succinil-CoA reductasa son codificadas por sucD de Clostridium kluyveri (Sohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996a); Sohling et al., 178:871-80 (1996)) y sucD de P. gingivalis (Takahashi et al., J. Bacteriol. 182:4704-4710 (2000)). Enzimas adicionales de succinil-CoA reductasa participan en el ciclo de 3-hidroxipropionato/4-hidroxibutirato de archaea termofílica tales como Metallosphaera sedula (Berg et al., Science. 318:1782-1786 (2007)) y Thermoproteus neutrophilus (Ramos-Vera et al., J Bacteriol. 191:4286-4297 (2009)). La CoA reductasa de M. sedula, codificada por Msed_G709, es dependiente de NADPH y también tiene actividad de malonil-CoA reductasa. La enzima T. neutrophilus es active con tanto NADPH como NADH. La acetaldehído deshidrogenasa acilante en Pseudomonas sp, codificada por bphG, ha sido demostrada por oxidar y acilar acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído, isobutiraldehído y formaldehído a sus ésteres de CoA correspondientes (Powlowski et al., 175:377-385 (1993)). Además de reducir acetil-CoA a etanol, la enzima codificada por adhE en Leuconostoc mesenteroides ha sido mostrada por oxidar el compuesto de cadena ramificada isobutiraldehído a isobutiril-CoA (Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)). La butiraldehído deshidrogenasa cataliza una reacción similar, conversión de butiril-CoA a butiraldehído, en organismos solventogénicos tales como Clostridium saccharoperbutilacetonicum (Kosaka eí al., Biosci. Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)). La acil-CoA reductasa codificada por ald en Clostridium beijerinckii ha sido indicada por reducir acetil-CoA y butíril-CoA a sus aldehidos correspondientes (Toth et al., Appl Environ. Microbio! 65:4973-4980 (1999)). Esta enzima presenta alta homología de secuencia a las enzimas acetaldehído deshidrogenasas dependientes de CoA de Salmonella typhimurium y E. coli codificada por eutE (Toth eí al., Appl Environ. Microbio! 65:4973-4980 (1999)).
Una enzima CoA reductasa adicional es malonil-CoA reductasa la cual transforma malonil-CoA a semialdehído malónico. La maionii-CoA reductasa es una enzima clave en ¡a fijación de carbono autotrófico vía el ciclo de 3-hidroxipropionato en la bacteria arcaes termoacidofílica (Berg ef al., 318:1782-1786 (2007); Thauer, 318:1732-1733 (2007)). La enzima utiliza NADPH como un cofactor y ha sido caracterizada en Metallosphaera y Sulfolobus spp (Alber ef al., 188:8551-8559 (2006); Hugler ef al., 184:2404-2410 (2002)). La enzima es codificada por Msed_0709 en Metallosphaera sedula (Alber et al., 188:8551-8559 (2006); Berg ef al., 318:1782-1786 (2007)). Un gene que codifica una malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaü se clonó y eterólogamente expresó en E. coli (Alber ef al., 188:8551-8559 (2006)). Esta enzima también ha sido indicada por catalizar la conversión de metilmalonil-CoA a su aldehido correspondiente (WO/2007/141208). Ambos candidatos de la enzima malonil-CoA reductasa tiene alta similitud de secuencia a la aspartato-semialdehído deshidrogenasa, una enzima que cataliza la reducción y desfosforilación concurrente de aspartil-4-fosfato a aspartato semialdehído. Genes adicionales pueden ser encontrados por homología de secuencia a proteínas en otros organismos que incluyen Sulfolobus solfataricus y Sulfolobus acidocaldarius. 1.2.1.d Oxidorreductasa (fosforilación/desfosforilación) (10/11 G): Las reducciones de (benzoiloxi)fosfonato a benzaldehído (Trayectoria G de la Figura 10) y (p-metilbenzoiloxi)fosfonato a p-metilbenzaldehído (Trayectoria G de la Figura 11) son catalizadas por enzimas con actividades de fosfonato reductasa. Aunque las enzimas que cataliza estas conversiones no han sido identificadas a la fecha, transformaciones similares catalizadas por gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.2.1.12), aspartato-semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.11) acetilglutamilfosfato reductasa (EC 1.2.1.38) y glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.) están bien documentadas. La aspartato semialdehído deshidrogenasa (ASD, EC 1.2.1.11) cataliza la reducción dependiente de NADPH de 4-aspartil fosfato a aspartato-semialdehído. ASD participa en la biosíntesis de aminoácido y recientemente ha sido estudiada como un objetivo antimicrobiano (Hadfield et al., Biochemistry 40:14475-14483 (2001)). La estructura de ASD de E. coli ha sido resuelta (Hadfield ef al., J Mol.Biol. 289:991-1002 (1999)) y la enzima ha sido mostrada por aceptar el sustrato alterno beta-3-metilaspartil fosfato (Shames et al., J Biol.Chem. 259:15331-15339 (1984)). La enzima Haemophilus influenzae ha sido el sujeto de estudios de ingeniería enzimática para alterar las afinidades de enlace del sustrato en el sitio activo (Blanco ,et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 60:1388-1395 (2004)). Otros genes ASD /enzimas se encuentran en Mycobacterium tuberculosis (Shafiani et al., J Appl Microbio! 98:832-838 (2005)), Methanococcus jannaschii (Faehnle et al., J Mol.Biol. 353:1055-1068 (2005)), y los microorganismos infecciosos Vibrio cholera y Helicobacter pilori (Moore et al., Protein Expr.Purif. 25:189-194 (2002)). Una enzima relacionada es acetilglutamilfosfato reductasa (EC 1.2.1.38), una enzima que naturalmente reduce acetilglutamilfosfato a acetilglutamato-5-semialdehído, encontrada en S. cerevisiae (Pauwels eí al., Eur.J Biochem. 270:1014-1024 (2003)), S. subtilis (O'Reilly eí al., Microbiology 140 (Pt 5):1023-1025 (1994)), E. coli (Parsot eí al., Gene. 68:275-283 (1988)), y otros organismos. Enzimas adicionales de fosfato reductasa de E. coli incluyen gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa codificada por gapA (Branlant eí al., Eur.J. Biochem. 150:61-66 (1985)) y glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa codificada por proA (Smith eí al., J. Bacterio!. 157:545-551 (1984b)). Genes que codifican glutamato-5-semienzimas aldehido deshidrogenasas de Salmonella typhimurium (Manan eí al., J Bacterio!. 156:1249-1262 (1983)) y Campilobacter jejuni (Louie eí al., Mol.Gen.Genet. 240:29-35 (1993)) se clonaron y expresaron en E. coli. 1.2.1.e Oxidorreductasa (ácido a aldehido): La conversión directa de benzoato a benzaldehído o p-toluato a p-metilbenzaldehído (Trayectoria B de la Figuras 10 y 11) es catalizada por una reductasa de ácido carboxílico. Enzimas ejemplares incluyen reductasa de ácido carboxílico, alfa-aminoadipato reductasa y reductasa de ácido retinoico. La reductasa de ácido carboxílico (CAR) cataliza el magnesio, ATP y reducción dependiente de NADPH de ácidos carboxílicos a sus aldehidos correspondientes (Venkitasubramanian et al., J Biol.Chem. 282:478-485 (2007)). El sustrato natural de esta enzima es benzoato y la enzima presenta amplia aceptación de sustratos aromáticos que incluyen p-toluato (Venkitasubramanian et al., Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries. CRC press (2006)). La enzima de Nocardia iowensis, codificada por car, se clonó y funcionalmente expresó en E. coli (Venkitasubramanian et al., J Biol.Chem. 282:478-485 (2007)). CAR requiere activación post- traduccional por una fosfopanteteína transferasa (PPTase) que convierte la enzima apo inactiva a la enzima holo activa (Hansen ef al., Appl.Environ.Microbiol 75:2765-2774 (2009)). La expresión del gene npt, que codifica una PPTase específica, mejoró la actividad de la enzima. Una enzima similar encontrada en Streptomyces griseus es codificada por los genes griC y griD. Esta enzima ha sido indicada para convertir 3- amino-4-hidroxiácido benzoico a 3-amino-4-hidroxibenzaldehido, como la supresión de ya sea griC o griD conduce a acumulación del ácido 3- acetilamino-4-hidroxibenzoico, un producto de derivación del metabolismo del ácido 3-acetilamino-4-hidroxibenzoico (Suzuki, ef al., J. Antibiot. 60(6):380-387 (2007)). La PPTase de S. griseus es probablemente codificada por SGR_665, como se predice por homología de secuencia al gene npt de Nocardia iowensis.
Una enzima con características similares, alfa-aminoadipato reductasa (AAR, EC 1.2.1.31), participa en las trayectorias de la biosíntesis de lisina en algunas especies fúngicas. Esta enzima naturalmente reduce alfa-aminoadipato a alfa-aminoadipato semialdehído. El grupo carboxilo es primero activado a través de la formación dependiente de ATP de un adenilato que es entonces reducido por NAD(P)H para proporcionar el aldehido y AMP. Como CAR, esta enzima utiliza magnesio y es activada por una PPTase. Enzimas para AAR y sus PPTase correspondientes se encuentran en Saccharomyces cerevisiae (Morris ef al., Gene 98:141-145 (1991)), Candida albicans (Guo et al., Mol.Genet.Genomics 269:271-279 (2003)), y Schizosaccharomyces pombe (Ford et al., Curr.Genet. 28:131-137 (1995)). La AAR de S. pombe presenta actividad significante cuando es expresada en E. coli (Guo ef al., Yeast 21:1279-1288 (2004)). La AAR de Penicillium chrysogenum acepta S-carboximetil-L-cisteína como un sustrato alterno, pero no reacciona con adipato, L-glutamato o diaminopimelato (Hijarrubia et al., J Biol.Chem. 278:8250-8256 (2003)). el gene que codifica la PPTase de P. chrysogenum no se ha identificado a la fecha y no se identificaron obstáculos de alta confianza por búsqueda de homología de comparación de secuencia. 2.3.1.a Aciltransferasa (fosfotransacilasa): Una enzima con actividad de fosfotransbenzoilasa es usada para interconvertir benzoil-CoA y (benzoiloxi)fosfonato (Trayectoria F de la Figura 10). Una enzima similar con actividad fosfotrans-p-metilbenzoilasa interconvierte p-metilbenzoil-CoA y (p-metilbenzoiloxi) fosfonato (Trayectoria F de la Figura 11). Las aciltransferasas de transferencia de fosfato ejemplares incluyen fosfotransacetilasa (EC 2.3.1.8) y fosfotransbutirilasa (EC 2.3.1.19). el gene pía de E. coli codifica una fosfotransacetilasa que convierte reversiblemente acetil-CoA en acetil-fosfato (Suzuki, Biochim.Biophys.Acta 191:559-569 (1969)). Esta enzima puede también convertir propionil-CoA propionilfosfato (Hesslinger eí al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)). Otras fosfato acetiltransferasas que presentan actividad en propionil-CoA se encuentran en Bacillus subtilis (Rado eí al., Biochim.Biophys.Acta 321:114-125 (1973)), Clostridium kluyveri (Stadtman, 1:596-599 (1955)), y Tn' ermotoga marítima (Bock eí al., J Bacteriol. 181:1861-1867 (1999)). De manera similar, el gene ptb de C. acetobutilicum codifica fosfotransbutirilasa, una enzima que convierte reversiblemente butiril-CoA en butiril-fosfato (Wiesenborn eí al., Appl Environ. Microbiol 55:317-322 (1989); Walter eí al., Gene 134:107-111 (1993)). Genes ptb adicionales se encuentran en bacterias que producen butirato L2-50 (Louis eí a/., J. Bacteriol. 186:2099-2106 (2004)) y Bacillus megaterium (Vázquez eí al., Curr. Microbiol 42.345-349 (2001)). 2.7.2.a Fosfotransferasa, aceptor de grupo carboxilo (quinasa): Quinasas o enzimas fosfotransferasas transforman ácidos carboxílicos a ácidos fosfónicos con hidrólisis concurrente de una ATP. Tal enzima es usada para convertir benzoato a (benzoiloxi)fosfonato (Figura 10, Trayectoria H) y p-toluato a (p-metilbenzoiloxi)fosfonato (Figura 11, Trayectoria H). Estas transformaciones exactas no han sido demostradas a la fecha. Enzimas ejemplares incluyen butirato quinasa (EC 2.7.2.7), isobutirato quinasa (EC 2.7.2.14), aspartoquinasa (EC 2.7.2.4), acetato quinasa (EC 2.7.2.1) y gamma-glutamil quinasa (EC 2.7.2.11). Butirato quinasa cataliza la conversión reversible de butiril-fosfato a butirato durante la acidogénesis en especies Clostridial (Cary et al., Appl.Environ.Microbiol 56:1576-1583 (1990)). La enzima de Clostridium acetobutilicum es codificada por ya sea los dos productos del gene buk (Huang eí al., J Mol. Microbio! Biotechnol 2:33-38 (2000)). Otras enzimas butirato quinasas se encuentran en C. butyricum y C. tetanomorphum (TWAROG ef al., J Bacterio!. 86:112-117 (1963)). Una enzima relacionada, isobutirato quinasa de Thermotoga marítima, fue expresada en E. coli y cristalizada (Diao eí al., J Bacteriol. 191:2521-2529 (2009); Diao eí al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 59:1100-1102 (2003)). Aspartoquinasa cataliza la fosforilación dependiente de ATP de aspartato y participa en la síntesis de varios aminoácidos. La enzima aspartoquinasa III en E. coli, codificada por lysC, tiene un amplio rango de sustrato y tos residuos catalíticos involucrados en la especificidad del sustrato han sido elucidados (Keng ef al., Arch.Biochem.Biophys. 335:73-81 (1996)). Dos quinasas adicionales en E. coli son acetato quinasa y gamma-glutamil quinasa. La acetato quinasa de E. coli, codificada por ackA (Skarstedt et al., J.Biol.Chem. 251:6775-6783 (1976)), fosforila propionato además de acetato (Hessiinger et al., Mol.Microbiol 27:477-492 (1998)). La gamma-glutamil quinasa de E. coli, codificada por proB (Smith ef al., J. Bacterio!. 157:545-551 (1984a)), fosforila el grupo de ácido carbónico gamma de glutamato. 2.8.3.a CoA transferasa (10/11 A): CoA transferasas catalizan la transferencia reversible de una porción de CoA de una molécula a otra. La Trayectoria A de la Figura 10 es catalizada por una enzima con actividad de benzoil-CoA transferasa. En esta transformación, se forma benzoil-CoA de benzoato por la transferencia del grupo CoA de un donador de CoA tal como acetil-CoA, succinil-CoA u otros. p-Metilbenzoil-CoA transferasa cataliza una reacción similar de p-toluato en la Trayectoria A de la Figura 11. Enzimas de CoA transferasas ejemplares que reaccionan con sustratos similares incluyen cinamoil-CoA transferasa (EC 2.8.3.17) y bencilsuccinil-CoA transferasa. Cinamoil-CoA transferasa, codificada por fldA en Clostridium sporogenes, transfiere una porción de CoA de cinamoil-CoA a una variedad de sustratos de ácido aromático que incluyen fenilacetato, 3-fenilpropionato y 4-fenilbutirato (Dickert et al., Eur.J Biochem. 267:3874-3884 (2000)). Bencilsuccinil-CoA transferasa utiliza succinil-CoA o maleil-CoA como el donador de CoA, formando bencilsuccinil-CoA de bencilsuccinato. Esta enzima se caracteriza en la desnitrificación de la bacteria Thauera aromática, donde es codificada por bbsEF (Leutwein et al., J Bacteriol. 183:4288-4295 (2001)).
Enzimas CoA transferasa adicionales con diversos rangos de sustratos incluyen succinil-CoA transferasa, 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, butiril-CoA transferasa, glutaconil-CoA transferasa y acetoacetil-CoA transferasa. Los productos del gene de catl, cat2, y cat3 de Clostridium kluyveri han sido mostrados por presentar actividad de succinil-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA, y butiril-CoA transferasa, respectivamente (Seedorf eí al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S. A 105:2128-2133 (2008); Sohling eí al., J Bacterio!. 178:871-880 (1996b)). Actividades similares de CoA transferasa también están presentes en Trichomonas vaginalis (van Grinsven eí al., J.Biol.Chem. 283:1411-1418 (2008)) y Trypanosoma brucei (Riviere eí al., J.Biol.Chem. 279:45337-45346 (2004)). La enzima glutaconil-CoA-transferasa (EC 2.8.3.12) de la bacteria anaeróbica Acidaminococcus fermentans reacciona con glutaconil-CoA y 3-butenoil-CoA (Mack eí al., Eur.J.Biochem. 226:41-51 (1994)). Los genes que codifican esta enzima son gctA y gctB. Esta enzima tiene actividad reducida pero detectable con otros derivados de CoA que incluyen glutaril-CoA, 2-hidroxiglutaril-CoA, adipil-CoA, crotonil-CoA y acrilil-CoA (Buckel eí al., Eur.J Biochem. 118:315-321 (1981)). La enzima ha sido clonada y expresada en E. coli (Mack eí al., Eur.J.Biochem. 226:41-51 (1994)). La actividad de glutaconato CoA-transferasa también se ha detectado en Clostridium sporosphaeroides y Clostridium symbiosum. Acetoacetil-CoA transferasa utiliza acetil-CoA como el donador de CoA. Esta enzima es codificada por los genes atoA (subunidad alfa) y atoD (subunidad beta) de E. coli (Korolev eí al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 58:2116-2121 (2002); Vanderwinkel eí al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 33:902-908 (1968)). Esta enzima tiene un amplio rango de sustrato (Sramek et al., Arch.Biochem.Biophys. 171:14-26 (1975)) y se ha mostrado por transferir la porción CoA de acetil-CoA a una variedad de sustratos, que incluyen isobutirato (Matthies et al., Appl Environ.Microbiol 58:1435-1439 (1992)), valerato (Vanderwinkel et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 33:902-908 (1968)) y butanoato (Vanderwinkel ef al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 33:902-908 (1968)). Existen enzimas similares en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Duncan et al., Appl. Environ. Microbio! 68:5186-5190 (2002)), Clostridium acetobutilicum (Cary eí al., Appl. Environ. Microbio! 56:1576-1583 (1990); Wiesenborn ef al., Appl. Environ. Microbio! 55:323-329 (1989)), y Clostridium saccharoperbutilacetonicum (Kosaka eí al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)). 3.1.2.a CoA hidrolasa (10/11 A): Benzoil-CoA y P-metilbenzoil-CoA pueden ser hidrolizados a sus correspondientes ácidos por CoA hidrolasas o tioesterasas en la clase EC 3.1.2 (Trayectoria A de la Figuras 10 y 11). Tioésteres CoA ejemplares que hidrolizan benzoil- CoA y/o sustratos similares incluyen 4-hidroxibenzoil-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.23) y fenilglioxal-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.25). el gene orfl de Azoarcus evansii codifica una enzima con actividad de benzoil-CoA hidrolasa que participa en el metabolismo de benzoato (Ismailo, Arch. Microbio! 190:451-460 (2008)). Esta enzima, cuando es expresada heterólogamente en E. coli, demuestra actividad en un número de sustratos alternos. Enzimas adicionales de benzoil-CoA hidrolasa se identificaron en agrupamientos del gene de degradación de benzoato de Magnetospirillum magnetotacticum, Jannaschia sp. CCS1 y Sagittula stellata E-37 por similitud de secuencia (Ismailo, Arch.Microbiol 190:451-460 (2008)). La 4-hidroxibenzoil-CoA hidrolasa de Pseudomonas sp. CBS3 acepta benzoil-CoA y p-metilbenzoil-CoA como sustratos y ha sido expresada heterólogamente y caracterizada en E. coli (Song et al., Bioorg.Chem. 35:1-10 (2007)). Enzimas adicionales con actividad demostrada de benzoil-CoA hidrolasa incluyen la palmitoil-CoA hidrolasa de Mycobacterium tuberculosis (Wang et al., Chem. Biol. 14:543-551 (2007)) y la acil-CoA hidrolasa de E. coli codificada por entH (Guo ef al., Biochemistry 48:1712-1722 (2009)).
Varias CoA hidrolasas con amplios rangos de sustratos son enzimas adecuadas para hidrolizar benzoil-CoA y/o p-metilbenzoil-CoA. Por ejemplo, la enzima codificada por acot12 de cerebro de Rattus norvegicus (Robinson et al., Biochem.Biophys. Res.Commun. 71:959-965 (1976)) puede reaccionar con butiril-CoA, hexanoil-CoA y malonil-CoA. La tioesterasa de ácido dicarboxílico humana, codificada por acot8, presenta actividad en glutaril-CoA, adipil-CoA, suberil-CoA, sebacil-CoA, y dodecanodioil-CoA (Westin et al., J.Biol.Chem. 280:38125-38132 (2005)). El homólogo de E. coli más cercano a esta enzima, tesB, también puede hidrolizar un rango de CoA tiolésteres (Naggert et al., J Biol Chem 266:11044-11050 (1991)). Una enzima similar también ha sido caracterizada en el hígado de rata (Deana R., Biochem Int 26:767- 773 (1992)). 4.1.1a. Carboxi-liasa (6/7 E): Enzimas descarboxilasas en la clase EC 4.1.1 son usadas para convertir benzoato a benceno (Trayectoria E de la Figura 10) y p-toluato a tolueno (Trayectoria E de la Figura 11). Enzimas ejemplares que reaccionan con estos o sustratos similares incluyen benceno carboxilasa, vanillato descarboxilasa, cinamato descarboxilasa, aminobenzoato descarboxilasa y una variedad de hidroxibenzoato descarboxilasas. Enzimas descarboxilasas pueden ser oxidativas o no oxidativas, dependiendo de los cofactores utilizados (Lupa et al., Genomics 86:342-351 (2005a)). Una enzima predicha por tener actividad de benzoato carboxilasa se identificó en un BF de clon de cultivo enriquecido con bacteria de Clostridia (Abu et al., Environ.Microbiol (2010)).
Un número de descarboxilasas caracterizadas con actividad demostrada en aromáticos hidroxilados tales como 4-hidroxibenzoato, 2,3-dihidroxibenzoato, 3,4-dihidroxibenzoato, 2,6-dihidroxibenzoato y 4,5-dihidroxiftalato también pueden presentar actividad en sustratos alternos tales como p-toluato o benzoato. Enzimas ejemplares de hidroxibenzoato descarboxilasas incluyen la 4,5-dihidroxiftalato descarboxilasa de Comamonas testosteroni (Nakazawa et al., Appl.Environ. Microbio! 36:264-269 (1978)), la 2,3-dihidroxibenzoato descarboxilasa de Aspergillus niger (Kamath ef al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 145:586-595 (1987)) y la 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato descarboxilasa de E. coli (Zhang et al., J Bacteriol. 182:6243-6246 (2000)). 4-hidroxibenzoato descarboxilasas ejemplares son codificadas por shdBD y ubiD de Sedimentibacter hidroxibenzoicus (anteriormente Clostridium hidroxibenzoicum) y ubiD de Enterobacter cloacae P240 (Matsui eí al., Arch. Microbio! 186:21-29 (2006a); He eí al., Eur.J Biochem. 229:77-82 (1995)). La 4-hidroxibenzoato descarboxilasa de la anaerobia facultativa, Enterobacter cloacae, codificada por ubiD, ha sido probada para determinar la actividad en sustratos múltiples y se mostró por ser inducida por tanto ácido 4-hidroxibenzoico como ácido 4-aminobenzoico ( atsui eí al., Arch.Microbiol 186:21-29 (2006b)). Los bsdBCD de Bacillus subtilis codifican una 4-hidroxibenzoato/vanillato descarboxilasa no oxidativa reversible (Lupa et al., Can.J Microbiol 54:75-81 (2008)). Esta enzima fue heterólogamente expresada en E. coli. Descarboxilasas similares han sido indicadas en varios otros organismos (Lupa et al., Genomics 86:342-351 (2005b)) y genes para algunos de estos están listados abajo.
Una clase adicional de descarboxilasas ha sido caracterizada que cataliza la descarboxilación de cinamato (fenilacrilato) y derivados de cinamato sustituidos. Estas enzimas son comunes en una variedad de organismos y genes específicos que codifican estas enzimas que se han clonado y expresado en E. coli incluyen pad 1 de Saccharomyces cerevisae (Clausen et al., Gene 142:107-112 (1994)), pdc de Lactobacillus plantarum (Barthelmebs et al., 67:1063-1069 (2001); Q¡ et al., Metab Eng 9:268-276 (2007); Rodríguez ef a/., J. Agrie. Food Chem. 56:3068-3072 (2008)), pofK (pad) de Klebsiella oxytoca (Uchiyama ef a/., Biosci.Biotechnol.Biochem. 72:116-123 (2008); Hashidoko eí a/., Biosci.Biotech.Biochem. 58:217-218 (1994)), Pedicoccus pentosaceus (Barthelmebs ef a/., 67:1063-1069 (2001)), y padC de Bacillus subtilis y Bacillus pumilus (Shingler eí al., 174:711-724 (1992)). Una descarboxilasa de ácido ferúiico de Pseudomonas fluorescens también ha sido purificada y caracterizada (Huang eí al., J.Bacteriol. 176:5912-5918 (1994)). Enzimas en esta clase se han mostrado por ser estables y no requieren ya sea co-factores exógenos o internamente unidos, de este modo haciendo a estas enzimas adecuadas para biotransformaciones (Sariaslani, Annu.Rev. Microbiol. 61:51-69 (2007)). 4.1.99.a Descarbonilasa: Una enzima de descarbonilasa es usada para convertir benzaldehído a benceno (Trayectoria C de la Figura 10) y p-metilbenzaldehído a tolueno (Trayectoria C de la Figura 11). Enzimas de descarbonilasa catalizan la etapa final de la biosíntesis de alcano en plantas, mamíferos, insectos y bacteria (Dennis et al., Arch.Biochem.Biophys. 287:268-275 (1991)). Descarbonilasas no oxidativas transforman aldehidos en alcanos con la liberación concurrente de CO. Enzimas ejemplares de descarbonilasa incluyen octadecanal descarbonilasa (EC 4.1.99.5), esterol desaturasa y aldehido descarbonilasa graso, el gene CER1 de Arabidopsis thaliana codifica una descarbonilasa de ácido graso involucrada en la formación de cera epicuticular (US 6,437,218). Las descarbonilasas de ácido graso adicionales se encuentran en Medicago truncatula, Vitis vinifera y Oryza sativa (Solicitud de Patente Estadounidense 2009/0061493). Una descarbonilasa que contiene cobalto-porfirina se purificó y caracterizó en las algas Botryococcus braunii; sin embargo, ningún gene ha sido asociado con esta actividad a la fecha (Dennis eí al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89:5306-5310 (1992)). Una descarbonilasa que contiene cobre de Pisum sativum también se purificó y caracterizó, pero aún no está asociada con un gene (Schneider-Belhaddad et al., Arch.Biochem.Biophys. 377:341-349 (2000)).
Alternativamente, una descarbonilasa oxidativa puede convertir un aldehido en un alcano. Las descarbonilasas oxidativas son enzimas del citocromo P450 que utilizan NADPH y 02 como cofactores y liberan C02, agua y NADP+. Esta actividad se demostró en los productos del gene CYP4G2v1 y CYP4G1 de Musca domestica y Drosophila melanogaster (Solicitud de Patente Estadounidense 2010/0136595). Enzimas adicionales con actividad oxidativa de descarbonilasa pueden ser identificadas por homología de secuencia en otros organismos tales como Mamestra brassicae, Helicoverpa zea y Acyrthosiphon pisum.
LOC100164072 XP_001944205.1 193650239 Acyrthosiphon pisum 6.2.1 a Ácido-tiol ligasa (8A, 11 B) : La activación dependiente de ATP de benzoato a benzoil-CoA o p-toluato a p-metilbenzoil-CoA (Trayectoria A de la Figuras 10 y 11) es catalizada por una CoA sintetasa o Ácido-tiol ligasa. CoA ligasas que forman AMP activan los ácidos aromáticos a sus derivados CoA correspondientes, mientras ligadas de CoA que forman ADP son en general reversible. Benzoil-CoA ligasas que forman AMP ejemplares de cepas CIB de Thauera aromática y Azoarcus sp. han sido caracterizadas (López Barragan er al., J Bacteriol. 186:5762-5774 (2004); Schuhle et al., J. Bacterio!. 185:4920-4929 (2003)). Alternativamente, CoA ligasas que forman AMP que reaccionan con sustratos estructuralmente similares pueden tener actividad en benzoato o p-toluato. La CoA-ligasa de ciclohexancarboxilato que forma AMP de Rhodopseudomonas palustris, codificada por aliA, está bien caracterizada, y la alteración del sitio activo ha sido mostrada para ¡mpactar la especificidad del sustrato de la enzima (Samanta et al., Mol. Microbio! 55:1151-1159 (2005)). Esta enzima también funciona como una ciclohex-1 -eno-1 -carboxilato CoA-ligasa durante la degradación del anillo de benceno aromático (Egland et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S. A 94:6484-6489 (1997)). CoA ligasas ejemplares adicionales incluyen dos fenilacetato-CoA ligasas caracterizadas de P. chrysogenum (Lamas-Maceiras ef al., Biochem.J 395:147-155 (2006); Wang et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 360:453-458 (2007)); Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 360:453-458 (2007)), la fenilacetato-CoA ligasa de Pseudomonas putida (Martinez-Blanco et al., J Biol.Chem. 265:7084-7090 (1990)), y la 6-carboxihexanoate-CoA ligasa de Bacillus subtilis (Bower et al., J Bacteriol. 178:4122-4130 (1996)).
Las CoA ligasas que forman ADP que catalizan estas transformaciones exactas no han sido caracterizadas a la fecha; sin embargo, varias enzimas con amplias especificidades de sustrato se han descrito en la literatura. La acetil-CoA sintetasa que forma ADP (ACD, EC 6.2.1.13) de Archaeoglobus fulgidus, codificada por A F 1211 , se mostró por operar en una variedad de sustratos de cadena lineal y ramificada que incluyen isobutirato, isopentanoato, y fumarato (Musfeldt ef al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). Una segunda ACD reversible en Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1983, también fue indicada por tener un amplio rango de sustrato con alta actividad en compuestos aromáticos fenilacetato e indolacetato ( usfeldt et al., supra). La enzima de Haloarcula marismortui, anotada como una succinil-CoA sintetasa, acepta propionato, butirato y ácidos de cadena ramificada (isovalerato e isobutirato) como sustratos, y se mostró por operar en las direcciones hacia adelante y hacia atrás (Brasen et al., Arch.Microbiol 182:277-287 (2004)). La ACD codificada por PAE3250 de crenarchaeon hipertermofílico de Pyrobaculum aerophilum mostró el rango de sustrato más amplio de todas las ACD caracterizadas, que reaccionan con acetil-CoA, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetil-CoA (Brasen y Schonheit, Arch.Microbiol 182:277-287 (2004)). La ingeniería o evolución dirigida puede ser usada para modificar esta enzima para operar a la temperatura fisiológica el organismo hospedero. Las enzimas de A. fulgidus, H. marismortui y P. aerophilum todas han sido clonadas, funcionalmente expresadas, y caracterizada en E. coli (Brasen y Schonheit, Arch.Microbiol 182:277-287 (2004); Musfeldt y Schonheit, J Bacterio!. 184:636-644 (2002)). Una enzima adicional es codificada por sucCD en E. coli, la cual naturalmente cataliza la formación de succinil-CoA de succinato con el consumo concomitante de una ATP, una reacción la cual es reversible in vivo (Buck eí al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)). La acil CoA ligasa de Pseudomonas putida ha sido indicada funcionar en varios sustratos alifáticos que incluyen ácidos acético, propiónico, butírico, valérico, hexanoico, heptanoico y octanoico y en compuestos aromáticos tales como ácidos fenilacético y fenoxiacético (Fernandez-Valverde ef al., Appl.Environ.Microbiol. 59:1149-1154 (1993)). Una enzima relacionada, malonil CoA sintetasa (6.3.4.9) de Rhizobium leguminosarum podría convertir varios diácidos, es decir, etil-, propil-, alil-, isopropil-, dimetil-, ciclopropil-, ciclopropilmetileno-, ciclobutil-, y bencil-malonato en sus monotioésteres correspondientes (Pohl ef al., J.Am.Chem.Soc. 123:5822-5823 (2001)).
Ejemplo VIII Trayectorias a 2,4-pentadienoato de piruvato, ornitina y alanina Este ejemplo muestra trayectorias de piruvato, ornitina y alanina a 2,4-pentadienoato.
La Figura 12 muestra la conversión de piruvato a 2,4- pentadienoato. Esta conversión puede ser lograda en cuatro etapas enzimáticas. Piruvato y acetaldehído son primero condensados a 4-hidroxi-2-oxovalerato por 4-hidroxi-2-cetovalerato aldolasa (Etapa A de la Figura 12). El producto 4-hidroxi-2-oxovalerato es después deshidratado a 2-oxopentenoato (Etapa B de la Figura 12). La subsecuente reducción y deshidratación de 2-oxopentenoato proporciona 2,4-pentadienoato (Etapas C/D de la Figura 12).
La Figura 13 muestra trayectorias de alanina u ornitina a 2,4-pentadienoato. En la etapa A de la Figura 13, alanina y acetil-CoA se unen por AKP tiolasa para formar AKP. En una trayectoria, AKP es desaminada a acetilacrilato (Etapa B). El grupo 4-oxo de acetilacrilato es entonces reducido y deshidratado a 2,4-pentadienoato (Etapas C/D). En una trayectoria alterna, AKP es convertida a 2,4-dioxopentanoato por una aminotransferasa o deshidrogenasa (Etapa E). Reducción del grupo 2- o 4-oxo de 2,4-dioxopentanoato proporciona 2-hidrox¡-4-oxopentanoato (Etapa H) o 4-hidroxi-2-oxovalerato (Etapa K), respectivamente. El 4-hidroxi-2-oxovalerato puede alternativamente ser formado por la reducción de AKP a 2-amino-4-hidroxipentanoato (Etapa J) seguido por transaminación o desaminación oxidativa (Etapa L). Una vez formado, el 4-hidroxi-2-oxovalerato puede ser convertido a 2,4-pentadienoato en tres etapas enzimáticas como se muestra en la Figura 12 (Etapas B/C/D de la Figura 12). El intermediario 2-hidroxi-4-oxopentanoato puede sufrir deshidratación a acetilacrilato (Etapa F) seguido por reducción y deshidratación (Etapas C/D).
Un punto de entrada alterno en las trayectorias de AKP mostrado en la Figura 13 es ornitina. Una ornitina aminomutasa es primero requerida para convertir ornitina a 2,4-diaminopentanoato (Etapa M). El intermediario 2,4-diaminopentanoato es después convertido a AKP por transaminacion o desaminación oxidativa (Etapa N).
Se entiende que cualquiera del estereoisómero D- o L- de alanina u ornitina puede servir como el precursor o intermediario a una trayectoria de 2,4-pentadienoato mostrada en la Figura 13. Los estereoisómeros D- y L- de alanina u ornitina son fácilmente interconvertidos por enzimas de alanina racemasa u ornitina racemasa.
Las enzimas para catalizar las transformaciones mostradas en la Figuras 5 y 6 son categorizadas por el número EC (Tabla 2) y descritas adicionalmente abajo. 1.1.1.a Oxidorreductasa (oxo a alcohol): un número de transformaciones en la Figuras 5 y 6 involucradas en la reducción de una cetona a un alcohol. En la Etapa C de la Figura 12, se reduce 2-oxopentenoato a 2-hiroxipentenoato. Una transformación similar es la reducción del ceto-ácido 2,4-dioxopentanoato a su correspondiente hidroxi-ácido, 2-hidroxi-4-oxopentanoato (Etapa H de la Figura 13). Las etapas C, J y K de la Figura 13 está implicadas en la reducción del grupo 4-oxos de AKP, 2,4-dioxopentanoato y acetüacrilato a sus correspondientes alcoholes. Estas transformaciones son catalizadas por enzimas de oxidorreductasa en la clase 1.1.1. de EC.
Varias deshidrogenasas de alcohol ejemplares se convierten de una cetona a un grupo funcional alcohol. Dos de estas enzimas de E. coli son codificadas por malato deshidrogenasa (mdh) y lactato deshidrogenasa (IdhA). Además, el lactato deshidrogenasa de Ralstonia eutropha se ha mostrado por demostrar altas actividades en 2-cetoácidos de varias longitudes de cadena incluyendo lactato, 2-oxobutirato, 2-oxopentanoato y 2-oxoglutarato (Steinbuchel et al., Eur.J.Biochem. 130:329-334 (1983)). La conversión de alfa-cetoadipato en alfa-hidroxiadipato es catalizada por 2-cetoadipato reductasa, una enzima encontrada en placenta humana y de rata (Suda et al., Arch.Biochem.Biophys. 176:610-620 (1976); Suda et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 77:586-591 (1977)). Una oxidorreductasa candidato adicional es la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa mitocondrial (bdh) del corazón humano el cual ha sido clonado y caracterizado (Marks et al., J.Biol.Chem. 267:15459-15463 (1992)). Las enzimas de alcohol deshidrogenasa de C. beijerinckii (Ismaiel et al., J.Bacteriol. 175:5097-5105 (1993)) y T. brockii (Lamed et al., Biochem.J. 195:183-190 (1981); Peretz ef al., Biochemistry. 28:6549-6555 (1989)) se convierten de acetona a isopropanol. La metil etil cetona reductasa cataliza la reducción de MEK a 2-butanol. Las enzimas reductasa MEK ejemplares se pueden encontrar en Rhodococcus ruber (Kosjek ef al., Biotechnol Bioeng. 86:55-62 (2004)) y Pyrococcus furiosus (van der ef al., Eur.J.Biochem. 268:3062-3068 (2001)). 1.4.1.a Oxidorreductasa (desaminación): Las enzimas en la clase 1.4.1 de EC cataliza la desaminación oxidativa de grupos amino con NAD + , NADP+ o FAD como aceptor. Esta enzima es requerida para catalizar la desaminación oxidativa de AKP a 2,4-dioxopentanoato (Figura 13, la etapa E), 2-amino-4-hidroxipentanoato a 4-hidroxi-2-oxovalerato (Figura 13, la etapa L) y 2,4-diaminopentanoato a AKP (Figura 13, la etapa N). La conversión de 2,4-diaminopentanoato a AKP (Etapa N de la Figura 13) es catalizada por 2,4-diaminopentanoato deshidrogenasa (EC 1.4.1.12). Las enzimas 2,4-diaminopentanoato deshidrogenasa se han caracterizado en organismos que sufren fermentación anaeróbica de ornitina, tai como el producto del gene ord de Clostridium sticklandii (Fonknechten, J.Bacteriol. In Press: (2009)). Los candidatos del gene 2,4-diaminopentanoato deshidrogenasa adicionales pueden ser inferidos en otros organismos por similitud de secuencia al producto del gene ord. Una enzima relacionada, 3,5-diaminohexanoato deshidrogenasa (EC 1.4.1.11), cataliza la desaminación oxidativa de 3,5-diaminohexanoato a 5-amino-3-oxohexanoato. el gene que codifican esta enzima, kdd, fue recientemente identificada en Fusobacterium nucieatum (Kreimeyer eí al., J Biol.Chem. 282:7191-7197 (2007)). La enzima ha sido purificada y caracterizada en otros organismos que fermentan lisina pero los genes asociados con estas enzimas no han sido identificados hasta la fecha (Baker eí al., J Biol.Chem. 247:7724-7734 (1972); Baker ef al., Biochemistry 13:292-299 (1974)). Candidatos en Myxococcus xanthus, Porphiromonas gingivalis W83 y otros organismos secuenciados pueden ser inferidos por homología de secuencia.
Los sustratos AKP y 2-amino-4-hidroxipentanoato (Etapas E y L de la Figura 13), son similares a alfa-aminoácidos y pueden servir como sustratos alternos para enzimas de aminoácido deshidrogenasa tal como glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2), leucina deshidrogenasa (EC 1.4.1.9), y aspartato deshidrogenasa (EC 1.4.1.21). El glutamato deshidrogenasa cataliza el NAD(P)+ reversible dependiente de la conversión de glutamato a 2-oxoglutarato. Las enzimas ejemplares son codificadas por gd A en Escherichia coli (McPherson ef al., Nucleic. Ácidos Res. 11:5257-5266 (1983); Korber ef al., J.Mol.Biol. 234:1270-1273 (1993)), gdh en Thermotoga maritima (Kort eí al., Extremophiles 1:52-60 (1997); Lebbink eí al., J.Mol.Biol. 280:287-296 (1998); Lebbink ef al., J.Mol.Biol. 289:357-369 (1999)), y gdhA1 en Halobacterium salinarum (Ingoldsby eí al., Gene. 349:237-244 (2005)). Enzimas de glutamato deshidrogenasa adicionales se han caracterizado en Bacillus subtilis (Khan eí al., Biosci.Biotechnol Biochem. 69:1861- 1870 (2005)), Nicotiana tabacum (Purnell eí al., Planta 222:167-180 (2005)), Oryza sativa (Abiko ef al., Plant Cell Physiol 46:1724-1734 (2005) ), Haloferax mediterranei (Díaz et al., Extremophiles. 10:105-115 (2006) ) y Halobactreium salinarum (Hayden et al., FEMS Microbio! Lett. 211:37-41 (2002)). La enzima de Nicotiana tabacum está compuesta de subunidades alfa y beta codificadas por gdhl y gdh2 (Purnell et al., Planta 222:167-180 (2005)). Una leucina deshidrogenasa ejemplar es codificada por Idh de Bacillus cereus. Esta enzima reacciona con un intervalo de sustratos que incluyen leucina, isoleucina, valina, y 2-aminobutanoato (Stoyan et al., J.Biotechnol 54:77-80 (1997); Ansorge eí al., Biotechnol Bioeng. 68:557-562 (2000)). El aspartato deshidrogenasa de Thermotoga maritime, codificados por nadX, está involucrado en la biosíntesis de NAD (Yang et al., J.Biol.Chem. 278:8804-8808 (2003)). 2.6.1. a Aminotransferasa: Varias transformaciones en la Figura 13 son catalizadas por enzimas aminotransferasa o transaminasa, que incluyen la conversión de AKP a 2,4-dioxopentanoato (Etapa E), 2-amino-4-hidroxipentanoato a 4-hidroxi-2-oxovalerato (Etapa L) y 2,4-diaminopentanoato a AKP (Etapa N). Varias aminotransferasas se convierten a aminoácidos y derivados de sus 2-oxoácidos correspondientes. Estas enzimas son particularmente bien adaptadas para catalizar las transformaciones descritas en las Etapas E y L de la Figura 13 (es decir, AKP aminotransferasa y 2-amino-4-hidroxipentanoato aminotransferasa). La selección de un aminoácido aminotransferasa apropiado para estas transformaciones puede depender de la estereoquímica del sustrato. Cuando el sustrato está en la configuración D, se puede utilizar un D-aminoácido aminotransferasa (EC 2.6.1.21), mientras que el L-estereoisómero es el sustrato preferido de un aminoácido aminotransferasa L tal como aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1). El aspartato aminotransferasa es naturalmente transferido a un grupo oxo de oxatoacetato a glutamato, formando alfa-cetoglutarato y aspartato. La actividad de aspartato aminotransferasa es catalizada por, por ejemplo, el productos del gene de aspC de Escherichia coli (Yagi et al., 100:81-84 (1979); Yagi et al., 113:83-89 (1985)), AAT2 de Saccharomyces cerevisiae (Yagi ef al., 92:35-43 (1982)) y ASP5 de Arabidopsis thaliana (Kwok et al., 55:595- 604 (2004); de la et al., 46:414-425 (2006); Wilkie et al., Protein Expr.Purif. 12:381-389 (1998)). La enzima de Rattus norvegicus se ha mostrado por transaminar sustratos alternos tal como ácido 2-aminohexanedioico y ácido 2,4-diaminobutírico (Recasens ef al., Biochemistry 19:4583-4589 (1980)). Las aminotransferasas que trabajan en otros sustratos L-aminoácido pueden también ser capaces para catalizar estas transformaciones. La valina aminotransferasa cataliza la conversión de valina y piruvato a 2-cetoisovalerato y alanina. el gene de E. coli, avtA, codifica una enzima similar (Whalen et al., J. Bacterio!. 150:739-746 (1982)), el cual cataliza la transaminacion de a-cetobutirato para generar a-aminobutirato, a pesar que el donador amino en esta reacción no ha sido identificado (Whalen et al., J. Bacterio!. 158:571-574 (1984)), Otro candidato de enzima es alfa-aminoadipato aminotransferasa (EC 2.6.1.39), una enzima que participa en biosintesis de lisina y degradación en algunos organismos. Esta enzima se interconvierte a 2-aminoadipato y 2-oxoadipato, usando alfa-cetoglutarato como el aceptor amino. Los candidatos del gene son encontrados en Homo sapiens (Okuno eí al., Enzima Protein 47:136-148 (1993)) y Thermus thermophilus (Miyazaki ef al., Microbiology 150:2327-2334 (2004)). La enzima Thermus thermophilus, codificada por lysN, está activa con varios sustratos alternos que incluyen oxaloacetato, 2-oxoisocaproate, 2-oxoisovalerato, y 2-oxo-3-metilvalerato.
Si el sustrato está presente en el estereoisómero D, la transaminación puede ser catalizada por aminotransferasa D (EC 2.6.1.21), también conocido como D-aminoácido aminotransferasa y D-alanina aminotransferasa (DAAT). Esta clase de enzima se hace notar por su amplia especificidad de sustrato, lo cual es especifico de las especies. La D-aminotransferasa de Bacillus especies YM-1, codificadas por dat, ha sido clonada, secuenciada (Tanizawa et al., J Biol.Chem. 264:2450-2454 (1989)) y la estructura cristalina ha sido resuelta (Peisach et al., Biochemistry 37:4958-4967 (1998)). Esta enzima también ha sido diseñada por ingeniería para alterar la especificidad del sustrato (Gutiérrez eí al., Eur.J Biochem. 267:7218-7223 (2000); Gutiérrez et al., Protein Eng 11:53-58 (1998)). Los candidatos del gene adicionales son encontrados en Bacillus licheniformis ATCC 10716 (Tailor et al., Biochim.Biophys.Acta 1350:38-40 (1997)), Staphilococcus haemolyticus (Pucci ef al., J Bacterio!. 177:336-342 (1995)) y Bacillus subtilis (Martinez-Carrion eí al., J Biol.Chem. 240:3538-3546 (1965)).
La conversión de 2,4-diaminopentanoato a AKP (Etapa N de la Figura 13) es catalizada por una enzima con actividad 2,4- diaminopentanoato aminotransferasa. A pesar que esta actividad no ha sido caracterizada en las enzimas hasta la fecha, varias enzimas catalizan una transformación similar, la conversión de 2,4- diaminobutanoato a aspartato-4-semialdehído. Los candidatos de la enzima ejemplares incluyen beta-alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.18), diaminobutirato aminotransferasa (EC 2.6.1.46 y EC 2.6.1.76) y gama-aminobutirato (GABA) aminotransferasa (EC 2.6.1.19). Una enzima diaminobutirato aminotransferasa ejemplar es codificada por los productos del gene dat en Acinetobacter baumanii y Haemophilus influenza (Ikai ef al., J Bacteriol. 179:5118-5125 (1997); Ikai et al., Biol Pharm.Bull. 21:170-173 (1998)). Además de su sustrato natural, 2,4- diaminobutirato, la DAT de A. baumanii transamina las aminas terminales de lisina, 4-aminobutirato y ornitina. Los candidatos del gene diaminobutirato aminotransferasa adicionales incluyen los productos del gene ectB de Marinococcus halophilus y Halobacillus dabanensis (Zhao ef al., Curr Microbiol 53:183-188 (2006); Louis et al., Microbiology 143 (Pt 4):1141-1149 (1997)) y el producto del gene pvdH de Pseudomonas aeruginosa (Vandenende et al., J Bacteriol. 186:5596-5602 (2004)). Las enzimas diaminobutirato aminotransferasa que utilizan alfa-cetoglutarato como un aceptor amino son incluidas en la clase 2.6.1.76 EC. Estas enzimas son encontradas en Acinetobacter baumanü, La beta-alanina aminotransferasa de Pseudomonas fluorescens también acepta 2,4-diaminobutirato como un sustrato (Hayaishi et al., J Biol Chem 236:781-790 (1961)); sin embargo, esta actividad no ha sido asociada con un gene hasta la fecha. La gama-aminobutirato aminotransferasa naturalmente intercovierte semialdehído succínico y glutamato a 4-aminobutirato y alfa-cetoglutarato. Generalmente, aminotransferasas GABA reacciona con un amplio intervalo de sustratos alternos (Schulz et al., 56:1-6 (1990); Liu et al., 43:10896-10905 (2004)). Las dos Transaminasas GABA en E. coli son codificadas por gabT (Bartsch ef al., J Bacteriol. 172:7035-7042 (1990)) y puuE (Kurihara eí al., J. Biol. Chem. 280:4602-4608 (2005)). El producto del gene gabT se ha mostrado por tener especificidad de sustrato amplia (Schulz eí al., 56:1-6 (1990); Liu ef al., 43:10896-10905 (2004)). Las aminotransferasas GABA en Mus musculus y Sus scrofa han sido mostradas por reaccionar con un intervalo de sustratos alternos (Cooper, Methods Enzymol. 113:80-82 (1985)). 4.1.3.a Liasa: La condensación de piruvato y acetaldehido a 4-hidroxi-2-oxovalerato (Etapa A de la Figura 12) es catalizada por 4- hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (EC 4.1.3.39). Esta enzima participa en trayectorias para la degradación de fenoles, cresoles y catecoles. La enzima E. coli, codificada por mhpE, es muy especifica para acetaldehido como un aceptor pero acepta los sustratos alternos 2- cetobutirato o fenilpiruvato como donadores (Pollard et al., Appl Environ Microbiol 64:4093-4094 (1998)). Las enzimas similares son codificadas por los genes cmtG y todH de Pseudomonas putida (Lau et al., Gene 146:7-13 (1994); Eaton, J Bacterio!. 178:1351-1362 (1996)). En Pseudomonas CF600, esta enzima es parte de una aldolasa- deshidrogenasa heterodímera bifuncional codificada por dmpFG (Manjasetty et al., Acta Crystallogr.D.Biol Crystallogr. 57:582-585 (2001)). La funcionalidad de deshidrogenase intercovierte acetaldehido y acetil-CoA, proporcionando la ventaja de reducir las concentraciones celulares de acetaldehido, tóxico para algunas células. 4.2.1.a Deshidratasa: Deshidratación de 4-hidroxi-2- oxovalerato a 2-oxopentenoato (Etapa B de la Figura 12) es catalizada por 4-hidroxi-2-oxovalerato hidratasa (EC 4.2.1.80). Una enzima similar es requerida para catalizar la deshidratación de 4-hidroxipent-2-enoato a 2,4-pentadienoato (Etapa D de la Figura 13). 4-Hidroxi-2-oxovalerato hidratasa participa en trayectorias de degradación aromáticas y es típicamente co-transcrita con un gene que codifica una enzima con actividad 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa. Productos ejemplares del gene son codificados por mhpD de E. coli (Ferrandez et al., J Bacterio!. 179:2573-2581 (1997); Pollard et al., Eur J Biochem. 251:98-106 (1998)), rodG y cmtF de Pseudomonas putida (Lau et al., Gene 146:7-13 (1994); Eaton, J Bacteriol. 178:1351-1362 (1996)), cnbE de Comamonas sp. CNB-1 (Ma et al., Appl Environ Microbiol 73:4477-4483 (2007)) y mhpD de Burkholderia xenovorans (Wang et al., FEBS J 272:966-974 (2005)). Una enzima cercanamente relacionada, 2-oxohepta-4-eno-1 ,7- dioato hidratasa, participa en la degradación ácido 4-hidroxifenilacético, donde se convierte a 2-oxo-hept-4-eno-1 ,7-dioato (OHED) un 2-oxo-4- hidroxi-hepta-1 ,7-dioato usando magnesio como un cofactor (Burks eí al., J.Am.Chem.Soc. 120: (1998)). Los candidatos de la enzima OHED hidratasa se han identificado y caracterizado en E. coli C (Roper et al., Gene 156:47-51 (1995); Izumi et al., J Mol.Biol. 370:899-911 (2007)) y E. coli W (Prieto eí al., J Bacteriol. 178:111-120 (1996)). La comparación de secuencia recela homólogos en un amplio intervalo de bacterias, plantas y animales. Las enzimas con secuencias muy similares están contenidas en Klebsiella pneumonía (91% de identidad, valor e = 2e-138) y Salmonella entérica (91% de identidad, valor e = 4e- 138), entre otros.
Candidatos de la enzima para catalizar la deshidratación de 2-hidroxipentenoato (Figura 12, la etapa D) o 2-hidroxi-4-oxopentanoato (Figura 13, la etapa F) incluye fumarasa (EC 4.2.1.2), citramalato hidratasa (EC 4.2.1.34) y dimetilmaleato hidratasa (EC 4.2.1.85). Las enzimas de fumarasa naturalmente catalizan la deshidratación reversible de malato a fumarato. A pesar que la capacidad de .fumarasa para reaccionar con 2-hidroxipentenoato o 2-hidroxi-4-oxopentanoato como sustratos no ha sido descrita en la literatura, una riqueza de información estructural está disponible para esta enzima y otros investigadores han exitosamente diseñado por ingeniería la enzima para alterar la actividad, inhibición y localización (Weaver, 61:1395-1401 (2005)). E. coli tiene tres fumarasas: FumA, FumB, y FumC que son reguladas por condiciones de crecimiento. La FumB es sensible al oxígeno y solamente es activo bajo condiciones anaeróbicas. La FumA está activa bajo condiciones microanaeróbicas, y FumC es la enzima solamente activa en crecimiento aeróbico (Tseng et al., 183:461-467 (2001); Woods et al., 954:14-26 (1988); Guest eí al., J Gen Microbio! 131:2971-2984 (1985)). Candidatos adicionales de la enzima son encontrados en Campilobacter jejuni (Smith et al., Int.J Biochem.Cell Biol 31:961-975 (1999)), Thermus thermophilus (Mizobata et al., Arch.Biochem.Biophys. 355:49-55 (1998)) y Rattus norvegicus (Kobayashi eí al., 89:1923-1931 (1981)). Enzimas similares con alta homología de secuencia incluyen fum1 de Arabidopsis thaliana y fumC de Corynebacterium glutamicum. La fumarasa mmcBC de Pelotomaculum thermopropionicum es otra clase de fumarasa con dos subunidades (Shimoyama ef al., 270:207-213 (2007)). Citramalato hidroliasa naturalmente deshidrata 2-metilmalato a mesaconato. Esta enzima ha sido estudiada en Methanocaldococcus jannaschii en el contexto de la trayectoria a piruvato a 2-oxobutanoato, donde se ha demostrado que tiene una amplia especificidad de sustrato (Dreviand et al., J Bacteriol. 189:4391-4400 (2007)). Esta actividad de la enzima también se ha detectado en Clostridium tetanomorphum , Morganella morganii, Citrobacter amalonaticus donde se cree que participa en la degradación de glutamato (Kato et al., Arch. Microbiol 168:457-463 (1997)). La secuencia de proteína de M. jannaschii no lleva homología significante a los genes en estos organismos. La dimetílmaleato hidratasa es una enzima dependiente de Fe + y sensible al oxígeno reversible en la familia aconitasa que hidrata a dimetilmaeato para formar (2R,3S)-2,3-dimetilmalato. Esta enzima es codificada por dmdAB en Eubacterium barkeri (Alhapel et al., supra; Kollmann-Koch et al., Hoppe Seilers.Z.Physiol Chem. 365:847-857 (1984)). 4.3.1.a Amoníaco-liasa: Una enzima de amoníaco liasa es requerida para catalizar la desaminación de 2-amino-4-oxopentanoato (AKP) a acetilacrilato en la Etapa B de la Figura 13. Una enzima que cataliza esta transformación exacta no ha sido identificada. Sin embargo la AKP es estructuralmente similar a aspartato, el sustrato nativo de aspartasa (EC 4.3.1.1.)· La aspartasa es una enzima común en microorganismos, y ha sido caracterizada ampliamente (Viola, 74:295-341 (2000)). La enzima E. coli se ha mostrado para reaccionar con una variedad de sustratos alternos que incluyen aspartatofenilmetiléster, aspargina, bencil-aspartato y malato (Ma et al., 672:60-65 (1992)). Además, la evolución directa ha sido empleada en esta enzima para alterar ¡a especificidad del sustrato (Asano et al., 22:95-101 (2005)). La estructura cristalina de la aspartasa E. coli, codificada por aspA, ha sido resuelta (Shi ef al., 36:9136-9144 (1997)). Las enzimas con funcionalidad de aspartasa también se han caracterizado en Haemophilus influenzae (Sjostrom ef al., Biochim.Biophys.Acta 1324:182-190 (1997)), Pseudomonas fluorescens (Takagi et al., J.Biochem. 96:545-552 (1984)), Bacillus subtilis (Sjostrom et al., 1324:182-190 (1997)) y Serratia marcescens (Takagi eí al., 161:1-6 (1985)).
Otro candidato de la enzima para catalizar la desaminacion de AKP es 3-metilaspartasa (EC 4.3.1.2). Esta enzima, también conocida como beta-metilaspartasa y 3-metilaspartato amoníaco-liasa, naturalmente cataliza la desaminacion de treo-3-metilaspartato a mesaconato. La 3-metilaspartasa de Clostridium tetanomorphum ha sido clonada, funcionalmente expresada en E. coli, y cristalizada (Asunción et al., 57:731-733 (2001); Asunción ef al., J Biol Chem. 277:8306-8311 (2002); Botting ef al., 27:2953-2955 (1988); Goda ef al., 31:10747- 10756 (1992)). En Citrobacter amalonaticus, esta enzima es codificada por BAA28709 (Kato y Asano, Arch.Microbiol 168:457-463 (1997)). La 3-metilaspartasa también ha sido cristalizada de YG1002 E. coli (Asano eí al., FEMS Microbiol Lett. 118:255-258 (1994)) a pesar que la secuencia de proteína no aparece en bases de datos públicas tal como GenBank. La homología de secuencia se puede usar para identificar genes candidatos adicionales, que incluyen CTC_02563 in C. reían/ y ECs0761 en Escherichia coli 0157.H7. 5.1.1.a Racemasa: Las enzimas de racemasa en la clase 5.1.1 EC isomeriza aminoácidos D y L. Esta enzima puede ser requerida para incrementar la biodisponibilidad de D-alanina y/o D-ornitina y de este modo mejora la conversión de alanina a AKP (Etapa A de la Figura 13) u ornitina a 2,4-diaminopentanoato (Etapa M de la Figura 13). Las enzimas con actividad alanina racemasa (EC 5.1.1.1) y ornitina racemasa (EC 5.1.1.12) se han caracterizado. La alanina racemasa intercovierte los estereoisómeros L y D de alanina. Escherichia coli tiene dos enzimas de alanina aminomutasa, que codifica alr y dadX (Lilley eí al., Gene 129:9-16 (1993); Wild eí al., Mol Gen Genet. 198:315-322 (1985)). el gene vanT de Enterococcus gallinarum también exhibe actividad alanina racemasa cuando se expresa E. coli (Arias eí al., Microbiology 146 (Pt 7): 1727-1734 (2000)). Candidatos de la enzima alanina racemasa adicionales se han caracterizado en Bacillus subtilis y Mycobacterium tuberculosis (Pierce et al., FEMS Microbio! Lett. 283:69-74 (2008); Strych ef al., FEMS Microbio! Lett. 196:93-98 (2001)). La interconversión de D-ornitina y L-ornitina es catalizada por ornitina racemasa. La enzima codificada por el producto del gene orr de C. sticklandii es purificado y caracterizado (Fonknechten, J. Bacterio!. In Press: (2009)). Candidatos dei gene ornitina racemasa adicionales pueden ser identificados por similitud de secuencia en organismos tal como Clostridium difficile y Fusobacterium periodonticum. 5.4.3.a Aminomutasa: La ornitina aminomutasa (EC 5.4.3.5) cataliza la conversión de ornitina a 2,4-diaminopentanoato (Etapa M de ia Figura 13). Una enzima dependiente de B12 con esta actividad, codificada por oraSE de Clostridium sticklandii, ha sido clonada, secuenciada y expresada en E. coli (Chen eí al., J.Biol.Chem. 276:44744-44750 (2001)). Esta enzima preferencialmente reacciona con el estereoisómero D de ornitina (Fonknechten, J. Bacterio!. In Press: (2009)). Las enzimas de ornitina aminomutasa no han sido caracterizadas en otros organismos hasta la fecha. Enzima similares en organismos tal como Alkaliphilus oremlandii y Clostridium difficile pueden ser identificadas por similitud de secuencia. Lisina aminomutasa cataliza dos transformaciones similares: la interconversión de lisina con 2,5-diaminohexanoato (EC 5.4.3.4), y 3,6-diaminohexanoato con 3,5-diaminohexanoato (EC 5.4.3.3). Esta enzima participa en la fermentación de lisina a acetato y butirato y ha sido caracterizada en Clostridium sticklandii (Berkovitch et al., Proc.Natl.Acad.Sci.il '.S. A 101:15870-15875 (2004)) y Porphiromonas gingivalis (Tang eí al., Biochemistry 41 :8767-8776 (2002)).
Otro: El 2-Amino-4-oxopentanoato (AKP) es formado de alanina y acetil-CoA por AKP tiolasa (Etapa A en la Figura 13). La AKP tiolasa (AKPT, sin número EC) es una enzima dependiente de piridoxai fosfato que participa en degradación de ornitina en Clostridium sticklandii (Jeng et al., Biochemistry 13:2898-2903 (1974); Kenklies et al., Microbiology 145 (Pt 4):819-826 (1999)). Un agrupamiento de gene que codifican las subunidades alfa y beta de AKPT (or-2 (ortA) y or-3 (ortB)) fue recientemente descrito y las propiedades químicas de la enzima son caracterizadas (Fonknechten, J.Bacteriol. In Press: (2009)).
La enzima es capaz de operar en ambas direcciones y reacciona con el isómero D de alanina. El diseño por ingeniería o la evolución directa de la enzima puede permitir a la enzima funcionar con L-alanina como un sustrato que proporciona versatilidad de trayectoria adicional con respecto al sustrato primario. Alternativamente, la co-expresión de una enzima alanina racemasa puede mejorar la disponibilidad de sustrato. Las enzimas con alta homología de secuencia son encontrados en Clostridium difficile, Alkaíiphilus metaüiredigenes QYF, Thermoanaerobacter sp. X514, y Thermoanaerobacter tengcongenesis MB4 (Fonknechten, J.Bacteriol. In Press: (2009)).
Ejemplo IX Enzimas de Hidrogenasa y Deshidrogenasa CO Ejemplares para Extraer Equivalentes de reducción de Syngas y Enzimas de Ciclo TCA Reductivo Ejemplares Enzimas del ciclo TCA reductivo útiles en los organismos microbianos que no se originan naturalmente de la presente invención incluye uno o más de ATP-citrato liasa y tres enzimas que fijan C02: isocitrato deshidrogenasa, alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa, piruvato:ferredoxina oxidorreductasa. La presencia de ATP-citrato liasa o citrato liasa y alfa-cetoglutarato:ferredox¡na oxidorreductasa indica la presencia de ¡n ciclo TCA reductivo activo en un organismo. Las enzimas para cada etapa del ciclo TCA reductivo se muestran abajo.
ATP-citrato liasa (ACL, EC 2.3.3.8), también llamada ATP citrato sintasa, cataliza el desdoblamiento dependiente de ATP de citrato a oxaloacetato y acetil-CoA. ACL es una enzima del ciclo RTCA que ha sido estudiada en bacterias de azufre verdes Chiorobium limicola y Chiorobium tepidum. La enzima alfa(4)beta(4) heteromérica de Chiorobium limicola fue clonada y caracterizada en E. coli (Kanao et al., Eur. J. Biochem. 269:3409-3416 (2002). La enzima C. limicola, codificada por aclAB, es irreversible y la actividad de la enzima es regulada por ¡a proporción de ADP/ATP. Un ACL recombinante de Chiorobium tepidum también es expresada en E. coli y la holoenzima es reconstituida in vitro, en un estudio que explica el papel de las subunidades alfa y beta en el mecanismo catalítico (Kim y Tabita, J. Bacteriol. 188:6544-6552 (2006). Las enzimas ACL también se han identificado en Balnearium lithotrophicum, Sulfurihidrogenibium subterraneum y otros miembros de las bacterias philum Aquificae (Hugler et al., Environ. Microbiol. 9:81-92 (2007)). Esta actividad ha sido reportada también en algunos hongos. Organismos ejemplares incluyen Sordaria macrospora (Nowrousian et al., Curr. Genet. 37:189-93 (2000), AspergMus nidulans, Yarrowia Hpolytica (Hynes y Murray, Eukaryotic Cell, July: 1039-1048, (2010) y Aspergillus niger (Meijer et al. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36:1275-1280 (2009). Otros candidatos pueden ser encontrados en base a la homología de secuencia. Información relacionada a estas enzimas es tabulada a continuación: En algunos organismos la conversión de citrato a oxaloacetato y acetil-CoA proviene a través de un intermediario citril-CoA y es catalizada por dos enzimas separadas, citril-CoA sintetasa (EC 6.2.1.18) y citril-CoA Masa (EC 4.1.3.34) (Aoshima, M. , Appl. Microbiol. Biotechnol. 75:249-255 (2007). La Citril-CoA sintetasa cataliza la activación de citrato a citril-CoA. La enzima Hidrogenobacter thermophilus está compuesta de subunidades grandes y pequeñas codificadas por ccsA y ccsB, respectivamente (Aoshima ef al., Mol. Micrbiol. 52:751-761 (2004)). La citril-CoA sintetasa de Aquifex aeolicus está compuesta de subunidades alfa y beta codificadas por sucC1 y sucD1 (Hugler ef al., Environ. Microbiol. 9:81-92 (2007)). Citril-CoA Masa divide citril-CoA en oxaloacetato y acetil-CoA. Esta enzima es un homotrímero codificado por ccl en Hidrogenobacter thermophilus (Aoshima ef al., Mol. Microbiol. 52:763-770 (2004)) y aq_150 en Aquifex aeolicus (Hugler ef al., supra (2007)). Los genes para este mecanismo de convertir citrato a oxaloacetato y citril-CoA también ha sido reportado recientemente en Chlorobium tepidum (Eisen ef al., PNAS 99(14): 9509-1 (2002).
El oxaloacetato es convertido en malato por malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37), una enzima la cual funciona en las direcciones tanto hacia adelante y hacia atrás. S. cerevisiae tiene tres copias de malato deshidrogenasa, MDH1 (McAlister-Henn y Thompson, J. Bacterio!. 169:5157-5166 (1987), MDH2 (Minard y McAlister-Henn, Mol. Cell. Biol. 11:370-380 (1991); Gibson y McAlister-Henn, J. Biol. Chem. 278:25628-25636 (2003)), y MDH3 (Steffan y McAlister-Henn, J. Biol. Chem. 267:24708-24715 (1992)), la cual localiza al mitocondrión, citosol, y peroxisoma, respectivamente. E. coli se conoce por tener una malato deshidrogenasa activa codificada por mdh.
Fumarato hidratasa (EC 4.2.1.2) cataliza la hidratación reversible de fumarato a malato. Las tres fumarasas de E. coli, codificadas por fumA, fumB y fumC, son reguladas bajo diferentes condiciones de disponibilidad de oxígeno. FumB es sensible al oxígeno y está activa bajo condiciones anaeróbicas. FumA está activa bajo condiciones microanaeróbicas, y FumC está activa bajo condiciones de crecimiento aeróbico (Tseng et al., J. Bacteriol. 183:461-467 (2001);Woods et al., Biochim. Biophys. Acta 954:14-26 (1988); Guest eí al., J. Gen. Microbio!. 131:2971-2984 (1985)). S. cerevisiae contiene una copia de un gene que codifica fumarasa, FUM1 , cuyo producto se localiza tanto en el crisol como en mitocondrión (Sass ef al., J. Biol. Chem. 278:45109-45116 (2003)). Las enzimas de fumarasa adicionales son encontradas en Campilobacter jejuni (Smith eí al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31:961-975 (1999)), Thermus thermophilus (Mizobata eí al., Arch. Biochem. Biophys. 355:49-55 (1998)) y Rattus norvegicus (Kobayashi eí al., J. Biochem. 89:1923-1931 (1981)). Enzima similares con alta homología de secuencia incluyen fum1 de Arabidopsis thaliana y fumC de Corynebacterium glutamicum. La fumarasa MmcBC de Pelotomaculum thermopropionicum es otra clase de fumarasa con dos subunidades (Shimoyama ef al., FEMS Microbiol. Lett. 270:207-213 (2007)).
La fumarato reductasa cataliza la reducción de fumarato a succinato. La fumarato reductasa de E. coli, se compone de cuatro subunidades codificadas por frdABCD, está unida a la membrana y es activa bajo condiciones anaeróbicas. El donador de electrón para esta reacción es menaquinona y los dos protones producidos en esta reacción no contribuyen al gradiente de protón (Iverson eí al., Science 284:1961-1966 (1999)). El genoma de la levadura codifica dos isozimas de fumarato reductasa solubles codificadas por FRDS1 (Enomoto et al., DNA Res. 3:263-267 (1996)) y FRDS2 (Muratsubaki ef al., Arch. Biochem. Biophys. 352:175-181 (1998)), las cuales localizan al crisol y promitocondrión, respectivamente, y son usadas durante el crecimiento anaeróbico en glucosa (Arikawa ef al., FEMS Microbiol. Lett. 165:111-116 (1998)).
La acilación dependiente de ATP de succinato a succinil-CoA es catalizada por succinil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.5). El producto de los genes LSC1 y LSC2 de S. cerevisiae y los genes sucC y sucD de E. coli naturalmente forman un complejo succinil-CoA sintetasa que cataliza la formación de succinil-CoA de succinato con el consumo concomitante de una ATP, una reacción la cual es reversible in vivo (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)). Estas proteínas son identificadas a continuación: La alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.3), también conocida como 2-oxoglutarato sintasa o 2-oxoglutarato:ferredoxin oxidorreductasa (OFOR), forma alfa-cetoglutarato de C02 y succinil-CoA con consumo concurrente de dos equivalentes ferredoxina reducidos. Las OFOR y piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (PFOR) son miembros de una familia diversa de 2-oxoácido:ferredoxina (flavodoxina) oxidorreductasas las cuales utilizan tiamina pirofosfato, CoA y agrupaciones de hierro-azufre como cofactores y ferredoxina, flavodoxina y FAD como portadores de electrón (Adams et al., Archaea. Adv. Protein Chem. 48:101-180 (1996)). Las enzimas en esta clase son reversibles y funcionan la dirección de carboxilación en organismos que fija carbono por el ciclo RTCA tal como especies Hidrogenobacter thermophilus, Desulfobacter hidrogenophilus y Chlorobium (Shiba et al. 1985; Evans et al., Proc. Nati. Acad. Sel. U.S. A. 55:92934 (1966); Buchanan, 1971). La enzima de dos subunidades de H. thermophilus, codificadas por orAB, ha sido clonada y expresada en E. coli (Yun et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:589-594 (2001)). Una OFOR de cinco unidades del mismo organismo con la especificidad del sustrato estricta para succinil-CoA, codificada por forDABGE, fue recientemente identificada y expresada en E. coli (Yun et al. 2002). Los cinéticos para fijar C02 de ambas enzimas OFOR H. thermophilus se han caracterizado (Yamamoto et al., Extremophiles 14:79-85 (2010)). Una OFOR que fija C02 de Chlorobium thiosulfatophilum ha sido purificada y caracterizada pero los genes que codifican esta enzima no han sido identificadas hasta la fecha. Candidatos de la enzima en especies de Chlorobium pueden ser inferidos por similitud de secuencia a los genes de H. thermophilus Por ejemplo, el genoma Chlorobium limicola codifica dos proteínas similares. Bacterias Acetogénicas tal como Moorella thermoacetica son previstas para codificar dos enzimas OFOR. La enzima codificada por Moth_0034 es prevista para funcionar en la dirección que asimila C02. Los genes asociados con esta enzima, Moth_0034 no ha sido experimentalmente validada hasta la fecha pero pueden ser inferidos por similitud de secuencia a enzimas OFOR conocidas.
Las enzimas OFOR que funcionan en la dirección de descarboxilacion bajo condiciones físicas pueden también catalizar la reacción reversa. La OFOR del Archaeon Sulfolobus sp. termoacidofílica cepa 7, codificada por ST2300, ha sido ampliamente estudiada (Zhang et al. 1996. A plasmid-based expression system has been developed for efficiently expressing this protein in E. coli (Fukuda et al., Eur. J. Biochem. 268:5639-5646 (2001)) y son determinados residuos involucrados en la especificidad del sustrato (Fukuda y Wakagi, Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80 (2002)). La OFOR codificada por Ape1472/Ape1473 de Aeropyrum pernix str. El K1 fue recientemente clonado en E. coli, caracterizado, y se encuentra por reaccionar con 2-oxoglutarato y un amplio intervalo de 2-oxoácidos (Nishizawa er al., FEBS Lett. 579:2319-2322 (2005)). Otra OFOR ejemplar es codificada por oorDABC en Helicobacter pilori (Hughes et al. 1998). Una enzima específica para alfa-cetoglutarato ha sido reportada en Thauera aromática (Dorner y Boíl, J, Bacteriol. 184 (14), 3975-83 (2002). Una enzima similar se pueden encontrar en Rhodospirillum rubrum por homología de secuencia. Una enzima de dos subunidades también ha sido identificada en Chlorobium tepidum (Eisen et al., PNAS 99(14): 9509-14 (2002)).
La isocitrato deshidrogenase cataliza la descarboxilación reversible de isocitrato a 2-oxoglutarato acoplado a la reducción de NAD(P)+. Las enzimas IDH en Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli son codificadas por IDP1 y icd, respectivamente (Haselbeck y McAlister-Henn, J. Biol. Chem. 266:2339-2345 (1991); Nimmo, H.G., Biochem. J. 234:317-2332 (1986)). La reacción reversa en el ciclo TCA reductivo, la carboxilación reductiva de 2-oxoglutarato a isocitrato, es favorecida por la IDH que fija C02 dependiente de NADPH de Chlorobium limicola y fue funcionalmente expresada en E. coli (Kanao er al., Eur. J. Biochem. 269:1926-1931 (2002)). Una enzima similar con 95% de identidad de secuencia es encontrada en el genoma C. tepidum en adición a algunos otros candidatos listados a continuación.
En H. thermophilus la carboxilación reductiva de 2-oxoglutarato a isocitrato es catalizada por dos enzimas: 2-oxoglutarato carboxilasa y oxalosuccinato reductasa. La 2-oxoglutarato carboxilasa (EC 6.4.1.7) cataliza la Carboxilación dependiente de ATP de alfa-cetoglutarato a oxalosuccinato (Aoshima y Igarashi, Mol. Microbiol. 62:748-759 (2006)). Esta enzima es un complejo amplio que se compone de dos subunidades. La biotinilación de la subunidad (A) amplia es requerida para función de la enzima (Aoshima et al., Mol. Microbiol. 51:791-798 (2004)). La oxalosuccinato reductasa (EC 1.1.1.-) cataliza la conversión dependiente de NAD de oxalosuccinato a D-rreo-isocitrato. La enzima es un homodímero codificado por icd en H. thermophilus. Los parámetros cinéticos de esta enzima indica que la enzima solamente opera en la dirección reductiva de carboxilación in vivo, en contraste a las enzimas de ¡socitrato deshidrogenase en otros organismos (Aoshima y Igarashi, J. Bacteriol. 190:2050-2055 (2008)). En base a la homología de secuencia, candidatos del gene también han sido encontrados en Thiobacillus denitrificans y Thermocrinis albus. aconitasa (EC 4.2.1.3) es una proteína que contiene hierro-azufre que cataliza la isomerización reversible de citrato e iso-citrato vía el intermediario c/'s-aconitato. Dos enzimas aconitasa son codificadas en el genoma de E. coli por acnA y acnB. AcnB es la principal enzima catabólica, mientras AcnA es más estable y parece ser activa bajo condiciones de estrés oxidativo o ácido (Cunningham ef al., Microbiology 143 (Pt 12):3795-3805 (1997)). Dos isozimas de aconitasa en Salmonella typhimurium son codificadas por acnA y acnB (Horswill y Escalante-Semerena, Biochemistry 40:4703-4713 (2001)). La aconitasa S. cerevisiae, codificada por AC01 , es localizada en la mitocondria en donde participa en el ciclo TCA (Gangloff et al., Mol. Cell. Biol. 10:3551-3561 (1990)) y el crisol en donde participa en la derivación de glioxilato (Regev-Rudzki et al., Mol. Biol. Cell. 16:4163-4171 (2005)).
La piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (PFOR) cataliza la oxidación reversible de piruvato para formar acetil-CoA. La PFOR de Desulfovibrio africanus ha sido clonada y expresada en E. coli resultando en una enzima recombinante activa que fue estable por varios días en la presencia de oxígeno (Pieulle et al., J. Bacteriol. 179:5684-5692 (1997)). La estabilidad de oxígeno es relativamente poco común en PFORs y se cree debe conferir una extensión de 60 residuos en la cadena de polipéptido de la enzima D. africanus. Dos residuos de cisteína es esta enzima forman un enlace de disulfuro que protege contra inactivación en la forma de oxígeno. Este enlace de disulfuro y la estabilidad en la presencia de oxígeno se ha encontrado también en otras especies de Desulfovibrio (Vita et al., Biochemistry, 47: 957-64 (2008)). La PFOR de M. thermoacetica es también caracterizada (Menon y Ragsdale, Biochemistry 36:8484-8494 (1997)) y fue mostrada por tener gran actividad en la dirección de síntesis de piruvato durante crecimiento autotrófico (Furdui y Ragsdale, J. Biol. Chem. 275:28494-28499 (2000)). Además, E. coli tiene una estructura lectora abierta no caracterizada, ydbK, que codifican una proteína que es 51% idéntica a la PFOR de M. thermoacetica. Ha sido descrita evidencia para actividad de piruvato oxidorreductasa en £. coli (Blaschkowski ef al., Eur. J. Biochem. 123:563-569 (1982)). También se han descrito PFORs en otros organismos, que incluyen Rhodobacter capsulatas (Yakunin y Hallenbeck, Biochimica et Biophysica Acta 1409 (1998) 39-49 (1998)) y Choloboum tepidum (Eisen ef al., PNAS 99(14): 9509-14 (2002)). La PFOR cinco subunidades de H. thermophilus, codificada por porEDABG , fue clonada en E. coli y se muestra por funcionar en direcciones tanto de descarboxilante como en asimilante de C02 (Ikeda et al. 2006; Yamamoto ef al., Extremophiles 14:79-85 (2010)). Los homólogos también existen en C. carboxidivorans P7. Varias enzimas PFOR adicionales se describen en la siguiente revisión (Ragsdale, S.W., Chem. Rev. 103:2333-2346 (2003)). Finalmente, flavodoxina reductasas (por ejemplo, fqrB de Helicobacter pilori o Campilobacter jejuni) (St Maurice ef al., J. Bacterio!. 189:4764-4773 (2007)) o proteínas tipo Rnf (Seedorf ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 105:2128-2133 (2008); y Herrmann, J. Bacterio! 190:784-791 (2008)) proporciona medios para generar NADH o NADPH de la ferredoxina reducida generada por PFOR. Estas proteínas son identificadas a continuación.
La conversión de piruvato en acetil-CoA puede ser catalizada por otras varias enzimas o sus combinaciones. Por ejemplo, piruvato deshidrogenasa puede transformar piruvato en acetil-CoA con la reducción concomitante de una molécula de NAD en NADH. Es un complejo de enzimas múltiples que cataliza una serie de reacciones parciales las cuales resultan en descarboxilación oxidativa acilante de piruvato. La enzima comprende tres subunidades: piruvato descarboxilasa (E1), dihidrolipoamida aciltransferasa (E2) y dihidrolipoamida deshidrogenasa (E3). Esta enzima está naturalmente presente en varios organismos, que incluyen E. coli y S. cerevisiae. En la enzima E. coli, residuos específicos en el componente E1 son responsables para la especificidad del sustrato (Bisswanger, H., J. Biol. Chem. 256:815-82 (1981); Bremer, J., Eur. J. Biochem. 8:535-540 (1969); Gong ef al., J. Biol. Chem. 275:13645-13653 (2000)). La enzima diseñada por ingeniería hace esfuerzos por tener actividad enzima PDH de E. coli mejorada bajo condiciones anaeróbicas (Kim et al., J. Bacteriol. 190:3851-3858 (2008); Kim et al., Appl. Environ. icrobiol. 73:1766-1771 (2007); Zhou et al., Biotechnol. Lett. 30:335-342 (2008)). En contraste a PDH de E. coli, el complejo de B. subtilis está activo y es requerido para crecimiento bajo condiciones anaeróbicas (Nakano ef al., J. Bacteriol. 179:6749-6755 (1997)). La PDH de Klebsiella pneumoniae, caracterizada durante crecimiento en glicerol, es también activa bajo condiciones anaeróbicas (5). Las estructuras enzimáticas del complejo enzimático de riñon de bovino (18) y el dominio catalítico E2 de Azotobacter vinelandii están disponibles (4). Aún otra enzima que puede catalizar esta conversión es piruvato formiato Masa. Esta enzima cataliza la conversión de piruvato y CoA en acetil-CoA y formiato. Piruvato formiato Masa es una enzima común en organismos procarióticos que se usan para ayudar a modular balance rédox anaeróbico. Enzimas ejemplares se pueden encontrar en Escherichia coli codificadas por pflB (Knappe y Sawers, FEMS.Microbiol Rev. 6:383-398 (1990)), Lactococcus lactis (Melchiorsen et al., Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344 (2002)), y Streptococcus mutans (Takahashi-Abbe et a/., Oral. Microbiol Immunol. 18:293-297 (2003)). E. coli tiene una piruvato formiato Masa adicional, codificada por tdcE, que cataliza la conversión de piruvato o 2-oxobutanoato a acetil-CoA o propionil-CoA, respectivamente (Hesslinger ef al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)). Tanto pflB como tdcE de E. coli requieren la presencia de la enzima que activa piruvato formiato Masa, codificada por pflA. Además, una proteína corta codificada por yfiD en E. coli puede estar asociada con y restaurar la actividad a piruvato formiato Masa desdoblada por oxígeno (Vey et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105:16137-16141 (2008). Nótese que pflA y pflB de E. coli son expresadas en S. cerevisiae como un medio para incrementar acetil-CoA cistosólico para producción de butanol como se describe en WO/2008/080124]. Piruvato formiato asa adicional y candidatos de la enzima de activación, codificadas por pfl y acf, respectivamente, son encontradas en Clostridium pasteurianum (Weidner et al., J Bacteriol. 178:2440-2444 (1996)).
Además, diferentes enzimas pueden ser usadas en combinación para convertir piruvato en acetil-CoA. Por ejemplo, en S. cerevisiae, acetil-CoA es obtenida en el crisol primero descarboxilando piruvato para formar acetaldehído; lo último es oxidado a acetato por acetaldehído deshidrogenasa y subsecuentemente activado para formar acetil-CoA por acetil-CoA sintetasa. Acetil-CoA sintetasa es una enzima nativa en otros organismos variados que incluyen E. coli (Kumari ef al., J. Bacteriol. 177:2878-2886 (1995)), Salmonella entérica (Starai ef a/., Microbiology 151:3793-3801 (2005); Starai et a/., J. Biol. Chem. 280:26200-26205 (2005)), y Moorella thermoacetica (ya descrita). Alternativamente, el acetato puede ser activado para formar acetil-CoA por acetato quinasa y fosfotransacetilasa. El acetato quinasa primero convierte acetato en acetil-fosfato con el uso acompañante de una molécula ATP. Acetil-fosfato y CoA son después convertidas en acetil-CoA con la liberación de un fosfato por fosfotransacetilasa. Tanto la acetato quinasa como la fosfotransacetliasa son enzimas bien estudiadas en varias Clostridia y Methanosarcina thermophila.
Aún otra forma de convertir piruvato a acetil-CoA es vía piruvato oxidasa. La piruvato oxidasa convierte piruvato en acetato, usando ubiquinona como el aceptor de electrón. En E. coli, esta actividad es codificada por poxB. PoxB tiene similitud a piruvato descarboxilasa de S. cerevisiae y Zymomonas mobilis. La enzima tiene un cofactor tiamina pirofosfato (Koland y Gennis, Biochemistry 21:4438-4442 (1982)); O'Brien et al., Biochemistry 16:3105-3109 (1977); O'Brien y Gennis, J. Biol. Chem. 255:3302-3307 (1980)) y un cofactor de flavina adenina dinucleótido (FAD). El acetato puede entonces ser convertido en acetil-CoA por cualquiera de acetil-CoA sintetasa o por acetato quinasa y fosfotransacetilasa, como se describe anteriormente. Algunas de estas enzimas pueden también catalizar la reacción reversa de acetil-CoA a piruvato.
Para enzimas que usan equivalentes de reducción en la forma de NADH o NADPH, estos portadores reducidos pueden ser generados transfiriendo electrones de ferredoxina reducida. Dos enzimas catalizan la transferencia reversible de electrones de ferredoxina reducida a NAD(P)+, ferredoxina:NAD+ oxidorreductasa (EC 1.18.1.3) y ferredoxina:NADP+ oxidorreductasa (FNR, EC 1.18.1.2). Ferredoxina:NADP+ oxidorreductasa (FNR, EC 1.18.1.2) tiene un cofactor FAD de enlace no covalentemente que facilita la transferencia reversible de electrones de NADPH a aceptores potenciales bajos tal como ferredoxinas o flavodoxinas (Blaschkowski et al., Eur. J. Biochem. 123:563-569 (1982); Fujii et al., 1977). La FNR de Helicobacter pilori, codificada por HP1164 (fqrB), es acoplada a la actividad de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (PFOR) resultando en la producción dependiente de piruvato de NADPH (St et al. 2007). Una enzima análoga es encontrada en Campilobacter jejuni (St et al. 2007). Una enzima ferredoxina:NADP+ oxidorreductasa es codifica en el genoma de E. coli por fpr (Bianchi et al. 1993). La ferredoxina:NAD+ oxidorreductasa utiliza ferredoxina reducida para generar NADH de NAD+. En varios organismos, que incluyen E. coli, esta enzima es un componente de la enzima dioxigenasa multifuncional formada en complejos. La ferredoxina:NAD+ oxidorreductasa de E. coli, codificada por hcaD, es un componente del sistema 3-fenilpropionato dioxigenasa involucrado en utilización de ácido aromático (Diaz et al. 1998). La actividad de NADH:ferredoxina reductasa fue detectada en extractos celulares de Hidrogenobacter thermophilus cepa TK-6, a pesar de que un gene con esta actividad aún no ha sido indicado (Yoon et al. 2006). Finalmente, las proteínas tipo Rnf asociadas a la membrana que conservan energía (Seedorf ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 105:2128-2133 (2008); Herrmann et al., J. Bacteriol. 190:784-791 (2008)) proporcionan medios para generar NADH o NADPH de ferredoxina reducida. Las ferredox¡na:NAD(P)+ oxidorreductasas adicionales se han anotado en Clostridium carboxidivorans P7.
Las ferredoxinas son proteínas acidas pequeñas que contiene una o más agrupaciones de hierro-azufre que funcionan como portadores de electrón intracelular con un potencial de reducción bajo. Las ferredoxinas reducidas donan electrones a las enzimas dependientes de Fe tal como ferredoxina-NADP+ oxidorreductasa, piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (PFOR) y 2-oxoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa (OFOR). El gene fdxl de H. thermophilus codifica una ferredoxina tipo [4Fe-4S] que es requerida para la carboxilacion reversible de 2-oxoglutarato y piruvato por OFOR y PFOR, respectivamente (Yamamoto et al., Extremophiles 14:79-85 (2010)). La ferredoxina asociada con la 2-oxoácido:ferredoxina reductasa de Sulfolobus solfataricus es un diagrupamiento monomérico ferredoxina tipo [3Fe-4S][4Fe-4S] (Park et al. 2006). Mientras que el gene asociado con esta proteína no ha sido completamente secuenciado, el dominio N-terminal participa en 93% de homología con la ferredoxina zfx de S. acidocaldarius. El genoma de E. coli codifica una ferredoxina soluble de función fisiológica desconocida, fdx. Alguna evidencia indica que esta proteína puede funcionar en montaje de agrupamiento hierro-azufre (Takahashi y Nakamura, 1999). Proteínas de ferredoxina adicionales se han caracterizado en Helicobacter pilori (Mukhopadhyay et al. 2003) y Campilobacter jejuni (van Vliet et al. 2001). Una ferredoxina 2Fe-2S de Clostridium pasteurianum ha sido clonada y expresada en E. coli (Fujinaga y Meyer, Biochemical y Biophysical Research Communications, 192(3): (1993)). Bacterias acetogénicas tal como Moorella thermoacetica, Clostridium carboxidivorans P7 y Rhodospirillum rubrum son previstas para codificar varias ferredoxinas, listadas en la tabla posterior.
La succinil-CoA transferasa cataliza la conversión de succinil-CoA a succinato mientras transfiere la porción CoA a una molécula aceptora CoA. Muchas transferasas tienen especificidad ampliada y pueden utilizar aceptores CoA tan diversos como acetato, succinato, propionato, butirato, 2-metilacetoacetato, 3-cetohexanoato, 3- cetopentanoato, valerato, cronato, 3-mercaptopropionato, propionato, vinilacetato, y butirato, entre otros.
La conversión de succinato a succinil-CoA puede ser llevada a cabo por una transferasa la cual no requiere el consumo directo de una ATP o GTP. Este tipo de reacción es común en un número de organismos. La conversión de succinato a succinil-CoA puede también ser catalizada por succinil-CoA:Acetil-CoA transferasa. El producto del gene de catl de Clostridium kluyveri se ha mostrado por exhibir actividad succinil-CoA:acetil-CoA transferasa (Sohling y Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996)). Además, la actividad está presente en Trichomonas vaginalis (van Grinsven et al..2008) y Trypanosoma brucei (Riviere et al. 2004). La succinil-CoA:acetato de CoA-transferasa de Acetobacter aceti, codificada por aarC, reemplaza succinil-CoA sintetasa en un ciclo TCA variante (Mullins et al. 2008). Las actividades succinil-CoA transferasa similares están también presentes en Trichomonas vaginalis (van Grinsven et al. 2008), Trypanosoma brucei (Riviere et al. 2004) y Clostridium kluyveri (Sohling y Gottschalk, 1996c). La beta-cetoad¡pato:succinil-CoA transferasa codificada por peal y pcaJ en Pseudomonas putida es aún otro candidato (Kaschabek et al. 2002). Las proteínas antes mencionadas son identificadas a continuación.
Una transferasa ejemplar adicional que convierte succinato a succinil-CoA mientras convierte una 3-cetoacil-CoA a un 3-cetoácido es succ¡nil-CoA:3:cetoácido-CoA transferasa (EC 2.8.3.5). Succíníl-CoA:3:cetoácido-CoA transferasas ejemplares están presentes en Helicobacter pilori (Corthesy-Theulaz et al. 1997), Bacillus subtilis, y Homo sapiens (Fukao et al. 2000; Tanaka et al. 2002). Las proteínas antes mencionadas son identificadas a continuación.
La conversión de succinato a succinil-CoA por succinil-CoA:3:cetoácido-CoA transferasa requiere la conversión simultánea de una 3-cetoacil-CoA tal como acetoacetil-CoA a un 3-cetoácído tal como acetoacetato. La conversión de un 3-cetoácido nuevamente a un 3-cetoacíl-CoA puede ser catalizada por una acetoacetil-CoA:acetato:CoA transferasa. Acetoacetíl-CoA:acetato:CoA transferasa convierte acetoacetil-CoA y acetato a acetoacetato y acetil-CoA, o vice versa. Enzimas ejemplares incluyen los productos del gene de atoAD de E. coli (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007), ctfAB de C. acetobutilicum (Jojima et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224 (2008), y ctfAB de Clostridium saccharoperbutilacetonicum (Kosaka eí al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)) se muestran abajo.
Aún otro posible aceptor de CoA es bencilsuccinato. La succinil-CoA:(R)-Bencilsuccinato CoA-Transferasa funciona como parte de una trayectoria de degradación anaeróbica para tolueno en organismos tal como Thauera aromática (Leutwein y Heider, J. Bact. 183(14) 4288-4295 (2001)). Se pueden encontrar homólogos en Azoarcus sp. T, Aromatoleum aromaticum EbN1, y Geobacter metallireducens GS-15. Las proteínas antes mencionadas son identificadas a continuación.
Adicionalmente, ygfH codifica una propionil CoA:succinato CoA transferasa en E. coli (Haller et al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629). Se pueden encontrar homólogos cercanos en, por ejemplo, Citrobacter youngae ATCC 29220, Salmonella entérica subsp. arizonae serovar, y Yersinia intermedia ATCC 29909. Las proteínas antes mencionadas son identificadas a continuación.
Citrato Masa (EC 4.1.3.6) cataliza una serie de reacciones que resulta en el desdoblamiento de citrato a acetato y oxaloacetato. La enzima está activa bajo condiciones anaerobicas y está compuesta de tres subunidades: una proteína que porta acilo (ACP, gama), una ACP transferasa (alfa), y una acil liasa (beta). La activación enzimática usa enlaces covalentes y acetilación de un grupo prostético inusual, 2'-(5"-fosforibosil)-3-'-defosfo-CoA, el cual es similar en estructura a acetil-CoA. La acilación es catalizada por CitC, una citrato liasa sintetasa. Dos proteínas adicionales, CitG y CitX, son usadas para convertir la enzima apo en la enzima holo activa (Schneider ef al., Biochemistry 39:9438-9450 (2000)). La E. coli tipo nativo no tiene actividad citrato liasa; sin embargo, mutantes deficientes en síntesis del cofactor de molibdeno tienen una citrato liasa activa (Clark, FEMS Microbiol. Lett. 55:245-249 (1990)). La enzima de E. coli es codificada por citEFD y la citrato liasa sintetasa es codificada por citC (Nilekani y SivaRaman, Biochemistry 22:4657-4663 (1983)). La citrato liasa de Leuconostoc mesenteroides ha sido clonada, caracterizada y expresada en E. coli (Bekal et al., J. Bacterio!. 180:647-654 (1998)). Las enzimas de citrato liasa también se han identificado en enterobacterias que utilizan citrato como un carbono y fuente de energía, que incluyen Salmonella typhimurium y Klebsiella pneumoniae (Bott, Arch. Microbiol. 167: 78-88 (1997); Bott y Dimroth, Mol. Microbiol. 14:347-356 (1994)). Las proteínas antes mencionadas son tabuladas a continuación.
Acetato quinasa (EC 2.7.2.1) cataliza la fosforilación dependiente de ATP reversible de acetato a acetilfosfato. Las enzimas acetato quinasa ejemplares se han caracterizado en muchos organismos que incluyen E. coli, Clostridium acetobutilicum y Methanosarcina thermophila (Ingram-Smith et al., J. Bacterio!. 187:2386-2394 (2005); Fox y Roseman, J. Biol. Chem. 261:13487-13497 (1986); Winzer et al., Microbioloy 143 (Pt 10):3279-3286 (1997)). La actividad de acetato quinasa también ha sido demostrada en el producto del gene de E. coli purT ( arolewski ef al., Biochemistry 33:2531-2537 (1994). Algunas enzimas de butirato quinasa (EC 2.7.2.7), por ejemplo bukl y buk2 de Clostridium acetobutilicum, también aceptan acetato como un sustrato (Hartmanis, M.G., J. Biol. Chem. 262:617-621 (1987)).
La formación de acetil-CoA de acetilfosfato es catalizada por fosfotransacetilasa (EC 2.3.1.8). el gene ptun de E. coli codifica una enzima que reversiblemente convierte acetil-CoA en acetil-fosfato (Suzuki, T., Biochim. Biophys. Acta 191:559-569 (969)). Las enzimas acetiltransferasa adicionales se han caracterizado en Bacillus subtilis (Rado y Hoch, Biochim. Biophys. Acta 321:114-125 (1973), Clostridium kluyveri (Stadtman, E., Methods Enzymol. 1:5896-599 (1955), y Thermotoga marítima (Bock et al., J. Bacteriol. 181:1861-1867 (1999)). Esta reacción es también catalizada por algunas enzimas fosfotranbutirilasa (EC 2.3.1.19) que incluyen los productos del gene ptb de Clostridium acetobutilicum (Wiesenborn ef al., App. Environ.
Microbio!. 55:317-322 (1989); Walter et al., Gene 134:107-111 (1993)). Los genes ptb adicionales son encontrados en bacterias que producen butirato L2-50 (Louis er al., J. Bacterio!. 186:2099-2106 (2004) y Bacillus megaterium (Vázquez et al., Curr. Microbiol. 42:345-349 (2001).
La acilación de acetato a acetil-CoA es catalizada por enzimas con actividad acetil-CoA sintetasa. Dos enzimas que catalizan esta reacción son acetil-CoA sintetasa que forma AMP (EC 6.2.1.1) y acetil-CoA sintetasa que forma ADP (EC 6.2.1.13). La acetil-CoA sintetasa que forma AMP (ACS) es la enzima predominante para activación de acetato a acetil-CoA. Las enzimas ACS ejemplares son encontrados en E. coli (Brown et al., J. Gen. Microbiol. 102:327-336 (1977)), Ralstonia eutropha (Priefert y Steinbuchel, J. Bacteriol. 174:6590-6599 (1992)), Methotromobacter thermautotrophicus (Ingram- Smith y Smith, Archaea 2:95-107 (2007)), Salmonella entérica (Gulick et al., Biochemistry 42:2866-2873 (2003)) y Saccharomyces cerevisiae (Jogl y Tong, Biochemistry 43:1425-1431 (2004)). Las acetil-CoA sintetasas que forman ADP son enzimas reversibles con un intervalo de sustrato generalmente amplio (Musfeldt y Schonheit, J. Bacterio!. 184:636-644 (2002)). Dos isozimas de acetil-CoA sintetasas que forman ADP son codificadas en el genoma de Archaeoglobus fulgidus son codificadas por AF1211 y AF1983 (Musfeldt y Schonheit, supra (2002)). La enzima de Haloarcula marismortui (anotada como una sintetasa succinil-CoA) también acepta acetato como un sustrato y la reversibilidad de la enzima fue demostrada (Brasen y Schonheit, Arch. Microbio!. 182:277-287 (2004)). La ACD codificada por PAE3250 de crenarcheon hipertermofílico de Pirobaculum aerophilum muestra el intervalo de sustrato más amplio de todos las ACDs caracterizadas, que reaccionan con acetato, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetil-CoA (Brasen y Schonheit, supra (2004)). La evolución directa o diseñada por ingeniería se puede usar para modificar esta enzima para operar a la temperatura fisiológica del organismo hospedero. Las enzimas de A. fulgidus, H. marismortui y P. aerophilum todas se han clonado, funcionalmente expresadas, y caracterizadas en E. coli (Brasen y Schonheit, supra (2004); Musfeldt y Schonheit, supra (2002)). Candidatos adicionales incluyen las succinil-CoA sintetasa codificadas por sucCD en E. coli (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)) y la acil-CoA ligasa de Pseudomonas putida (Fernandez-Valverde eí al., Appl. Environ. Microbio!. 59:1149-1154 (1993)). Las proteínas antes mencionadas son tabuladas a continuación.
La conversión de acetil-CoA a malonil-CoA puede ser llevada a cabo por una enzima acetil-CoA carboxilasa. Estas enzimas contienen subunidades múltiples. Tres de estas enzimas son proporcionadas a continuación.
Los rendimientos del producto por C-mol del sustrato de células microbianas que sintetizan los productos de fermentación reducida tal como 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -ol, o 1 ,3-butadieno, son limitados por equivalentes de reducción insuficientes en la materia prima de carbohidrato. Los equivalentes de reducción, o electrones, pueden ser extraídos de la síntesis de componentes de gas tal como CO y H2 usando enzimas monóxido de carbono deshidrogenasa (CODH) e hidrogenase, respectivamente. Los equivalentes de reducción entonces se pasan a aceptores tal como ferredoxinas oxidadas, quinonas oxidadas, citocromos oxidados, NAD(P) + , agua, o peróxido de hidrógeno para formar ferredoxina reducida, quinonas reducidas, citocromos reducidos, NAD(P)H, H2, o agua, respectivamente. La ferredoxina reducida y NAD(P)H son particularmente útiles de forma que pueden servir como portadores rédox para varias trayectorias Wood-LjungdahI y enzimas de ciclo TCA reductivas.
En la presente a continuación, se describen las enzimas y los genes correspondientes usados para extracción rédox de componentes syngas. La CODH es una enzima reversible que intercovierte CO y C02 al gasto o ganancia de electrones. El papel fisiológico natural de la CODH en ACS/CODH formada en complejos es convertir C02 a CO para incorporación en acetil-CoA por acetil-CoA síntasa. No obstante, estas enzimas CODH son adecuadas para la extracción de equivalentes de reducción de CO debido a la naturaleza reversible de estas enzimas. La expresión de estas enzimas CODH en la ausencia de ACS les permite operar en la dirección opuesta a su papel fisiológico natural (es decir, oxidación de CO).
En M. thermoacetica, C. hidrogenoformans, C. carboxidivorans P7, y otros organismos variados, genes que codifican CODH adicionales están localizados fuera de los operones ACS/CODH. Estas enzimas proporcionan medios para extraer electrones (o equivalentes de reducción) de la conversión de monóxido de carbono a dióxido de carbono, el gene M. thermoaceticun (Genbank Número de acceso: YP_430813) es expresado por sí mismo en un operón y se cree que transfiere electrones de CO a un mediador externo similar a ferredoxina en una reacción "Ping-pong" (de desplazamiento doble). El mediador reducido entonces se acopla a otros portadores nicolinamida adenina dinucleótido fosfato (NAD(P)H) reducidos o procesos celulares dependientes de ferredoxina (Ragsdale, Annals of the New York Academy of Sciences 1125: 129-136 (2008)). Los genes que codifican las CODH-II y CooF de C. hidrogenoformans, una proteína cercana, son clonados y secuenciados (González y Robb, FEMS Microbiol Lett. 191:243-247 (2000)). El complejo resultante está unido a la membrana, a pesar que las fracciones citoplásmicas de CODH-II se muestran para catalizar la formación de NADPH sugiriendo un papel anabólico (Svetlitchnyi ef al., J Bacterio!. 183:5134-5144 (2001)). La estructura cristalina de la CODH-II está también disponible (Dobbek et al., Science 293:1281-1285 (2001)). Las enzimas CODH similares libres de ACS se pueden encontrar en un arreglo diverso de organismos que incluyen Geobacter metallireducens GS-15, Chlorobium phaeobacteroides DSM 266, Clostridium cellulolyticum H10, Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27774, Pelobacter carbinolicus DS M 2380 , y Campiiobacter curvus 525.92.
En algunos casos, genes que codifican hidrogenasa están localizados adyacentes a una CODH. En Rhodospirillum rubrum, las proteínas CODH/hidrogenasa codificadas forman un complejo de enzima unida a la membrana que ha sido indicado por ser un sitio en donde la energía, en la forma de un gradiente de protón es generada a partir de la conversión de CO y H20 a C02 y H2 (Fox et al., J Bacteriol. 178:6200- 6208 (1996)). La CODH-I de C. hidrogenoformans y sus geYies adyacentes ha sido propuesta para catalizar un papel funcional similar en base a su similitud al agrupamiento del gene CODH/hidrogenasa de R. rubrum (Wu et al., PLoS Genet. 1:e65 (2005)). La CODH-I de C. hidrogenoformans también es mostrada por exhibir actividades oxidación de CO y reducción de C02 intensas cuando se une a un electrodo (Parkin et al., J Am.Chem.Soc. 129:10328-10329 (2007)). La secuencia de proteínas de genes CODH e hidrogenasa ejemplares puede ser identificada por los siguientes números de acceso de GenBank.
Nativos de E. coli y otras bacterias entéricas son genes múltiples que codifican hasta cuatro hidrogenasas (Sawers, G., Antonie Van Leeuwenhoek 66:57-88 (1994); Sawers et al., J Bacterio!. 164:1324- 1331 (1985); Sawers y Boxer, Eur.J Biochem. 156:265-275 (1986); Sawers et al., J Bacterio!. 168:398-404 (1986)). Dada la multiplicidad de actividades enzimáticas, E. coli o otro organismo hospedero puede proporcionar suficiente actividad de hidrogenasa para dividir hidrógeno molecular entrante y reducir el aceptor correspondiente. E. coli tiene dos hidrogenasas de absorción, Hyd-1 y Hyd-2, codificadas por los agrupamientos del gene hyaABCDEF y hybOABCDEFG, respectivamente (Lukey et al., How E. coli is equipped to oxidize hydrogen under different redox conditions, J Biol Chem published online Nov 16, 2009). Hyd-1 es tolerante al oxígeno, irreversible, y está acoplada a reducción de quinona vía el citocromo hyaC. Hyd-2 es sensible a 02, reversible, y transfiere electrones a la ferredoxina periplásmica hybA la cual, a su vez, reduce una quinona vía la proteína de membrana integral hybB. Las quinonas reducidas pueden servir como la fuente de electrones para fumarato reductasa la ramificación reductiva del ciclo TCA. Las ferredoxina reducidas pueden ser usadas por enzimas tal como NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasas para generar NADPH o NADH. Pueden alternativamente ser usadas como el donador de electrón para reacciones, tal como piruvato ferredoxina oxidorreductasa, AKG ferredoxina oxidorreductasa, y 5, 10-metilen-H4folato reductasa.
Los sistemas hidrógeno-Masa de E. coli incluyen hidrogenasa 3, un complejo de enzima unido a la membrana usando ferredoxina como un aceptor, e hidrogenasa 4 que también usa un aceptor de ferredoxina. Las hidrogenasa 3 y 4 son codificadas por los agrupamientos del gene hyc y hyf, respectivamente. La hidrogenasa 3 se ha mostrado por ser una enzima reversible (Maeda et al., Appl Microbio! Biotechnol 76(5): 1035-42 (2007)). La actividad de hidrogenasa en E. coli es también dependiente de la expresión de los genes hyp cuyas proteínas correspondientes son involucradas en el montaje de la hidrogenasa formada en complejos (Jacobi et al., Arch. Microbio! 158:444-451 (1992); Rangarajan et al., J. Bacterio 190:1447-1458 (2008)).
Las hidrogenasas de M. thermoacetica son adecuadas para un hospedero que carece de suficiente actividad endógena de hidrogenasa. M. thermoacetica puede crecer con C02 como la fuente de carbono exclusiva indicando que los equivalentes de reducción son extraídos de H2 para permitir la síntesis de acetil-CoA vía la trayectoria Wood-Ljungdahl (Drake, H. L, J. Bacteriol. 150:702-709 (1982); Drake y Daniel, Res. Microbiol. 155:869-883 (2004); Kellum y Drake, J. Bacteriol. 160:466-469 (1984)) (véase Figura 22). M. thermoacetica tiene homólogos para varios genes hyp, hyc, y hyf de E. coli. Las secuencias de proteínas codificas por estos genes son identificada por los siguientes números de acceso de GenBank.
Las proteínas en M. thermoacetica cuyos genes son homólogos a los genes hyp de E. coli se muestran abajo.
Las proteínas en M. thermoacetica que son homólogas a las proteínas de hidrogenasa 3 y/o 4 de E. coli son listadas en la siguiente tabla.
Además, varios agrupamientos del gene que codifica funcionalidad de hidrogenasa están presentes en M. thermoacetica y sus correspondientes secuencias de proteína se proporcionan a continuación.
La H16 de Ralstonia eutropha usa hidrógeno como una fuente de energía con oxígeno como un aceptor de electrón terminal. Está unida a la absorción de membrana [NiFe]-hidrogenasa es una hidrogenasa "tolerante a 02" (Cracknell, et al. Proc Nat Acad Sci, 106(49) 20681-20686 (2009)) que está orientada periplásmicamente y conectada a la cadena respiratoria vía un citocromo tipo b (Schink y Schlegel, Biochim. Biophys. Acta, 567, 315-324 (1979); Bernhard et al., Eur. J. Biochem. 248, 179-186 (1997)). R. eutropha también contiene una hidrogenasa soluble tolerante a 02 codificada por el operón Hox, el cual es NAD+ citoplásmica y directamente reducida en el consumo de hidrógeno (Schneider y Schlegel, Biochim. Biophys. Acta 452, 66-80 (1976); Burgdorf, J. Bact. 187(9) 3122-3132(2005)). Las enzimas de hidrogenasa solubles están adicionalmente presentes en otros organismos variados que incluyen Geobacter sulfurreducirns (Coppi, Microbiology 151, 1239-1254 (2005)), Synechocystis str. PCC 6803 (Germer, J. Biol. Chem., 284(52), 36462-36472 (2009)), y Thiocapsa roseopersicina (Rakhely, Appl. Environ. Microbiol. 70(2) 722-728 (2004)). La enzima de Synechocystis es capaz de generar NADPH a partir de hidrógeno. La sobreexpresión de tanto el operón Hox de Synechocystis str. PCC 6803 como los genes accesorios codificados por el operón Hyp de Nostoc sp. PCC 7120 lleva a actividad de hidrogenasa incrementada comparada a la expresión de los genes Hox solos (Germer, J. Biol. Chem. 284(52), 36462-36472 (2009)).
Las enzimas variadas y los genes correspondientes usados para fijar dióxido de carbono a cualquiera de piruvato o fosfoenolpiruvato para formar el ciclo TCA intermediario, oxaloacetato o malato se describen a continuación.
La carboxilación de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato es catalizada por fosfoenolpiruvato carboxilasa. Las enzimas PEP carboxilasa ejemplares son codificadas por ppc en E. coli (Kai eí al., Arch. Biochem. Biophys. 414:170-179 (2003), ppc>4 en Metilobacterium extorquens AM1 (Arps et al., J. Bacteriol. 175:3776-3783 (1993), y ppc en Corynebacterium glutamicum (Eikmanns et al., Mol. Gen. Genet. 218:330-339 (1989).
Una enzima alterna para convertir fosfoenolpiruvato a oxaloacetato es PEP carboxiquinasa, la cual simultáneamente forma un ATP mientras carboxila PEP. En la mayoría de los organismos, la PEP carboxiquinasa sirve como una función gluconeogénica y convierte oxaloacetato a PEP en el consumo de un ATP. S. cerevisiae es uno de estos organismos cuyas carboxiquinasa PEP nativa, PCK1 , sirve como un papel gluconeogénico (Valdes-Hevia et al., FEBS Lett. 258:313-316 (1989). E. coli es otro de estos organismos, con el papel de PEP carboxiquinasa en la producción de xaloacetato se cree que es menor cuando se compara a la PEP carboxilasa, la cual no forma ATP, posiblemente debido al mayor Km para bicarbonato de PEP carboxiquinasa (Kim et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:1238-1241 (2004)). No obstante, la actividad de la PEP carboxiquinasa nativa E. coli de PEP hacia el oxaloacetato ha sido recientemente demostrada en mutantes ppc de E. coli K-12 (Kwon et al., J. Microbiol. Biotechnol. 16:1448-1452 (2006)). Estas cepas no exhiben defectos de crecimiento y tienen producción incrementada de succinato en concentraciones altas de NaHC03. Las cepas mutantes de E. coli pueden adoptar Pck como la enzima que fija C02 dominante después de evolución adaptativa (Zhang et al. 2009). En algunos organismos, particularmente bacterias de la panza, PEP carboxiquinasa es bastante eficiente en la producción de oxaloacetato de PEP y generar ATP. Ejemplos de genes PEP carboquinasa que han sido clonados en E. coli incluyen aquellos de Mannheimia succiniciproducens (Lee et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 7:95-99 (2002)), Anaerobiospirillum succiniciproducens (Laivenieks er al., Appl. Environ. Microbiol. 63:2273-2280 (1997), y Actinobacillus succinogenes (Kim et al. supra). La enzima codificada PEP carboxiquinasa por Haemophilus influenza es efectiva en la formación de oxaloacetato de PEP.
La piruvato carboxilasa (EC 6.4.1.1) directamente convierte piruvato a oxaloacetato al precio de una ATP. Las enzimas de piruvato carboxilasa son codificadas por PYC1 (Walker ef al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:1210-1217 (1991) y PYC2 (Walker et al., supra) en Saccharomyces cerevisiae, y pyc en Mycobacterium smegmatis (Mukhopadhyay y Purwantini, Biochim. Biophys. Acta 1475:191-206 (2000)).
La enzima mélica puede ser aplicada para convertir C02 y piruvato a malato en el consumo de un equivalente de reducción. Las enzimas mélicas para este propósito pueden incluir, sin limitación, enzima mélica (dependiente de NAD) y enzima mélica (dependiente de NADP). Por ejemplo, una de las enzima málicas E. coli (Takeo, J. Biochem. 66:379-387 (1969)) o una enzima similar con mayor actividad puede ser expresada para permitir la conversión de piruvato y C02 a malato. Fijando carbono a piruvato opuesto a PEP, la enzima málica permite la unión de fosfato de alta energía de PEP para ser conservado por piruvato quinasa con ello ATP es generada en la formación de piruvato o por el sistema fosfotransferasa para transporte de glucosa. A pesar que la enzima málica es típicamente considerada para operar en la dirección de formación piruvato a partir de malato, la sobreexpresión de la Enzima dependiente de NAD, codificada por maeA, ha sido demostrada por el incremento de producción de succinato en E. coli mientras se restaura el fenotipo Apfl-AldhA letal bajo condiciones anaeróbicas operando en la dirección que fija carbono (Stols y Donnelly, Appl. Environ. Microbiol. 63(7) 2695-2701 (1997)). Una observación similar se hace en la sobreexpresión de la enzima málica de Ascaris suum in E. coli (Stols et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65(1), 153-158 (1997)). La segunda enzima málica E. coli, codificada por maeB, es Dependiente de NADP y también decarboxila oxaloacetato y otro alfa-ceto ácidos (Iwakura et al., J. Biochem. 85(5): 1355-65 (1979)).
Las enzimas usadas para convertir oxaloacetato (formado de, por ejemplo, PEP carboxilasa, PEP carboxiquinasa, o piruvato carboxilasa) o malato (formado de, por ejemplo, enzima mélica o malato deshidrogenasa) a succinil-CoA vía la ramificación reductiva del ciclo TCA son malato deshidrogenasa, fumarato deshidratasa (fumarasa), fumarato reductasa, y succinil-CoA transferasa. Los genes para cada una de las enzimas se describen en la presente a continuación.
Enzimas, genes y métodos para trayectorias diseñadas por ingeniería de succinil-CoA para varios productos en un microorganismo son ahora conocidos en la técnica. Los equivalentes de reducción adicionales obtenidos de CO y/o H2, como se describe en la presente, mejora los rendimientos de 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -ol, o 1,3-butadieno cuando se utiliza materia prima a base de carbohidrato. Por ejemplo, 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -ol, o 1 ,3-butadieno puede ser producido de succinil-CoA vía trayectorias ejemplificadas en la Figura 20. Enzimas ejemplares para la conversión de succinil-CoA a 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol, o 1 ,3-butadieno incluyen succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa, 3-oxoadipil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, 3-oxoadipato deshidrogenasa, 2-fumarilacetato descarboxilasa, 3-oxopent-4-enoato reductasa, 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa, 3-oxoadipil-CoA reductasa, 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, 3-hidroxiadipato deshidrogenasa, 3-hidroxíhex-4-enedioato descarboxilasa, 3-oxoadipato reductasa, 2-fumarilacetato reductasa, 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa, 2,4-pentadienoato descarboxilasa.
Enzimas, genes y métodos para trayectorias diseñadas por ingeniería de intermediarios de glicólisis para varios productos en un microorganismo se conocen en la técnica. Los equivalentes de reducción adicionales obtenidos de CO y H2, como se describe, mejora los rendimientos de todos estos productos en carbohidratos.
Ejemplo X Métodos para Manipulación de CO y Cultivos anaeróbicos Este ejemplo describe métodos usados en la manipulación de CO y cultivos anaeróbicos.
A. Manipulación de CO cantidades pequeñas para ensayos y cultivos pequeños. CO es un gas inodoro, incoloro y no tiene sabor que es un veneno. Por lo tanto, cultivos y ensayos que utilizan CO requieren manipulación especial. Varios ensayos, que incluyen oxidación de CO, síntesis de acetil-CoA, concentración de CO usan mioglobina, y tolerancia/utilización de CO en cultivos de lote pequeños, pedidos para cantidades pequeñas del gas CO que son dispersadas y manipuladas dentro de una campana extractora de gases. Los ensayos bioquímicos pedidos para saturación de cantidades muy pequeñas (<2 mL) del medio de ensayo bioquímico o amortiguador con CO y entonces se realiza el ensayo. Todas las etapas de manipulación de CO se realizan en una campana extractora de gases con la banda fijada en la longitud apropiada y el extractor activado; el CO se dispersa de un cilindro de gas comprimido y el regulador se conecta a una línea Schlenk. Lo último asegura que concentraciones iguales de CO se dispersen en cada uno de las cubetas o viales posibles. La linea Schlenk se establece que contiene un depurador de oxígeno en el lado de entrada y un burbujeador de liberación de presión de aceite y una ventilación del otro lado. Las cubetas de ensayo ambas son anaeróbicas y contienen CO. Por lo tanto, las cubetas de ensayo son herméticamente selladas con un tapón de caucho y se agregan los reactivos o se remueven usando agujas y jeringas herméticas a los gases. En segundo lugar, se hacen crecer pequeños cultivos (~ 50 mi) con saturación de CO en botellas de suero herméticamente tapadas. Como con los ensayos bioquímicos, los cultivos microbianos saturados con CO son equilibrados en la campana extractora de gases usando el sistema de línea Schlenk. Ambos ensayos bioquímicos y los cultivos microbianos están en contenedores sellados, portátiles y en volúmenes pequeños elaborados para manipulación segura fuera de la campana extractora de gases. El tanque de CO comprimido está adyacente a la campana extractora de gases.
Típicamente, se usa una línea Schlenk para dispersar CO a las cubetas, en cada ventilación. Los tapones de caucho en las cubetas son perforados con agujas para jeringa desechables calibre 19 ó 20 y son ventilados con las mismas. Un burbujeador de aceite se usa con un tanque de CO y depurador de oxígeno. Las cubetas del espectrofotómetro de vidrio o cuarzo tienen un agujero circular en la parte superior en el cual se fija una manga de tapón Kontes, Sz7 774250-0007. La unidad detectora de CO se coloca cerca a la campana extractora de gases.
B. Manipulación de CO en grandes cantidades alimentado a cultivos de gran escala. Cultivos de fermentación son alimentados con cualquiera de CO o una mezcla de CO y H2 para estimular syngas como una materia prima en producción de fermentación. Por lo tanto, cantidades de células que varían de 1 litro a varios litros pueden incluir la adición de gas CO para incrementar la concentración disuelta de CO en el medio. En estas circunstancias, cantidades administradas bastante grandes y continuas de CO son agregadas a los cultivos. A puntos diferentes, los cultivos son recolectados o las muestras removidas. Alternativamente, las células son recolectadas con un centrifugador de flujo continuo integrado que es parte del termentador.
El proceso de fermentación se lleva a cabo bajo condiciones anaeróbicas. El algunos casos, es antieconómico para bombear oxígeno o aire en los termentadores para asegurar adecuada saturación de oxígeno para proporcionar un ambiente respirable. Además, la energía de reducción generada durante la fermentación anaerobica puede ser necesaria en la formación del producto que en la respiración. Además, muchas de las enzimas para varias trayectorias son sensibles al oxígeno variando de grado. Los acetógenos clásicos tales como M. thermoacetica son anaeróbicos obligados y las enzimas en la trayectoria Wood-Ljungdahl son bastantes sensibles a la inactivación irreversible por oxígeno molecular. Mientras estos son octógenos tolerantes al oxígeno, el repertorio de enzimas en la trayectoria Wood-Ljungdhal puede ser compatible en la presencia de oxígeno porque muchos son metalo-enzimas, componentes clave son ferrodoxina, y la regulación puede desviar el metabolismo lejos de la trayectoria Wood-Ljundahl para maximisar la adquisición de energía. Al mismo tiempo, las células en el cultivo actúan como depuradores de oxígeno que moderan la necesidad de medidas extremas en la presencia de crecimiento celular extenso.
C. Cámara y condiciones anaeróbicas. Cámaras anaeróbicas ejemplares están comercialmente disponibles (véase por ejemplo, Vacuum Atmospheres Company, Hawthorne CA; MBraun, Newburyport MA). Las condiciones incluyen una concentración de 02 de 1 ppm o menos y 1 atm pura de N2. En un ejemplo, se usan 3 depuradores de oxígeno/regeneradores de catalizador, y la cámara incluye un electrodo 02 (tal como Teledyne; City of Industry CA). Casi todos los puntos y reactivos son ciclados cuatro veces en la burbuja de aire de la cámara antes de abrir la puerta de la cámara interior. Los reactivos con un volumen de >5 mi son rociados con N2 puro antes de ser introducidos en la cámara. Se cambian guantes dos veces/año y los contenedores del catalizador son regenerados periódicamente cuando la cámara exhibe respuesta cada vez más lenta para cambiar los niveles de oxígeno. La presión de la cámara es controlada a través de válvulas de unidireccionales activadas por solenoides. Esta característica permite ajustar la presión de la cámara a un nivel mayor que el que la rodea para permitir la transferencia de tubos muy pequeños a través de la válvula de purga.
Los niveles de 02 logrados en las cámaras anaeróbicas que son consistentemente muy bajas y son necesarias para condiciones anaeróbicas muy sensibles al oxígeno. Sin embargo, el crecimiento y manipulación de las células usualmente no requiere esta precaución. En una configuración de cámara anaeróbica alternativa, se pueden usar platino o paladio como un catalizador que requiere algo de gas hidrógeno en la mezcla. En lugar de usar válvulas de solenoide, la liberación de presión se puede controlar por un burbujeador. En lugar de usar el monitoreo de 02 a base de un instrumento, en su lugar se pueden usar tiras de prueba.
D. Microbiología anaeróbica. Se manipulan cultivos pequeños como se describe anteriormente para manipulación de Co. En particular, se fijan botellas de suero o del medio con tapones de caucho gruesos y se emplean engarces de aluminio para sellar la botella. El medio, tal como Caldo Terrefíc, se elabora de una manera convencional y se dispersa en una botella de suero de tamaño apropiado. Las botellas son rociadas con nitrógeno por ~30 min para burbujeo moderado. Esto remueve la mayoría del oxígeno del medio y, después de esta etapa, cada botella es tapada con un tapón de caucho (tal como tapones de septo Bélico 200 mm; Bélico, Vineland, NJ) y selladas con engarce (Bélico 20 mm). Después las botellas con el medio se someten a autoclave usando un cíelo de escape lento (líquido). Al menos algunas veces una aguja puede ser empujada a través del tapón para proporcionar escape durante el proceso de autoclave; la aguja necesita ser removida inmediatamente en la remoción de la autoclave. El medio estéril tiene los restos de los componentes del medio, por ejemplo, amortiguador o antibióticos, agregados vía jeringa y aguja. Antes de la adición de agentes de reducción, las botellas son equilibradas por 30 -60 minutos con nitrógeno (o CO dependiendo del uso). Se agrega un agente de reducción tal como sulfuro de sodio 100 x 150 mM, cisteína-HCI 200 mM. Esto se hace pesando el sulfuro de sodio en un vaso seco y la cisteína en una botella de suero, llevando ambos a la cámara anaeróbica, disolviendo el sulfuro de sodio en agua anaeróbica, entonces agregar esto a la cisteína en la botella de suero. La botella se tapa inmediatamente ya que la solución de sulfuro de sodio genera gas hidrógeno en contacto con la cisteína. Cuando se inyecta en el cultivo, se usa un filtro de jeringa para esterilizar la solución. Se agregan otros componentes a través de las ajugas de jeringa, tal como B12 (cianocobalamina 10 µ?), cloruro de níquel (NiCI2, concentración final 20 microM de una solución base 40 mM hecha en agua anaeróbica en la cámara y esterilizada por autoclave o usando un filtro de jeringa en la inyección en el cultivo), y sulfato de amonio ferroso (concentración final necesaria es 100 µ? - hecha como una solución base 100-1000x en agua anaeróbica en la cámara y esterilizada por autoclave o usando un filtro de jeringa en inyección en el cultivo). Para facilitar el crecimiento más rápido bajo condiciones anaeróbicas, las botellas de 1 litro se inoculan con 50 mi de un precultivo de crecimiento anaeróbicamente. Se lleva a cabo la inducción del promotor pA1-lac01 en los vectores se realiza por adición de isopropil ß-D-l -tiogalactopiranosida (IPTG) a una concentración final de 0.2 mM por aproximadamente 3 horas.
Se pueden hacer crecer medios de cultivo extensos en botellas grandes usando adición de gas continua mientras se burbujea. Se coloca un tapón de caucho con un burbujeador de metal después de la adición del medio y se rocía con nitrógeno por 30 minutos o mucho antes de la formación del resto de la botellas. Cada botella se coloca junto de forma que un filtro estéril pueda esterilizar el gas burbujeado en y las mangueras en las botellas se compriman con abrazaderas C pequeñas. El medio y las células se agitan con barras agitadoras magnéticas. Una vez que todos los componentes del medio se agregan, las botellas son incubadas en una incubadora en un cuarto ventilado, pero con esparcimiento de nitrógeno continuo en las botellas.
Ejemplo XI Ensayo de oxidación de CO (CODH) Este ejemplo describes métodos de ensayo para la medición de la oxidación de CO (Deshidrogenasa CO; CODH).
Se clona el operón CODH/ACS de 7 genes de Moorella thermoacetica en vectores de expresión de E. coli. Se clona el fragmento de DNA ~10 kbp intacto, y si son similares al de algunos de los genes en esta región se expresan a partir de sus propios promotores endógenos y todos contienen sitios de enlace ribosomal endógeno. Estos clones son sometidos a ensayo por oxidación de CO, usando un ensayo que cuantitativamente mide la actividad de CODH. Se usa antisuero para los productos del gene de M. thermoacetica por Western blots para estimar la actividad específica. M. thermoacetica es Gram positiva, y los elementos del sitio de enlace ribosoma se espera que trabajen bien en E. coli. Esta actividad, descrita posteriormente en mayor detalle, se estima sea - ~1/50avo de la actividad específica de M. thermoacetica. Es posible que actividad CODH de células de E. coli recombinantes pueda ser limitada por el hecho que las enzimas de M. thermoacetica tiene temperatura óptima de aproximadamente 55°C. Por lo tanto, una trayectoria CODH/ACS mesofílica puede ser ventajosa tal como la cercana en relación de Moorella que es mesofílica y tiene un operón CODH/ACS aparentemente intacto y una trayectoria Wood-Ljungdahl, Desulfitobacterium hafniense. Acetógenos como potenciales organismo hospederos incluyen, pero no se limitan a, Rhodospirillum rubrum, Moorella thermoacetica y Desulfitobacterium hafniense.
La oxidación de CO es tanto el más sensible como robusto de los ensayos CODH/ACS. Es probable que un sistema usando syngas a base de E. coli puede al final necesitar ser aproximadamente sistemas anaeróbicos como Clostridial (es decir, Moorella), especialmente para actividad máxima. El mejoramiento en CODH puede ser posible pero puede al final ser limitada por la solubilidad de gas CO en agua.
Inicialmente, cada uno de los genes se clona individualmente en vectores de expresión. Las unidades de expresión combinadas para complejos de subunidades/1 múltiples. Se determina la expresión en E. coli en el nivel de proteína. Se elaboran tanto los operones CODH/ACS de M. thermoacetica combinados como los clones de expresión individuales.
El ensayo de oxidación CO. Este ensayo es uno de los ensayos simples, seguros y más versátiles de actividades enzimáticas dentro de la trayectoria Wood-Ljungdahl y pruebas CODH (Seravalli et al., Biochemistry 43:3944-3955 (2004)). Una actividad típica de CODH M. thermoacetica de actividad específica es 500 U a 55°C o ~60U a 25°C. Este ensayo emplea reducción de metil viológeno en la presencia de CO. Esto es medido a 578 nm en cubetas de vidrio, anaeróbicas, tapadas.
En mayor detalle, las cubetas de vidrio tapadas con caucho son preparadas después de lavar primero la cubeta cuatro veces en agua desionizada y una vez con acetona. Una cantidad pequeña de grasa a vacío se unta en la parte superior del empaque de caucho. La cubeta se gasifica con CO, se seca por 10 min con una aguja de 22 Ga. más una aguja de escape. Un volumen de 0.98 ml/L de amortiguador de reacción (Hepes 50 mM, pH 8.5, ditiotreitol (DTT) 2 mM se agrega usando una aguja 22Ga., con aguja de escape, y CO al 100%. La solución base de metil viológeno (CH3 viológeno) fue 1M en agua. Cada ensayo usa 20 microlitros para una concentración final de 20 mM. Cuando se agrega metil viológeno, se usa una aguja de 18 Ga (parcial) como una chaqueta para facilitar el uso de una jeringa Hamilton para retirar el CH3 viológeno. Se retiraron y desecharon 4-5 alícuotas por lavado y la jeringa equilibra el gas. Se agrega una cantidad pequeña de ditionito de sodio (base 0.1 M) cuando se constituye el CH3 viológeno base para ligeramente reducir el CH3 viológeno. La temperatura es equilibrada a 55°C en un espectrómetro Olis calentado (Bogart GA). Una reacción blanco (CH3 viológeno + amortiguador) primero se corre para medir la proporción base de reducción CH3 viológeno. Extractos celulares crudos de E. coli de ACS90 y ACS91 (operón CODH-ACS de M. thermoacetica con y sin, respectivamente, el primer cooC). 10 microlitros de extracto se agregaron de una vez, mezclaron y ensayaron. El CH3 viológeno reducido cambió a púrpura. Los resultaos d un ensayo se muestran en la Tabla I.
Tabla I. Extracto Crudo de Actividades de Oxidación de CO ACS90 7.7 mg/ml ACS91 11.8 mg/ml Mta98 9.8 mg/ml Mta99 11.2 mg/ml Extracto Vol ODI U/ml U/mq ACS90 10 microlitros 0.073 0.376 0.049 ACS91 10 microlitros 0.096 0.494 0.042 Mta99 10 microlitros 0.0031 0.016 0.0014 ACS90 10 microlitros 0.099 0.51 0.066 Mta99 25 microlitros 0.012 0.025 0.0022 ACS91 25 microlitros 0.215 0.443 0.037 Mta98 25 microlitros 0.019 0.039 0.004 ACS91 10 microlitros 0.129 0.66 0.053 Promedios 0.057 U/mg ACS90 0.042 U/mg ACS91 0.0018 U/mg Mta99 Mta98/Mta99 son cepas de E. coli MG1655 que expresan genes de metiltransferasa de metanol de M. thermoacetia y, por lo tanto, son controles negativos para las cepas ACS90 ACS91 de E. coli que contienen operones CDOH de M. thermoacetica CODH.
Si - 1% de la proteína celular es CODH, entonces estas figuras podrían ser aproximadamente 100X menos que la actividad de 500 U/mg de CODH de M. thermoacetica pura. Los estimados actuales asados en Western blots son 0.5% de la proteína celular, de manera que la actividad es aproximadamente 50X menor que para CODH de M. thermoacetica. No obstante, este experimento demuestra la actividad de oxidación de CO en E. coli recombinante con una cantidad mucho menor en los controles negativos. La cantidad mínima de oxidación de CO (reducción de CH3 viológeno) vista en los controles negativos indica que E. coli podría tener una capacidad limitada para reducir CH3 viológeno.
Para estimar las concentraciones finales de proteínas de CODH y Mtr, se realizaron análisis de SDS-PAGE seguido por Western blot en los mismos extractos celulares usados en la oxidación de CO, ACS, metiltransferasa, y ensayos de Fe-S corrinoides. Los antisueros usados fueron policlonales a proteínas CODH-ACS y Mtr de M. thermoacetica purificada y se visualizaron usando un anticuerpo secundario de cabra-anti-conejo ligado a fosfatasa alcalina. Se realizaron Western blots y los resultados se muestran en la Figura 24. Las cantidades de CODH en ACS90 y ACS91 se estimaron a 50 ng por comparación en las líneas de control. Las expresiones de los genes del operón de CODH-ACS que incluyen 2 subunidades de CODH y la metiltransferasa se confirmaron vía análisis de Western blot. Por lo tanto, las células de E. coli recombinante expresan componentes múltiples de un operón del gene 7. Además, tanto la metiltransferasa como la proteína de azufre e hierro corrinoide fueron activas en las mismas células recombinantes de E. coli. Estas proteínas son parte del mismo operón clonado en las mismas células.
Los ensayos de oxidación CO se repitieron usando extractos de células de Moorella thermoacetica para los controles positivos. Aunque la actividad de CODH en ACS90 y ACS91 de E. coli fue medible, fue aproximadamente 130 - 150 X inferior que el control de M. thermoacetica. Los resultados del ensayo se muestran en la Figura 25. Brevemente, las células (M. thermoacetica o E. coli con el operón CODH/ACS; ACS90 o ACS91 o vector vacío: pZA33S) se hicieron crecer y los extractos se prepararon como se describe anteriormente. Los ensayos se realizaron como se describe anteriormente a 55°C a varios tiempos en el día que se prepararon los extractos. La reducción de metilviológeno se siguió a 578 nm durante un curso de tiempo de 120 segundos.
Estos resultados describen los ensayos y resultados de la oxidación de CO (CODH). Las células recombinantes de E. coli expresan actividad de oxidación de CO como se mide por el ensayo de reducción de metil viológeno.
Ejemplo XII Experimento de Tolerancia a CO de E. coli y Ensayo de Concentración de CO (ensayo de mioglobina) Este ejemplo describe la tolerancia de E. coli para altas concentraciones de CO.
Para probar si o no E. coli puede crecer anaerobiamente en la presencia de cantidades de saturación de CO, los cultivos se establecieron en botellas de suero de 120 mi con 50 mi de medio de Caldo Terrific (más solución de reducción, NiCI2, Fe(ll)NH4S04, cianocobalamina, IPTG, y cloranfenicol) como se describe anteriormente para microbiología anaeróbica en volúmenes pequeños. Una mitad de estas botellas se equilibraron con gas de nitrógeno por 30 minutos y una mitad se equilibró con gas de CO por 30 minutos. Se usó un vector vacío (pZA33) como un control, y cultivos que contiene el vector vacío pZA33 así como también tanto ACS90 como ACS91 se probaron con tanto N2 como CO. Todas se inocularon y se hicieron crecer por 36 hrs con sacudimiento (250 rpm) a 37°C. Al final del periodo de 36 horas, la examinación de los matraces mostró altas cantidades de crecimiento en todos. El volumen del crecimiento observado ocurrió durante la noche con un retardo largo.
Dado que todos los cultivos parecen crecer bien en la presencia de CO, se confirmaron las concentraciones finales de CO. Esto se realizó usando un ensayo del cambio espectral de mioglobina después de la exposición a CO. La mioglobina reducida con ditionita de sodio tiene una absorbancia pico a 435 nm; este pico se cambió a 423 nm con CO. Debido a la baja longitud de onda y necesidad de registrar un espectro completo de 300 nm hacia arriba, deben ser usados con cubetas de cuarzo. La concentración de CO es medida contra una curva estándar y depende de las constantes de Ley de Henry para CO de máxima solubilidad en agua = 970 micromolares a 20°C y 1 atm.
Para la prueba de mioglobina de concentración de CO, lavaron cubetas 10X con agua, 1X con acetona, y después se taparon como con el ensayo CODH. Se sopló N2 en las cubetas por ~10 min. Se agregó un volumen de 1 mi de amortiguador anaeróbico (HEPES, pH 8.0, 2mM de DTT) al blanco (no equilibrado con CO) con una jeringa Hamilton. Se agregaron un volumen de 10 microlitros de mioglobina (~1 mM— puede ser variado, solo necesita una cantidad bastante grande) y 1 microlitro de ditionita (20 mM de solución base). Se hace una curva estándar de CO usando amortiguador saturado de CO agregado a incrementos de 1 microlitro. Se registró el cambio y peso máximos para cada incremento. Los cultivos probados fueron pZA33/CO, ACS90/CO, y ACS91/CO. Cada uno de estos se agregó en incrementos de 1 microlitro a la misma cubeta. A la mitad del experimento una segunda cubeta se ajustó y usó. Los resultados se muestran en la Tabla II.
Tabla II. Concentraciones de Monóxido de Carbono 36 hrs.
Cepa y Condiciones de Concentración Final de CO Crecimiento (micromolar) PZA33-CO 930 ACS90-CO 638 494 734 883 prom. 687 SD 164 ACS91-CO 728 812 760 611 prom. 728 SD 85 Los resultados mostrados en la Tabla II indican que los cultivos crecen si se cultiva o no la cepa en la presencia o no de CO. Estos resultados indican que E. coli puede tolerar la exposición a CO bajo condiciones anaeróbicas y que células de E. coli que expresan el operón CODH-ACS pueden metabolizar algo del CO.
Estos resultados demuestran que células de E. coli, si expresan o no CODH/ACS, fueron capaces de crecer en la presencia de cantidades de saturación de CO. Además, estas crecen igual también como los controles en nitrógeno en lugar de CO. Este experimento demostró que las cepas de laboratorio de E. coli son insensibles a CO a los niveles que se logran en un proyecto de syngas realizado a presión atmosférica normal. Además, experimentos preliminares indican que células de E. coli recombinantes que expresan CODH/ACS actualmente consumen algo de CO, probablemente por oxidación a dióxido de carbono.
Ejemplo XIII Enzimas de 3-Hidroxiácido descarboxilasa para la formación de 1,3- butadieno y 3-buteno-1-ol Enzimas de 3-hidroxiácido descarboxilasa catalizan la descarboxilación conducida por ATP de 3-hidroxiácidos a derivados alqueno. Las enzimas 3-hidroxiácido descarboxilasa han sido recientemente descritas que catalizan la formación de isobutileno, propileno y etileno (WO 2010/001078 y Gogerty y Bobik, Appl. Environ. Microbiol., p. 8004-8010, Vol. 76, No. 24 (2010)). Se propone aquí la aplicación de enzimas similares para catalizar la conversión de 3-hidroxipent-4-enoato (3HP4) a 1 ,3-butadieno, mostrado en la Figura 16 y 3,5-dihidroxipentanoato a 3-buteno-1-ol, mostrado en la Figura 17. El producto de 3-buteno-1 -ol puede entonces ser convertido a butadieno vía deshidratación química o deshidratación biológica vía una enzima de 3-buteno-1 -ol deshidratasa.
La conversión de 3-hidroxipent-4-enoato a butadieno se lleva a cabo por una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa. De manera similar, la conversión de 3,5-dihidroxipentanoato a 3-buteno-1 -ol se lleva a cabo por una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa. Tales enzimas pueden portar similitud a enzimas de mevalonato pirofosfato descarboxilasa o difosfomevalonato descarboxilasa. Una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa potencial es la mevalonato difosfato descarboxilasa de Saccharomyces cerevisiae (ScMDD o ERG19) la cual fue mostrada para convertir 3-hidroxi-3-metilbutirato (3-HMB) a isobuteno (Gogerty y Bobik, 2010, Appl. Environ. Microbiol., p. 8004-8010, Vol. 76, No. 24). Dos variantes mejoradas de la enzima, ScMDDI (I145F) y ScMDD2 (R74H), se demostraron para lograr incrementos de 19 veces y 38 veces comparado con la enzima His-etiquetada de tipo nativo. Candidatos de enzimas adicionales y ERG19 se proporcionan a continuación.
Ejemplo XIV Deshidratación Química de 3-buteno-1 -ol a butadieno Alcoholes pueden ser convertidos a olefinas por reacción con un catalizador de deshidratación adecuado bajo condiciones apropiadas. Catalizadores de deshidratación típicos que se convierten a alcoholes tales como butanoles y pentanoles en olefinas incluyen varias alúminas no tratadas y tratadas con ácido (por ejemplo, ?-alúmina) y catalizadores de sílice y arcillas que incluyen zeolitas (por ejemplo, zeolitas tipo-ß, ZSM-5 o zeolitas tipo Y, catalizadores de zeolita-ß tratados con fluoruro, catalizadores de arcilla tratados con fluoruro, etc.), resinas de ácido sulfónico (por ejemplo, resinas estirénicas sulfonadas tales como Amberlyst® 15), ácidos fuertes tales como ácido fosfórico y sulfúrico, ácidos Lewis tales como trifluoruro de boro y tricloruro de aluminio, y muchos tipos diferentes de sales de metal que incluyen óxidos de metal (por ejemplo, óxido de circonio u óxido de titanio) y cloruros de metal (por ejemplo, Latshaw B E, Dehydration of Isobutanol to Isobutylene in a Slurry Reactor, Department of Energy Topical Report, Febrero 1994).
Las reacciones de deshidratación pueden llevarse a cabo en fases tanto líquidas como gaseosas con sistemas catalizadores tanto heterogéneos como homogéneos en muchas configuraciones diferentes del reactor. Típicamente, los catalizadores usados son estables al agua que es generada por la reacción. El agua es usualmente removida de la zona de reacción con el producto. Los alqueno(s) resultante(s) ya sea que salen al reactor en la fase gaseosa o líquida (por ejemplo, dependiendo de las condiciones del reactor) y son capturados por un proceso de purificación corriente abajo o son además convertidos en el reactor a otros compuestos (tales como butadieno o isopreno) como se describe. El agua generada por la reacción de deshidratación sale al reactor con producto(s) de alqueno y alcohol sin reaccionar y se separa por destilación o fase de separación. Debido a que el agua es generada en grades cantidades en la etapa de deshidratación, los catalizadores de deshidratación usados son en general tolerantes al agua y un proceso para remover el agua del sustrato y producto puede ser parte de cualquier proceso que contiene una etapa de deshidratación. Por esta razón, es posible usar alcohol húmedo (es decir, hasta aproximadamente 95% o 98% de agua en peso) como un sustrato para una reacción de deshidratación y remover esta agua con el agua generada por la reacción de deshidratación (por ejemplo, usando un catalizador de zeolita como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,698,452 y 4,873,392). Adicionalmente, zeolita y alúmina neutrales deshidratarán alcoholes a alquenos pero en general a temperaturas y presiones superiores que las versiones ácidas de estos catalizadores.
La deshidratación de 3-buten-1-ol a butadieno es bien conocida en la técnica (Gustav. Egloff y George. Hulla, Chem. Rev., 1945, 36 (1), pp 63-141). Por ejemplo, 3-buten-1-ol es formado como un intermediario en la deshidratación de 1 ,4-butanodiol a 1 ,3-butadieno (Sato, et al, Catalysis Communications, 5 (8), 2004, p. 397-400).
Ejemplo XV Trayectorias a 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1 -ol y 1 ,3-butadieno Este ejemplo describe trayectorias a 2,4-pentadienoato, 3-buteno-1-ol y 1 ,3-butadieno. Nuevas trayectorias a los intermediarios 3HP4, 3,5-dihidroxipentanoato y 3-buteno-1 -ol se muestran en la Figuras 18-21. Trayectorias a 3HP4 se muestran en la Figuras 18, 19 y 20 (nueva). Trayectorias a 3,5-dihidroxipentanoato y 3-buteno-1 -ol se muestran en la Figuras 19 y 21 (nueva). Trayectorias adicionales al 2,4-pentadienoato precursor de butadieno se muestran en la Figuras 19, 20 y 21 (nueva).
Varios trayectorias a 2,4-pentadienoato se describen en los ejemplos anteriores (véase por ejemplo, Figuras 4, 12, 13 14 y 15. La hidratación de 2,4-pentadienoato proporciona 3-hidroxipent-4-enoato como se muestra en la Figura 18 (nueva). 3-Hidroxipent-4-enoato puede ser subsecuentemente descarboxilado a butadieno por una 3- hidroxiácido descarboxilasa, también descrita anteriormente.
Trayectorias adicionales de acrilil-CoA y 3-HP-CoA a 2,4-pentadienoato se muestran en la Figura 19. También se muestran aquí trayectorias a 3HP4, 3-buteno-1 -ol y butadieno.
Trayectorias a 3HP4 de acrilil-CoA incluyen: etapas M/O/P, etapas M/N/T Trayectorias a 3HP4 de 3-HP-CoA incluyen: etapas A/L/O/P, etapas A/L/N/T Trayectorias a 3HP4 y 24PD de succinil-CoA se muestran en la Figura 20. Succinil-CoA y acetil-CoA son primero unidos por 3-oxoadipil-CoA tiolasa para formar 3-oxoadipil-CoA (Etapa A). En una trayectoria el grupo 3-oxo de 3-oxoadipil-CoA se reduce para formar 3-hidroxiadipil-CoA (Etapa G). La porción CoA es después convertida a un grupo ácido por una CoA hidrolasa, sintetasa o transferasa. 3-Hidroxiadipato es entonces oxidado para formar 3-hidroxihex-4-enedioato (Etapa I). Este producto es entonces descarboxilado para formar 3HP4. En una ruta alterna, 3-oxoadipil-CoA es convertido a 3-oxoadipato por una CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa en la Etapa B. 3-Oxoadipato es entonces reducido a 3-hidroxiadipato (Etapa K), el cual es convertido a 3HP4 como se describe previamente. Alternativamente, 3-oxoadipato es convertido a 2-fumarilacetato en la Etapa C. El grupo 3-oxo de 2-fumarilacetato es entonces reducido a 3-hidroxihex-4-enedioato, el cual es descarboxilado a 3HP4. En aún otra modalidad, el 2-fumarilacetato es descarboxilado para formar 3-oxopent-4-enoato (Etapa D), el cual es subsecuentemente reducido a 3HP4 (Etapa E). 3HP4 puede entonces ser convertido a butadieno en una etapa por descarboxilacíón por una 3HP4 descarboxilasa (Etapa M), o en dos etapas por deshidratación a 2,4-pentadieno seguido por descarboxilacíón (Etapas F, N).
Trayectorias a 3-buteno-1-ol, butadieno y 2,4-pentadienoato de malonil-CoA y acetil-CoA se muestran en la Figura 21. En estas trayectorias, malonil-CoA y acetil-CoA se unen por una tiolasa para formar 3-oxoglutaril-CoA. Este intermediario puede entonces ser convertido a 3,5-dihidroxipentanoato por varias rutas alternas (Etapas B/C/D, Etapas B/G, Etapas H/l/J, Etapas H/L/D, K/J). Una vez formado, 3,5-dihidroxipentanoato puede ser descarboxilado por una 3-hidroxiácido descarboxilasa para formar 3-buteno-1 -ol (Etapa M). La deshidratación subsecuente por una 3-buteno-1 -ol deshidrogenasa o un catalizador químico proporciona butadieno (Etapa O). Alternativamente, 3,5- dihidroxipentanoato puede ser deshidratado a 5-hidroxipent-2-enoato como se muestra en la etapa E. Este intermediario puede entonces ser descarboxilado a 3-buteno-1 -ol (Etapa N) o además deshidratado a 2,4- pentadienoato (Etapa F).
Enzimas para catalizar las transformaciones mostradas en la Figuras 18-21 son categorizadas por número EC (Tabla 1) y descritas adicionalmente abajo. catalizadas por enzimas de alcohol deshidrogenasas. Estas reacciones incluyen Etapas B, I, N y P de la Figura 19, Etapas E, G, K y L de la Figura 20 y Etapas B, D, I, J y L de la Figura 21.
Genes ejemplares que codifican enzimas que catalizan la reducción de un aldehido a alcohol (es decir,, alcohol deshidrogenase o equivalentemente aldehido reductasa) incluyen alrA que codifica una alcohol deshidrogenase de cadena media para C2-C14 (Tani et al., Appl.Environ. Microbio!. 66:5231-5235 (2000)), yqhD y fucO de E. coli (Sulzenbacher et al., 342:489-502 (2004)), y bdh I y bdh II de C. acetobutilicum la cual convierte butiraldehído en butanol (Walter et al., 174:7149-7158 (1992)). YqhD cataliza la reducción de un amplio rango de aldehidos usando NADPH como el cofactor, con un preferencia para cadenas de longitudes más largas de C(3) (Sulzenbacher er al., 342:489-502 (2004); Pérez et al., J Biol.Chem. 283:7346-7353 (2008)). El producto del gene adhA de Zymomonas mobilisE ha sido demostrado por tener actividad en un número de aldehidos que incluyen formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído, y acroleína (Kinoshita er al., Appl Microbio! Biotechnol 22:249-254 (1985)). Candidatos de aldehido reductasas adicionales son codificados por bdh en C. saccharoperbutilacetonicum y Cbei_1722, Cbei_2181 y Cbei_2421 en C. Beijerinckii. Candidatos de aldehido reductasas adicionales del gene en Saccharomyces cerevisiae incluyen las aldehido reductasas GRE3, ALD2-6 y HFD1, glioxilato reductasas GOR1 y YPL113C y glicerol deshidrogenasa GCY1 (WO 2011/022651 A1 ; Atsumi er al., Nature 451:86-89 (2008)). Los candidatos de la enzima descritos previamente para catalizar la reducción de metilglioxal a acetol o lactaldehído son también candidatos de la enzima lactaldehído reductasa adecuados.
Enzimas que presentan actividad de 4-hidroxibutirato deshidrogenasa (EC 1.1.1.61) también caen en esta categoría. Tales enzimas se han caracterizado en Ralstonia eutropha (Bravo et al., J Forens Sci, 49:379-387 (2004)), Clostridium kluyveri (Wolff et al., Protein Expr.Purif. 6:206-212 (1995)) y Arabidopsis thaliana (Breitkreuz et al., J Biol Chem, 278:41552-41556 (2003)). La enzima A. thaliana fue clonada y caracterizada en levadura (Breitkreyz et al., J. Biol. Chem. 278:41552-41556 (2003)). Aún otro gene es la alcohol deshidrogenasa adhl de Geobacillus thermoglucosidasius (Jeon ef al., J Biotechnol 135:127-133 (2008)).
Otra aldehido reductasa ejemplar es metilmalonato semialdehído reductasa, también conocido como 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa (EC 1.1.1.31). Esta enzima participa en la degradación de valina, leucina e isoleucina y ha sido identificada en bacterias, eucariotas, y mamíferos. Las enzimas codificadas por P84067 de Thermus thermophilus HB8 has sido estructuralmente caracterizados (Lokanath ef al., J Mol Biol, 352:905-17 (2005)). La reversibilidad de la 3-hidroxüsobutirato deshidrogenasa humana fue demostrada usando sustrato isotópicamente etiquetado (Manning ef al., Biochem J, 231:481-4 (1985)). Genes adicionales que codifican esta enzima incluyen 3hidh en Homo sapiens (Hawes et al., Métodos Enzymol, 324:218-228 (2000)) y Oryctolagus cuniculus (Hawes ef al., supra; Chowdhury ef al., Biosci.Biotechnol Biochem. 60:2043-2047 (1996)), mmsB en Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida, y dhat en Pseudomonas putida (Aberhart ef al., J Chem.Soc.[Perkin 1] 6:1404-1406 (1979); Chowdhury et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 60:2043-2047 (1996); Chowdhury et al., Biosci.Biotechnol Biochem. 67:438-441 (2003)). Varias enzimas de 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa se han caracterizado en la dirección reductiva, que incluyen mmsB de Pseudomonas aeruginosa (Gokarn ef al., Patente Estadounidense 739676, (2008)) y mmsB de Pseudomonas putida.
Existen varias alcohol deshidrogenases ejemplares que reducen una cetona a un grupo funcional hidroxilo. Dos de tales enzimas de E. coli son codificadas por malato deshidrogenasa (mdh) y lactato deshidrogenase (IdhA). Además, lactato deshidrogenasa de Ralstonia eutropha se ha mostrado por demostrar altas actividades en 2-cetoácidos de varias longitudes de cadena incluyendo lactato, 2-oxobutirato, 2-oxopentanoato y 2-oxoglutarato (Steinbuchel et al., Eur.J.Biochem. 130:329-334 (1983)). La conversión de alfa-cetoadipato en alfa-hidroxiadipato puede ser catalizada por 2-cetoadipato reductasa, una enzima reportada por ser encontrada en placenta humana y de rata (Suda ef al., Arch.Biochem.Biophys. 176:610-620 (1976); Suda et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 77:586-591 (1977)). Una oxidorreductasa adicional es la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa mitocondrial (bdh) del corazón humano la cual ha sido clonada y caracterizada (Marks et al., J.Biol.Chem. 267:15459-15463 (1992)). Enzimas de alcohol deshidrogenasas de C. beijerinckii (Ismaiel ef al., J.Bacteriol. 175:5097-5105 (1993)) y T. brockii (Lamed ef al., Biochem.J. 195:183-190 (1981); Peretz et al., Biochemistry. 28:6549-6555 (1989)) se convierten de acetona a isopropanol. Metil etil cetona reductasa cataliza la reducción de MEK a 2-butanol. Enzimas MEK reductasa ejemplares se pueden encontrar en Rhodococcus ruber (Kosjek et al., Biotechnol Bioeng. 86:55-62 (2004)) y Pirococcus furiosus (van der ef al., Eur.J.Biochem. 268:3062-3068 (2001)).
A número de organismos puede catalizar la reducción de 4-hidroxi-2-butanona a 1 ,3-butanodiol, que incluyen aquellos que pertenecen a los géneros Bacillus, Brevibacterium, Candida, y Klebsiella entre otros, como se describe por Matsuyama et al. ((1995)). Una fenilacetaldehído reductasa mutasa de Rhodococcus (Sar268) y una alcohol deshidrogenase de Leifonia también se han mostrado por catalizar esta transformación a alta proporción (Itoh et al., Appl. Microbio! Biotechnol. 75:1249-1256 (2007)).
Enzimas de alcohol deshidrogenasas que reducen sustratos de 3-oxoacil-CoA a sus productos correspondientes de 3-hiroxiacil-CoA también son relevantes para las trayectorias representadas en la Figuras 19-21. Enzimas de 3-Oxoacil-CoA deshidrogenase (EC 1.1.1.35) se convierten a moléculas de 3-oxoacil-CoA en moléculas de 3-hidroxiacil-CoA y están a menudo involucradas en la beta-oxidación del ácido graso o catabolismo de fenilacetato. Por ejemplo, subunidades de dos complejos de oxidación de ácido graso en E. coli, codificadas por fadB y fadJ, funcionan como 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasas (Binstock et al., Métodos Enzymol. 71 Pt C:403-411 (1981)). Dada la proximidad en E. coli de paaH a otros genes en el operón de degradación de fenilacetato (Nogales et al., 153:357-365 (2007)) y el hecho de que mutantes de paaH no pueden crecer fenilacetato (Ismail et al., Eur.J Biochem. 270:3047-3054 (2003)), se espera que el gene paaH de E. coli también codifique una 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa. Acetoacetil-CoA reductasa participa en la trayectoria de fermentación de acetil-CoA a butirato en varias especies de Clostridia y ha sido estudiada en detalle (Jones et al., Microbiol Rev. 50:484-524 (1986)). La enzima de Clostridium acetobutilicum, codificada por hbd, ha sido clonada y funcionalmente expresada en E. coli (Youngleson er al., J Bacteriol. 171:6800-6807 (1989)). Aún otros genes demostrados por reducir acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA son phbB de Zoogloea ramigera (Ploux er al., Eur.J Biochem. 174:177-182 (1988)) y phaB de Rhodobacter sphaeroides (Alber et al., Mol. Microbiol 61:297-309 (2006)). el gene anterior es dependiente de NADPH, su secuencia de nucleótido ha sido determinada (Peoples et al., Mol. Microbiol 3:349-357 (1989)) y el gene ha sido expresado en E. coli. Estudios de especificidad del sustrato en el gene conducen a la conclusión de que se podría aceptar 3-oxopropionil-CoA como un sustrato además de acetoacetil-CoA (Ploux et al., Eur.J Biochem. 174:177-182 (1988)). Genes adicionales incluyen phaB en Paracoccus denitrificans, Hbd1 (dominio C-terminal) y Hbd2 (dominio N-terminal) en Clostridium kluyveri (Hillmer y Gottschalk, Biochim. Biophys. Acta 3334:12-23 (1974)) y HSD17B10 en Bos taurus (Wakil ef al., J Biol.Chem. 207:631-638 (1954)). La enzima de Paracoccus denitrificans ha sido funcionalmente expresada y caracterizada en E. coli (Yabutani eí al., FEMS Microbio! Lett. 133:85-90 (1995)). Un número de enzimas similares se han encontrado en otras especies de Clostridia y en Metallosphaera sedula (Berg eí al., Science. 318:1782-1786 (2007)). La enzima de Candida tropicalis es un componente de la enzima multifuncional de la beta-oxidación del ácido graso peroxisomal tipo 2 (MFE-2). El dominio B de deshidrogenasa de esta proteína es catalíticamente activo en acetoacetil-CoA. El dominio ha sido funcionalmente expresado en E. coli, una estructura cristalina está disponible, y el mecanismo catalítico es bien entendido (llianttila eí al., Biochem Biophys Res Commun 324:25-30 (2004); llianttila eí al., J Mol Biol 358:1286-1295 (2006)).
Oxidorreductasas bifuncionales se convierten a una acil-CoA en su alcohol correspondiente. Enzimas con esta actividad se requieren para convertir 3-hidroxiglutaril-CoA a 3,5-dihidroxipentanoato (Figura 21, la etapa G) y 3-oxoglutaril-CoA a 5-hidroxi-3-oxopentanoato (Figura 21, etapa K).
Oxidorreductasas bifuncionales ejemplares que se convierten de un acil-CoA a alcohol incluyen aquellas que transforman sustratos tales como acetil-CoA a etanol (por ejemplo, adhE de E. coli (Kessler et al., FEBS.Lett. 281:59-63 (1991))) y butiril-CoA a butanol (e.g. adhE2 de C. acetobutilicum (Fontaine et al., J. Bacterio!. 184:821-830 (2002))). Las enzimas de C. acetobutilicum codificadas por bdh I y bdh II (Walter, et al., J. Bacteriol. 174:7149-7158 (1992)), reducen acetil-CoA y butiril-CoA a etanol y butanol, respectivamente. Además de reducir acetil-CoA a etanol, las enzimas codificadas por adhE en Leuconostoc mesenteroides se han mostrado por oxidar el compuesto de cadena ramificada ¡sobutiraldehído a isobutiril-CoA (Kazahaya et al., J.Gen.Appl.Microbiol. 18:43-55 (1972); Koo et al., Biotechnol Lett, 27:505-510 (2005)). Otra enzima ejemplar puede ser convertida a malonil-CoA a 3-HP. Una enzima dependiente de NADPH con esta actividad se ha caracterizado en Chloroflexus aurantiacus en donde participa en el ciclo de 3-hidroxipropionato (Hugler et al., J Bacterio!, 184:2404-2410 (2002); Strauss et al., Eur J Biochem, 215:633-643 (1993)). Esta enzima, con una masa de 300 kDa, es un sustrato altamente específico y muestra poca similitud de secuencia con otras oxidorreductasas conocidas (Hugler et al., supra). Ningunas enzimas en otros organismos se han mostrado por catalizar esta reacción específica; sin embargo existe evidencia bioinformática de que otros organismos pueden tener trayectorias similares (Klatt et al., Env Microbiol, 9:2067-2078 (2007)). Candidatos de la enzima en otros organismos que incluyen Roseiflexus castenholzii, Erythrobacter sp. NAP1 y gama proteobacteria HTCC2080 marina pueden ser inferidos por similitud de secuencia.
Moléculas de acil-CoA de cadena larga pueden ser reducidas a sus correspondientes alcoholes por enzimas tales como la FAR de jojoba (Simmondsia chinensis) la cual codifica una acil-CoA reductasa grasa que forma un alcohol. Su sobreexpresión en E. coli resulta en actividad de FAR y la acumulación de alcohol graso (Metz et al., Plant Physiol, 122:635-644 (2000)).
Otro candidato para catalizar estas etapas es 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (o HMG-CoA reductasa). Esta enzima naturalmente reduce el grupo CoA en 3-h¡droxi-3-met¡lglutaril-CoA a un mevalonato que forma alcohol, el gene hmgiln de Sulfolobus solfataricus, que codifica 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa, ha sido clonado, secuenciado, y expresado en E. coli (Bochar ef al., J Bacterio!. 179:3632-3638 (1997)). S. cerevisiae también tiene dos HMG-CoA reductasas en esta (Basson ef al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 83:5563-5567 (1986)). el gene también ha sido aislado de Arabidopsis thaliana y se ha mostrado que complementa la actividad de HMG-COA reductasa en S. cerevisiae (Learned ef al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86:2779-2783 (1989)).
Acil-CoA reductasas en la familia 1.2.1 reducen una acil-CoA a su aldehido correspondiente. Tal conversión es requerida en las Etapas C y H de la Figura 21. Varias enzimas de acil-CoA deshidrogenasas se han descrito en la literatura abierta al público y representan candidatos adecuados para estas etapas. Estas se describen abajo.
Enzimas acil-CoA reductasas ejemplares incluyen acil-CoA reductasa grasa, succinil-CoA reductasa (EC 1.2.1.76), acetil-CoA reductasa y butiril-CoA reductasa. Enzimas grasas ejemplares de acil-CoA reductasa son codificadas por acrl de Acinetobacter calcoaceticus (Reiser, Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997)) y Acinetobacter sp. M-1 (Ishige ef al., Appl. Environ. Microbio!. 68:1192-1195 (2002)). Enzimas con actividad de succinil-CoA reductasa son codificadas por sucD de Clostridium kluyveri (Sohiing, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996)) y sucD de P. gingivalis (Takahashi, J. Bacteriol 182:4704-4710 (2000)). Enzimas succinil-CoA reductasas adicionales participan en el ciclo de 3-hidroxipropionato/4-hidroxibutirato de archaea termofílica que incluye Metallosphaera sedula (Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007)) y Thermoproteus neutrophilus (Ramos-Vera et al., J Bacteriol. , 191:4286-4297 (2009)). La enzima M. sedula, codificada por Msed_0709, es estrictamente dependiente de NADPH y también tiene actividad de malonil-CoA reductasa. La enzima T. neutrophilus es activa con tanto NADPH como NADH. La enzima que acila acetaldehído deshidrogenasa en Pseudomonas sp, codificada por bphG, es aún otra como se ha demostrado por oxidar y acilar acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído, isobutiraídehído y formaldehído (Powlowski, J. Bacteriol. 175:377-385 (1993)). Además de reducir acetil-CoA a etanol, las enzimas codificadas por adhE en Leuconostoc mesenteroides se han mostrado por oxidar el compuesto de cadena ramificada isobutiraídehído a isobutiril-CoA (Kazahaya, J. Gen. Appl. Microbio!. 18:43-55 (1972); y oo ef al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)). La butiraldehído deshidrogenasa cataliza un similar reacción, la conversión de butiril-CoA a butiraldehído, en organismos solventogénicos tales como Clostridium saccharoperbutilacetonicum (Kosaka ef al., Biosci Biotechnol Biochem., 71:58-68 (2007)).
Un tipo de enzima adicional que convierte una acil-CoA a su aldehido correspondiente es malonil-CoA reductasa la cual transforma malonil-CoA a semialdheído malónico. Malonil-CoA reductasa es una enzima clave en la fijación autotrofica de carbono vía el ciclo de 3-hidroxipropionato en bacterias archaeal termoacidofílicas (Berg, Science 318:1782-1786 (2007); y Thauer, Science 318:1732-1733 (2007)). La enzima utiliza NADPH como un cofactor y ha sido caracterizada en Metallosphaera y Sulfolobus sp. (Alber et al., J. Bacterio!. 188:8551-8559 (2006); y Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). La enzima es codificada por Msed_0709 en Metallosphaera sedula (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); y Berg, Science 318:1782-1786 (2007)). un gene que codifica a malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaii fue clonado y heterólogamente expresado en E. coli (Alber et al., J. Bacteriol 188:8551-8559 (2006). Esta enzima también ha sido mostrada por catalizar la conversión de metilmalonil-CoA a su aldehido correspondiente (WO2007141208 (2007)). A pesar que la funcionalidad aldehido de deshidrogenasa de estas enzimas es similar a la deshidrogenasa bifuncional de Chloroflexus aurantiacus, existe poca similitud de secuencia. Ambos candidatos de malonil-CoA reductasa de la enzima tienen alta similitud de secuencia a aspartato-semialdehído deshidrogenasa, una enzima que cataliza la reducción y desfosforilación concurrente de aspartil-4-fosfato a aspartato semialdehído. Candidatos adicionales del gene pueden ser encontrados por homología de secuencia a proteínas en otros organismos que incluyen Sulfolobus solfataricus y Sulfolobus acidocaldarius y han sido listados a continuación. Aún otro candidato para CoA-acilante aldehido deshidrogenasa es el gene ald de Clostridium beijerinckii (Toth, Appl. Environ. Microbio!. 65:4973-4980 (1999). Esta enzima ha sido reportada por reducir acetil-CoA y butiril-CoA a sus aldehidos correspondientes. Este gene es muy similar a eutE que codifica una acetaldehído deshidrogenasa de Salmonella typhimurium y E. coli (Toth, Appl. Environ. Microbio!. 65:4973-4980 (1999).
Enzimas de 2-Enoato reductasa, algunas de las cuales son reversibles, se conocen por catalizar la reducción dependiente de NAD(P)H de una amplia variedad de ácido a, ß-carboxílicos insaturados y aldehidos (Rohdich et al., 276:5779-5787 (2001)). Estas enzimas representan candidatos adecuados para llevar a cabo las transformaciones representadas por las etapas I y C de la Figura 20. Varios ejemplos se proporcionan a continuación.
En la secuencia genómica publicada recientemente de C. kluyveri, se reportaron 9 secuencias codificantes para enoato reductasas, de las cuales una ha sido caracterizada (Seedorf et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S. A 105:2128-2133 (2008)). Los genes enr de tanto C. tyrobutiricum como M. thermoaceticum han sido clonados y secuenciados y muestran 59% de identidad entre sí. el gene anterior es también encontrado por tener aproximadamente 75% de similitud al gene caracterizado en C. kluyveri (Giesel et al., 135:51-57 (1983)). Se ha reportado con base en estos resultados de secuencia que enr es muy similar a la dienoil CoA reductasa en E. coli (fadH) (Rohdich et al., J Biol.Chem. 276:5779-5787 (2001)). el gene enr de C. thermoaceticum también ha sido expresado en una forma catalíticamente activa en E. coli (Rohdich et al., J Biol.Chem. 276:5779-5787 (2001)). Esta enzima presenta actividad en un amplio intervalo de compuestos alfa, beta-carbonilo insaturados.
Otro candidato de 2-enoato reductasa es maleilacetato reductasa (MAR, EC 1.3.1.32), una enzima que cataliza la reducción de 2-maleilacetato (4-oxohex-2-enedioato) a 3-oxoadipato. Enzimas MAR participan naturalmente en trayectorias de degradación aromáticas (Kaschabek et al., J Bacterio!. 175:6075-6081 (1993); Kaschabek er al., J Bacterio!. 177:320-325 (1995); Cámara er al., J Bacterio!. (2009); Huang et al., Appl Environ. Microbio! 72:7238-7245 (2006)). La enzima actividad fue identificada y caracterizada en Pseudomonas sp. cepa B13 (Kaschabek et al., 175:6075-6081 (1993); Kaschabek et al., 177:320-325 (1995)), y el gene codificante fue clonado y secuenciado (Kasberg et al., J Bacterio!. 179:3801-3803 (1997)). Candidatos MAR adicionales del gene incluyen el gene elcE de Pseudomonas sp. cepa B13 (Kasberg et al., J Bacteriol. 179:3801-3803 (1997)), gene macUn de Rhodococcus opacus (Seibert ef al., 180:3503-3508 (1998)), el gene macUn de Ralstonia eutropha (también conocido como Cupriavidus necator) (Seibert et al., Microbiology 150:463-472 (2004)), tfdFII de Ralstonia eutropha (Seibert et al., J Bacteriol. 175:6745-6754 (1993)) y NCgl1112 en Corynebacterium glutamicum (Huang ef al., Appl Environ. Microbio! 72:7238-7245 (2006)). Una MAR en Pseudomonas reinekei MT1, codificada por ccaD, fue recientemente identificada (Cámara et al., J Bacteriol. (2009)).
La Etapa A de la Figuras 19-21 y Etapa M de la Figura 19 requiere condensación de cualquiera de 3-hidroxipropionil-CoA, acrilil-CoA, succinil-CoA o malonil-CoA con acetil-CoA. Varias enzimas ?-cetotiolasa se han descrito en la literatura abierta al público y representan candidatos adecuados para estas etapa. Estas se describen abajo.
Por ejemplo, 3-Oxoadipil-CoA tiolasa representa un tipo de enzima beta-cetotiolasa que es adecuada para las etapas mencionadas anteriormente. 3-Oxoadipil-CoA tiolasa (EC 2.3.1.174) naturalmente convierte beta-cetoadipil-CoA a succinil-CoA y acetil-CoA y es una enzima clave de la trayectoria beta-cetoadipato para degradación de compuestos aromáticos. La enzima es dispersada en bacterias y hongos del suelo que incluyen Pseudomonas putida (Harwood et al., J Bacterio!. 176:6479-6488 (1994)) y Acinetobacter calcoaceticus (Doten et al., J Bacteriol. 169:3168-3174 (1987)). Los productos del gene codificados por pcaF en Pseudomonas cepa B13 (Kaschabek et al., J Bacteriol. 184:207-215 (2002)), phaD en Pseudomonas putida U (Olivera et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S. A 95:6419-6424 (1998)), paaE en Pseudomonas fluorescens ST (Di et al., Arch.Microbiol 188:117-125 (2007)), y paaJ de E. coli (Nogales et al., Microbiology 153:357-365 (2007)) también catalizan esta transformación. Varias beta-cetotiolasas presentan actividades significantes y selectivas en la dirección de formación de oxoadipil-CoA que incluyen bkt de Pseudomonas putida, pcaF y bkt de Pseudomonas aeruginosa PA01, bkt de Burkholderia ambifaria A MD, paaJ de E. coli, y phaD de P. putida.
Glutaril-CoA y acetil-CoA son condensados para formar 3-oxopimeloil-CoA por oxopimelo¡l-CoA:glutaril-CoA aciltransferasa, a beta-cetotiolasa (EC 2.3.1.16). Una enzima que cataliza esta transformación es encontrada en Ralstonia eutropha (anteriormente conocida como Alcaligenes eutrophus), codificada por genes bktB y bktC (Slater et al., J. Bacterio!. 180:1979-1987 (1998); Haywood et al., 52:91-96 (1988)). Se conoce la secuencia de la proteína BktB; sin embargo, la secuencia de la proteína BktC no se ha reportado. El operón pim de Rhodopseudomonas palustris también codifica una beta-cetotiolasa, codificada por pimB, predicha por catalizar esta transformación en la dirección degradativa durante la degradación de benzoil-CoA (Harrison et al., 151:727-736 (2005)). Un candidato de enzima beta-cetotiolasa en S. acid'itrophicus se identificó por homología de secuencia a bktB (43% de identidad, valor e = 1e-93).
Enzimas de beta-cetotiolasa que catalizan la formación de beta-cetovalerato de acetil-CoA y propionil-CoA pueden también ser capaces de catalizar la condensación de acetil-CoA con 3-hidroxipropionil-CoA, acrilil-CoA, succinil-CoA, o malonil-CoA. Zoogloea ramigera tiene dos cetotiolasas que pueden formar D-cetovaleril-CoA de propionil-CoA y acetil-CoA y R. eutropha tiene una ü-oxidación cetotiolasa que es también capaz de catalizar esta transformación (Gruys et al., Patente Estadounidense 5,958,745 (1999)). Las secuencias de estos genes o sus proteínas traducidas no se han reportado, pero varios candidatos en R. eutropha, Z. ramigera, u otros organismos pueden ser identificados en base a la homología de secuencia a bktB de R. eutropha. Estos incluyen: Candidatos adicionales incluyen beta-cetotiolasas que son conocidas por convertir dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA (EC 2.1.3.9). Enzimas de acetoacetil-CoA tiolasa ejemplares incluyen los productos del gene de atoB de E. coli (Martin et al., Nat.Biotechnol 21:796-802 (2003)), thIA y thlB de C. acetobutilicum (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Winzer et al., J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541 (2000)), y ERG10 de S. cerevisiae (Hiser ef al., J.Biol.Chem. 269:31383-31389 (1994)).
Enzimas en la familia 2.8.3 catalizan la transferencia reversible de una porción CoA de una molécula a otra. Tal transformación es requerida por las etapas F, O, G, T, H, y E de la Figura 19 y etapas B y H de la Figura 20. Varias enzimas de CoA transferasa se han descrito en la literatura abierta al público y representan candidatos adecuados para estas etapa. Estas se describen abajo.
Mucha transferasas tienen especificidad amplia y de este modo pueden utilizar Aceptores CoA tan diversos como acetato, succinato, propionato, butirato, 2-metilacetoacetato, 3-cetohexanoato, 3-cetopentanoato, valerato, cronato, 3-mercaptopropionato, propionato, vinilacetato, butirato, entre otros. Por ejemplo, una enzima de Roseburia sp. A2-183 fue mostrada por tener actividad de butiril-CoA:acetato:CoA transferasa y propionil-CoA:acetato:CoA transferasa (Charrier et al., Microbiology 152, 179-185 (2006)). Homólogos cercanos se pueden encontrar en, por ejemplo, Roseburia intestinalis L1-82, Roseburia inulinivorans DSM 16841, Eubacterium rectale ATCC 33656. Otro enzima con actividad de propionil-CoA transferasa se puede encontrar en Clostridium propionicum (Selmer er al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002)). Esta enzima puede usar acetato, (R)-lactato, (S)-lactato, acrilato, y butirato como la CoA aceptora (Selmer er al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002); Schweiger y Buckel, FEBS Letters, 171(1) 79-84 (1984)). Homólogos cercanos se pueden encontrar en, por ejemplo, Clostridium novyi NT, Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, y Clostridium botulinum C str. Eklund. YgfH codifica una propionil CoA:succinato CoA transferasa en E. coli (Haller er al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629). Homólogos cercanos se pueden encontrar en, por ejemplo, Citrobacter youngae ATCC 29220, Salmonella entérica subsp. arizonae serovar, y Yersinia intermedia ATCC 29909. Estas proteínas son identificadas a continuación.
Una enzima candidata adicional es la enzima de unidades codificada por peal y pcaJ en Pseudomonas, la cual se mostrado por tener actividad de 3-oxoadipil-CoA/succinato transferasa (Kaschabek et al., supra). Existen enzimas similares con base en la homología en Acinetobacter sp. ADP1 (Kowalchuk et al., Gene 146:23-30 (1994)) y Streptomyces coelicolor. Succinil-CoA:3:oxoácido-CoA transferasas ejemplares adicionales están presentes en Helicobacter pilori (Corthesy-Theulaz et al., J.Biol.Chem. 272:25659-25667 (1997)) y Bacillus subtilis (Stols ef al., Protein.Expr.Purif. 53:396-403 (2007)). Estas proteínas son identificadas a continuación.
Una CoA transferasa que puede utilizar acetato como el CoA aceptor es acetoacetil-CoA transferasa, codificada por los genes atoA (alfa subunidad) y atoD (beta subunidad) de E. coli (Vanderwinkel ef al., Biochem.Biophys.Res Commun. 33:902-908 (1968); Korolev et al., Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)). Esta enzima también ha sido mostrada por transferir la porción CoA a acetato de una variedad de sustratos acil-CoA lineales y ramificados, que incluyen isobutirato (Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)), valerato (Vanderwinkel et al., supra) y butanoato (Vanderwinkel et al., supra). Enzimas similares existen en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Duncan ef al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)), Clostridium acetobutilicum (Cary ef al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)), y Clostridium saccharoperbutilacetonicum (Kosaka ef al., Biosci.Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)). Estas proteínas son identificadas a continuación.
Candidatos de transferasa ejemplares adicionales son catalizados por los productos del gene de catl, cat2, y cat3 de Clostridium kluyveri los cuales han sido mostrados por exhibir actividad de succinil-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA, y butiril-CoA transferasa, respectivamente (Seedorf et al., supra; Sohling et al., Eur.J Biochem. 212:121-127 (1993); Sohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)). Actividades similares de CoA transferasa están también presentes en Trichomonas vaginalis (van Grinsven eí al., J.Biol.Chem. 283:1411-1418 (2008)) y Trypanosoma brucei (Riviere eí al., J.Biol.Chem. 279:45337-45346 (2004)). Estas proteínas son identificadas a continuación.
La enzima glutaconato-CoA-transferasa (EC 2.8.3.12) de la bacteria anaeróbica Acidaminococcus fermentans reacciona con diácido glutaconil-CoA y 3-butenoil-CoA (Mack et al., FEBS Lett. 405:209-212 (1997)). Los genes que codifican esta enzima son gctA y gctB. Esta enzima tiene actividad reducida pero detectable con otros derivados de CoA que incluyen glutaril-CoA, 2-hidroxiglutaril-CoA, adipil-CoA y acrilil-CoA (Buckel et al., Eur.J.Biochem. 118:315-321 (1981)). La enzima ha sido clonada y expresada en E. coli (Mack et al., Eur.J.Biochem. 226:41-51 (1994)). Estas proteínas son identificadas a continuación.
Enzimas en la familia 3.1.2 hidrolizan moléculas de acil-CoA a sus correspondientes ácidos. Tal transformación es requerida por las etapas F, O, G, T, H, y E de la Figura 19 y etapas B y H de la Figura 20.
Varias de tales enzimas se han descrito en la literatura y representan candidatos adecuados para estas etapas.
Por ejemplo, las enzimas codificadas por acot12 de cerebro de Rattus norvegicus (Robinson et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 71:959-965 (1976)) pueden reaccionar con butiril-CoA, hexanoil-CoA y malonil-CoA. La tioesterasa de ácido dicarboxílico humana, codificada por acot8, presenta actividad en glutaril-CoA, adipil-CoA, suberil-CoA, sebacil-CoA, y dodecanodioil-CoA (Westin ef al., J.Biol.Chem. 280:38125-38132 (2005)). El homólogo de E. coli más cercano a esta enzima, tesB, puede también hidrolizar un intervalo de tiolésteres de CoA (Naggert et al., J Biol Chem 266:11044-11050 (1991)). Una enzima similar también ha sido caracterizada en el hígado de rata (Deana R., Biochem Int 26:767-773 (1992)). Enzimas adicionales con actividad de hidrolasa en E. coli incluyen ybgC, paal, y ybdB (Kuznetsova, et al., FEMS Microbio! Rev, 2005, 29(2):263-279; Song ef al., J Biol Chem, 2006, 281 (16): 11028-38). Aunque su secuencia no se ha reportado, la enzima del mitocondrión de la hoja de chícharo tiene una amplia especificidad de sustrato, con actividad demostrada en acetil-CoA, propionil-CoA, butiril-CoA, palmitoil-CoA, oleoil-CoA, succinil-CoA, y crotonil-CoA (Zeiher ef al., Plant.Physiol. 94:20-27 (1990)) La acetil-CoA hidrolasa, ACH1, de S. cerevisiae representa otra candidato de hidrolasa (Buu et al., J.Biol.Chem. 278:17203-17209 (2003)).
Aún otro candidato de hidrolasa es la glutaconato CoA-transferasa de Acidaminococcus fermentans. Esta enzima se transformó por mutagénesis dirigida al sitio en una acil-CoA hidrolasa con actividad en glutaril-CoA, acetil-CoA y 3-butenoil-CoA (Mack et al., FEBS.Lett. 405:209-212 (1997)). Esto sugiere que las enzimas que codifican succinil-CoA:3-cetoácido-CoA transferasas y acetoacetil-CoA:acetil-CoA transferasas pueden también servir como candidatos para esta reacción etapa pero podrían requerir ciertas mutaciones para cambiar su función.
Enzimas hidrolasas adicionales incluyen 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa la cual ha sido descrita por catalizar eficientemente la conversión de 3-hidroxiisobutiril-CoA a 3-hidroxiisobutirato durante la degradación de valina (Shimomura et al., J Biol Chem. 269:14248-14253 (1994)). Genes que codifican esta enzima incluyen hibch de Rattus norvegicus (Shimomura et al., Métodos Enzymol. 324:229-240 (2000)) y Homo sapiens (Shimomura et al., supra). Candidatos similares del gene también pueden ser identificados por homología de secuencia, que incluyen hibch de Saccharomyces cerevisiae y BC_2292 de Bacillus cereus.
Enzimas descarboxilasas en la clase EC 4.1.1 se requieren para catalizar las etapas U,Y,V, y X de la Figura 19, etapas D,J,M, y N de la Figura 20, y etapas M,N, y P de la Figura 21. Enzimas descarboxilasas candidatas se han descrito anteriormente en esta solicitud.
La hidratación de un doble enlace puede ser catalizada por enzimas hidratasas en la familia 4.2.1 de enzimas. La remoción de agua para formar un doble enlace es catalizada por enzimas deshidratasas en la familia 4.2.1 de enzimas. Enzimas hidratasas son algunas veces reversibles y también catalizan la deshidratación. Enzimas deshidratasas son algunas veces reversibles y también catalizan la hidratación. La adición o remoción de agua de un sustrato dado es requerida por las etapas S, K, L, R, D, C, J, Q, y W en la Figura 19, por la etapa F en la Figura 20, y por las etapas E, F, y O en la Figura 21. Varias enzimas hidratasas y deshidratasas se han descrito en la literatura y representan candidatos adecuados para estas etapas.
Por ejemplo, muchas enzimas deshidratasas catalizan la alfa, beta-eliminación de agua la cual involucra activación del alfa-hidrógeno por un grupo carbonilo, carboxilato o CoA-tiol éster de electrón atrayente y remoción del grupo hidroxilo de la posición beta (Buckel ef al., J Bacterio!, 117:1248-60 (1974); Martins et al., PNAS 101:15645-9 (2004)). Las enzimas ejemplares incluyen 2-(hidroximetil)glutarato deshidratasa (EC 4.2.1.-), fumarasa (EC 4.2.1.2), 3-deshidroquinato deshidratasa (EC 4.2.1.10), ciclohexanona hidratasa (EC 4.2.1.-) y 2-ceto-4-pentenoato deshidratasa (EC 4.2.1.80), citramalato hidroliasa y dimetilmaleato hidratasa.
La 2-(Hidroximetil)glutarato deshidratasa es una enzima que contiene [4Fe-4S] que deshidrata 2-(hidroximetil)glutarato a 2-metilene-glutarato, estudiada por su papel en el catabolismo de nicotinato en Eubacterium barkeri (anteriormente Clostridium barkeri) (Alhapel et al., Proc Nati Acad Sci 103:12341-6 (2006)). Enzimas similares con alta homología de secuencia son encontradas en Bacteroides capillosus, Anaerotruncus colihominis, y Natranaerobius thermophilius. Estas enzimas son homologas a las subunidades alfa y beta de serina deshidratases bacterianas que contienen [4Fe-4S] (por ejemplo, enzimas de E. coli codificadas por tdcG, sdhB, y sdaA). Una enzima con similar funcionalidad en E. barkeri es dimetilmaleato hidratasa, una enzima sensible al oxígeno y dependiente de Fe2+ reversible en la familia aconitasa que hidrata dimetilmaleato para formar (2R,3S)-2,3-dimetilmalato. Esta enzima es codificada por dmdAB (Alhapel et al., Proc Nati Acad Sci U S A 103:12341-6 (2006); Kollmann-Koch et al., Hoppe Seilers.Z.Physiol Chem. 365:847-857 (1984)).
Enzimas de fumarato hidratasa (EC 4.2.1.2) catalizan naturalmente la hidratación reversible de fumarato a malato. A pesar que la capacidad de fumarato hidratasa para reaccionar con 3-oxobutanol como un sustrato no ha sido descrita en la literatura, una riqueza de información estructural está disponible para esta enzima y otros investigadores han diseñado exitosamente por ingeniería la enzima para alterar actividad, inhibición y localización (Weaver, 61:1395-1401 (2005)). E. coli tiene tres fumarasas: FumA, FumB, y FumC que son reguladas por condiciones de crecimiento. FumB es sensible al oxígeno y solamente es activa bajo condiciones anaeróbicas. FumA está activa bajo condiciones microanaeróbicas, y FumC es la enzima solamente activa en crecimiento aeróbico (Tseng et al., J Bacterio!, 183:461-467 (2001); Woods et al., 954:14-26 (1988); Guest et al., J Gen Microbio! 131:2971-2984 (1985)). Candidatos adicionales de la enzima son encontrados en Campilobacter jejuni (Smith et al., Int.J Biochem.Cell Biol 31:961-975 (1999)), Thermus thermophilus (Mizobata ef a/., Arch.Biochem.Biophys. 355:49-55 (1998)) y Rattus norvegicus (Kobayashi et al., J. Biochem, 89:1923-1931 (1981)). Enzimas similares con alta homología de secuencia incluyen fum1 de Arabidopsis thaliana y fumC de Corynebactérium glutamicum. La fumarasa MmcBC de Pelotomaculum thermopropionicum es otra clase de fumarasa con dos subunidades (Shimoyama ef al., FEMS Microbio! Lett, 270:207-213 (2007)).
La deshidratación de 4-hidroxi-2-oxovalerato a 2- oxopentenoato es catalizada por 4-hidroxi-2-oxovalerato hidratasa (EC 4.2.1.80). Esta enzima participa en trayectorias de degradación aromáticas y es típicamente co-transcrita con un gene que codifica una enzima con actividad de 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa. Productos ejemplares del gene son codificados por mhpD of E. coli (Ferrandez et al., J Bacteriol. 179:2573-2581 (1997); Pollard et al., Eur J Biochem. 251:98-106 (1998)), todG y cmtF de Pseudomonas putida (Lau er al., Gene 146:7-13 (1994); Eaton, J Bacteriol. 178:1351-1362 (1996)), cnbE de Comamonas sp. CNB-1 (Ma er al., Appl Environ Microbio! 73:4477-4483 (2007)) y mhpD de Burkholderia xenovorans (Wang er al., FEBS J 272:966-974 (2005)). Una enzima cercanamente relacionada, 2-oxohepta-4-eno-1 ,7-dioato hidratasa, participa en la degradación del ácido 4-hidroxifenilacético, donde se convierte 2-oxo-hept-4-eno-1 ,7-dioato (OHED) a 2-oxo-4-hidroxi-hepta-1 ,7-dioato usando magnesio como un cofactor (Burks er al., J.Am.Chem.Soc. 120: (1998)). Candidatos de hidratasa OHED de la enzima se han identificado y caracterizado en E. coli C (Roper er al., Gene 156:47-51 (1995); Izumi er al., J Mol.Biol. 370:899-911 (2007)) y E. coli W (Prieto er al., J Bacteriol. 178:111-120 (1996)). La comparación de secuencia revela homólogos en un amplio intervalo de bacterias, plantas y animales. Enzimas con secuencias muy similares están contenidas en Klebsiella pneumonía (91% de identidad, valor e = 2e-138) y Salmonella entérica (91% de identidad, valor e = 4e-138), entre otros.
Otro candidato de la enzima es citramalato hidroliasa (EC 4.2.1.34), una enzima que naturalmente deshidrata 2-metilmalato a mesaconato. Esta enzima ha sido estudiada en Methanocaldococcus jannaschii en el contexto de la trayectoria de piruvato a 2-oxobutanoato, donde se ha demostrado que tiene una amplia especificidad de sustrato (Drevland er al., J Bacteriol. 189:4391-4400 (2007)). Esta actividad de la enzima también se ha detectado en Clostridium tetanomorphum, Morganella morganii, Citrobacter amalonaticus donde se cree que participa en la degradación de glutamato (Kato et al., Arch. Microbio! 168:457-463 (1997)). La secuencia de proteína de M. jannaschii no lleva homología significante a los genes en estos organismos.
Dimetilmaleato hidratasa (EC 4.2.1.85) es una enzima sensible al oxígeno y dependiente de Fe2+ reversible en la familia aconitasa que hidrata dimetilmaleato para formar (2R,3S)-2,3-dimetilmalato. Esta enzima es codificada por dmdAB en Eubacterium barkeri (Alhapel et al., supra; Kollmann-Koch et al., Hoppe Seilers.Z.Physiol Chem. 365:847-857 (1984)).
Oleato hidratasas representan candidatos adicionales adecuados como se sugiere en el documento WO2011076691. Estos son particularmente útiles para la etapa W de la Figura 19 y etapa O de la Figura 21. Ejemplos incluyen las siguientes proteínas.
Enoil-CoA hidratasas (EC 4.2.1.17) catalizan la deshidratación de un intervalo de sustratos de 3-hidroxiacil-CoA (Roberts et al., Arch.Microbiol 117:99-108 (1978); Agnihotri et al., Bioorg.Med.Chem. 11:9-20 (2003); Conrad et al., J Bacteriol. 118:103-111 (1974)). La enoil-CoA hidratasa de Pseudomonas putida, codificada por ech, cataliza la conversión de 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA (Roberts et al., Arch.Microbiol 117:99-108 (1978)). Esta transformación es también catalizada por el producto del gene de crt de Clostridium acetobutilicum, el producto del gene crt1 de C. kluyveri, y otros organismos clostridiales Atsumi et al., Metab Eng 10:305-311 (2008); Boynton ef al.., J Bacteriol. 178:3015-3024 (1996); Hillmer er al., FEBS Lett. 21:351-354 (1972)). Candidatos de enoil-CoA hidratasa adicionales son phaA y phaB, de P. putida, y paaA y paaB de P. fluorescens (Olivera er al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S. A 95:6419-6424 (1998)). El producto del gene de pimF en Rhodopseudomonas palustris es predicho por codificar una enoil-CoA hidratasa que participa en la degradación de pimeloil-CoA (Harrison eí al., Microbiology 151:727-736 (2005)). Finalmente, un número de genes de Escherichia coli ha sido mostrado por demonstrar la funcionalidad de enoil-CoA hidratasa que incluye maoC (Park et al., J Bacteriol. 185:5391-5397 (2003)), paaF (Ismail et al., Eur.J Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park eí al., Appl. Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004); Park eí al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)) y paaG (Ismail eí al., Eur.J Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park y Lee, Appl. Biochem. Biotechnol 113-116:335-346 (2004); Park y Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)).
Alternativamente, los productos del gene E. coli de fadA y fadB codifican un multicomplejo de enzima involucrado en la oxidación del ácido graso que presenta actividad de enoil-CoA hidratasa (Yang et al., Biochemistry 30:6788-6795 (1991); Yang, J Bacteriol. 173:7405-7406 (1991); Nakahigashi eí al., Nucleic Acids Res. 18:4937 (1990)). Agónicos a un regulador negativo codificado por fadR se pueden utilizar para activar el producto del gene fadB (Sato et al., J Biosci.Bioeng 103:38-44 (2007)). Los genes fadl y fadJ codifican funciones similares y son naturalmente expresados bajo condiciones anaeróbicas (Campbell et al., Mol. Microbio! 47:793-805 (2003)).
La conversión de sustratos de acil-CoA a sus productos de ácido puede ser catalizada por una CoA ácido-tiol ligasa o CoA sintetasa en la familia 6.2.1 de enzimas, varias de las cuales son reversibles. Varias reacciones mostradas en las Figuras 19-20 son catalizadas por enzimas ácido-tiol ligasa. Estas reacciones incluyen las Etapas F, O, G, T, H, y E de la Figura 19 y las Etapas B y H de la Figura 20. Varias enzimas que catalizan actividades de CoA ácido-tiol ligasa o CoA sintetasa se han descrito en la literatura y representan candidatos adecuados para estas etapas.
Por ejemplo, acetil-CoA sintetasa que forma ADP (ACD, EC 6.2.1.13) es una enzima que acopla la conversión de acil-CoA ésteres a sus correspondientes ácidos con la síntesis concomitante de ATP. ACD I de Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1211, fue mostrada para operar en una variedad de sustratos lineales y ramificados que incluyen isobutirato, ¡sopentanoato, y fumarato ( usfeldt ef al., J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). Una segunda ACD reversible en Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1983, también es mostrada por tener un amplio rango de sustrato con alta actividad en los compuestos cíclicos fenilacetato y indoleacetato (Musfeldt y Schonheit, J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). La enzima de Haloarcula marismortui (anotada como una succinil-CoA sintetasa) acepta propionato, butirato, y ácidos de cadena ramificada (¡sovalerato e isobutirato) como sustratos, y fue mostrada por operar en las direcciones hacia adelante y hacia atrás (Brasen ef al., Arch Microbio! 182:277-287 (2004)). Las ACD codificadas por PAE3250 de crenarchaeon hipertermofílico de Pirobaculum aerophilum muestran el intervalo de sustrato más amplio de todas las ACDs caracterizadas, que reaccionan con acetil-CoA, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetil-CoA (Brasen et al, supra). La evolución directa o diseñada por ingeniería se puede usar para modificar esta enzima para operar a la temperatura fisiológica del organismo hospedero. Las enzimas de A. fulgidus, H. marismortui y P. aerophilum todas se han clonado, funcionalmente expresado, y caracterizado en E. coli (Brasen y Schonheit, supra; Musfeldt y Schonheit, J Bacteriol. 184:636-644 (2002)). Un candidato adicional es succinil-CoA sintetasa, codificada por sucCD de E. coli y genes LSC1 y LSC2 de Saccharomyces cerevisiae. Estas enzimas catalizan la formación de succinil-CoA de succinato con el consumo concomitante de un ATP en una reacción la cual es reversible in vivo (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)). La acil CoA ligasa de Pseudomonas putida ha sido demostrada por funcionar en varios sustratos alifáticos que incluyen ácidos acético, propiónico, butírico, valérico, hexanoico, heptanoico y octanoico y en compuestos aromáticos tales como ácidos fenilacético y fenoxiacético (Fernandez-Valverde et al., Appl.Environ. Microbio!. 59:1149-1154 (1993)). Una enzima relacionada, malonil CoA sintetasa (6.3.4.9) de Rhizobium leguminosarum podría ser convertida a varios diácidos, es decir, etil-, propil-, alil-, isopropil-, dimetil-, ciclopropil-, ciclopropilmetilen-, ciclobutil-, y bencil-malonato en sus correspondientes monotioésteres (Pohl et al., J.Am.Chem.Soc. 123:5822-5823 (2001)).
Otra enzima candidata para estas etapas es 6-carboxihexanoato-CoA ligasa, también conocida como pimeloil-CoA ligasa (EC 6.2.1.14), la cual naturalmente activa pimelato a pimeloil-CoA durante la biosíntesis de biotina en bacterias gram-positivas. La enzima de Pseudomonas mendocina, clonada en E. coli, fue mostrada por aceptar los sustratos alternos hexanedioato y nonanedioato (Binieda et al., Biochem.J 340 (Pt 3):793-801 (1999)). Otros candidatos son encontrados en Bacillus subtilis (Bower et al., J Bacterio!. 178:4122-4130 (1996)) y Lysinibacillus sphaericus (anteriormente Bacillus sphaericus) (Ploux et al., Biochem.J 287 (Pt 3):685-690 (1992)).
CoA-ligasas adicionales incluyen la dicarboxilato-CoA ligasa de rata para la cual la secuencia es aún no caracterizada (Vamecq eí al., Biochem.J 230:683-693 (1985)), cualquiera de las dos fenilacetato-CoA ligasas caracterizadas de P. chrysogenum (Lamas-Maceiras eí al., Biochem.J 395:147-155 (2006); Wang eí al., 360:453-458 (2007)), la fenilacetato-CoA ligasa de Pseudomonas putida (Martinez-Blanco eí al., J Biol Chem 265:7084-7090 (1990)) y la 6-carboxihexanoato-CoA ligasa de Bacillus subtilis (Bower et al. J Bacteriol 178(14):4122-4130 (1996)). Las acetoacetil-CoA sintetasas de Mus musculus (Hasegawa eí al., Biochim Biophys Acta 1779:414-419 (2008)) y Homo sapiens (Ohgami eí al., Biochem.Pharmacol. 65:989-994 (2003)) catalizan naturalmente la conversión de acetoacetato dependiente de ATP en acetoacetil-CoA.
Como enzimas en otras clases, ciertas enzimas en la clase EC 6.2.1 han sido determinadas por tener especificidad de sustrato amplia. La acil CoA ligasa de Pseudomonas putida ha sido demostrada por funcional en varios sustratos alifáticos que incluyen ácidos acético, propiónico, butírico, valérico, hexanoico, heptanoico y octanoico y en compuestos aromáticos tales como ácidos fenilacético y fenoxiacético (Fernandez-Valverde et al., Applied and Environmental Microbiology 59:1149-1154 (1993)). Una enzima relacionada, malonil CoA sintetasa (6.3.4.9) de Rhizobium trifolii podría convertir varios diácidos, es decir, etil-, propil-, alil-, isopropíl-, dimetil-, ciclopropíl-, ciclopropilmetileno-, cíclobutil-, y bencil-malonato en sus correspondientes monotioésteres (Pohl et al., J.Am.Chem.Soc. 123:5822-5823 (2001)).
A través de esta solicitud varias publicaciones han sido referenciadas. Las descripciones de estas publicaciones en sus totalidades, que incluyen publicaciones de GenBank y Número Gl, están de este modo incorporados por referencia en su totalidad para describir más completamente el estado de la técnica al cual está invención pertenece. A pesar que la invención ha sido descrita con referencia a los ejemplos proporcionados anteriormente, se debe entender que se pueden hacer varias modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención.

Claims (243)

REIVINDICACIONES
1. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de tolueno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno expresada en una cantidad suficiente para producir tolueno, tal trayectoria de tolueno es seleccionada de (A) 1) una o ambas de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, y 3) fenilacetaldehído descarbonilasa; (B) 1) una o más de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, 3) una o más de fenilacetaldehído deshidrogenasa y fenilacetaldehído oxidasa, y 4) fenilacetato descarboxilasa; (C) 1) una o más de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato oxidasa, y 3) fenilacetato descarboxilasa; y (D) 1) fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato oxidasa y 3) fenilacetato descarboxilasa.
2. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
3. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
4. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque los tres ácidos nucleicos exógenos codifican 1) fenilalanina aminotransferasa o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, 3) fenilacetaldehído descarbonilasa.
5. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
6. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque los cuatro ácidos nucleicos exógenos codifican 1) fenilalanina aminotransferasa o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, 3) fenilacetaldehído deshidrogenasa o oxidasa, y 4) fenilacetato descarboxilasa.
7. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
8. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
9. Un método para producir tolueno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de tolueno, dicha trayectoria comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno expresada en una cantidad suficiente para producir tolueno, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir tolueno, tal trayectoria de tolueno es seleccionada de (A) 1) una o ambas de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, y 3) fenilacetaldehído descarbonilasa; (B) 1) una o más de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, 3) una o más de fenilacetaldehído deshidrogenasa y fenilacetaldehído oxidasa, y 4) fenilacetato descarboxilasa; (C) una o más de fenilalanina aminotransferasa y fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato oxidasa, y 3) fenilacetato descarboxilasa; y (D) 1) fenilalanina aminotransferasa y/o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato oxidasa y 3) fenilacetato descarboxilasa.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los tres ácidos nucleicos exógenos codifican 1) fenilalanina aminotransferasa o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, y 3) fenilacetaldehído descarbonilasa.
14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque los cuatro ácidos nucleicos exógenos codifican 1) fenilalanina aminotransferasa o fenilalanina oxidorreductasa (desaminación), 2) fenilpiruvato descarboxilasa, 3) fenilacetaldehído deshidrogenasa o oxidasa, y 4) fenilacetato descarboxilasa.
16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
17. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de benceno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benceno expresada en una cantidad suficiente para producir benceno, dicha trayectoria de benceno comprende una fenilalanina benceno-Masa.
18. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exogeno es la fenilalanina benceno-Masa.
19. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exogeno es un ácido nucleico heterólogo.
20. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
21. Un método para producir benceno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de benceno, dicha trayectoria comprende al menos un ácido nucleico exogeno que codifica una enzima de la trayectoria de benceno expresada en una cantidad suficiente para producir benceno, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir benceno, dicha trayectoria de benceno comprende una fenilalanina benceno-Masa.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exogeno es la fenilalanina benceno-Masa.
23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exogeno es un ácido nucleico heterólogo.
24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
25. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de estireno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de estireno expresada en una cantidad suficiente para producir estireno, dicha trayectoria de estireno es seleccionada de (A) 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) una o más de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa, e hidrolasa, 3) benzoil-acetato descarboxilasa, 4) acetofenona reductasa, y 5) 1 -feniletanol deshidratasa; o (B) 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, 3) benzoil-acetato quinasa, 4) benzoil-acetato descarboxilasa, 5) acetofenona reductasa, y 6) 1 -feniletanol deshidratasa.
26. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
27. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
28. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
29. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
30. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque tales cinco ácidos nucleicos exógenos codifican 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) uno de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa, e hidrolasa, 3) benzoil-acetato descarboxilasa, 4) acetofenona reductasa, y 5) 1 -feniletanol deshidratasa.
31. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende seis ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
32. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque tales seis ácidos nucleicos exógenos codifican 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, 3) benzoil-acetato quinasa, 4) benzoil-acetato descarboxilasa, 5) acetofenona reductasa, y 6) 1-feniletanol deshidratasa.
33. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
34. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
35. Un método para producir estireno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de estireno, dicha trayectoria comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de estireno expresada en una cantidad suficiente para producir estireno, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir estireno, dicha trayectoria de estireno es seleccionada de (A) 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) una o más de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa, e hidrolasa, 3) benzoil-acetato descarboxilasa, 4) acetofenona reductasa, y 5) 1 -feniletanol deshidratasa; o (B) 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) fosfotrans-3-???-3-fenilpropionilasa, 3) benzoil-acetato quinasa, 4) benzoil-acetato descarboxilasa, 5) acetofenona reductasa, y 6) 1 -feniletanol deshidratasa.
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
38. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
39. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
40. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque dichos cinco ácidos nucleicos exógenos codifican 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) uno de 3-oxo-3-fenilpropionil-CoA sintetasa, transferasa, e hidrolasa, 3) benzoil-acetato descarboxilasa, 4) acetofenona reductasa, y 5) 1 -feniletanol deshidratase.
42. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende seis ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de estireno.
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque dichos seis ácidos nucleicos exógenos codifican 1) benzoil-CoA acetiltransferasa, 2) fosfotrans-3-oxo-3-fenilpropionilasa, 3) benzoil-acetato quinasa, 4) benzoil-acetato descarboxilasa, 5) acetofenona reductasa, y 6) 1 -feniletanol deshidratasa.
44. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
45. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1,3-butadieno, dicha trayectoria de 1 ,3-butadieno seleccionadas de (A) 1) trans, frans-muconato descarboxilasa y 2) r ans-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (B) 1) c/'s, frans-muconato c/'s-descarboxilasa y 2) trans-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) 1) c/s, frans-muconato trans-descarboxilasa 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (D) 1) cis, cis-muconato descarboxilasa y 2) c/s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (E) c/s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; y (F) frans-2,4-pentadienoato descarboxilasa.
46. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno.
47. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque dichos dos ácidos nucleicos exógenos codifican una serie seleccionada de (A) 1) trans, rrans-muconato descarboxilasa y 2) frans-2, 4-pentadienoato descarboxilasa; (B) 1) cis, frans-muconato c/s-descarbox¡lasa y 2) trans- 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) 1) cis, frans-muconato trans- descarboxilasa 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; y (D) 1) cis, c/'s-muconato descarboxilasa y 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa. 5
48. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
49. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el 10 organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
50. Un método para producir 1 ,3-butadieno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno, dicha 15 trayectoria comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1 ,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir .1 ,3-butadieno, dicha trayectoria de 1 ,3-butadieno seleccionadas de (A) 1) trans, transió muconato descarboxilasa y 2) írans-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (B) 1) cis, /rans-muconato c/'s-descarboxilasa y 2) frans-2,4- pentadienoato descarboxilasa; (C) 1) cis, frans-muconato trans- descarboxilasa 2) c/s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (D) 1) cis, cis- muconato descarboxilasa y 2) c/'s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (E) 25 c/s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; y (F) rrans-2,4-pentadienoato descarboxilasa.
51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
52. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno.
53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque dichos dos ácidos nucleicos exógenos codifican una serie seleccionada de (A) 1) trans, írans-muconato descarboxilasa y 2) frans-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (B) 1) c/'s, írans-muconato c/'s-descarboxilasa y 2) frans-2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) 1) cis, frans-muconato írans-descarboxilasa 2) c/s-2,4-pentadienoato descarboxilasa; y (D) 1) c s, c/'s-muconato descarboxilasa y 2) c/s-2,4-pentadienoato descarboxilasa.
54. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
55. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato expresada en una cantidad suficiente para producir (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato, dicha trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato comprende eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa.
56. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato.
57. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque dichos dos ácidos nucleicos exógenos codifican eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa.
58. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
59. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano es cultivado anaeróbicamente.
60. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de benzoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benzoato expresada en una cantidad suficiente para producir benzoato, dicha trayectoria de benzoato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfosh¡kimato-2- carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato Masa.
61. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benzoato.
62. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benzoato.
63. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benzoato.
64. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cinco ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benzoato.
65. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende seis ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benzoato.
66. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende siete ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benzoato.
67. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benzoato.
68. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque dichos ocho ácidos nucleicos exógenos codifican 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato liasa.
69. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque comprende además una trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa.
70. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
71. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
72. Un método para producir benzoato, caracterizado porque comprende cultivar el organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 60, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir benzoato.
73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
74. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benzoato.
75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque dichos ocho ácidos nucleicos exógenos codifican 2- deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3- deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato liasa.
76. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende además una trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa.
77. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
78. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de benceno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benceno expresada en una cantidad suficiente para producir benceno, dicha trayectoria de benceno se selecciona de una serie de enzimas de las trayectorias seleccionadas de: a) benzoato descarboxilasa; b) benzoato reductasa y benzaldehído descarbonilasa; c) benzoato quinasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa; d) (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotransbenzoilasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa; y e) (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), benzoil-CoA reductasa y benzaldehído descarbonilasa, f) (benzoil-QoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), benzoato descarboxilasa, g) benzoil-CoA reductasa y benzaldehído descarbonilasa, h) fosfotransbenzoilasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa, i) fosfotransbenzoilasa, benzoato quinasa, benzoato descarboxilasa, j) fosfotransbenzoilasa, benzoato quinasa, benzoato reductasa, benzaldehído descarbonilasa; k) fosfotransbenzoilasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa; y I) benzoil-CoA reductasa y benzaldehído descarbonilasa.
79. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende benzoato descarboxilasa.
80. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende benzoato reductasa y benzaldehído descarbonilasa
81. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende benzoato quinasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa.
82. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotransbenzoilasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa.
83. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), benzoil-CoA reductasa y benzaldehído descarbonilasa.
84. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benceno.
85. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benceno.
86. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benceno.
87. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque comprende además una trayectoria de benzoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benzoato expresada en una cantidad suficiente para producir benzoato, dicha trayectoria de benzoato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato Masa.
88. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque comprende además una trayectoria de (2-hidroxi-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa.
89. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
90. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
91. Un método para producir benceno, caracterizado porque comprende cultivar el organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 78, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir benceno.
92. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende benzoato descarboxilasa.
93. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende benzoato reductasa y benzaldehído descarbonilasa
94. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende benzoato quinasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa.
95. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende (benzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotransbenzoilasa, (benzoiloxi)fosfonato reductasa, y benzaldehído descarbonilasa.
96. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dicha trayectoria de benceno comprende (benzoil- CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), benzoil-CoA reductasa y benzaldehído descarbonilasa.
97. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benceno.
98. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benceno.
99. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de benceno.
100. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque comprende además una trayectoria de benzoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de benzoato expresada en una cantidad suficiente para producir benzoato, dicha trayectoria de benzoato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenase; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato Masa.
101. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque comprende además una trayectoria de (2-hidrox¡-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende eritrosa-4-fosfato deshidratasa y (2,4-dioxobutoxi)fosfonato reductasa.
102. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
103. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente es cultivado en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
104. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de tolueno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de tolueno expresada en una cantidad suficiente para producir tolueno, dicha trayectoria de tolueno se selecciona de una serie de enzimas de las trayectorias seleccionadas de: a) p-toluato descarboxilasa; b) p-toluato reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; c) p-toluato quinasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; d) (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotrans-p-metilbenzoilasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; y e) (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), p-metilbenzoil-CoA reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa, f) (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), p-toluato descarboxilasa, g) p-metilbenzoil-CoA reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa, h) fosfotrans-p-metilbenzoilasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa, i) fosfotrans-p-metilbenzoilasa, p-toluato quinasa, p-toluato descarboxilasa, j) fosfotrans-p-metilbenzoilasa, p-toluato quinasa, p-toluato reductasa, p-metilbenzaldehído descarbonilasa; k) fosfotrans-p-metilbenzoilasa, (p- metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa (desfosforilación), y p-metilbenzaldehído descarbonilasa; y I) p-metilbenzoil-CoA reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa.
105. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende p-toluato descarboxilasa.
106. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende p-toluato reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa
107. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende c) p-toluato quinasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa.
108. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotrans-p-metilbenzoilasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa.
109. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), p-metilbenzoil-CoA reductasa y p- metilbenzaldehído descarbonilasa.
110. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
111. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
112. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
113. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque comprende además una trayectoria de p-toluato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de p-toluato expresada en una cantidad suficiente para producir p-toluato, dicha trayectoria de p-toluato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato Masa.
114. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque comprende además una trayectoria de (2-hidroxi-3-metil-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende DXP sintasa, DXP reductoisomerasa, y 2ME4P deshidratasa.
115. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
116. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
117. Un método para producir tolueno, caracterizado porque comprende cultivar el organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 104, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir tolueno.
118. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende p-toluato descarboxilasa.
119. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende p-toluato reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa
120. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende c) p-toluato quinasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldehído descarbonilasa.
121. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), fosfotrans-p-metilbenzoilasa, (p-metilbenzoiloxi)fosfonato reductasa, y p-metilbenzaldeh ido descarbonilasa.
122. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dicha trayectoria de tolueno comprende (p-metilbenzoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa), p-metilbenzoil-CoA reductasa y p-metilbenzaldehído descarbonilasa.
123. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
124. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
125. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de tolueno.
126. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque comprende además una trayectoria de p-toluato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de p-toluato expresada en una cantidad suficiente para producir p-toluato, dicha trayectoria de p-toluato comprende 2-deshidro-3-desoxifosfoheptanoato sintasa; 3-deshidroquinato sintasa; 3-deshidroquinato deshidratasa; shikimato deshidrogenasa; shikimato quinasa; 3-fosfoshikimato-2-carboxiviniltransferasa; corismato sintasa; y corismato liasa.
127. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque comprende además una trayectoria de (2-hidroxi-3-met¡l-4-oxobutoxi)fosfonato que comprende DXP sintasa, DXP reductoisomerasa, y 2ME4P deshidratasa.
128. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
129. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente es cultivado en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
130. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato, dicha trayectoria de 2,4-pentadienoato que tiene una serie de enzimas seleccionadas de A) i) una 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, ii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iii) una 2-oxopentenoato reductasa, y iv) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa; B) i) una desaminasa AKP, ii) una acetilacrilato reductasa, y iii) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; C) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenase, ii) una 2,4-dioxopentanoato-2-reductasa, iii) una 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratasa, iv) una acetilacrilato reductasa, y v) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; D) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-4-reductasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa; y E) i) una AKP reductasa, ii) una 2-amino-4-hidroxipentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
131. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
132. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
133. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado porque los tres ácidos nucleicos exógenos codifican i) una desaminasa AKP, ii) una acetilacrilato reductasa, y iii) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
134. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
135. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado porque los cuatro ácidos nucleicos exógenos codifican i) una 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, ii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iii) una 2-oxopentenoato reductasa, y iv) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
136. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
137. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 136, caracterizado porque dichos cinco ácidos nucleicos exógenos codifican i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-2- redgctasa, üi) una 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratasa, iv) una acetilacrilato reductasa, y v) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
138. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 136, caracterizado porque dichos cinco ácidos nucleicos exógenos codifican i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-4-reductasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
139. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 136, caracterizado porque dichos cinco ácidos nucleicos exógenos codifican i) una AKP reductasa, ii) una 2-amino-4-hidroxipentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
140. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
141. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
142. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque comprende además una 2,4-pentadienoato descarboxilasa expresada en una cantidad suficiente para producir 1 ,3-butadieno por conversión de 2,4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno.
143. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque comprende además al menos uno de una AKP tiolasa, una ornitina 4,5-aminomutasa, una 2,4-diaminopentanoato 4-aminotransferasa y a 2,4-diaminopentanoato 4-deshidrogenasa.
144. Un método para producir 2,4-pentadienoato, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato, dicha trayectoria comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato, dicha trayectoria de 2,4-pentadienoato seleccionadas de A) i) una 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, ii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iii) una 2-oxopentenoato reductasa, y iv) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa; B) i) una desaminasa AKP, i¡) una acetilacrilato reductasa, y iii) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; C) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-2-reductasa, iii) una 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratasa, iv) una acetilacrilato reductasa, y v) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; D) i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-4-reductasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-h¡drox¡pentenoato deshidratasa; y E) i) una AKP reductasa, ¡i) una 2-amino-4-hidroxipentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ¡¡i) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
145. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
146. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
147. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
148. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende tres ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
149. El método de conformidad con la reivindicación 148, caracterizado porque los tres ácidos nucleicos exógenos codifican i) una desaminasa AKP, ¡i) una acetilacrilato reductasa, y iii) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
150. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
151. El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado porque los cuatro ácidos nucleicos exógenos codifican i) una 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa, ii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, ¡ii) una 2-oxopentenoato reductasa, y iv) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
152. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
153. El método de conformidad con la reivindicación 152, caracterizado porque dichos cinco ácidos nucleicos exógenos codifican i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-2-reductasa, iii) una 2-hidroxi-4-oxopentanoato deshidratasa, iv) una acetilacrilato reductasa, y v) una 4-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
154. El método de conformidad con la reivindicación 152, caracterizado porque dichos cinco ácidos nucleicos exógenos codifican i) una AKP aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii) una 2,4-dioxopentanoato-4-reductasa, iii) una 4-hidroxi-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
155. El método de conformidad con la reivindicación 152, caracterizado porque dichos cinco ácidos nucleicos exógenos codifican i) una AKP reductasa, ii) una 2-amino-4-hidroxipentanoato aminotransferasa y/o deshidrogenasa, ii¡) una 4-hidrox¡-2-oxovalerato deshidratasa, iv) una 2-oxopentenoato reductasa, y v) una 2-hidroxipentenoato deshidratasa.
156. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque comprende además una 2,4-pentadienoato descarboxilasa expresada en una cantidad suficiente para convertir 2,4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno.
157. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque comprende además al menos uno de una AKP tiolasa, una ornitina 4,5-aminomutasa, una 2,4-diaminopentanoato 4-aminotransferasa y a 2,4-diaminopentanoato 4-deshidrogenasa.
158. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato, dicha trayectoria de 2,4-pentadienoato que tiene una serie de enzimas seleccionadas de: 1) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 2) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5- h¡droxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 3) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 4) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 5) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 6) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil- CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 7) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 8) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 9) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 10) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2- enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/ó hidrolasa; 11) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 12) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, D. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 13) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, R. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 14) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y 15) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, S. 3-hidrox¡pent-4-enoato deshidratasa; 16) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, R. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA deshidratasa, E. pent-2,4-dienoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa; 17) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; 18) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, S. 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa. 19) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-h¡droxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, Q. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; 20) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, Q. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; 21) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, Q. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; 22) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, Q. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; 23) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, Q. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; and 24) . acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, Q. 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
159. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, o ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
160. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
161. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
162. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque comprende además una 2,4-pentadieno descarboxilasa para convertir 2,4-pentadienoato a 1 ,3-butadieno.
163. Un método para producir 2,4-pentadienoato, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 158, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato.
164. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, o ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
165. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
166. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
167. Un método para producir 1 ,3-butadieno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 162, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1 ,3-butadieno.
168. El método de conformidad con la reivindicación 167, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, o ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
169. El método de conformidad con la reivindicación 167, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
170. El método de conformidad con la reivindicación 167, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
171. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1,3-butadieno, dicha trayectoria de 1 ,3-butadieno que tiene una serie de enzimas seleccionadas de: 1) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 2) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 3) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 4) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 5) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, N. 3-oxopent-4-enoil-CoA reductasa, T. 3-hidroxipent-4-enoil-CoA transferasa, sintetasa o hidrolasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; 6) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, O. 3-oxopent-4-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, P. 3-oxopent-4-enoato reductasa, Y. 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa;
172. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 171, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, o cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno.
173. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 171, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
174. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 171, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
175. Un método para producir 1 ,3-butadieno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 171, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1 ,3-butadieno.
176. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, o cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno.
177. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
178. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
179. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1-ol expresada en una cantidad suficiente para producir 3-buteno-1-ol, dicha trayectoria de 3-buteno-1 -ol que tiene una serie de enzimas seleccionadas de: 1) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5- hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 2) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 3) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 4) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 5) A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 6) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 7) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2- enoato descarboxilasa; 8) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 9) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 10) M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 11) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 12) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, F. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 13) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3- hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 14) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. · 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 15) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, A. 3-hidroxipropanoil-CoA acetiltransferasa, B. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 16) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 17) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, F. 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, I. 3-oxo-5-hidroxipentanoato reductasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 18) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3- ???-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, U. 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; 19) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, G. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, J. 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; 20) K. 3-hidroxipropanoil-CoA deshidratasa, M. acrilil-CoA acetiltransferasa, L. 3-oxo-5-hidroxipentanoil-CoA deshidratasa, B. 3-???-5-hidroxipentanoil-CoA reductasa, C. 3,5-dihidroxipentanoil-CoA deshidratasa, H. 5-hidroxipent-2-enoil-CoA sintetasa, transferasa y/o hidrolasa, V. 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa;
180. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete, ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1 -ol.
181. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
182. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
183. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque comprende además una 3-buteno-1-ol deshidratasa para convertir 3-buteno-1 -ol a 1 ,3-butadieno.
184. Un método para producir 3-buteno-1 -ol, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 179, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 3-buteno-1-ol.
185. El método de conformidad con la reivindicación 184, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1 -ol.
186. El método de conformidad con la reivindicación 184, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
187. El método de conformidad con la reivindicación 184, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
188. El método de conformidad con la reivindicación 184, caracterizado porque comprende además la deshidratación química de 3-buteno-1 -ol para proporcionar 1 ,3-butadieno.
189. Un método para producir 1 ,3-butadieno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 183, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1 ,3-butadieno.
190. El método de conformidad con la reivindicación 189, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, o ocho ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno.
191. El método de conformidad con la reivindicación 189, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
192. El método de conformidad con la reivindicación 189, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
193. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1,3-butadieno, dicha trayectoria de 1 ,3-butadieno seleccionadas de: (A) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenase; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (B) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2- fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (D) una succinil-CoA:acet¡l-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (E) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (F) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (G) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; y (H) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa.
194. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 193, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno.
195. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 194, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (B) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoad¡pato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (C) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (D) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (E) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; (F) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3- hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-h¡drox¡hex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa; (G) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato descarboxilasa; y (H) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadienoato descarboxilasa.
196. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 193, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exogeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exogeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exogeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exogeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxiíasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenase, y una H2 hidrogenasa; o (iii) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
197. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas.
198. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
199. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque, dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato Masa, citrato Nasa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
200. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 193, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
201. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 193, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
202. Un método para producir 1 ,3-butadieno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de cualquier uno de conformidad con las reivindicaciones 193-201, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1 ,3-butadieno.
203. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato, dicha trayectoria de 2,4-pentadienoato seleccionadas de: (A) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato des h id rata sa; (B) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato déshidratasa; (C) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato déshidratasa; and (D) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3- hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enod¡oato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa.
204. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 203, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, o seis ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
205. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 204, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato descarboxilasa; una 3-oxopent-4-enoato reductasa; y una 3-hidro ipent-4-enoato deshidratasa; (B) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato deshidrogenasa; una 2-fumarilacetato reductasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; (C) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA transferasa, una 3-oxoadipil-CoA sintetasa o una 3-oxoadipil-CoA hidrolasa; una 3-oxoadipato reductasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enodioato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa; and (D) una succinil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoadipil-CoA reductasa; una 3-hidroxiadipil-CoA transferasa, una 3-hidroxiadipil-CoA sintetasa o una 3-hidroxiadipil-CoA hidrolasa; una 3-hidroxiadipato deshidrogenasa; una 3-hidroxihex-4-enod¡oato descarboxilasa; y una 3-hidroxipent-4-enoato deshidratasa.
206. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 203, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (iii) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
207. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 206, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas.
208. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 206, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
209. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 206, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato Masa, citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetogl uta rato: ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
210. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 203, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
211. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 203, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
212. Un método para producir 2,4-pentadienoato, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de cualquier uno de conformidad con las reivindicaciones 203-211, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato.
213. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 ,3-butadieno que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria de enzima 1,3-butadieno expresada en una cantidad suficiente para producir 1,3-butadieno, dicha trayectoria de 1 ,3-butadieno seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5- dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidrox¡-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-h idroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-h idroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (F) una malonil-CoA:acet¡l-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (G) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidrox¡-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (H) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (I) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidrox¡-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (J) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent- 2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (K) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (L) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-h¡droxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (M) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (N) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; and (O) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa.
214. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 213, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete ácidos nucleicos exogenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 1 ,3-butadieno.
215. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 214, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende ácidos nucleicos exogenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato re.ductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (F) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (G) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (H) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-h¡droxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (I) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; (J) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (K) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (L) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa; (M) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidrox¡pent-2-enoato deshidratasa; y una 2,4-pentadieno descarboxilasa; (N) una malon¡l-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1-ol deshidratasa; and (O) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; y una 3-buteno-1 -ol deshidratasa.
216. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 213, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato liasa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (¡¡i) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
217. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 216, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas.
218. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 216, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
219. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 216, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato liasa, citrato liasa, una fumarato reductasa, y una alfa- cetoglutarato:ferredoxina oxido rreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvatoiferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenase, y una H2 hidrogenasa; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenase y una H2 hidrogenasa.
220. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 213, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
221. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 213, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
222. Un método para producir 1 ,3-butadieno, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de cualquier uno de conformidad con las reivindicaciones 213-221, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 1 ,3-butadieno.
223. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 2,4-pentadienoato que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 2,4-pentadienoato expresada en una cantidad suficiente para producir 2,4-pentadienoato, dicha trayectoria de 2,4-pentadienoato seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-h id roxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidrox¡-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril- CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; and (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril- CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratase; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
224. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 223, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco o seis ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 2,4-pentadienoato.
225. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 224, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; (D) una malonil-CoA:acet¡l-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa; and (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato deshidratasa.
226. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 223, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato liasa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (iii) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
227. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 226, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una ¡socitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas.
228. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 226, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
229. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 226, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato Masa, citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ü) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
230. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 223, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
231. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 223, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
232. Un método para producir 2,4-pentadienoato, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de cualquier uno de conformidad con las reivindicaciones 223-231, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 2,4-pentadienoato.
233. Un organismo microbiano que no se origina naturalmente, caracterizado porque comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 3-buteno-1 -ol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1-ol expresada en una cantidad suficiente para producir 3- buteno-1-ol, dicha trayectoria de 3-buteno-1 -ol seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidrox¡-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (B) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (F) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5- dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidrox¡-5-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (G) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (H) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (I) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y (J) una malonil-CoA.acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa.
234. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 233, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende dos, tres, cuatro o cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de la trayectoria de 3-buteno-1-ol.
235. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 234, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende ácidos nucleicos exógenos que codifican cada una de las enzimas seleccionadas de: (A) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (B) una malon¡l-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de aldehido); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (C) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (D) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de CoA y formación de alcohol); una 5-hidroxi-3-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (E) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (F) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3,5-dioxopentanoato reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (G) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; (H) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de aldehido); una 3-hidroxi-5-oxopentanoato reductasa; y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa; (I) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); una 3,5-dihidroxipentanoato deshidratasa; y una 5-hidroxipent-2-enoato descarboxilasa; y (J) una malonil-CoA:acetil-CoA aciltransferasa; una 3-oxoglutaril-CoA reductasa (reducción de cetona); una 3-hidroxiglutaril-CoA reductasa (formación de alcohol); y una 3,5-dihidroxipentanoato descarboxilasa.
236. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 233, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano comprende además: (i) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una ATP-citrato Masa, una citrato Masa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; (ii) una trayectoria reductora de TCA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una trayectoria reductora de la enzima TCA, en donde al menos un ácido nucleico exógeno se selecciona de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o (iii) al menos un ácido nucleico exógeno codifica una enzima seleccionada de una CO deshidrogenasa, una H2 hidrogenasa, y combinaciones de las mismas.
237. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 236, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una aconitasa, una isocitrato deshidrogenasa, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenasa, una acetato quinasa, una fosfotransacetilasa, una acetil-CoA sintetasa, una NAD(P)H:ferredoxina oxidorreductasa, ferredoxina, y combinaciones de las mismas.
238. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 236, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende además un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima seleccionada de una aconitasa, una isocitrato deshidrogenase, una succinil-CoA sintetasa, una succinil-CoA transferasa, una fumarasa, una malato deshidrogenase, y combinaciones de las mismas.
239. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 236, caracterizado porque dicho microorganismo microbiano que comprende (i) comprende cuatro ácidos nucleicos exógenos que codifican una ATP-citrato Masa, citrato liasa, una fumarato reductasa, y una alfa-cetoglutarato:ferredoxina oxidorreductasa; en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (ii) comprende cinco ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, una CO deshidrogenasa, y una H2 hidrogenasa; o en donde dicho microorganismo microbiano que comprende (iii) comprende dos ácidos nucleicos exógenos que codifican una CO deshidrogenasa y una H2 hidrogenasa.
240. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 233, caracterizado porque al menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.
241. El organismo microbiano que no se origina naturalmente de conformidad con la reivindicación 233, caracterizado porque el organismo microbiano que no se origina naturalmente está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.
242. Un método para producir 3-buteno-1-ol, caracterizado porque comprende cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de cualquier uno de conformidad con las reivindicaciones 233-241, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 3-buteno-1-ol.
243. Un método para producir 1 ,3-butadieno caracterizado porque comprende, cultivar un organismo microbiano que no se origina naturalmente de cualquier uno de conformidad con las reivindicaciones 233-241, bajo condiciones y por un periodo de tiempo suficiente para producir 3-buteno-1 -ol, y convertir químicamente tal 3-buteno-1 -ol a 1,3-butadieno.
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