CN105164248A - 烷烃的重组合成 - Google Patents

Abstract

本申请公开了用于改变作为宿主的光能自养生物的方法和组合物，使得该生物有效产生烷烃，特别是使用这样的生物来商业化生产烷烃及相关分子的用途。也描述了其他材料、方法和组合物。

Description

烷烃的重组合成

相关申请的交叉引用

本申请涉及2013年1月25日提交的美国临时专利申请61/756,973号和2013年5月23日提交的美国临时专利申请61/826,637号；其均出于全部目的而通过引用在此全文并入。

序列表

本发明包含经由EFS-Web提交的序列表，且其通过引用在此全文并入。所述ASCII拷贝创建于20XX年XX月，命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，大小为X,XXX,XXX字节。

背景技术

许多现有的光能自养生物(即，植物、藻类和光合细菌)不适合工业化生物处理，且因此没有显现出商业上的可行性。已经对重组光合微生物进行工程化来以超过该生物体天然产生的水平的量生产烃类和醇类。

发明内容

本文描述了工程化微生物，其中所述工程化微生物包含编码一种或多种酶的一种或多种重组基因，所述一种或多种酶具有催化烷烃产生的酶活性，其中所述酶活性包括：烷烃脱甲酰单加氧酶活性、硫酯酶活性、羧酸还原酶活性和磷酸泛酰巯基乙胺基(phosphopanthetheinyl)转移酶活性；烷烃脱甲酰单加氧酶活性、硫酯酶活性、长链脂肪酸CoA-连接酶活性和长链酰基-CoA还原酶活性；和/或烷烃脱甲酰单加氧酶活性、丙酮酸脱羧酶活性和2-酮酸脱羧酶活性。

在一些方面，酶包括烷烃脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。在一些方面，烷烃脱甲酰单加氧酶具有EC编号4.1.99.5，硫酯酶具有EC编号3.1.2.14，羧酸还原酶具有EC编号1.2.99.6，和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶具有EC编号2.7.8.7。在一些方面，烷烃脱甲酰单加氧酶由adm编码，硫酯酶由fatB或fatB2编码，羧酸还原酶由carB编码，和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶由entD编码。

在一些方面，具有烷烃脱甲酰单加氧酶活性的酶具有EC编号4.1.99.5。在一些方面，具有硫酯酶活性的酶具有EC编号3.1.2.14。在一些方面，具有羧酸还原酶活性的酶具有EC编号1.2.99.6。在一些方面，具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的酶具有EC编号2.7.8.7。

在一些方面，酶包括烷烃脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、长链脂肪酸CoA-连接酶和长链酰基-CoA还原酶。在一些方面，烷烃脱甲酰单加氧酶具有EC编号4.1.99.5、硫酯酶具有EC编号3.1.2.14、长链脂肪酸CoA-连接酶具有EC编号6.2.1.3和长链酰基-CoA还原酶具有EC编号1.2.1.50。在一些方面，烷烃脱甲酰单加氧酶由adm编码，硫酯酶由fatB或fatB2编码，长链脂肪酸CoA-连接酶由fadD编码，和长链酰基-CoA还原酶由acrM编码。

在一些方面，具有烷烃脱甲酰单加氧酶活性的酶具有EC编号4.1.99.5。在一些方面，具有硫酯酶活性的酶具有EC编号3.1.2.14。在一些方面，具有长链脂肪酸CoA-连接酶活性的酶具有EC编号6.2.1.3。在一些方面，具有长链酰基-CoA还原酶活性的酶具有EC编号1.2.1.50。

在一些方面，一种或多种重组基因包含编码催化酰基-ACP转化为脂肪酸的硫酯酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编码使由羧酸还原酶基因编码的蛋白质的ACP部分磷酸泛酰巯基乙胺基化(phosphopatetheinylate)的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编码催化脂肪酸转化为脂肪醛的羧酸还原酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编码催化脂肪醛转化为烷烃或烯烃的烷烃脱甲酰单加氧酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编码催化脂肪酸转化为酰基-CoA的脂肪酸CoA-连接酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编码催化酰基-CoA转化为脂肪醛的酰基-CoA还原酶的重组基因。

在一些方面，酶包括烷烃脱甲酰单加氧酶、丙酮酸脱羧酶和2-酮酸脱羧酶。

在一些方面，所述微生物是细菌。在一些方面，所述微生物是革兰氏阴性细菌。在一些方面，所述微生物是大肠杆菌。

在一些方面，所述微生物是光合微生物。在一些方面，所述微生物是蓝细菌。在一些方面，所述微生物是耐热性蓝细菌。在一些方面，所述微生物是聚球藻属(Synechococcus)的种。

在一些方面，包含一种或多种重组核酸序列的操纵子的表达受重组启动子控制，其中启动子是组成型或诱导型的。在一些方面，所述操纵子被整合到所述微生物的基因组中。在一些方面，所述操纵子在染色体外。

在一些方面，所述烷烃的长度小于或等于11个碳原子。在一些方面，所述烷烃的长度为7至11个碳原子。在一些方面，所述烷烃的长度为7、8、9、10或11个碳原子。在一些方面，所述烷烃的长度小于或等于18个碳原子。在一些方面，所述烷烃的长度为7至18个碳原子。在一些方面，所述烷烃的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子。

在一些方面，所述重组基因与表中所示序列至少90％或至少95％相同。

本文还描述了包含培养基和本文所述微生物的细胞培养物。

本文还描述了生产烃的方法，其包括：在培养基中培养本文所述工程化微生物，其中相对于在相同条件下培养的其他方面相同但缺乏所述重组基因的微生物，所述工程化微生物产生增加量的烷烃。在一些方面，该方法还包括允许烷烃在培养基或生物体中积累。在一些方面，该方法还包括分离烷烃的至少一部分。在一些方面，该方法还包括处理分离的烷烃以产生经处理的材料。

本文还描述了用于生产烃的方法，其包括：(i)在培养基中培养本文所述工程化微生物；和(ii)使所述工程化微生物暴露于光和无机碳，其中所述暴露导致所述无机碳被所述微生物转化为烷烃，其中所述烷烃以比由在相同条件下培养的其他方面相同但缺乏所述重组基因的微生物产生的量更大的量产生。在一些方面，该方法还包括允许烷烃在培养基或生物体中积累。在一些方面，该方法还包括分离烷烃的至少一部分。在一些方面，该方法还包括处理分离的烷烃以产生经处理的材料。

本文还描述了包含烷烃的组合物，其中所述烷烃由本文所述方法产生。在一些方面，组合物包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的烷烃。

本发明在某些实施方式中提供了由工程化生物生产短链烷烃或烯烃的方法，该方法包括：在工程化微生物中表达重组烷醛(alkanal)脱甲酰单加氧酶(“ADM”)；和在有效地生产短链烷烃或烯烃的条件下在含有碳源的培养基中培养工程化微生物。

在实施方式中，ADM催化醛转化为烷烃或烯烃，其中醛选自乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、丁醛、3-甲基-1-丁醛和2-苯基乙醛。在实施方式中，烷烃或烯烃选自甲烷、丙烷、乙烷、丁烷、丙烷、异丁烷和甲苯。在实施方式中，由工程化生物产生短链烷烃或烯烃的方法包括在工程化微生物中表达重组丙酮酸脱羧酶(“Pdc”)。在某些实施方式中，Pdc与SEQIDNO:46至少90％相同。在实施方式中，由工程化生物产生短链烷烃或烯烃的方法包括在工程化微生物中表达2-酮酸脱羧酶。在某些实施方式中，Pdc或2-酮酸脱羧酶在受单一启动子控制的操纵子中表达。

在实施方式中，操纵子包含ADM。在某些实施方式中，ADM与SEQIDNO:36至少90％相同。

本文还提供了包含工程化微生物的实施方式，其中工程化微生物包含编码烷醛脱甲酰单加氧酶(“ADM”)的重组基因，并且其中工程化微生物还包含编码选自丙酮酸脱羧酶和2-酮酸脱羧酶的酶的重组基因。

在一个实施方式中，ADM催化醛转化为烷烃或烯烃，其中醛选自乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、2-甲基-1-丁醛、丁醛、3-甲基-1-丁醛和2-苯基乙醛。在某些实施方式中，烷烃或烯烃选自甲烷、丙烷、乙烷、丁烷、丙烷、异丁烷和甲苯。

在一个实施方式中，工程化微生物包含重组丙酮酸脱羧酶(“Pdc”)。在某些实施方式中，Pdc与SEQIDNO:46至少90％相同。在一个实施方式中，工程化微生物包含2-酮酸脱羧酶。在某些实施方式中，Pdc或2-酮酸脱羧酶在受单一启动子控制的操纵子中表达。

在一个实施方式中，操纵子包含ADM。在一些实施方式中，工程化微生物是工程化蓝细菌。在某些实施方式中，ADM与SEQIDNO:36至少90％相同。

本文还提供了包含细胞培养物的实施方式，所述细胞培养物包含重组微生物和含有碳源的培养基，其中当重组微生物在有效地表达多肽的条件下在培养基中培养时，催化醛转化为烷烃的多肽在重组微生物中过表达，并且烷烃或烯烃在细胞培养物中产生。在实施方式中，多肽具有烷醛脱甲酰单加氧酶活性。在实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:36具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，醛选自乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、丁醛、3-甲基-1-丁醛和2-苯基乙醛。

在实施方式中，烷烃或烯烃选自甲烷、丙烷、乙烷、丁烷、丙烷、异丁烷和甲苯。在实施方式中，烷烃是短链烷烃。在某些实施方式中，烷烃包含C₂到C₄烷烃。在一些实施方式中，烷烃包含C₂到C₇烷烃。在实施方式中，烷烃或烯烃被分泌到培养基中。

在实施方式中，重组微生物还包含包括丙酮酸脱羧酶(“Pdc”)活性的重组多肽。在某些实施方式中，Pdc与SEQIDNO:46至少90％相同。在实施方式中，工程化微生物还包含重组2-酮酸脱羧酶。在一些实施方式中，Pdc或2-酮酸脱羧酶在受单一启动子控制的操纵子中表达。在实施方式中，操纵子包含ADM。

在实施方式中，重组微生物选自酵母、真菌、丝状真菌、藻类和细菌。在一些实施方式中，微生物是蓝细菌。

本文还提供了包含用于生产异丁烷或异丁烷衍生物的方法的实施方式，该方法包括在体外将ADM与醛接触。在实施方式中，ADM与SEQIDNO:36至少90％相同。在某些实施方式中，ADM是点形念珠藻(Nostocpunctiforme)ADM。在实施方式中，醛是3-甲基丁醛。

本发明的这些实施方式和其他实施方式于此在附图、说明书、实施例和权利要求中作进一步描述。

附图说明

图1.示出AcrM蛋白质在大肠杆菌中过表达的SDS-PAGE凝胶。

图2.(A)癸酰基-CoA和(B)月桂酰基-CoA分析的TIC色谱图。实线：野生型BL21(DE3)；虚线：acrM-表达BL21(DE3)。

图3.示出检测到由表达Adm、CarB、TesA和EntD蛋白质的聚球藻(Synechococcussp.)PCC7002株产生的C13和C15烷烃的GC/FID色谱图。灰色迹线：对照菌株(不表达CarB蛋白质)；黑色实线迹线：C13、C14和C15正烷烃的标准品；黑色虚线迹线：表达Adm、CarB、TesA和EntD蛋白质的聚球藻PCC7002株。

图4.来自酸喂食(acid-fed)(虚线)或对照(实线)的表达Adm和CarB的聚球藻PCC7002的样品的TIC色谱图。A和D：辛酸喂食；B和E：癸酸喂食；C和F：十二烷酸喂食。

图5.示出检测到由表达Adm、CarB、FatB2和EntD蛋白质的聚球藻PCC7002株在12h和72h时产生的壬烷的GC/FID色谱图。实线迹线：对照菌株(野生型)；点状迹线：表达Adm、CarB、FatB2和EntD蛋白质的聚球藻PCC7002株。

图6.烷烃产生途径的实例。注意，可以通过产生使CarB蛋白质的ACP部分磷酸泛酰巯基乙胺基化的entD(磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)的产物来促进carB的使用。例如，可以使用芽孢杆菌(Bacillus)entD，其酶产物具有包括CarB在内的广泛底物谱。

图7.当用癸酸和十二烷酸喂食时，检测到由表达Adm、硫酯酶、CarB、和EntD蛋白质的聚球藻PCC7002株产生的壬烷(A)和十一烷(B)。圆圈：在细胞团块中检测的烷烃；三角形：在十六烷上覆层(overlay)中检测的烷烃。

图8.示出了通过表达Adm、硫酯酶、CarB、和EntD蛋白质的聚球藻PCC7002株从CO₂生物合成壬烷(A)和十一烷(B)(其分泌到十六烷上覆层中)的GC/FID色谱图。实线迹线：第0天的样品；点状迹线：第5天的样品。

图9.通过表达Adm、硫酯酶、CarB、和EntD蛋白质的聚球藻PCC7002株从CO₂生物合成十一烷(三角形)和壬烷(圆圈)(其分泌到十六烷上覆层中)的时程。

图10.示出检测到由表达Adm、CarB、TesA_m和EntD蛋白质的7002株产生的C13和C15烷烃的GC/FID色谱图。实线：对照株；虚线：ALK-C13C15(实验株)。

图11.ALK-C13C15在10天时间的生长曲线。

图12.ALK-C13C15在10天时间的十三烷和十五烷的产量曲线。

图13.描述了His₆-标记ADM酶的Ni-NTA纯化的级分。标示出合并以用于分析的收集的级分。

图14.通过JCC6036从CO₂生物合成十一烷(三角形)的时程。

图15.当用癸酸喂食时，检测到由表达Adm、CarB和EntD蛋白质的7002株产生的壬烷。通过表达pAQ3上的Nhis标记Adm，初始活性与pAQ4上的相比明显提高。

具体实施方式

除非本文中另有限定，关于本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文需要，单数术语应该包含复数而复数术语应当包含单数。通常，与本文中描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学作用及与杂交相关使用的术语及其技术是本领域众所周知和常用的。

除非另有注明，本发明的方法和技术通常依据本领域公知的常规方法和按本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中描述的进行。参见，例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates(1992，和2002增刊)；Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1990)；Taylor和Drickamer，IntroductiontoGlycobiology，OxfordUniv.Press(2003)；WorthingtonEnzymeManual，WorthingtonBiochemicalCorp.，Freehold，N.J.；HandbookofBiochemistry:SectionAProteins，VolI，CRCPress(1976)；HandbookofBiochemistry:SectionAProteins，VolII，CRCPress(1976)；EssentialsofGlycobiology，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。

本文中涉及的所有公开出版物、专利和其他参考文献通过引用在此全文并入。

以下术语，除非另有说明，应当被理解为具有以下含义：

术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指至少10个碱基长度的核苷酸聚合形式。该术语包括DNA分子(如cDNA或者基因组DNA或合成DNA)和RNA分子(如mRNA或合成RNA)，以及包含非天然核苷酸类似物、非原始核苷间键(intemucleosidebond)或两者的DNA或RNA类似物。核酸可以是任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链的、双链的、三链的、四重体的、部分双链的、分枝的、发夹的、环形的或是扣锁构象的。

除非另有说明，并作为在本文中以“SEQIDNO:”的一般形式描述的所有序列的例子，“包含SEQIDNO:1的核酸”是指其至少一部分具有(i)SEQIDNO:1的序列，或(ii)与SEQIDNO:1互补的序列的核酸。这两者间的选择由上下文决定。例如，如果该核酸被用作探针，这两者间的选择由探针与所希望的靶互补的需要决定。

“分离”的RNA、DNA或混合聚合物是在其天然宿主细胞中与天然多核苷酸自然伴随的其他细胞成分(如与其自然相关的核糖体、聚合酶以及基因组序列)基本上分离的RNA、DNA或混合聚合物。

如本文所用，“分离的”有机分子(如烷烃)是与其所来源的宿主细胞的细胞成分(膜脂质、染色体、蛋白质)，或与宿主细胞在其中培养的培养基基本上分离的有机分子。尽管特定的分离的生物分子可以被纯化至接近均质，但该术语不要求生物分子与所有其他化学物质分离。

术语“重组的”是指(1)已从其所天然存在的环境中移除的，(2)不与在其中天然发现该基因的多核苷酸的全部或部分相关联的，(3)与并非与之天然相连的多核苷酸可操作地相连的，或(4)自然界中不存在的生物分子，如基因或蛋白质。术语“重组的”可用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或通过异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由这样的核酸编码的蛋白质和/或mRNA。

如本文所用，如果异源序列被置于与内源核酸序列相邻使得该内源核酸序列的表达被改变，则生物体的基因组中的该内源核酸序列(或该序列的编码蛋白质产物)在本文中被认为是“重组的”。在这种情况下，异源序列是与内源核酸序列非天然相邻的序列，无论该异源序列是其自身内源的(源自相同的宿主细胞或其后代)还是外源的(源自不同的宿主细胞或其后代)。举例来说，启动子序列可以替换(例如通过同源重组)宿主细胞基因组中的基因的天然启动子以使得该基因表达模式改变。因为该基因至少与一些天然位于其侧翼的序列分离，该基因现变为是“重组的”。

如果核酸含有任何对于基因组中的相应核酸并非天然存在的改变，则该核酸也被认为是“重组的”。例如，如果内源编码序列含有人为导入(如通过人为干预)的插入、缺失或点突变，则该内源编码序列被认为是“重组的”。“重组的核酸”也包括在异源位点整合到宿主细胞染色体中的核酸以及作为附加体存在的核酸构建体。

如本文所用，短语参考核酸序列的“简并变体”包括可以依据标准遗传密码翻译以提供与从参考核酸序列翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。术语“简并寡核苷酸”或“简并引物”用于表示能够与序列上不是必须相同而是在一个或多个特定区段内彼此同源的靶核酸序列杂交的寡核苷酸。

涉及核酸序列的术语“百分序列同一性”或“相同”是指当以最大对应性比对时相同的两个序列中的残基。序列同一性比较的长度可以覆盖至少约9个核苷酸的延伸，通常至少约20个核苷酸，更经常至少约24个核苷酸，通常至少约28个核苷酸，更通常至少约32个核苷酸，且优选至少36个或更多的核苷酸。本领域中有多种已知的不同算法可用于测定核苷酸序列同一性。例如，可以使用作为WisconsinPackage版本10.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，Wis中的程序的FASTA、Gap或Beatfit来比较多核苷酸序列。FASTA提供查询和检索序列间最佳重叠区域的比对和百分序列同一性。Pearson，MethodsEnzymol.183:63-98(1990)(通过引用全文并入本文)。例如，核酸序列间的百分序列同一性可以利用FASTA以其默认参数(6的字长和用于得分矩阵的NOPAM因子)，或使用GCG版本6.1(通过应用并入全文)中提供的Gap以其默认参数来确定。可选择地，可以使用计算机程序BLAST来比较序列(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish和States，NatureGenet.3:266-272(1993)；Madden等，Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997)；Zhang和Madden，GenomeRes.7:649-656(1997))，特别是blastp或tblastn(Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997))。

术语“基本同源性”或“基本相似性”当指核酸或其片段时表示在以适合的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，以上面讨论的任何公知的序列同一性算法如FASTA、BLAST或Gap测定的，在至少约76％、80％、85％，优选至少约90％，更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。

或者，当核酸或其片段与另一核酸、与另一核酸的链或与其互补链在严格杂交条件下杂交时，存在基本同源性或相似性。核酸杂交试验情况中的“严格杂交条件”和“严格洗涤条件”取决于多种不同的物理参数。如本领域技术人员容易理解的，核酸杂交会受到如盐浓度、温度、溶剂、杂交物质的碱基组成、互补区域长度和杂交核酸之间核苷酸碱基失配的数目的这些条件的影响。具备本领域常识的人知道怎样改变这些参数以实现特定的杂交严格性。

通常，“严格杂交”在低于特定条件集下的特定DNA杂合体的热熔点(T_m)约25℃下进行。“严格洗涤”在低于特定条件集下的特定DNA杂合体的T_m约5℃的温度下进行。T_m是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。见Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)，9.51页，在此并入作为参考。出于本发明的目的，“严格条件”对于溶液相杂交定义为在6xSSC(其中20xSSC含有3.0MNaCl和0.3M柠檬酸钠)，1％SDS中，65℃下的水相杂交(即，没有甲酰胺)8-12小时，随后在0.2xSSC，0.1％SDS中，65℃下进行20分钟的两次洗涤。技术人员可以理解在65℃下的杂交根据包括杂交的序列长度和百分同一性的多种因素以不同速率发生。

本发明的核酸(也被称为多核苷酸)可以包括RNA、cDNA、基因组DNA及上述核酸的合成形式和混合聚合体的有义链和反义链。如本领域技术人员容易理解的，它们可以被化学和生物化学地修饰，或可以包含非天然的或衍生的核苷酸碱基。这样的修饰包括，例如，标记、甲基化、一个或多个天然存在的核苷酸被类似物替换、核苷酸间修饰(intemucleotidemodification)如不带电连接(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电的连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧部分(如多肽)、嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的连接(如，α异头核酸等)。也包括模拟多核苷酸通过氢键键合和其他化学相互作用结合指定序列的能力的合成分子。这样的分子是本领域已知的且包括，例如，在分子骨架中肽键替代磷酸酯键的分子。其他修饰可包括，例如其中核糖环包含桥接部分或其他结构的类似物，如在“锁”核酸中发现的修饰。

当用于核酸序列时，术语“突变的”意思是与参考核酸序列相比，核酸序列中的核苷酸可以被插入、缺失或改变。可以在基因座处进行单一改变(点突变)或在单个基因座处插入、缺失或改变多个核苷酸。此外，可以在核酸序列内多个基因座处进行一个或多个改变。核酸序列可以用任何本领域已知的方法突变，包括但不限于诱变技术如“易错PCR”(在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR以使得沿PCR产物的全长获得高点突变率的过程，见Leung等，Technique，1:11-15(1989)以及Caldwell和Joyce，PCRMethodsApplic.2:28-33(1992))；和“寡核苷酸定点诱变”(能够在任何感兴趣的克隆DNA片段中产生位点特异性突变的过程；见，如Reidhaar-Olson和Sauer，Science241:53-57(1988))。

本发明使用的术语“减弱”通常指功能缺失，包括对基因序列或控制基因序列转录的序列进行的突变、部分或全部缺失、插入、或其他变化，其降低或抑制基因产物的产生，或导致基因产物为非功能性的。在某些情况下功能缺失被描述为敲除突变。减弱也包括通过改变核酸序列的氨基酸序列变化、将基因置于较不活跃的启动子控制之下、下调、表达靶向感兴趣的基因的干扰RNA、核酶或反义序列或者通过任何其他本领域已知的技术。在一个实例中，特定酶对于反馈抑制或非产物或反应物的组合物引起的抑制(非途径特异性反馈)的敏感性较低，以使得酶活性不受化合物存在的影响。在其他情况下，已被改变为较低活性的酶可以被称为减弱的。

缺失：从核酸分子中去除一个或多个核苷酸或从蛋白质中去除一个或多个氨基酸，任一侧的区域连接在一起。

敲除：其表达水平或活性被降低至零的基因。在某些实例中，基因通过其编码序列的部分或全部的删除被敲除。在其他实例中，基因通过向其开放阅读框中引入一个或多个核苷酸(其导致无义的或另外非功能性的蛋白质产物的翻译)被敲除。

本发明中使用的术语“载体”意图指能够转运其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其通常是指环形双链DNA环，另外的DNA片段可以接合到其中，但也包括线性双链分子如由聚合酶链式反应(PCR)扩增得到的或从用限制性内切酶处理环形质粒得到的线性双链分子。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另外一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以被接合到病毒基因组中(下面更详细地讨论)。特定载体能够在其被引入的宿主细胞内自主复制(如，具有在宿主细胞内起作用的复制起点的载体)。其他载体在被引入宿主细胞中时可以被整合进宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组一起复制。此外，特定的优选载体能够指导其可操作地连接的基因的表达。这样的载体本发明中被称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。

“可运行地连接的”或“可操作地连接的”表达控制序列是指其中表达控制序列与感兴趣的基因邻接以控制感兴趣的基因的连接，以及以反式方式或在一定距离起作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列。

本发明中使用的术语“表达控制序列”是指影响与之可操作连接的编码序列的表达所必须的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括适合的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA加工信号如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(如，核糖体结合位点)；提高蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增加蛋白质分泌的序列。这样的控制序列的性质依宿主生物体的不同而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意图至少包括其存在对于表达至关重要的所有组分，且也可以包括其存在有利的其他组分，例如前导序列和融合伴体序列。

本发明中使用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指重组载体被引入其中的细胞。应当理解这样的术语不仅意指特定对象细胞，也指这样细胞的后代。由于突变或环境影响可能导致后续世代中发生特定的改变，这样的后代可能实际上不与母细胞相同，但仍然包含在本发明使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或可以是定殖于活组织或生物体中的细胞。

本发明中使用的术语“肽”是指短的多肽，如通常低于50个氨基酸长度和更通常低于30个氨基酸长度的多肽。本发明中使用的该术语包括类似物和模拟结构和由此模拟生物功能的模拟物。

术语“多肽”包括自然发生的和非自然发生的蛋白质及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的或聚合的。此外，多肽可以包括多个不同的结构域，各结构域有一种或多种不同的活性。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是就其起源或衍生来源来说(1)不与在其原始状态中伴随的天然相关的组分关联的，(2)以自然中不存在的纯度存在的，其中纯度可以相对于其他细胞物质的存在来判定(如，不含来自相同种的其他蛋白质)，(3)由来自不同物种的细胞表达的，或(4)不是自然界发生的(如其是自然界发现的多肽的片段，或其包含自然中不存在的氨基酸类似物或衍生物或不同于标准肽键的连接)。因此，化学合成的或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将与其自然相关的组分“分离”。多肽或蛋白质也可以通过使用本领域公知的蛋白质纯化技术分离而使得基本没有天然相关的组分。如此定义的，“分离的”不必须是需要这样描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已从其原始环境中物理移除。

本发明中使用的术语“多肽片段”是指与全长的多肽相比具有缺失的多肽，如氨基端和/或羧基端缺失。在优选的实施方式中，多肽片段是其中片段的氨基酸序列与自然发生序列中的对应位置相同的连续序列。片段通常为至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长，优选至少12、14、16或18个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，更优选至少25、30、35、40或45个氨基酸长，甚至更优选至少50或60个氨基酸长，甚至更优选至少70个氨基酸长。

“修饰的衍生物”是指初级结构序列基本同源，但包括例如体内或体外化学或生物化学修饰或整合了天然多肽中不存在的氨基酸的多肽或其片段。如本领域技术人员容易理解的，这样的修饰包括，例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记(如用放射性核素)以及各种酶学修饰。多种标记多肽的方法和多种用于这种目的的取代物或标记是本领域公知的，并包括放射性同位素如¹²⁵I、³²P、³⁵S和³H、连接到标记的抗配体物(antiligand)(如抗体)的配体、荧光团、化学发光剂、酶及可以作为标记配体的特异性结合对成员的抗配体物。标记的选择取决于需要的灵敏度、与引物偶联的难易、稳定性要求和可用的手段。标记多肽的方法是本领域公知的。参见如Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates(1992，和2002增刊)(通过引用并入本文)。

术语“融合蛋白”是指包含与异源氨基酸序列偶联的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因为它们可以被构建为包含来自两个或更多个不同蛋白质的两个或更多个需要的功能元件。融合蛋白包含来自感兴趣的多肽的至少10个连续氨基酸，更优选至少20或30个氨基酸，甚至更优选至少40、50或60个氨基酸，还更优选至少75、100或125个氨基酸。包括本发明蛋白质整体的融合体有特别的用途。包括在本发明融合蛋白中的异源多肽至少6个氨基酸长，经常至少8个氨基酸长，并有利地至少15、20和25个氨基酸长。包括更大的多肽(如IgGFc区域)和甚至整个蛋白质(如含有绿色荧光蛋白(“GFP”)发色团的蛋白质)的融合体有特别的用途。融合蛋白可以通过构建与编码不同蛋白质或肽的核酸序列同框的编码多肽或其片段的核酸并随后表达该融合蛋白来重组产生。可选地，融合蛋白可以通过将多肽或其片段与另一蛋白质交联来化学产生。

术语“非肽类似物”是指具有与参考肽的特性相似的特性的化合物。非肽化合物也可以被称为“肽模拟物”或“拟肽”。参见，例如，Jones，AminoAcidandPeptideSynthesis，OxfordUniversityPress(1992)；Jung，CombinatorialPeptideandNonpeptideLibraries:AHandbook，JohnWiley(1997)；Bodanszky等，PeptideChemistry--APracticalTextbook，SpringerVerlag(1993)；SyntheticPeptides:AUsersGuide，(Grant，作者，W.H.FreemanandCo.，1992)；Evans等，J.Med.Chem.30:1229(1987)；Fauchere，J.Adv.DrugRes.15:29(1986)；Veber和Freidinger，TrendsNeurosci.，8:392-396(1985)，及上述各文献中引用的参考文献，这些都通过引用并入本文。这样的化合物通常在计算机分子建模的辅助下开发。与本发明中有用的肽结构相似的肽模拟物可以用于产生等同的效果，且因此被设想为本发明的部分。

“多肽突变体”或“突变蛋白”是指与天然或野生型蛋白质的氨基酸序列相比，其序列包含一个或多个氨基酸的插入、重复、缺失、重排或置换的多肽。突变蛋白可以在自然发生的蛋白质的序列中具有一个或多个氨基酸点置换(其中一个位置上的单个氨基酸被改变成另一种氨基酸)、一个或多个插入和/或缺失(其中一个或多个氨基酸分别被插入或缺失)和/或在氨基或羧基端的任一端或在两端截短。与自然发生的蛋白质相比，突变蛋白可以具有相同的，但优选具有不同的生物活性。

突变蛋白具有与其野生型对应物至少85％的总体序列同源性。甚至更优选是与野生型蛋白质具有至少90％的总体序列同源性的突变蛋白。

在甚至更优选的实施方式中，突变蛋白显示至少95％的序列同一性，甚至更优选98％，甚至更优选99％以及甚至更优选99.9％的总体序列同一性。

序列同源性可以通过任何常见序列分析算法，如Gap或Bestfit来测定。

氨基酸置换可以包括：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力或酶活性，和(5)赋予或改变这类类似物的其他物理化学或功能特性的置换。

如本文中所用，二十种常见氨基酸和其缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(Golub和Gren编辑，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.，第二版，1991)，其并入本文作为参考。二十种常见氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-,α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸和其他非常规氨基酸也可以是本发明多肽的适合组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、N-甲基精氨酸以及其他相似氨基酸和亚氨基酸(如4-羟脯氨酸)。在本发明中使用的多肽符号中，按照标准的用法和规则，左手端对应氨基末端和右手端对应羧基末端。

如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二蛋白质的核酸序列相似的序列，则该蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或者是与其“同源的”。可选地，如果两种蛋白质有“相似”的氨基酸序列，蛋白质与第二蛋白质具有同源性。(因此，术语“同源蛋白质”定义为表示两种蛋白质具有相似的氨基酸序列)。如本发明中使用的，氨基酸序列的两个区域间的同源性(特别是关于预测的结构相似性)被解释为暗示了功能上的相似。

当对蛋白质或肽使用“同源的”时，公认的是不相同的残基位置通常因保守的氨基酸置换而不同。“保守的氨基酸置换”是其中氨基酸残基由带具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的侧链(R基)的另一氨基酸残基置换。通常，保守的氨基酸置换不显著改变蛋白质的功能特性。在其中两个或多个氨基酸序列由于保守氨基酸置换而互不相同的情况下，百分序列同一性或同源度可以上调以对于置换的保守性特性进行校正。进行这种调整的方法是本领域技术人员所公知的。参见，例如Pearson，1994，MethodsMol.Biol.24:307-31和25:365-89(通过引用并入本文)。

下列六组各包含互为保守置换的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

多肽的序列同源性，也被称为百分序列同一性，通常使用序列分析软件测定。见，如SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroup(GCG)，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，910UniversityAvenue，Madison，Wis.53705。蛋白质分析软件使用赋于各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的同源性量值来匹配相似序列。例如，GCG包含如“Gap”和“Bestfit”的程序，这些程序可以默认参数使用以确定密切相关的多肽(如来自不同物种生物体的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见，如GCG，版本6.1。

当比较特定多肽序列和包含来自不同生物体的大量序列的数据库时，优选的算法是计算机程序BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish和States，NatureGenet.3:266-272(1993)；Madden等，Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997)；Zhang和Madden，GenomeRes.7:649-656(1997))，特别是blastp或tblastn(Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997))。

BLASTp优选的参数为：期望值10：(默认)；过滤器：seg(默认)；开放空位罚分：11(默认)；扩展空位罚分：1(默认)；最大比对：100(默认)；字长：11(默认)；描述编号：100(默认)；罚分矩阵：BLOWSUM62。

比较同源性的多肽序列的长度一般至少约16个氨基酸残基，经常至少约20个残基，更经常至少约24个残基，通常至少约28个残基，优选多于约35个残基。当检索包含来自大量不同生物体的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。使用氨基酸序列的数据库检索可以通过本领域已知的blastp以外的算法测定。例如，可以使用FASTA，GCG版本6.1中的程序来比较多肽序列。FASTA提供查询和检索序列间最佳重叠区域的比对和百分序列同一性。Pearson，MethodsEnzymol.183:63-98(1990)(通过引用并入本文)。例如，如GCG版本6.1(通过引用并入本文)中提供的，氨基酸序列间的百分序列同一性可以使用FASTA以其默认参数(2的字长和PAM250得分矩阵)确定。

“特异性结合”是指两个分子优先于与环境中的其他分子结合而相互结合的能力。通常，“特异性结合”区别于反应中的偶然结合至少2倍、更通常至少10倍，经常至少100倍。通常，如通过解离常数量化的，特异性结合反应的亲和力或亲合力约为10^-7M或更强(如10^-8M、10^-9M或甚至更强)。

本发明中使用的术语“区域”是指生物分子初级结构的物理连续部分。在蛋白质的情况下，区域被定义为该蛋白质氨基酸序列的连续部分。

本发明中使用的术语“结构域”是指导致生物分子的已知或可能的功能的生物分子的结构。结构域可以与其区域或部分同延；结构域也可以包括生物分子的不同的非连续区域。蛋白质结构域的例子包括，但不限于，Ig结构域、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。

本发明中使用的术语“分子”指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂质等，且这样的化合物可以是天然的或合成的。

“感兴趣的碳基产物”包括醇类，如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯；烃和烷烃，如丙烷、辛烷、柴油、喷气推进剂8(JP8)；聚合物如对苯二酸酯、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、多元醇、聚羟基烷酸酯(PHA)、聚-β-羟基丁酸酯(PHB)、丙烯酸酯、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶；商品化学物质，如乳酸酯、二十二碳六烯酸(DHA)、3-羟基丙酸、γ-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸酯、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、ω-3DHA、番茄红素、衣康酸酯、1,3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸酯、柠檬酸酯、柠檬酸、谷氨酸酯、苹果酸酯、3-羟基丙酸(HPA)、乳酸、THF、γ-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸酯、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸；特种化学品如类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸；药物和药物中间体如7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)/头孢菌素、红霉素、聚酮、他汀类、紫杉醇、多西紫杉醇、萜、肽、类固醇、ω-脂肪酸和其他合适的目的产物。这样的产物在生物燃料、工业和特种化学品的情况中作为用于其他产品如营养补充剂、保健品(neutraceutical)、聚合物、石蜡替代品、个人护理产品和药品的中间体是有用的。

生物燃料：生物燃料是指源于生物来源的任何燃料。生物燃料可以指一种或多种烃、一种或多种醇(如乙醇)、一种或多种脂肪酯或其混合物。

烃：该术语通常指由元素碳(C)、氢(H)和任选的氧(O)组成的化合物。烃基本有三种类型，如芳香烃、饱和烃和不饱和烃如烯烃、炔烃和二烯烃。该术语也包括燃料、生物燃料、塑料、蜡、溶剂和油。烃包括生物燃料，以及塑料、蜡、溶剂和油。

除非另外指明，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。下面描述了示例性的方法和材料，尽管类似或等同于本发明中描述的那些的方法和材料也可以用于实施本发明且其对本领域技术人员是显而易见的。本发明中提及的所有公开出版物和其他参考文献整体通过引用并入本文。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)优先。材料、方法和实施例仅是说明性的而不意图是限制性的。

在整个说明书和权利要求中，单词“包括”或其变型如“包含”或“包括有”应被理解为指包含指定的成分或成分组，但不排除任何其他成分或成分组。

核酸序列

本发明提供用于编码酶及其变体的基因的分离的核酸分子。编码酶的基因的示例性全长核酸序列及其对应氨基酸序列如表1和表2所示。

在一个实施方式中，本发明提供了具有包含在感兴趣的宿主细胞中表达的编码烷基脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、羧酸还原酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、长链脂肪酸CoA-连接酶和/或长链酰基-CoA还原酶及其同源物、变体和衍生物的基因或由其组成的核酸序列的分离的核酸分子。本发明还提供了包含作为本文所述烷基脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、羧酸还原酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、长链脂肪酸CoA-连接酶和/或长链酰基-CoA还原酶的密码子优化形式的序列或由其组成的核酸分子。在进一步的实施方式中，本发明提供了包含作为与野生型基因具有至少80％同一性的烷基脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、羧酸还原酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、长链脂肪酸CoA-连接酶和/或长链酰基-CoA还原酶的变体的序列或由其组成的核酸分子以及该分子的同源物、变体和衍生物。核酸序列可以优选与野生型基因具有高于80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或甚至更高的同一性。

在另一个实施方式中，本发明的核酸分子编码具有在表1和表2中公开的氨基酸序列的多肽。优选地，本发明的核酸分子编码与在表1和表2中示出的氨基酸序列具有至少50％、60、70％、80％、85％、90％或95％同一性的多肽序列，且同一性甚至可以更优选为96％、97％、98％、99％、99.9％或甚至更高。

本发明也提供在严格条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子。如上文所定义的和本领域所公知的，严格杂交是在比特定条件集下的特定DNA杂合体的热熔点(T_m)低约25℃下进行，其中T_m是50％靶序列与完美匹配的探针杂交的温度。严格洗涤是在比特定条件集下的特定DNA杂合体的T_m低约5℃的温度下进行。

也提供了包含上述核酸序列中任一个的片段的核酸分子。这些片段优选包含至少20个连续核苷酸。更优选地，核酸序列的片段含有至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或甚至更多的连续核苷酸。

本发明的核酸序列片段在多种系统和方法中显示出用途。例如，片段可在各种不同杂交技术中作为探针使用。取决于方法，靶核酸序列可以是DNA或RNA。靶核酸序列可以在杂交前分级分离(如通过凝胶电泳)，或者可以对样品进行原位杂交。本领域技术人员会理解，已知序列的核酸探针在染色体结构确定(如，通过DNA印迹法)或在基因表达测量中(如，通过RNA印迹法)中具有用途。在这样的实验中，优选可检测地标记序列片段，使得可以检测和任选地定量其与靶序列的特异性杂交。本领域技术人员会理解，本发明的核酸片段可以用于本文没有具体描述的广泛印迹技术中。

也应当理解，当固定在微阵列上时，本文公开的核酸序列片段也有作为探针的用途。通过将核酸沉积并固定到载体基板上来制造微阵列的方法是本领域所公知的。其在DNAMicroarrays:APracticalApproach(PracticalApproachSeries)，Schena(编者)，OxfordUniversityPress(1999)(ISBN:0199637768)；NatureGenet.21(1)(suppl):1-60(1999)；MicroarrayBiochip:ToolsandTechnology，Schena(编者)，EatonPublishingCompany/BioTechniquesBooksDivision(2000)(ISBN:1881299376)中综述，这些公开内容通过引用在此全文并入。例如，使用包含核酸序列片段(如本文公开的核酸序列片段)的微阵列进行基因表达的分析是序列片段在细胞和分子生物学领域中广泛确认的用途。固定在微阵列上的序列片段的其他用途在Gerhold等，TrendsBiochem.Sci.24:168-173(1999)和Zweiger，TrendsBiotechnol.17:429-436(1999)；DNAMicroarrays:APracticalApproach(PracticalApproachSeries)，Schena(编者)，OxfordUniversityPress(1999)(ISBN:0199637768)；NatureGenet.21(1)(suppl):1-60(1999)；MicroarrayBiochip:ToolsandTechnology，Schena(编者)，EatonPublishingCompany/BioTechniquesBooksDivision(2000)(ISBN:1881299376)中描述，这些公开内容均通过引用在此全文并入。

如本领域所公知的，酶活性可以以各种方式测定。例如，OMP的焦磷酸解可以用分光光度方式追踪(Grubmeyer等，(1993)J.Biol.Chem.268:20299-20304)。可选地，酶的活性可以使用色谱技术追踪，如高效液相色谱法(Chung和Sloan，(1986)J.Chromatogr.371:71-81)。作为另一种可选方式，活性可以通过测定酶活性产生的产物水平而间接测量。这些水平可以使用包括本领域已知的和描述的氯仿/甲醇水性提取在内的技术进行测量(Cf.M.Kates(1986)TechniquesofLipidology；Isolation，analysisandidentificationofLipids.ElsevierSciencePublishers，NewYork(ISBN:0444807322))。更现代的技术包括使用与质谱联合的气相色谱(Niessen，W.M.A.(2001).Currentpracticeofgaschromatography--massspectrometry.NewYork，N.Y:MarcelDekker.(ISBN:0824704738))。其他用于鉴别重组蛋白质活性和产物的现代技术，包括液相色质谱(LCMS)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)、核磁共振(NMR)、近红外(NIR)光谱、粘度测定(Knothe，G(1997)Am.Chem.Soc.Symp.Series，666:172–208)、测定游离脂肪酸的滴定(Komers(1997)Fett/Lipid，99(2):52–54)、酶学方法(Bailer(1991)FreseniusJ.Anal.Chem.340(3):186)、基于物理性质的方法、湿式化学方法等，可被用于分析由本发明的生物体产生的产物的水平与身份。如本领域技术人员所知的，其他的方法和技术也可适合于酶活性的测量。

载体

也提供了包含本发明的上述核酸分子的载体(包括表达载体)，如本文所进一步描述的。在第一实施方式中，载体包括上述分离的核酸分子。在替代实施方式中，本发明的载体包括与一种或多种表达控制序列可操作地连接的上述核酸分子。因此本发明的载体可用于通过宿主细胞表达促进烷烃产生活性的多肽。

可用于在原核生物中表达核酸的载体是本领域中所公知的。

分离的多肽

依据本发明另一个方面，提供了由本发明的核酸分子编码的分离的多肽(包括突变蛋白、等位基因变体、片段、衍生物和类似物)。在一个实施方式中，分离的多肽包含对应于表1或表2所示的多肽序列的多肽序列。在本发明的替代实施方式中，分离的多肽包含与表1和表2所示的多肽序列至少85％相同的多肽序列。优选地，本发明的分离的多肽与表1或表2所示的多肽序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或甚至更高的同一性。

根据本发明的其他实施方式，提供了包含上述多肽序列的片段的分离的多肽。这些片段优选含有至少20个连续氨基酸，更优选至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或甚至更多的连续氨基酸。

本发明的多肽也包括上述多肽序列与异源多肽之间的融合体。异源序列可以，例如，包括设计为利于纯化(如组氨酸标签)和/或重组表达的蛋白质的可视化的序列。蛋白质融合体的其他非限制性实例包括允许在噬菌体或细胞表面上展示编码的蛋白质的融合体，与固有荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(GFP))的融合体和与IgGFc区域的融合体。

宿主细胞转化体

在本发明的另一方面，提供了使用本发明的核酸分子或载体转化的宿主细胞及其后代。在本发明的一些实施方式中，这些细胞在载体上携带本发明的核酸序列，载体可以是但不是必须是自由复制载体。在本发明的其他实施方式中，核酸已被整合到宿主细胞的基因组中。

在替代性实施方式中，本发明的宿主细胞可以通过本发明的分离的核酸的破坏、缺失或突变进行的重组来突变，使得相对于缺少该突变的宿主细胞，宿主细胞中的一种或多种酶的活性被降低或消除。

用于产生感兴趣的碳基产物的选择的或工程化的微生物

微生物：包括来自古细菌(Archaea)、细菌(Bacteria)和真核生物(Eucarya)域(domain)的原核和真核微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。术语“微生物细胞”和“微小生物”可与术语微生物互换使用。

多种宿主微生物可以被转化以产生感兴趣的产物。光能自养生物包括真核植物和藻类以及原核蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。

极端微生物也被认为是适合的生物体。这样的生物体耐受各种环境参数如温度、辐射、压力、重力、真空、干燥、盐度、pH、氧张力和化学物质。它们包括在80℃下或在高于80℃下生长的超嗜热微生物如延胡索酸火叶菌(Pyrolobusfumarii)；在60-80℃之间生长的嗜热微生物如灰蓝聚球藻(Synechococcuslividis)；在15-60℃之间生长的中温微生物；和在15℃下或在低于15℃下生长的低温微生物如嗜冷杆菌(Psychrobacter)和一些昆虫。耐辐射生物包括耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans)。耐压生物包括耐受130Mpa压力的嗜压微生物。耐重力生物体包括嗜压微生物。耐超重力(如>1g)低重力(如<1g)生物也包括在内。耐真空生物体包括缓步动物、昆虫、微生物和种子。耐干燥和脱水生活(anhydrobiotic)的生物体包括耐旱生物如卤虫(Artemiasalina)；线虫、微生物、真菌和地衣。耐盐生物体包括嗜盐生物(如2-5MNaCl)盐杆菌科(Halobacteriacea)和盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)。耐pH生物体包括嗜碱生物如嗜盐碱杆菌属(Natronobacterium)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)OF4、螺旋藻属(Spirulinaspp.)(如pH>9)和嗜酸生物如高温红藻(Cyanidiumcaldarium)、铁原体属(Ferroplasma)(如低pH)。不能耐受O₂的厌氧生物如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)；耐受一定O₂的微氧生物如梭菌属(Clostridium)和需要O₂的需氧生物也被包括在内。耐受纯CO₂的气体耐受生物体包括高温红藻，和金属耐受生物体包括耐金属体如Ferroplasmaacidarmanus(如Cu、As、Cd、Zn)和青枯菌属(Ralstonia)CH34种(如Zn、Co、Cd、Hg、Pb)。Gross，Michael.LifeontheEdge:AmazingCreaturesThrivinginExtremeEnvironments.NewYorK:Plenum(1998)和Seckbach，J."SearchforLifeintheUniversewithTerrestrialMicrobesWhichThriveUnderExtremeConditions."InCristianoBatalliCosmovici，StuartBowyer及DanWertheimer编辑，AstronomicalandBiochemicalOriginsandtheSearchforLifeintheUniverse，p.511.Milan:EditriceCompositori(1997)。

植物包括但不限于下列属：拟南芥属(Arabidopsis)、甜菜属(Beta)、大豆属(Glycine)、麻风树属(Jatropha)、芒属(Miscanthus)、黍属(Panicum)、虉草属(Phalaris)、杨属(Populus)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、希蒙得木属(Simmondsia)和玉蜀黍属(Zea)。

藻类和蓝细菌包括但不限于下列属：刺菊石属(Acanthoceras)、Acanthococcus属、Acaryochloris属、曲壳藻属(Achnanthes)、细曲壳藻属(Achnanthidium)、星状藻属(Actinastrum)、Actinochloris属、辐环藻属(Actinocyclus)、辐射鼓藻属(Actinotaenium)、双金藻属(Amphichrysis)、前沟藻属(Amphidinium)、尖粒藻属(Amphikrikos)、双肋藻属(Amphipleura)、茧形藻属(Amphiprora)、分须藻属(Amphithrix)、双眉藻属(Amphora)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、暗额藻属(Aneumastus)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、锚藻属(Ankyra)、异菱藻属(Anomoeoneis)、虚幻球藻属(Apatococcus)、束丝藻属(Aphanizomenon)、隐球藻属(Aphanocapsa)、隐毛藻属(Aphanochaete)、隐杆藻属(Aphanothece)、梨囊藻属(Apiocystis)、顶丝藻属(Apistonema)、四棘鼓藻属(Arthrodesmus)、节旋藻属(Artherospira)、Ascochloris属、星杆藻属(Asterionella)、绿星球藻属(Asterococcus)、奥杜藻属(Audouinella)、沟链藻属(Aulacoseira)、杆状藻属(Bacillaria)、巴尔比亚藻属(Balbiania)、似竹鼓藻属(Bambusina)、红毛菜属(Bangia)、鞭毛虫属(Basichlamys)、串珠藻属(Batrachospermum)、骈胞藻属(Binuclearia)、角藻属(Bitrichia)、盘苔属(Blidingia)、拟气球藻属(Botrdiopsis)、气球藻属(Botrydium)、葡萄藻属(Botryococcus)、球葡萄藻属(Botryosphaerella)、咸胞藻属(Brachiomonas)、短纹藻属(Brachysira)、短毛藻属(Brachytrichia)、Brebissonia属、毛鞘藻属(Bulbochaete)、柱杆藻属(Bumilleria)、拟柱杆藻属(Bumilleriopsis)、美壁藻属(Caloneis)、眉藻属(Calothrix)、马鞍藻属(Campylodiscus)、盒管藻属(Capsosiphon)、四鞭藻属(Carteria)、Catena属、Cavinula属、刺棘藻属(Centritractus)、Centronella属、角藻属(Ceratium)、角毛藻属(Chaetoceros)、Chaetochloris属、硬毛藻属(Chaetochloris)、卡盾藻属(Chaetonella)、毛丝藻属(Chaetonema)、盾毛藻属(Chaetopeltis)、胶毛藻属(Chaetophora)、毛球藻属(Chaetosphaeridium)、管孢藻属(Chamaesiphon)、轮藻属(Chara)、Characiochloris属、拟小椿藻属(Characiopsis)、小庄藻属(Characium)、轮藻目(Charales)、缘胞藻属(Chilomonas)、厚胞藻属(Chlainomonas)、盖毛藻属(Chlamydoblepharis)、Chlamydocapsa属、衣藻属(Chlamydomonas)、Chlamydomonopsis属、衣粘藻属(Chlamydomyxa)、Chlamydonephris属、Chlorangiella属、拟绿囊藻属(Chlorangiopsis)、小球藻属(Chlorella)、绿囊藻属(Chlorobotrys)、绿幅藻属(Chlorobrachis)、绿点藻属(Chlorochytrium)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿胶藻属(Chlorogloea)、绿胶球藻属(Chlorogloeopsis)、绿梭藻属(Chlorogonium)、绿带藻属(Chlorolobion)、拟衣藻属(Chloromonas)、吊兰属(Chlorophysema)、绿藻门(Chlorophyta)、绿胶囊藻属(Chlorosaccus)、背包藻属(Chlorosarcina)、Choricystis属、色植藻属(Chromophyton)、金光藻属(Chromulina)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、色指藻属(Chroodactylon)、蓝隐藻属(Chroomonas)、色合藻属(Chroothece)、金变形藻属(Chrysamoeba)、金网藻属(Chrysapsis)、金星藻属(Chrysidiastrum)、金囊藻属(Chrysocapsa)、Chrysocapsella属、Chrysochaete属、金色藻属(Chrysochromulina)、金粒藻属(Chrysococcus)、Chrysocrinus属、Chrysolepidomonas属、Chrysolykos属、Chrysonebula属、金藻门(Chrysophyta)、金钟藻属(Chrysopyxis)、Chrysosaccus属、Chrysophaerella属、金环藻属(Chrysostephanosphaera)、刚毛藻属(Clodophora)、链孢藻属(Clastidium)、拟新月藻属(Closteriopsis)、新月藻属(Closterium)、胶球藻属(Coccomyxa)、卵形藻属(Cocconeis)、Coelastrella属、空星藻属(Coelastrum)、腔球藻属(Coelosphaerium)、帽球藻属(Coenochloris)、无胶集球藻属(Coenococcus)、聚囊藻属(Coenocystis)、柄裸藻属(Colacium)、鞘毛藻属(Coleochaete)、Collodictyon属、Compsogonopsis属、弯枝藻属(Compsopogon)、Conjugatophyta门、Conochaete属、Coronastrum属、鼓藻属(Cosmarium)、Cosmioneis属、胶球鼓藻属(Cosmocladium)、Crateriportula属、Craticula属、发毛针藻属(Crinalium)、十字藻属(Crucigenia)、Crucigeniella属、Cryptoaulax属、隐藻属(Cryptomonas)、隐藻门(Cryptophyta)、Ctenophora属、蓝网藻属(Cyanodictyon)、Cyanonephron属、蓝载藻属(Cyanophora)、蓝藻门(Cyanophyta)、蓝杆藻属(Cyanothece)、Cyanothomonas属、环胞藻属(Cyclonexis)、环冠藻属(Cyclostephanos)、小环藻属(Cyclotella)、简藻属(Cylindrocapsa)、柱胞鼓藻属(Cylindrocystis)、柱孢藻属(Cylindrospermum)、细柱藻属(Cylindrotheca)、波缘藻属(Cymatopleura)、桥弯藻属(Cymbella)、Cymbellonitzschia属、胞甲藻属(Cystodinium)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、单板藻属(Debarya)、细齿藻属(Denticula)、Dermatochrysis属、瘤皮藻属(Dermocarpa)、小皮果蓝细菌属(Dermocarpella)、缢带藻属(Desmatractum)、角丝鼓藻属(Desmidium)、鼓藻属(Desmococcus)、带线藻属(Desmonema)、Desmosiphon属、长刺藻属(Diacanthos)、Diacronema属、等半藻属(Diadesmis)、等片藻属(Diatoma)、等隔藻属(Diatomella)、双细胞藻属(Dicellula)、双须藻属(Dichothrix)、叉球藻属(Dichotomococcus)、Dicranochaete属、网绿藻属(Dictyochloris)、球网藻属(Dictyococcus)、胶网藻属(Dictyosphaerium)、Didymocystis属、Didymogenes属、双楔藻属(Didymocystis)、丝藻属(Dilabifilum)、双形藻属(Dimorphococcus)、锥囊藻属(Dinobryon)、球甲藻属(Dinococcus)、双绿藻属(Diplochloris)、双壁藻属(Diploneis)、双十藻属(Diplostauron)、Distrionella属、基纹鼓藻属(Docidium)、竹枝藻属(Draparnaldia)、杜氏藻属(Dunaliella)、异形藻属(Dysmorphococcus)、延胞藻属(Ecballocystis)、纺锤藻属(Elakatothrix)、Ellerbeckia属、内丝藻属(Encyonema)、浒苔属(Enteromorpha)、内枝藻属(Entocladia)、茧形藻属(Entomoneis)、石囊藻属(Entophysalis)、附金藻属(Epichrysis)、附钟藻属(Epipyxis)、窗纹藻属(Epithemia)、独球藻属(Eremosphaera)、拟凹顶藻属(Euastropsis)、凹顶鼓藻属(Euastrum)、立方藻属(Eucapsis)、真卵形藻属(Eucocconeis)、空球藻属(Eudorina)、裸藻属(Euglena)、裸藻门(Euglenophyta)、短缝藻属(Eunotia)、Eustigmatophyta门、双鞭藻属(Eutreptia)、曲解藻属(Fallacia)、侧生藻属(Fischerella)、脆杆藻属(Fragilaria)、Fragilariforma属、被刺藻属(Franceia)、肋缝藻属(Frustulia)、Curcilla属、双胞藻属(Geminella)、短水绵属(Genicularia)、灰胞藻属(Glaucocystis)、灰藻门属(Glaucophyta)、Glenodiniopsis属、薄甲藻属(Glenodinium)、粘球藻属(Gloeocapsa)、Gloeochaete属、Gloeochrysis属、圆球藻属(Gloeococcus)、胶囊藻属(Gloeocystis)、Gloeodendron属、胶胞藻属(Gloeomonas)、Gloeoplax属、粘杆藻属(Gloeothece)、胶丝藻属(Gloeotila)、胶刺藻属(Gloeotrichia)、Gloiodictyon属、多芒藻属(Golenkinia)、拟多芒藻属(Golenkiniopsis)、孢根藻属(Gomontia)、楔桥弯藻属(Gomphocymbella)、异极藻属(Gomphonema)、束球藻属(Gomphosphaeria)、白氏膝接藻属(Gonatozygon)、Gongrosia属、链瘤藻属(Gongrosira)、角绿藻属(Goniochloris)、盘藻属(Gonium)、膝口藻属(Gonyostomum)、粒绿藻属(Granulochloris)、拟粒囊藻属(Granulocystopsis)、Groenbladia属、裸甲藻属(Gymnodinium)、缢丝鼓藻属(Gymnozyga)、布纹藻属(Gyrosigma)、鞭毛藻属(Haematococcus)、哥胞藻属(Hafniomonas)、Hallassia属、双尖藻属(Hammatoidea)、Hannaea属、菱板藻属(Hantzschia)、软管藻属(Hapalosiphon)、Haplotaenium属、定鞭藻门(Haptophyta)、海氏藻属(Haslea)、混沟甲藻属(Hemidinium)、Hemitoma属、茸壳藻属(Heribaudiella)、异毛藻属(Heteromastix)、异丝藻属(Heterothrix)、Hibberdia属、胭脂藻属(Hildenbrandia)、隐鞭藻属(Hillea)、浩罗藻属(Holopedium)、须藻属(Homoeothrix)、Hormanthonema属、皮襟藻属(Hormotila)、Hyalobrachion属、Hyalocardium属、明盘藻属(Hyalodiscus)、透明梭藻属(Hyalogonium)、圆丝鼓藻属(Hyalotheca)、Hydrianum属、水胞藻属(Hydrococcus)、水鞘藻属(Hydrocoleum)、水条藻属(Hydrocoryne)、水网藻属(Hydrodictyon)、水链藻属(Hydrosera)、水树藻属(Hydrurus)、蓝枝藻属(Hyella)、膜胞藻属(Hymenomonas)、细绿藻属(Isthmochloron)、拟丝藻属(Johannesbaptistia)、肾粒藻属(Juranyiella)、Karayevia属、Kathablepharis属、下甲藻属(Katodinium)、金杯藻属(Kephyrion)、角球藻属(Keratococcus)、蹄形藻属(Kirchneriella)、克里藻属(Klebsormidium)、Kolbesia属、Koliella属、Komarekia属、Korshikoviella属、Kraskella属、顶棘藻属(Lagerheimia)、烧瓶藻属(Lagynion)、丽枝藻属(Lamprothamnium)、鱼子菜属(Lemanea)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、细链藻属(Leptosira)、Lobococcus属、Lobocystis属、叶衣藻属(Lobomonas)、Luticola属、鞘丝藻属(Lyngbya)、Malleochloris属、鱼鳞藻属(Mallomonas)、Mantoniella属、射星藻属(Marssoniella)、Martyana属、鞭鞘藻属(Mastigocoleus)、Gastogloia属、直链藻属(Melosira)、平裂藻属(Merismopedia)、Mesostigma属、中带鼓藻属(Mesotaenium)、微星藻属(Micractinium)、小星藻属(Micrasterias)、微毛藻属(Microchaete)、微鞘藻属(Microcoleus)、微囊藻属(Microcystis)、软壳藻属(Microglena)、Micromonas属、微孢藻属(Microspora)、小丛藻属(Microthamnion)、柄球藻属(Mischococcus)、单鞭金藻属(Monochrysis)、蒜头藻属(Monodus)、Monomastix属、单壳缝藻属(Monoraphidium)、礁膜属(Monostroma)、转板藻属(Mougeotia)、拟转板藻属(Mougeotiopsis)、喙藻属(Myochloris)、Myromecia属、粘囊藻属(Myxosarcina)、瓶丝藻属(Naegeliella)、微绿球藻属(Nannochloris)、类球藻属(Nautococcus)、舟形藻属(Navicula)、Neglectella属、长蓖藻属(Neidium)、Nephroclamys属、肾形藻属(Nephrocytium)、Nephrodiella属、肾藻属(Nephroselmis)、梭形鼓藻属(Netrium)、丽藻属(Nitella)、拟丽藻属(Nitellopsis)、菱形藻属(Nitzschia)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、棕鞭藻属(Ochromonas)、鞘藻属(Oedogonium)、Oligochaetophora属、棘接鼓藻属(Onychonema)、Oocardium属、卵囊藻属(Oocystis)、槌棒藻属(Opephora)、黄管藻属(Ophiocytium)、Orthoseira属、颤藻属(Oscillatoria)、Oxyneis属、厚枝藻属(Pachycladella)、四集藻属(Palmella)、Palmodictyon属、实球藻属(Pnadorina)、Pannus属、帕拉藻属(Paralia)、巴喧氏藻属(Pascherina)、Paulschulzia属、盘星藻属(Pediastrum)、柄钟藻属(Pedinella)、平藻属(Pedinomonas)、指藻属(Pedinopera)、海网藻属(Pelagodictyon)、柱形鼓藻属(Penium)、袋鞭藻属(Peranema)、拟多甲藻属(Peridiniopsis)、多甲藻属(Peridinium)、Peronia属、石藻属(Petroneis)、壳衣藻属(Phacotus)、扁裸藻属(Phacus)、Phaeaster属、褐皮藻属(Phaeodermatium)、褐藻门(Phaeophyta)、Phaeosphaera属、金枝藻属(Phaeothamnion)、席藻属(Phormidium)、叶楯藻属(Phycopeltis)、叶绿藻属(Phyllariochloris)、Phyllocardium属、Phyllomitas属、羽纹藻属(Pinnularia)、Pitophora属、Placoneis属、游丝藻属(Planctonema)、浮球藻属(Planktosphaeria)、微曲壳藻属()Planothidium)、织线藻属(Plectonema)、杂球藻属(Pleodorina)、Pleurastrum属、厚皮藻属(Pleurocapsa)、侧枝藻属(Pleurocladia)、双盘藻属(Pleurodiscus)、斜纹藻属(Pleurosigma)、侧链藻属(Pleurosira)、宽带鼓藻属(Pleurotaenium)、Pocillomonas属、Podohedra属、多鞭藻属(Polyblepharides)、多胶毛藻属(Polychaetophora)、多角藻属(Polyedriella)、多突藻属(Polyedriopsis)、多角绿藻属(Polygoniochloris)、Polyepidomonas属、Polytaenia属、素衣藻属(Polytoma)、Polytomella属、紫球藻属(Porphyridium)、Posteriochromonas属、Prasinochloris属、绿枝藻属(Prasinocladus)、绿枝藻门(Prasinophyta)、溪菜属(Prasiola)、原绿藻门(Prochlorphyta)、原绿发藻属(Prochlorothrix)、原皮藻属(Protoderma)、原管藻属(Protosiphon)、朴罗藻属(Provasoliella)、三毛金藻属(Prymnesium)、Psammodictyon属、Psammothidium属、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、Pseudenoclonium属、拟四鞭藻属(Psuedocarteria)、Pseudochate属、Pseudocharacium属、Pseudococcomyxa属、伪胶网藻属(Pseudodictyosphaerium)、假金杯藻属(Pseudokephyrion)、伪瘤皮藻属(Pseudoncobyrsa)、Pseudoquadrigula属、Pseudosphaerocystis属、Pseudostaurastrum属、Pseudostaurosira属、Pseudotetrastrum属、翼膜藻属(Pteromonas)、Punctastruata属、塔衣藻属(Pyramichlamys)、塔胞藻属(Pyramimonas)、甲藻门(Pyrrophyta)、Quadrichloris属、四瓣藻属(Quadricoccus)、并联藻属(Quadrigula)、辐球藻属(Radiococcus)、辐丝藻属(Radiofilum)、尖头藻属(Raphidiopsis)、Raphidocelis属、针丝藻属(Raphidonema)、绿胞藻门(Raphidophyta)、Peimeria属、棒条藻属(Rhabdoderma)、杆胞藻属(Rhabdomonas)、根枝藻属(Rhizoclonium)、红胞藻属(Rhodomonas)、红藻门(Rhodophyta)、弯楔藻属(Rhoicosphenia)、棒杆藻属(Rhopalodia)、胶须藻属(Rivularia)、浅罗氏藻属(Rosenvingiella)、Rossithidium属、弯柱鼓藻属(Roya)、栅藻属(Scenedesmus)、Scherffelia属、Schizochlamydella属、裂壁藻属(Schizochlamys)、裂线藻属(Schizomeris)、裂须藻属(Schizothrix)、弓形藻属(Schroederia)、Scolioneis属、螺翼藻属(Scotiella)、Scotiellopsis属、斯氏藻属(Scourfieldia)、伪枝藻属(Scytonema)、月牙藻属(Selenastrum)、月绿藻属(Selenochloris)、鞍眉藻属(Sellaphora)、Semiorbis属、褐胞藻属(Siderocelis)、拟铁囊藻属(Diderocystopsis)、Dimonsenia属、管线藻属(Siphononema)、链枝藻属(Sirocladium)、链膝藻属(Sirogonium)、骨条藻属(Skeletonema)、群星藻属(Sorastrum)、Spermatozopsis属、Sphaerellocystis属、拟球藻属(Sphaerellopsis)、Sphaerodinium属、环藻属(Sphaeroplea)、瘤接鼓藻属(Sphaerozosma)、刺胞藻属(Spiniferomonas)、水绵属(Spirogyra)、螺带鼓藻属(Spirotaenia)、螺旋藻属(Spirulina)、椎葚属(Spondylomorum)、顶接鼓藻属(Spondylosium)、Sporotetras属、泡沫藻属(Spumella)、角星鼓藻属(Staurastrum)、Stauerodesmus属、辐节藻属(Stauroneis)、十字脆杆藻亚属(Staurosira)、Staurosirella属、长羽藻属(Stenopterobia)、Stephanocostis属、冠盘藻属(Stephanodiscus)、冠孔藻属(Stephanoporos)、Stephanosphaera属、列丝藻属(Stichococcus)、粘胶藻属(Stichogloea)、毛枝藻属(Stigeoclonium)、真枝藻属(Stigonema)、柄球藻属(Stipitococcus)、斯特克藻属(Stokesiella)、陀裸藻属(Strombomonas)、Stylochrysalis属、柄甲藻属(Stylodinium)、Styloyxis属、绿柄球藻属(Stylosphaeridium)、双菱藻属(Surirella)、Sykidion属、束藻属(Symploca)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、针杆藻属(Synedra)、聚赭胞藻属(Synochromonas)、黄群藻属(Synura)、平板藻属(Tabellaria)、Tabularia属、泰林鼓藻属(Teilingia)、切孢藻属(Temnogametum)、裂顶鼓藻属(Tetmemorus)、四球藻属(Tetrachlorella)、四环藻属(Tetracyclus)、四链藻属(Tetradesmus)、骈列藻属(Tetraedriella)、四角藻属(Tetraedron)、四爿藻属(Tetraselmis)、四孢藻属(Tetraspora)、四星藻属(Tetrastrum)、海链藻属(Thalassiosira)、丛毛藻属(Thamniochaete)、胸甲藻属(Thorakochloris)、红索藻属(Thorea)、鸟巢藻属(Tolypella)、单歧藻属(Tolypothrix)、囊裸藻属(Trachelomonas)、Trachydiscus属、共球藻属(Trebouxia)、桔色藻属(Trentepholia)、四刺藻属(Treubaria)、黄丝藻属(Tribonema)、红海束毛藻属(Trichodesmium)、Trichodiscus属、小箍藻属(Trochiscia)、盘杆藻属(Tryblionella)、软丝藻属(Ulothrix)、辐尾藻属(Uroglena)、尾丝藻属(Uronema)、尾管藻属(Urosolenia)、尾孢藻属(Urospora)、Uva属、周泡藻属(Vacuolaria)、无隔藻属(Vaucheria)、团藻属(Volvox)、Volvulina属、韦斯藻属(Westella)、网甲藻属(Woloszynskia)、多棘鼓藻属(Xanthidium)、黄藻门(Xanthophyta)、异球藻属(Xenococcus)、双星藻属(Zygnema)、拟双星藻属(Zygnemopsis)和Zygonium属。蓝细菌包括以下属的成员：管孢藻属、色球藻属、蓝细菌属、蓝菌属(Cyanobium)、蓝杆藻属、蓝纤维藻属、蓝杆菌属(Gloeobacter)、粘球藻属、粘杆藻属、微囊藻属、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属(Prochloron)、聚球藻属、集胞藻属、蓝囊胞藻属(Cyanocystis)、包皮藻属、直毛藻属(Stanieria)、异球藻属、拟色球藻属、粘囊藻属、节旋藻属、博氏藻属(Borzia)、发毛针藻属、Geitlerinemia属、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、浮游蓝丝藻属(Planktothrix)、原绿丝藻属(Prochiorothrix)、假鱼腥藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、束藻属、束毛藻属、灰线蓝细菌属(Tychonema)、鱼腥藻属、项圈藻属、束丝藻属、蓝螺菌属(Cyanospira)、拟柱胞藻属(Cylindrospermopsis)、柱孢藻属、节球藻属、念珠藻属、伪枝藻属(Scylonema)、眉藻属、胶须藻属、单歧藻属、绿胶球藻属、侧生藻属、吉特勒氏蓝细菌属(Geitieria)、Iyengariella属、拟珠藻属(Nostochopsis)、真枝藻属和嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)。

绿色非硫细菌包括但不限于下列属：绿弯菌属(Chloroflexus)、绿线菌属(Chloronema)、颤绿菌属(Oscillochloris)、太阳发菌属(Heliothrix)、爬管菌属(Herpetosiphon)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)和热微菌属(Thermomicrobium)。

绿色硫细菌包括但不限于下列属：绿菌属(Chlorobium)、格状绿菌属(Clathrochloris)和突柄绿菌属(Prosthecochloris)。

紫色硫细菌包括但不限于下列属：异着色菌属(Allochromatium)、着色菌属(Chromatium)、盐着色菌属(Halochromatium)、等着色菌属(Isochromatium)、海洋着色菌属(Marichromatium)、小红卵菌属(Rhodovulum)、热着色菌属(Thermochromatium)、荚硫菌属(Thiocapsa)、硫红球菌属(Thiorhodococcus)和囊硫菌属(Thiocystis)。

紫色非硫细菌包括但不限于下列属：褐螺菌属(Phaeospirillum)、Rhodobaca属、红细菌属(Rhodobacter)、红微菌属(Rhodomicrobium)、红球形菌属(Rhodopila)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、海洋玫瑰菌属(Rhodothalassium)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红弧菌属(Rodovibrio)和玫瑰螺菌属(Roseospira)。

需氧化能自氧菌包括但不限于硝化细菌如硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)的种、硝化杆菌属(Nitrobacter)的种、硝化刺菌属(Nitrospina)的种、硝化球菌属(Nitrococcus)的种、硝化螺旋菌属(Nitrospira)的种、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)的种、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)的种、亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)的种、亚硝酸叶菌属(Nitrosolobus)的种、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)的种；无色硫细菌如卵硫菌属(Thiovulum)的种、硫杆菌属(Thiobacillus)的种、硫微螺菌属(Thiomicrospira)的种、硫球菌属(Thiosphaera)的种、嗜热丝菌属(Thermothrix)的种；专性化能自养氢细菌如产氢杆菌属(Hydrogenobacter)的种、铁和锰氧化和/或沉积细菌如铁球菌属(Siderococcus)的种、以及趋磁细菌如水螺菌属(Aquaspirillum)的种。

古细菌包括但不限于产甲烷古细菌如甲烷杆菌属(Methanobacterium)的种、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)的种、甲烷嗜热菌属(Methanothermus)的种、甲烷球菌属(Methanococcus)的种、甲烷微菌属(Methanomicrobium)的种、甲烷螺菌属(Methanospirillum)的种、产甲烷菌属(Methanogenium)的种、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)的种、甲烷叶菌属(Methanolobus)的种、甲烷丝菌属(Methanothrix)的种、甲烷类球菌属(Methanococcoides)的种、甲烷盘菌属(Methanoplanus)的种；极端嗜热硫代谢菌如热变形菌属(Thermoproteus)的种、热网菌属(Pyrodictium)的种、硫化叶菌属(Sulfolobus)的种、嗜酸菌属(Acidianus)的种，以及其他微生物如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、链霉菌属(Streptomyces)的种、青枯菌属(Ralstonia)的种、红球菌属(Rhodococcus)的种、棒状杆菌属(Corynebacteria)的种、短杆菌属(Brevibacteria)的种、分枝杆菌属(Mycobacteria)的种和产油酵母菌。

依据本发明公开的方法生产烷烃的优选生物体包括：拟南芥(Arabidopsisthaliana)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、奇岗(Miscanthusgiganteus)和玉米(Zeamays)(植物)；布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、盐生杜氏藻(Dunalielasalina)(藻类)；聚球藻PCC7002、聚球藻PCC7942、聚球藻PCC6803、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)BP-1(蓝细菌)；Chlorobiumtepidum(绿色硫细菌)；橙色绿屈挠菌(Chloroflexusauranticus)(绿色非硫细菌)；微温着色菌(Chromatiumtepidum)和酒色着色菌(Chromatiumvinosum)(紫色硫细菌)；深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalusris)(紫色非硫细菌)。

此外其他适合的生物体包括如Venter等.，美国专利公开号2007/0264688所描述的合成的细胞或由合成的基因组产生的细胞，以及Glass等，美国专利公开号2007/0269862所述的细胞样系统或合成细胞。

此外其他适合的生物体包括可以被工程化以固定二氧化碳的微生物，细菌如大肠杆菌、醋酸杆菌(Acetobacteraceti)、枯草芽孢杆菌；酵母和真菌如杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)。

适合选择和工程化的生物体能够自养固定CO₂到产物中。这包括光合作用和甲烷生成。乙酸生成，包括三种类型CO₂固定：卡尔文循环、乙酰CoA途径和还原TCA途径也被覆盖。使用二氧化碳作为细胞碳的唯一来源(自养)的能力在几乎所有主要原核生物组中发现。组间CO₂固定途径不同，而且四种目前已知自养途径没有明确的分布模式。参见，如Fuchs,G.1989.AlternativepathwaysofautotrophicCO₂fixation，第365-382页.在H.G.Schlegel,和B.Bowien(编者)，Autotrophicbacteria.Springer-Verlag，Berlin,Germany。还原磷酸戊糖循环(卡尔文-巴舍姆-本森循环)代表了几乎所有需氧自养细菌如蓝细菌中的CO₂固定途径。

优选的是工程蓝细菌如聚球藻或嗜热聚球藻种类生产烷烃。其他优选的生物体包括集胞藻、产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、大肠杆菌或酿酒酵母。其他原核的、古细菌的和真核的宿主细胞也包括在本发明范围内。

在一些方面，由光合生物生产烷烃可以使用在PCT/US2009/035937(2009年3月3日提交)和PCT/US2009/055949(2009年9月3日提交)中描述的组合物、材料和方法进行，其均出于全部目的而通过引用在此全文并入。

感兴趣的碳基产物：烃类和醇类

在本发明的各种实施方式中，可以产生期望的特定链长的烃类和/或醇类，或其混合物。在某些方面中，宿主细胞产生至少一种以下感兴趣的碳基产物：烷烃如庚烷、壬烷、十三烷、十五烷和/或十一烷。在其他方面，碳链长度范围从C₂到C₂₀，例如C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉或C₂₀。因此，本发明提供了适合作为燃料和化学品使用的不同链长的烷烃的生产。

在优选的方面，该方法提供了培养宿主细胞以直接分泌产物来容易地回收而不需要提取生物质。这些感兴趣的碳基产物被直接分泌到培养基中。由于本发明使得能够产生各种不同的确定链长的烃类和醇类，分泌的产物容易回收或分离。因此本发明的产物可以直接使用或者经最小的处理来使用。

燃料组合物

在各个实施方式中，由本发明的方法产生的组合物被作为燃料使用。这样的燃料符合ASTM标准，例如柴油燃料油D975-09b的标准规格，和在ASTM规格D.1655-68中规定的JetA、JetA-1和JetB的标准规格。燃料组合物可能需要混合多种产物以产生均匀的产品。混合过程相对简单，但是确定纳入混合物中的各组分的量要困难的多。因此，燃料组合物可包括芳香烃和/或支链烃，如75％的饱和烃和25％的芳香烃，其中一些饱和烃是支链的而一些饱和烃是环状的。优选地，本发明的方法产生一系列烃，如C₂-C₁₇或C₁₀-C₁₅来改变浊点。而且，组合物可包含用于增强燃料或发动机性能的燃料添加剂。例如，燃料添加剂可用于改变冰点/胶凝点、浊点、润滑性、粘度、氧化稳定性、点火性能、辛烷值和闪点。燃料组合物还可包含，特别是，抗氧化剂、静电消除剂、缓蚀剂、防冰剂、杀生物剂、金属钝化剂和热稳定改良剂。

除本发明的许多环保优势如CO₂转化和可再生资源以外，本文所公开的燃料组合物的其他优势包括低硫含量、低排放、不含或基本不含醇并具有高十六烷值。

实施例1：过表达acrM的大肠杆菌细胞的粗提取物将月桂酰基-CoA 转化为十二醛和将癸酰基-CoA转化为癸醛。

针对大肠杆菌表达，对不动杆菌M-1种的酰基辅酶A还原酶acrM进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark，CA；SEQIDNO.1)合成，在5'端具有NdeI位点和在3'端具有EcoRI位点。通过使用NdeI和EcoRI消化并随后连接来将获得的基因亚克隆至pET28a载体(Novagen)中。将所得含有N-端His6-标记acrM的质粒pET28a-acrM(SEQIDNO.2)转化至购自NewEnglandBiolabs的BL21(DE3)大肠杆菌菌株中，该菌株随后在1L体积中在补充了100μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基中振摇生长至OD₆₀₀＝0.8，之后用0.25mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷在2L摇瓶中在37℃下诱导5小时。图1示出了证明AcrM蛋白质在含有pET28a-acrM的BL21(DE3)大肠杆菌细胞中过表达的SDS-PAGE凝胶。

通过离心收集含有过表达的AcrM的大肠杆菌细胞，以1:3(w/v)比率在HEPES缓冲液(100mMHEPES、10％甘油、pH7.5)中再悬浮，并通过超声裂解。含有100μL总裂解物、1mM酰基-CoA、3mMNADH(Sigma-Aldrich)、100mMHEPES、10％甘油的200μL缓冲溶液在pH7.5下在37℃孵育30分钟，用100μL乙酸乙酯萃取，并通过配有HP-5ms柱(Agilent，SantaClara，CA)的GC/MS进行分析。如图2所示，总离子色谱(TIC)表明检测到在补充的NADH的存在下通过含有AcrM的细胞提取物从相应酰基-CoA底物产生的醛，这表明AcrM能够将月桂酰基-CoA转化为十二醛并将癸酰基-CoA转化为癸醛。

实施例2：对表达adm-carB-entD的聚球藻PCC7002株喂食脂肪酸 导致检测到相应的醛和烷烃。

从耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)PCR扩增羧酸还原酶(carB)基因(SEQIDNO.3)，并通过Genewiz(SouthPlainfield，NJ)进行多引物测序来验证。针对大肠杆菌过表达，对蓝杆藻(Cyanothece)adm、大肠杆菌无前导(leaderless)tesA和大肠杆菌entD基因进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark，CA；SEQIDNO.4和5)合成，在各个基因的前端具有单个核糖体结合位点。将全部四种基因亚克隆至含有氨抑制型P(nir07)启动子(美国专利7,955,820号)、上游/下游同源区域和壮观霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒，pAQ3::P(nir07)-adm-carB-tesA-entD-SpecR(SEQIDNO.6)转化到野生型聚球藻PCC7002种中，并在壮观霉素的存在下进行分离。

通过GC/FID在转化的聚球藻PCC7002种中检测到十三烷和十五烷证实了Adm、CarB、TesA和EntD蛋白质的表达和活性(图3)。

聚球藻PCC7002种培养物生长到OD₇₃₀约为5，之后加入1mM脂肪酸(100mM乙醇储备液)，然后在十五烷上覆层(6mL培养物具有1mL上覆层)不存在(喂食月桂酸)或存在(喂食辛酸和癸酸)的情况下，以150rpm、在37℃振摇约3小时。通过配备有HP-5ms柱的GC/MS分析来自辛酸喂食培养物(图4A和4D)或癸酸培养物(图4B和4E)的十五烷上覆层。对于月桂酸喂食分析，使用400μL己烷通过1分钟涡旋萃取1mL培养物，之后通过GC/MS对其进行分析(图4C、4F)。注意到表达pAQ3::P(nir07)-adm-carB-tesA-entD-SpecR的聚球藻PCC7002株甚至可以在不喂食十二烷酸的情况下产生可检测水平的十一烷。Adm和carB一起能够在体内产生十一烷。

实施例3：表达adm-carB-fatB2-entD的聚球藻PCC7002株导致在 十五烷上覆层中检测到的壬烷增加。

pAQ3::P(nir07)-adm-carB-tesA-entD-SpecR的大肠杆菌无前导tesA被萼距花(Cupheahookeriana)无前导fatB2(中等链酰基-ACP硫酯酶)替代，该fatB2是针对大肠杆菌过表达而进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark、CA；SEQIDNO.7)合成，具有该基因前端的单个核糖体结合位点、5'KpanI限制性位点和3'HindIII限制性位点。将所得质粒pAQ3::P(nir07)-adm-carB-fatB2-entD-SpecR(SEQIDNO.8)转化到野生型聚球藻PCC7002种中，并在壮观霉素的存在下进行分离。

野生型聚球藻PCC7002种和表达pAQ3::P(nir07)-adm-carB-fatB2-entD-SpecR的聚球藻PCC7002种培养物(35mL)在JB3.0培养基(下表A)中生长到OD₇₃₀为约3(在2mM尿素存在下)，之后加入10mL十五烷上覆层。

培养物在150rpm、37℃下连续振摇3天以上。在加入十五烷后12小时(图5A)或72小时(图5B)从各个烧瓶分别取100μL十五烷上覆层样品，并使用配备有20米hp-5ms柱的GC/FID直接进行分析。在表达pAQ3::P(nir07)-adm-carB-fatB2-entD-SpecR的聚球藻PCC7002种培养物中检出壬烷产生增加，但在野生型对照中未检出。还在表达pAQ3::P(nir07)-adm-carB-fatB2-entD-SpecR的聚球藻PCC7002种培养物中检出辛烷和庚烷产生相对增加。Adm、CarB和FatB2一起在体内产生壬烷。如果体内提供更短的脂肪酸，也可以通过Adm-CarB途径产生更短的烷烃。

实施例4：烷烃产生

鉴别并选择编码具有催化烷烃产生的酶活性的一种或多种酶的一种或多种重组基因。酶活性包括：烷烃脱甲酰单加氧酶活性、硫酯酶活性、羧酸还原酶活性、和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性、长链脂肪酸CoA-连接酶活性和/或长链酰基-CoA还原酶活性。这样的基因和酶可以是在表1和表2中描述的那些。

将选出的基因克隆到表达载体中。例如，将adm-carB-entD-fatB或adm-acrM-fadD-fatB(或其同源物的组合)克隆到一个或多个载体中。参见图6。基因可受诱导型控制(如尿素抑制型nir07启动子或cumate诱导型cum02启动子)。基因可以操纵子(operonically)方式表达，也可不通过操纵子方式表达；并且一种或多种基因可被置于组成型控制之下，以使得当诱导其他基因时，该组成型控制之下的基因也表达。例如，可以组成型地表达adm、carB和entD，同时将产生脂肪酸的fatB置于诱导型控制之下；因此当脂肪酸在诱导后由fatB产生时，该途径的其余部分已经存在。

选择一种或多种载体并将其转化到微生物(例如蓝细菌)中。细胞生长到适合的光学密度。在一些情况下，细胞在未诱导的状态下生长到适合的光学密度，然后对其施加诱导信号以开始烷烃产生。

通过转化的细胞产生烷烃。烷烃通常具有7、8、9、10、11或更多个碳原子。在一些情况下，检测到烷烃。在一些情况下，定量烷烃。在一些情况下，收集烷烃。

在一些方面，可以使用硫酯酶如fatB。为测试fatB的下游，随无机碳(例如CO₂)一起向细胞喂食各种不同链长的脂肪酸，并监测烷烃产生。在加入fatB后，向细胞提供无机碳(例如CO₂)，并监测烷烃产生。

实施例5.向表达adm、硫酯酶和carB/entD的聚球藻PCC7002株 喂食癸酸和十二烷酸导致检测到相应的壬烷和十一烷和分泌。

从耻垢分枝杆菌PCR扩增羧酸还原酶(carB)基因(SEQIDNO.18)，并通过Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达，对点形念珠藻adm、加州月桂(Umbellulariacalifornicia)fatB_m(其中下标“m”表示成熟蛋白质，即没有前导序列)和大肠杆菌entD基因进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark，CA；SEQIDNO.19、20和21)合成。将adm基因亚克隆至具有P(cpcB)启动子(美国专利7,794,969号)、上游/下游同源区和红霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ4::P(cpcB)-adm_Npu-ermC(SEQIDNO.22))转化到野生型聚球藻PCC7002株中，并在红霉素的存在下进行分离(这产生ADM株)。将fatB_m、carB和entD基因亚克隆至含P(nir07)启动子、上游/下游同源区和壮观霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ3::P(nir07)-fatB_m-carB-entD-SpecR(SEQIDNO.52))转化到ADM株中，并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离。

将上述最终株的培养物在JB3.0培养基中在37℃、150rpm下，使用2％CO₂，并在15mM尿素的存在下生长至OD₇₃₀约为6。将细胞离心，并在不含尿素的新鲜培养基中再悬浮，过夜生长以使受P(nir07)启动子调控的蛋白质表达。然后将1.5mL十六烷的上覆层加到6mL培养物上，之后向培养物中每2小时喂食0.1mM癸酸或十二烷酸(200mM储备液，溶解于100％乙醇中)。在2小时和4小时，收集0.15mL上覆层(三角形)和0.6mL水性培养物样品(圆圈)，并通过配备有hp-5ms柱的GC/FID进行分析。在喂食癸酸时，壬烷以>2.2mg/L/h的初始速率在体内产生，其中超过90％被分泌到上覆层中(图7A)。在喂食十二烷酸时，十一烷以1.2mg/L/h的初始速率在体内产生，其中～50％在4小时后分泌(图7B)。这表明十一烷产物随时间自发地分泌到细胞外的上覆层中。

实施例6.通过表达adm、硫酯酶和carB/entD的聚球藻PCC7002 株生物合成壬烷和十一烷并分泌。

从耻垢分枝杆菌PCR扩增羧酸还原酶基因(carB)(SEQIDNO.24)，并通过Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达，对点形念珠藻adm、加州月桂fatB_m(其中下标“m”表示成熟蛋白质，即没有前导序列)、萼距花fatB2_m和大肠杆菌entD基因进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark，CA；SEQIDNO.25、26、27和28)合成。将adm基因亚克隆至具有P(cpcB)启动子、上游/下游同源区和红霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ4::P(cpcB)-adm_Npu-ermC(SEQIDNO.22))转化到野生型聚球藻PCC7002株中，并在红霉素的存在下进行分离(其产生ADM株)。将fatB_m、carB和entD基因亚克隆至含P(nir07)启动子、上游/下游同源区和壮观霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ3::P(nir07)-fatB_m-carB-entD-SpecR(SEQIDNO.52))转化到ADM株中，并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离，获得ALK-C11株。将fatB2_m、carB和entD基因亚克隆至含P(nir07)启动子、上游/下游同源区和壮观霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ3::P(nir07)-fatB2_m-carB-entD-SpecR(SEQIDNO.31))转化到ADM株中，并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离，获得ALK-C9株。

将ALK-C9(图8A)和ALK-C11(图8B)在JB3.0培养基中在37℃、150rpm下，使用2％CO₂，并在15mM尿素的存在下生长至OD₇₃₀约为3。将细胞离心，并在不含尿素的新鲜培养基中再悬浮，然后将8mL十六烷上覆层加到32mL培养物上。每天收集0.1mL上覆层并通过配备有hp-5ms柱的GC/FID进行分析。在ALK-C9的上覆层中检出增加量的壬烷(图9，圆圈)，和在ALK-C11的上覆层中检出增加量的十一烷(图9，三角形)。通过ALK-C9和ALK-C11从CO₂连续产生壬烷和十一烷。

实施例7：通过表达adm、tesA(硫酯酶)和carB/entD的聚球藻 PCC7002株生物合成十三烷和十五烷。

从耻垢分枝杆菌PCR扩增羧酸还原酶基因(carB)(SEQIDNO.32)，并通过Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达，对蓝杆藻ATCC51142adm、大肠杆菌tesA_m(其中下标“m”表示成熟蛋白质，即没有前导序列)和大肠杆菌entD基因进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark，CA；分别为SEQIDNO.33和34)合成，在各个基因前端具有单个核糖体结合位点。将全部四种基因亚克隆至含P(nir07)启动子、上游/下游同源区和壮观霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ3::P(nir07)-adm-carB-tesA_m-entD-SpecR(SEQIDNO.35))转化到野生型7002株中，并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离，获得ALK-C13C15株。

将OD730为约0.5的ALK-C13C15在摇瓶中在37℃、150rpm下，使用2％CO₂，并在2mM尿素的存在下在JB3.0培养基中生长。在48小时后，收集0.5mL培养物样品，并在15000rpm下离心5分钟。用丙酮提取细胞团块，并通过配备有hp-5ms柱的GC/FID进行分析。图10。类似处理不表达tesAm、carB或entD蛋白质的对照株，并通过相同方法制备和分析样品。

也在十天的时间内分析ALK-C13C15的生长和烷烃产生。图11示出ALK-C13C15在10天期间的生长曲线。图12示出由ALK-C13C15在10天期间的十三烷和十五烷产生曲线

使用CO₂和日光，在体内通过ALK-C9和ALK-C11连续产生壬烷和十一烷。

实施例8：短链烷烃酶合成的途径。

构建表达adm(烷醛脱甲酰单加氧酶)和导致短链醛形成的途径两者的生物体。这样的醛产生途径的实例在表3中示出。

表3：通过烷醛脱甲酰单加氧酶产生醛并随后转化为烷烃/烯烃的途径。

例如，根据标准基因工程技术对生物体(例如，蓝细菌)进行工程化来表达来自运动发酵单胞菌的Pdc(SEQIDNO:46)和来自点形念珠藻的Adm(SEQIDNO:36)。Pdc多肽将丙酮酸转化为乙醛。Adm多肽将乙醛转化为短链烷烃甲烷。本发明的基因可通过合成方式构建或者通过PCR分离。

或者，通过重组方式由生物体表达酮酸脱羧酶和Adm。酮酸脱羧酶是来自乳酸乳球菌乳酸亚种KF147的KivD(SEQIDNO:43)。或者，酮酸脱羧酶是来自酿酒酵母S288c的ARO10(SEQIDNO:44)。

所得生物体包含共表达adm基因和pdc和/或2-酮酸脱羧酶基因的操纵子。培养细胞，并通过气相色谱分析测量表3中的预期产物的存在。

实施例9：来自点形念珠藻PCC73102的纯化ADM使异戊醛脱甲酰 化并体外形成异丁烷。

由从DNA2.0(MenloPark，CA；SEQIDNO.37)获得的密码子优化基因，通过使用允许引入5'BamHI和3'HindIII限制性位点的引物UN19(5'-CATCACCACAGCCAGGATCCGATGCAGCAACTGACCGATCAAAGCAAAGAACTGGACTTC-3')(SEQIDNO:40)和UN20(5'-CGGCCCGCCAAGCTTTTAGGCACCGATCAGGCCATAGGCGCTCAGACGCATGATATC-3')(SEQIDNO:41)的PCR扩增点形念珠藻PCC73102adm。通过用BamHI和HindIII消化并随后连接，将所得PCR产物插入到大肠杆菌载体pCDF-Duet1(Merck；Darmstadt，Germany)中。将含有N-端His₆-标记的点形念珠藻adm的所得质粒pCDF-npu(SEQIDNO.42)转化到大肠杆菌株BL21(DE3)中，其随后在1L体积中在补充了100μg/mL壮观霉素的Luria-Bertani培养基中振摇生长至OD₆₀₀＝0.8，之后用0.25mMIPTM在2L摇瓶中在37℃下诱导4小时。通过使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen；Valencia，CA)柱的亲和色谱纯化ADM蛋白质，用pH7.5的缓冲溶液洗脱纯化的蛋白质，该缓冲溶液含有100mMHEPES、10％甘油和250mM咪唑。收集的级分的SDS-PAGE凝胶在图13中示出。

纯化的ADM的活性在各种不同的短链醛上测试：异丁醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛，其中3-甲基丁醛(异戊醛)转化为异丁烷；而其他两个未示出可检测地脱甲酰以得到对应烷烃。纯化的ADM的活性还在丁醛、戊醛和异戊醛上测试，如表4所示。分析条件如下：～0.2mM点形念珠藻Adm(N-His₆-标记的)、0.3mM1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐(Sigma-Aldrich；St.Louis，MO)、10mMNADH(Sigma-Aldrich)、10mM醛(250mM储备液，溶于二甲基亚砜中)，在含有100mMHEPES、10％甘油的pH为7.4的缓冲溶液中。每次分析在25℃下运行5分钟，之后立即通过使用20-mHP-5MS柱(AgilentTechnologies；SantaClara，CA)的顶空气相色谱进行分析。柱在40℃下保持3分钟，之后以15℃/min加热到100℃。与购自Sigma-Aldrich的对应标准品相比较，根据保留时间鉴别物质种类。结果在表4中示出。ADM的表达导致每种产物的峰面积增加。

表4：色谱分析结果。

实施例10.通过表达adm、硫酯酶和carB/entD的聚球藻PCC7002 株生物合成十一烷并分泌。

从耻垢分枝杆菌PCR扩增羧酸还原酶基因(carB)(SEQIDNO.47)，并通过Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达，对六组氨酸标记的点形念珠藻adm、加州月桂fatB_m(没有前导序列)和大肠杆菌entD基因进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark，CA；SEQIDNO.48、49和50)合成。将具有N端六组氨酸标签的adm基因亚克隆至具有P(cpcB)启动子、上游/下游同源区和红霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ4::P(cpcB)-Nhistag_adm(Npu)-ErmC(SEQIDNO.51))转化到野生型聚球藻PCC7002株中，并在红霉素的存在下进行分离(其产生ADM株)。将fatB_m、carB和entD基因亚克隆至含P(nir07)启动子、上游/下游同源区和壮观霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ3::P(nir07)-fatB_m-carB-entD-SpecR(SEQIDNO.52))转化到ADM株中，并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离，获得JCC6036株。

将JCC6036在JB3.0培养基中在37℃、150rpm下，使用2％CO₂，并在15mM尿素的存在下生长至OD₇₃₀约为3。将细胞离心，并在含有3mM尿素的新鲜JB3.0培养基中再悬浮，然后将6mL十五烷上覆层加到30mL培养物上。每天收集0.06mL上覆层并通过配有hp-5ms柱的GC/FID进行分析。在JCC6036的上覆层中检出增加量的十一烷(图14)。

实施例11.向表达adm和carB/entD的聚球藻PCC7002株喂食癸酸 导致检测到对应的壬烷和分泌。pAQ3上His标记的Adm显示出明 显更高的体内活性。

从耻垢分枝杆菌PCR扩增羧酸还原酶基因(carB)(SEQIDNO.53)，并通过Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达进行密码子优化的六组氨酸标记的点形念珠藻adm和大肠杆菌entD基因由DNA2.0(MenloPark，CA；SEQIDNO.54和55)合成。将adm基因亚克隆至具有P(cpcB)启动子、pAQ3或pAQ4的上游和下游同源区和壮观霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ3::P(cpcB)-Nhistag_adm(Npu)-SpecR(SEQIDNO.56)和pAQ4::P(cpcB)-Nhistag_adm(Npu)-EmrC(SEQIDNO.57))转化到野生型聚球藻PCC7002株中，并在壮观霉素的存在下进行分离(获得ADM3和ADM4株)。将carB和entD基因亚克隆至含P(nir07)启动子、pAQ7的上游和下游同源区和卡那霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒(pAQ7::P(nir07)-carB-entD-KanR(SEQIDNO.58))转化到ADM3和ADM4株中，并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离(获得ADM3CARB和ADM4CARB株)。

将ADM3CARB和ADM4CARB株在JB3.0培养基中在37℃、150rpm下，使用2％CO₂，并在15mM尿素的存在下生长至OD₇₃₀约为4。将细胞离心，并在不含尿素的新鲜JB3.0培养基中再悬浮，过夜生长以使受P(nir07)启动子调控的蛋白质表达。然后将1.5mL十五烷上覆层加到6mL培养物上，之后在开始时向培养物中喂食4mM癸酸(500mM储备液，溶解于100％乙醇中)。喂食后1小时和2小时处收集0.08mL上覆层并通过配备有hp-5ms柱的GC/FID进行分析。在喂食癸酸时，壬烷以～6mg/L/h的初始速率由ADM3CARB株体内产生(图15)。

已经描述了本发明的大量实施方式。然而，理解可以进行各种各样的改变但不背离本发明的精神和范围。本文中提到的所有公开出版物、专利和其他文献通过引用在此全文并入。

Claims (81)

1.一种工程化微生物，其中所述工程化微生物包含编码一种或多种酶的一种或多种重组核酸序列，所述一种或多种酶具有催化烷烃产生的酶活性，其中所述酶活性包括烷烃脱甲酰单加氧酶活性及

硫酯酶活性、羧酸还原酶活性和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性；

硫酯酶活性、长链脂肪酸CoA-连接酶活性和长链酰基-CoA还原酶活性；和/或

丙酮酸脱羧酶活性和2-酮酸脱羧酶活性。

2.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述酶包括烷烃脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。

3.权利要求2所述的工程化微生物，其中所述烷烃脱甲酰单加氧酶具有EC编号4.1.99.5，所述硫酯酶具有EC编号3.1.2.14，所述羧酸还原酶具有EC编号1.2.99.6，和所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶具有EC编号2.7.8.7。

4.权利要求2所述的工程化微生物，其中所述烷烃脱甲酰单加氧酶由adm编码，所述硫酯酶由tesA、fatB或fatB2编码，所述羧酸还原酶由carB编码，和所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶由entD编码。

5.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述具有烷烃脱甲酰单加氧酶活性的酶具有EC编号4.1.99.5，所述具有硫酯酶活性的酶具有EC编号3.1.2.14，所述具有羧酸还原酶活性的酶具有EC编号1.2.99.6，和所述具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的酶具有EC编号2.7.8.7。

6.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述酶包括烷烃脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、长链脂肪酸CoA-连接酶和长链酰基-CoA还原酶。

7.权利要求6所述的工程化微生物，其中所述烷烃脱甲酰单加氧酶具有EC编号4.1.99.5、所述硫酯酶具有EC编号3.1.2.14、所述长链脂肪酸CoA-连接酶具有EC编号6.2.1.3，和所述长链酰基-CoA还原酶具有EC编号1.2.1.50。

8.权利要求6所述的工程化微生物，其中所述烷烃脱甲酰单加氧酶由adm编码，所述硫酯酶由tesA、fatB或fatB2编码，所述长链脂肪酸CoA-连接酶由fadD编码，和所述长链酰基-CoA还原酶由acrM编码。

9.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述具有烷烃脱甲酰单加氧酶活性的酶具有EC编号4.1.99.5、所述具有硫酯酶活性的酶具有EC编号3.1.2.14、所述具有长链脂肪酸CoA-连接酶活性的酶具有EC编号6.2.1.3，和所述具有长链酰基-CoA还原酶活性的酶具有EC编号1.2.1.50。

10.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催化酰基-ACP转化为脂肪酸的硫酯酶的重组核酸序列。

11.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码使由羧酸还原酶核酸序列编码的蛋白质的ACP部分磷酸泛酰巯基乙胺基化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的重组核酸序列。

12.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催化脂肪酸转化为脂肪醛的羧酸还原酶的重组核酸序列。

13.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催化脂肪醛转化为烷烃或烯烃的烷烃脱甲酰单加氧酶的重组核酸序列。

14.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催化脂肪酸转化为酰基-CoA的脂肪酸CoA-连接酶的重组核酸序列。

15.权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催化酰基-CoA转化为脂肪醛的酰基-CoA还原酶的重组核酸序列。

16.权利要求1-15中任一项所述的工程化微生物，其中所述微生物是细菌。

17.权利要求1-16中任一项所述的工程化微生物，其中所述微生物是革兰氏阴性细菌。

18.权利要求1-17中任一项所述的工程化微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。

19.权利要求1-18中任一项所述的工程化微生物，其中包含所述一种或多种重组核酸序列的操纵子的表达受重组启动子控制，其中所述启动子是组成型或诱导型的，并且任选地，其中adm存在于高拷贝数载体上。

20.权利要求19所述的工程化微生物，其中所述操纵子被整合到所述微生物的基因组中。

21.权利要求19所述的工程化微生物，其中所述操纵子在染色体外。

22.权利要求1-21中任一项所述的工程化微生物，其中所述微生物是光合微生物。

23.权利要求1-22中任一项所述的工程化光合微生物，其中所述微生物是蓝细菌。

24.权利要求1-23中任一项所述的工程化光合微生物，其中所述微生物是耐热性蓝细菌。

25.权利要求1-12中任一项所述的工程化光合微生物，其中所述微生物是聚球藻属(Synechococcus)的种。

26.权利要求1-25中任一项所述的工程化光合微生物，其中所述烷烃的长度少于或等于18个碳原子。

27.权利要求1-26中任一项所述的工程化微生物，其中所述烷烃的长度为2至18个碳原子。

28.权利要求1-27中任一项所述的工程化微生物，其中所述烷烃的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子。

29.权利要求1-28中任一项所述的工程化微生物，其中所述重组核酸序列与表1所示序列至少90％或至少95％相同。

30.一种包含培养基和权利要求1-29中任一项所述微生物的细胞培养物。

31.一种生产烃的方法，其包括：

在培养基中培养权利要求1-29中任一项所述的工程化微生物，其中相对于在相同条件下培养的其他方面相同但缺乏所述重组核酸序列的微生物，所述工程化微生物产生增加量的烷烃。

32.权利要求31所述的方法，其还包括允许烷烃在所述培养基或所述生物体中积累。

33.权利要求31-32中任一项所述的方法，其还包括分离所述烷烃的至少一部分。

34.权利要求1-33中任一项所述的方法，其还包括处理所述分离的烷烃以产生经处理的材料。

35.一种包含烷烃的组合物，其中所述烷烃由权利要求31-34中任一项所述的方法产生。

36.权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的烷烃。

37.一种用于生产烃的方法，其包括：

(i)在培养基中培养权利要求1-29中任一项所述的工程化微生物；和

(ii)使所述工程化微生物暴露于光和无机碳，其中所述暴露导致所述无机碳被所述微生物转化为烷烃，其中所述烷烃以比由在相同条件下培养的其他方面相同但缺乏所述重组核酸序列的微生物产生的量更大的量产生。

38.权利要求37所述的方法，其还包括允许烷烃在所述培养基或所述生物体中积累。

39.权利要求37-38中任一项所述的方法，其还包括分离所述烷烃的至少一部分。

40.权利要求37-39中任一项所述的方法，其还包括处理所述分离的烷烃以产生经处理的材料。

41.一种包含烷烃的组合物，其中所述烷烃由权利要求37-40中任一项所述的方法产生。

42.权利要求41所述的组合物，其中所述组合物包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的烷烃。

43.一种由工程化微生物产生短链烷烃或烯烃的方法，所述方法包括：

a.在所述工程化微生物中表达重组烷醛脱甲酰单加氧酶(“ADM”)；和

b.在有效地产生短链烷烃或烯烃的条件下在含有碳源的培养基中培养所述工程化微生物。

44.权利要求43所述的方法，其中所述ADM催化醛转化为烷烃或烯烃，其中所述醛选自乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、丁醛、3-甲基-1-丁醛和2-苯基乙醛。

45.权利要求43所述的方法，其中所述烷烃或烯烃选自甲烷、丙烷、乙烷、丁烷、丙烷、异丁烷和甲苯。

46.权利要求43所述的方法，其还包括在所述工程化微生物中表达重组丙酮酸脱羧酶(“Pdc”)。

47.权利要求46所述的方法，其中所述Pdc与SEQIDNO:46至少90％相同。

48.权利要求43所述的方法，其还包括在所述工程化微生物中表达2-酮酸脱羧酶。

49.权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述Pdc或所述2-酮酸脱羧酶在受单一启动子控制的操纵子中表达。

50.权利要求49所述的方法，其中所述操纵子包含ADM。

51.权利要求43-50中任一项所述的方法，其中所述ADM与SEQIDNO:36至少90％相同。

52.一种工程化微生物，其中所述工程化微生物包含编码烷醛脱甲酰单加氧酶(“ADM”)的重组基因，并且所述工程化微生物还包含编码选自丙酮酸脱羧酶和2-酮酸脱羧酶的酶的重组基因。

53.权利要求52所述的工程化微生物，其中所述ADM催化醛转化为烷烃或烯烃，其中所述醛选自乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、丁醛、2-甲基-1-丁醛、丁醛、3-甲基-1丁醛和2-苯基乙醛。

54.权利要求53所述的工程化微生物，其中所述烷烃或烯烃选自甲烷、丙烷、乙烷、丁烷、丙烷、异丁烷和甲苯。

55.权利要求52所述的工程化微生物，其还包含重组丙酮酸脱羧酶(“Pdc”)。

56.权利要求55所述的工程化微生物，其中所述Pdc与SEQIDNO:46至少90％相同。

57.权利要求52所述的工程化微生物，其还包含2-酮酸脱羧酶。

58.权利要求55-57中任一项所述的工程化微生物，其中所述Pdc或所述2-酮酸脱羧酶在受单一启动子控制的操纵子中表达。

59.权利要求58所述的工程化微生物，其中所述操纵子包含ADM。

60.权利要求52所述的工程化微生物，其中所述工程化微生物是工程化蓝细菌。

61.权利要求52-60中任一项所述的工程化微生物，其中所述ADM与SEQIDNO:36至少90％相同。

62.一种细胞培养物，其包含重组微生物和含有碳源的培养基，其中当所述重组微生物在有效地表达催化醛转化为烷烃的多肽的条件下在所述培养基中培养时，所述多肽在所述重组微生物中过表达，并且烷烃或烯烃在所述细胞培养物中产生。

63.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述多肽具有烷醛脱甲酰单加氧酶活性。

64.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述醛选自乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、丁醛、3-甲基-1-丁醛和2-苯基乙醛。

65.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃或烯烃选自甲烷、丙烷、乙烷、丁烷、丙烷、异丁烷和甲苯。

66.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃是短链烷烃。

67.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃包含C₂到C₄烷烃。

68.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃包含C₂到C₇烷烃。

69.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃或烯烃被分泌到所述培养基中。

70.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述多肽包含与SEQIDNO:36具有至少90％同一性的氨基酸序列。

71.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述重组微生物还包含包括丙酮酸脱羧酶(“Pdc”)活性的重组多肽。

72.权利要求71所述的细胞培养物，其中所述Pdc与SEQIDNO:46至少90％相同。

73.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述重组微生物还包含重组2-酮酸脱羧酶。

74.权利要求71-73中任一项所述的细胞培养物，其中所述Pdc或所述2-酮酸脱羧酶在受单一启动子控制的操纵子中表达。

75.权利要求74所述的细胞培养物，其中所述操纵子包含ADM。

76.权利要求62所述的细胞培养物，其中所述重组微生物选自酵母、真菌、丝状真菌、藻类和细菌。

77.权利要求76所述的细胞培养物，其中所述细菌是蓝细菌。

78.一种用于生产异丁烷或异丁烷衍生物的方法，其包括在体外将ADM与醛接触。

79.权利要求78所述的方法，其中所述ADM与SEQIDNO:36至少90％相同。

80.权利要求78所述的方法，其中所述ADM是点形念珠藻ADM。

81.权利要求78所述的方法，其中所述醛是3-甲基丁醛。