CN102575265B - 在工程化的微生物中的1-烯烃的生物合成 - Google Patents

Abstract

通过本发明的工程化的微生物和方法合成各种1-烯烃，包括1-十九碳烯和1-十八碳烯。在某些实施方式中，所述微生物包含重组的1-烯烃合成酶。所述工程化的微生物可以是光合微生物，例如蓝细菌。

Description

在工程化的微生物中的1-烯烃的生物合成

相关申请的交叉引用

本发明要求较早于2009年6月22日提交的美国临时专利申请系列号NO.61/219,369的优先权，其公开内容通过引用合并在此。

发明领域

本发明一般地涉及在宿主细胞中生产感兴趣的基于碳的产物中有用的基因。本发明还涉及在光合和非光合生物中通过工程化代谢途径来生产燃料和化学物质的方法。

发明背景

不饱和直链烃例如α-链烯或1-烯烃是工业上重要类型的分子，除了在燃料中使用外，其可以充当润滑剂和表面活性剂。相比化合合成，有机化学物质的生物合成可以提供高效的选择性。因而，存在着对微生物菌株的需求，所述菌株可以产生提高产量的烃类，特别是末端烯烃。

发明概述

本发明涉及代谢系统和在燃料和化学物质的生产中采用这样的系统的方法。各种微生物被遗传工程化来提高1-烯烃合成酶的活性，用于烯烃(也称为链烯)，特别是1-烯烃，包括1-十九碳烯和1-十八碳烯的生产。

本发明提供了分离的多核苷酸，其包含或由选自以下的核酸序列组成：1-烯烃合成酶和/或A1174水解酶的编码序列、这些核酸序列的表达优化的变体以及相关的核酸序列和片段。本发明还提供了包含所述分离的多核苷酸的载体和宿主细胞。

本发明进-步提供了分离的多肽，其包含或由选自以下的多肽序列组成：1-烯烃合成酶基因编码的序列以及相关的多肽序列、片段和融合物。本发明还提供了分离的多肽，其包含或由选自以下的多肽序列组成：A1174水解酶基因编码的序列以及相关的多肽序列、片段和融合物。还提供了特异性结合所述分离的多肽的抗体。

本发明还提供了在宿主细胞中表达异源核酸序列的方法，所述异源核酸序列编码1-烯烃生物合成途径中改善的1-烯烃合成酶活性。

本发明还提供了1-烯烃合成酶活性的编码序列以及相关的核酸序列和片段，所述核酸序列是1-烯烃合成酶活性基因的表达优化的编码序列。同样地，本发明提供了A1174水解酶活性的编码序列和相关的核酸序列和片段。

在此描述的发明提供了基因，其可以是在一系列生物体中过量表达的，并且其编码参与1-烯烃和其他感兴趣的基于碳的产物的合成的酶。基因的过量表达可以与其他基因组合使用，来实现高水平的1-烯烃生产。生物体例如重组的或光合的细菌(例如，蓝细菌)可以被遗传地修饰来优化利用光、水和二氧化碳的1-烯烃的生产。做为选择，微生物可以被工程化来直接或间接地从外源添加的碳底物生产1-烯烃。

在一个实施方式中，本发明提供了分离的或重组的多核苷酸，其包含或由选自以下的核酸序列组成：SEQIDNO：1或SEQIDNO：3；作为SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的简并变体的核酸序列；与SEQIDNO：1或SEQIDNO：3至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的核酸序列；编码具有SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的氨基酸序列的多肽的核酸序列；编码与SEQIDNO：2或SEQIDNO：4至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％相同的多肽的核酸序列；以及在严格条件下与SEQIDNO：1或SEQIDNO：3杂交的核酸序列。

在另一个实施方式中，本发明提供了分离的或重组的前述段落的多核苷酸，其中所述核酸序列编码具有1-烯烃合成酶活性的多肽。在又一个实施方式中，所述分离的或重组的多核苷酸编码具有A1174水解酶活性的多肽。在又一个实施方式中，本发明提供了前述段落的分离的多核苷酸，其中所述核酸序列和感兴趣的序列可操作地连接到一个或更多个表达控制序列。在另一个实施方式中，本发明提供了包含前述段落中的多核苷酸之一的载体。在又一个实施方式中，本发明提供了包含前述段落中描述的重组或分离的多核苷酸的宿主细胞。在相关的实施方式中，所述宿主细胞选自由原核生物、真核生物、酵母菌、丝状真菌、原生动物、藻类和合成的细胞。在又一个实施方式中，所述宿主细胞产生感兴趣的基于碳的产物。在又一个实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段或衍生物，其与前述段落的分离的多肽之一选择性地结合。

本发明还提供了遗传工程化生物体来提高1-烯烃合成酶的表达的方法，包括修饰内源的1-烯烃合成酶的启动子，在所述生物体中重组表达内源的1-烯烃合成酶，或通过提高生物体的内源1-烯烃合成酶的启动子的上游启动子的通读(read-through)，例如，通过除去上游启动子所编码的结构基因。

本发明还提供了鉴定改善微生物的1-烯烃合成的修饰的基因的方法，包括：通过采用合理设计、易错PCR、位点定向诱变、全基因位点饱和诱变、位点定向饱和诱变、基因改组或相关的位点饱和诱变来修饰编码1-烯烃合成酶的基因；在宿主细胞中表达所述修饰的合成酶基因；以及筛选宿主细胞的提高的1-烯烃合成酶活性(例如，测量1-十九碳烯或感兴趣的其他1-烯烃的提高的产量)。在又一个实施方式中，本发明提供了通过前述方法鉴定的改进的酶，其中所述酶的特征在于改善的底物亲和性、底物催化转化比率、改善的热稳定性、在不同pH值下的活性、或为了在宿主细胞中改善的表达的优化的密码子利用。在又一个实施方式中，本发明提供了编码前述的1-烯烃合成酶的核酸，其中所述核酸的特征在于，例如，当在转化的微生物中表达时提高的稳定性和/或提高的表达。

在又一个实施方式中，本发明提供了1-烯烃的生物合成生产的方法，包括：在培养基中培养工程化的微生物，其中所述工程化的微生物包含重组的1-烯烃合成酶，以及其中所述工程化的微生物产生1-烯烃，和其中所述工程化的微生物所产生的所述1-烯烃的量大于在相同条件下培养的、除了缺乏所述重组1-烯烃合成酶以外均相同的微生物所产生的量。在相关的实施方式中，产生的1-十九碳烯的量是除了缺乏所述重组1-烯烃合成酶以外均相同的微生物所产生量的至少两倍、至少三倍、或两倍到十倍之间。在另一个相关的实施方式中，产生的1-十九碳烯的量是至少0.75％细胞干重(“DCW”)。在相关的实施方式中，重组的1-烯烃合成酶是至少部分地从其天然启动子之外的启动子表达的内源1-烯烃合成酶。在又一个相关的实施方式中，重组的1-烯烃合成酶是异源的1-烯烃合成酶。在又一个相关的实施方式中，所述重组的1-烯烃合成酶是从异源启动子表达的。在又一个相关的实施方式中，所述1-烯烃合成酶相对所述微生物是内源的，但是从异源启动子重组地表达。

在生产1-烯烃的方法的另一个实施方式中，所述工程化的微生物是光合微生物，其中将所述工程化的微生物暴露于光和二氧化碳引起所述微生物产生烯烃。在相关的实施方式中，工程化的微生物是蓝细菌。在生产1-烯烃的方法的又一个实施方式中，所述1-烯烃选自由1-十九碳烯和1-十八碳烯。在所述方法的又一个实施方式中，所述1-烯烃分离自所述蓝细菌或所述培养基。在又一个实施方式中，外源的脂肪酸被添加到所述培养基作为所述重组1-烯烃合成酶的底物。

在另一个实施方式中，本发明提供了链烯的生物合成生产的方法，包括(1)在培养基中培养蓝细菌，其中所述蓝细菌具有1-烯烃合成酶活性，以及其中所述培养基包含外源的脂肪酸；以及(2)将所述工程化的蓝细菌暴露于光和二氧化碳，其中所述暴露引起所述蓝细菌生产链烯，以及其中所述产生的链烯的量大于在相同条件下培养、除了不存在所述外源的脂肪酸以外均相同的蓝细菌所产生的量。在相关的实施方式中，所述培养基中外源添加的脂肪酸的浓度是至少1μg/ml。在其他相关的实施方式中，所述浓度是至少10μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少500μg/ml、至少1mg/ml、至少10mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、或至少500mg/ml，或这些浓度的任一两者之间的范围(即，1μg/ml和500mg/ml之间)。在又一个相关的实施方式中，所述脂肪酸是奇碳链脂肪酸，例如，十三烷酸。在又一个相关的实施方式中，所述脂肪酸是十三烷酸，产生的链烯是1-十八碳烯。在又一个相关的实施方式中，产生的所述1-十八碳烯的量是至少0.01％细胞干重(“DCW”)、至少0.039％细胞干重、至少0.05％细胞干重、至少0.1％细胞干重。在又一个相关的实施方式中，产生的所述1-十八碳烯的量在0.3％细胞干重到1％细胞干重之间。在又一个相关的实施方式中，产生的所述1-十八碳烯的％DCW是所述微生物产生的1-十九碳烯的％DCW的至少一半。在又一个相关的实施方式中，所述脂肪酸是偶碳链脂肪酸，产生的链烯是1-十九碳烯。在又一个相关的实施方式中，产生的链烯从所述蓝细菌或所述培养基中分离。

在又一个实施方式中，本发明提供了烯烃的生物合成生产的方法，包括(1)在培养基中培养工程化的微生物，其中所述工程化的微生物包含修饰，其中所述修饰降低了所述蓝细菌天然的A1174水解酶的活性；以及

(2)将所述工程化的微生物暴露于光和二氧化碳，其中所述暴露引起所述工程化的微生物的烯烃生产，其中所述烯烃包含1-烯烃，以及其中所产生的1-烯烃的量大于在相同条件下培养、除了缺乏所述修饰以外均相同的蓝细菌所产生的量。在相关的实施方式中，所述1-烯烃包括1-十九碳烯。在又一个相关的实施方式中，所述微生物是蓝细菌。

在又一个实施方式中，本发明提供了工程化的蓝细菌，其中所述蓝细菌包含A1174水解酶中的突变，其中所述突变降低了所述水解酶的活性。在又一个实施方式中，所述突变是敲除突变，例如，编码A1174水解酶的结构基因的全部或部分的删除。

在又一个实施方式中，本发明提供了用于链烯生产的工程化的细胞，其中所述细胞包含重组的nonA基因，以及其中所述nonA基因编码的蛋白质的活性大于除了缺乏所述重组nonA基因以外均相同的细胞中所述蛋白质的活性。在相关的实施方式中，所述重组的nonA基因是异源基因。在又一个相关的实施方式中，所述重组的nonA基因包含重组启动子。在又一个相关的实施方式中，所述工程化的蓝细菌包含编码A1174水解酶的结构基因的全部或部分的删除。

在又一个实施方式中，本发明提供了工程化的蓝细菌，其中所述蓝细菌包含nonA敲除。

在各种相关的实施方式中，在上文描述的方法和组合物中1-烯烃合成酶至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少80％、或至少95％与SEQIDNO：2、SEQIDNO：8或SEQIDNO：9的1-烯烃合成酶相同。在又其他的实施方式中，所述1-烯烃合成酶与SEQIDNO：2、SEQIDNO：8或SEQIDNO：9的1-烯烃合成酶相同。

在各种相关的实施方式中，上文描述的所述方法和组合物中的微生物是大肠杆菌。在其他相关的实施方式中，所述微生物是聚球蓝细菌属(Synechococcus)的物种。在再其他相关的实施方式中，所述微生物是聚球蓝细菌属物种PCC7002。

与本发明相关的其他信息可以在以下的附图和详细说明中找到。

附图

附图1显示了1-烯烃合成酶YP_001734428(NonA)中存在的结构域的示意图，通过NCBI网站上可用的保守结构域(CD)搜索程序所鉴定的。结构域的缩写：酰基载体蛋白(ACP)；磷酸泛酰巯基乙胺基(PP)；酮合成酶(KS)；酰基转移酶(AT)；酮还原酶(KR)；磺基转移酶(ST)；和硫酯酶(TE)。参考YP_001734428基因序列，结构域位于以下残基处：LuxE结构域：10-557；ACP结构域：598-675；KS结构域：693-1095；AT结构域：1216-1490；KR结构域：1777-1943；ST结构域：2145-2360；TE结构域：2449-2708。

附图2概述了聚酮化合物合成酶(PKS)催化的克莱森缩合。在步骤1中，酰基转移酶(AT)催化特异性延伸剂单元(在这种情况下丙二酰基-CoA)和附着于ACP的泛酰巯基乙胺基基团上的硫醇基团之间的硫酯交换。CoA在这个反应中被置换。所有的ACP为了有活性必需被磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶翻译后修饰。在步骤2中，随着延伸剂单元经历脱羧作用，(聚)酮链从上游ACP转移到KS的活性位点丝氨酸上。在步骤3中，KS上的酯键经历碳负离子的亲核攻击，产生延伸两个碳的聚酮化合物链。

附图3说明了来自硬脂酸、硬脂酰-ACP或硬脂酰-CoA的1-十九碳烯生物合成的推定的机制。AT，酰基转移酶；ACP，酰基载体蛋白；KS，酮合成酶；KR，酮还原酶；ST，磺基转移酶；TE，硫酯酶。

附图4显示了1-十九碳烯的MS裂解模式(左侧)和在JCC138细胞团粒提取物中相应的峰(右侧)。

附图5显示了堆叠形式的GC/FID色谱，容许比较来自标明的蓝细菌菌株的细胞团粒提取物。FID响应轴线上刻度之间的间隔是100,000。^*十九碳二烯与不相关的代谢物在这些条件下共同洗脱。BHT＝丁基化羟基甲苯

附图6显示了堆叠形式的GC/FID层析谱，容许比较与0、2.8或11.2mg十三烷酸孵育的JCC138的丙酮细胞团粒提取物。FID响应轴线上刻度之间的间隔是10,000。^*十九碳二烯与不相关的代谢物在这些条件下共同洗脱。

附图7显示了相对于NIST库中1-十八碳烯光谱(底部质谱)标绘的JCC1381-十八碳烯峰(顶部质谱)的MS片段光谱。

发明详述

除非在此另外定义，与本发明关联使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，单数的术语应当包括复数，复数的术语应当包括单数。一般地，相关使用的命名，以及在此描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域公知和通常使用的。除非另有说明，一般根据本领域公知的常规方法以及如各种一般的和更具体的参考文献所描述的进行上述方法和技术，这些参考文献在整个本说明书中被引证和讨论。参见，例如，Sambrook等人MolecularCloning：ALaboratoryManual，2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates(1992，andSupplementsto2002)；HarlowandLane，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1990)；TaylorandDrickamer，IntroductiontoGlycobiology，OxfordUniv.Press(2003)；WorthingtonEnzymeManual，WorthingtonBiochemicalCorp.，Freehold，N.J.；HandbookofBiochemistry：SectionAProteins，Vol.I，CRCPress(1976)；HandbookofBiochemistry：SectionAProteins，Vol.II，CRCPress(1976)；EssentialsofGlycobiology，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。

除非另有说明，以下术语应当理解为具有以下含义：

术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指长度至少10个碱基的核苷酸的多聚形式。该术语包括DNA分子(例如，cDNA或基因组或合成的DNA)以及RNA分子(例如，mRNA或合成的RNA)，以及含有非天然核苷酸类似物或非天然核苷内键或两者的DNA或RNA的类似物。所述核酸可以处于任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链的、双链的、三链的、四链的、部分双链的、分枝的、发夹形的、环形的或处于挂锁构象。

除非另有陈述以及举例来说，对于根据通式“SEQIDNO：”的在此描述的所有序列，“包含SEQIDNO：1的核酸”是指一种核酸，其至少一部分具有(i)SEQIDNO：1的序列，或(ii)与SEQIDNO：1互补的序列。两者之间的选择由上下文指出。例如，如果核酸被用作探针，两者之间的选择由探针与期望的靶点互补的要求来确定。

“分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合聚合物)是基本上从其天然宿主细胞中天然伴随该天然多核苷酸的其他细胞组分中分离的多核苷酸，例如核糖体、聚合酶和它天然相关的基因组序列。该术语包括(1)从其天然发生环境移出的核酸或多核苷酸，(2)不与多核苷酸(其中“分离的多核苷酸”为天然发现的)的全部或部分相关的核酸或多核苷酸，(3)与天然中不与之连接的多核苷酸可操作连接的核酸或多核苷酸，或(4)不天然存在的核酸或多核苷酸。术语“分离的”或“基本上纯的”还可以用于指代重组或克隆的DNA分离物、化学上合成的多核苷酸类似物、或通过异源系统生物学合成的多核苷酸类似物。

然而，“分离的”不必然需要这样描述的核酸或多核苷酸本身从它的天然环境物理地移出。例如，如果异源序列被放置邻近于内源的核酸序列，从而该内源核酸序列的表达被改变，则生物体的基因组中的内源核酸序列在此被认为是“分离的”。在这方面，异源序列是不天然地邻近于内源核酸序列的序列，无论该异源序列本身是内源的(来自相同的宿主细胞或其子代)还是外源的(来自不同的宿主细胞或其子代)。举例来说，启动子序列可以取代(例如，通过同源重组)宿主细胞的基因组中基因的天然启动子，从而该基因具有改变的基因表达模式。这种基因选择将变为“分离的”，因为它从天然侧翼于它的至少某些序列分离。

如果核酸含有对基因组中相应核酸的非天然发生的任何修饰，则核酸被认为是“分离的”。例如，如果含有人工地(例如通过人工干预)引入的插入、删除或点突变，则内源编码序列被认为是“分离的”。“分离的核酸”还包括在异源位点整合到宿主细胞染色体中的核酸，以及作为游离体存在的核酸构建体。此外，“分离的核酸”当通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞材料或基本上不含培养基，或当化学合成时可以基本上不含化学物质前体或其他化学物质。

术语“重组”是指生物分子，例如，基因或蛋白质，其(1)已经从它的天然发生的环境中移出，(2)不与多核苷酸(其中该基因是天然发现的)的所有或部分相关，(3)与在天然中与之不连接的多核苷酸可操作地连接，或(4)在天然中不存在。术语“重组的”还可以用于指代克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或由异源系统生物学地合成的多核苷酸类似物，以及这样的核酸编码的蛋白质和/或mRNA。例如，“重组1-烯烃合成酶”可以是由异源1-烯烃合成酶基因编码的蛋白质；或由内源的1-烯烃合成酶基因的复制拷贝编码的蛋白质；或由修饰的内源的1-烯烃合成酶基因编码的蛋白质；或由从异源启动子表达的内源的1-烯烃合成酶基因编码的蛋白质；或由内源的1-烯烃合成酶基因编码的蛋白质，其中表达至少部分地由不同于生物体天然的1-烯烃合成酶启动子的异源启动子驱动。

如在此使用的，用语参考核酸序列的“简并变体”涵盖核酸序列，其根据标准遗传密码可以被翻译以提供与从参考序列翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列。术语“简并寡核苷酸”或“简并引物”被用于表示能够与目标核酸序列杂交的寡核苷酸，其不一定在序列上是相同的但是在一个或多个特定片段内是相互相同的。

术语“序列同一性百分比”或“相同的”在核酸序列的上下文中是指当进行最大相应性比对时两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是在至少约九个核苷酸、通常至少约20个核苷酸、更通常地至少约24个核苷酸、一般地至少约28个核苷酸、更一般地至少约32个核苷酸、优选的至少约36个或更多核苷酸的长度上进行。存在着本领域已知的、可以用于测量核苷酸序列同一性的多种不同算法。例如，可以使用FASTA、Gap或Bestfit来比较多核苷酸序列，其是WisconsinPackageVersion10.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，Wis中的程序。FASTA提供了在查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的对准和序列同一性百分比。Pearson，MethodsEnzymol.183：63-98(1990)(其全部通过引用合并在此)。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以使用GCG版本6.1中提供的FASTA用其缺省参数(6的字大小，NOPAM因子用于计分矩阵)，或使用Gap用其缺省参数来测定，通过引用合并在此。做为选择，可以使用计算机程序BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；GishandStates，NatureGenet.3：266-272(1993)；Madden等人，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul等人，NucleicAcidsRes.25：3389-3402(1997)；ZhangandMadden，GenomeRes.7：649-656(1997))、特别是blastp或tblastn(Altschul等人，NucleicAcidsRes.25：3389-3402(1997))来比较序列。

用于序列比较的数学算法的特定的、非限制性实例是Karlin和Altschul的(Proc.Natl.Acad.Sci.(1990)USA87：2264-68；Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：5873-77)，如在Altschul等(J.Mol.Biol.(1990)215：403-10)的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中使用的。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，分值＝100，字长＝12，来获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST多肽检索，分值＝50，字长＝3，来获得与多肽分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的对准，可以利用如Altschul等人(NucleicAcidsResearch(1997)25(17)：3389-3402)中描述的GappedBLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。本领域技术人员还可以使用引入Myers和Miller(Comput.Appl.Biosci.(1988)4：11-17)的非线性算法的ALIGN程序。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，本领域技术人员可以使用PAM120加权残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。

术语″基本上同源″或″基本上相似″当用于核酸或其片段时，表明，如以上讨论的通过任何公知的序列同一性算法，如FASTA、BLAST或Gap所测量的，当具有合适的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)最佳对准时，在至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、优选地至少约90％和更优选的至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基上存在核苷酸序列同一性。

做为选择，当核酸或其片段与另一个核酸、与另一个核酸的链、或与其互补链在严格杂交条件下杂交时，存在很大的同源性或相似性。在核酸杂交实验的上下文中的“严格杂交条件”和“严格洗涤条件”取决于多种不同的物理参数。核酸杂交将受到这些条件的影响，如盐浓度、温度、溶剂、杂交物质的碱基组成、互补区域的长度、杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数量，这是本领域技术人员容易理解的。具有本领域普通技术的人员将知道如何改变这些参数来实现特定的杂交严格度。

一般地，“严格杂交”在特定的条件组合下在低于特定DNA杂交的热熔点(Tm)约25℃下进行。“严格洗涤”在特定的条件组合下在低于特定DNA杂交的热熔点(Tm)约5℃的温度下进行。T_m是50％的目标序列与完全匹配的探针杂交的温度。参见Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)，page9.51，通过引用合并在此。为此，“严格杂交”被定义为液相杂交，如在6XSSC(其中20XSSC含有3.0MNaCl和0.3M柠檬酸钠)、1％SDS中在65℃8-12小时、随后在0.2XSSC、0.1％SDS中在65℃20分钟两次洗涤的水性杂交(即，没有甲酰胺)。技术人员要理解的是，取决于许多因素，包括杂交的序列的长度和同一性白分比，在65℃下杂交将以不同的速度发生。

严格杂交条件的优选的、非限制性实例包括在4x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、约65-70℃下杂交(或在4xSSC加50％甲酰胺中在约42-50℃下杂交)，随后在1×SSC、约65-70℃下一次或更多次洗涤。高度严格杂交条件的优选的、非限制性实例包括在1×SSC、约65-70℃下杂交(或在1×SSC加50％甲酰胺中在约42-50℃下杂交)，随后在0.3×SSC、约65-70℃下一次或更多次洗涤。降低的严格杂交条件的优选的、非限制性实例包括在4×SSC、约50-60℃下杂交(或作为选择在6×SSC加50％甲酰胺在约40-45℃下杂交)，随后在2×SSC、约50-60℃下一次或更多次洗涤。中间范围，例如，在65-70℃或在42-50℃也在本发明的范围内。SSPE(1xSSPE是0.15MNaCl、10mMNaH2PO4和1.25mMEDTA，pH7.4)可以替代杂交中的SSC(1xSSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)和洗涤缓冲液；在每次杂交完成之后进行洗涤15分钟。对于预期长度小于50个碱基对的杂交物的杂交温度应当低于杂交物的熔解温度(T_m)5-10℃，其中T_m根据以下公式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交物，T_m(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度18到49个碱基对之间的杂交物，T_m(℃)＝81.5+16.6(log10[Na⁺])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交物中碱基的数量，[Na⁺]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1×SSC的[Na⁺]＝0.165M)。

熟练的技术人员了解的是，一些试剂可以添加到杂交和/或洗涤缓冲液中。例如，为了降低核酸分子与例如硝化纤维或尼龙膜的非特异性杂交，可以使用封闭试剂，包括但不限于BSA或鲑鱼或鲱鱼精子载体DNA，和/或洗涤剂，包括但不限于SDS、螯合剂EDTA、Ficoll、PVP等等。当使用尼龙膜时，特别地，严格杂交条件的另外的非限制性实例是在0.25-0.5MNaH₂PO₄、7％SDS中在约65℃杂交，随后在0.02MNaH₂PO₄、1％SDS中在65℃一次或更多次洗涤(ChurchandGilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：1991-1995)，或作为选择在0.2xSSC、1％SDS中一次或更多次洗涤。

核酸(也称为多核苷酸)还包括RNA的有义和反义链、cDNA、基因组DNA和合成的形式，以及上述的混合的聚合物。它们可以被化学地或生物化学地修饰，或可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，这是技术人员容易理解的。这样的修饰包括，例如，标记物、甲基化、一个或更多个天然发生的核苷酸用类似物取代、核苷内修饰，例如不带电的连键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯，等等)、带电的连键((例如，硫代磷酯、二硫代磷酸酯，等等)、悬挂的部分(例如，多肽)、嵌入物(例如，吖啶、补骨脂素，等等)、螯合剂、烷化剂和修饰的连键(例如，α异头核酸，等等)。还包括的是模拟多核苷酸通过氢键键合和其他化学相互作用结合指定序列的能力的合成的分子。这样的分子是本领域已知的，包括，例如，其中肽键替代分子主干中的磷酸连键的那些。其他修饰可以包括，例如，在其中核糖环含有桥接部分或其他结构，例如，在“锁定”核酸中存在的修饰的类似物。

术语“突变的”当应用于核酸序列时是指核酸序列中的核苷酸与参考核酸序列相比可以被插入、删除或改变。可以在基因座上进行单个改变(点突变)，或可以在单个基因座上插入、删除或改变多个核苷酸。此外，可以在核酸序列内任何数量的基因座上进行一个或多个改变。通过本领域已知的任何方法核酸序列可以被突变，包括但不限于诱变技术，如“易错PCR”(在DNA聚合酶的复制精确度低的条件下进行PCR的过程，从而在PCR产物的整个长度上获得高比率的点突变，参见，例如Leung等人，Technique，1：11-15(1989)andCaldwellandJoyce，PCRMethodsApplic.2：28-33(1992))；和“寡核苷酸定向的诱变”(允许在感兴趣的任何克隆DNA片段中产生位点特异性突变的过程；参见，例如Reidhaar-OlsonandSauer，Science241：53-57(1988))。

术语“衍生自”意图包括多核苷酸片段从指定来源的分离(完全地或部分地)。该术语意图包括，例如，基于或来自与指定多核苷酸来源相关的序列的直接克隆、PCR扩增或人工合成。

如在此使用的术语“基因”是指核苷酸序列，其可以直接合成酶或其他多肽分子(例如，可以包含编码序列，例如，编码多肽的连续的开放阅读框(ORF))或本身可以是在生物体中有功能的。生物体中的基因可以在操纵子内簇聚，如在此定义的，其中操纵子被基因间的DNA与其他基因和/或操纵子分隔。操纵子内含有的单个的基因可以重叠，但不包括在单个基因之间的基因间隔区DNA。

如在此描述，“分离的基因”包括一种基因，其基本上没有在衍生出该基因的生物体的染色体DNA中天然地侧翼于该基因的序列(即，没有编码第二种或独特多肽或RNA分子的邻近编码序列、邻近结构序列等等)，并任选地包括5′和3′调节序列，例如，启动子序列和/或终止子序列。在一个实施方式中，分离的基因包括多肽的主要编码序列。

当与核苷酸序列的转录作用和/或翻译相关地使用时，在此使用的术语“表达”一般地包括被增强、提高、产生宿主细胞中基础或持家(housekeeping)水平、组成型、减弱、降低或抑制的核苷酸序列表达水平。

在此使用的术语“减弱”一般是指对基因序列或控制基因序列的转录的序列进行的功能性删除，包括突变、部分或完全删除、插入或其他改变，其降低或抑制基因产物的产生，或使得基因产物无功能。在某些情况下，功能性删除被描述为敲除突变。减弱还包括通过改变核酸序列、将基因放置在较低活性启动子的控制下，减量调节，表达靶向感兴趣基因的干扰RNA、核酶或反义序列，或通过本领域已知的任何其他技术的氨基酸序列改变。在一个实例中，特定的酶对于不是产物或反应物的成分所引起的反馈抑制或抑制作用的敏感性(非途径特异性反馈)被减小，从而酶活性不受到化合物存在的影响。在其他情况中，被改变为较低活性的酶可以称为减弱的。

“删除”是从核酸分子中除去一个或更多个核苷酸，或从蛋白质中除去一个或更多个氨基酸，位于两侧的区域被连接在一起。

“敲除”是一种基因，它的表达或活性的水平被降低为零。在某些实例中，基因通过其编码序列的一些或全部的删除来敲除。在其他实例中，基因通过一个或更多个核苷酸向其开放阅读框中的引入而被敲除，这引起无义的或无功能的蛋白质产物的翻译。

术语“密码子利用”意图指分析要在接受者宿主生物体(或其非细胞提取物)中表达的核酸序列中偏爱的密码子的出现和使用，宿主生物体有益地转录所述密码子用于最佳的核酸序列转录作用。接受者宿主可以用任何偏爱的密码子重组地改变。做为选择，可以选择已经具有优越的密码子利用率的特定的细胞宿主，或者核酸序列可以遗传工程化来将限制性密码子改变为非限制性密码子(例如，通过导入沉默突变)。

如在此使用的，术语“载体”是指能够转运与之连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，是指在其中可以连接其他DNA片段的环状双链DNA环。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)、fosmid、噬菌体和噬菌粒。另一种载体是病毒载体，其中其他DNA片段可以连接到病毒基因组中(以下更详细地讨论)。某些载体能够在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点载体)。其他载体可以在导入宿主细胞中时被整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这些载体在此被称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。

如在此使用的“表达优化”被定义为对启动子和终止子元件中核苷酸序列的一个或更多个任选的修饰，引起产生所述核苷酸序列编码的蛋白质产物的期望比率和水平的转录与翻译。在此使用的表达优化还包括设计信使核糖核酸(mRNA)序列的有效的预测的二级结构(例如，茎-环结构和终止序列)来促进期望水平的蛋白质生产。可以使用对于蛋白质的生产必不可少的其他基因和基因组合，例如，生物合成途径中的、翻译后修饰所需的、杂多聚蛋白质所需的蛋白质的基因，其中为了期望水平的蛋白质产物的优化表达的效果选择基因的组合。反之，一个或更多个基因任选地可以被“敲除”或改变，从而所述基因的降低或消除的表达实现了期望的蛋白质表达水平。另外，表达优化可以通过密码子优化来实现。如在此使用的，密码子优化被定义为为了转移核糖核酸(tRNA)的相对浓度方面宿主细胞偏爱的有效利用而修饰核苷酸序列，从而实现到最终蛋白质产物的期望比例和水平的基因核苷酸序列翻译，而不改变所述核苷酸序列所编码的肽序列。

如在此使用的术语“表达控制序列”是指多核苷酸序列，其是影响与它们可操作连接的编码序列的表达所需的。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后翻译事件和翻译的序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效力的序列(例如，核糖体结合位点)；提高蛋白质稳定性的序列；和当期望时，提高蛋白质分泌的序列。这些控制序列的性质取决于宿主生物体而不同，在原核生物中，这些控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意图包括，至少，其存在对于表达是必需的所有组件，还可以包括其存在是有益的其他组件，例如，前导序列和融合配体序列。

“可操作地连接的”或“可操作连接的”表达控制序列是指一种连接，其中表达控制序列与感兴趣的基因是连续的以控制感兴趣的基因，以及以反式或以一定距离控制感兴趣基因的表达控制序列。

如在此使用的，术语“重新宿主细胞(或简称“宿主细胞”)意图指已经导入重组载体的细胞。要理解的是，这种术语不仅仅意图指特定的接受细胞，还指这种细胞的子代。由于突变或环境影响在继承的一代中可能出现某些改变，实际上，这种子代可能不与亲本细胞完全相同，但仍然被包括在此处使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或可以是存在于活组织或生物体中的细胞。

如在此使用的术语“肽”是指短的多肽，例如，一般长度低于约50个氨基酸、更特别地长度低于约30个氨基酸的肽。在此使用的术语涵盖类似物和模拟物，其模拟了结构和因而模拟了生物学功能。

术语“多肽”涵盖天然发生的和非天然发生的蛋白和其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的或聚合的。进一步的，多肽可以包含多个不同的结构域，每个结构域具有一种或多种不同的活性。

术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是一种蛋白或多肽，它的衍化的起源或来源(1)不与在其天然状况中伴随它的天然相关成分相关，(2)以天然中不存在的纯度存在，该纯度可以根据其他细胞材料的存在来判断(例如，没有来自相同物种的其他蛋白)，(3)被来自不同物种的细胞表达，或(4)在天然中不存在(例如，它是在天然中发现的多肽的片段，或它包括天然中不存在的氨基酸类似物或衍生物或除标准肽键之外的连键)。因而，化学合成的或在不同于它天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是从它天然相关成分“分离的”。通过使用本领域公知的蛋白纯化技术分离，多肽或蛋白也可以变为基本上没有天然相关的成分。如这样定义的，“分离的”不一定需要这样描述的蛋白、多肽、肽或寡肽物理上从它的天然环境移出。

分离的或纯化的多肽或其生物学活性部分基本上不含来自衍生该多肽的表达宿主细胞的细胞材料或其他污染多肽，或当化学合成时基本上不含化学物质前体或其他化学物质。在一个实施方式中，分离的或纯化的多肽具有低于约30％(按照干重)的污染多肽或化学物质，更有益地低于约20％的污染多肽或化学物质，再更有益地低于约10％的污染多肽或化学物质，以及最有益地低于约5％的污染多肽或化学物质。

在此使用的术语“多肽片段”是指与全长多肽相比具有删除(例如氨基末端和/或羧基末端缺失)的多肽。在优选的实施方式中，多肽片段是连续的序列，其中该片段的氨基酸序列与天然发生的序列中的相应位置相同。片段一般是长度至少5、6、7、8、9或10个氨基酸，优选的长度至少12、14、16或18个氨基酸，更优选的长度至少20个氨基酸，更优选的至少25、30、35、40或45个氨基酸，再更优选的长度至少50或60个氨基酸，以及再更优选的长度至少70个氨基酸。

“修饰的衍生物”是指多肽或其片段，其在初级结构序列上是基本上同源的，但其包括，例如体内或体外的化学和生物化学修饰，或者其包括在天然多肽中不存在的氨基酸。这种修饰包括，例如，乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记，例如用放射性核素，各种酶修饰，这将是本领域技术人员容易理解的。标记多肽的各种方法以及用于这种目的的取代基或标记物是本领域公知的，包括放射性同位素，例如¹²⁵I、³²P、³⁵S和³H，结合标记的抗配体(antiligand)(例如，抗体)的配体，荧光基团，化学发光试剂，酶，和可以充当标记的配体的特异性结合配对成员的抗配体。标记物的选择取决于需要的敏感性、与引物结合的容易度、稳定性需求和可用的检测设备。标记多肽的方法是本领域公知的。参见，例如，Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates(1992，andSupplementsto2002)(通过引用合并在此)。

术语“热的稳定性”和“热稳定性”可互换地使用，是指在至少约20℃、优选的至少约25℃到35℃、更优选的约37℃或更高、更优选的约50℃或更高再更优选的至少约60℃或更高温度展现催化反应的能力的酶的能力(例如，无论是在细胞中表达的、在细胞提取物中存在的、细胞溶解产物、或处于纯化或部分纯化的形式)。

术语“嵌合的”是指表达的或翻译的多肽，其中特定的同源或非同源蛋白质的结构域或亚基被遗传工程化，以在另一个同源的或非同源的蛋白质的核苷酸和氨基酸序列中共同线性地被转录、翻译和/或表达。

术语“融合蛋白”是指包含与异源氨基酸序列连接的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因为它们可以被构建以含有来自两种或多种不同蛋白的两种或多种期望的功能元件。融合蛋白包含来自目标多肽的至少10个连续氨基酸，更优选的至少20或30个氨基酸，再更优选的至少40、50或60个氨基酸，又更优选的至少75、100或125个氨基酸。包括蛋白质的整体的融合物具有特别的实用性。在融合蛋白内包括的异源多肽是长度至少6个氨基酸，通常长度至少8个氨基酸，有用地长度至少15、20和25个氨基酸。包括更大的多肽，例如，IgGFc区域，以及甚至整个蛋白质，例如，含绿色荧光蛋白(“GFP”)发色团的蛋白质的融合物具有特别的实用性。通过构建核酸序列，所述核酸序列编码多肽或其片段，与编码不同蛋白或肽的核酸序列处于读码框内，然后表达融合蛋白，可以重组地产生融合蛋白。做为选择，融合蛋白可以通过将多肽或其片段交联到另一个蛋白来化学地产生。

如在此使用的，术语“原体(protomer)”是指形成更大的寡聚蛋白质结构的亚基的氨基酸的多聚形式。寡聚结构的原体可以是相同的或不相同的。原体可以组合来形成寡聚的亚基，其可以进一步与其他相同的或不相同的原体组合来形成更大的寡聚蛋白质。

如在此使用的，术语“抗体”是指一种多肽，其至少一部分由至少一种免疫球蛋白基因或其片段编码，其可以与期望的目标分子特异性结合。该术语包括天然发生的形式，以及片段和衍生物。

在术语“抗体”的范围内的片段包括通过用各种蛋白酶消化产生的那些，通过化学裂解和/或化学解离产生的那些，以及重组地产生的那些，只要该片段保持了能与目标分子特异性结合。这样的片段有Fab、Fab′、Fv、F(ab′)₂和单链Fv(scFv)片段。

“衍生物”，在该术语的范围内包括抗体(或其片段)，其在序列上被修饰但仍然能够特异性结合目标分子，包括：种间嵌合的和人源化抗体；抗体融合物；异聚抗体复合物和抗体融合物，例如双抗体(双特异性抗体)、单链双抗体和内抗体(intrabodies)(参见，例如，IntracellularAntibodies：ResearchandDiseaseApplications(1998)Marasco，ed.，Springer-VerlagNewYork，Inc.)，其全部公开内容通过引用合并在此)。

如在此使用的，抗体可以通过任何已知的技术产生，包括从天然B淋巴细胞的细胞培养物收获、从杂交瘤的培养物、重组表达系统和噬菌体展示收获。

术语“非肽类似物”是指具有类似于参考多肽的性质的性质的化合物。非肽化合物也可以称为“肽模拟物”或“拟肽”。参见，例如，Jones，AminoAcidandPeptideSynthesis，OxfordUniversityPress(1992)；Jung，CombinatorialPeptideandNonpeptideLibraries：AHandbook，JohnWiley(1997)；Bodanszky等人，PeptideChemistry--APracticalTextbook，SpringerVerlag(1993)；SyntheticPeptides：AUsersGuide，(Grant，ed.，W.H.FreemanandCo.，1992)；Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)；Fauchere，J.Adv.DrugRes.15：29(1986)；VeberandFreidinger，TrendsNeurosci.，8：392-396(1985)；和上述每一个中引用的参考文献，通过引用合并在此。这种化合物通常借助计算机化的分子建模来开发。结构上类似于有用肽的肽模拟物可以用于产生等同的效果，并因而预想是本发明的一部分。

“多肽突变体”或“突变肽(mutein)”是指一种多肽，与天然的或野生型蛋白质的氨基酸序列相比，它的序列含有一个或更多个氨基酸的插入物、重复、删除、重排或取代。突变肽可以具有在天然发生的蛋白质的序列中的一个或更多个氨基酸点取代(其中在一位置的单个氨基酸被改变为另一个氨基酸)，一个或更多个插入和/或删除(其中一个或更多个氨基酸分别被插入或删除)，和/或在氨基或羧基末端之一或两者中氨基酸序列的截短。与天然发生的蛋白质相比，突变肽可以具有相同的，但优选不同的生物学活性。

突变肽与它的野生型对应物具有至少85％的总体序列同源性。再更优选的是，突变肽具有与它的野生型蛋白质至少90％的总体序列同源性。在

再更优选的实施方式中，突变肽展现了至少95％的序列同一性、再更优选的98％、再更优选的99％以及再更优选的99.9％的总体序列同一性。

序列同源性可以通过任何通用的序列分析算法来测量，例如，Gap或Bestfit。

氨基酸取代可以包括(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性或酶活性，和(5)赋予或修改这样的类似物的其他物理化学或功能性质的那些。

如在此使用的，二十种常规的氨基酸和它们的缩写按照常规使用。参见Immunology-ASynthesis(GolubandGreneds.，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.，2^nded.1991)，通过引用将它合并在此。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-，α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸和其他非常规氨基酸也可以是多肽的适合的组件。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、-N，N，N-三甲基赖氨酸、-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在此处使用的多肽符号中，根据标准的使用和惯例，左侧末端相应于氨基末端，右侧末端相应于羧基末端。

如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二蛋白质的核酸序列相似的序列，则蛋白质具有与第二蛋白质的“同源性”或“同源”于第二蛋白质。做为选择，如果两种蛋白质具有“相似的”氨基酸序列，则蛋白质具有与第二蛋白质的同源性。(因而，术语“同源蛋白质”被定义为是指两种蛋白质具有相似的氨基酸序列。)如在此使用的，氨基酸序列的两个区域之间的同源性(特别是对于预测的结构相似性)被解释为意味着功能上的相似性。

当针对蛋白或肽使用“同源”时，公认的是不相同的残基位置通常差异是保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是一种替换，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一种氨基酸残基替换。一般地，保守性氨基酸替换将基本上不改变蛋白的功能性质。当两种或多种氨基酸序列通过保守性替换相互不同时，序列同一性百分比或同源性程度可以被调高以修正替换的保守性性质。进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。参见，例如，Pearson，1994，MethodsMol.Biol.24：307-331and25：365-389(通过引用合并在此)。

以下的六组各自包含相互是保守性替换的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

多肽的序列同源性，其也被称为序列同一性百分比，一般使用序列分析软件来测量。参见，例如，910UniversityAvenue，Madison，Wis.53705的威斯康星大学生物技术中心遗传计算机小组(GCG)的序列分析软件包。蛋白质分析软件利用分配给各种取代、删除和其他修饰，包括保守性氨基酸替换的同源性的度量来匹配相似的序列。例如，GCG含有程序如“Gap”和“Bestfit”，其可以与缺省参数使用来确定紧密相关的多肽，例如来自不同物种的生物体的同源多肽之间、或野生型蛋白和其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCGVersion6.1。

当比较特定多肽序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库时，优选的算法是计算机程序BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；GishandStates，NatureGenet.3：266-272(1993)；Madden等人，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul等人，NucleicAcidsRes.25：3389-3402(1997)；ZhangandMadden，GenomeRes.7：649-656(1997))、特别是blastp或tblastn(Altschul等人，NucleicAcidsRes.25：3389-3402(1997))。

BLASTp的优选的参数是：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；打开缺口的代价：11(默认)；延伸缺口的代价：1(默认)；最大比对：100(默认)；字大小：11(默认)；描述的NO.：100(默认)；罚分矩阵：BLOWSUM62。

同源性比较的多肽序列的长度一般是至少约16个氨基酸残基、通常至少约20个残基、更通常地至少约24个残基、一般地至少约28个残基、以及优选的超过约35个残基。当搜索含有来自许多不同生物体的序列的数据库时，优选的是比较氨基酸序列。使用氨基酸序列的数据库检索可以通过本领域已知的除了blastp之外的算法来衡量。例如，多肽序列可以使用GCGVersion6.1中的程序FASTA来比较。FASTA提供了在查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的对准和序列同一性百分比。(Pearson，MethodsEnzymol.183：63-98(1990)通过引用合并在此)。例如，氨基酸序列之间的序列同一性百分比可以使用GCG版本6.1中提供的FASTA用其默认参数(2的字大小，PAM250计分矩阵)来确定，通过引用合并在此。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，根据最优的比较目的对序列进行对准，以及，如有必要，为了与第二氨基酸或核酸序列的最佳对准，可以在第一氨基酸或核酸序列中引入缺口。当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在这个位置相同。两个序列之间的同一性百分比是所评估的序列共有的相同的位置数目的函数，例如，通过计算相同位置的数量/位置的总数×100。序列对准的其他评估可以包括考虑了产生最佳对准所需的缺口数量与缺口大小的数字性罚分。

“特异性结合”是指两种分子优先于结合环境中的其他分子相互结合的能力。一般地，“特异性结合”在反应中区别于偶然的结合达至少两倍、更一般地至少10倍、通常至少100倍。一般地，特异性结合反应的亲和性或亲合力如通过离解常数定量的，是约10^-7M或更强(例如，约10^-8M、10^-9M或更强)。

在此使用的术语“区域”是指生物分子的一级结构的物理连续部分。对于蛋白质来说，区域由该蛋白质的氨基酸序列的连续部分来定义。

在此使用的术语“结构域”是指生物分子的结构，其对生物分子的已知的或怀疑的功能有贡献。结构域可以与区域或其部分共同扩展；结构域也可以包括生物分子的不同的、非连续的区域。蛋白质结构域的实例包括但不限于，Ig结构域、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。

如在此使用的，术语“分子”是指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂质，等等，这样的化合物可以是天然的或是合成的。

如在此使用的术语“底物亲和性”是指对底物结合动力学，K_m，米-曼氏常数，如本领域技术人员所理解的。更特别地，对于在此描述发明来说，K_m被优化高于内源的活性。

如在此使用的，术语“糖”是指从光、二氧化碳和水内源地产生的任何碳水化物，内源地产生的任何碳水化物，和/或来自任何外源的碳源例如生物质的任何碳水化物，包括糖分子或这样的糖分子的集合或来源。

如在此使用的，术语“碳源”是指二氧化碳、外源的糖类或生物质。

“感兴趣的基于碳的产物”包括醇，例如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯；烃类和烷烃，例如丙烷、辛烷、柴油、JetPropellant8(JP8)；聚合物，例如1-十九碳烯、对酞酸盐、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、多元醇、多羟基链烷酸酯(PHA)、聚-β-羟基丁酸(PHB)、丙烯酸酯、己二酸、ε己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶；商品化学物质例如乳酸盐、二十二碳六烯酸(DHA)、3羟基丙酸、γ-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天冬氨酸盐、天冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、Ω-3DHA、番茄红素、衣康酸盐、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、3-羟基丙酸(HPA)、乳酸、THF、γ丁内酯、吡咯烷酮、羟基丁酸、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸；特殊化学物质例如类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸；药物和药物中间体例如7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)/头孢菌素、红霉素(crythromycin)、聚酮化合物、他汀类、紫杉醇、多西他赛、萜烯、肽、类固醇、Ω脂肪酸、链烯、烯烃和其他这样的适合的感兴趣产物。这样的产物在生物燃料、工业和特殊化学的情境中、作为用于产生其他产品的中间物(例如，营养增补剂、健康食品、聚合物、石蜡替代物、个人护理产品和药物)是有用的。

如在此使用的“生物燃料”是来自生物学来源的任何燃料。“燃料”是指一种或更多种烃类(例如，1-烯烃)、一种或更多种醇、一种或更多种脂肪酸酯或其混合物。优选地，使用液体烃类。

如在此使用的，术语“烃类”一般指由元素碳(C)、氢(H)和任选的氧(O)组成的化合物。基本上存在三种类型的烃类，例如，芳香烃类、饱和烃类和不饱和烃类，例如，烯烃、炔烃和二烯。该术语还包括燃料、生物燃料、塑料、蜡、溶剂和油。烃类涵盖生物燃料，以及塑料、蜡、溶剂和油。

聚酮化合物合成酶是产生聚酮化合物的酶或酶复合物，聚酮化合物是在细菌、真菌、植物和动物中次级代谢产物的一大类。在此描述的发明提供了重组1-烯烃合成酶基因，其与I型聚酮化合物合成酶相关。如在此使用的，“1-烯烃合成酶”是一种酶，其(1)包含同源于或相同于附图1中确定的每种结构域的区域，或它的BLAST比对覆盖了YP_001734428.1的长度的90％并具有与YP_001734428.1的氨基酸序列至少50％的同一性的区域，YP_001734428.1即，聚球蓝细菌属物种PCC7002的1-烯烃合成酶(SEQIDNO：2)；和(2)催化1-烯烃的合成。1-烯烃合成酶在此还称为NonA；相应的基因可以称为nonA。

示范性的1-烯烃合成酶是聚球蓝细菌属物种PCC7002的1-烯烃合成酶(SEQIDNO：2)。编码1-烯烃合成酶的示范性的基因是聚球蓝细菌属物种PCC7002的nonA基因(SEQIDNO：2)。其他示范性的1-烯烃合成酶是来自蓝丝菌属物种(Cyanothecesp.)PCC7424的YP_002377174.1(SEQIDNO：8)和来自蓝丝菌属物种PCC7822的ZP_03153601.1(SEQIDNO：9)。这些基因的氨基酸序列与2010年6月22日在NCBI数据库中出现，通过引用合并在此。本发明还提供了1-烯烃合成酶(其与SEQIDNO：2至少95％相同，或与YP_002377174.1(SEQIDNO：8)至少95％相同或与ZP_03153601.1(SEQIDNO：9)至少95％相同)，还有表达编码这些1-烯烃合成酶的基因的工程化的微生物，以及通过培养这些微生物生产1-烯烃的方法。

本发明还提供了分离的或重组的A1174水解酶基因，其是指编码具有一氨基酸序列的水解酶的基因，所述氨基酸序列与聚球蓝细菌属物种PCC7002的YP_001734429.1水解酶(SEQIDNO：4)至少95％相同。

BLASTp的优选的参数是：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；打开缺口的代价：11(默认)；延伸缺口的代价：1(默认)；最大比对：100(默认)；字大小：11(默认)；描述的NO.：100(默认)；罚分矩阵：BLOWSUM62。

如在此使用的术语“分解代谢的”和“分解代谢”是指大分子到较小的分子的分子分解或降解的过程。分解代谢的或分解代谢是指特定的反应途径，其中分子分解通过单个或多个催化成分或通过一般的完整细胞过程发生，其中分子分解利用超过一种特定的反应途径和多种催化成分发生。

如在此使用的术语“合成代谢的”和“合成代谢”是指小分子到更大的分子的化学构建的过程。合成代谢的是指特定的反应途径，其中分子构建通过单个或多个催化成分或通过一般的完整细胞过程发生，其中分子构建利用超过一种特定的反应途径和多个催化成分发生。

如在此使用的，“相关的饱和诱变”中的术语“相关的”是指在多肽的两个或更多个位置上改变氨基酸类型，来实现不同于进行改变的多肽的结构或功能性质的改变的功能或结构性质。

除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明相关技术领域的一个普通技术人员通常所理解的相同含义。以下描述了示范性的方法和材料，然而与在此描述的那些相似或等同的方法和材料也可以使用，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。在此提及的所有公开物和其他参考文件通过引用完全合并在此。在冲突的情况下，当前的说明书，包括定义，是支配性的。材料、方法和实施例仅是说明性的，而不意图是限制性的。

在本说明书和权利要求书中，词语“包含”或变形如“包括”或“含有”将被理解为蕴涵包括声称的整体或整体的组，而不排除任何其他的整体或整体的组。

核酸序列

蓝细菌聚球蓝细菌属物种PCC7002(以前的Agmenellumquadruplicatum)已经显示了产生线性的α烯烃1-十九碳烯(Winters等人1969)。产生这种代谢物的菌株还产生十九碳二烯作为次级代谢物(Winters等人1969)，其被鉴定为1，14-(顺式)-十九碳二烯(GoodloeandLight，1982)。¹⁴C-标记的硬脂酸的饲喂引起了脂肪酸向1-十九碳烯中的掺入，展现了链烯来源于脂肪酸生物合成(GoodloeandLight，1982)，但是没有鉴定出对链烯的产生负责的酶或多个酶。

在一个实施方式中，本发明因而提供了分离的1-烯烃合成酶基因，如上文定义的，其编码与I型聚酮化合物合成酶相关的酶(NonA)，并且其进行硬脂酸向1-十九碳烯的转化。示范性的1-烷烃合成酶包括SYNPCC7002_A1173(NCBI序列#NC_010475.1；SEQIDNO：1和SEQIDNO：2分别是核酸和编码的蛋白质序列)，并含有进行1-十九碳烯的生物合成所需的催化结构域(附图1)。第一结构域与LuxE相关，这表明蛋白质可以通过作为酰基转移酶(AT)起作用来附着脂肪酸。LuxE是一种在Lux操纵子中充当酰基-蛋白质合成酶的蛋白质(Lin等人(1996))。接下来是磷酸泛酰巯基乙胺基(PP)附着位点，它是酰基载体蛋白(ACP)结构域的特征。还存在几种其他的结构域，包括酮合成酶(KS)、酰基转移酶(AT)、酮还原酶(KR)结构域、磺基转移酶(ST)和硫酯酶(TE)结构域。

一般地，聚酮化合物的生物合成类似于脂肪酸合成，其中在起始单元和PKS的ACP之间形成硫酯键，然后在酰基-硫酯底物和酰基-CoA中间物之间发生β-酮合成酶(KS)催化的克莱森缩合来形成生长的聚酮化合物链(附图2)。在链延伸期间，每个缩合步骤可以继之以β-羰基的连续反应，通过立体特异性的β-酮还原来形成β-羟基、脱水产生α，β双键以及引起亚甲基形成的烯酰还原。链被延伸限定的次数，直到通过硫酯酶结构域的作用从酶上释放。

NonA的1-十九碳烯生物合成的推定的机制在附图3中示出。步骤1是通过脂肪酸酰基转移酶将硬脂酸加载在ACP上。可能的起始单元是硬脂酸酯的硬脂酸酯(即，硬脂酰-ACP或硬脂酰-CoA)，与游离酸不同。在第二步骤中，发生一轮链延伸，通过与丙二酰基-CoA的脱羧基的缩合延伸碳链两个碳原子。这继之以通过酮还原酶的β-羰基的还原。磺基转移酶结构域将磺酸酯附着到β-羟基来产生硫酸酯基团，硫酯酶结构域催化硫酯键的水解，这继之以硫酸酯的脱羧基的消除来产生末端烯烃。

在此描述的发明的目的是在宿主细胞中重组地表达编码1-烯烃合成酶的基因来生产1-烯烃，包括1-十九碳烯和1-十八碳烯，以及其他感兴趣的基于碳的产物。所述途径可以在聚球蓝细菌属菌株例如JCC138(聚球蓝细菌属物种PCC7002)或任何其他光合生物中过量表达，来从光和二氧化碳产生烃类。它还可以在非光合生物中表达来从糖类来源产生烃类。因而，本发明提供了编码具有1-烯烃合成酶活性的酶以及其变体的分离的核酸分子(包括所述聚酮化合物和水解酶基因的表达优化的形式)，以及在其上改进的方法。来自聚球蓝细菌属物种PCC7002的1-烯烃合成酶基因的全长核酸序列(SEQIDNO：1)YP_001734428是在此提供的，蛋白质序列也是(SEQIDNO：2)。

还在此提供的是如上文限定的A1174水解酶的编码(SEQIDNO：3)和氨基酸序列(SEQIDNO：4)。示范性的A1774水解酶是来自聚球蓝细菌属物种PCC7002的水解酶，YP_001734429(也称为SYNPCC7002_A1174)。在聚球蓝细菌属物种PCC7002中，编码这种水解酶的基因邻近于1-烯烃合成酶基因。编码这种蛋白质的结构基因的删除(但保持它的内源启动子)在此显示了调节细胞产生的1-十九碳烯的产量。

在一个实施方式中提供了具有核酸序列的分离的核酸分子，所述核酸序列包含或由野生型聚酮化合物合成酶基因编码序列SEQIDNO：1的1-烯烃合成酶基因同源物、变体和衍生物组成。本发明提供了包含或由序列组成的核酸分子，所述序列是野生型或天然1-烯烃合成酶基因的结构上或功能上优化的版本。在优选的实施方式中，提供了核酸分子和同源物、变体和衍生物，其包含或由为了底物亲和性和/或底物催化转化率而优化的序列组成。

在一个实施方式中提供了具有核酸序列的分离的核酸分子，所述核酸序列包含或由野生型水解酶基因编码序列SEQIDNO：3的A1174水解酶基因同源物、变体和衍生物组成。本发明提供了包含或由序列组成的核酸分子，所述序列是天然或野生型A1174水解酶基因的结构上或功能上优化的版本。在优选的实施方式中，提供了核酸分子和同源物、变体和衍生物，其包含或由为了底物亲和性和/或底物催化转化率而优化的序列组成。

在其他实施方式中，本发明提供了为了聚球蓝细菌属物种PCC7002和其他蓝细菌菌株的nonA和/或A1174基因敲除菌株的制备而构建的载体。这些载体含有足够长度的、侧翼是可选择标记物如抗生素抗性标志物(庆大霉素、卡那霉素、氨苄西林，等等)的相应基因相关的上游和下游序列，从而与载体的重组用抗生素抗性基因替换了基因的染色体拷贝。在此提供了这样的载体的示范性的实例(例如，SEQIDNO：5和SEQIDNO：6)。

在其他实施方式中，本发明提供了蓝细菌和其他微生物的敲除菌株，其中A1774基因或nonA基因通过突变或删除被灭活。

在进一步的实施方式中提供了包含或由序列组成的核酸分子和其同源物、变体和衍生物，所述序列是与SEQIDNO：1具有至少71％同一性的1-烯烃合成酶基因的变体。在进一步的实施方式中提供的是包含或由序列组成的核酸分子和同源物、变体和衍生物，所述序列是与SEQIDNO：1具有至少50％同一性的1-烯烃合成酶基因的变体，并且是为底物亲和性、底物催化转化率、改善的热稳定性、在不同pH值下的活性而优化的，和/或为在宿主细胞中改善的表达而密码子利用率优化的。所述核酸序列可以优选地是与野生型基因71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或甚至更高地相同的。

在进一步的实施方式中提供了包含或由序列组成的核酸分子和其同源物、变体和衍生物，所述序列是与SEQIDNO：3具有至少71％同一性的A1174水解酶基因的变体。在进一步的实施方式中提供的是包含或由序列组成的核酸分子和同源物、变体和衍生物，所述序列是与SEQIDNO：3具有至少71％同一性的A1174水解酶基因的变体，并且是为底物亲和性、底物催化转化率、改善的热稳定性、在不同pH值下的活性而优化的，和/或为在宿主细胞中改善的表达而密码子利用率优化的。所述核酸序列可以优选地是与野生型基因71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或甚至更高相同的。

在另一个实施方式中，所述核酸分子编码具有SEQIDNO：2和/或SEQIDNO：4的氨基酸序列的多肽。还提供的是编码与SEQIDNO：2或SEQIDNO：4至少50％相同的多肽序列的核酸分子。优选地，核酸分子编码与SEQIDNO：2或SEQIDNO：4至少55％、60％、70％、80％、90％、或95％相同的多肽序列，所述同一性可以再更优选的是98％、99％、99.9％或甚至更高。

还提供的是在严格条件下与上文描述的核酸分子杂交的核酸分子。如上文定义的，以及如本领域公知的，在特定组合的条件下，在低于特定DNA杂交物的热熔点(T_m)约25℃下进行严格杂交，其中T_m是50％的目标序列与完全匹配的探针杂交时的温度。严格洗涤可以在特定的条件组合下在低于特定DNA杂交物的T_m约5℃的温度下进行。

核酸分子包括DNA分子(例如，线性的、环形的、cDNA、染色体DNA、双链的或单链的)和RNA分子(例如，tRNA、rRNA、mRNA)和利用核苷酸类似物的在此描述的DNA或RNA分子的类似物。本发明的分离的核酸分子包括没有衍生该核酸的生物体染色体DNA中天然侧翼的序列(即，位于核酸分子的5′和3′的序列)的核酸分子。在各种实施方式中，分离的核酸分子可以含有来自衍生该核酸分子的微生物的天然侧翼核苷酸染色体DNA序列的小于约10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp。

在此描述的1-烯烃合成酶和/或A1174水解酶基因包括核酸分子，例如，多肽或RNA编码核酸分子，是由基因间隔区DNA与另一个基因或其他基因分隔的(例如，在生物体的染色体DNA中天然地侧翼于和/或分隔所述基因的插入或间隔DNA)。

还提供了包含上述核酸序列的任一项的片段的核酸分子。这些片段优选地含有至少20个连续的核苷酸。更优选的，核酸序列的片段含有至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或甚至更多个连续核苷酸。

在另一个实施方式中，分离的1-烯烃合成酶编码核酸分子与具有SEQIDNO：1中所列核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或与具有一核苷酸序列(所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO：2的氨基酸序列的多肽)的核酸分子的全部或部分杂交。这样的杂交条件是本领域技术人员已知的(参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等人，eds.，JohnWiley&Sons，Inc.(1995)；MolecularCloning：ALaboratoryManual，Sambrook等人，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989))。在另一个实施方式中，分离的核酸分子包含与在此所述的1-烯烃合成酶编码核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一个实施方式中，分离的水解酶编码核酸分子与具有SEQIDNO：3中所列核苷酸序列的核酸分子的全部或部分杂交，或与具有一核苷酸序列(所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO：4的氨基酸序列的多肽)的核酸分子的全部或部分杂交。这样的杂交条件是本领域技术人员已知的(参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等人，eds.，JohnWiley&Sons，Inc.(1995)；MolecularCloning：ALaboratoryManual，Sambrook等人，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989))。在另一个实施方式中，分离的核酸分子包含与在此所述的聚酮化合物合成酶编码核苷酸序列互补的核苷酸序列。

核酸序列片段在各种系统和方法中显示了实用性。例如，片段可以在各种杂交技术中用作探针。取决于方法，目标核酸序列可以是DNA或RNA。目标核酸序列可以在杂交之前进行分级(例如，通过凝胶电泳)，或者杂交可以原位地对样品进行。本领域技术人员将理解的是，已知序列的核酸探针在测定染色体结构(例如，通过Southern印迹)和测量基因表达(例如，通过Northern印迹)方面具有实用性。在这样的实验中，序列片段优选地被可检测地标记，从而它们与目标序列的特异性杂交可以被检测和任选地被定量。本领域技术人员将理解的是，核酸片段可以在此处没有具体描述的各种各样的印迹技术中使用。

还应当理解的是，在此公开的核酸序列片段当被固定在微阵列上时作为探针也是有用的。通过核酸在支持物基质上的沉积和固定来产生微阵列的方法是本领域公知的。在DNAMicroarrays：APracticalApproach(PracticalApproachSeries)，Schena(ed.)，OxfordUniversityPress(1999)(ISBN：0199637768)；NatureGenet.21(1)(suppl)：1-60(1999)；MicroarrayBiochip：ToolsandTechnology，Schena(ed.)，EatonPublishingCompany/BioTechniquesBooksDivision(2000)(ISBN：1881299376)中综述了，其公开内容通过将它们完全引用合并在此)。例如，利用包含核酸序列片段(例如，在此公开核酸序列片段)的微阵列，基因表达的分析是细胞和分子生物学领域中序列片段的公认的运用。在Gerhold等人，TrendsBiochem.Sci.24：168-173(1999)和Zweiger，TrendsBiotechnol.17：429-436(1999)；DNAMicroarrays：APracticalApproach(PracticalApproachSeries)，Schena(ed.)，OxfordUniversityPress(1999)(ISBN：0199637768)；NatureGenet.21(1)(suppl)：1-60(1999)；MicroarrayBiochip：ToolsandTechnology，Schena(ed.)，EatonPublishingCompany/BioTechniquesBooksDivision(2000)(ISBN：1881299376)中描述了固定在微阵列上的序列片段的其他用途，其每一个的公开内容通过完全引用合并在此。

在另一个实施方式中，本发明提供了编码1-十九碳烯生物合成途径中的、展现了提高的活性的1-烯烃合成酶的分离的核酸分子。

如本领域中公知的，酶活性以各种方式来测量。例如，OMP的焦磷酸解作用可用分光光谱跟踪。Grubmeyer等人，J.Biol.Chem.268：20299-20304(1993)。做为选择，利用层析技术(例如，通过高效液相层析法)来跟踪酶的活性。Chung和Sloan，J.Chromatogr.371：71-81(1986)。其他的选择是，通过测量自酶活性产生的产物水平来间接地测量活性。更为现代的技术包括利用与质谱相连的气相层析法。(Niessen，W.M.A.(2001).Currentpracticeofgaschromatography--massspectrometry.NewYork，N.Y：MarcelDekker.(ISBN：0824704738))。使用用于重组蛋白质活性和产物鉴定的其他现代技术，包括液相层析-质谱(LCMS)、高效液相层析(HPLC)、毛细管电泳、基质辅助的激光脱附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOFMS)、核磁共振(NMR)、近红外的(NIR)光谱法、粘度测定法(Knothe，G.，R.O.Dunn，andM.O.Bagby.1997.Biodiesel：Theuseofvegetableoilsandtheirderivativesasalternativedieselfuels.Am.Chem.Soc.Symp.Series666：172-208)，基于物理性质的方法、湿化学方法等等来分析生物体产生的产物的水平和特征。其他方法和技术也可以适合于酶活性的测量，这是本领域技术人员已知的。

另一个实施方式包括突变的或嵌合的1-烯烃合成酶和/或A1174水解酶核酸分子或基因。一般地，突变体核酸分子或突变体基因包含一核苷酸序列，所述核苷酸序列具有至少一个改变，包括但不限于，简单的替换、插入或删除。所述突变体的多肽可以展现不同于野生型核酸分子或基因编码的多肽的活性。一般地，嵌合的突变体多肽包括来自另一个多肽的全部结构域，其被遗传工程化以与相应的结构域为共线的。优选地，突变体核酸分子或突变体基因编码具有改善的活性的多肽，例如，底物亲和性、底物特异性、改善的热稳定性、在不同pH值下的活性、或为了在宿主细胞中改善的表达的优化的密码子利用率。

载体

重组载体可以被改变、修饰或工程化以具有相比衍生的或天然的重组载体核酸分子中不同的、或不同数量的核酸序列。优选地，重组载体包括与调节序列可操作连接的基因或重组核酸分子，包括但不限于，启动子序列、终止子序列和/或人工核糖体结合位点(RBS)，如在此定义的。

一般地，编码1-烯烃合成酶的基因以一定方式与调节序列可操作连接，从而其容许核苷酸序列的期望的表达特征。优选地，当重组核酸分子被包括在此处定义的重组载体中、并导入到微生物中时，编码1-十九碳烯生物合成途径中的1-烯烃合成酶的基因被转录和翻译成由所述核苷酸序列编码的基因产物。

调节序列可以包含调整、调节或影响其他核酸序列的表达的核酸序列。在一个实施方式中，相对于在其天然状态中观察到的，例如，处于天然位置和/或取向的核酸序列，调节序列可以处于相似的或相同的位置和/或取向。例如，感兴趣的基因被包括在与调节序列可操作连接的重组核酸分子或重组载体中，所述调节序列在天然宿主细胞中伴随着或邻近于所述感兴趣的基因，或可以在天然宿主细胞中邻近于不同的基因，或可以与来自另一种生物体的调节序列可操作地连接。与基因可操作连接的调节序列可以来自其他细菌调节序列、噬菌体调节序列，等等。

在一个实施方式中，调节序列是被修饰、突变、取代、衍生、删除的序列，包括化学地合成的序列。优选地，调节序列包括启动子、增强子、终止信号、抗终止信号和其他表达控制元件，例如，它们充当抑制物或诱导物结合的序列，或者充当或编码转录和/或翻译调节性多肽的结合位点，例如，在转录的mRNA中(参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，andManiatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual.2nd，ed，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989)。调节序列包括指导核苷酸序列在宿主细胞中组成型表达的启动子、指导核苷酸序列在宿主细胞中可诱导表达的启动子、以及减弱或抑制宿主细胞中核苷酸序列表达的启动子。调节感兴趣的基因的表达还可以通过除去或删除调节序列来进行。例如，涉及转录作用的负调节的序列可以被除去，从而感兴趣的基因的表达被提高。在一个实施方式中，重组核酸分子或重组载体包括编码至少一种细菌1-烯烃合成酶的核酸序列或基因，其中编码所述酶的基因与启动子或启动子序列可操作地连接。优选地，启动子包括天然启动子、替代启动子和/或噬菌体启动子。

在一个实施方式中，启动子与生物化学的持家基因相连。在另一个实施方式中，启动子是噬菌体启动子。其他启动子包括tef(翻译延伸因子(TEF)启动子)，其促进芽胞杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis))中的高水平表达。例如，用于革兰氏阳性微生物的其他有益的启动子包括但不限于，amyE启动子或噬菌体SP02启动子。例如，用于革兰氏阴性微生物的其他有益的启动子包括但不限于tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-p_R或λ-p_L。

在另一个实施方式中，重组核酸分子或重组载体包括转录终止子序列。一般地，终止子序列是指用来终止基因的转录的调节序列。终止子序列(或串联转录终止子)可以进一步用来例如相对核酸酶稳定mRNA(例如，通过向mRNA添加结构)。

在另一个实施方式中，重组核酸分子或重组载体具有容许含有载体的序列的检测的序列(即，可检测的和/或可选择的标记物)，例如，克服营养缺陷突变的序列(例如，ura3或ilvE)、荧光标记物和/或量热标记物(例如，lacZ/β-半乳糖苷酶)和/或抗生素抗性基因(例如，gen、spec、bla或tet)。

要理解的是本发明的聚酮化合物合成酶和/或水解酶基因的任一个可以被导入到载体中，所述载体还包含在来自光、水和二氧化碳生物合成1-十九碳烯中所涉及的一种或更多种基因。

还提供的是载体，包括表达载体，其包含在此进一步描述的上述核酸分子。在第一实施方式中，所述载体包括如上所述的分离的核酸分子。在可选择的实施方式中，所述载体包括与一种或更多种表达控制序列可操作连接的上述核酸分子。本发明的载体因而可以用于表达具有1-十九碳烯生物合成途径中的1-烯烃合成酶的多肽。

对于原核生物中核酸的表达有用的载体是本领域公知的。在此有用的载体是质粒pCDFDuet-1，其可从Novagen获得。另一种有用的载体是内源的聚球蓝细菌属物种PCC7002质粒pAQ1(Genbank登记号码NC_010476)。

分离的多肽

在一个实施方式中，核酸序列编码的多肽通过重组DNA技术产生，可以通过利用标准多肽纯化技术的合适的纯化方案从表达宿主细胞分离。在另一个实施方式中，利用标准的肽合成技术化学地合成核酸序列编码的多肽。

包括在本发明的范围内的是聚酮化合物合成酶多肽或基因产物，它们是天然发生的细菌基因编码的衍生多肽或基因产物。进一步的，包括在本发明的范围内的是细菌衍生的多肽或基因产物，其不同于野生型基因，包括具有改变的、插入的或删除的核酸的基因，但是其编码在结构和/或功能上与野生型1-烯烃合成酶基因基本上相似的多肽。对A1174水解酶的相似的变体也包括在本发明的范围内。

例如，理解的是本领域技术人员可以突变(例如，取代)核酸，由于遗传密码的简并性，该核酸编码与天然发生的基因所编码的相同的氨基酸。为了改善在特定生物体中表达的核酸的密码子利用率，这可能是期望的。此外，理解的是本领域技术人员可以突变(例如，取代)编码保守性氨基酸替换的核酸。进一步理解的是，本领域技术人员可以取代、添加或删除氨基酸达到一定程度，与天然发生的基因产物相比，以改进或至少非实质性地影响基因产物的功能和/或结构(例如，1-烯烃合成酶活性)，其每一种情况都意图被包括在本发明的范围内。例如，1-烯烃合成酶活性、酶/底物亲和性、酶热稳定性和/或在各种pH值下的酶活性可以不受影响或被合理地改变，使用在此描述的分析可容易地被评估。

在各种方面中，提供了核酸分子编码的分离的多肽(包括突变肽、等位变体、片段、衍生物或类似物)。在一个实施方式中，所述分离的多肽包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：4相应的多肽序列。在可选择的实施方式中，分离的多肽包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：4至少50％相同的多肽序列。优选地，所述分离的多肽优选地具有与为了底物亲和性和/或底物催化转化率而被优化的序列的50％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或甚至更高的同一性。

根据其他实施方式，提供了包含上文描述的多肽序列的片段的分离的多肽。这些片段优选地包括至少20个连续的氨基酸，更优选的至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或甚至更多个连续氨基酸。

所述多肽还包括上文描述的多肽序列与异源多肽之间的融合物。例如，异源序列可以包括被设计以帮助纯化的序列(例如，组氨酸标签)，和/或帮助重组表达的蛋白质的可视化的序列。蛋白质融合物的其他非限制性实例包括允许编码的蛋白质在噬菌体或细胞的表面展示的那些，与固有荧光的蛋白质(例如绿色荧光蛋白(GFP))的融合物，以及与IgGFc区域的融合物。

宿主细胞转化体

在其他方面，提供了用核酸分子或载体转化的宿主细胞以及其后代。在某些实施方式中，这些细胞携带载体上的核酸序列，所述载体可以是自由地复制的载体，例如，pAQ1、pAQ3、pAQ4、pAQ5、pAQ6和pAQ7。在其他实施方式中，核酸被整合到宿主细胞的基因组中。

编码1-烯烃合成酶的宿主细胞可以是缺乏内源的1-烯烃合成酶基因的宿主细胞，或具有内源的1-烯烃合成酶基因的宿主。宿主细胞可以被工程化以表达除了其内源1-烯烃合成酶基因之外的重组1-烯烃合成酶，和/或，宿主细胞可以被修饰，从而它的内源1-烯烃合成酶基因被过量表达(例如，通过启动子交换，或通过提高来自上游启动子的通读)。

在优选的实施方式中，宿主细胞包含编码1-烯烃合成酶的一种或更多种重组核酸(例如，SEQIDNO：1)。

在可选择的实施方式中，宿主细胞可以通过重组突变来带有所述分离的核酸的破坏、删除或突变，从而相比缺少所述突变的宿主细胞，所述1-烯烃合成酶的活性被降低或消除。

在另一个实施方式中，含有1-烯烃合成酶的宿主细胞适合于生产1-十九碳烯或1-辛二烯。在特定的实施方式中，宿主细胞是产生1-十九碳烯的重组宿主细胞，其包含编码SEQIDNO：1的核酸的异源核酸。

在某些方面，提供了在适合的培养条件下表达多肽、以及为了最佳的酶表达、活性和稳定性(密码子利用率、盐度、pH值、温度，等等)选择宿主细胞系的方法。

在另一个方面，本发明提供了通过在一定条件下培养宿主细胞来生产1-烯烃(例如，1-十九碳烯、1-十八碳烯和/或其他长链1-烯烃)的方法，其中1-烯烃合成酶以足够水平表达来产生可测量量的感兴趣的烯烃(例如，1-十九碳烯、1-十八碳烯，等等)。在相关的实施方式中，通过在一定条件下使获自上述宿主细胞的细胞溶解产物来进行生产1-烯烃的方法，在所述条件中1-烯烃从光、水和二氧化碳产生。因而，本发明提供了具有改善的1-烯烃合成酶活性，并具有，例如，热稳定性、各种pH值下的活性和/或优越的底物亲和性或特异性的酶提取物。

用于感兴趣的基于碳的产物的生产的选择的或工程化的微生物

微生物：包括原核和真核的微生物物种，来自原生域、细菌和真核域，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高级原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物(microbes)”与微生物(microorganism)可互换地使用。

各种宿主生物体可以转化来生产1-烯烃。光自养生物包括真核的植物和藻类，以及原核的蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。

宿主细胞可以是革兰氏阴性细菌细胞或格兰氏阳性细菌细胞。本发明的革兰氏阴性宿主细胞可以是，例如，葡糖杆菌属(Gluconobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、产碱菌属(Alcaligenes)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、固氮螺菌属(Azospirillum)、红螺菌属(Rhodospirillum)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、伯克霍尔德杆菌属(Burkholderia)、Desuifomonas、Geospirillum、Succinomonas、气单孢菌属(Aeromonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、盐着色菌属(Halochromatium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、克氏杆菌属(Klebsiella)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、发酵杆菌属(Zymobacter)、或醋酸杆菌属(Acetobacter)。本发明的格兰氏阳性宿主细胞可以是，例如，丝状杆菌属(Fibrobacter)、Acidobacter、拟杆菌属(Bacteroides)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、Geobacillus、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、硫化芽胞杆菌属(Sulfobacillus)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、厌氧杆菌属(Anaerobacter)、真杆菌属(Eubacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、Thermobifida、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、或八叠球菌属(Sarcina)。

也期待极端生物作为适合的生物体。这样的生物体抵抗各种环境参数，例如，温度、辐射、压力、重力、真空、干燥、盐度、pH值、氧张力和化学物质。它们包括超嗜热生物，其在高于80℃下生长，例如，延胡索酸火叶菌(Pyrolobusfumarii)；嗜热生物，其在60-80℃之间生长，例如，Synechococcuslividis；中温生物，其在15-60℃之间生长，和嗜冷生物，其在或低于15℃下生产，例如嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和某些昆虫。辐射耐受生物体包括Deinococcusradiodurans。压力耐受生物体包括piezophiles或嗜压微生物，其耐受130MPa的压力。超重(例如，＞1g)、低重(例如，＜1g)耐受生物体也是期待的。真空耐受生物体包括节肢动物、昆虫、微生物和种子。干燥耐受和脱水生的生物体包括旱生植物例如盐卤虫(Artemiasalina)；线虫、微生物、真菌和地衣。盐耐受生物体包括嗜盐生物(例如，2-5MNaCl)Halobacteriacea和盐藻(Dunaliellasalina)。pH耐受生物体包括嗜碱生物，例如，嗜盐碱杆菌属(Natronobacterium)、坚固芽孢杆菌(Bacillusfirmus)OF4、螺旋藻属物种(Spirulinaspp.)(例如，pH＞9)，以及嗜酸生物，例如Cyanidiumcaldarium、Ferroplasma属物种(例如，低pH值)。厌氧生物，其不能耐受O₂，例如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)；微氧生物，其耐受一定O₂，例如梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，以及需氧生物，其需要O₂，都是期待的。耐受纯的CO₂的气体耐受生物包括Cyanidiumcaldarium，金属耐受生物包括耐金属生物，例如，Ferroplasmaacidarmanus(例如，Cu，As，Cd，Zn)、劳尔氏菌属物种(Ralstoniasp.)CH34(例如Zn，Co，Cd，Hg，Pb)。Gross，Michael.LifeontheEdge：AmazingCreaturesThrivinginExtremeEnvironments.NewYork：Plenum(1998)以及Seckbach，J.″SearchforLifeintheUniversewithTerrestrialMicrobesWhichThriveUnderExtremeConditions.″InCristianoBatalliCosmovici，StuartBowyer，andDanWertheimer，eds.，AstronomicalandBiochemicalOriginsandtheSearchforLifeintheUniverse，p.511.Milan：EditriceCompositori(1997)。

植物包括但不限于以下属：拟南芥属(Arabidopsis)、Beta、大豆属(Glycine)、麻风树属(Jatropha)、芒属(Miscanthus)、黍属(Panicum)、Phalaris、白杨属(Populus)、蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、希蒙得木属(Simmordsia)和玉蜀黍属(Zea)。

藻类和蓝细菌包括但不限于以下属：Acanthoceras、Acanthococcus、Acaryochloris、曲壳藻属(Achnanthes)、Achnanthidium、集星藻属(Actinastrum)、Actinochloris、辐环藻属(Actinocyclus)、Actinotaenium、Amphichrysis、前沟藻属(Amphidinium)、Amphikrikos、双肋藻属(Amphipleura)、Amphiprora、Amphithrix、双眉藻属(Amphora)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、暗额藻属(Aneumastus)、纤维藻(Ankistrodesmus)、锚藻属(Ankyra)、异菱藻属(Anomoeoneis)、Apatococcus、束丝藻属(Aphanizomenon)、隐球藻属(Aphanocapsa)、Aphanochaete、隐杆藻属(Aphanothece)、梨囊藻属(Apiocystis)、Apistonema、四棘鼓藻属(Arthrodesmus)、Artherospira、Ascochloris、星杆藻属(Asterionella)、肠球菌属(Asterococcus)、奥杜藻属(Audouinella)、Aulacoseira、Bacillaria、巴尔比亚藻属(Balbiania)、Bambusina、Bangia、Basichlamys、串珠藻属(Batrachospermum)、骈胞藻属(Binuclearia)、Bitrichia、盘苔属(Blidingia)、Botrdiopsis、气球藻属(Botrydium)、葡萄藻属(Botryococcus)、Botryosphaerella、Brachiomonas、Brachysira、海雹菜属(Brachytrichia)、Brebissonia、毛鞘藻属(Bulbochaete)、Bumilleria、拟杆藻属(Bumilleriopsis)、美壁藻属(Caloneis)、Calothrix、Campylodiscus、Capsosiphon、Carteria、Catena、Cavinula、顶剌藻属(Centritractus)、Centronella、角藻属(Ceratium)、角毛藻属(Chaetoceros)、Chaetochloris、硬毛藻属(Chaetomorpha)、Chaetonella、Chaetonema、Chaetopeltis、胶毛藻属(Chaetophora)、Chaetosphaeridium、管胞藻属(Chamaesiphon)、轮藻属(Chara)、Characiochloris、拟小桩藻属(Characiopsis)、Characium、Charales、缘胞藻属(Chilomonas)、Chiainomonas、Chlamydoblepharis、Chlamydocapsa、衣藻属(Chlamydomonas)、Chlamydomonopsis、Chlamydomyxa、Chlamydonephris、Chlorangiella、Chlorangiopsis、小球藻属(Chlorella)、绿囊藻属(Chlorobotrys)、Chlorobrachis、绿点藻属(Chlorochytrium)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿胶藻属(Chlorogloea)、Chlorogloeopsis、绿梭藻属(Chlorogonium)、Chlorolobion、拟衣藻属(Chloromonas)、Chlorophysema、绿藻门属(Chlorophyta)、Chlorosaccus、Chlorosarcina、Choricystis、Chromophyton、单鞭金藻属(Chromulina)、Chroococcidiopsis、色球藻属(Chroococcus)、Chroodactylon、蓝隐藻属(Chroomonas)、Chroothece、金变形藻属(Chrysamoeba)、Chrysapsis、金星藻属(Chrysidiastrum)、金囊藻属(Chrysocapsa)、Chrysocapsella、Chrysochaete、金色藻属(Chrysochromulina)、Chrysococcus、Chrysocrinus、Chrysolepidomonas、Chrysolykos、Chrysonebula、金藻门(Chrysophyta)、金钟藻属(Chrysopyxis)、Chrysosaccus、Chrysophaerella、Chrysostephanosphaera、刚毛藻属(Clodophora)、Clastidium、Closteriopsis、新月藻属(Closterium)、拟单囊虫属(Coccomyxa)、卵形藻属(Cocconeis)、Coelastrella、空星藻属(Coelastrum)、腔球藻属(Coelosphaerium)、Coenochloris、Coenococcus、Coenocystis、柄裸藻属(Colacium)、鞘毛藻属(Coleochaete)、Collodictyon、Compsogonopsis、美芒藻属(Compsopogon)、Conjugatophyta、Conochaete、Coronastrum、鼓藻属(Cosmarium)、Cosmioneis、Cosmocladium、Crateriportula、Craticula、Crinalium、十字藻属(Crucigenia)、Crucigeniella、Cryptoaulax、隐藻属(Cryptomonas)、Cryptophyta、Ctenophora、Cyanodictyon、Cyanonephron、Cyanophora、Cyanophyta、Cyanothece、Cyanothomonas、Cyclonexis、Cyclostephanos、小环藻属(Cyclotella)、简藻属(Cylindrocapsa)、柱胞鼓藻属(Cylindrocystis)、柱孢藻属(Cylindrospermum)、筒柱藻属(Cylindrotheca)、Cymatopleura、桥弯藻属(Cymbella)、Cymbellonitzschia、胞甲藻(Cystodinium)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、单板藻属(Debarya)、Denticula、Dermatochrysis、皮果藻属(Dermocarpa)、Dermocarpella、缢带藻属(Desmatractum)、角丝鼓藻属(Desmidium)、Desmococcus、Desmonema、Desmosiphon、Diacanthos、Diacronema、Diadesmis、等片藻属(Diatoma)、Diatomella、Dicellula、Dichothrix、Dichotomococcus、Dicranochaete、Dictyochloris、Dictyococcus、Dictyosphaerium、Didymocystis、Didymogenes、Didymosphenia、Dilabifilum、双形藻属(Dimorphococcus)、锥囊藻属(Dinobryon)、Dinococcus、Diplochloris、Diploneis、双十藻属(Diplostauron)、Distrionella、Docidium、竹枝藻属(Draparnaldia)、杜氏藻属(Dunaliella)、Dysmorphococcus、Ecballocystis、Elakatothrix、Ellerbeckia、Encyonema、浒苔属(Enteromorpha)、Entocladia、Entomoneis、Entophysalis、Epichrysis、Epipyxis、Epithemia、Eremosphaera、Euastropsis、Euastrum、Eucapsis、Eucocconeis、空球藻属(Eudorina)、眼虫属(Euglena)、裸藻门(Euglenophyta)、Eunotia、Eustigmatophyta、双鞭藻属(Eutreptia)、Fallacia、飞氏藻属(Fischerella)、脆杆藻属(Fragilaria)、Fragilariforma、Franceia、肋逢藻属(Frustulia)、Curcilla、双胞藻属(Geminella)、Genicularia、灰胞藻属(Glaucocystis)、灰藻门(Glaucophyta)、Glenodiniopsis、薄甲藻属(Glenodinium)、Gloeocapsa、Gloeochaete、Gloeochrysis、Gloeococcus、胶囊藻属(Gloeocystis)、Gloeodendron、Gloeomonas、Gloeoplax、Gloeothece、Gloeotila、胶刺藻属(Gloeotrichia)、Gloiodictyon、Golenkinia、Golenkiniopsis、Gomontia、楔桥弯藻属(Gomphocymbella)、异极藻属(Gomphonema)、束球藻属(Gomphosphaeria)、棒形鼓藻属(Gonatozygon)、Gongrosia、Gongrosira、角绿藻属(Goniochloris)、盘藻属(Gonium)、Gonyostomum、Granulochloris、Granulocystopsis、Groenbladia、裸甲藻属(Gymnodinium)、缢丝鼓藻属(Gymnozyga)、布纹藻属(Gyrosigma)、红球藻属(Haematococcus)、Hafniomonas、Hallassia、双尖藻属(Hammatoidea)、Hannasa、Hantzschia、软管藻属(Hapalosiphon)、Haplotaenium、Haptophyta、Haslea、半沟藻属(Hemidinium)、Hemitoma、Heribaudiella、Heteromastix、Heterothrix、Hibberdia、Hildenbrandia、Hillea、Holopedium、须藻属(Homoeothrix)、Hormanthonema、皮襟藻属(Hormotila)、Hyalobrachion、Hyalocardium、明盘藻属(Hyalodiscus)、Hyalogonium、Hyalotheca、Hydrianum、Hydrococcus、水鞘藻属(Hydrocoleum)、Hydrocoryne、水网藻属(Hydrodictyon)、水链藻属(Hydrosera)、水树藻属(Hydrurus)、蓝枝藻属(Hyella)、Hymenomonas、Isthmochloron、Johannesbaptistia、肾粒藻属(Juranyiella)、Karayevia、Kathablepharis、Katodinium、金杯藻属(Kephyrion)、角球藻属(Keratococcus)、蹄形藻属(Kirchneriella)、Klebsormidium、Kolbesia、Koliella、Komarekia、Korshikoviella、Kraskella、拉氏藻属(Lagerheimia)、金瓶藻属(Lagynion)、丽枝藻属(Lamprothamnium)、Lemanea、鳞孔藻属(Lepocinclis)、细链藻属(Leptosira)、Lobococcus、Lobocystis、Lobomonas、Luticola、鞘丝藻属(Lyngbya)、Malleochloris、Mallomonas、Mantoniella、射星藻属(Marssoniella)、Martyana、鞭鞘藻属(Mastigocoleus)、Gastogloia、直链藻属(Melosira)、平裂藻属(Merismopedia)、Mesostigma、中带鼓藻属(Mesotaenium)、微芒藻属(Micractinium)、微星鼓藻属(Micrasterias)、微毛藻属(Microchaete)、微鞘藻属(Microcoleus)、微囊藻属(Microcystis)、软壳藻属(Microglena)、Micromonas、微孢藻属(Microspora)、小丛藻属(Microthamnion)、柄球藻属(Mischococcus)、单鞭金藻属(Monochrysis)、蒜头藻属(Monodus)、Monomastix、Monoraphidium、Monostroma、转板藻属(Mougeotia)、拟转板藻属(Mougeotiopsis)、喙藻属(Myochloris)、Myromecia、Myxosarcina、粘囊藻属(Naegeliella)、Nannochloris、类球藻属(Nautococcus)、舟形藻属(Navicula)、Neglectella、Neidium、Nephroclamys、Nephrocytium、Nephrodiella、肾藻属(Nephroselmis)、梭形鼓藻属(Netrium)、丽藻属(Nitella)、拟丽藻属(Nitellopsis)、菱形藻属(Nitzschia)、Nodularia、念珠藻属(Nostoc)、棕鞭藻属(Ochromonas)、Oedogonium(鞘藻属)、Oligochaetophora、Onychonema、Oocardium、Oocystis、槌棒藻属(Opephora)、黄管藻属(Ophiocytium)、Orthoseira、Oscillatoria、颤蓝菌属(Oxyneis)、Pachycladella、四集藻属(Palmella)、Palmodictyon、Pnadorina、Pannus、Paralia、巴喧氏藻属(Pascherina)、Paulschulzia、盘星藻属(Pediastrum)、柄钟藻属(Pedinella)、平藻属(Pedinomonas)、Pedinopera、Pelagodictyon、Penium、Peranema、Peridiniopsis、多甲藻属(Peridinium)、Peronia、Petroneis、Phacotus、Phacus、Phaeaster、Phaeodermatium、Phaeophyta、Phaeosphaera、金枝藻属(Phaeothamnion)、Phormidium、叶楯藻属(Phycopeltis)、Phyllariochloris、Phyllocardium、Phyllomitas、Pinnularia、Pitophora、Placoneis、游丝藻属(Planctonema)、浮球藻属(Planktosphaeria)、Planothidium、织线藻属(Plectonema)、杂球藻属(Pleodorina)、Pleurastrum、Pleurocapsa、Pleurocladia、双盘藻属(Pleurodiscus)、Pleurosigma、Pleurosira、Pleurotaenium、Pocillomonas、Podohedra、多鞭藻属(Polyblepharides)、Polychaetophora、Polyedriella、多突藻属(Polyedriopsis)、Polygoniochloris、Polyepidomonas、Polytaenia、素衣藻属(Polytoma)、Polytomella、紫球藻属(Porphyridium)、Posteriochromonas、Prasinochloris、Prasinocladus、Prasinophyta、溪菜属(Prasiola)、Prochlorphyta、Prochlorothrix、原皮藻属(Protoderma)、Protosiphon、Provasoliella、Prymnesium、Psammodictyon、Psammothidium、伪鱼腥藻(Pseudanabaena)、Pseudenoclonium、Psuedocarteria、Pseudochate、Pseudocharaciun、Pseudococcomyxa、Pseudodictyosphaerium、Pseudokephyrion、伪瘤皮藻属(Pseudoncobyrsa)、Pseudoquadrigula、Pseudosphaerocystis、Pseudostaurastrum、Pseudostaurosira、Pseudotetrastrum、翼膜藻属(Pteromonas)、Punctastruata、Pyramichlamys、Pyramimonas、甲藻门(Pyrrophyta)、Quadrichloris、Quadricoccus、并联藻属(Quadrigula)、辐球藻(Radiococcus)、辐丝藻属(Radiofilum)、Raphidiopsis、Raphidocelis、Raphidonema、Raphidophyta、Peimeria、灰胞藻属(Rhabdoderma)、Rhabdomonas、根枝藻属(Rhizoclonium)、红胞藻属(Rhodomonas)、Rhodophyta、Rhoicosphenia、棒杆藻属(Rhopalodia)、胶须藻属(Rivularia)、Rosenvingiella、Rossithidium、Roya、栅藻属(Scenedesmus)、Scherffelia、Schizochlamydella、裂壁藻属(Schizochlamys)、Schizomeris、Schizothrix、弓形藻属(Schroederia)、Scolioneis、Scotiella、Scotiellopsis、Scourfieldia、伪枝藻属(Scytonema)、Selenastrum、月绿藻属(Selenochloris)、Sellaphora、Semiorbis、Siderocelis、Diderocystopsis、Dimonsenia、Siphononema、Sirocladium、链膝藻属(Sirogonium)、Skeletonema、Sorastrum、Spermatozopsis、Sphaerellocystis、Sphaerellopsis、Sphaerodinium、环藻属(Sphaeroplea)、Sphaerozosma、Spiniferomonas、水棉属(Spirogyra)、Spirotaenia、螺旋藻属(Spirulina)、Spondylomorum、Spondylosium、Sporotetras、Spumella、角星鼓藻属(Staurastrum)、Stauerodesmus、辐节藻属(Stauroneis)、Staurosira、Staurosirella、Stenopterobia、Stephanocostis、冠盘藻属(Stephanodiscus)、Stephanoporos、Stephanosphaera、Stichococcus、Stichogloea、毛枝藻属(Stigeoclonium)、真枝藻属(Stigonema)、Stipitococcus、Stokesiella、陀螺藻属(Strombomonas)、Stylochrysalis、Stylodinium、Styloyxis、Stylosphaeridium、双菱藻属(Surirella)、Sykidion、Symploca、聚球菌属(Synechococcus)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、针杆藻属(Synedra)、Synochromonas、黄群藻属(Synura)、平板藻属(Tabellaria)、Tabularia、Teilingia、切孢藻属(Temnogametum)、裂项鼓藻(Tetmemorus)、四球藻属(Tetrachlorella)、Tetracyclus、Tetradesmus、Tetraedriella、Tetraedron、Tetraselmis、四孢藻属(Tetraspora)、Tetrastrum、海链藻属(Thalassiosira)、Thamniochaete、Thorakochloris、红索藻属(Thorea)、鸟巢藻属(Tolypella)、Tolypothrix、囊裸藻属(Trachelomonas)、Trachydiscus、Trebouxia、Trentepholia、四刺藻属(Treubaria)、黄丝藻属(Tribonema)、束毛藻属(Trichodesmium)、Trichodiscus、Trochiscia、Tryblionella、丝藻属(Ulothrix)、Uroglena、Uronema、Urosolenia、Urospora、Uva、Vacuolaria、无隔藻属(Vaucheria)、团藻属(Volvox)、Volvulina、韦斯藻属(Westella)、网甲藻属(Woloszynskia)、Xanthidium、黄藻门(Xanthophyta)、Xenococcus、Zygnema、拟双星藻属(Zygnemopsis)和Zygonium。

绿色非硫细菌包括但不限于以下属：Chloroflexus、绿线菌属(Chloronema)、绿颤细菌属(Oscillochloris)、Heliothrix、Herpetosiphon、Roseiflexus和Thermomicrobium。

绿色硫细菌包括但不限于以下属：Chlorobium、Clathrochloris和绿突菌属(Prosthecochloris)。

紫色硫细菌包括但不限于以下属：Allochromatium、Chromatium、Halochromatium、Isochromatium、Marichromatium、Rhodovulum、Thermochromatium、荚硫菌属(Thiocapsa)、Thiorhodococcus和囊硫菌属(Thiocystis)。

紫色非硫细菌包括但不限于以下属：Phaeospirillum、Rhodobaca、Rhodobacter、Rhodomicrobium、Rhodopila、红假单细胞属(Rhodopseudomonas)、Rhodothalassium、红螺菌属(Rhodospirillum)、Rodovibrio和Roseospira。

有氧化能无机营养细菌包括但不限于硝化细菌，例如硝化杆菌科菌(Nitrobacteraceaesp.)、硝化杆菌属菌(Nitrobactersp.)、Nitrospinasp.、Nitrococcussp.、硝化螺菌属菌(Nitrospirasp.)、Nitrosomonassp.、Nitrosococcussp.、亚硝化螺菌属菌(Nitrosospirasp.)、亚硝化叶菌属菌(Nitrosolobussp.)、亚硝化弧菌属菌(Nitrosovibriosp.)；无色硫细菌例如，Thiovulumsp.、硫杆菌属菌(Thiobacillussp.)、Thiomicrospirasp.、Thiosphaerasp.、Thermothrixsp.；绝对化学无机营养的氢细菌例如Hydrogenobactersp.，铁和锰-氧化和/或沉积细菌，例如Siderococcussp.，以及磁性细菌，例如Aquaspirillumsp。

古细菌包括但不限于产甲烷古细菌，例如甲烷杆菌属菌(Methanobacteriumsp.)、甲烷短杆菌属菌(Methanobrevibactersp.)、甲烷嗜热菌属菌(Methanothermussp.)、Methanococcussp.、甲烷微菌属菌(Methanomicrobiumsp.)、Methanospirillumsp.、Methanogeniumsp.、固定化甲烷八叠球菌(Methanosarcinasp.)、Methanolobussp.、Methanothrixsp.、Methanococcoidessp.、Methanoplanussp.；极度嗜热硫代谢生物，例如Thermoproteussp.、Pyrodictiumsp.、Sulfolobussp.、Acidianussp.和其他微生物，例如，枯草杆菌(Bacillussubtilis)、酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、链霉菌属菌(Streptomycessp.)、青枯菌属菌(Ralstoniasp.)、红球菌属菌(Rhodococcussp.)、棒状杆菌属菌(Corynebacteriasp.)、短杆菌属菌(Brevibacteriasp.)、分枝杆菌属菌(Mycobacteriasp.)和产油酵母。

在优选的实施方式中，亲本光自养生物可以用编码1-烯烃合成酶的基因转化。

用于超光合转化的优选的生物体包括：拟南芥(Arabidopsisthaliana)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、奇岗(Miscanthusgiganteus)和玉米(植物)、布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和Dunalielasalina(藻类)、聚球蓝细菌属菌PCC7002、聚球蓝细菌属物种PCC7942、集胞蓝细菌属菌(Synechocystissp.)PCC6803和ThermoSynechococcuselongatusBP-1(蓝细菌)、Chlorobiumtepidum(绿色硫细菌)、Chloroflexusauranticus(绿色非硫细菌)、微温着色菌(Chromatiumtepidum)和光合细菌(Chromatiumvinosum)(紫色硫细菌)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、Rhodobactercapsulatus和Rhodopseudomonaspalusris(紫色非硫细菌)。

其他适合的生物体包括合成的细胞或通过合成基因组产生的细胞，如在Venter等人USPat.Pub.No.2007/0264688中描述的，以及细胞样的系统或合成的细胞，如在Glass等人USPat.Pub.No.2007/0269862中描述的。

另外，其他适合的生物体包括可以被工程化以固定二氧化碳的微生物，细菌例如大肠杆菌、醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)、枯草杆菌，酵母和真菌例如Clostridiumljungdahlii、Clostridiumthermocellum、南极海洋真菌(Penicilliumchrysogenum)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomycespombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)。

在选择或工程化适合的生物体中的常见的话题是CO₂到产物的自养的固定。这将涵盖光合作用和产甲烷作用。产乙酰作用，其包括三种类型的CO₂固定；还涵盖了卡尔文循环、乙酰CoA途径和还原TCA途径。使用二氧化碳作为细胞碳的单独来源(自养)的能力在原核生物的几乎所有主要类群中存在。CO₂固定途径在不同类群之间不同，四种当前已知的自养途径没有清楚的分布模式。Fuchs，G.1989.AlternativepathwaysofautotrophicCO₂fixation，p.365-382.InH.G.Schlegel，andB.Bowien(ed.)，Autotrophicbacteria.Springer-Verlag，Berlin，Germany。还原的戊糖磷酸循环(Calvin-Bassham-Benson循环)代表了许多有氧自养细菌，例如蓝细菌中的CO₂固定途径。

基因整合和增殖

产生1-十九碳烯的基因可以通过插入到宿主细胞基因组来增殖。向宿主细胞基因组中的整合任选地在特定的座位对受损的或失能的不需要的基因产物或代谢途径来进行。

在另一个实施方式中描述了1-烯烃合成途径中的1-烯烃合成酶基因和/或水解酶基因向质粒的整合。质粒可以表达一种或更多种基因，任选的，包括一种或更多种基因的操纵子，优选的，涉及1-烯烃合成的一种或更多种基因，或更优选的，供应1-烯烃的生物合成途径的相关代谢途径的一种或更多种基因。

又一个实施方式提供了将一种或更多种1-烯烃合成酶基因整合到表达载体中的方法，表达载体包括但不限于pJB5(参见，例如，WO2009/111513，2009年9月11日公开)或pCDFDuet-1(Novagen)。

抗体

在另一个方面，在此提供的是特异性结合分离的多肽和多肽片段、或结合由分离的核酸编码的一种或更多种多肽的分离的抗体，包括其片段和衍生物。所述抗体可以特异于这样的多肽或多肽片段的线性表位、不连续表位或构象表位，所述表位在处于其天然构象的多肽上存在，或在某些情况下，在变性的多肽上存在，例如，通过在SDS中溶解而变性的。在其中，有用的抗体片段是Fab、Fab′、Fv、F(ab′)₂和单链Fv片段。

“特异性结合”和“特异结合”在此意味着抗体优先于结合其他分子种类、结合第一分子种类的能力，抗体和所述分子第一种类与所述其他分子种类是混合的。当其特异性结合第一分子种类时，抗体被称为特异性“识别”第一分子种类。

本领域公知的是，混合物中分子种类中抗体可以辨别的程度将部分地取决于混合物中种类的构象相关性；一般地，相对于对无关的多肽的偶然结合，抗体将以至少两倍、更一般地至少5倍、一般地超过10倍、25倍、50倍、75倍，常常超过100倍、有时超过500倍或1000倍地区分。

一般地，抗体(或抗体多聚体，如在IgM五聚体的情况下)对多肽或多肽片段的亲和性或亲合力将是至少约1×10^-6M，一般地至少约5×10^-7M，有用地至少约1×10^-7M，1×10^-8M、5×10^-9M、1×10^-10M或更强的亲和性和亲和力被证明是特别有用的。

分离的抗体可以是来自任何哺乳动物物种的天然发生的形式，例如，IgG、IgM、IgDIgE和IgA。例如，抗体有用地从物种包括啮齿动物，一般为小鼠，但还有大鼠、豚鼠和仓鼠，兔类动物，一般地为兔子，以及更大的哺乳动物，例如，绵羊、山羊、牛和马来获得。动物一般根据标准的免疫方案用多肽或多肽片段确定地免疫。

实际上，当偶联到载体时，多肽的8个或更多个连续的氨基酸的所有片段可以被有效地用作免疫原，一般地，所述载体是蛋白质例如牛甲状球蛋白、钥孔血蓝素或牛血清白蛋白，方便地利用双功能接头来轭合。免疫原性还可以通过多肽和多肽片段与其他部分的融合来赋予。例如，肽可以通过固相合成在分枝的聚赖氨酸核心矩阵上生产；这些多抗原性肽(MAP)提供了高纯度、提高的亲合力、精确的化学物质定义和疫苗开发中改善的安全性。参见，例如，Tam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5409-5413(1988)；Posnett等人，J.Biol.Chem.263，1719-1725(1988)。

免疫的方案是本领域公知的。这样的方案经常包括多次免疫，有或者没有佐剂例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。抗体可以是多克隆或单克隆的，多克隆抗体在蛋白质的免疫组织化学检测方面具有一定优势，单克隆抗体在鉴定和辨别蛋白质的特定表位方面具有优势。在免疫之后，抗体可以利用任何本领域接受的技术来产生。用于重组抗体生产的宿主细胞可以是原核的或真核的，所述抗体是完整抗体、抗体片段或抗体衍生物。原核宿主对于生产噬菌体展示抗体是特别有用的，这是本领域公知的。真核细胞，包括哺乳动物、昆虫、植物和真菌细胞对于抗体、抗体片段和抗体衍生物的表达也是有用的。抗体还可以通过无细胞翻译来制备。

包括片段和其衍生物的分离的抗体可以有用地被标记。因而，另一个方面是提供标记的抗体，所述抗体特异性结合一种或更多种多肽或多肽片段。标记物的选择部分地取决于期望的用途。在某些情况下，抗体可以用酶有用地标记。做为选择，抗体可以与胶体金或用荧光团标记。对于利用标记的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、或中性亲和素的二级检测，抗体可以有用地用生物素标记。例如，当抗体用于Western印迹应用时，它们可以用放射性同位素，例如，³³P、³²P、³⁵S、³H和¹²⁵I有用地标记。如将要理解的，上文描述的标记物的使用不限于任何特定的应用。

设计蛋白质变体的方法

提高的1-烯烃生产可以通过良好适合于现代的遗传工程技术的生物体中1-烯烃合成酶和1-烯烃合成途径的表达和优化来实现，所述生物体即，快速生长、能够以便宜的食物资源健壮生长、容易和经济地实现从其中分离期望的产品的那些。为了提高1-烯烃的生产率，有益的是设计和选择酶的变体，包括但不限于，为了底物亲和性、底物特异性、底物催化转化率、改善的热稳定性、不同pH值下的活性和/或为在宿主细胞中改善的表达的优化的密码子利用率而优化的变体。参见，例如，与催化率的改变相关的、同时维持相似的亲和性的氨基酸改变(RLZhengandRGKemp，J.Biol.Chem.(1994)Vol.269：18475-18479)，或与影响催化周转的过渡态稳定性方面的改变相关的氨基酸改变(MAPhillips，等人，J.Biol.Chem.，(1990)Vol.265：20692-20698)。另一个优势是设计和选择酶，所述酶被改变以具有实质上降低的逆反应活性(其中酶-底物产物将是相当不利的键形成、或底物的分子重构的结果)，以及具有改善的正向反应活性(其中酶-底物产物将是相当不利的分子键还原或分子重构的结果)。

因而，设计改善的聚酮化合物合成酶蛋白质用于合成1-十九碳烯的一种方法利用了计算机和生物信息学分析，来设计和选择编码产乙醇酶活性的初级氨基酸序列方面有益的改变。计算方法和生物信息学提供了蛋白质结构和功能的合理设计的易处理的选择性。近来，分析蛋白质结构的生物物理学特征的算法(例如，运动动力学和总能量或Gibb’s自由能评估)已经成为商业上可行方法，其补充了评估同源性、同一性和/或序列与结构域保守程度的蛋白质序列分析数据，来改进或设计期望性质的蛋白质(Rosetta++，UniversityofWashington)。例如，在硅片上的(insilico)的核酸内切酶I-MsoI重新设计是基于对一级氨基酸序列的合理选择的改变的生物物理学参数的计算性评估。研究人员能够维持野生型结合选择性和亲和性，同时改善催化周转达四个数量级(Ashworth，等人，Nature(2006)vol.441：656-659)。

在一个实施方式中，处在与底物的复合物中的多肽序列或相关的同源物从蛋白质数据库(PDB：PDB；HMBerman，等人，NucleicAcidsResearch(2000)vol.28：235-242)获得，用于对稳态和/或相对于野生型蛋白质的Gibb’s自由能改变的计算分析。作为本领域技术人员已知的，利用标准软件程序来观察分子，一个氨基酸残基对另一个的取代通过硅芯片计算机(insilico)实现，作为鉴定优化了蛋白质与底物之间的结构性或催化性接触的特定残基取代的手段。当在此描述的多肽(和同源物)的通过硅芯片计算机确定的结构可通过PDB获得时，那些结构可以用于合理地设计具有期望的(一般地，改善的)活性的修饰蛋白质。基于优化了例如范得华力相互作用、疏水性、亲水性、空间不干扰性、pH值依赖性静电学和相关的化学相互作用的取代的残基的特征，特定氨基酸取代被合理地选择。本领域技术人员计算和评估当不结合或结合到其底物时取代蛋白质模型的总体能量改变，来评估自由能改变与总体结构稳定性的相关性(例如，Meiler，J.andD.Baker，Proteins(2006)65：538-548)。此外，这样的计算方法提供了精确地预测四级蛋白质结构相互作用的手段，从而在硅片上的修饰对于总体的多聚体结构稳定性是有预测性或决定性的(Wollacott，AM，等人，ProteinScience(2007)16：165-175；Joachimiak，LA，等人，J.Mol.Biol.(2006)361：195-208)。

优选地，对1-烯烃合成酶蛋白质序列的一级结构的合理的设计改变最小地改变未结合的多肽的Gibb’s自由能态，并维持了折叠的、有功能的和相似的野生型酶结构。更优选的，实现蛋白质序列的更小的计算性总自由能改变，来表明优化的酶结构稳定性的可能性。

虽然相对于野生型结构、蛋白质结构的更低的自由能是热力学稳定性的指示，提高的热稳定性与优化的功能性的正相关性不一定存在。因而，优选地，修饰的1-烯烃合成酶蛋白质结构与底物之间最佳的催化性接触，利用分解反应的总自由能中相伴预测的有利改变来实现，例如，通过合理地设计1-烯烃合成酶蛋白质/底物相互作用，对于宿主细胞表达突变体1-烯烃合成酶蛋白质所处的期望的环境，所述相互作用稳定了酶反应的过渡态、同时维持未结合的1-烯烃合成酶蛋白质的相似的或有利的自由能改变。再更优选的，合理地选择的氨基酸改变引起实质上降低的1-烯烃合成酶的合成代谢性蛋白质/底物反应，或提高1-烯烃合成酶的分解代谢性蛋白质/底物反应。在进一步的实施方式中，任何的和/或所有的1-烯烃合成酶序列对于特定的表达宿主细胞来进行表达优化。

产生蛋白质变体的方法

本领域技术人员已知的几种方法可以用于利用聚合酶链式反应(“PCR”)(美国专利4,683,202)来产生相应多肽序列的随机核苷酸序列变体。一个实施方式是利用易错PCR的方法产生1-烯烃合成酶基因变体。(R.CadwellandG.Joyce，PCRMeth.Appl.(1991)Vol.2：28-33；Leung，等人，Technique(1989)Vol.1：11-15)。易错PCR建立PCR实验期间的化学环境来实现，所述环境引起要复制的DNA亲本拷贝的不准确复制的提高。例如，提高PCR实验中使用的化学物质混合物的锰或镁离子含量，非常低的退火温度，改变添加的双脱氧核苷酸之间的平衡，从亲本DNA模板的少量群体开始，或使用被设计以提高精确DNA复制方面的低效性的聚合酶，都引起在PCR复制过程期间子代DNA序列中的核苷酸改变。产生的突变体DNA序列被遗传工程化到要在宿主细胞中表达的合适载体中，并进行分析来筛选和选择对于感兴趣的产物或过程的全细胞生产的期望影响。在一个实施方式中，利用本领域技术人员公知技术通过易错PCR来产生1-烯烃合成酶编码核苷酸序列的随机诱变。通过克隆筛选分析和在此描述的其他方法分析产生的核苷酸序列的结构和功能性质。

另一个实施方式是利用位点定向诱变产生特定的期望蛋白质突变体。例如，使用重叠延伸(An，等人，Appl.Microbiol.Biotech.(2005)vol.68(6)：774-778)或mega-引物PCR(E.BurkeandS.Barik，MethodsMol.Bio.(2003)vol226：525-532)，人们可以使用在亲本核苷酸的相应密码子位置处被改变的核苷酸引物来产生含有期望突变的DNA子代序列。做为选择，人们可以使用盒诱变(Kegler-Ebo，等人，NucleicAcidsRes.(1994)vol.22(9)：1593-1599)，这是本领域技术人员公知的。

在一个方面，利用位点定向诱变和盒诱变，SEQIDNO：2中所有可能的位置被改变成脯氨酸，转化到适合的高表达载体中，并在适合的表达宿主细胞中以高水平表达。通过本领域技术人员已知的方法(P.RellosandR.K.Scopes，Prot.Exp.Purific.(1994)Vol.5：270-277)获得处于合适的生物物理学分析技术所需浓度下的纯化的等分量，并评估提高的热稳定性。

另一个实施方式是，通过比较编码多肽的第一核酸序列与编码具有更期望性质的多肽的第二相关核酸序列的核酸序列，并改变所述第一核酸序列的至少一个密码子以具有与第二核酸序列的相应密码子的相同性，来选择多肽变体，从而在宿主细胞中实现改善多肽活性、底物特异性、底物亲和性、底物催化转化率、改善的热稳定性、不同的pH值下的活性、和/或对于表达的优化的的密码子利用率、和/或改变的多肽的结构。

在又一个实施方式中，利用这样的方法，如位点饱和诱变，在任何期望的、指定的核苷酸密码子位置处编码所有氨基酸残基变异(Meyers，等人，Science(1985)Vol.229：242-247；Derbyshire，等人，Gene(1986)Vol.46：145-152；U.S.Patent6,171,820)。全基因位点饱和诱变(K.Kretz，等人，Meth.Enzym.(2004)Vol.388：3-11)是优选的，其中在每个核苷酸密码子位置处编码所有的氨基酸残基变异。两种方法都产生不同于亲本多肽为一个氨基酸的蛋白质变体群体，每一个氨基酸取代与多肽中任何位置处的结构/功能性质相关。饱和诱变使用PCR以及与亲本序列同源的引物，其中编码核苷酸三联体的一个或更多个密码子是随机的。随机化引起相应于最终翻译的多肽中所有氨基酸替换的密码子的掺入。每个PCR产物被遗传工程化到要导入表达宿主中的表达载体中，通过克隆筛选方法和在此描述的其他方法筛选结构和功能性质。

在饱和诱变的一个方面中，使用相关的饱和诱变(“CSM”)，其中在合理地指定的位置处两个或更多个氨基酸相伴地改变为不同的氨基酸残基，来工程化改善的酶功能和结构。相关饱和诱变容许鉴定对1-烯烃合成酶结构和功能具有例如正协同作用的互补的氨基酸改变。这样的协同作用包括但不限于，显著改变的酶稳定性、底物亲和性、底物特异性或催化转换率，独立地或相伴地有利提高1-烯烃的产生。

在又一个实施方式中，为了特定功能而优化的CSM衍生蛋白变体的氨基酸取代组合，与为另一个特定功能而优化的一种或更多种CSM衍生蛋白变体相组合，来得到展现了多种优化的结构和功能特征的1-烯烃合成酶和/或A1174水解酶蛋白质变体。例如，显示了优化的原体相互作用的组合突变体中的氨基酸改变，与显示了优化的催化周转的组合突变体中的氨基酸改变相组合。

在一个实施方式中，来自在此描述的方法的突变变体被克隆。饱和诱变所产生的DNA序列被设计以在基因序列的末端具有限制性位点，以容许切除和转化到宿主细胞质粒中。产生的质粒储备物被转化到宿主细胞中，在最佳生长条件下孵育来成功地鉴定转化的菌落。

另一个实施方式利用基因混洗(P.Stemmer，Nature(1994)Vol.370：389-391)或基因重装配(US5,958,672)通过嵌合蛋白质的产生来开发改善的蛋白质结构/功能。利用基因混洗，两种或更多种同源的1-烯烃合成酶编码核苷酸序列用内核酸酶在随机位置处理，混合在一起，加热直到充分熔化和重新退火。来自同源物的核苷酸序列将退火来产生嵌合基因的群体，所述基因被修复以填充来自重新退火过程的任何缺口，被表达和筛选改善的结构/功能性1-烯烃合成酶嵌合体。基因重装配类似于基因混洗；然而，特定的、同源的1-烯烃合成酶蛋白质结构域的核苷酸序列是目标，并与其他同源结构域交换，用于重装配成嵌合基因。基因被表达并筛选改善的结构/功能性1-烯烃合成酶嵌合体。

在进一步的实施方式中，任何的和/或所有的序列对于特定的表达宿主细胞来进行表达优化。

测量蛋白质变体效力的方法

表达的多肽序列中的改变可以产生全细胞底物转化率中可测量的差异。期望的是通过相对于具有不同蛋白质变体的其他全细胞评估具有特定蛋白质变体的宿主细胞中的生产力，来测定底物转化率中的差异。另外，期望的是测定作为环境因素，包括但不限于pH值、温度、营养浓度和盐度的函数的全细胞底物转化的效力。

因此，在一个实施方式中，进行在此描述的对蛋白质变体的生物物理学分析来测量结构/功能性质。多肽活性的标准分析是本领域普通技术人员公知的。这样的分析可能需要大量多肽的表达和高纯度，随后是各种物理方法(包括但不限于，量热法、荧光、分光光度法、光谱法、液相层析(LC)、质谱(MS)、LC-MS、亲和层析、光散射、核磁共振等等)来分析在特定环境中的功能或同源物之中的功能差异。

在另一个实施方式中，多肽被表达、纯化和经历前述的分析技术，来评估多肽序列同源物之间的功能差异，例如，底物转化率和/或1-烯烃合成。

分批培养(或封闭系统培养)分析是本领域公知的，可以提供遗传表达工程化的基因的宿主细胞的、关于宿主细胞群体效应的信息。在分批培养中，宿主细胞群体将生长直到可获得的营养物从培养基中耗尽。

在一个实施方式中，多肽在分批培养中表达，并分析大致的加倍时间、工程化的多肽的表达效力、以及终点净产物形成和净生物质产生。

Turbidostats是本领域公知的一种连续培养形式，其中在不间断的基础上提供培养基和营养物，容许宿主细胞群体的无停止的增殖。Turbidostats容许用户测定关于全细胞增殖以及特定生物产生的终产物的稳态生产力的信息，例如，宿主细胞加倍时间、特定宿主细胞群体密度下临时限制性的生物质生产率、临时限制性宿主细胞群体密度对底物转化的影响、以及宿主细胞底物转化的净生产力。Turbidostats可以被设计以监视底物转化产物向液态或气态的分配。另外，感兴趣的基于碳的产物的净生产力的定量评估可以精确地进行，因为在turbidostat的操作上本领域技术人员所拥有的精确控制水平。这些类型的信息对于评估被遗传工程化以产生感兴趣的特定基于碳的产物的宿主细胞的分解的和净效力是有用的。

在一个实施方式中，不同仅在于同源酶的核酸和表达的多肽序列的相同宿主细胞系被培养在均匀环境turbidostat中，来测定期望的感兴趣的基于碳的产物的最高全细胞效力。

在另一个实施方式中，不同仅在于同源酶的核酸和表达的多肽序列的相同宿主细胞系被培养在可变环境的(例如，温度、pH值、盐度、营养物暴露)分批培养或turbidostat中，来测定期望的感兴趣的基于碳的产物的最高全细胞效力。

在一个实施方式中，来自在此描述的方法的突变变体被克隆。饱和诱变所产生的DNA序列被设计以在基因序列的末端具有限制性位点，以容许裂解和转化到宿主细胞质粒中。产生的质粒储备物被转化到宿主细胞中，在最佳生长条件下孵育来成功地鉴定转化的菌落。

生产1-十九碳烯的方法

期望的是在很好适合于工业用途的生物体中工程化一遗传系统，从所述遗传系统可以有效地和干净地产生1-十九碳烯。

因而，本发明包括利用在此描述的1-烯烃合成酶将水、二氧化碳和光转化成1-烯烃。在一个实施方式中，本发明包括利用表达1-烯烃合成酶基因的遗传工程化的宿主细胞生产1-烯烃，包括1-十九碳烯和1-十八碳烯。

在另一个优选的实施方式中，所述遗传工程化的宿主细胞表达1-烯烃合成酶和1-烯烃生物合成途径中的一种或更多种基因，容许所述宿主细胞将水、光和二氧化碳和/或硬脂酸转化成1-十九碳烯。

在本发明的另一个实施方式中，遗传工程化的宿主细胞被加工成酶的溶解产物用于进行上述转化反应。在又一个实施方式中，1-烯烃合成酶基因产物被纯化，如在此描述的，用于进行转化反应。

转化反应中使用的所述宿主细胞和/或酶，例如，在溶解产物中的、部分地纯化的、或纯化的，是处于一定形式，其容许它们进行它们预期的功能、生产期望的产物，例如，1-十九碳烯。使用的微生物可以是全细胞，或可以仅是获得期望的最终结果所需的那些细胞的部分。所述微生物可以被悬浮(例如，在合适的溶液，如缓冲溶液或培养基中)、清洗(例如，清洗掉来自微生物培养的培养基)、丙酮干燥、固定(例如，用聚丙烯酰胺凝胶或k-角叉菜胶，或在合成支持物上，例如，珠粒、基质等等)、固定、交联或渗透化(例如，渗透化的膜和/或壁，从而化合物例如底物、中间物或产物可以容易地穿过所述膜或壁)。

在又一个实施方式中，纯化的或未纯化的1-烯烃合成酶(例如，1-烯烃合成酶)被用于转化反应中。所述酶处于容许它进行其预期功能的形式中。例如，所述酶可以被固定、偶联或自由地漂浮。

在又一个实施方式中，1-烯烃合成酶是嵌合的，其中在聚酮化合物合成酶和另一个酶之间编码了多肽接头。在翻译成多肽时，代谢途径的两个酶被多肽接头拴系在一起。在宿主细胞中拴系在一起的两种或更多种功能上相关的蛋白质的这种设置提高了代谢上相关的酶的局部有效浓度，其可以提高底物转化的效率。

以下实施例是用于说明性的目的，不意图限制本发明的范围。

实施例1：通过蓝细菌中的基因敲除提高1-烯烃的产量

构建三种载体，从而制备了聚球蓝细菌属物种PCC7002的基因敲除菌株：nonA(SYNPCC7002_A1173)、上游推定的水解酶基因(SYNPCC7002_A1174)以及用作标记对照菌株的不相关基因(SYNPCC7002_A1189)。这些质粒含有侧翼于庆大霉素抗性标志物的相应基因的大约750bp上游和下游序列。这些质粒的DNA序列分别在SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7中给出。

菌株构建：

聚球蓝细菌属物种PCC7002的敲除菌株使用以下操作来制备。在含有200mg/L壮观霉素的A+培养基中的5ml培养物在150rpm在37℃在2％CO₂/空气和连续光照(70-130μEm2/sPAR，用LI-250A光度计(LI-COR)测量的)下在Infors摇动孵化器中孵育，直到它的OD₇₃₀达到1。A+培养基包含18.0g/L氯化钠、5.0g/L硫酸镁七水合物、1.0g/L硝酸钠、1.0g/LTris、0.6g/L氯化钾、0.3g/L氯化钙(无水的)、50mg/L磷酸二氢钾、34.3mg/L硼酸、29.4mg/LEDTA(二钠盐二水合物)、3.9mg/L氯化铁(III)六水合物、4.3mg/L氯化锰四水合物、315.0μg/L氯化锌、30.0μg/L氧化钼(VI)、12.2μg/L氯化钴(II)六水合物、10.0μg/L维生素B12和3.0μg/L硫酸铜(II)五水合物。对于每种质粒，将500μl的培养物和5μg质粒DNA添加到微离心管中。试管然后在250rpm在NewBrunswick摇动孵化器中在37℃在暗处孵育4h。每个转化250μl然后接种在A+琼脂平板上。平板在恒定的照明(40-60μE/m2/sPAR，用LI-250A光度计(LI-COR)测量的)下在37℃下中Percival灯照孵化器中孵育约24小时过夜。在第二天，将庆大霉素溶液添加到平板的琼脂的下方到最终估计的25mg/L庆大霉素浓度(假定平板中40mlA+琼脂)。将这些平板放回到孵化器中直到显现细小的菌落。将平板移动到处于相同条件下，只是在空气中维持1％CO₂的另一个Percival孵化器中(容许更快的生长)。来自每个转化平板的两个菌落在含有50mg/L庆大霉素的A+平板上划线，在Percival孵化器(环境CO₂浓度)中孵育直到出现菌落。重复这个接种步骤，除去了相应的基因(表1)的分离的菌株通过使用被设计以探测相应基因存在的引物的PCR筛选来鉴定。

表1：用于1-烯烃生产的研究的菌株。

JCC#	亲本菌株	基因型	标志物
				JCC138	NA	聚球蓝细菌属物种PCC 7002	NA
JCC1129	JCC138	ΔA1189(II型位点特异性脱氧核糖核酸酶)	庆大霉素
				JCC1218	JCC138	ΔA1173(nonA)	庆大霉素
JCC1219	JCC138	ΔA1174(含有水解酶结构域的蛋白质)	庆大霉素

培养条件

表1中所列的每种菌株的一个30ml培养物在JB2.1培养基(参见，例如，2010年6月17日公开的PCTUS2009/006516)中在125ml烧瓶中以OD₇₃₀＝0.2制备(接种物来自含有200mg/L大观霉素的5mlA+培养物，其是从在MultitronIIInfors摇动光孵育器中在～100μEm^-2s^-1光合活性辐射(PAR)的连续光照下在37℃在150rpm下在2％CO₂富集空气中孵育3天的菌落开始的)。培养物在Infors孵化器中在～100μEm^-2s^-1光合活性辐射(PAR)的连续光照下在37℃在150rpm在2％CO₂富集空气中孵育四天。通过添加回milli-Q水(根据烧瓶的重量损失)来补偿水分流失。进行730nm(OD₇₃₀)处的光密度测量(表2)。取出2.5ml的每种培养物，细胞使用SorvallRC6Plus超高速离心机(ThermoElectronCorp)和F13S-14X50CY转子(5000rpm10分钟)来团粒化。移除培养基上清液，细胞重悬浮在1mlMilli-Q水中。细胞再一次使用台式离心机来团粒化，丢弃上清液，细胞团粒保存在-80℃等待分析1-十九碳烯的存在。

菌株中1-十九碳烯的检测和定量

解冻细胞团粒，添加含有100ml/L丁基化羟基甲苯(Sigma-AldrichB1378)和50mg/L花生酸乙酯(SigmaA9010)的1ml等分量的丙酮(AcrosOrganics326570010)。细胞团粒涡旋15秒两次(整个提取时间1-2分钟)。悬浮液离心2分钟来团化碎屑，利用火焰电离检测(GC/FID)或质谱检测(GC/MS)用气相色谱仪来分析上清液。

装备有7683系列自动进样器的Agilent7890AGC/5975CEI-MS被用于确认1-十九碳烯的身份。1μL的每种样品使用脉冲的不分流注射(压力：20psi，脉冲时间：0.3分钟，吹扫时间：0.2分钟，清洗气流：15mL/分钟)来注射到GC进口中，进口温度280℃。柱是HP-5MS(Agilent，30mx0.25mmx0.25μm)，运载气体是1.0mL/分钟流动的氦气。GC烘箱温度程序是50℃保持一分钟；10℃/分钟提高到280℃，保持十分钟。GC/MS接口是290℃，监视的MS范围是25到600amu。JCC138的提取物中存在的峰具有与商业上可获得的1-十九碳烯标准物(Fluka74320)相同的保留时间(17.5分钟)和质谱(附图4)，确认了这个菌株的1-烯烃的生产。

装备有7683系列自动进样器的Agilent7890AGC/FID被用于定量1-十九碳烯。1μL的每种样品来注射到GC进口中(分流5：1，压力：20psi，脉冲时间：0.3分钟，吹扫时间：0.2分钟，清洗气流：15mL/分钟)，进口处在280℃的温度下。柱是HP-5MS(Agilent，30mx0.25mmx0.25μm)，运载气体是1.0mL/分钟流动的氦气。GC烘箱温度程序是50℃保持一分钟；10℃/分钟提高到280℃，保持十分钟。使用1-十九碳烯标准物(rt18.8)构建标准曲线，测定提取物中的浓度并标准化为花生酸乙酯(内标准物)的浓度。

聚球蓝细菌属物种PCC7002中nonA的删除取消了1-十九碳烯的生产，确认了该基因对于烯烃的产生是必不可少的(附图5)。与JCC138和JCC1129菌株相比，JCC1219(Δ水解酶)产生大约3x的1-十九碳烯(附图5；表2)。这表明了，JCC138可以被工程化来过度地生产1-烯烃。

表2：各种培养物中的OD730和1-十九碳烯细胞干重％(DCW)。

菌株	基因型	OD730	1-十九碳烯(％DCW*)
				JCC138	野生型	11.8	0.25
JCC1129	Δ核糖核酸酶	11.4	0.26
				JCC1218	ΔnonA	9.1	未检出
JCC1219	Δ水解酶	11.5	0.75

^*DCW是利用300mgL^-1OD₇₃₀ ^-1的实验上测定的平均值

根据OD测量来估计的。

实施例2：通过NonA的更短的链烯的生产

JCC138的三个30ml培养物在JB2.1中在125ml烧瓶中以OD₇₃₀＝0.07制备(接种物来自含有200mg/L大观霉素的5mlA+培养物，其是从在MultitronIIInfors摇动光孵育器中在～100μEm^-2s^-1光合活性辐射(PAR)的连续光照下在37℃在150rpm下在2％CO₂富集空气中孵育3天的菌落开始的)。培养物在Infors孵化器中在～100μEm^-2s^-1光合活性辐射(PAR)的连续光照下在37℃在150rpm在2％CO₂富集空气中孵育三天。所有三个培养物具有OD₇₃₀＝6.2。将在75μl乙醇中的2.8mg十三烷酸(Fluka91988)添加到一个烧瓶中，11.2mg的脂肪酸添加到另一个烧瓶的相同体积乙醇中。75μl乙醇添加到第三个烧瓶作为对照。培养物放回Infors中，孵育总共231.8h。进行703nm(OD₇₃₀)的光密度测量(表3)，细胞团粒样品进行细胞干重测定并用于1-烯烃提取。如实施例1描述的进行丙酮提取和GC分析。

GC/FIC析谱的检查显示了在十三烷酸-饲喂的培养物中几个新的峰的存在(附图6)。通过GC/MS的提取物的分析得以将这些峰之一鉴定为1-十八碳烯(附图6中r.t.17.8)。这通过将实验上测定的与峰相关的质谱与通过搜索NIST08MS数据库找到的质谱匹配进行匹配来进行。1-十八碳烯的定量通过根据对1-十九碳烯的实验上测定的响应因子估计响应因子来进行。在与十三烷酸孵育的培养物的1-十八碳烯的鉴定之后，JCC138光谱数据的检查揭示了JCC138产生了少量的1-十八碳烯。1-十八碳烯与1-十九碳烯的比例以及在JCC138培养物中发现的％DCWs在表3中给出。

表3：

在十三烷酸(FA)饲喂之后1-十八碳烯和1-十九碳烯的OD₇₃₀和％DCWs

^*标明了1-十八碳烯与1-十九碳烯的摩尔比。

实施例3：nonA的克隆和1-烯烃合成酶的表达

nonA(SYNPCC7002_A1173)的克隆

优选的克隆方法是根据从BLAST检索获得的核苷酸序列来合成nonA和/或A1174水解酶，任选地包括改变为反映了表达、酶结构或酶功能的期望的优化的序列。合成的1-烯烃合成酶和/或A1174水解酶基因可以从例如，DNA2.0(MenloPark，CA)获得。做为选择，PCR可以用于利用例如包含同源基因的JCC1138或蓝细菌作为来源来扩增基因。可以利用几种其他策略来将基因克隆到适合的宿主中，如在Ausubel，等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenPub.Assoc.andWileyIntersciences，N.Y.1993)以及Sambrook，等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual(ColdSpringHarbor，N.Y.2nded.1989)中描述的。

质粒pJB5被设计为用于重组到聚球蓝细菌属物种PCC7002中的空的表达载体。两个同源性区域，上游同源区(UHR)和下游同源区(DHR)被设计以侧翼于所述构建体。这些500bp的同源性区域分别相应于UHR和DHR的位置3301-3800和3801-4300(Genbank登记号NC_005025)。设计aadA启动子、基因序列和终止子以为整合构建体赋予壮观霉素和链霉素抗性。对于表达，pJB5被设计有aph2卡那霉素抗性盒启动子和核糖体结合位点(RBS)。这个启动子和RBS的下游，设计和插入了NdeI和EcoRI的限制性内切酶识别位点，以及XhoI、BamHI、SpeI和PacI的位点。在EcoRI位点之后，包括了来自Zymomonasmobilis(pdc)终止子的丙酮酸脱羧酶基因的天然终止子。方便的XbaI限制性位点侧翼于UHR和DHR，容许被设计用于从载体其余部分重组的DNA的切割。pJB5由DNA2.0(MenloPark，CA)构建。

pJB5-NonA载体的构建

来自JCC138的1-烯烃合成酶使用标准方法克隆到pJB5质粒中。构建体转化到高效率的NEB5-αF’Iq感受态的E.coli细胞(NewEnglandBioLabs，Ipswitch，MA)中。基因在大肠杆菌中表达，产生1-十九碳烯。

遗传修饰的聚球蓝细菌属物种PCC7002

使用以下方案将pJB5-NonA构建体克隆到聚球蓝细菌属物种PCC7002中。Synechococcus7002在FrigaardNU等人(2004)“GeneinactivationinthecyanobacteriumSynechococcussp.PCC7002andthegreensulfurbacteriumChlorobiumtepidumusinginvitro-madeDNAconstructsandnaturaltransformation”MethodsMolBiol274：325-340中描述的A⁺培养基中以1的OD₇₃₀在30℃下在1％CO₂中在孵育的摇动器烧瓶中从菌落生长48小时。对于每个构建体，将500μl的培养物添加到测试试管中，其具有自QiagenQIAprepSpinMiniprep试剂盒(Valencia，CA)制备的30μL的1-5μgDNA。细胞在大约每2秒一个气泡下在1％CO₂中鼓泡孵育4小时。将200μL的细胞接种在具有1.5％琼脂糖的A+培养平板上，在低光下在30℃生长两天。将10μg/mL的壮观霉素置于平板上。在7-10天可见抗性菌落。

在另一个实施方式中，更强的启动子和/或组成型和/或可诱导启动子置于nonA的前方，相对于除了缺乏所述更强的、组成型和/或可诱导启动子以外均相同的菌株，观察到更高的1-十九碳烯(和/或其他1-烯烃)生产。在另一个实施方式中，通过至少加倍染色体中的基因来提高细胞中nonA的拷贝数，相对于除了缺乏所述加倍的基因以外均相同的菌株，观察到更高的1-十九碳烯(和/或其他1-烯烃)的生产。

对在此提及的各个文献的完全引证在下文中提供：

Goodloe，R.S.andLight，R.J.1982.Structureandcompositionofhydrocarbonsandfattyacidsfromamarineblue-greenalga，Synechococcussp.BiochimicaetBiophysicaActa710：485-492.

Gu，L.，Wang，B.，Kulkarni，A.，Gehret，J.J.，Lloyd，K.R.，Gerwick，L.，Gerwick，W.H.，Wipf，P.，K.，Smith，J.L.andSherman，D.H.2009.PolyketidedecarboxylativechainterminationprecededbyO-sulfonationincuracinAbiosynthesis.JournaloftheAmericanChemicalSociety131：16033-16035.

Higashi，S.andMurata，N.1993.Aninvivostudyofsubstratespecificitiesofacyl-lipiddesaturasesandacyltransferasesinlipidsynthesisinSynechocystisPCC6803.PlantPhysiology102：1275-1278.

Kaczmarzyk，D.andFulda，M.2010.Fattyacidactivationincyanobacteriamediatedbyacyl-acylcarrierproteinsynthetaseenablesfattyacidrecycling.PlantPhysiology152：1598-1610.

Lin，J.-W.，Chao，Y-.F.andWeng，S.-F.1996.NucleotidesequenceandfunctionalanalysisoftheluxEgeneencodingacyl-proteinsynthetaseoftheluxoperonfromPhotobacteriumleiognathi.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications228：764-773.

Williams，J.P.，Maissan，E.，Mitchell，K.andKhan，J.P.1990.Themanipulationofthefattyacidcompositionofglycerolipidsincyanobacteriausingexogenousfattyacids.PlantCellPhysiology31：495-503.

Winters，K.，Parker，P.L.andVanBaalen，C.1969.HydrocarbonsofBlue-GreenAlgae：GeochemicalSignificance.Science163：467-468.

在此提及的所有出版物、专利和其他参考文献为了所有目的、通过以它们的整体引用而合并在此。

非正式的序列表

SEQIDNO.1

＞SYNPCC7002_A11731-烯烃合成酶(PKS)[聚球蓝细菌属物种PCC7002]

ATGGTTGGTCAATTTGCAAATTTCGTCGATCTGCTCCAGTACAGAGCTAAACTTCAGGCGCGGAAAACCG

TGTTTAGTTTTCTGGCTGATGGCGAAGCGGAATCTGCGGCCCTGACCTACGGAGAATTAGACCAAAAAGC

CCAGGCGATCGCCGCTTTTTTGCAAGCTAACCAGGCTCAAGGGCAACGGGCATTATTACTTTATCCACCG

GGTTTAGAGTTTATCGGTGCCTTTTTGGGATGTTTGTATGCTGGTGTTGTTGCGGTGCCAGCTTACCCAC

CACGGCCGAATAAATCCTTTGACCGCCTCCATAGCATTATCCAAGATGCCCAGGCAAAATTTGCCCTCAC

CACAACAGAACTTAAAGATAAAATTGCCGATCGCCTCGAAGCTTTAGAAGGTACGGATTTTCATTGTTTG

GCTACAGATCAAGTTGAATTAATTTCAGGAAAAAATTGGCAAAAACCGAACATTTCCGGCACAGATCTCG

CTTTTTTGCAATACACCAGTGGCTCCACGGGCGATCCTAAAGGAGTGATGGTTTCCCACCACAATTTGAT

CCACAACTCCGGCTTGATTAACCAAGGATTCCAGGATACAGAGGCGAGTATGGGCGTTTCCTGGTTGCCG

CCCTACCATGATATGGGCTTGATCGGTGGGATTTTACAGCCCATCTATGTGGGAGCAACGCAAATTTTAA

TGCCTCCCGTGGCCTTTTTGCAGCGACCTTTTCGGTGGCTAAAGGCGATCAACGATTATCGGGTTTCCAC

CAGCGGTGCGCCGAATTTTGCCTATGATCTCTGTGCCAGCCAAATTACCCCGGAACAAATCAGAGAACTC

GATTTGAGCTGTTGGCGACTGGCTTTTTCCGGGGCCGAACCGATCCGCGCTGTGACCCTCGAAAATTTTG

CGAAAACCTTCGCTACAGCAGGCTTTCAAAAATCAGCATTTTATCCCTGTTATGGTATGGCTGAAACCAC

CCTGATCGTTTCCGGTGGTAATGGTCGTGCCCAGCTTCCCCAGGAAATTATCGTCAGCAAACAGGGCATC

GAAGCAAACCAAGTTCGCCCTGCCCAAGGGACAGAAACAACGGTGACCTTGGTCGGCAGTGGTGAAGTGA

TTGGCGACCAAATTGTCAAAATTGTTGACCCCCAGGCTTTAACAGAATGTACCGTCGGTGAAATTGGCGA

AGTATGGGTTAAGGGCGAAAGTGTTGCCCAGGGCTATTGGCAAAAGCCAGACCTCACCCAGCAACAATTC

CAGGGAAACGTCGGTGCAGAAACGGGCTTTTTACGCACGGGCGATCTGGGTTTTTTGCAAGGTGGCGAAC

TGTATATTACGGGTCGTTTAAAGGATCTCCTGATTATCCGGGGGCGCAACCACTATCCCCAGGACATTGA

ATTAACCGTCGAAGTGGCCCATCCCGCTTTACGACAGGGGGCCGGAGCCGCTGTATCAGTAGACGTTAAC

GGGGAAGAACAGTTAGTCATTGTCCAGGAAGTTGAGCGTAAATATGCCCGCAAATTAAATGTCGCGGCAG

TAGCCCAAGCTATTCGTGGGGCGATCGCCGCCGAACATCAACTGCAACCCCAGGCCATTTGTTTTATTAA

ACCCGGTAGCATTCCCAAAACATCCAGCGGGAAGATTCGTCGCCATGCCTGCAAAGCTGGTTTTCTAGAC

GGAAGCTTGGCTGTGGTTGGGGAGTGGCAACCCAGCCACCAAAAAGAAGGAAAAGGAATTGGGACACAAG

CCGTTACCCCTTCTACGACAACATCAACGAATTTTCCCCTGCCTGACCAGCACCAACAGCAAATTGAAGC

CTGGCTTAAGGATAATATTGCCCATCGCCTCGGCATTACGCCCCAACAATTAGACGAAACGGAACCCTTT

GCAAGTTATGGGCTGGATTCAGTGCAAGCAGTACAGGTCACAGCCGACTTAGAGGATTGGCTAGGTCGAA

AATTAGACCCCACTCTGGCCTACGATTATCCGACCATTCGCACCCTGGCTCAGTTTTTGGTCCAGGGTAA

TCAAGCGCTAGAGAAAATACCACAGGTGCCGAAAATTCAGGGCAAAGAAATTGCCGTGGTGGGTCTCAGT

TGTCGTTTTCCCCAAGCTGACAACCCCGAAGCTTTTTGGGAATTATTACGTAATGGTAAAGATGGAGTTC

GCCCCCTTAAAACTCGCTGGGCCACGGGAGAATGGGGTGGTTTTTTAGAAGATATTGACCAGTTTGAGCC

GCAATTTTTTGGCATTTCCCCCCGGGAAGCGGAACAAATGGATCCCCAGCAACGCTTACTGTTAGAAGTA

ACCTGGGAAGCCTTGGAACGGGCAAATATTCCGGCAGAAAGTTTACGCCATTCCCAAACGGGGGTTTTTG

TCGGCATTAGTAATAGTGATTATGCCCAGTTGCAGGTGCGGGAAAACAATCCGATCAATCCCTACATGGG

GACGGGCAACGCCCACAGTATTGCTGCGAATCGTCTGTCTTATTTCCTCGATCTCCGGGGCGTTTCTCTG

AGCATCGATACGGCCTGTTCCTCTTCTCTGGTGGCGGTACATCTGGCCTGTCAAAGTTTAATCAACGGCG

AATCGGAGTTGGCGATCGCCGCCGGGGTGAATTTGATTTTGACCCCCGATGTGACCCAGACTTTTACCCA

GGCGGGCATGATGAGTAAGACGGGCCGTTGCCAGACCTTTGATGCCGAGGCTGATGGCTATGTGCGGGGC

GAAGGTTGTGGGGTCGTTCTCCTCAAACCCCTGGCCCAGGCAGAACGGGACGGGGATAATATTCTCGCGG

TGATCCACGGTTCGGCGGTGAATCAAGATGGACGCAGTAACGGTTTGACGGCTCCCAACGGGCGATCGCA

ACAGGCCGTTATTCGCCAAGCCCTGGCCCAAGCCGGCATTACCGCCGCCGATTTAGCTTACCTAGAGGCC

CACGGCACCGGCACGCCCCTGGGTGATCCCATTGAAATTAATTCCCTGAAGGCGGTTTTACAAACGGCGC

AGCGGGAACAGCCCTGTGTGGTGGGTTCTGTGAAAACAAACATTGGTCACCTCGAGGCAGCGGCGGGCAT

CGCGGGCTTAATCAAGGTGATTTTGTCCCTAGAGCATGGAATGATTCCCCAACATTTGCATTTTAAGCAG

CTCAATCCCCGCATTGATCTAGACGGTTTAGTGACCATTGCGAGCAAAGATCAGCCTTGGTCAGGCGGGT

CACAAAAACGGTTTGCTGGGGTAAGTTCCTTTGGGTTTGGTGGCACCAATGCCCACGTGATTGTCGGGGA

CTATGCTCAACAAAAATCTCCCCTTGCTCCTCCGGCTACCCAAGACCGCCCTTGGCATTTGCTGACCCTT

TCTGCTAAAAATGCCCAGGCCTTAAATGCCCTGCAAAAAAGCTATGGAGACTATCTGGCCCAACATCCCA

GCGTTGACCCACGCGATCTCTGTTTGTCTGCCAATACCGGGCGATCGCCCCTCAAAGAACGTCGTTTTTT

TGTCTTTAAACAAGTCGCCGATTTACAACAAACTCTCAATCAAGATTTTCTGGCCCAACCACGCCTCAGT

TCCCCCGCAAAAATTGCCTTTTTGTTTACGGGGCAAGGTTCCCAATACTACGGCATGGGGCAACAACTGT

ACCAAACCAGCCCAGTATTTCGGCAAGTGCTGGATGAGTGCGATCGCCTCTGGCAGACCTATTCCCCCGA

AGCCCCTGCCCTCACCGACCTGCTGTACGGTAACCATAACCCTGACCTCGTCCACGAAACTGTCTATACC

CAGCCCCTCCTCTTTGCTGTTGAATATGCGATCGCCCAACTATGGTTAAGCTGGGGCGTGACGCCAGACT

TTTGCATGGGCCATAGCGTCGGCGAATATGTCGCGGCTTGTCTGGCGGGGGTATTTTCCCTGGCAGACGG

CATGAAATTAATTACGGCCCGGGGCAAACTGATGCACGCCCTACCCAGCAATGGCAGTATGGCGGCGGTC

TTTGCCGATAAAACGGTCATCAAACCCTACCTATCGGAGCATTTGACCGTCGGAGCCGAAAACGGTTCCC

ATTTGGTGCTATCAGGAAAGACCCCCTGCCTCGAAGCCAGTATTCACAAACTCCAAAGCCAAGGGATCAA

AACCAAACCCCTCAAGGTTTCCCATGCTTTCCACTCCCCTTTGATGGCTCCCATGCTGGCAGAGTTTCGG

GAAATTGCTGAACAAATTACTTTCCACCCGCCGCGTATCCCGCTCATTTCCAATGTCACGGGCGGCCAGA

TTGAAGCGGAAATTGCCCAGGCCGACTATTGGGTTAAGCACGTTTCGCAACCCGTCAAATTTGTCCAGAG

CATCCAAACCCTGGCCCAAGCGGGTGTCAATGTTTATCTCGAAATCGGCGTAAAACCAGTGCTCCTGAGT

ATGGGACGCCATTGCTTAGCTGAACAAGAAGCGGTTTGGTTGCCCAGTTTACGTCCCCATAGTGAGCCTT

GGCCGGAAATTTTGACCAGTCTCGGCAAACTGTATGAGCAAGGGCTAAACATTGACTGGCAGACCGTGGA

AGCTGGCGATCGCCGCCGGAAACTGATTCTGCCCACCTATCCCTTCCAACGGCAACGATATTGGTTTAAT

CAAGGCTCTTGGCAAACTGTTGAGACCGAATCTGTGAACCCAGGCCCTGACGATCTCAATGATTGGTTGT

ATCAGGTGGCGTGGACGCCCCTGGACACTTTGCCCCCGGCCCCTGAACCGTCGGCTAAGCTGTGGTTAAT

CTTGGGCGATCGCCATGATCACCAGCCCATTGAAGCCCAATTTAAAAACGCCCAGCGGGTGTATCTCGGC

CAAAGCAATCATTTTCCGACGAATGCCCCCTGGGAAGTATCTGCCGATGCGTTGGATAATTTATTTACTC

ACGTCGGCTCCCAAAATTTAGCAGGCATCCTTTACCTGTGTCCCCCAGGGGAAGACCCAGAAGACCTAGA

TGAAATTCAAAAGCAAACCAGTGGCTTCGCCCTCCAACTGATCCAAACCCTGTATCAACAAAAGATCGCG

GTTCCCTGCTGGTTTGTGACCCACCAGAGCCAACGGGTGCTTGAAACCGATGCTGTCACCGGATTTGCCC

AAGGGGGATTATGGGGACTCGCCCAGGCGATCGCCCTCGAACATCCAGAGTTGTGGGGGGGAATTATTGA

TGTCGATGACAGCCTGCCAAATTTTGCCCAGATTTGCCAACAAAGACAGGTGCAGCAGTTGGCCGTGCGG

CACCAAAAACTCTACGGGGCACAGCTCAAAAAGCAACCGTCACTGCCCCAGAATCTCCAGATTCAAC

CCCAACAGACCTATCTAGTGACAGGGGGACTGGGGGCCATTGGCCGTAAAATTGCCCAATGGCTAGCCGC

AGCAGGAGCAGAAAAAGTAATTCTCGTCAGCCGGCGCGCTCCGGCAGCGGATCAGCAGACGTTACCGACC

AATGCGGTGGTTTATCCTTGCGATTTAGCCGACGCAGCCCAGGTGGCAAAGCTGTTTCAAACCTATCCCC

ACATCAAAGGAATTTTCCATGCGGCGGGTACCTTAGCTGATGGTTTGCTGCAACAACAAACTTGGCAAAA

GTTCCAGACCGTCGCCGCCGCCAAAATGAAAGGGACATGGCATCTGCACCGCCATAGTCAAAAGCTCGAT

CTGGATTTTTTTGTGTTGTTTTCCTCTGTGGCAGGGGTGCTCGGTTCACCGGGACAGGGGAATTATGCCG

CCGCAAACCGGGGCATGGCGGCGATCGCCCAATATCGACAAGCCCAAGGTTTACCCGCCCTGGCGATCCA

TTGGGGGCCTTGGGCCGAAGGGGGAATGGCCAACTCCCTCAGCAACCAAAATTTAGCGTGGCTGCCGCCC

CCCCAGGGACTAACAATCCTCGAAAAAGTCTTGGGCGCCCAGGGGGAAATGGGGGTCTTTAAACCGGACT

GGCAAAACCTGGCCAAACAGTTCCCCGAATTTGCCAAAACCCATTACTTTGCAGCCGTTATTCCCTCTGC

TGAGGCTGTGCCCCCAACGGCTTCAATTTTTGACAAATTAATCAACCTAGAAGCTTCTCAGCGGGCTGAC

TATCTACTGGATTATCTGCGGCGGTCTGTGGCGCAAATCCTCAAGTTAGAAATTGAGCAAATTCAAAGCC

ACGATAGCCTGTTGGATCTGGGCATGGATTCGTTGATGATCATGGAGGCGATCGCCAGCCTCAAGCAGGA

TTTACAACTGATGTTGTACCCCAGGGAAATCTACGAACGGCCCAGACTTGATGTGTTGACGGCCTATCTA

GCGGCGGAATTCACCAAGGCCCATGATTCTGAAGCAGCAACGGCGGCAGCAGCGATTCCCTCCCAAAGCC

TTTCGGTCAAAACAAAAAAACAGTGGCAAAAACCTGACCACAAAAACCCGAATCCCATTGCCTTTATCCT

CTCTAGCCCCCGGTCGGGTTCGACGTTGCTGCGGGTGATGTTAGCCGGACATCCGGGGTTATATTCGCCG

CCAGAGCTGCATTTGCTCCCCTTTGAGACTATGGGCGATCGCCACCAGGAATTGGGTCTATCCCACCTCG

GCGAAGGGTTACAACGGGCCTTAATGGATCTAGAAAACCTCACCCCAGAGGCAAGCCAGGCGAAGGTCAA

CCAATGGGTCAAAGCGAATACACCCATTGCAGACATCTATGCCTATCTCCAACGGCAGGCGGAACAACGT

TTACTCATCGACAAATCTCCCAGCTACGGCAGCGATCGCCATATTCTAGACCACAGCGAAATCCTCTTTG

ACCAGGCCAAATATATCCATCTGGTACGCCATCCCTACGCGGTGATTGAATCCTTTACCCGACTGCGGAT

GGATAAACTGCTGGGGGCCGAGCAGCAGAACCCCTACGCCCTCGCGGAGTCCATTTGGCGCACCAGCAAC

CGCAATATTTTAGACCTGGGTCGCACGGTTGGTGCGGATCGATATCTCCAGGTGATTTACGAAGATCTCG

TCCGTGACCCCCGCAAAGTTTTGACAAATATTTGTGATTTCCTGGGGGTGGACTTTGACGAAGCGCTCCT

CAATCCCTACAGCGGCGATCGCCTTACCGATGGCCTCCACCAACAGTCCATGGGCGTCGGGGATCCCAAT

TTCCTCCAGCACAAAACCATTGATCCGGCCCTCGCCGACAAATGGCGCTCAATTACCCTGCCCGCTGCTC

TCCAGCTGGATACGATCCAGTTGGCCGAAACGTTTGCTTACGATCTCCCCCAGGAACCCCAGCTAACACC

CCAGACCCAATCCTTGCCCTCGATGGTGGAGCGGTTCGTGACAGTGCGCGGTTTAGAAACCTGTCTCTGT

GAGTGGGGCGATCGCCACCAACCATTGGTGCTACTTCTCCACGGCATCCTCGAACAGGGGGCCTCCTGGC

AACTCATCGCGCCCCAGTTGGCGGCCCAGGGCTATTGGGTTGTGGCCCCAGACCTGCGTGGTCACGGCAA

ATCCGCCCATGCCCAGTCCTACAGCATGCTTGATTTTTTGGCTGACGTAGATGCCCTTGCCAAACAATTA

GGCGATCGCCCCTTTACCTTGGTGGGCCACTCCATGGGTTCCATCATCGGTGCCATGTATGCAGGAATTC

GCCAAACCCAGGTAGAAAAGTTGATCCTCGTTGAAACCATTGTCCCCAACGACATCGACGACGCTGAAAC

CGGTAATCACCTGACGACCCATCTCGATTACCTCGCCGCGCCCCCCCAACACCCGATCTTCCCCAGCCTA

GAAGTGGCCGCCCGTCGCCTCCGCCAAGCCACGCCCCAACTACCCAAAGACCTCTCGGCGTTCCTCACCC

AGCGCAGCACCAAATCCGTCGAAAAAGGGGTGCAGTGGCGTTGGGATGCTTTCCTCCGTACCCGGGCGGG

CATTGAATTCAATGGCATTAGCAGACGACGTTACCTGGCCCTGCTCAAAGATATCCAAGCGCCGATCACC

CTCATCTATGGCGATCAGAGTGAATTTAACCGCCCTGCTGATCTCCAGGCGATCCAAGCGGCTCTCCCCC

AGGCCCAACGTTTAACGGTTGCTGGCGGCCATAACCTCCATTTTGAGAATCCCCAGGCGATCGCCCAAAT

TGTTTATCAACAACTCCAGACCCCTGTACCCAAAACACAATAA

SEQIDNO.2

＞gi|170077790|ref|YP_001734428.1|1-烯烃合成酶[聚球蓝细菌属物种PCC7002]

MVGQFANFVDLLQYRAKLQARKTVFSFLADGEAESAALTYGELDQKAQAIAAFLQANQAQGQRALLLYPP

GLEFIGAFLGCLYAGVVAVPAYPPRPNKSFDRLHSIIQDAQAKFALTTTELKDKIADRLEALEGTDFHCL

ATDQVELISGKNWQKPNISGTDLAFLQYTSGSTGDPKGVMVSHHNLIHNSGLINQGFQDTEASMGVSWLP

PYHDMGLIGGILQPIYVGATQILMPPVAFLQRPFRWLKAINDYRVSTSGAPNFAYDLCASQITPEQIREL

DLSCWRLAFSGAEPIRAVTLENFAKTFATAGFQKSAFYPCYGMAETTLIVSGGNGRAQLPQEIIVSKQGI

EANQVRPAQGTETTVTLVGSGEVIGDQIVKIVDPQALTECTVGEIGEVWVKGESVAQGYWQKPDLTQQQF

QGNVGAETGFLRTGDLGFLQGGELYITGRLKDLLIIRGRNHYPQDIELTVEVAHPALRQGAGAAVSVDVN

GEEQLVIVQEVERKYARKLNVAAVAQAIRGAIAAEHQLQPQAICFIKPGSIPKTSSGKIRRHACKAGFLD

GSLAVVGEWQPSHQKEGKGIGTQAVTPSTTTSTNFPLPDQHQQQIEAWLKDNIAHRLGITPQQLDETEPF

ASYGLDSVQAVQVTADLEDWLGRKLDPTLAYDYPTIRTLAQFLVQGNQALEKIPQVPKIQGKEIAVVGLS

CRFPQADNPEAFWELLRNGKDGVRPLKTRWATGEWGGFLEDIDQFEPQFFGISPREAEQMDPQQRLLLEV

TWEALERANIPAESLRHSQTGVFVGISNSDYAQLQVRENNPINPYMGTGNAHSIAANRLSYFLDLRGVSL

SIDTACSSSLVAVHLACQSLINGESELAIAAGVNLILTPDVTQTFTQAGMMSKTGRCQTFDAEADGYVRG

EGCGVVLLKPLAQAERDGDNILAVIHGSAVNQDGRSNGLTAPNGRSQQAVIRQALAQAGITAADLAYLEA

HGTGTPLGDPIEINSLKAVLQTAQREQPCVVGSVKTNIGHLEAAAGIAGLIKVILSLEHGMIPQHLHFKQ

LNPRIDLDGLVTIASKDQPWSGGSQKRFAGVSSFGFGGTNAHVIVGDYAQQKSPLAPPATQDRPWHLLTL

SAKNAQALNALQKSYGDYLAQHPSVDPRDLCLSANTGRSPLKERRFFVFKQVADLQQTLNQDFLAQPRLS

SPAKIAFLFTGQGSQYYGMGQQLYQTSPVFRQVLDECDRLWQTYSPEAPALTDLLYGNHNPDLVHETVYT

QPLLFAVEYAIAQLWLSWGVTPDFCMGHSVGEYVAACLAGVFSLADGMKLITARGKLMHALPSNGSMAAV

FADKTVIKPYLSEHLTVGAENGSHLVLSGKTPCLEASIHKLQSQGIKTKPLKVSHAFHSPLMAPMLAEFR

EIAEQITFHPPRIPLISNVTGGQIEAEIAQADYWVKHVSQPVKFVQSIQTLAQAGVNVYLEIGVKPVLLS

MGRHCLAEQEAVWLPSLRPHSEPWPEILTSLGKLYEQGLNIDWQTVEAGDRRRKLILPTYPFQRQRYWFN

QGSWQTVETESVNPGPDDLNDWLYQVAWTPLDTLPPAPEPSAKLWLILGDRHDHQPIEAQFKNAQRVYLG

QSNHFPTNAPWEVSADALDNLFTHVGSQNLAGILYLCPPGEDPEDLDEIQKQTSGFALQLIQTLYQQKIA

VPCWFVTHQSQRVLETDAVTGFAQGGLWGLAQAIALEHPELWGGIIDVDDSLPNFAQICQQRQVQQLAVR

HQKLYGAQLKKQPSLPQKNLQIQPQQTYLVTGGLGAIGRKIAQWLAAAGAEKVILVSRRAPAADQQTLPT

NAVVYPCDLADAAQVAKLFQTYPHIKGIFHAAGTLADGLLQQQTWQKFQTVAAAKMKGTWHLHRHSQKLD

LDFFVLFSSVAGVLGSPGQGNYAAANRGMAAIAQYRQAQGLPALAIHWGPWAEGGMANSLSNQNLAWLPP

PQGLTILEKVLGAQGEMGVFKPDWQNLAKQFPEFAKTHYFAAVIPSAEAVPPTASIFDKLINLEASQRAD

YLLDYLRRSVAQILKLEIEQIQSHDSLLDLGMDSLMIMEAIASLKQDLQLMLYPREIYERPRLDVLTAYL

AAEFTKAHDSEAATAAAAIPSQSLSVKTKKQWQKPDHKNPNPIAFILSSPRSGSTLLRVMLAGHPGLYSP

PELHLLPFETMGDRHQELGLSHLGEGLQRALMDLENLTPEASQAKVNQWVKANTPIADIYAYLQRQAEQR

LLIDKSPSYGSDRHILDHSEILFDQAKYIHLVRHPYAVIESFTRLRMDKLLGAEQQNPYALAESIWRTSN

RNILDLGRTVGADRYLQVIYEDLVRDPRKVLTNICDFLGVDFDEALLNPYSGDRLTDGLHQQSMGVGDPN

FLQHKTIDPALADKWRSITLPAALQLDTIQLAETFAYDLPQEPQLTPQTQSLPSMVERFVTVRGLETCLC

EWGDRHQPLVLLLHGILEQGASWQLIAPQLAAQGYWVVAPDLRGHGKSAHAQSYSMLDFLADVDALAKQL

GDRPFTLVGHSMGSIIGAMYAGIRQTQVEKLILVETIVPNDIDDAETGNHLTTHLDYLAAPPQHPIFPSL

EVAARRLRQATPQLPKDLSAFLTQRSTKSVEKGVQWRWDAFLRTRAGIEFNGISRRRYLALLKDIQAPIT

LIYGDQSEFNRPADLQAIQAALPQAQRLTVAGGHNLHFENPQAIAQIVYQQLQTPVPKTQ

SEQIDNO.3

SYNPCC7002_A1174

含有水解酶α/β折叠结构域的蛋白质

＞gi|170076636：c1215155-1214256聚球蓝细菌属物种PCC7002

ATGACCATTACTTCCCCCGCTCATCCCCATACCGATTACAGCTGGCAATGGCACGGCTTCAATATTAACT

ATCGTCAGTGGGGCACCCAGGGGCTGCCCGTTCTTTTCGTCCATGGCTTTGGGGCCTCGGCCGGTCATTG

GCGCAAAAATCTTCCGGTTTTAGGGGAACATTACCGCTGCTATGCCATCGACTTACTGGGCTTTGGGAAA

TCGGCAAAACCCCAACCGGAGGTTGAAGCGGACTACACTTTTGAAACTTGGGCCACCCAGATTAAGGCGT

TCTGTGCTGAAATCATTGGTGAACCGGCTTTTCTAGTTGGTAATTCCATTGGTTGTGTCGTTGTCATGCA

GGCGGCTGTGTCCTATCCCCACTGGGTGCGGGGGGTTGTGGCACTCAATTTTTCCCTGCGGCTGTTCCAT

GAGCGCAATCTTTTAAAAGCACCTTTTTATCAACGCTGGGGCGTTCCCCTCTTCCAAAAACTCTTGACCC

AAACCCCCCTCGGTTCCTTGTTCTTTAAGCAATTGGCCCAGCCGAAAACAATCCGCAAAATTTTAGCCCA

GGCCTACCGAGACAAAACAGCGATTACCGATGAGTTGGTGGAGCTGATCCTGACCCCCGCCCAGGACCCA

GGGGCGGCAGCGGTTTTCCTGGCCTTTACGAGTTATTCCCAGGGGCCACTCCCGGACGACCTGCTGCCCC

AGTTGCATTGCCCCACGGCAGTTTTGTGGGGAACAGCGGATCCGTGGGAACCAGTTGATCTGGGCCGTGC

CCTTGTCGCCCAATATCCTCAGATTGAGTTTATTCCCCTCGATAATGTCGGCCATTGTCCCCAGGATGAA

GCTCCGGCATTAGTCAACGGCTATTTACTCGATTGGTTAGGGCGACAACAGTCAGCGTAG

SEQIDNO.4

＞gi|170077791|ref|YP_001734429.1|含有水解酶α/β折叠结构域的蛋白质[聚球蓝细菌属物种PCC7002]

MTITSPAHPHTDYSWQWHGFNINYRQWGTQGLPVLFVHGFGASAGHWRKNLPVLGEHYRCYAIDLLGFGK

SAKPQPEVEADYTFETWATQIKAFCAEIIGEPAFLVGNSIGCVVVMQAAVSYPHWVRGVVALNFSLRLFH

ERNLLKAPFYQRWGVPLFQKLLTQTPLGSLFFKQLAQPKTIRKILAQAYRDKTAITDELVELILTPAQDP

GAAAVFLAFTSYSQGPLPDDLLPQLHCPTAVLWGTADPWEPVDLGRALVAQYPQIEFIPLDNVGHCPQDE

APALVNGYLLDWLGRQQSA

SEQIDNO5

pJB844的序列，SYNPCC7002_A1173的敲除载体(UHR和DHR为斜体字；aacC1庆大霉素标志物是下划线的)

TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTGAAAAA

GCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGAT

TCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCAT

GAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTA

CGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGC

GATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAA

TATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCAT

GCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCA

TCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATAC

AAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTT

GGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTA

TCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAA

CCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTTTGCCTGG

CGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTG

GGGACTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTT

TCGCCCGGGCTAATTAGGGGGTGTCGCCCTTCTGAAGTGGGGCCTGCAGG

GCGGCCGCTCATATGTAACAGGAATTCGGTTACTAGTTTTTAATTAAcgaatccatgtgggagtttattcttgacacagatatttatgatataataac

tgagtaagcttaacataaggaggaaaaactaatgttacgcagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaggtggctcaagtatgggcatcattcgcacatgta

ggctcggccctgaccaagtcaaatccatgcgggctgctcttgatcttttcggtcgtgagttcggagacgtagccacctactcccaacatcagccggactccgattacctcgggaacttgctccg

tagtaagacattcatcgcgcttgctgccttcgaccaagaagcggttgttggcgctctcgcggcttacgttctgcccaagtttgagcagccgcgtagtgagatctatatctatgatctcgcagtctc

cggcgagcaccggaggcagggcattgccaccgcgctcatcaatctcctcaagcatgaggccaacgcgcttggtgcttatgtgatctacgtgcaagcagattacggtgacgatcccgcagtg

gctctctatacaaagttgggcatacgggaagaagtgatgcactttgatatcgacccaagtaccgccacctaGGcgcgcc

ggccggCCAACGTCAAAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAA

TGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATATCA

AAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAA

AAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGCAACGTATCTTATTTAAAGTG

CGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACAGGCGCCCTTAAATATTCTGA

CAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCGCCGAAGCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGAT

TACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAG

AAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTT

CCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACG

GTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAA

AAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAG

AGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTC

CGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGT

AGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTG

CGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTA

ACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAG

AAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCA

AACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGA

AGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGT

CATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTT

SEQIDNO6

pJB845的序列，SYNPCC7002_A1174的敲除载体(UHR和DHR为斜体字；

aacC1庆大霉素标志物是下划线的)。

TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAA

GCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGAT

TCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCAT

GAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTA

CGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGC

GATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAA

TATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCAT

GCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCA

TCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATAC

AAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTT

GGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTA

TCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAA

CCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTTTGCCTGG

CGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTG

GGGACTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTT

TCGCCCGGGCTAATTAGGGGGTGTCGCCCTTCTGAAGTGGGGCCTGCA

GCGGCC

GCTCATATGTAACAGGAATTCGGTTACTAGTTTTTAATTAAcgaatccatgtgggagtttattcttgacacagatatttatgatataataactgagtaagctt

aacataaggaggaaaaactaatgttacgcagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaggtggctcaagtatgggcatcattcgcacatgtaggctcggccc

tgaccaagtcaaatccatgcgggctgctcttgatcttttcggtcgtgagttcggagacgtagccacctactcccaacatcagccggactccgattacctcgggaacttgctccgtagtaagacat

tcatcgcgcttgctgccttcgaccaagaagcggttgttggcgctctcgcggcttacgttctgcccaagtttgagcagccgcgtagtgagatctatatctatgatctcgcagtctccggcgagcac

cggaggcagggcattgccaccgcgctcatcaatctcctcaagcatgaggccaacgcgcttggtgcttatgtgatctacgtgcaagcagattacggtgacgatcccgcagtggctctctataca

aagttgggcatacgggaagaagtgatgcactttgatatcgacccaagtaccgccacctaGGcgcgcc

ggccgg

CCAACGTCAAAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATA

TTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATATCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTT

AATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGT

TCATCAATCGAAAAAGCAACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATA

TATCAAGCAAAGTGACAGGCGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCG

CCGAAGCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGA

CTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGT

TTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGG

CGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATG

TGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCC

CTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGT

TTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTT

CGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGC

TGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAG

ACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAG

TTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTAC

CTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGC

AGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAA

CGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGC

TT

SEQIDNO：7

pJB808的序列，SYPCC7002_A1189的敲除载体(UHR和DHR为斜体字；aacC1庆大霉素标志物是下划线的)。

TAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAG

CCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATT

CCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATG

AGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTAC

GCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGCG

ATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAAT

ATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATG

CATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATC

TCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAA

GCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGG

AATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATC

AGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACC

AATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTTTGCCTGGCG

GCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGG

GACTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTC

GCCCGGGCTAATTAGGGGGTGTCGCCCTTATTCGACTCTATAGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTT

CTGAAGTGGGGAAGCTTAAGTATAGGAACTTCTGAAGTGGGGCCTGCA

CGCGGCC

GCGGTACCCATATGTAACAGGAATTCACTAGTTTTTAATTAAcgaatccatgtggggaggtttattcttggacacaggatatttatgatataataactgagtaag

cttaacataaggaggaaaaactaatgttacgcagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaggtggctcaagtatgggcatcattcgcacatgtaggctcggc

cctgaccaaggtcaaatccatgcgggctgctcttgatcttttcgggtcggtggagttcggaggacgtagccacctactcccaacatcagccggactccgattacctcgggaacttgctccgtagtaagga

cattcatcgcgcttgctgccttcggaccaagaagcggttgttggcgctctcgcggcttacgttctggcccaagtttggaggcaggccgcgtagtggaggatctatatctatgatctcgcagtctccggcgag

caccggagggcaggggcattgccaccgcggctcatcaatctcctcaagcatgaggccaacgcgcttggtgcttatgtgatctacgtgcaagcagattacggtgacgatcccgcagtggctctctat

acaaagttgggcatacggggaagaagtgatggcactttgatatcggacccaagtaccggccacctaGGCGCGCC

G

GCCGGCCAAAATGAAGTGAAGTTCCTATACTTAAGCTTAAAATGAAGTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGG

AACTTCTATAGTGAGTCGAATAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAG

TTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATATCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGA

TTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAA

TTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGCAACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAAT

AATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACAGGCGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATA

AAAAAACCCGCCGAAGCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCC

CGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCC

TTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCG

TTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGG

AAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAG

GCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAG

ATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCG

CCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCT

CCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCC

AACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGC

GGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCT

GAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTT

TTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGA

CGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAG

CGTAATGCTCTGCTTT

SEQIDNO：8

来自蓝丝菌属物种PCC7424的NonA同源物YP_002377174.1

MKRNFSNFVDLLNHRAETQSDKILFTFLGDGETESLSLTYQQLDQQARAIAVQLQSLNATGERALLLYQP

GLEFISAFFGCLYGGVIPVPAYPPRANRSIERLQAIVSDAEAKFALTSESLVNSIEGKLTQSLSQEAIQC

VTTDNLELSLSQGWHKPKINPEQLAFLQYTSGSTGNPKGVMVSHSNLMHNAALINHYFQDTPESRGASWL

PPYHDMGLIGGILQPIYVGVYVVLMPPVTFLQRPLRWLEVISRYRITTSGAPNFAYELCATQITPEQREN

LDLSCWELAFSGAEPIRAHTLEQFAKAFAPCGFRPEAFYACYGMAETTLIVTGGKRSEKPFLKEFNSKGI

EKNQVIPASSCDQDRVSLVSCGQVAEAQKVIIVNPETLNQCADDEIGEIWVSSESVAQGYWNRPQLTEAI

FKAYTPDSPERPFLRTGDLGFLQDGELFVTGRLKDLIIIRGRNHYPQDIEMTAEKSHPALRESCGAAFSV

EVGEEERLVITYEVKRSYIRKLNVEEVTSAIRKAVTQTHELQPYAIVLLKTGSIPKTSSGKIQRHACKAE

FLEGSLNSVGQWSVTQLSEASSQQSKPKPRKNLKQHSPSNSQQQLIQDWLVDKIAQRLSISSAEIEITEP

FASYGLDSVQAVRITAELEDWLKVKLSPTLAYDYPSIESLAQYLTALLKGQEIPSTPVLKTVTQQQTKSE

LIAIIGMGCRFPGANNPDQFWQLLQQGKDQITQVKGRWEKETWGGFLDHIDQFDPQFFGISRREAQEIDP

QQRLLLEVSWEALENASIAVDQLAGSQTGVFIGISSSDYSQIRLKSQLDPSAYAGTGNAHSIAANRLSYF

YDFRGPSLTVDTACSSSLVAVHLAISSLQRGECQMAIAGGVNLLLSPELTETFTQAGMMATDGRCKTFDE

GADGYVRGEGCGVVILKSLENAIADGDPILGVIHGSAINQDGRSNGLTAPNGIAQKQVICQALINGNIQA

ADISYIETHGTGTPLGDPIEVNALKSVLMEGRSLDQPLWIGSLKTNIGHLEAAAGIAGLIKVILSLKHQQ

IPPHLHLNSLNPHINLNETPIAIPTQLTPWKIDSKPRLAGVSSFGFGGTNAHVIVGEYNSLSPSPENLSP

YPSPTRREELKPVERPLHILTLSAKREKDLSALIDSYKSYLTSQPTASLEDICFTANVGRSPLKHRVAII

ANSQDQLREKLGKGEVIKAENSAQLTPKIAFLFTGQGSQYVGMGYQLYQTQPTFKTALDTCADLLSPYLK

RPLLEILYPQDSTAISDELDQTAYTQPALFALEYALAQLWLSWGIEPSIVMGHSVGEYVAATLAGVFSLE

DGIKLIAHRGKLMQALPQNGQMVAVLSDEVTVKKAINSHHQKVVIAAINGEKSLVISGEHQAVIEVTEVL

KNQGIKTKPLTVSHAFHSPLMQPMLTEFERVAQEIEYSLPLIPIVSNVTGNIAGEEMATPHYWVNHVVDT

VQFASSMKCLEKQGYKVFLEIGAKPTLLGMGRSTLESDPLNSNSSPYLWLPSLRPEQEDWQQILSSLAQL

YVNGIWVDWAGFDQDYPRQRVIGLPTYPFDRQSYWLTQTPQLNSHGLYQVEWEVKQPINDNFSLINPSTW

LILADEQGLGELLGQELEKLGQTCLLIYPENGKGQKETFESLLAEVKQTQQTLGGIIHLWSLDEVTLTEA

QHRGCESILYLLQTLYEQEISSKVWIATRGTQRVTLQENSLSHLQGTLWGLSKVVALEYSQYWGGIIDLD

PEHDPQEAQFFLSEIFNSQKETYLAFRKGQRYVTRLKKATLTPQKLSLYQEGTYLITGGLGAVGLKVAQW

LVKEGAKHLVLMGRSQPSANAQEILNTLEEKGVNLSIVQGDVTELEDINRIFNQIKNSHPPLKGIIHAAG

LLKDGILQGLSWESFQQVLAPKVQGTWNLHQASLDLSLDFFVMFSSAASLLGSPGQGNYAAANGFLDAFA

HYRHSLGLPGLTINWGALSAGMATSTRLGVKGLEMIEIESALEMLSSLLTTSTPQVGVLSVKWDSLSEQF

PDLLKTPFFQEVISQDNKPSHEHSEIFTTLLTLSPPQRTEVLITYLQSSIARILHLSPADISPSDSLVDL

GMDSLMVMEAINTLKKDLQLMLYPREIYEHPKIEALATYLGTEFEGTHGQSPKSPQIHNPQKQELVVSRFS

KTYQPLTITKKLPGIIFILSSPRAGSTLLRVMFAGHPDLISPPELHLLPFNTMGQRDQELALSYLGEGLQ

RAFMELGGLDSQTSQSLIEELIHQNTSIPDVYQRLQELAGNRLLVDKSPTYGMQREILDRGEAMFEGAKY

IHLVRHPYSVIDSFSRMRMDKLVGVSGDNPYSIAESVWLESNRNILDFSQTIDKERYYQLRYEDLVTQPS

QMMRSLCEFLDIPFNSALLDPYQGDRMTDGVYNQSISVGDPNFSQRRQIDPKLADAWKKIHLPQPLGDTT

LRLAASFNYELPHETVLPSPPRRGVGGEVISIPMQENYLTIRGLKLCLCSWGPEDGELILCIHGILEQGA

AWEEVATRLAQKGYRVIAPDLRGHGKSDHVGNGGSYNLIDFLGDLDAIATHLTDKPFTLVGHSLGSIIAA

MFTSIRPEKVKHLVLVETVLPTEVHEGDTVEQLATHLNYLSSPPKHPVFPDVETAAKRLQTATPAMSEQL

AMKLAKRITQAGEGGIQWRWDSLLRTRAGIEFNGINRSRYLSLLKQIQAKITLIYGDQSDFNRPEDLQLQ

QQTMSQANRIVVNGGHNLHLEAFEELANIING

SEQIDNO：9

来自蓝丝菌属物种PCC7822的NonA同源物ZP_03153601.1

MKRNFSNFVDLLNHQAEAQSDKTIFTFLGDGESETLSLTYQQLDQQARAIAVQLQSLQAAGERALLLYQP

GLEFISAFFGCLYGGVIPVPAYPPRANRSIERLQAIVSDAEAKFALTTQGIVSTIEGKLTQSQISTEAIQ

CVTTDNLELSLSNQWRRPNLKPDQLAFLQYTSGSTGNPKGVMVSHGNLMHNAALINGYFRDTPSSRGASW

LPPYHDMGLIGGILQPIYADVYVVLMPPVTFLQRPLRWLEVISRYRITTSGAPNFAYELCATQITPEQRE

NLDLSCWELAFSGAEPVRAQTLAQFAEAFAPCGFRKEAFYPCYGMAETTLIVSGGTRGVYPLLKDFDAKG

IEKNQVIPSSPLEPNNLTLVSCGKISGGQKVIIVNPDTLKQCDNYQIGEIWVNSESVAKGYWKRPQLTEA

IFNAYTADTQEGPFLRTGDLGFLEDGELFVTGRLKDLIIIRGRNHYPQDIEMTAEKSHPALRESCGAAFS

VEVGEEERLVITYEVKRSYIRKLNVEEVTSAIRKAVTQTHELQPYAIVLLKTGSIPKTSSGKIQRHACKA

EFLEGSLNSVGQWSAAQTLPKTSKQLLEVNSRKKRGHIIKSNPQQEIIENWLVTNIAQRLGLSPTEIEIT

EPFASYGLDSVQAVRITAELEDWLKVKLSPTLAYDHPTVESLAKYLASGTVETTLATSKPLKTSSSVAII

GMSCRLPGANSPDEFWQLLRQGKDQITQVNARWDRDDWGGYLKGVDLFDAQFFGISPREAQEMDPQQRLL

LEVSWEALEKAALAANQLAGSNTGVFIGISSHDYSQIRLKNALEPSAYAGTGNAASIAANRLSYLYDFRG

PSLTVDTACSSSLVAIHLAIKSLQSGECQMALAGGVNILLSPELSETFTQAGMMAPDGRCKTFDESADGY

VRGEGCGVIVLKSLEDAIRDGDPILGVIHGSAINQDGRSNGLTAPNGIAQQGVIRQALMNAGMSAADISY

VETHGTGTALGDPIEVNSLKSVLMEGRSEKHPLWLGSVKTNIGHLEAAAGIAGLIKVLLCLQHQEIPPHL

HLYRLNSHINLDDSPISIPTQLTPWKPENRPRLAGVSSFGFGGTNAHIIVGEYQNLSPTKRGQVEELERP

LHILTLAAKREKDLSSLVKSYQHYLTAFPSASLEDICFTANNGRTQFKNRLAIIAQSREQLAEKLSRGEF

ITPQIAQKLNPKIAFLFTGQGSQYIGMGYQLYQTQPTFRAALNTCADLLEPYLEYPLLEVLYPQENSNLA

HYLDQTAYTQPALFALEYALAQLWLSWGIEPSVVMGHSVGEYVAATLAGVFSLEDGLKLIAHRGKLMQSL

PQNGQMVAVLSDEETVKKAINSHDEKVVIAAINGERNLVISGENQAIIEVTDRLTHQGIKTKPLQVSHAF

HSPLMQPMLEEFASIAREVEYSLPQIPLVSNVSGNLAAEAIATPEYWVNHVINPVHFSPSIKLMESKGYQ

IFLEIGAKPTLLGMGRSIIESDSSVNHQNAYLWLPSLRPGQSDWQQMLTSLAQLYVQGINIDWAGFEADY

QRQRMGGLPTYPFERQRYWLKPELEIHTGTKRLTTEQVSPPNQDWLYQVVWEAKPINPHQLSNQKTSTWL

IFGDQQGLAKTVAEQLEKLGKTSLLVQSDKGDKNGNHKTLNPTEKNDFQRLLTPFKTSGESLEGIIYLWS

LEEDEISKSNPQSILYLLQTLYEQNLSSRLWTATRGIQPVTTEDLAAPHIPLQGMLWGLGKVIALEYSDY

WGGLIDIGTQPHTDEAKLLLSAIINPDGEQYLAFRDGQRYVARIDKAEIKPKKFSIDENGSYLITGGLGA

VGLKVAQWLAKAGAKHLILMGRSHPTANAQETIKHLEKQGIEIIIAQADVTRQEDIDRVFNQIKTPLKGI

IHAAGLLDDGILQGLSWEKFKKVLAPKVEGTWNLHKASLNHPLDFFVMFSSAASLFGSPGQGNYAAANGF

LDGMAYYRQSQGLPALTVNWGALSGGMAKATRLAVKGLDLIDIEPALDILSHLLADKIAQIGVVSVDWET

LAQQFPQLRQSPYFQRVITQLSPEQVKPDHSQSQILANLLALSPEQRTEALTAYLQSAMAQIMQLSPSQI

SGEDSLLDIGMDSLMIMEAINQLKRDLQLMLYPREIYQHPKIEALANYLAAEFERTHGKGQIPVTSKQEL

VVSRLTIANQPLTITKKLPGILFILSSPRAGSTLLRVMLAGHPDLASPPELHLLPFNSMGQRNQELALSY

LGEGLQRAFMDLQGLDSATSQQLIERLIAEDISIPDVYEMLQQSAGKRLLVDKSPTYGMQREILDRAEAI

FEGAKYIHLVRHPYPVIDSFCRMRMDKLVGSEGDNPYQLAESIWWESNRNIIEFSKTISSDRYYQLRYED

LVTQPSQAMQALCEFLDIPFDSALLDPYQGQRMTDGVYNQSMSVGDPNFSKRKQIDPKLADAWKDIQLPH

PLGDNTRQLAISLNYPLPHQNIPPLLRGEGGITEEVHLEEEYINIRGLNLCLCSWGPKQGELILCVHGIL

EQGAAWGQMATRLAGLGYRVVAPDLRGQGKSDHVGKGGSYNLIDFLADLDAIANSLTDQPFTLVGHSLGS

IIAAMFTSIRPEKVKNLVLVETVLPTEVSQTDAVEQLATHLNYLASPPEHPVFPDVETAAKRLQTATPAM

SEALAISLAKRITEPCEGGIRWRWDSLLRTRAGIEFNGINRSRYISLLEQIQAPITLIYGDNSDFNRPED

LQAQQKAMSAAKRIILKGGHNLHLDAYEQLANIIKQILGKTGQSF

Claims (15)

1.一种1-烯烃的生物合成生产的方法，包括：

在培养基中培养工程化的微生物，其中所述工程化的微生物包含重组的1-烯烃合成酶，所述1-烯烃合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2、8和9中任一个所示，以及其中所述工程化的微生物产生1-烯烃，和其中所述工程化的微生物所产生的所述1-烯烃的量大于由在相同条件下培养的、除了缺乏所述重组1-烯烃合成酶以外均相同的微生物所产生的量。

2.权利要求1的方法，其中所述重组的1-烯烃合成酶是至少部分地从其天然启动子之外的启动子表达的内源性1-烯烃合成酶。

3.权利要求1的方法，其中所述重组1-烯烃合成酶是异源的1-烯烃合成酶。

4.权利要求1的方法，其中所述重组1-烯烃合成酶是从异源启动子表达的。

5.权利要求4的方法，其中所述1-烯烃合成酶对于所述微生物是内源性的。

6.权利要求1的方法，其中所述工程化的微生物是光合微生物，以及其中将所述工程化的微生物暴露于光和二氧化碳引起所述微生物产生1-烯烃。

7.权利要求6的方法，其中所述工程化的微生物是蓝细菌。

8.权利要求1或6的方法，其中所述1-烯烃选自1-十九碳烯和1-十八碳烯。

9.权利要求7的方法，进一步包括从所述蓝细菌或所述培养基分离所述1-烯烃。

10.一种链烯的生物合成生产的方法，包括

(1)在培养基中培养蓝细菌，其中所述蓝细菌包含1-烯烃合成酶活性，以及其中所述培养基包含外源的脂肪酸，所述1-烯烃合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2、8和9中任一个所示；

(2)将所述工程化的蓝细菌暴露于光和二氧化碳，其中所述暴露引起所述蓝细菌产生链烯，以及其中所述产生的链烯的量大于由在除了缺乏所述外源脂肪酸以外均相同的条件下培养的相同蓝细菌所产生的量。

11.权利要求10的方法，其中在所述培养基中所述脂肪酸的所述浓度是至少1μg/ml。

12.权利要求11的方法，其中所述脂肪酸是奇碳链脂肪酸。

13.权利要求12的方法，其中所述奇碳链脂肪酸是十三烷酸，所述链烯是1-十八碳烯。

14.权利要求13的方法，其中产生的所述1-十八碳烯的量是至少0.039％细胞干重。

15.权利要求10的方法，进一步包括从所述蓝细菌或所述培养基分离所述链烯。