CN104769119A

CN104769119A - 生物合成1,3丁二烯的方法

Info

Publication number: CN104769119A
Application number: CN201380043586.3A
Authority: CN
Inventors: P.S.珀尔曼; C.陈; A.博特斯; A.V.E.康拉德
Original assignee: Technology Of English Weida LLC
Current assignee: Invista Textiles UK Ltd
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2013-06-12
Publication date: 2015-07-08
Also published as: WO2013188546A3; WO2013188546A2; EP2861745A2

Abstract

本申请描述了通过在丁二烯合成底物中形成两个乙烯基来生产丁二烯的生物化学途径。本申请描述的这些途径依赖于用于最终酶促步骤的酶，比如甲羟戊酸二磷酸脱羧酶、异戊二烯合酶和脱水酶。

Description

生物合成1,3丁二烯的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年11月30日提交的国际申请号PCT/US2012/067463(该申请要求了2011年12月2日提交的美国申请号61/566,085和2012年10月17日提交的美国申请号61/714,883的优先权)的优先权；以及要求2012年6月15提交的国际申请号PCT/US2012/042757(该申请要求了2012年10月17日提交的美国临时申请号61/714,883；2011年12月2日提交的美国临时申请号61/566,085和2011年6月17日提交的美国临时申请号61/498,408的优先权)的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

技术领域

本发明涉及生物合成1,3-丁二烯的方法，更具体地涉及使用一种或多种分离的酶如脱氢酶、单加氧酶、去饱和酶、脱水酶和脱羧酶，或者使用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞合成1,3-丁二烯。

背景

1,3-丁二烯(下文称丁二烯)是用于产生包括苯乙烯-丁二烯-橡胶(SBR)、聚丁二烯(PB)、苯乙烯-丁二烯乳胶(SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS)的合成橡胶、腈橡胶和己二腈的重要单体，所述己二腈用于生产尼龙-66(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

丁二烯通常作为蒸汽裂解工艺的副产物而产生，其被蒸馏为粗丁二烯流并通过萃取蒸馏纯化(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。已专门采用其他方法制备丁二烯，通过n-丁烷和n-丁烯的脱氢反应(胡得利工艺)；和n-丁烯的氧化脱氢反应(Oxo-D或O-X-D工艺)(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

工业上，全球95％的丁二烯生产是通过使用石化基原料如石脑油的蒸汽裂解工艺进行的。考虑到较高的生产成本和较低的工艺收率，专门生产丁二烯是没有意义的(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。鉴于对石化原料的依赖以及对于专门生产丁二烯的高能耗催化步骤而言；生物技术通过生物催化提供了一种替代方法。生物催化是使用生物催化剂如酶对有机化合物进行生物化学转化。

因此，在这一背景下，很明显需要生产中间体特别是丁二烯的适宜方法，其中所述方法是基于生物催化剂的(Jang等，Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。

生物来源的原料和石化原料均是生物催化工艺可行的初始原料。

在中碳链长度的酶底物中生成两个乙烯基是通过生物催化工艺合成丁二烯的关键考虑因素。

尚无任何已知的在原核生物或真核生物中合成丁二烯的酶途径。已提出的由生物质-糖生产1,3-丁二烯的三个潜在的途径为：(1)由乙酰基-CoA通过巴豆酰基-CoA；(2)由赤藓糖-4-磷酸；和(3)通过丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合反应。然而，尚无使用这些策略的信息报道(Jang等，Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。

利用原核生物或真核生物合成的最为类似的化合物是2-甲基-1,3-丁二烯(异戊二烯)，其具有短的5碳链长和两个乙烯基。异戊二烯可以通过产生前体二甲基乙烯基-PP的两条路线，即甲羟戊酸(mevalonate)和非甲羟戊酸途径合成(Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2002,66(8),1619-1627)。

甲羟戊酸途径引入了脱羧酶甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(下文称MDD)，其在形成异戊二烯的前体中生成第一个乙烯基(Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2002,66(8),1619-1627)。

因此，可以将甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)标记为在由非天然底物合成丁二烯中的候选酶。

在对与天然底物甲羟戊酸二磷酸相关联的3-甲基的作用的阐述中，已证实如图12(a)所示的3-羟基-5-二磷酸戊酸的周转(turn-over)数K_cat为0.23±0.05[s^-1]，其与天然底物的名义8.33±1[s^-1]相比显著降低(Dhe-Paganon等，Biochemistry,1994,33,13355–13362)。此外，与底物的反应仅进行得远到3-羟基的磷酸化，即无可检测的脱羧产物，这意味着与天然底物相比脱羧率降低了至少300倍。总而言之，认为3-甲基在稳定碳阳离子过渡态中是不可或缺的(Dhe-Paganon等，Biochemistry,1994,33,13355–13362)。

已证实来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MDD酶接受3-羟基-3-甲基-丁酸(图12(b))，其包括稳定碳阳离子过渡态的3-甲基，其是将所述底物转化为异丁烯的底物。然而，与天然底物活性6.4[μmol/(min·mg)]相比，该比活性显著降低为4.8·10^-6[μmol/(min·mg)](Gogerty&Bobik,Applied&Environmental Microbiology,2010,76(24),8004–8010)。

在催化裂隙周围的丝氨酸和精氨酸残基与天然底物甲羟戊酸二磷酸的磷酸基之间关键的底物结合相互作用已被阐明。因此，在催化裂隙中正确的底物方向对酶活性是重要的，这就合理地解释了当接受3-羟基-3-甲基-丁酸(图14(b))作为底物时MDD具有低活性(Barta等，Biochemistry,2012,51,5611-5621)。

与天然底物结合的3-甲基和焦磷酸基对于支撑MDD活性作用的重要性反对在由不含这些关键基团的非天然前体合成丁二烯中使用MDD。

异戊二烯合酶(下文称ISPS)在异戊二烯合成的最终前体二甲基乙烯基-PP中生成第二个乙烯基。

因此，可以将异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)标记为由非天然底物合成丁二烯的候选酶。

与MDD类似，与天然底物二甲基乙烯基-PP结合的3-甲基在稳定碳阳离子中起重要作用，假定所述碳正离子是过渡态中间体(Silver&Fall,J.Biol.Chem.,1995,270(22),13010–13016；Kuzma等，Current Microbiology,1995,30,97–103)。

3-甲基对于支撑ISPS活性作用的重要性反对在由不含3-甲基的非天然前体合成丁二烯中使用ISPS。

除了MDD和ISPS以外，微生物通常能够通过脱水酶、解氨酶(ammonialyase)、去饱和酶或脱羧酶的活性在代谢物中生成乙烯基。然而，这些酶的活性很少能够催化末端乙烯基的形成。脱水酶和解氨酶通常接受具有活化的氢原子的脂肪酸类似物或芳香族化合物，其中芳香环作为吸电子基团。去饱和酶在脂肪酸合成中占支配地位，其在沿着长链脂肪酸的固定的非末端位置产生不饱和键。继而，脱羧酶作用于末端的羧基，其在催化后通常留下末端位置上结合的α官能团。因此，这些酶的相关酶促活性反对其在导致丁二烯合成的短链或中链碳代谢物中产生末端乙烯基的用途。

发明概述

本申请至少部分地基于这样一个发现，有可能构建用于生产中链碳代谢物的生化途径，在所述代谢物中能够形成两个乙烯基，从而导致丁二烯的合成。本申请所描述的这些途径依赖于用于最终的酶促步骤的酶诸如MDD、ISPS和脱水酶。

在本发明人的这个令人吃惊的发现之前，尚不知晓存在能够在中链碳代谢物中形成两个末端乙烯基的酶或者其可以被生成以合成丁二烯。

因此，在一方面，本申请提供了能够将丁二烯合成底物转化成丁二烯的酶。在本申请中使用的术语“丁二烯合成底物”指如下的底物，所述底物的酶能够催化直接产生1,3-丁二烯或在经过一个或多个酶催化的反应后转化为1,3-丁二烯的产物的反应。

在一些实施方式中，导致合成丁二烯的第一个乙烯基是在4-草酰巴豆酸(4-oxalocrotonate)、2-羟基粘康酸半醛(2-hydroxymuconate semialdehyde)或2-羟基-6-氧代壬-2,4-二烯-1,9-二酯(2-hydroxy-6-oxonona-2,4-diene-1,9-dioate)中酶促形成的，以生产2-氧代戊-4-烯酸(2-oxopent-4-enoate)。见图2。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在丙酰基-CoA(propanoyl-CoA)、乳酰基-CoA(lactoyl-CoA)或3-羟基丙酰基-CoA(3-hydroxypropionyl-CoA)中酶促形成的，以生产丙烯酰基-CoA(propenoyl-CoA)。见图3。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在(R)3-羟基-戊酸((R)3-hydroxy-pentanoate)中酶促形成的，以生产3-羟基戊-4-烯酸(3-hydroxypent-4-enoate)。见图4。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在戊-2-烯酰基[acp](pent-2-enoyl[acp])中酶促形成的，以生产2,4-戊二烯酰基-[acp](2,4--pentadienoyl-[acp])。见图5。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在5-羟基戊酰基-CoA(5-hydroxypentanoyl-CoA)(通过5-羟基-戊-2-烯酰基-CoA(5-hydroxy-pent-2-enoyl-CoA as intermediate)作为中间体)或戊-3-烯酰基-CoA(pent-3-enoyl-CoA)中酶促形成的，生产2,4-戊二烯酰基-CoA(2,4-pentadienoyl-CoA)。见图6。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在4-羟基丁酰基-CoA(4-hydroxybutyryl-CoA)、(R)3-羟基丁酰基-CoA((R)3-hydroxybutanoyl-CoA)或戊烯二酰基-CoA(glutaconyl-CoA)中酶促形成的,以生产巴豆酰基-CoA(crotonyl-CoA)。见图7。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在2-丁醇中酶促形成的，以生产3-丁烯-2-醇。见图8。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第二个乙烯基是利用分类为EC4.1.1.33的酶甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase，MDD)形成的(图9)。例如，利用两种或更多种酶连续转化2-羟基戊-4-烯酸；在通过脱羧的最后酶促转化中直接产生丁二烯(图1，反应X)。

在一些实施方式中，导致合成丁二烯的第二个乙烯基是利用分类为EC4.2.3.27的酶异戊二烯合酶(isoprene synthase,ISPS)形成的(图10)。例如，可以利用一种或多种酶由丁烯醇生成活化的丁烯醇(二磷酸酯)(图1，反应II)；在通过脱磷酸化的最后酶促转化中直接产生丁二烯(图1，反应III)。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第二个乙烯基是利用分类为EC4.2.1.-的酶脱水酶形成的，如芳樟醇脱水酶(linalool dehydratase)(EC4.2.1.127)、奇维酮水合酶(kievitone hydratase)(EC 4.2.1.95)、油酸水合酶(oleate hydratase)(EC 4.2.1.53)或类胡萝卜素1,2-水合酶(carotenoid1,2-hydratase)(EC 4.2.1.131)(图11)。此类脱水酶接受羟基化的底物如丁烯醇。例如，可以在一个或多个酶促步骤中利用脱水酶、水合酶、去饱和酶、脱氢酶或脱羧酶的活性由丁二醇、丁醇、丁烯、丁烯醛或C5烯醇生成丁烯醇(图1，反应IV、V、VI、VII、IX)；通过脱水在最后的酶促转化中直接生产丁二烯(图1，反应I)。丁烯醇包括例如1-丁烯-1-醇、2-丁烯-1-醇和3-丁烯-2-醇(见图1)。

例如，本申请提供了将丁烯醇转化为丁二烯的酶。这种转化可以利用单一的酶进行，或者可以利用两种或更多种酶顺序作用进行(也就是说，例如第一种酶作用于四碳分子以生产第一丁烯醇，然后该第一丁烯醇在第二个酶的作用下生产丁二烯)(参见例如图1，反应I)。

本申请还提供了由不饱和的羟基化四碳分子生产丁二烯的方法，所述方法包括至少一个生物催化步骤。例如，在转化为丁二烯之前可以将丁烯醇活化为相应的丁烯醇二磷酸酯(参见例如图1，反应II&III)。在一些实施方式中，所述丁烯醇选自由以下组成的组：1丁烯2醇、1丁烯3醇、1丁烯4醇、2丁烯1醇、2丁烯2醇、2丁烯3醇或2丁烯4醇。对于丁烯醇如1-丁烯-1醇、1-丁烯-2醇、2-丁烯-2-醇和2-丁烯-3-醇而言，可以利用相应的酮或醛如1-丁醛或2-丁酮在原位生成丁烯醇。

在一些实施方式中，丁烯醇由选自由以下组成的组的四碳分子通过酶的作用生产：丁二醇(1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇)(图1，反应IV)或丁醇(1-丁醇或2-丁醇)(图1，反应V)或丁烯(1-丁烯或2-丁烯)(图1，反应VI)或丁醛如1-丁醛或2-丁醛或者2-酮-丁-1-烯(图1，反应VII)。

利用酶进行的反应可以是净脱水(即利用具有脱水酶活性的酶从分子中除去H₂O，反应IV)，利用具有去饱和酶活性的酶或酶的复合物的脱氢(即从分子中除去氢，这在由酶催化的反应中导致所述分子的碳骨架去饱和)(反应V)，利用具有羟化酶活性的酶的羟基化(即使用羟基取代氢)，如烯烃单加氧酶或细胞色素P450或ω-羟化酶(反应VI)或利用氧化还原酶/酮还原酶的还原，以便将丁醛或C4不饱和酮转化为丁烯醇。对于脱水步骤而言，所述酶可以是与在用于将丁烯醇脱水成丁二烯的酶类别相同的酶类别，或者可以是其他酶类的。在所述丁烯醇中的双键迁移可以由异构酶催化。

本申请还提供了来自酶类4.2.1.-.的酶，其将丁二醇转化为丁烯醇(图1，反应VIII)。

在一些实施方式中，丁烯醇如1-丁烯-4-醇由五碳分子如2-羟基戊-4-烯酸通过脱羧酶(如来自EC 4.1.1.-的脱羧酶)的作用生产(图1，反应IX)。还可以利用脱羧酶或GHMP激酶将2-羟基戊-4-烯酸直接转化为丁二烯而不形成中间体丁烯醇(图1，反应X)。

在一些实施方式中，所述丁烯醇选自由以下组成的组：1丁烯2醇、1丁烯3醇、1丁烯4醇、2丁烯1醇、2丁烯2醇、2丁烯3醇或2丁烯4醇。对于丁烯醇如1-丁烯-2醇、2-丁烯-2-醇和2-丁烯-3-醇而言，可以利用相应的酮或醛如1-丁醛或2-丁酮在原位生成所述丁烯醇。

在一方面，本申请的特征在于一种生物合成丁二烯的方法。所述方法包括在丁二烯合成底物中形成两个末端乙烯基。可以在丁二烯合成底物中酶促形成第一个乙烯基以生产选自由以下组成的组的化合物：2-氧代戊-4-烯酸、丙烯基-CoA、(R)3-羟基戊-4-烯酸、2,4-戊二烯酰基-[acp]、2,4-戊二烯酰基-CoA、巴豆酰基-CoA和3-丁烯-2-醇。

在一方面，可以通过(i)使用分类为EC 4.1.1.77的4-草酰巴豆酸脱羧酶在4-草酰巴豆酸中，(ii)使用分类为EC 3.7.1.9的2-羟基粘康酸半醛水解酶在2-羟基粘康酸半醛中，或(iii)使用分类为EC 3.7.1.14的2-羟基-6-氧代壬-2,4-二烯二酯水解酶在2-羟基-6-氧代壬-2,4-二烯-1,9-二酯中形成第一个乙烯基来生产2-氧代戊-4-烯酸。可以通过使用分类为EC 1.2.1.32的2氨基粘康酸半醛脱氢酶(2aminomuconate semialdehyde dehydrogenase)将2-羟基粘康酸半醛转化为2-羟基粘康酸，使用分类为EC 5.3.2.6的2-羟基粘康酸互变异构酶(2-hydroxymuconate tautomerase)将2-羟基粘康酸转化为4-草酰巴豆酸和使用分类为EC 4.1.1.77的4-草酰巴豆酸脱羧酶(4-oxalocrotonate decarboxylase)将4-草酰巴豆酸转化为2-氧代戊-4-烯酸来生产2-氧代戊-4-烯酸。可以通过使用分类为EC 1.13.11.2的儿茶酚2,3-双加氧酶(catechol 2,3-dioxygenase)将儿茶酚转化为2-羟基粘康酸半醛来生产2-羟基粘康酸半醛。通过使用分类为EC1.14.12.1的邻氨基苯甲酸1,2-双加氧酶(anthranilate 1,2-dioxygenase)转化邻氨基苯甲酸或使用分类为EC 4.1.1.63的原儿茶酸脱羧酶(protocatechuatedecarboxylase)转化原儿茶酸(Protocatechuate)生产儿茶酸。可以通过使用分类为EC 4.1.3.27的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)转化分支酸生产邻氨基苯甲酸。可以通过使用分类为EC 4.2.1.118的3-脱氢莽草酸脱水酶(3-dehydroshikimate dehydratase)转化3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimate)生产原儿茶酸。

在一方面，可以通过使用5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱羧酶，如由praH编码的5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱羧酶转化5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛生产2-羟基粘康酸半醛。可以通过使用原儿茶酸2,3-双加氧酶，如由praA编码的原儿茶酸2,3-双加氧酶转化原儿茶酸生产5-羧基-2-羟基粘抗酸-6-半醛。可以通过使用分类为EC 1.13.11.16的3-羧乙基儿茶酚2,3-双加氧酶转化2,3-二羟基苯基丙酸生产2-羟基-6-氧代壬-2,4-二烯-1,9-二酯。可以通过使用分类为EC 1.3.1.87的3-(顺式-5,6-二羟基环己-1,3-二烯-1-基)丙酸脱氢酶转化顺式-3-(羧基-乙基)-3,5-环-己二烯-1,2-二醇生产2,3-二羟基苯基丙酸。可以通过使用分类为EC 1.14.12.19的3-苯基丙酸双加氧酶转化3-苯基-丙酸生产顺式-3-(羧基-乙基)-3,5-环-己二烯-1,2-二醇。可以通过使用分类为EC 1.3.1.31的2-烯酸还原酶转化E-肉桂酸生产3-苯基-丙酸。可以通过使用分类为EC4.3.1.24的苯丙氨酸解氨酶转化L-苯丙氨酸生产E-肉桂酸。

在一方面，所述丁二烯合成底物可以是丙酰基-CoA。可以通过(i)使用分类为EC 1.3.8.1的丁酰基-CoA脱氢酶或分类为EC 1.3.8.7的中链酰基-CoA脱氢酶在丙烯酰基-CoA中，(ii)使用分类为EC 4.2.1.54的乳酰基-CoA脱氢酶在乳酰基-CoA或(iii)使用分类为EC 4.2.1.116的3-羟基丙酰基-CoA脱氢酶在3-羟基丙酰基-CoA中形成第一个乙烯基来生产丙烯酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 2.1.3.1的甲基丙二酰基-CoA羧基转移酶或分类为EC4.1.1.41的甲基丙二酰基-CoA脱羧酶转化(2S)-甲基丙二酰基-CoA生产丙酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 5.1.99.1的甲基丙二酰基-CoA表异构酶转化(2R)-甲基丙二酰基-CoA生产(2S)-甲基丙二酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 5.4.99.2的甲基丙二酰基-CoA变位酶生产(2R)-甲基丙二酰基-CoA。

可以通过使用分类为EC 2.3.1.-的2-酮丁酸甲酸裂解酶，如由tdcE编码的2-酮丁酸甲酸裂解酶转化2-氧代-丁酸生产丙酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 4.3.1.19的苏氨酸解氨酶转化L-苏氨酸生产2-氧代-丁酸。

可以通过使用丙醛脱氢酶，如由pduP编码的丙醛脱氢酶转化丙醇生产丙酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 4.2.1.28的丙二醇脱水酶转化1,2-丙二醇生产丙醇。

可以通过使用分类为EC 2.3.1.-的转移酶转化乙酰丙酰基-CoA(levulinyl-CoA)由乙酰丙酸(levulinic acid)生产丙酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 6.2.1.-的酰基-CoA合成酶或连接酶转化乙酰丙酸生产丙酰基-CoA。

可以通过使用分类为EC 2.8.3.1的丙酸CoA转移酶转化L-乳酸生产乳酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 1.1.1.27的L-乳酸脱氢酶转化丙酮酸生产L-乳酸。

可以通过使用分类为EC 3.1.2.4的3-羟基异丁酰基-CoA水解酶转化3-羟基丙酸或者通过使用分类为EC 1.1.1.59的3-羟基丙酸脱氢酶转化丙二酸半醛来生产3-羟基丙酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 1.2.1.75的丙二酸单酰基-CoA还原酶转化丙二酸单酰基-CoA来生产丙二酸半醛。

可以通过使用分类为EC 1.3.8.1的丁酰基-CoA脱氢酶或者通过使用分类为EC 1.3.8.7的中链酰基-CoA脱氢酶转化丙烯酰基-CoA来生产丙酰基-CoA。

可以通过使用去饱和酶/单加氧酶或细胞色素P450在(R)3-羟基戊酸中形成第一个乙烯基生产(R)3-羟基戊-4-烯酸丙烯酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 3.1.2.-的硫酯酶转化(R)3-羟基戊酰基-CoA来生产(R)3-羟基-戊酸。可以通过使用分类为EC 1.1.1.36的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 2.3.1.16的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化丙酰基-CoA来生产3-氧代戊酰基-CoA。

可以通过使用酰基-[acp]脱氢酶在戊-2-烯酰基-acp中形成第一个乙烯基来生产2,4-戊二烯酰基-[acp]。可以通过(i)使用分类为EC 4.2.1.-的5-羟基戊酰基-CoA脱水酶在5-羟基戊酰基-CoA中或(ii)使用分类为EC 1.3.1.34在2,4-二烯酰基辅酶A还原酶的戊-3-烯酰基-CoA中形成第一个乙烯基来生产2,4-戊二烯酰基-CoA。所述5-羟基戊酰基-CoA脱水酶可源自绿色梭菌(Clostridiumviride)。

巴豆酰基-CoA可以通过(i)使用分类为EC 4.1.1.70的戊烯二酰基-CoA脱羧酶在戊烯二酰基-CoA中，(ii)使用分类为EC 4.2.1.120的4-羟基丁酰基-CoA脱水酶和分类为EC 5.3.3.3的乙烯基乙酰基-CoA异构酶在4-羟基丁基-CoA中或(iii)使用分类为EC 4.2.1.119的烯酰基-CoA水合酶在(R)3-羟基丁酰基-CoA中形成第一个乙烯基来生产。

可以通过使用去饱和酶或单加氧酶在2-丁醇中形成第一个乙烯基来生产3-丁烯-2-醇。

第二个乙烯基通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MDD)在(R)3-羟基戊-4-烯酸中酶促形成。MDD可以是分类为EC 4.1.1.33的。MDD可以包含在催化裂隙的催化性精氨酸残基任一侧的五个残基中的最少四个丝氨酸残基。MDD可以来自链球菌属(Streptococcus)或葡萄球菌属(Staphylococcus)。

第二个乙烯基可以通过异戊二烯合酶(ISPS)在2-丁烯-1-醇二磷酸或3-丁烯-2-醇二磷酸中酶促形成。第二个乙烯基通过酶分类EC 4.2.1.-中的脱水酶在3-丁烯-2-醇或2-丁烯-1-醇中酶促形成，所述脱水酶如芳樟醇脱水酶(EC4.2.1.127)、奇维酮水合酶(EC 4.2.1.95)、油酸水合酶(EC 4.2.1.53)或类胡萝卜素1,2-水合酶(EC 4.2.1.131)。

可以通过使用分类为EC 4.2.1.59的3-羟基酰基-[acp]脱水酶转化(R)3-羟基戊酰基-[acp]来生产戊-2-烯酰基-[acp]。可以通过使用分类为EC 1.1.1.100的3-氧代酰基-[acp]还原酶转化3-氧代戊酰基-[acp]来生产(R)3-羟基戊酰基-[acp]。

可以使用分类为EC 2.3.1.41的β-酮酰基-[acp]合酶I和酰基转移酶如tcsA转化戊酰基-CoA来生产3-氧代戊酰基-[acp]。

可以使用酰基转移酶转化戊-2-烯酰基-CoA来生产戊-2-烯酰基-[acp]。可以通过使用分类为EC 4.2.1.119的烯酰基-CoA水合酶转化(R)3-羟基戊酰基-CoA来生产戊-2-烯酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 1.1.1.36的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊酰基-CoA。

可以通过使用分类为EC 2.3.1.16的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化丙酰基-CoA来生产3-氧代戊酰基-CoA。

可以通过使用分类为EC 5.3.3.8的异构酶转化戊-2-烯酰基-CoA来生产戊-3-烯酰基-CoA。

可以(i)通过使用分类为EC 2.8.3.14的5-羟基戊酰基CoA-转移酶转化5-羟基戊酸或(ii)使用细胞色素P450，如CYP153A6的基因产物转化戊酰基-CoA来生产5-羟基戊酰基-CoA。可以使用5-羟基戊酸脱氢酶，如cpnD的基因产物或来自绿色梭菌的脱氢酶转化5-氧代戊酸来生产5-羟基戊酸。可以通过使用分类为EC 2.6.1.48的5-氨基戊酸转氨酶转化5-氨基戊酸来生产5-氧代戊酸。可以通过使用分类为EC 1.21.4.1的D-脯氨酸还原酶转化D-脯氨酸来生产5-氨基戊酸。可以通过使用分类为EC 5.1.1.4的脯氨酸消旋酶转化L-脯氨酸来生产D-脯氨酸。可以通过使用分类为EC 1.5.1.2的吡咯啉-5-羧酸还原酶转化(S)-1-吡咯啉-5-羧酸来生产L-脯氨酸。可以通过L-谷氨酸5-半醛的自发转化来生产(S)-1-吡咯啉-5-羧基。可以通过使用分类为EC 1.2.1.41的谷氨酸-5-半醛脱氢酶转化L-谷氨酰基-5-磷酸来生产L-谷氨酸5-半醛。可以通过使用分类为EC 2.7.2.11的谷氨酸5-激酶转化L-谷氨酸来生产L-谷氨酰基-5-磷酸。

可以通过使用分类为EC 1.3.1.38的反式-2-烯酰基-CoA还原酶转化戊-2-烯酰基-CoA来生产戊酰基-CoA。

可以通过使用分类为EC 4.2.1.-的脱水酶转化2-羟基戊二酰基-CoA来生产戊烯二酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 2.8.3.12的戊烯二酸CoA-转移酶转化2-羟基戊二酸来生产2-羟基戊二酰基-CoA。可以通过使用分类为EC1.1.99.2的2-羟基戊二酸脱氢酶转化2-氧代戊二酸来生产2-羟基戊二酸。可以通过使用分类为EC 1.1.1.36的3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶转化乙酰乙酰基-CoA来生产3-羟基丁酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 2.3.1.9的乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶转化乙酰基-CoA来生产乙酰乙酰基-CoA。

可以通过使用CoA-转移酶，如Ck-cat2的基因产物转化4-羟基丁酸来生产4-羟基丁酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 1.1.1.61的4-羟基丁酸脱氢酶转化琥珀酸半醛来生产4-羟基丁酸，可以通过使用分类为EC 1.2.1.76的琥珀酸-半醛脱氢酶转化琥珀酰基-CoA来生产琥珀酸半醛。

可以通过使用分类为EC 1.1.1.B4的(R)-特异性仲醇脱氢酶转化丁酮来生产2-丁醇。可以通过使用分类为EC 4.2.1.28的丙二醇脱水酶转化2,3丁二醇来生产丁酮。可以通过使用分类为EC 1.1.1.4的(R,R)-丁二醇脱氢酶转化(R)-乙偶姻(acetoin)来生产2,3丁二醇。可以通过使用分类为EC 4.1.1.5的乙酰乳酸脱羧酶转化2-乙酰乳酸来生产(R)-乙偶姻。可以通过使用分类为EC 2.2.1.6的乙酰乳酸合酶转化丙酮酸来生产2-乙酰乳酸。可以通过使用分类为EC 3.1.2.-的硫酯酶转化3-羟基戊-4-烯酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊-4-烯酸。可以通过使用分类为EC 4.2.1的烯酰基-CoA脱水酶转化2,4-戊二烯酰基-CoA来生产3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。可以使用2-羟基异己酰基-CoA脱水酶，如起始物(initiator)HadI和HadBC的基因产物转化2-羟基戊-4-烯酰基-CoA来生产2,4-戊二烯酰基-CoA。可以通过使用CoA-转移酶，如GctAB的基因产物转化2-羟基戊-4-烯酸来生产2-羟基戊-4-烯酰基-CoA。可以通过使用(R)-2-羟基异己酸脱氢酶，如来自艰难梭菌(Clostridium difficile)的LdhA的基因产物转化2-氧代戊-4-烯酸生产2-羟基戊-4-烯酸。

可以通过使用分类为EC 3.1.2.-的硫酯酶转化(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA来生产(R)-羟基戊-4-烯酸。可以通过使用分类为EC 1.1.1.36的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊-4烯酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 2.3.1.16的β-酮硫解酶转化丙烯酰基-CoA来生产3-氧代戊-4-烯酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 3.1.2.-的硫酯酶转化(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA来生产(R)-羟基戊-4-烯酸。可以通过使用(R)-3-羟基酰基-ACP：CoA转酰基酶，如phaG的基因产物转化(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]来生产(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。可以通过使用分类为EC 4.2.1.59的3-羟基酰基-[酰基-运载体-蛋白]脱水酶转化2,4戊二烯酰基-[acp]来生产(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]。可以通过使用分类为EC 4.2.1.119的烯酰基-CoA脱水酶2转化2,4-戊二烯酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。

可以通过使用分类为EC 2.7.4.2的磷酸甲羟戊酸激酶或使用分类为EC2.7.6.-的二磷酸激酶转化2-丁烯-1-醇磷酸来生产2-丁烯-1-醇二磷酸。可以通过使用分类为EC 2.7.1.36的甲羟戊酸激酶转化2-丁烯-1-醇来生产2-丁烯-1-醇磷酸。可以通过使用分类为EC 1.1.1.54的烯丙醇脱氢酶转化2-丁烯-1-醛来生产2-丁烯-1-醇。可以通过使用分类为EC 1.2.1.48的长链乙醛脱氢酶转化巴豆酸来生产2-丁烯-1醛。可以通过使用分类为EC 6.2.1.5的琥珀酸-CoA连接酶转化巴豆酰基-CoA来生产巴豆酸。

可以通过使用分类为EC 2.7.6.-的二磷酸激酶，如分类为EC 2.7.6.2的硫胺素二磷酸激酶转化2-丁烯-1-醇来生产2-丁烯-1-醇二磷酸。

可以通过使用分类为EC 2.7.6.-的二磷酸激酶转化3-丁烯-2-醇或分类为EC 2.7.4.2的磷酸甲羟戊酸激酶转化3-丁烯-2-醇来生产3-丁烯-2-醇二磷酸。可以通过使用分类为EC 2.7.1.36的甲羟戊酸激酶转化3-丁烯-2-醇来生产3-丁烯-2-醇磷酸。

在本申请所述的任何方法中，所述方法可以使用分离的酶、使用包含所述酶的细胞裂解物或使用重组的宿主进行。所述重组宿主可以是厌氧、微需氧或需氧培养的。可以将所述重组宿主细胞保持在陶瓷中空纤维膜中以便在发酵过程中保持较高的细胞密度。供给所述发酵的主要碳源来源于生物或非生物原料。例如，所述生物原料是或者来源于单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素如乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯如甘油和脂肪酸、农业废弃物或城市垃圾。所述非生物原料是或者来源于天然气、合成气、CO₂/H₂、甲醇、乙醇、来自环己烷氧化工艺的非挥发性残渣(NVR)或碱洗废物流。

宿主微生物可以是原核生物，所述原核生物来自埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；来自梭菌属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；来自棒状杆菌(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；来自贪铜菌(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自假单胞菌(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或Pseudomonas oleavorans；来自代尔夫特菌(Delftia)如代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)；来自芽孢杆菌(Bacillus)如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)；来自乳杆菌(Lactobacillus)如德氏乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)或来自乳球菌(Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。宿主微生物是真核生物，所述真核生物来自曲霉(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)；来自酵母菌(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；来自毕赤酵母(Pichia)如毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自耶氏酵母(Yarrowia)如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；来自伊萨酵母(Issatchenkia)如Issathenkia orientalis；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)；来自Arxula如Arxulaadenoinivorans或来自克鲁维酵母(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

在本申请所述的重组宿主中，可减弱催化丙酰基-CoA和乙酰基-CoA水解的酶；可减弱通过甲基柠檬酸循环消耗丙酰基-CoA的酶；可减弱消耗丙酰基-CoA形成丙酮酸的酶；可减弱消耗丙酰基-CoA形成丙二酸单酰基-CoA的酶；可以将反馈抗性苏氨酸脱氨酶经基因工程改造进入宿主生物体中；可减弱催化乙酰基-CoA缩合为乙酰乙酰基-CoA的β-酮硫解酶如AtoB或phaA的基因产物；可减弱在天然累积聚羟基脂肪酸酯的宿主菌株中聚合物合酶；可减弱编码磷酸转乙酰基酶的基因如pta；减弱了编码降解丙酸的乙酸激酶的基因如ack；可减弱编码将丙酮酸降解为乳酸的基因；减弱了编码将磷酸烯醇式丙酮酸降解为琥珀酸的基因如frdBC；可减弱编码将乙酰基-CoA将解为乙醇的基因如adhE；可扩增催化补充柠檬酸循环中间体的添补反应的酶；嘧啶核苷酸转氢酶基因如UdhA可以过表达；甘油醛-3P-脱氢酶基因如GapN可以过表达；苹果酸酶基因如maeA或maeB在所述宿主生物体中可以过表达；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因如zwf在所述宿主生物体中可以过表达；果糖1,6二磷酸酶基因如fbp在所述宿主生物体中可以过表达；可以通过对细胞膜进行遗传工程化结构修饰增强或扩增丁二烯穿过所述细胞膜向细胞外介质的外流；或者可以通过基因工程改造增加任意与丁二烯相关的转运活性来增强或扩增丁二烯穿过所述细胞膜向细胞外介质的外流；在所述宿主生物体中减弱了将丁二烯降解为毒性中间体如1,2-环氧-3-丁烯和1,2:3,4-二环氧丁烷的加氧酶。

在本申请所述的任何方法中，所述硫酯酶可以是tesB的基因产物；所述乙酰乙酰基-CoA还原酶可以是phaB的基因产物；所述乙酰基-CoA C酰基转移酶可以是BktB的基因产物；所述烯酰基-CoA水合酶可以是phaJ的基因产物；所述去饱和酶可以是MdpJ的基因产物；所述细胞色素P450可以是CYP4家族的基因产物；所述β-酮酰基-[acp]合酶I是tcsB的基因产物；所述酰基-转移酶是tcsA的基因产物。

本申请还提供了一种将丁烯醇转化为丁二烯的方法。所述方法包括将3-丁烯-2-醇与芳樟醇脱水酶接触以便生产出1,3-丁二烯。所述芳樟醇脱水酶的分类为EC 4.2.1.127。

除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语均与本领域的普通技术人员对于发明所属领域的通常理解具有相同的含义。尽管可以使用与本申请所描述的那些类似或等价的方法和材料实施本发明，下文中描述了适宜的方法和材料。本申请中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本申请。在存在冲突的情况下，以本申请的说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，其并非旨在进行限制。

在下文中的附图和说明书中对本发明的一个或多个实施方式的细节进行了阐述。本发明的其他特征、目的和优点从说明书和附图以及从权利要求中将是显而易见的。根据专利法的标准惯例可以使用“基本上由……组成”或“由……组成”代替权利要求中的用词“包含”。

附图说明

图1是由C4醛和酮、C4羟基-醛和二酮、丁烯、丁醛或不饱和的酮、丁醇、丁二醇、C5烯醇和活化的丁醇生成1,3丁二烯的主要酶活性的示意性总览。

图2是使用2-氧代戊-4-烯酸作为中心前体生成丁二烯的生化通路的示意图。

图3是使用丙烯酰基-CoA作为中心前体生成丁二烯的生化通路的示意图。

图4是使用3-羟基-4-戊酸作为中心前体生成丁二烯的生化通路的示意图。

图5是使用2,4-戊二烯酰基-[acp]作为中心前体生成丁二烯的生化通路的示意图。

图6是使用2,4-戊二烯酰基-CoA作为中心前体生成丁二烯的生化通路的示意图。

图7是使用巴豆酰基-CoA作为中心前体生成丁二烯的生化通路的示意图。

图8是使用3-丁烯-2-醇作为中心前体生成丁二烯的生化通路的示意图。

图9是使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶合成丁二烯的生化通路的示意图。

图10是使用异戊二烯合酶合成丁二烯的生化通路的示意图。

图11是使用脱水酶合成丁二烯的生化通路的示意图。

图12是MDD接受的替代底物的结构：(a)3-羟基-5-二磷酸戊酸和(b)3-羟基-3-甲基-丁酯。

图13是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Uniprot(通用蛋白质资源)登记号P32377,SEQ ID NO:1)、表皮葡萄球菌(Staphyloccocusepidermidis)(Uniprot登记号Q7CCL9,SEQ ID NO:2)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)(Uniprot登记号B8ZLF3,SEQ ID NO:3)的MDD酶的氨基酸序列，在所述酶催化裂隙中的保守残基加粗显示。

发明详述

特别地，本申请提供了酶、非天然的途径、培养策略、原料、宿主微生物和对宿主生化网络的减弱，其在四碳和五碳链代谢产物中生成两个末端乙烯基，以便由中心前体或中心代谢产物合成1,3丁二烯(在本申请中称为“丁二烯”)。在本申请中使用的术语“中心前体”用于指在合成丁二烯的通路中的关键代谢产物。在本申请中使用的术语“中心代谢产物”用于指在所有微生物中生产的用于支持生长的代谢产物。

这样，本申请中所述的宿主微生物可以包括能够被操纵以使得能够生产丁二烯的内源性途径。在内源性途径中，所述宿主微生物天然地表达催化在所述途径中的反应的所有酶。含有经工程改造的途径的宿主微生物不能天然地表达催化所述途径中的反应的所有酶，但是其经过工程改造，以使得在所述途径中的所有酶在所述宿主中表达。在经工程改造的途径中，所述酶可以来自单一的来源，即来自一个物种，或可以来自多个来源，即不同物种。已从各种生物体中鉴定出编码本申请所述的酶的核酸并且其易于从公开可用的数据库如GenBank或EMBL获得。经工程改造的宿主能够天然地不表达或表达一些(例如，一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或者六种或更多中)本申请所述的通路的酶。还可以破坏经工程改造的宿主的内源性基因以阻止不利的代谢产物的形成或者阻止在所述途径中通过其他酶作用于此类中间体导致中间体的损失。经工程改造的宿主可以指重组的宿主或重组的宿主细胞。因此，根据下文中更加详细的描述，如本申请所述的重组的宿主可以包括编码脱羧酶、脱氢酶、去饱和酶、单加氧酶、酰基[酰基运载体蛋白(acp)]脱氢酶、脱水酶或水合酶的一种或多种的核酸。

此外，使用本申请所述的分离的酶，使用来自宿主微生物的裂解物(例如，细胞裂解物)作为酶的来源或者使用来自不同宿主微生物的多种裂解物作为酶的来源可以在体外进行丁二醇的生产。

图1提供了可以由各种四碳或五碳分子包括C4醛和酮、C4羟基-醛和二酮、丁烯、丁醛或不饱和的酮、丁醇、丁二醇、C5烯醇和活化的丁醇生产1,3丁二烯的主要酶活性的概述。

4.1在丁二烯的生物合成中生成第一个末端乙烯基的酶

如图2-8中所描述的，可以在4-草酰巴豆酸、2-羟基粘康酸半醛、2-羟基-6-氧代壬-2,4-二烯-1,9-二酯、丙酰基-CoA、乳酰基-CoA、3-羟基丙酰基-CoA、(R)3-羟基-戊酸、戊-2-烯酰基-[acp]、5-羟基戊酰基-CoA(通过5-羟基-戊-2-烯酰基-CoA)、戊-3-烯酰基-CoA、4-羟基丁酰基-CoA、戊烯二酰基-CoA、(R)3-羟基丁酰基-CoA或2-丁醇中形成第一个乙烯基以生产此类化合物如2-氧代戊-4-烯酸、丙烯基-CoA、(R)3-羟基戊-4-烯酸、(R)3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]、2,4-戊二烯酰基-CoA、巴豆酰基-CoA和3-丁烯-2-醇。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在4-草酰巴豆酸、2-羟基粘康酸半醛或2-羟基-6-氧代壬-2,4-二烯-1,9-二酯中通过4-草酰巴豆酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)、2-羟基粘康酸半醛水解酶(EC 3.7.1.9)或2-羟基-6-氧代壬-2,4二烯二酯水解酶(EC 3.7.1.14)酶促形成的以生产2-氧代戊-4-烯酸。参见例如图2。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在丙酰基-CoA、乳酰基-CoA或3-羟基丙酰基-CoA中通过丁酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.8.1)、中链酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.8.7)、乳酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.54)或3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)酶促形成的以生产丙烯酰基-CoA。参见例如图3。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在(R)3-羟基-戊酸中通过去饱和酶或单加氧酶如MdpJ的基因产物或者细胞色素P450如CYP4家族的基因产物酶促形成的以生产3-羟基戊-4-烯酸。参见例如图4。

单加氧酶的基因产物MdpJ使与仲醇连接的末端乙基去饱和(等，Applied and Environmental Microbiology,2012,78(24))。

细胞色素P450CYP4家族的基因产物针对C5羧酸戊酸的末端去饱和相对于ω-羟基化显示出特异性(Rettie等，Biochemistry,1995,34,7889–7895)。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在戊-2-烯酰基[acp]中通过酰基-[acp]脱氢酶如TcsD的基因产物酶促形成的以生产2,4-戊二烯酰基-[acp]。参见例如图5。

酰基-[acp]脱氢酶的基因产物TscD使戊-2-烯酰基-[acp]的末端亚甲基去饱和以产生2,4-戊二烯酰基-[acp](Mo等，J.Am.Chem.Soc.,2011,133(4),976–985)。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在5-羟基戊酰基-CoA(通过5-羟基-戊-2-烯酰基-CoA作为中间体)或戊-3-烯酰基-CoA中通过5-羟基戊酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.-)或2,4-二烯酰基辅酶A还原酶(EC1.3.1.34)酶促形成的以生产2,4-戊二烯酰基-CoA。参见例如图6。

已从绿色梭菌(Clostridium viride)中鉴定出将5-羟基戊酸脱水为2,4戊二酰基-CoA所利用5-羟基戊酰基-CoA脱水酶(Eikmanns和Buckel,Eur.J.Biochem.,1991,197,661–668)。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在4-羟基丁酰基-CoA、(R)3-羟基丁酰基-CoA或戊烯二酰基-CoA中通过烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)如phaJ的基因产物、4-羟基丁酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.120)或戊烯二酰基-CoA脱羧酶(EC 4.1.1.70)酶促形成的以产生巴豆酰基-CoA。参见例如图7。

已在若干梭菌(Clostridium)属如克氏梭菌(Clostridium kluyveri)中鉴定出了可逆的脱水酶4-羟基丁酰基-CoA脱水酶，其提供了经由中心代谢产物琥珀酸生成巴豆酰基-CoA的途径(Scherf等，Arch.Microbiol,1994,161(3),239–245；Sherf和Buckel,Eur.J.Biochem.,1993,215,421–429)。

生物素依赖性脱羧酶戊烯二酰基-CoA脱羧酶在脱羧后保持了底物的乙烯基的位置，其提供了经由中心代谢产物2-氧代戊二酸生成巴豆酰基-CoA的途径(Kerstin等，The EMBO Journal,2003,22(14),3493–3502)。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第一个乙烯基是在2-丁醇中通过去饱和酶或单加氧酶如MdpJ的基因产物或者细胞色素P450如CYP4家族的基因产物酶促形成的以生产3-丁烯-2-醇。参见例如图8。

4.2在丁二烯的生物合成中生成第二个末端乙烯基的酶

如图9-11中所描述的，可以使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MDD)、异戊二烯合酶(ISPS)或脱水酶酶促形成第二个乙烯基。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第二个乙烯基是利用酶分类为EC4.1.1.33的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MDD)形成的。参见例如图9。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第二个乙烯基是利用酶分类为EC4.2.3.27的异戊二烯合酶(ISPS)形成的。参见例如图10。

在一些实施方式中，导致丁二烯合成的第二个乙烯基是利用酶分类为EC4.2.1.-的脱水酶形成的，如芳樟醇脱水酶(EC 4.2.1.127)、奇维酮水合酶(EC4.2.1.95)、油酸水合酶(EC 4.2.1.53)或类胡萝卜素1,2-水合酶(EC 4.2.1.131)。参见例如图11。

可以将芳樟醇认为是在α位被异己烯基R-基团取代的3-丁烯-2-醇。芳樟醇至月桂烯的脱水具有热力学偏好性并且可能通过去质子化发挥作用，其中所述R-基团不具有机械作用(Bordkorb等，J.Biol.Chem.,2010,285(40),30436–30442)。

油酸水合酶将长链不饱和脂肪酸油酸转化为(R)-10-羟基硬脂酸。然而，在对E.meningoseptica的油酸水合酶序列的165个同源物的筛选中，有几个接受异丁醇作为形成异丁烯的底物(Bianca等，Appl.Microbiol Biotechnol.,2012,93,1377–1387)。

4.3生化途径

4.3.1使用2-氧代戊-4-烯酸作为中心前体生成丁二烯的途径

由芳香化合物如原儿茶酸(Kasai等，J.Bacteriol.,2009,191(21),6758–6768)、儿茶酚(He和Spain,J.Bacteriol.,1998,180(9),2502–2506)、邻氨基苯甲酸(Muraki等，Applied and Environmental Microbiology,2003,69(3),1564–1572)和3-苯丙酸(Ferrandez等，J.Bacteriol.,1997,179(8),2573–2581)产生2-氧代戊-4-烯酸的途径已很好地表征。来自中心代谢产物的碳通量可以通过利用3-去氢莽草酸脱水酶(EC 4.2.1.118)的3-去氢莽草酸、通过利用邻氨基苯甲酸合酶(EC 4.1.3.27)的分支酸以及利用苯丙氨酸解氨酶(EC4.3.1.24)和2-烯酮还原酶(EC 1.3.1.31)的L-苯丙氨酸指向这些降解途径。

在一些实施方式中，由中心代谢产物分支酸合成2-氧代戊-4-烯酸，其通过利用邻氨基苯甲酸合酶(EC 4.1.3.27)转化为邻氨基苯甲酸；随后通过利用邻氨基苯甲酸1,2-双加氧酶(EC 1.14.12.1)转化为儿茶酚；随后通过利用儿茶酚2,3-双加氧酶(EC 1.13.11.2)转化为2-羟基粘康酸半醛；随后通过利用2-羟基粘康酸-半醛水解酶(EC 3.7.1.9)转化为2-氧代戊-4-烯酸。此外，可以利用氨基粘康酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.32)将2-羟基粘康酸半醛转化为2-羟基粘康酸，可以利用2-羟基粘康酸异构酶(EC 5.3.2.6)将4-羟基粘康酸转化为4-草酰巴豆酸和可以利用4-草酰巴豆酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)将4-草酰巴豆酸转化为2-氧代戊-4-烯酸。参见例如图2。

在一些实施方式中，由中心代谢产物3-去氢莽草酸合成2-氧代戊-4-烯酸，通过利用3-去氢莽草酸脱水酶(EC 4.2.1.118)转化为原儿茶酸；随后通过利用原儿茶素脱羧酶(EC 4.1.1.63)转化为儿茶酚；随后通过利用儿茶酚2,3-双加氧酶(EC 1.13.11.2)转化为2-羟基粘康酸半醛；随后通过利用2-羟基粘康酸-半醛水解酶(EC 3.7.1.9)或通过利用氨基粘康酸半醛脱氢酶(EC1.2.1.32)、2-羟基粘康酸异构酶(EC 5.3.2.6)和4-草酰巴豆酸脱羧酶(EC4.1.1.77)转化为2-氧代戊-4-烯酸。参见例如图2。

在一些实施方式中，由中心代谢产物3-去氢莽草酸合成2-氧代戊-4-烯酸，通过利用3-去氢莽草酸脱水酶(EC 4.2.1.118)转化为原儿茶素；随后通过利用原儿茶素2,3-双加氧酶如praA的基因产物转化为5-羧基2-羟基粘康酸-6-半醛；随后通过利用5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱羧酶如praH的基因产物转化为2-羟基粘抗酸半醛；随后通过利用2-羟基粘康酸-半醛水解酶(EC3.7.1.9)或者利用氨基粘康酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.32)、2-羟基粘抗酸异构酶(EC 5.3.2.6)和4-草酰巴豆酸脱羧酶(EC 4.1.1.77)转化为2-氧代戊-4-烯酸。参见例如图2。

在一些实施方式中，由中心代谢产物L-苯丙氨酸合成2-氧代戊-4-烯酸，通过利用苯丙氨酸解氨酶(EC 4.3.1.24)转化为E-肉桂酸；随后通过利用2-烯酮还原酶(EC 1.3.1.31)转化为3-苯基-丙酸；随后利用3-苯基丙酸双加氧酶(EC 1.14.12.19)转化为顺式-3-(羧基-乙基)-3,5-环-己二烯-1,2-二醇；随后通过利用3-(顺式-5,6-二羟基环己-1,3-二烯-1-基)丙酸脱氢酶(EC1.3.1.87)转化为2,3-二羟基苯基丙酸；随后通过利用3-羧基乙基儿茶酚2,3双加氧酶(EC 1.13.11.16)转化为2-羟基-6-氧代壬-2,4-二烯-1,9-二酯；随后通过利用2-羟基-6-氧代壬-2,4-二烯二酯水解酶(EC 3.7.1.14)转化为2-氧代戊-4-烯酸。参见例如图2。

在一些实施方式中，由2-氧代戊-4-烯酸合成丁二烯，通过利用(R)-2-羟基异己酸脱氢酶如LdhA的基因产物转化为2-羟基戊-4-烯酸；随后通过利用CoA转移酶如GctAB的基因产物转化为2-羟基戊-4-烯酰基-CoA；随后通过利用2-羟基异己酰基-CoA脱水酶如起始子HadI和HadBC的基因产物转化为2,4-戊二烯酰基-CoA；随后通过利用烯酰基-CoA脱水酶2(EC 4.1.1.119)转化为(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-CoA；随后通过利用硫酯酶(EC 3.1.2.-)如tesB的基因产物转化为(R)-3-羟基戊-4-烯酸；随后利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(C4.1.1.33)转化为丁二烯。参见例如图9。

(R)-2-羟基异已酸脱氢酶(LdhA的基因产物)接受2-氧代戊酸和2-氧代己酸作为底物(Kim,On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyl-CoA脱水酶from Clostridium difficile(来自艰难梭菌的2-羟基异己酰基-CoA脱水酶的酶促机制),2004,Ph.D.论文，Marburg,2004)。2-氧代戊酸是2-氧代戊-4-烯酸非常接近的底物类似物。

戊烯二酸CoA-转移酶(GctAB)是接受长度范围为3至6个碳的碳链混杂酶，所述碳链是具有支链的和不具有支链的、α取代的和未被取代的单羧酸和二羧酸(参见例如Buckel等，Eur.J.Biochem.,1981,118,315–321)。2-羟基戊-4-烯酸具有相应的结构和官能团，其中CoA的活化是2-羟基异已酰基-CoA脱水酶的活性所需要的。

2-羟基异己酰基-CoA脱水酶(HadI&HadBC)接受所述底物类似物2-羟基戊-4-烯酰基-CoA作为底物，合成2,4-戊二烯酰基-CoA(Kim等，NatureLetters,2008,452,239–243)。

已使用tesB的基因产物证实了短碳链和中碳链酰基-CoA底物的水解(Liu等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,76,811–818)。tesB的基因产物硫酯酶II有效地水解(R)-3-羟基戊酰基-CoA(Martin和Prather,Journal ofBiotechnology,2009,139,61–67)。

4.3.2丙酰基-CoA作为前体使得中心前体生成丁二烯的途径

在一些实施方式中，丙酰基-辅酶A(CoA)是在丁二烯的合成中生成中心前体的前体(参见例如图3)。

在一些实施方式中，由中心代谢产物琥珀酰基-COA合成丙酰基-CoA，通过利用甲基丙二酰基-CoA变位酶(EC 5.4.99.2)将琥珀酰基-CoA转化为(2R)-甲基丙二酰基-CoA；通过利用甲基丙二酰基-CoA差向异构酶(EC5.1.99.1)转化为(2S)-甲基丙二酰基-CoA；通过利用甲基丙二酰基-CoA羧基转移酶(EC 2.1.3.1)或甲基丙二酰基-CoA脱羧酶(EC 4.1.1.41)转化为丙酰基-CoA。参见例如图3。

在一些实施方式中，由中心代谢产物L-苏氨酸合成丙酰基-CoA，通过利用苏氨酸解氨酶(EC 4.3.1.19)将L-苏氨酸转化为2-氧代丁酸；通过利用2-酮丁酸甲酸裂解酶如tdcE的基因产物(EC 2.3.1.-)转化为丙酰基-CoA(参见Tseng等，Microbial Cell Factories,2010,9:96)。参见例如图3。

已证实了细胞内累积的来自L-苏氨酸的丙酰基-CoA是生成其他产物的前体(Tseng等，Microbial Cell Factories,2010,9:96)。

在一些实施方式中，由1,2-丙二醇合成丙酰基-CoA，通过利用丙二醇脱水酶(EC 4.2.1.28)转化为丙醛；随后通过利用CoA-依赖性丙醛脱氢酶如pduP的基因产物转化为丙酰基-CoA(参见Luo等，Bioresource Technology,2012,103,1-6)。参见例如图3。

已报道了来自1,2丙二醇的丙酰基-CoA在细胞内的累积(Luo等，Bioresource Technology,2012,103,1-6)。

在一些实施方式中，由碳源乙酰丙酸合成丙酰基-CoA，通过利用酰基-CoA合酶或连接酶(EC 6.2.1.-)将乙酰丙酸转化为乙酰丙酰基-CoA；随后通过利用分类为EC 2.3.1.-的转移酶转化为丙酰基-CoA(Jaremko和Yu,Journalof Biotechnology,2011,155,2011,293–298)。参见例如图3。

在一些实施方式中，由中心代谢产物丙酮酸合成丙酰基-CoA，通过利用L-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)将丙酮酸转化为L-乳酸；随后通过利用丙酸-CoA-转移酶(EC 2.8.3.1)转化为乳酰基-CoA；随后通过利用乳酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.54)转化为丙烯酰基-CoA；随后通过利用丁酰基-CoA脱氢酶(EC1.3.8.1)或中链酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.8.7)转化为丙酰基-CoA。参见例如图3。

在一些实施方式中，由中心代谢产物丙二酰基-CoA合成丙酰基-CoA，通过利用丙二酰基-CoA还原酶(EC 1.2.1.75)将丙二酰基-CoA转化为丙二酸；随后通过利用3-羟基丙酸脱氢酶(EC 1.1.1.59)转化为3-羟基丙酸；随后通过利用3-羟基异丁酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)转化为3-羟基丙酰基-CoA；随后通过利用3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)转化为丙烯酰基-CoA；随后通过利用丁酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.8.1)或中链酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.8.7)转化为丙酰基-CoA。参见例如图3。

4.3.3使用丙烯酰基-CoA作为中心前体生成丁二烯的途径

在一些实施方式中，利用丁酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.8.1)或中链酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.8.7)由丙酰基-CoA合成丙烯酰基-CoA。参见例如图3。

在一些实施方式中，由中心代谢产物丙酮酸合成丙烯酰基-CoA，通过利用L-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)由丙酮酸合成L-乳酸；随后通过利用丙酸CoA转移酶(EC 2.8.3.1)转化为乳酰基-CoA；随后通过利用乳酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.54)转化为丙酰基-CoA。参见例如图3。

在一些实施方式中，由中心代谢产物丙二酰基-CoA合成丙烯酰基-CoA，通过利用丙二酰基-CoA还原酶(EC 1.2.1.75)转化为丙二酸半醛；随后通过利用3-羟基丙酸脱氢酶(EC 1.1.1.59)转化为3-羟基丙酸；随后通过利用3-羟基异丁酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)转化为3-羟基丙酰基-CoA；随后通过利用3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)转化为丙烯酰基-CoA。参见例如图3。

在一些实施方式中，由丙烯酰基-CoA合成丁二烯，通过利用β-酮硫解酶如EC 2.3.1.16转化为3-氧代戊-4-烯酰基-CoA；随后通过利用乙酰乙酰基-CoA还原酶(EC 1.1.1.36)如phaB的基因产物转化为(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-CoA；随后通过利用硫酯酶(EC.3.1.2.-)如tesB的基因产物转化为(R)-3-羟基戊-4-烯酸；随后通过利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)转化为丁二烯。参见例如图9。

4.3.4使用(R)3-羟基戊-4-烯酸作为中心前体生成丁二烯的途径

在一些实施方式中，由丙酰基-CoA合成(R)3-羟基戊-4-烯酸，通过利用乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)转化为3-氧代戊酰基-CoA；随后通过利用乙酰乙酰基-CoA还原酶(EC 1.1.1.36)如phaB的基因产物转化为(R)3-羟基戊酰基-CoA；随后通过利用硫酯酶如tesB的基因产物(EC 3.1.2.-)转化为(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA；随后通过利用去饱和酶如MdpJ的基因产物或细胞色素P450如CYP4家族的基因产物转化为(R)3-羟基戊-4-烯酸。参见例如图4。

已对利用在CYP4家族中的细胞色素P450将羧酸末端去饱和进行了阐释。CYP4B1通过除去末端的ω-1氢将12个碳链长度的脂肪酸月桂酸去饱和(Guan等，Chemico-Biology Interactions,1998,110,103–121)。

在一些实施方式中，利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)由(R)3-羟基戊-4-烯酸合成丁二烯。参见例如图9。

4.3.5使用2,4-戊二烯酰基-[acp]作为中心前体生成丁二烯的途径

在一些实施方式中，由丙酰基-CoA合成(R)3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]，通过利用乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)将丙酰基-CoA转化为3-氧代戊酰基-CoA；随后通过利用3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.36)如phaB的基因产物转化为(R)3-羟基戊酰基-CoA；随后通过利用烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)如phaJ的基因产物转化为戊-2-烯酰基-CoA；随后通过与酰基转移酶的基因产物如tcsA的反应转化为戊-2-烯酰基-[acp]；随后通过利用酰基-[acp]脱氢酶如TcsD的基因产物转化为(R)2,4-戊二烯酰基-[acp]。参见例如图5。

在一些实施方式中，由丙酰基-CoA合成(R)3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]，通过利用β-酮酰基-[acp]合酶I(EC 2.3.1.41)如tcsB和酰基-转移酶如tcsA将丙酰基-CoA转化为3-氧代戊酰基-[acp]；随后通过利用3-氧代酰基-[酰基-运载体-蛋白]还原酶(EC 1.1.1.100)转化为(R)3-羟基戊酰基-CoA；随后通过利用3-羟基酰基-[acp]脱水酶(EC 4.2.1.59)转化为戊-2-烯酰基-[acp]；随后通过利用acyl-[acp]脱氢酶如TcsD的基因产物转化为2,4-戊二烯酰基-[acp]。参见例如图5。

在一些实施方式中，由(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]合成丁二烯，通过利用(R)-3-羟基酰基-[acp]:CoA转酰基酶如phaG的基因产物转化为(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-CoA；随后通过利用硫酯酶如tesB的基因产物转化为(R)-3-羟基戊-4-烯酸；随后通过利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)转化为丁二烯。参见例如图9。

phaJ(EC 4.2.1.119)的基因产物是用于提供由脂肪酸合成聚羟基烷酸酯合酶酶的短链和中链R-特异性3-羟基酰基-CoA单体的关键酶(Chung和Rhee,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2012,76(3),613–616；Tsuge等，InternationalJournal of Biological Macromolecules,2003,31,195–205)。

利用4-戊烯酸作为生产聚羟基烷酸酯的细菌的碳源以通过β氧化生产(R)-3-羟基戊-4-烯酸。因此，4-戊烯酸被转化为2,4-戊二烯酰基-CoA，可以将其提供给在利用R-特异性烯酰基-CoA脱水酶的活性对(R)-3-羟基戊-4-烯酸水合后的聚合物合酶酶(Ulmer等，Macromolecules,1994,27,1675–1679)。

4.3.6使用2,4戊二烯酰基-CoA作为中心前体生成丁二烯的途径

在一些实施方式中，由丙酰基-CoA合成2,4-戊二烯酰基-CoA，通过利用乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)如bktB的基因产物将丙酰基-CoA转化为3-氧代-戊酰基-CoA；随后通过利用3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC1.1.1.36)如phaB的基因产物转化为(R)3-羟基戊酰基-CoA；随后通过利用烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)如phaJ的基因产物转化为戊-2-烯酰基-CoA；随后通过利用异构酶(EC 5.3.3.8)转化为戊-3-烯酰基-CoA；随后通过利用2,4-二烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.34)转化为2,4,-戊二烯酰基-CoA。参见例如图6。

在一些实施方式中，由丙酰基-CoA合成2,4-戊二烯酰基-CoA，通过利用乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)如bktB的基因产物将丙酰基-CoA转化为3-氧代-戊酰基-CoA；随后通过利用3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC1.1.1.36)如phaB的基因产物转化为(R)3-羟基戊酰基-CoA；随后通过利用烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)如phaJ的基因产物转化为2E-戊烯酰基-CoA；随后通过利用反式-2-烯酰基-CoA还原酶如EC 1.3.1.38转化为戊酰基-CoA；随后通过利用细胞色素P450单加氧酶如CYP153A6的基因产物转化为5-羟基戊酰基-CoA；随后通过利用5-羟基戊酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.-)(例如来自绿色梭菌(Clostridium viride))转化为2,4,-戊二烯酰基-CoA。参见例如图6。

在一些实施方式中，由中心代谢产物L-谷氨酸合成2,4-戊二烯酰基-CoA，通过利用谷氨酸5-激酶(EC 2.7.2.11)将L-谷氨酸转化为L-谷氨酰基-5-磷酸；随后通过谷氨酸-5-半醛脱氢酶(EC 1.2.1.41)转化为L-谷氨酸-5-半醛；随后自发转化为(S)-1-吡咯啉-5-羧酸；随后通过利用吡咯啉-5-羧酸还原酶(EC1.5.1.2)转化为L-脯氨酸；随后通过脯氨酸消旋酶(EC 5.1.1.4)转化为D-脯氨酸；随后通过D-脯氨酸还原酶(EC 1.21.4.1)转化为5-氨基戊酸；随后通过利用5-氨基戊酸氨基转移酶(EC 2.6.1.48)转化为5-氧代戊酸；随后通过利用5-羟基戊酸脱氢酶如cpnD的基因产物或来自绿色梭菌(Clostridiumviride)的脱氢酶转化为5-羟基戊酸；随后通过利用5-羟基戊酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.14)转化为5-羟基戊酰基-CoA；随后通过利用5-羟基戊酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.-)(例如来自绿色梭菌(Clostridium viride))转化为2,4-戊二烯酰基-CoA。参见例如图6。

在一些实施方式中，由2,4-戊二烯酰基-CoA合成丁二烯，通过利用烯酰基-CoA脱水酶2(EC 4.2.1.119)如phaJ的基因产物将2,4-戊二烯酰基-CoA转化为(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-CoA；随后通过利用硫酯酶如tesB的基因产物转化为(R)-3-羟基戊-4-烯酸；随后通过利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC4.1.1.33)转化为丁二烯。参见例如图9。

4.3.7使用巴豆酰基-CoA作为中心前体生产丁二烯的途径

在一些实施方式中，由中心代谢产物乙酰基-CoA合成巴豆酰基-CoA，通过利用乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)如atoB或phaA的基因产物将乙酰基-CoA转化为乙酰乙酰基-CoA；随后通过利用3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.36)如phaB的基因产物转化为(R)3-羟基丁酰基-CoA；随后通过利用烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)如phaJ的基因产物转化为巴豆酰基-CoA。参见例如图7。

在一些实施方式中，由中心代谢产物琥珀酰基-CoA合成巴豆酰基-CoA，通过利用琥珀酸-半醛脱氢酶(EC 1.2.1.76)将琥珀酰基-CoA转化为琥珀酸半醛；随后通过利用4-羟基丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.61)转化为4-羟基丁酸；随后通过利用CoA-转移酶如Ck-cat2的基因产物转化为4-羟基丁酰基-CoA；随后通过利用4-羟基丁酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.120)和乙烯基乙酰基-CoA异构酶(EC 5.3.3.3)转化为巴豆酰基-CoA。参见例如图7。

在一些实施方式中，由中心代谢产物2-氧代-戊二酸合成巴豆酰基-CoA，通过利用2-羟基戊二酸脱氢酶(EC 1.1.99.2)将2-氧代-戊二酸转化为2-羟基戊二酸；随后通过利用戊烯二酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.12)转化为2-羟基戊二酰基-CoA；随后通过利用脱水酶(EC 4.2.1.-)转化为戊烯二酰基-CoA；随后通过戊烯二酰基-CoA脱羧酶(EC 4.1.1.70)转化为巴豆酰基-CoA。参见例如图7。

在一些实施方式中，由巴豆酰基-CoA合成丁二烯，通过利用琥珀酸-CoA连接酶(EC 6.2.1.5)转化为巴豆酸；随后通过利用长链醛脱氢酶(EC 1.2.1.48)转化为2-丁烯醛；随后通过利用烯丙醇脱氢酶(EC 1.1.1.54)转化为2-丁烯-1-醇；随后通过利用甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)转化为2-丁烯-1-醇磷酸；随后通过利用磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)转化为2-丁烯-1-醇二磷酸；随后通过利用异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)转化为丁二烯。参见例如图10。

在一些实施方式中，由巴豆酰基-CoA合成丁二烯，通过利用琥珀酸-CoA连接酶(EC 6.2.1.5)转化为巴豆酸；随后通过利用长链醛脱氢酶(EC 1.2.1.48)转化为2-丁烯醛；随后通过利用烯丙醇脱氢酶(EC 1.1.1.54)转化为2-丁烯-1-醇；随后通过利用二磷酸转移酶如硫胺素二磷酸激酶(EC 2.7.6.2)转化为2-丁烯-1-醇二磷酸；随后通过利用异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)转化为丁二烯。参见例如图10。

在一些实施方式中，由巴豆酰基-CoA合成丁二烯，通过利用琥珀酸-CoA连接酶(EC 6.2.1.5)将巴豆酰基-CoA转化为巴豆酸；随后通过利用长链醛脱氢酶(EC 1.2.1.48)转化为2-丁烯醛；随后通过利用烯丙醇脱氢酶(EC1.1.1.54)转化为2-丁烯-1-醇；随后通过利用酶分类为EC 4.2.1.-的脱水酶如芳樟醇脱水酶(EC 4.2.1.127)、奇维酮水合酶(EC 4.2.1.95)、油酸水合酶(EC4.2.1.53)或类胡萝卜素1,2-水合酶(EC 4.2.1.131)。参见例如图11。

4.3.8使用3-丁烯-2-醇作为中心前体生产丁二烯的途径

在一些实施方式中，由中心前体丙酮酸合成3-丁烯-2-醇，通过利用乙酰乳酸合酶(EC 2.2.1.6)将丙酮酸转化为2-乙酰乳酸；随后通过利用乙酰乳酸脱羧酶(EC 4.1.1.5)转化为(R)-乙偶姻；随后通过利用(R,R)-丁二醇脱氢酶(EC 1.1.1.4)转化为2,3丁二醇；随后通过利用丙二醇脱水酶(EC 4.2.1.28)转化为丁酮；随后通过利用(R)-特异性仲醇脱氢酶(EC 1.1.1.B4)转化为2-丁醇；随后通过利用去饱和酶或单加氧酶如MdpJ的基因产物或在例如CYP4家族中的细胞色素P450。参见例如图8。

在一些实施方式中，由3-丁烯-2-醇合成丁二烯，通过利用甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)转化为3-丁烯-2-醇磷酸；随后通过利用磷酸甲羟戊酸激酶(EC2.7.4.2)转化为3-丁烯-2-醇二磷酸；随后通过利用异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)转化为丁二烯。参见例如图10。

在一些实施方式中，由3-丁烯-2醇合成丁二烯，通过利用二磷酸转移酶如硫胺素二磷酸激酶(EC 2.7.6.2)转化为3-丁烯-2-醇二磷酸；随后通过利用异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)转化为丁二烯。参见例如图10。

在一些实施方式中，由3-丁烯-2-醇合成丁二烯，通过利用酶分类为EC4.2.1.-的脱水酶如芳樟醇脱水酶(EC 4.2.1.127)、奇维酮水合酶(EC 4.2.1.95)、油酸水合酶(EC 4.2.1.53)或类胡萝卜素1,2-水合酶(EC 4.2.1.131)。参见例如图11。

4.4培养策略

在一些实施方式中，在重组宿主中使用发酵策略生物合成丁二烯，所述发酵策略包括重组宿主的厌氧、微需氧或需氧培养。

在掺入酶的丁二烯合成途径中需要分子氧和酶，所述酶的特征为在体外是氧敏感性的，其需要保持较低溶解的氧浓度的微需氧培养策略，同时维持充分的氧转移以阻止底物氧化的受控条件(Chayabatra&Lu-Kwang,Appl.Environ.Microbiol.,2000,66(2),4930498)。

在一些实施方式中，在丁二烯的合成中在分批补料或连续发酵的过程中采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞保持策略以达到并保持高细胞密度。

在一些实施方式中，在丁二烯的合成中供应发酵的主要碳源来自生物或非生物原料。

在一些实施方式中，所述生物原料是、包括、或者来源于单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素如乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯如甘油和脂肪酸、农业废弃物或城市垃圾。

已证实来源于生物柴油生产的粗甘油在若干微生物中被有效地分解代谢如大肠杆菌(Escherichia coli)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、Pseudomonas oleavorans、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(Lee等，Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166,1801–1813；Yang等，Biotechnology for Biofuels,2012,5:13；Meijnen等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90,885–893)。

在经由前体丙酰基-CoA的3-羟基戊酸合成中已证实来源于木质纤维的乙酰丙酸在若干微生物中被有效地分解代谢如钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(Jaremko和Yu,Journal ofBiotechnology,2011,155,2011,293–298；Martin和Prather,Journal ofBiotechnology,2009,139,61–67)。

已证实来源于木质素的芳香族化合物如苯甲酸类似物在若干微生物中被有效地分解代谢如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(Bugg等，Current Opinion in Biotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja等，FEMS Microbiol.Rev.,2008,32,736–794)。

已证实农业废弃物如橄榄油厂废水在若干微生物中被有效地利用，包括解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(Papanikolaou等，Bioresour.Technol.,2008,99(7),2419–2428)。

已证实可发酵的糖如来源于纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜蜜糖、木薯、玉米和其他农业来源的在若干微生物中被有效地利用如大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(参见例如Hermann等，Journal of Biotechnology,2003,104,155–172；Wee等，Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2),163–172；Ohashi等，Journal ofBioscience and Bioengineering,1999,87(5),647–654)。

已证实来源于多种农业木质纤维素来源的糖醛被钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)有效地利用(Li等，Biodegradation,2011,22,1215–1225)。

在一些实施方式中，所述非生物原料是或者来源于天然气、合成气、CO₂/H₂、甲醇、乙醇、来自环己烷氧化工艺的非挥发性残渣(NVR)或碱洗废物流。

已证实甲醇被甲醇酵母毕赤酵母(Pichia pastoris)有效地分解代谢。

已证实乙醇被克氏梭菌(Clostridium kluyveri)有效地分解代谢(Seedorf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128–2133)。

已证实CO₂和H₂被钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)有效地分解代谢，其可以来源于天然气以及其他化学和石油化学来源(Prybylski等，Energy,Sustainability and Society,2012,2:11)。

已证实合成气被多种微生物有效地分解代谢，如德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(等，Applied and Environmental Microbiology,2011,77(15),5467–5475)。

已证实来自环己烷工艺的非挥发性残渣废物流被多种微生物有效地分解代谢，如代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)和钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)(Ramsay等，Applied and Environmental Microbiology,1986,52(1),152–156)。

在一些实施方式中，所述宿主微生物是原核生物。例如，原核生物可以来自大肠杆菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；来自梭属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；来自棒状杆菌属(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或Pseudomonas oleavorans；来自代尔夫特菌属(Delftia)如代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)；来自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)；来自乳杆菌属(Lactobacillus)如德氏乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)或来自乳球菌属(Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。也可以将此类原核生物作为基因的来源以构建能够产生丁二烯的本申请所述的重组的宿主细胞。

在一些实施方式中，所述宿主微生物是真核生物。例如，真核生物可以来自曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)；来自酵母菌属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；来自毕赤酵母属(Pichia)如毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自耶氏酵母属(Yarrowia)如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；来自伊萨酵母属(Issatchenkia)如Issathenkiaorientalis；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)；来自Arxula如Arxula adenoinivorans或来自克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。也可以将此类真核生物作为基因的来源以构建能够产生丁二烯的本申请所述的重组的宿主细胞。

4.5代谢工程

本申请提供了涉及少于上述所有途径中描述的所有步骤的方法。此类方法可以涉及例如此类步骤的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个。当在此类方法中包括少于所有步骤时，第一步骤可以是所列步骤中的任一个。

此外，本申请所述的重组宿主可以包括上述酶的任意组合，以使得可以在重组宿主中进行一个或多个所述步骤，例如此类步骤中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个。

此外，本申请认识到当将酶描述为接受CoA活化的底物时，在相同的酶分类中不是必须存在与[acp]结合底物相关的类似的酶活性。

并且，本申请认识到当将酶描述为接受底物的(R)-对映体时，在相同的酶分类中不是必须存在与(S)-对映体底物相关的类似的酶活性。

本申请还认识到当酶显示出接受特定的辅因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA时，针对在催化特定酶的活性中接受多种不同的辅因子或共底物而言，多种酶是混杂的。而且，本申请认识到当酶对例如特定的辅因子如NADH具有较高的特异性时，对辅因子NADPH具有较高特异性的具有类似或相同活性的酶可以是在不同的酶分类中。

在一些实施方式中，在4.3部分中列出的途径中的酶是通过非直接的或合理的酶设计方法进行工程改造获得的酶，所述方法的目标为改善活性、改善特异性、减少反馈抑制、减少阻遏、改善酶的溶解度、改变立体特异性或改变辅因子的特异性。

在一些实施方式中，在4.3部分中列出的途径中的酶是通过附加体或染色体整合方法给药(即过表达)入所得到的遗传修饰生物体中的基因。

在一些实施方式中，使用基因组范围的系统生物学技术如通量平衡分析设计用于引导碳流向丁二烯的基因组范围的减弱或敲除策略。

减弱策略包括但不限于使用转座子、同源重组(双交换方法)、诱变、酶抑制剂和RNAi干扰的方法。

在一些实施方式中，利用通量组学、代谢组学和转录组学的数据提供信息或支持基因组范围的系统生物学技术，以设计用于引导碳流向丁二烯的基因组范围的减弱或敲除策略。

在需要丙酰基-CoA或丙烯酰基-CoA的细胞内可用性(intracellularavailability)以进行丁二烯合成的一些实施方式中，可以将在宿主生物体中催化的丙酰基-CoA和乙酰基-CoA水解的酶减弱。

在需要丙酰基-CoA或丙烯酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将在宿主生物体中通过甲基-柠檬酸循环消耗丙酰基-CoA的酶减弱(Upton和Mckinney,Microbiology,2007,153,3973–3982)。

在需要丙酰基-CoA或丙烯酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将在宿主生物体中消耗丙酰基-CoA生成丙酮酸的酶减弱。

在需要丙酰基-CoA或丙烯酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将在宿主生物体中消耗丙酰基-CoA生成丙二酰基-CoA的酶减弱。

在经由L-苏氨酸作为中心代谢产物需要丙酰基-CoA或丙烯酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将反馈抗性苏氨酸脱氨酶基因工程改造进入宿主生物体中(Tseng等，Microbial Cell Factories,2010,9:96)。

在需要乙酰基-CoA和丙酰基-CoA/丙烯酰基-CoA缩合以进行丁二烯合成的一些实施方式中，可以将催化乙酰基-CoA和乙酰乙酰基-CoA缩合的β-酮硫解酶如AtoB或phaA的基因产物减弱。

在使用天然累积聚羟基烷酸酯的宿主的一些实施方式中，可以将在宿主菌株中的聚合物合酶酶减弱。

在需要乙酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，可以使用缺乏(例如具有减弱的活性水平)在乙酸合成途径中的一种或多种酶的宿主。例如，可以使用缺乏磷酸转乙酰基酶(由pta基因编码)的宿主(Shen等，Appl.Environ.Microbio.,2011,77(9),2905–2915)。

在要求乙酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将在乙酸合成途径中编码乙酸激酶的基因如ack减弱。

在需要乙酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将编码丙酮酸降解为乳酸的基因如ldhA减弱(Shen等，Appl.Environ.Microbio.,2011,77(9),2905–2915)。

在需要乙酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将编码磷酸烯醇丙酮酸降解为琥珀酸的基因如frdBC减弱(参见例如，Shen等，2011，同上)。

在需要乙酰基-CoA的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将编码乙酰基-CoA降解为乙醇的基因如adhE减弱(Shen等，2011，同上)。

在需要L-谷氨酸的细胞内可用性以进行丁二烯合成的一些实施方式中，将催化补充柠檬酸循环中间体的添补反应的酶扩增。

在使用MDD酶促形成丁二烯中的第二个乙烯基的一些实施方式中，硫酯酶II tesB的基因产物将(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-CoA水解为(R)-3-羟基戊-4-烯酸。

在一些实施方式中，在丁二烯的合成中要求NADPH辅因子过量的途径中，嘧啶核苷酸转氢酶基因如UdhA在宿主生物体中过表达(Brigham等，Advanced Biofuels and Bioproducts,2012，第39章，1065–1090)。

在一些实施方式中，在丁二烯的合成中要求NADPH辅因子过量的途径中，甘油醛-3P-脱氢酶基因如GapN在宿主生物体中过表达(Brigham等，2012，同上)。

在一些实施方式中，在丁二烯的合成中要求NADPH辅因子过量的途径中，苹果酸酶基因如maeA或maeB在宿主生物体中过表达(Brigham等，2012，同上)。

在一些实施方式中，在丁二烯的合成中要求NADPH辅因子过量的途径中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因如zwf在宿主生物体中过表达(Lim等，Journalof Bioscience and Bioengineering,2002,93(6),543–549)。

在一些实施方式中，在丁二烯的合成中要求NADPH辅因子过量的途径中，果糖1,6二磷酸酶基因如fbp在宿主生物体中过表达(Becker等，Journal ofBiotechnology,2007,132,99–109)。

在一些实施方式中，通过对细胞膜进行遗传工程化结构修饰增强或扩增丁二烯穿过所述细胞膜向细胞外介质的外流或者增加与丁二烯相关的任意转运子的活性。

在一些实施方式中，将在宿主生物体中将丁二烯降解为毒性中间体如1,2-环氧-3-丁烯和1,2:3,4-二环氧丁烷的加氧酶减弱(参见例如Sweeney等，Carcinogenesis,1997,18(4),611–625)。

在下述实施方式中将对本发明进行进一步的描述，其并不限制权利要求中所描述的本发明的范围。

实施例

实施例1

接受3-羟基戊-4烯酸作为底物的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的酶活性

将具有his标签的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、表皮葡萄球菌(Staphyloccocus epidermidis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)的MDD基因克隆，并在含有LB培养基的摇瓶培养物中在大肠杆菌中表达。

通过离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的沉淀物，然后将所述沉淀物重悬和裂解。通过离心和使用0.2μm滤器过滤将细胞碎片与上清液分离。使用Ni亲和层析从上清液中纯化MDD酶，浓缩并通过使用10kDa聚砜醚膜的超滤将其缓冲液交换进入50mM Tris缓冲液(pH＝7.5)、100mM NaCl和5％(v/v)甘油中。

在由50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、100mM NaCl、5％(v/v)甘油、10mMMgCl₂、15mM ATP和5mM天然底物甲羟戊酸二磷酸(来自Sigma Aldrich)组成的缓冲液中在30℃下确证天然酶的活性。通过分别将10μL每种纯化的MDD酶加入含有所述底物的测定缓冲液中启动酶活性测定反应。经由LC-MS确证了全部三种MDD酶均接受甲羟戊酸二磷酸作为底物。

在由50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、100mM NaCl、5％(v/v)甘油、10mMMgCl₂、15mM ATP和4mM非天然外消旋底物3-羟基戊-4-烯酸(纯度>95％，来自Epison Chimie)组成的缓冲液中在30℃下进行非天然酶活性测定。在2mL隔膜密封的小瓶中进行非天然活性测定，使得丁二烯在顶部空间(headspace)中累积。通过分别将10μL每种纯化的MDD酶变体加入含有所述底物的测定缓冲液中启动该反应。

对于使用3-羟基戊-4-烯酸作为底物的非天然酶活性测定而言，来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、表皮葡萄球菌(Staphyloccocus epidermidis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)的三种MDD酶具有相似的色谱图和光谱。[23]丁二烯标准品和测定样品的保留时间在2％以内。丁二烯标准品MS离子峰面积与样品MS离子峰面积的比率在20％以内。而且，离子峰面积高于GC/MS的定量限。

来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、表皮葡萄球菌(Staphyloccocusepidermidis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)的MDD酶接受3-羟基戊-4-烯酸作为底物合成丁二烯。

实施例2

增加甲羟戊酸二磷酸脱羧酶在接受3-羟基戊-4-烯酸作为底物中的活性的氨基酸残基

图13提供了来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、表皮葡萄球菌(Staphyloccocus epidermidis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)的MDD酶的氨基酸序列，其中在所述酶的催化裂隙中的保守性残基以粗体表示。

使用来自密度测定法的总蛋白浓度和纯度，经纯化的来自酿酒酵母的MDD的酶浓度为385μg/mL和经纯化的来自肺炎链球菌的MDD的酶浓度为88μg/mL。

考虑到作为非天然底物的3-羟基戊-4-烯酸的不完全转化，来自酿酒酵母的MDD的特异性转化为809[(m/z 54离子的峰面积)/(μg MDD)]和来自肺炎链球菌的MDD为3200[(m/z 54离子的峰面积)/(μg MDD)]。因此，来自肺炎链球菌的MDD的特异性转化约为来自酿酒酵母的MDD的特异性转化的四倍。来自表皮葡萄球菌的MDD的特异性转化介于来自肺炎链球菌和酿酒酵母的MDD的特异性转化之间(未计算)。

在酿酒酵母中R158、表皮葡萄球菌中R144和肺炎链球菌中R144处的催化性精氨酸残基的区域中的氨基酸残基显示出在5个氨基酸残基以内增加的丝氨酸密度的趋势。在酿酒酵母中的R158在5个氨基酸残基以内具有3个丝氨酸残基(残基153、155和159)，在表皮葡萄球菌中的R144在5个氨基酸残基以内具有4个丝氨酸残基(残基139、141、143和145)以及肺炎链球菌R144在5个氨基酸残基以内具有5个丝氨酸残基(残基139、141、142、143和145)。参见例如图13。

在接受3-羟基戊-4-烯酸作为非天然底物中MDD的活性随着催化裂隙的催化性精氨酸残基区域中的丝氨酸密度的增加而增加。

实施例3

接受反式-2-丁烯基焦磷酸作为底物的异戊二烯合酶的酶活性

将具有his标签的来自银白杨(Populus alba)的异戊二烯合酶(ISPS)基因克隆并含有LB培养基的摇瓶培养物中在大肠杆菌中表达。

通过离心收获来自每种诱导的摇瓶培养物的沉淀物，然后将所述沉淀物重悬和裂解。通过离心和使用0.2μm滤器过滤将细胞碎片与上清液分离。使用Ni亲和层析从上清液中纯化ISPS酶，浓缩并通过使用10kDa聚砜醚膜将其缓冲液交换进入50mM Tris缓冲液(pH＝7.5)、100mM NaCl和5％(v/v)甘油中。

在由50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、100mM NaCl、5％(v/v)甘油、20mMMgCl₂和5mM天然底物，即来自Sigma Aldrich的二甲基烯丙基二磷酸组成的缓冲液中在30℃下确证天然酶的活性。在2mL隔膜密封的小瓶中进行天然活性测定，以使得异戊二烯在顶部空间中累积。通过分别将10μL每种纯化的ISPS酶加入含有所述底物的测定缓冲液中启动酶活性测定反应。经由GC-MS确证了来自银白杨的ISPS接受二甲基烯丙基二磷酸作为底物。

在由50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、100mM NaCl、5％(v/v)甘油、20mMMgCl₂和5mM非天然底物，即来自DALTON Pharma Services的反式-2-丁烯基焦磷酸(纯度>90％)组成的缓冲液中在30℃下进行非天然酶活性测定。在2mL隔膜密封的小瓶中进行非天然活性测定，以使得丁二烯在顶部空间中累积。通过将10μL纯化的ISPS酶加入含有所述底物的测定缓冲液中启动该酶活性反应。

丁二烯标准品和测定样品的保留时间在2％以内。丁二烯标准品MS离子峰面积与样品MS离子峰面积的比率均在20％以内。而且，离子峰面积高于GC/MS的定量限。

来自银白杨(Populus alba)的ISPS酶接受反式-2-丁烯基焦磷酸作为底物合成丁二烯。

实施例4

使用3-丁烯-2-醇作为底物的芳樟醇脱水酶的酶活性

将具有组氨酸标签的来自Castellaniella defragrans的芳樟醇脱水酶(EC4.2.1.127)克隆进入pARZ4载体并转化进入大肠杆菌BL21。将所得到的菌株在含有LB培养基和卡那霉素选择压力的摇瓶培养中培养和使用1[M]IPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)诱导。

收集来自每个诱导的摇瓶培养物的细胞并将其离心成团。将细胞沉淀物重悬并将细胞裂解。通过离心和使用0.2μm滤器过滤将细胞碎片与上清液分离。使用Ni亲和层析从已过滤的上清液中纯化所述酶，浓缩并使用Vivaspin15R离心浓缩机和Hi-trap脱盐柱将其缓冲液交换进入80mM Tris缓冲液(pH＝9)中。

在含有11mM 3-丁烯-2-醇的缓冲液中在25℃下进行非天然的酶活性测定。在2mL隔膜密封的小瓶中进行活性测定，以使得丁二烯在顶部空间中累积。通过将1mL经纯化的酶加入含有所述底物的测定缓冲液中启动该反应。

在顶部空间中取样以利用GC-MS(气相色谱-质谱)对丁二烯进行分析。丁二烯标准品和测定样品的保留时间在2％以内。丁二烯标准品MS离子峰面积与样品MS离子峰面积的比率均在20％以内。而且，离子峰面积高于GC/MS的定量限。

这些发现表明芳樟醇脱水酶(EC 4.2.1.127)接受3-丁烯-2-醇作为底物合成丁二烯。

其他实施方式

应当理解的是，尽管已结合其详细的说明书对本发明进行了描述，但是前述说明书旨在解释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围所定义。其他方面、优势和修订均在下述权利要求的范围内。

Claims

1.一种生物合成丁二烯的方法，所述方法包括在丁二烯合成底物中形成两个末端乙烯基基团。

2.根据权利要求1所述的方法，其中第一个乙烯基基团在所述丁二烯合成底物中酶促形成以产生选自由以下组成的组的化合物：2-氧代戊-4-烯酸、丙烯基-CoA、(R)3-羟基戊-4-烯酸、2，4-戊二烯酰基-[acp]、2，4-戊二烯酰基-CoA、巴豆酰基-CoA和3-丁烯-2-醇。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中通过(i)使用分类为EC 4.1.1.77的4-草酰巴豆酸脱羧酶在4-草酰巴豆酸中，(ii)使用分类为EC 3.7.1.9的2-羟基粘康酸半醛水解酶在羟基粘康酸半醛中或(iii)使用分类为EC 3.7.1.14的2-羟基-6-氧代壬-2，4-二烯二酯水解酶在2-羟基-6-氧代壬-2，4-二烯-1，9-二酯中形成第一个乙烯基基团来生产2-氧代戊-4-烯酸。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.2.1.32的2氨基粘康酸半醛脱氢酶将2-羟基粘康酸半醛转化为2-羟基粘康酸，使用分类为EC 5.3.2.6的2-羟基粘康酸互变异构酶将2-羟基粘康酸转化为4-草酰巴豆酸和使用分类为EC 4.1.1.77的4-草酰巴豆酸脱羧酶将4-草酰巴豆酸转化为2-氧代戊-4-烯酸来生产2-氧代戊-4-烯酸。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中通过使用分类为EC1.13.11.2的儿茶酚2，3-双加氧酶将儿茶酚转化为2-羟基粘康酸半醛来产生2-羟基粘康酸半醛。

6.根据权利要求5所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.14.12.1的邻氨基苯甲酸1，2-双加氧酶转化邻氨基苯甲酸或使用分类为EC 4.1.1.63的原儿茶酸脱羧酶转化原儿茶酸来生产儿茶酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.1.3.27的邻氨基苯甲酸合酶转化分支酸来生产邻氨基苯甲酸。

8.根据权利要求5所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1.118的3-脱氢莽草酸脱水酶转化3-脱氢莽草酸来产生原儿茶酸。

9.根据权利要求3或4所述的方法，其中通过使用5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱羧酶转化5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛来产生2-羟基粘康酸半醛。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱羧酶由praH编码。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其中通过使用原儿茶酸2，3-双加氧酶转化原儿茶酸来生产5-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述原儿茶酸2，3-双加氧酶由praA编码。

13.根据权利要求3所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.13.11.16的3-羧乙基儿茶酚2，3-双加氧酶转化2，3-二羟基苯基丙酸来生产2-羟基-6-氧代壬-2，4-二烯-1，9-二酯。

14.根据权利要求13所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.3.1.87的3-(顺式-5，6-二羟基环己-1，3-二烯-1-基)丙酸脱氢酶转化顺式-3-(羧基-乙基)-3，5-环-己二烯-1，2-二醇来产生2，3-二羟基苯基丙酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.14.12.19的3-苯基丙酸双加氧酶转化3-苯基-丙酸来生产顺式-3-(羧基-乙基)-3，5-环-己二烯-1，2-二醇。

16.根据权利要求15所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.3.1.31的2-烯酸还原酶转化E-肉桂酸来生产3-苯基-丙酸。

17.根据权利要求16所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.3.1.24的苯丙氨酸解氨酶转化L-苯丙氨酸来生产E-肉桂酸。

18.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述丁二烯合成底物是丙酰基-CoA。

19.根据权利要求2或权利要求18所述的方法，其中丙烯酰基-CoA是通过(i)使用分类为EC 1.3.8.1的丁酰基-CoA脱氢酶或分类为EC 1.3.8.7的中链酰基-CoA脱氢酶在丙烯酰基-CoA中，(ii)使用分类为EC 4.2.1.54的乳酰基-CoA脱氢酶在乳酰基-CoA中或(iii)使用分类为EC 4.2.1.116的3-羟基丙酰基-CoA脱氢酶在3-羟基丙酰基-CoA中形成第一个乙烯基基团生产的化合物。

20.根据权利要求18所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.1.3.1的甲基丙二酰基-CoA羧基转移酶或分类为EC 4.1.1.41的甲基丙二酰基-CoA脱羧酶转化(2S)-甲基丙二酰基-CoA来生产丙酰基-CoA。

21.根据权利要求20所述的方法，其中通过使用分类为EC 5.1.99.1的甲基丙二酰基-CoA表异构酶转化(2R)-甲基丙二酰基-CoA来生产(2S)-甲基丙二酰基-CoA。

22.根据权利要求21所述的方法，其中通过使用分类为EC 5.4.99.2的甲基丙二酰基-CoA变位酶来生产(2R)-甲基丙二酰基-CoA。

23.根据权利要求18所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.3.1.-的2-酮丁酸甲酸裂解酶转化2-氧代-丁酸来生产丙酰基-CoA。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述2-酮丁酸甲酸裂解酶由tdcE编码。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.3.1.19的苏氨酸解氨酶转化L-苏氨酸来生产2-氧代-丁酸。

26.根据权利要求18所述的方法，其中通过使用丙醛脱氢酶转化丙醇生产丙酰基-CoA。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述丙醛脱氢酶由pduP编码。

28.根据权利要求26所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1.28的丙二醇脱水酶转化1，2-丙二醇来生产丙醇。

29.根据权利要求18所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.3.1.-的转移酶转化乙酰丙酰基-CoA由乙酰丙酸生产丙酰基-CoA。

30.根据权利要求29所述的方法，其中通过使用分类为EC 6.2.1.-的酰基-CoA合成酶或连接酶转化乙酰丙酸来生产乙酰丙酰基-CoA。

31.根据权利要求19所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.8.3.1的丙酸CoA转移酶转化L-乳酸来生产乳酰基-CoA。

32.根据权利要求31所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.27的L-乳酸脱氢酶转化丙酮酸来生产L-乳酸。

33.根据权利要求19所述的方法，其中通过使用分类为EC 3.1.2.4的3-羟基异丁酰基-CoA水解酶转化3-羟基丙酸来生产3-羟基丙酰基-CoA。

34.根据权利要求19所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.59的3-羟基丙酸脱氢酶转化丙二酸半醛来生产3-羟基丙酰基-CoA。

35.根据权利要求34所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.2.1.75的丙二酸单酰基-CoA还原酶转化丙二酸单酰基-CoA来生产丙二酸半醛。

36.根据权利要求2或权利要求19所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.3.8.1的丁酰基-CoA脱氢酶或分类为EC 1.3.8.7的中链酰基-CoA脱氢酶转化丙烯酰基-CoA来生产丙酰基-CoA。

37.根据权利要求2所述的方法，其中通过使用去饱和酶/单加氧酶或细胞色素P450在(R)3-羟基戊酸中形成第一个乙烯基来生产(R)3-羟基戊-4-烯酸丙烯酰基-CoA。

38.根据权利要求37所述的方法，其中通过使用分类为EC 3.1.2.-的硫酯酶转化(R)3-羟基戊酰基-CoA来生产(R)3-羟基-戊酸。

39.根据权利要求38所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.36的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊酰基-CoA。

40.根据权利要求39所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.3.1.16的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化丙酰基-CoA来生产3-氧代戊酰基-CoA。

41.根据权利要求2所述的方法，其中通过使用酰基-[acp]脱氢酶在戊-2-烯酰基-acp中形成第一个乙烯基基团来生产2，4-戊二烯酰基-[acp]。

42.根据权利要求2所述的方法，其中通过在(i)使用分类为EC 4.2.1.-的5-羟基戊酰基-CoA脱水酶在5-羟基戊酰基-CoA中或(ii)使用分类为EC1.3.1.34的2，4-二烯酰基辅酶A还原酶在戊-3-烯酰基-CoA中形成第一个乙烯基来生产2，4-戊二烯酰基-CoA。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述5-羟基戊酰基-CoA脱水酶来自绿色梭菌(Clostridium viride)。

44.根据权利要求2所述的方法，其中通过在(i)使用分类为EC4.1.1.70的戊烯二酰基-CoA脱羧酶在戊烯二酰基-CoA中，(ii)使用分类为EC 4.2.1.120的4-羟基丁酰基-CoA脱水酶和分类为EC 5.3.3.3的乙烯基乙酰基-CoA异构酶在4-羟基丁基-CoA中或(iii)使用分类为EC 4.2.1.119的烯酰基-CoA水合酶在(R)3-羟基丁酰基-CoA中形成第一个乙烯基基团来生产巴豆酰基-CoA。

45.根据权利要求2所述的方法，其中通过使用去饱和酶或单加氧酶在2-丁醇中形成第一个乙烯基基团来生产3-丁烯-2-醇。

46.根据权利要求1所述的方法，其中通过甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MDD)在(R)3-羟基戊-4-烯酸中酶促形成第二个乙烯基基团。

47.根据权利要求1所述的方法，其中通过异戊二烯合酶(ISPS)在2-丁烯-1-醇二磷酸或3-丁烯-2-醇二磷酸中酶促形成所述第二个乙烯基。

48.根据权利要求1所述的方法，其中通过酶分类EC 4.2.1.-中的脱水酶在3-丁烯-2-醇或2-丁烯-1-醇中酶促形成第二个乙烯基。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述脱水酶是芳樟醇脱水酶(linalool dehydratase)(EC 4.2.1.127)、奇维酮水合酶(kievitone hydrase)(EC4.2.1.95)、油酸水合酶(oleate hydratase)(EC 4.2.1.53)或类胡萝卜素1，2-水合酶(carotenoid 1，2-hydratase)(EC 4.2.1.131)。

50.根据权利要求41所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1.59的3-羟基酰基-[acp]脱水酶转化(R)3-羟基戊酰基-[acp]来生产戊-2-烯酰基-[acp]。

51.根据权利要求50所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.100的3-氧代酰基-[acp]还原酶转化3-氧代戊酰基-[acp]来生产(R)3-羟基戊酰基-[acp]。

52.根据权利要求18和权利要求51所述的方法，其中使用分类为EC2.3.1.41的β-酮酰基-[acp]合酶I和酰基转移酶如tcsA转化戊酰基-CoA来生产3-氧代戊酰基-[acp]。

53.根据权利要求41所述的方法，其中使用酰基转移酶转化戊-2-烯酰基-CoA来生产戊-2-烯酰基-[acp]。

54.根据权利要求53所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1.119的烯酰基-CoA水合酶转化(R)3-羟基戊酰基-CoA来生产戊-2-烯酰基-CoA。

55.根据权利要求54所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.36的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊酰基-CoA。

56.根据权利要求18和权利要求55所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.3.1.16的乙酰基-CoA C-酰基转移酶转化丙酰基-CoA来生产3-氧代戊酰基-CoA。

57.根据权利要求42和权利要求54所述的方法，其中通过使用分类为EC 5.3.3.8的异构酶转化戊-2-烯酰基-CoA来生产戊-3-烯酰基-CoA。

58.根据权利要求42所述的方法，其中(i)通过使用分类为EC 2.8.3.14的5-羟基戊酰基CoA-转移酶转化5-羟基戊酸或(ii)使用细胞色素P450转化戊酰基-CoA来生产5-羟基戊酰基-CoA。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞色素P450是CYP153A6的基因产物。

60.根据权利要求58所述的方法，其中使用5-羟基戊酸脱氢酶转化5-氧代戊酸来生产5-羟基戊酸。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述5-羟基戊酸脱氢酶是cpnD的基因产物或来自绿色梭菌的脱氢酶。

62.根据权利要求60所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.6.1.48的5-氨基戊酸转氨酶转化5-氨基戊酸来生产5-氧代戊酸。

63.根据权利要求62所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.21.4.1的D-脯氨酸还原酶转化D-脯氨酸来生产5-氨基戊酸。

64.根据权利要求63所述的方法，其中通过使用分类为EC 5.1.1.4的脯氨酸消旋酶转化L-脯氨酸来生产D-脯氨酸。

65.根据权利要求64所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.5.1.2的吡咯啉-5-羧酸还原酶转化(S)-1-吡咯啉-5-羧酸来生产L-脯氨酸。

66.根据权利要求65所述的方法，其中通过L-谷氨酸5-半醛的自发转化生产(S)-1-吡咯啉-5-羧基。

67.根据权利要求66所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.2.1.41的谷氨酸-5-半醛脱氢酶转化L-谷氨酰基-5-磷酸来生产L-谷氨酸5-半醛。

68.根据权利要求67所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.7.2.11的谷氨酸5-激酶转化L-谷氨酸来生产L-谷氨酰基-5-磷酸。

69.根据权利要求54和权利要求58所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.3.1.38的反式-2-烯酰基-CoA还原酶转化戊-2-烯酰基-CoA来生产戊酰基-CoA。

70.根据权利要求44所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1.-的脱水酶转化2-羟基戊二酰基-CoA来生产戊烯二酰基-CoA。

71.根据权利要求70所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.8.3.12的戊烯二酸CoA-转移酶转化2-羟基戊二酸来生产2-羟基戊二酰基-CoA。

72.根据权利要求71所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.99.2的2-羟基戊二酸脱氢酶转化2-氧代戊二酸来生产2-羟基戊二酸。

73.根据权利要求44所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.36的3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶转化乙酰乙酰基-CoA来生产3-羟基丁酰基-CoA。

74.根据权利要求73所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.3.1.9的乙酰基-CoA C乙酰基转移酶转化乙酰基-CoA来生产乙酰乙酰基-CoA。

75.根据权利要求44所述的方法，其中通过使用CoA-转移酶转化4-羟基丁酸来生产4-羟基丁酰基-CoA。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述CoA-转移酶是Ck-cat2的基因产物。

77.根据权利要求75所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.61的4-羟基丁酸脱氢酶转化琥珀酸半醛来生产4-羟基丁酸。

78.根据权利要求77所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.2.1.76的琥珀酸-半醛脱氢酶转化琥珀酰基-CoA来生产琥珀酸半醛。

79.根据权利要求45所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.B4的(R)-特异性仲醇脱氢酶转化丁酮来生产2-丁醇。

80.根据权利要求79所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1.28的丙二醇脱水酶转化2，3丁二醇来生产丁酮。

81.根据权利要求80所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.4的(R，R)-丁二醇脱氢酶转化(R)-乙偶姻来生产2，3丁二醇。

82.根据权利要求81所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.1.1.5的乙酰乳酸脱羧酶转化2-乙酰乳酸来生产(R)-乙偶姻。

83.根据权利要求82所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.2.1.6的乙酰乳酸合酶转化丙酮酸来生产2-乙酰乳酸。

84.根据权利要求46所述的方法，其中通过使用分类为EC 3.1.2.-的硫酯酶转化3-羟基戊-4-烯酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊-4-烯酸。

85.根据权利要求84所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1的烯酰基-CoA脱水酶转化2，4-戊二烯酰基-CoA来生产3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。

86.根据权利要求85所述的方法，其中使用2-羟基异己酰基-CoA脱水酶转化2-羟基戊-4-烯酰基-CoA来生产2，4-戊二烯酰基-CoA。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述2-羟基异己酰基-CoA脱水酶是起始物HadI和HadBC的基因产物。

88.根据权利要求86所述的方法，其中通过使用CoA-转移酶转化2-羟基戊-4-烯酸来生产2-羟基戊-4-烯酰基-CoA。

89.根据权利要求88所述的方法，其中所述CoA-转移酶是GctAB的基因产物。

90.根据权利要求88所述的方法，其中通过使用(R)-2-羟基异己酸脱氢酶转化2-氧代戊-4-烯酸来生产2-羟基戊-4-烯酸。

91.根据权利要求90所述的方法，其中所述(R)-2-羟基异己酸脱氢酶是来自艰难梭菌(Clostridium difficile)的LdhA的基因产物。

92.根据权利要求46所述的方法，其中通过使用分类为EC 3.1.2.-的硫酯酶转化(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA来生产(R)-羟基戊-4-烯酸。

93.根据权利要求92所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.36的乙酰乙酰基-CoA还原酶转化3-氧代戊-4烯酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。

94.根据权利要求93所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.3.1.16的3-酮硫解酶转化丙烯酰基-CoA来生产3-氧代戊-4-烯酰基-CoA。

95.根据权利要求46所述的方法，其中通过使用分类为EC 3.1.2.-的硫酯酶转化(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA来生产(R)-羟基戊-4-烯酸。

96.根据权利要求95所述的方法，其中通过使用(R)-3-羟基酰基-ACP：CoA转酰基酶转化(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]来生产(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述(R)-3-羟基酰基-ACP：CoA转酰基酶是phaG的基因产物。

98.根据权利要求96所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1.59的3-羟基酰基-[酰基-运载体-蛋白]脱水酶转化2，4戊二烯酰基-[acp]来生产(R)-3-羟基戊-4-烯酰基-[acp]。

99.根据权利要求95所述的方法，其中通过使用分类为EC 4.2.1.119的烯酰基-CoA脱水酶2转化2，4-戊二烯酰基-CoA来生产(R)3-羟基戊-4-烯酰基-CoA。

100.根据权利要求47所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.7.4.2的磷酸甲羟戊酸激酶或使用分类为EC 2.7.6.-的二磷酸激酶转化2-丁烯-1-醇磷酸来生产2-丁烯-1-醇二磷酸。

101.根据权利要求100所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.7.1.36的甲羟戊酸激酶转化2-丁烯-1-醇来生产2-丁烯-1-醇磷酸。

102.根据权利要求101所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.1.1.54的烯丙醇脱氢酶转化2-丁烯-1-醛生产2-丁烯-1-醇。

103.根据权利要求102所述的方法，其中通过使用分类为EC 1.2.1.48的长链乙醛脱氢酶转化巴豆酸来生产2-丁烯-1醛。

104.根据权利要求103所述的方法，其中通过使用分类为EC 6.2.1.5的琥珀酸-CoA连接酶转化巴豆酰基-CoA来生产巴豆酸。

105.根据权利要求100和102所述的方法，其中通过使用分类为EC2.7.6.-的二磷酸激酶转化2-丁烯-1-醇来生产2-丁烯-1-醇二磷酸。

106.根据权利要求100或105所述的方法，其中所述二磷酸激酶是分类为EC 2.7.6.2的硫胺素二磷酸激酶。

107.根据权利要求47所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.7.6.-的二磷酸激酶转化3-丁烯-2-醇或分类为EC 2.7.4.2的磷酸甲羟戊酸激酶转化3-丁烯-2-醇来生产3-丁烯-2-醇二磷酸。

108.根据权利要求107所述的方法，其中通过使用分类为EC 2.7.1.36的甲羟戊酸激酶转化3-丁烯-2-醇来生产3-丁烯-2-醇磷酸。

109.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中使用分离的酶进行所述方法。

110.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中使用包含所述酶的细胞裂解物进行所述方法。

111.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中在重组宿主中进行所述方法。

112.根据权利要求111所述的方法，其中所述重组宿主是厌氧、微需氧或需氧培养的。

113.根据权利要求112所述的方法，其中将所述重组宿主细胞保持在陶瓷中空纤维膜中以便在发酵过程中保持较高的细胞密度。

114.根据权利要求112所述的方法，其中供给所述发酵的主要碳源来源于生物或非生物原料。

115.根据权利要求114所述的方法，其中所述生物原料是或者来源于单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素如乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯如甘油和脂肪酸、农业废弃物或城市垃圾。

116.根据权利要求114所述的方法，其中所述非生物原料是或者来源于天然气、合成气、C0₂/H₂、甲醇、乙醇、来自环己烷氧化工艺的非挥发性残渣(NVR)或碱洗废物流。

117.根据权利要求46所述的方法，其中分类为EC 4.1.1.33的所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的氨基酸序列包含在催化裂隙(catalytic cleft)的催化性精氨酸残基任一侧的五个残基内的最小数目四个丝氨酸残基。

118.根据权利要求46所述的方法，其中所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶来源于链球菌属(Streptococcus)或葡萄球菌属(Staphylococcus)。

119.根据权利要求111所述的方法，其中所述宿主微生物是原核生物或真核生物。

120.根据权利要求119所述的方法，其中所述宿主微生物是原核生物，所述原核生物来自埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；来自梭属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；来自棒状杆菌属(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或Pseudomonas oleavorans；来自代尔夫特菌属(Delftia)如代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)；来自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)；来自乳杆菌属(Lactobacillus)如德氏乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)或来自乳球菌属(Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。

121.根据权利要求119所述的方法，其中所述宿主微生物是真核生物，所述真核生物来自曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)；来自酵母菌属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；来自毕赤酵母属(Pichia)如毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自耶氏酵母属(Yarrowia)如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；来自伊萨酵母属(Issatchenkia)如Issathenkia orientalis；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)；来自Arxula如Arxula adenoinivorans或来自克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

122.根据权利要求119所述的方法，其中催化丙酰基-CoA和乙酰基-CoA水解的酶在所述宿主生物体中被减弱。

123.根据权利要求119所述的方法，其中通过甲基柠檬酸循环消耗丙酰基-CoA的酶在所述宿主生物体中被减弱。

124.根据权利要求119所述的方法，其中消耗丙酰基-CoA以形成丙酮酸的酶在所述宿主生物体中被减弱。

125.根据权利要求119所述的方法，其中消耗丙酰基-CoA形成丙二酸单酰基-CoA的酶在所述宿主生物体中被衰减。

126.根据权利要求119所述的方法，其中将耐反馈苏氨酸脱氨酶基因工程改造进入所述宿主生物体中。

127.根据权利要求119所述的方法，其中催化乙酰基-CoA缩合为乙酰乙酰基-CoA的β-酮硫解酶如AtoB或phaA的基因产物被减弱。

128.根据权利要求119所述的方法，其中在天然累积聚羟基脂肪酸酯的宿主菌株中的酶聚合物合酶被减弱。

129.根据权利要求119所述的方法，其中编码磷酸转乙酰基酶的基因如pta被减弱。

130.根据权利要求119所述的方法，其中编码降解丙酸的乙酸激酶的基因如ack被减弱。

131.根据权利要求119所述的方法，其中编码将丙酮酸降解为乳酸的基因被减弱。

132.根据权利要求119所述的方法，其中编码将磷酸烯醇式丙酮酸降解为琥珀酸的基因如frdBC被减弱。

133.根据权利要求119所述的方法，其中编码将乙酰基-CoA将解为乙醇的基因如adhE被减弱。

134.根据权利要求119所述的方法，其中将催化补充柠檬酸循环中间体的添补反应的酶扩增。

135.根据权利要求119所述的方法，其中将吡啶核苷酸转氢酶(puridinenucleotide transhydrogenase)基因如UdhA在所述宿主生物体中过表达。

136.根据权利要求119所述的方法，其中将甘油醛-3P-脱氢酶基因如GapN在所述宿主生物体中过表达。

137.根据权利要求119所述的方法，其中苹果酸酶基因如maeA或maeB在所述宿主生物体中过表达。

138.根据权利要求119所述的方法，其中将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因如zwf在所述宿主生物体中过表达。

139.根据权利要求119所述的方法，其中将果糖1，6二磷酸酶基因如fbp在所述宿主生物体中过表达。

140.根据权利要求119所述的方法，其中通过对细胞膜进行遗传工程化结构修饰增强或放大丁二烯穿过所述细胞膜向细胞外介质的外流。

141.根据权利要求119所述的方法，其中通过基因工程改造以增加任意与丁二烯相关的转运活性来增强或放大丁二烯穿过所述细胞膜向细胞外介质的外流。

根据权利要求119所述的方法，其中将丁二烯降解为毒性中间体如1，2-环氧-3-丁烯和1，2：3，4-二环氧丁烷的加氧酶在所述宿主生物体中被减弱。

142.根据权利要求38、84、92或95所述的方法，其中所述硫酯酶是tesB的基因产物。

143.根据权利要求39、55或93所述的方法，其中所述乙酰乙酰基-CoA还原酶是phaB的基因产物。

144.根据权利要求40或56所述的方法，其中所述乙酰基-CoA C酰基转移酶是BktB的基因产物。

145.根据权利要求44或54所述的方法，其中所述烯酰基-CoA水合酶是phaJ的基因产物。

146.根据权利要求37或45所述的方法，其中所述去饱和酶是MdpJ的基因产物。

147.根据权利要求37或45所述的方法，其中所述细胞色素P450是CYP4家族的基因产物。

148.根据权利要求52所述的方法，其中所述β-酮酰基-[acp]合酶I是tcsB的基因产物。

149.根据权利要求52所述的方法，其中所述酰基-转移酶是tcsA的基因产物。

150.一种将丁烯醇转化为丁二烯的方法，所述方法包括将3-丁烯-2-醇与芳樟醇脱水酶接触，其中生产出1，3-丁二烯。

151.根据权利要求150所述的方法，其中所述芳樟醇脱水酶的分类为EC 4.2.1.127。