CN106661597A - 用于产生戊二酸和戊二酸甲酯的方法 - Google Patents

用于产生戊二酸和戊二酸甲酯的方法 Download PDF

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Abstract

本文件描述了用于产生2,4‑戊二烯酰基‑CoA的生物化学途径，其通过在C5主链底物，诸如戊二酰基‑CoA，戊二酰基‑[acp]或戊二酸甲酯中形成一个或两个由羧基或羟基基团构成的末端官能团进行。可以将2,4‑戊二烯酰基‑CoA酶促转化为1,3‑丁二烯。

Description

用于产生戊二酸和戊二酸甲酯的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年6月16日提交的美国临时申请号62/012,722和于2014年6月16日提交的美国临时申请号62/012,586的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及提高具有羧酸还原酶活性的多肽对二羧酸的活性的方法，其通过使用具有丙二酰基-CoA甲基转移酶活性的多肽将二羧酸酶促转化成甲酯进行。本发明还涉及用于生物合成2,4-戊二烯酰基-CoA(例如作为生物合成1,3-丁二烯的前体)的方法，且更具体地涉及使用一种或多种分离的酶，诸如丙二酰基-CoA O-甲基转移酶,甲酯酯酶、羧酸还原酶、或5-羟基戊酰基-CoA脱水酶中的一种或多种，或使用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞合成2,4-戊二烯酰基-CoA。
发明背景
1,3-丁二烯(以下为丁二烯)是用于生产合成橡胶的重要单体，包括苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)，聚丁二烯(PB)，苯乙烯-丁二烯乳胶(SBL)，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS)，腈橡胶(nitrile rubber)和己二腈，其用于制造尼龙-66(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。
丁二烯通常从蒸汽裂化过程(steam cracking process)作为副产物产生，蒸馏成粗丁二烯流，并通过萃取蒸馏纯化(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。
已经通过正丁烷和正丁烯的脱氢(Houdry法)；和正丁烯的氧化脱氢(Oxo-D或O-X-D法)在其它方法中制备了目的丁二烯(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。
在工业上，95％的全球丁二烯生产通过使用基于石油化工的原料诸如石脑油的蒸汽裂化过程进行。考虑到生产的高成本和低工艺产率(White,Chemico-BiologicalInteractions,2007,166,10-14)，目的丁二烯的生产是不显著的。
鉴于依赖于石油化工原料，以及对于目的丁二烯，依赖于能量密集的催化步骤；生物技术通过生物催化提供了一种替代方法。生物催化是使用生物催化剂，如酶，来进行有机化合物的生物化学转化。
因此，在这种背景下，显然需要用于生产中间体的可持续方法。其中所述方法是基于生物催化剂的(Jang等人，Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。
发明概述
本公开至少部分基于开发用于生物合成2,4-戊二烯酰基-CoA或其前体的酶系统和重组宿主，其可用于制备例如1,3-丁二烯和1,3-丁二烯的聚合物或共聚物。具体地，如本文所述，2,4-戊二烯酰基-CoA可以由可再生原料生物合成产生，而不需要任何化学催化剂，如金属氧化物。例如，在本文所述的途径中，2,4-戊二烯酰基-CoA可以通过各种甲基酯屏蔽途径(methyl-ester shielded route)由丙二酰基-CoA或丙二酰基-[acp]制备。此类甲基酯屏蔽途径包括使用甲酯酯酶，如庚二酰基-[acp]甲酯酯酶(pimelyl-[acp]methyl esteresterase)或酯酶水解戊二酰基-[acp]甲酯、戊二酰基-CoA甲酯、戊二酸甲酯、戊二酸半醛甲酯、或5-羟基戊酸甲酯的甲酯，并使用5-羟基戊酰基-CoA脱水酶引入1,3-丁二烯的第一末端乙烯基。例如，1,3-丁二烯可以由源自2,4-戊二烯基-CoA的前体制备，如图7概述。
在一些实施方案中，可以经由转化成戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯，接着(i)分别将戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯脱酯化成戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA，或者(ii)将戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯水解成戊二酸甲酯从丙二酰基-[acp]或丙二酰基-CoA形成用于转化成1,3-丁二烯的C5脂肪族主链。参见图1-3。
在一些实施方案中，产生C5脂肪族主链的途径中的酶有目的地含有不可逆的酶促步骤。
在一些实施方案中，可以使用酯酶、硫酯酶、可逆性CoA连接酶、CoA转移酶、醛脱氢酶、7-氧庚酸脱氢酶、6-氧己酸脱氢酶或5-氧戊酸脱氢酶酶促形成末端羧基基团。参见图4。
在一些实施方案中，可以使用醇脱氢酶，4-羟基丁酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶和6-羟基己酸脱氢酶进行酶促形成末端羟基基团。参见图5。
在一些实施方案中，可以使用5-羟基戊酰基-CoA脱水酶来酶促形成末端乙烯基。参见图6。
在一个方面，本文件特征在于在重组宿主中生物合成戊二酸甲酯的方法。该方法包括在宿主中使用至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽和至少一种具有硫酯酶活性的多肽将丙二酰基-[acp]和丙二酰基-CoA中的至少一种酶促转化成戊二酸甲酯。
在一些实施方案中，使用至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-[acp]酶促转化成丙二酰基-[acp]甲酯。可以使用至少一种具有选自下组活性的多肽将丙二酰基-[acp]甲酯酶促转化成戊二酰基-[acp]甲酯：合酶活性、脱氢酶活性、脱水酶活性、和还原酶活性。可以使用至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化成戊二酸甲酯。
在一些实施方案中，使用至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-CoA酶促转化成丙二酰基-CoA甲酯。可以使用至少一种具有选自下组活性的多肽将丙二酰基-CoA甲酯酶促转化成戊二酰基-CoA甲酯：合酶活性、β-酮硫解酶活性、脱氢酶活性、水合酶活性、和还原酶活性。可以使用至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-CoA甲酯酶促转化成戊二酸甲酯。
具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有还原酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:19或20中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在宿主中使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化成戊二酸半醛甲酯。具有羧酸还原酶活性的多肽可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺(phosphopantetheine)转移酶增强剂活性的多肽组合使用。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使用至少一种具有选自下组活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化成5-氧戊酸：羧酸还原酶活性和酯酶活性。具有羧酸还原酶活性的多肽可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使用至少一种具有酯酶活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化成5-羟基戊酸。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用至少一种具有脱氢酶活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化成5-羟基戊酸。
具有酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使用至少一种具有酯酶活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化成戊二酸。方法可以进一步包括使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽和至少一种具有EC 1.1.1.-下分类的脱氢酶活性的多肽将戊二酸酶促转化成5-羟基戊酸。具有羧酸还原酶活性的多肽可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用。
具有羧酸还原酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:2-7中任一项中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有硫酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:17、18、22、和23中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使用至少一种具有选自下组活性的多肽将5-羟基戊酸酶促转化成2,4-戊二烯酰基-CoA：CoA-转移酶活性、合酶活性、和脱水酶活性。具有CoA-转移酶活性或合酶活性的多肽和具有脱水酶活性的多肽可以将5-羟基戊酸酶促转化成2,4-戊二烯酰基-CoA。方法可以进一步包括使用至少一种具有选自下组活性的多肽2,4-戊二烯酰基-CoA酶促转化成1,3丁二烯：水合酶活性、硫酯酶活性、脱羧酶活性、脱氢酶活性、CoA-转移酶活性、和脱水酶活性。
具有硫酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:14-15中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在另一个方面中，本文件特征在于制备戊二酸的方法。方法包括(i)使用具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化成戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA甲酯成戊二酰基-CoA，并且(ii)使用至少一种具有硫酯酶活性、可逆的CoA-连接酶活性、CoA-转移酶活性、酰化脱氢酶活性、醛脱氢酶活性、戊二酸半醛脱氢酶活性或琥珀酸-半醛脱氢酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化成戊二酸。
具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在一些实施方案中，使用具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化成戊二酸。在一些实施方案中，使用具有可逆的CoA-连接酶活性或CoA-转移酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化成戊二酸。在一些实施方案中，使用具有酰化脱氢酶活性、醛脱氢酶活性、戊二酸半醛脱氢酶活性、或琥珀酸-半醛脱氢酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化成戊二酸。
在另一个方面中，本文件特征在于重组宿主细胞。重组宿主细胞包括至少一种外源核酸，所述外源核酸编码具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽和具有硫酯酶活性的多肽，所述宿主产生戊二酸甲酯。
宿主可以进一步包含具有羧酸还原酶活性的外源多肽，所述宿主产生戊二酸半醛甲酯。在一些实施方案中，宿主进一步包含一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：合酶活性、脱氢酶活性、脱水酶活性、和还原酶活性。在一些实施方案中，宿主进一步包含一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：合酶活性、β-酮硫解酶活性、脱氢酶活性、水合酶活性、和还原酶活性。
具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有硫酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:17-18中任一项中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有还原酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:19或20中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
宿主可以进一步包含具有酯酶活性的外源多肽，所述宿主进一步生成戊二酸或5-氧戊酸。
在一些实施方案中，宿主包含一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：酯酶活性、6-羟基己酸脱氢酶活性、4-羟基丁酸脱氢酶活性、5-羟基戊酸脱氢酶活性、和醇脱氢酶活性，所述宿主产生5-羟基戊酸。宿主可以进一步包含具有选自下组活性的外源多肽：CoA-转移酶活性、合酶活性、和脱水酶活性，所述宿主从5-羟基戊酸生成2,4-戊二烯酰基-CoA。宿主可以进一步包含一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：水合酶活性、硫酯酶活性、脱羧酶活性、脱氢酶活性、CoA-转移酶活性、和脱水酶活性，所述宿主从2,4-戊二烯酰基-CoA生成1,3-丁二烯。
具有硫酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有羧酸还原酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:2-7中任一项中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在一些实施方案中，当宿主包含具有羧酸还原酶活性的外源多肽时，它与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的外源多肽组合使用。
在另一个方面中，本文件特征在于重组宿主，其包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽，和至少一种具有选自下组活性的多肽：硫酯酶活性、可逆的CoA-连接酶活性、CoA-转移酶活性、酰化脱氢酶活性、醛脱氢酶活性、戊二酸半醛脱氢酶活性、和琥珀酸-半醛脱氢酶活性。
具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在一些实施方案中，当宿主包含具有羧酸还原酶活性的多肽时，它与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的外源多肽组合使用。
在另一个方面中，本文件特征在于生物衍生的产物(bio-derived product)、基于生物的产物(bio-based product)或发酵衍生的产物(fermentation-derived product)，其中所述产物包含：(i.)组合物，所述组合物包含如本文中描述的至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，或其任何组合；(ii.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物，或其任何组合；(iii.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或其任何组合或ii.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或其任何组合或ii.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或其任何组合；(iv.)成型物质，其通过使(ii.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或(iii.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂或其任何组合成型获得；(v.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的配制剂，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物、(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物、(ii.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物、(iii.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，或(iv.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的成型物质，或其任何组合；或(vi.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体流(stream)，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物、(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物、(ii.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物、(iii.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，(v.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的配制剂，或iv的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的成型物质，或其任何组合。
本文件特征还在于提高具有羧酸还原酶活性的多肽对取代的或未取代的C4-C8二羧酸诸如戊二酸或肥酸(adipic acid)的活性的方法。所述方法包括使用具有丙二酰基-CoA甲基转移酶活性的多肽将所述C4-C8二羧酸酶促转化成HOC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酯，之后使用具有羧酸还原酶活性的多肽将所述HOC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酯酶促转化成HC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3。该方法可以进一步包括使用具有脱氢酶活性的多肽将所述HC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3转化成HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用具有酯酶活性的多肽将所述HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酶促转化成HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OH。
本文件特征还在于重组宿主，其包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码(i)丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶，(ii)庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶和(iii)硫酯酶，并且生成戊二酸甲酯、戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA。
生成戊二酸甲酯的此类重组宿主进一步可以包含酯酶，并且进一步生成戊二酸。
生成戊二酰基-[acp]的此类重组宿主进一步可以包含硫酯酶，并且生成戊二酸。
生成戊二酰基-CoA的此类重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)硫酯酶，(ii)可逆性CoA连接酶，(iii)CoA转移酶，或(iv)酰化脱氢酶，和(v)醛脱氢酶诸如7-氧庚酸脱氢酶、6-氧己酸脱氢酶或5-氧戊酸脱氢酶，并且进一步生成戊二酸或5-氧戊酸。
生成5-氧戊酸或戊二酸的重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)醇脱氢酶或(ii)羧酸还原酶，并且进一步生成5-羟基戊酸。
生成戊二酸甲酯的重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)醇脱氢酶、(ii)酯酶或(iii)羧酸还原酶，并且进一步生成5-羟基戊酸。
在另一个方面中，本文件特征在于用于生成生物衍生的4或5碳化合物的方法。所述方法包括在下述条件下将如本文中描述的宿主培养或生长足够的时间段，所述条件和时间段产生生物衍生的4或5碳化合物，其中任选地，生物衍生的4或5碳化合物可以选自下组：2,4-戊二烯酰基-CoA、戊二酰基-[acp]甲酯、5-羟基戊酸、3-丁烯-2-酮、3-丁烯-2-醇、1,3-丁二烯及其组合。
在另一个方面中，本文件特征在于组合物，其包含生物衍生的4或5碳化合物和除了生物衍生的4或5碳化合物外的化合物，其中生物衍生的4或5碳化合物选自下组：2,4-戊二烯酰基-CoA、戊二酰基-[acp]甲酯、5-羟基戊酸、3-丁烯-2-酮、3-丁烯-2-醇、1,3-丁二烯及其组合。例如，生物衍生的4碳化合物可以是宿主细胞或生物体的细胞部分。
本文件特征还在于基于生物(biobased)的聚合物，其包含生物衍生的4或5碳化合物，包括2,4-戊二烯酰基-CoA、戊二酰基-[acp]甲酯、5-羟基戊酸、3-丁烯-2-酮、3-丁烯-2-醇、1,3-丁二烯及其组合。
本文件特征还在于基于生物的树脂，其包含生物衍生的4或5碳化合物，包括2,4-戊二烯酰基-CoA、戊二酰基-[acp]甲酯、5-羟基戊酸、3-丁烯-2-酮、3-丁烯-2-醇、1,3-丁二烯及其组合，以及通过将基于生物的树脂成型获得的成型产物。
在另一个方面中，本文件的特征还在于用于生成基于生物的聚合物的方法，其包括在聚合物生成反应中使生物衍生的4或5碳化合物与自身或另一种化合物起化学反应。
在另一个方面中，本文件的特征在于用于生成如本文中描述的基于生物的树脂的方法，其包括在树脂生成反应中使生物衍生的4或5碳化合物与自身或另一种化合物起化学反应。
本文件特征还在于包括丙二酰基-CoA O-甲基转移酶的生物化学网络，其中丙二酰基-CoA O-甲基转移酶将丙二酰基-[acp]酶促转化成丙二酰基-[acp]甲酯。生物化学网络可以进一步包括合酶，脱氢酶，脱水酶，还原酶和硫酯酶，其中合酶，脱氢酶，脱水酶，还原酶和硫酯酶，将丙二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酸甲酯。
在一些实施方案中，生物化学网络进一步包括羧酸还原酶，其中羧酸还原酶将戊二酸甲酯酶促转化戊二酸半醛甲酯。生物化学网络可以进一步包括酯酶和脱氢酶，其中酯酶和脱氢酶将戊二酸半醛甲酯酶促转化成5-羟基戊酸。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包括CoA-转移酶和脱水酶，其中CoA-转移酶和脱水酶将5-羟基戊酸酶促转化2,4-戊二烯酰基-CoA。生物化学网络可以进一步包括水合酶，硫酯酶，脱羧酶，脱氢酶，CoA转移酶和脱水酶，其中水合酶，硫酯酶，脱羧酶，脱氢酶，CoA转移酶和脱水酶将2,4-戊二烯酰基-CoA酶促转化成1,3-丁二烯。
本文件特征还在于包括丙二酰基-CoA O-甲基转移酶的生物化学网络，其中所述丙二酰基-CoA O-甲基转移酶将丙二酰基-CoA酶促转化成丙二酰基-CoA甲基酯。生物化学网络可以进一步包括合酶，β-酮硫解酶，脱氢酶，水合酶，还原酶和硫酯酶，其中合酶，β-酮硫解酶，脱氢酶，水合酶，还原酶和硫酯酶将丙二酰基-CoA甲酯酶促转化成戊二酸甲酯。
在一些实施方案中，生物化学网络进一步包括羧酸还原酶，其中羧酸还原酶将戊二酸甲酯酶促转化成戊二酸半醛甲酯。生物化学网络可以进一步包括酯酶和脱氢酶，其中酯酶和脱氢酶将戊二酸半醛甲酯酶促转化成5-羟基戊酸。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包括CoA-转移酶和脱水酶，其中CoA-转移酶和脱水酶将5-羟基戊酸酶促转化成2,4-戊二烯酰基-CoA。生物化学网络可以进一步包括水合酶，硫酯酶，脱羧酶，脱氢酶，CoA转移酶和脱水酶，其中水合酶，硫酯酶，脱羧酶，脱氢酶，CoA转移酶和脱水酶将2,4-戊二烯酰基-CoA酶促转化成1,3-丁二烯。
本文件特征还在于提高具有羧酸还原酶活性的多肽对取代的或未取代的C4-C8二羧酸诸如戊二酸或肥酸的活性的方法。所述方法包括使用具有丙二酰基-CoA甲基转移酶活性的多肽将所述C4-C8二羧酸酶促转化成HOC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酯，之后使用具有羧酸还原酶活性的多肽将所述HOC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酯酶促转化成HC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3。所述方法可以进一步包括使用具有脱氢酶活性的多肽将所述HC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3转化成HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用具有酯酶活性的多肽将所述HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3产物酶促转化成HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OH产物。
可以在重组宿主中通过发酵进行任一方法。宿主可以经受需氧，厌氧或微需氧培养条件下的培养策略。可以在营养限制，诸如磷酸盐、氧或氮限制的条件下培养宿主。可以使用陶瓷膜保留所述宿主以在发酵期间维持高细胞密度。
在一些实施方案中，所述宿主经受需氧或微需氧培养条件下的培养策略。
在一些实施方案中，生物原料可以用作发酵的主要碳源。例如，生物原料可以是或可以源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟(condensed distillers'solubles)或城市废物。
在一些实施方案中，非生物原料可以用作发酵的主要碳源。非生物原料可以是或可以源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、非挥发性残留物(NVR)或来自环己烷氧化过程的碱洗液(caustic wash)废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
在本文中描述的任何实施方案中，宿主可以是原核生物。原核生物可以选自下组：埃希氏菌属(Escherichia)；梭菌属(Clostridia)；棒状杆菌属(Corynebacteria)；贪铜菌属(Cupriavidus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；代尔夫特菌属(Delftia)；芽孢杆菌属(Bacilluss)；乳杆菌属(Lactobacillus)；乳球菌属(Lactococcus)；和红球菌属(Rhodococcus)。例如，原核生物选自下组：大肠杆菌(Escherichia coli)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、克鲁佛梭菌(Clostridium kluyveri)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和马红球菌(Rhodococcus equi)。
在本文中描述的任何实施方案中，宿主可以是真核生物。真核生物可以选自下组：曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤氏酵属(Pichia)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Arxula、和克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)。例如，真核生物可以选自下组：黑曲霉(Aspergillusniger)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、Arxula adenoinivorans、和乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)。
在一些实施方案中，宿主展现出对高浓度C5构件块(C5building block)的耐受性，并且其中经由在选择性环境中的连续培养改善所述对高浓度C5构件块的耐受性。
在一些实施方案中，将宿主的内源生物化学网络减弱或提升以(1)确保乙酰基-CoA的胞内利用度，(2)产生辅因子，即NADH或NADPH的不平衡，其可以经由形成戊二酸甲酯、2,4-戊二烯酰基-CoA、或1,3-丁二烯来进行平衡，(3)防止导致的中心代谢物，中心前体的降解并且所述中心代谢物，中心前体包括戊二酸甲酯、2,4-戊二烯酰基-CoA、或1,3-丁二烯，并且(4)确保从细胞的足够流出。
在一些实施方案中，宿主包含下列一项或多项：通过过表达形成草乙酸的重组基因在宿主中提高用于生物合成C5构件块的草乙酸的胞内浓度；其中产生NADPH的不平衡，其可以经由形成C5构件块来平衡；其中使用用于赖氨酸合成的间2,6二氨基庚二酸(meso 2,6diaminopimelate)途径在宿主中引入经由2-氧代己二酸(2-oxoadipate)从2-酮戊二酸合成赖氨酸的外源赖氨酸生物合成途径；其中使用用于赖氨酸合成的2-氧代己二酸途径在宿主中引入从草乙酸至间2,6二氨基庚二酸合成赖氨酸的外源赖氨酸生物合成途径；其中在宿主中减弱所导致的并且包括C5构件块的中心代谢物和中心前体的内源降解途径；或者其中通过对细胞膜的遗传工程化结构修饰或者提高用于C5构件块的任何相关的转运蛋白活性增强或放大C5构件块穿过细胞膜流出到胞外培养基。
本文中描述的任何重组宿主可以进一步包含一种或多种以下弱化的多肽，其具有弱化的下列各项的活性：聚羟基烷酸酯合酶、乙酰基-CoA硫酯酶、乙酰基-CoA特异性β-酮硫解酶、乙酰乙酰基-CoA还原酶、形成乙酸的磷酸乙酸转移酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、menaquinol-延胡索酸氧化还原酶、产生异丁醇的2-酮酸(oxoacid)脱羧酶、形成乙醇的醇脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、消散辅因子不平衡的转氢酶、对产生了不平衡的辅因子特异的谷氨酸脱氢酶、利用NADH/NADPH的谷氨酸脱氢酶、庚二酰基-CoA脱氢酶；接受C5构件块和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；戊二酰基-CoA脱氢酶；和庚二酰基-CoA合成酶。
本文中描述的任何重组宿主可以进一步过表达一种或多种编码多肽的基因，所述多肽具有：乙酰基-CoA合成酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶；转酮醇酶；反馈抗性苏氨酸脱氨酶；吡啶核苷酸转氢酶(puridine nucleotide transhydrogenase)；甲酸脱氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；丙酰基-CoA合成酶；L-丙氨酸脱氢酶；L-谷氨酸脱氢酶；L-谷氨酸合成酶；赖氨酸转运蛋白；二羧酸转运蛋白；和/或多药物转运蛋白活性。
本文中所述的途径的反应可在一种或多种细胞(例如宿主细胞)菌株中进行，所述菌株(a)天然表达一种或多种相关酶，(b)经基因工程化改造以表达一种或多种相关酶，或(c)天然表达一种或多种相关酶并且遗传工程化改造以表达一种或多种相关酶。或者，可以从上述类型的宿主细胞中提取相关酶，并以纯化或半纯化形式使用。提取的酶可以任选地固定在合适的反应容器的底部和/或壁上。此外，这些提取物包括可用作相关酶来源的裂解物(例如细胞裂解物)。在文献提供的方法中，所有步骤可以在细胞(例如宿主细胞)中进行，所有步骤可以使用提取的酶进行，或者一些步骤可以在细胞中进行，而其它步骤可以使用提取的酶进行。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。尽管与本文中所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献，包括具有登录号的GenBank和NCBI提交物通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料，该方法和实施例仅仅是说明性的，而不是限制性的。
本领域技术人员理解，当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子，碱土金属离子或铝离子替代；或与有机碱配位时，含有羧酸基团的化合物(包括但不限于有机一元酸，羟基酸，氨基酸和二羧酸)形成或转化成其离子盐形式。可接受的有机碱包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。将本发明的盐分离为盐或通过经由添加酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降至pKa以下而转化成游离酸。
本领域技术人员理解，含有胺基团的化合物(包括但不限于有机胺，氨基酸和二胺)形成或转化为它们的离子盐形式，例如通过向胺中加入酸性质子形成铵盐，与无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等形成；或与有机酸形成，包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，环戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羟基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。本发明的盐以盐的形式分离或通过经由添加碱或用碱性离子交换树脂处理将pH至高于pKb转化成游离胺。
本领域技术人员理解，含有胺基团和羧酸基团两者的化合物(包括但不限于氨基酸)通过以下形成或转化成它们的离子盐形式：通过1)与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸包括但不限于盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，环戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羟基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等，或2)当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子，碱土金属离子或铝离子置换时；或与有机碱配位。可接受的有机碱包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。本发明的盐可以作为盐分离或通过经由添加酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降至pKa以下而转化为游离酸。
在下面的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征，目的和优点将从说明书和附图以及权利要求书中显而易见。根据专利法中的标准实践，权利要求书中的词语“包括”可以被“基本上由...组成”或由“由...组成”替代。
附图简述
图1是从丙二酰基-[acp]导致戊二酸甲酯或戊二酰基-[acp]的例示性生物化学途径的示意图。
图2是使用NADPH作为还原性等同物从丙二酰基-CoA导致戊二酸甲酯或戊二酰基-CoA的例示性生物化学途径的示意图。
图3是使用NADH作为还原性等同物从丙二酰基-CoA导致戊二酸甲酯或戊二酰基-CoA的例示性生物化学途径的示意图。
图4是使用戊二酸甲酯、戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA作为中心前体导致戊二酸的例示性生物化学途径的示意图。
图5是使用戊二酸甲酯或戊二酸作为中心前体导致5-羟基戊酸的例示性生物化学途径的示意图。
图6是使用5-羟基戊酸作为中心前体导致2,4-戊二烯酰基-CoA的例示性生物化学途径的示意图。
图7是使用2,4-戊二烯酰基-CoA作为中心前体导致1,3-丁二烯的例示性生物化学途径的示意图。
图8含有大肠杆菌庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶(参见Genbank登录号AAC76437.1，SEQ ID NO:1)，海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)羧酸还原酶(参见Genbank登录号ACC40567.1，SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)羧酸还原酶(参见Genbank登录号ABK71854.1，SEQ ID NO:3)，Segniliparus rugosus羧酸还原酶(参见Genbank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:4)，耻垢分枝杆菌羧酸还原酶(参见Genbank登录号ABK75684.1，SEQ ID NO:5)，马赛分枝杆菌(Mycobacterium massiliense)羧酸还原酶(参见Genbank登录号EIV11143.1，SEQ ID NO:6)，Segniliparus rotundus羧酸还原酶(参见Genbank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:7)，荧光假单胞菌酯酶(参见Genbank登录号AAC60471.2，SEQ ID NO:8)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)酰基-[acp]硫酯酶(参见Genbank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:9)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)酰基-[acp]硫酯酶(参见Genbank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:10)，齿垢密螺旋体(Treponema denticola)烯酰基-CoA还原酶(参见，例如Genbank登录号AAS11092.1，SEQ IDNo:11)，细小裸藻(Euglena gracilis)烯酰基-CoA还原酶(参见，例如Genbank登录号AAW66853.1，SEQ ID No:12)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶(参见，例如Genbank登录号AAP11034.1，SEQ ID No:13)，大肠杆菌硫酯酶(参见，例如Genbank登录号AAB59067.1，SEQ ID No:14)，和大肠杆菌硫酯酶(参见，例如Genbank登录号AAA24665.1，SEQ ID No:15)，枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(参见Genbank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:16)，诺卡氏菌属物种(Nocardia sp.)NRRL 5646磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(参见Genbank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:17)的氨基酸序列，
图9是柱状图，该柱状图汇总了20分钟后在340nm的吸光度的变化，其是仅酶的对照(无底物)中的NADPH的消耗和5种羧酸还原酶制备物的活性的测量。
图10是20分钟后在340nm的吸光度的变化的柱状图，所述变化是相对于空载体对照，NADPH的消耗和用于将戊二酸甲酯转化成戊二酸半醛甲酯的羧酸还原酶制备物的活性的测量。
图11是通过庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶，戊二酰基-CoA甲酯至戊二酰基-CoA的1小时后转化表。
发明详述
本文件提供了酶、非天然途径、培养策略、给料、宿主微生物和对宿主生物化学网络的弱化，其可用于从中心前体或中心代谢物合成2,4-戊二烯酰基-CoA和任选地1,3-丁二烯(又称为丁-1,3-二烯，二乙烯，或乙烯基乙烯)。因此，丁二烯的产生可以经由共同的中间体2,4-戊二烯酰基-CoA进行，即使存在有可用于产生2,4-戊二烯酰基-CoA的许多不同给料和不同途径。例如，可以使用丙二酰基-CoA或丙二酰基-[acp]经由不同甲酯屏蔽途径产生2,4-戊二烯酰基-CoA。如本文中使用的，术语“中心前体”用于表示导致5-羟基戊酸,2,4-戊二烯酰基-CoA or丁二烯合成的本文中显示的任何代谢途径中的任何代谢物。术语“中心代谢物”在本文中用于表示在所有微生物中产生以支持生长的代谢物。
因此，本文中描述的宿主微生物可以包含内源途径，该内源途径可以通过操作获得，使得可以生成2,4-戊二烯酰基-CoA。在内源途径中，宿主微生物天然表达催化途径内的反应的所有酶。含有工程化途径的宿主微生物不天然表达催化途径内的反应的所有酶，但是已经经过工程化改造，使得在宿主中表达途径内的所有酶。
如本文中提及核酸(或蛋白质)和宿主使用的，术语“外源”指不像其在自然界中被发现一样存在于特定类型细胞中(并且不能从特定类型细胞获得)的核酸或由所述核酸编码的蛋白质。如此，非天然存在的核酸一旦在宿主中即视为对于宿主而言外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中发现的核酸序列的核酸亚序列或片段，只要该核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦导入宿主中对于宿主细胞而言是外源的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制的质粒或病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)视为非天然存在的核酸。由此得出结论通过PCR或限制内切性核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA也视为非天然存在的核酸，因为它们作为未见于自然界的分开的分子存在。由此还得出结论任何以未见于自然界中的排布含有启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的任何核酸也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是对于特定宿主微生物而言外源的。例如，从酵母x的细胞分离的完整染色体一旦将该染色体导入酵母y的细胞中就酵母y细胞而言是外源核酸。
比较而言，如本文中提及核酸(例如基因)(或蛋白质)和宿主使用的，术语“内源的”指就像其在自然界中被发现一样的确存在于特定宿主中(并且可以从特定宿主获得)的核酸(或蛋白质)。此外，“内源表达”核酸(或蛋白质)的细胞就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样表达所述核酸(或蛋白质)。此外，“内源生成”核酸、蛋白质、或其它化合物的宿主就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样生成所述核酸、蛋白质、或化合物。
例如，根据宿主和由宿主产生的化合物，可以在宿主中表达一种或多种下列酶，包括丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶，庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶，酯酶，可逆性CoA连接酶，CoA转移酶，4-羟基丁酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，6-羟基己酸脱氢酶，醇脱氢酶，5-氧戊酸脱氢酶，6-氧己酸脱氢酶，7-氧庚酸脱氢酶，醛脱氢酶，或羧酸还原酶。在表达羧酸还原酶的重组宿主中，也可以表达磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，因为它增强羧酸还原酶的活性。
本文件特征还在于重组宿主，其包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码(i)具有丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶活性的多肽，(ii)具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽和(iii)具有硫酯酶活性的多肽，并且生成戊二酸甲酯、戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA。
生成戊二酸甲酯的此类重组宿主进一步可以包含具有酯酶活性的多肽，并且进一步生成戊二酸。
生成戊二酰基-[acp]的此类重组宿主进一步可以包含具有硫酯酶活性的多肽，并且生成戊二酸。
生成戊二酰基-CoA此类重组宿主进一步可以包含下列一项或多项：(i)具有硫酯酶活性的多肽，(ii)具有可逆性CoA连接酶活性的多肽，(iii)具有CoA转移酶活性的多肽，或(iv)具有酰化脱氢酶活性的多肽，和(v)具有醛脱氢酶活性诸如7-氧庚酸脱氢酶、6-氧己酸脱氢酶或5-氧戊酸脱氢酶活性的多肽，并且进一步生成戊二酸或5-氧戊酸。
生成5-氧戊酸或戊二酸的重组宿主进一步可以包含下列一项或多项：(i)具有醇脱氢酶活性的多肽或(ii)具有羧酸还原酶活性的多肽，并且进一步生成5-羟基戊酸。
生成戊二酸甲酯的重组宿主进一步可以包含下列一项或多项：(i)具有醇脱氢酶活性的多肽，(ii)具有酯酶活性的多肽或(iii)具有羧酸还原酶活性的多肽，并且进一步生成5-羟基戊酸。
在工程化途径内，酶可以来自单一来源，即来自一种物种或属，或者可以来自多种来源，即不同物种或属。编码本文中描述的酶的核酸已经自各种生物体鉴定，并且在公众可用的数据库(诸如GenBank或EMBL)中容易地可得到。
可用于生成一种或多种C5构件块的本文中描述的任何酶可以与相应野生型酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％)。应当理解，可以基于成熟酶(例如除去任何信号序列)或基于未成熟的酶(例如包括任何信号序列)测定序列同一性。还应当理解，初始甲硫氨酸残基可以或可以不存在于本文中描述的任何酶序列上。
例如，具有本文中描述的庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽与大肠杆菌(参见Genbank登录号AAC76437.1，SEQ ID NO:1)庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶的氨基酸序列可以具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。参见图1-3。
例如，具有本文中描述的羧酸还原酶活性的多肽可以与海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ IDNO:3)，Segniliparus rugosus(参见Genbank登录号EFV11917.1,SEQ ID NO:4)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK75684.1,SEQ ID NO:5)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)羧酸还原酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。参见图5。
例如，具有本文中描述的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶活性的多肽可以与枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(参见Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:16)或诺卡氏菌属物种(Nocardia sp.)NRRL 5646磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(参见Genbank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:17)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。参见图5。
例如，具有本文中描述的酯酶活性的多肽可以与荧光假单胞菌酯酶(参见Genbank登录号AAC60471.2,SEQ ID NO:8)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。参见图4，5。
例如，具有本文中描述的硫酯酶活性的多肽可以与短乳杆菌酰基-[acp]硫酯酶(参见Genbank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:9)，植物乳杆菌酰基-[acp]硫酯酶(参见Genbank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:10)，或大肠杆菌硫酯酶(参见Genbank登录号AAB59067.1或AAA24665.1，SEQ ID NO:15-16)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。参见图4。
例如，具有本文中描述的丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶活性的多肽可以与蜡状芽孢杆菌(参见Genbank登录号AAC76437.1,SEQ ID NO:13)丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。参见图1-3。
例如，具有本文中描述的烯酰基-CoA还原酶活性的多肽可以与齿垢密螺旋体(参见Genbank登录号AAS11092.1,SEQ ID NO:11)，或细小裸藻(参见Genbank登录号AAW66853.1,SEQ ID NO:12)烯酰基-CoA还原酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。参见图1-3。
可以如下测定两种氨基酸序列间的百分比同一性(同源性)。首先，使用来自含有BLASTP第2.0.14版的单机版BLASTZ的BLAST 2Sequences(Bl2seq)程序比对氨基酸序列。此单机版BLASTZ可以获自Fish&Richardson的网站(例如www.fr.com/blast/)或美国政府国立生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用Bl2seq程序的用法说明可以参见伴随BLASTZ的自述文件。Bl2seq使用BLASTP算法实施两种氨基酸序列之间的比较。为了比较两种氨基酸序列，如下设置Bl2seq的选项：-i设置为含有要比较的第一氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j设置为含有要比较的第二氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任何期望的文件名称(例如C:\output.txt)；并且所有其它选项保持为其缺省设置。例如，可以使用以下命令来产生含有两种氨基酸序列间的比较的输出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt–j c:\seq2.txt–p blastp–o c:\output.txt。如果两种比较序列共享同源性(同一性)，那么指定的输出文件会呈现那些同源性区作为比对序列。如果两种比较序列不共享同源性(同一性)，那么指定的输出文件不会呈现比对序列。可以对核酸序列遵循相似的规程，只是使用blastn。
一旦比对，通过计算相同氨基酸残基在这两种序列中呈现的位置的数目确定匹配数目。通过用匹配数目除以全长多肽氨基酸序列的长度，接着将所得的数值乘以100来确定百分比同一性(同源性)。注意到百分比同一性(同源性)值被四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13、和78.14被向下四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18、和78.19被向上四舍五入到78.2。还注意到长度值会总是整数。
应当领会，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域中公知的；即对于许多氨基酸，存在有超过一种充当氨基酸密码子的核苷酸三联体。例如，可以修饰给定酶的编码序列中的密码子，从而获得特定物种(例如细菌或真菌)中的最佳表达，这使用适合于所述物种的密码子偏爱表进行。
也可以在本文件的方法中使用本文中描述的任何酶的功能性片段。如本文中使用的，术语“功能性片段”指具有至少25％(例如至少30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；98％；99％；100％；或甚至大于100％)的相应的成熟、全长、野生型蛋白质活性的蛋白质的肽片段。功能性片段一般但不总是可以由蛋白质的连续区构成，其中该区具有功能性活性。
此文件还提供了(i)本文件的方法中使用的酶的功能性变体和(ii)上文描述的功能性片段的功能性变体。相对于相应的野生型序列，酶和功能性片段的功能性变体可以含有添加、缺失、或取代。具有取代的酶一般会具有不超过50(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、或50)处氨基酸取代(例如保守取代)。这适用于本文中描述的任何酶和功能性片段。保守取代是用一种氨基酸取代具有相似特征的另一种。保守取代包括下列组内的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸、和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸、和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上文提及的极性、碱性或酸性组的一种成员被相同组的另一种成员的任何取代可以视为保守取代。比较而言，非保守取代是用一种氨基酸取代具有不同特征的另一种。
缺失变体可以缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸的区段(具有两种或更多种氨基酸)或非连续的单一氨基酸。添加(添加变体)包括融合蛋白，其含有：(a)本文中描述的任何酶或其片段；和(b)内部或末端(C或N)无关或异源氨基酸序列。在此类融合蛋白的背景中，术语“异源氨基酸序列”指与(a)不同的氨基酸序列。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列(例如FLAG、多组氨酸(例如六组氨酸)、凝集素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源序列也可以是可用作可检测标志物的蛋白质，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞(例如酵母宿主细胞)中，可以经由使用异源信号序列提高靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引发免疫应答以生成抗体的载体(例如KLH)或ER或高尔基体保留信号。异源序列可以是不同长度的，并且在一些情况中可以是比与异源序列附接的全长靶蛋白质更长的序列。
工程化宿主可以天然表达本文中描述的途径的酶中的无一或一些(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种)。如此，工程化宿主内的途径可以包含所有外源酶，或者可以包含内源和外源酶两者。也可以破坏工程化宿主的内源基因以阻止不想要的代谢物的形成或阻止经由对中间体起作用的其它酶引起的途径中此类中间体的损失。工程化宿主可以称为重组宿主或重组宿主细胞。如本文中描述的，重组宿主可以包含编码如本文中描述的还原酶、脱乙酰酶、N-乙酰基转移酶、丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶、酯酶、硫酯酶、水合酶、脱氢酶、CoA连接酶、和/或CoA转移酶的活性。
另外，可以使用本文中描述的分离的酶，使用来自宿主微生物的裂解物(例如细胞裂解物)作为酶来源，或者使用来自不同宿主微生物的多种裂解物作为酶来源体外进行一种或多种C5构件块的产生。
在生物合成2,4-戊二烯酰基-CoA中产生末端羧基基团的酶
如图4中描绘，可以使用(i)具有硫酯酶活性的多肽，(ii)具有可逆性CoA连接酶活性的多肽，(iii)具有CoA转移酶活性的多肽，(iv)具有酰化脱氢酶活性的多肽，或(v)具有醛脱氢酶活性诸如7-氧庚酸脱氢酶、6-氧己酸脱氢酶、或5-氧戊酸脱氢酶活性的多肽，或(vi)具有酯酶活性的多肽酶促形成末端羧基基团。
在一些实施方案中，通过在EC 3.1.2.-下分类的硫酯酶，诸如YciA(SEQ ID NO:14)、tesB(Genbank登录号AAA24665.1,SEQ ID NO:15)或Acot13(参见例如，Cantu et al.,Protein Science,2010,19,1281–1295；Zhuang et al.,Biochemistry,2008,47(9),2789–2796；或Naggert et al.,J.Biol.Chem.,1991,266(17),11044–11050)的基因产物酶促形成导致戊二酸合成的末端羧基基团。
在一些实施方案中，通过CoA-转移酶诸如戊烯二酸CoA-转移酶(例如，在EC2.8.3.12下分类，诸如来自发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans))酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。参见例如，Buckel et al.,1981,Eur.J.Biochem.,118:315–321。图4。
在一些实施方案中，通过可逆的CoA-连接酶诸如琥珀酸-CoA连接酶(例如，在EC6.2.1.5下分类，诸如来自Thermococcus kodakaraensis))酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。参见例如，Shikata et al.,2007,J.Biol.Chem.,282(37):26963–26970。
在一些实施方案中，通过在EC 3.1.2.-分类的酰基-[acp]硫酯酶，诸如短乳杆菌(GenBank登录号ABJ63754.1,SEQ ID NO:9)或来自植物乳杆菌(GenBank登录号CCC78182.1,SEQ ID NO:10)的酰基-[acp]硫酯酶酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。此类酰基-[acp]硫酯酶具有C6–C8链长度特异性(参见例如，Jing et al.,2011,BMC Biochemistry,12(44))。参见例如图4。
在一些实施方案中，通过醛脱氢酶，例如，在EC 1.2.1.3下分类的醛脱氢酶(参见Guerrillot&Vandecasteele,Eur.J.Biochem.,1977,81,185–192)酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。参见图4。
在一些实施方案中，通过在EC 1.2.1.-下分类的醛脱氢酶，诸如戊二酸半醛脱氢酶(例如，在EC 1.2.1.20下分类)，琥珀酸-半醛脱氢酶(例如，在EC1.2.1.16或EC 1.2.1.79下分类)，或EC 1.2.1.3下分类的醛脱氢酶酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。例如，EC 1.2.1.-下分类的醛脱氢酶可以是5-氧戊酸脱氢酶诸如CpnE的基因产物、6-氧己酸脱氢酶(例如来自不动细菌属物种(Acinetobacter sp.)的ChnE的基因产物)，或7-氧代庚酸(7-oxoheptanoate)脱氢酶(例如，来自Sphingomonas macrogolitabida的ThnG的基因产物)(Iwaki et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(11),5158–5162；López-Sánchez et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2010,76(1),110-118)。例如，6-氧己酸脱氢酶可以在EC 1.2.1.63下分类，诸如ChnE的基因产物。例如，7-氧代庚酸脱氢酶可以在EC1.2.1.-下分类。
在一些实施方案中，通过具有酯酶活性的多肽诸如在EC 3.1.1.-，诸如EC3.1.1.1或EC 3.1.1.6下分类的酯酶酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。
在2,4-戊二烯酰基-CoA的生物合成中产生末端羟基基团的酶
如图5中描绘，可以使用醇脱氢酶诸如6-羟基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、或4-羟基丁酸脱氢酶酶促形成末端羟基基团。
例如，可以通过脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-下分类的脱氢酶，诸如6-羟基己酸脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.258下分类的6-羟基己酸脱氢酶(例如来自ChnD的基因)，5-羟基戊酸脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-下分类的5-羟基戊酸脱氢酶，诸如CpnD的基因产物(参见例如，Iwaki et al.,2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)，来自Clostridium viride的5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶诸如gabD(参加例如，Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMS Microbiology Letters,181(1):63–71)酶促形成导致5-羟基戊酸的末端羟基基团。参见图5。
在生物合成2,4-戊二烯酰基-CoA中产生末端乙烯基基团的酶
如图6中描绘，可以使用脱水酶诸如来自Clostridium viride的5-羟基戊酰基(羟基pentanoyl)-CoA脱水酶(Eikmanns and Buckel,1991,Eur.J.Biochem.,197,661-668)酶促形成末端乙烯基基团。
生物化学途径
从丙二酰基-[acp]或丙二酰基-CoA至戊二酸甲酯、戊二酰基-CoA或戊二酰基-[acp]的途径
如图1中显示，可以如下从丙二酰基-[acp]合成戊二酸甲酯：通过丙二酰基-CoAO-甲基转移酶，例如，在EC 2.1.1.197下分类的丙二酰基-CoA O-甲基转移酶，诸如bioC的基因产物将丙二酰基-[acp]转化成丙二酰基-[acp]甲酯；接着通过用丙二酰基-[acp]和β-酮酰基-[acp]合酶，例如，在EC 2.3.1.-诸如EC2.3.1.41、EC 2.3.1.179或EC 2.3.1.180下分类(例如fabB,fabFor fabH的基因产物)缩合转化成3-氧戊二酰基-[acp]甲酯(3-oxoglutaryl-[acp]methyl ester)；接着通过3-羟基酰基-CoA脱氢酶，例如在EC 1.1.1.-诸如EC 1.1.1.100下分类(例如fabG的基因产物)转化成3-羟基-戊二酰基-[acp]甲酯；接着通过3-羟基酰基-[acp]脱水酶，例如在EC 4.2.1.59下分类，诸如fabZ的基因产物转化成2,3-脱氢戊二酰基-[acp]甲酯；接着通过反-2-烯酰基-CoA还原酶(trans-2-enoyl-CoAreductase)，例如，在EC 1.3.1.-诸如EC 1.3.1.10下分类，诸如fabI的基因产物转化成戊二酰基-[acp]甲酯；接着(i)通过硫酯酶，例如，在EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ IDNO:17)，YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13，多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)转化成戊二酸甲酯或(ii)通过庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶，例如，在EC3.1.1.85下分类，诸如bioH(SEQ ID NO:1)转化成戊二酰基-[acp]。
如图2中显示，可以如下从丙二酰基-CoA合成戊二酸甲酯：通过丙二酰基-CoA O-甲基转移酶，例如，在EC 2.1.1.197下分类，诸如bioC的基因产物将丙二酰基-CoA转化成丙二酰基-CoA甲酯；接着通过β-酮硫解酶，例如，在EC 2.3.1.16下分类，诸如bktB的基因产物与乙酰基-CoA缩合或者通过β-酮酰基-[acp]合酶，例如，在EC 2.3.1.180下分类，诸如fabH的基因产物与丙二酰基-CoA缩合转化成3-氧戊二酰基-CoA甲酯；接着通过3-羟基酰基-CoA脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-诸如EC 1.1.1.100(例如fabG的基因产物)或EC 1.1.1.36(例如phaB的基因产物)下分类转化成3-羟基-戊二酰基-CoA甲酯；接着通过烯酰基-CoA水合酶，例如，在EC 4.2.1.119下分类，诸如phaJ的基因产物(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915；Fukui et al.,Journal ofBacteriology,1998,180(3),667–673)转化成2,3-脱氢戊二酰基-CoA甲酯；接着通过反-2-烯酰基-CoA还原酶，例如，在EC 1.3.1.-诸如EC 1.3.1.38，EC 1.3.1.8，EC 1.3.1.10或EC1.3.1.44下分类转化成戊二酰基-CoA甲酯；接着(i)通过硫酯酶，例如在EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ ID NO:17)，YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13，多形拟杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)转化成戊二酸甲酯或者(ii)通过庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶，例如，在EC 3.1.1.85下分类，诸如bioH(SEQ ID NO:1)转化成戊二酰基-CoA。
如图3中显示，可以如下从丙二酰基-CoA合成戊二酸甲酯：通过丙二酰基-CoA O-甲基转移酶，例如，在EC 2.1.1.197下分类，诸如bioC的基因产物将丙二酰基-CoA转化成丙二酰基-CoA甲酯；接着通过β-酮硫解酶，例如，在EC 2.3.1.16下分类，诸如bktB的基因产物与乙酰基-CoA缩合或者通过β-酮酰基-[acp]合酶，例如，在EC 2.3.1.180下分类，诸如fabH的基因产物与丙二酰基-CoA缩合转化成3-氧戊二酰基-CoA甲酯；接着通过3-羟基酰基-CoA脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-诸如EC 1.1.1.35或EC 1.1.1.157下分类(例如fadB或hbd的基因产物)转化成3-羟基-戊二酰基-CoA甲酯；接着conversion to 2,3-dehydro戊二酰基-CoA甲酯通过烯酰基-CoA水合酶，例如，在EC 4.2.1.17下分类，诸如crt的基因产物；接着通过反-2-烯酰基-CoA还原酶，例如，在EC 1.3.1.44下分类，诸如ter或tdter的基因产物转化成戊二酰基-CoA甲酯；接着(i)通过硫酯酶，例如，在EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ IDNO:17)，YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13，多形拟杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)转化成戊二酸甲酯或(ii)通过庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶，例如，在EC 3.1.1.85下分类，诸如bioH(SEQ IDNO:1)转化成戊二酰基-CoA。
使用戊二酸甲酯、戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA作为中心前体至戊二酸或5-氧戊酸的途径
如图4中描绘，可以通过酯酶，例如在EC 3.1.1.-，诸如EC 3.1.1.1或EC 3.1.1.6下分类，诸如estC(SEQ ID NO:8)将戊二酸甲酯转化成戊二酸。
如图4中描绘，可以将戊二酰基-CoA转化成戊二酸，其通过(i)硫酯酶，例如，在EC3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ ID NO:17)、YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13、多形拟杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)(ii)可逆的CoA-连接酶，例如，在EC 6.2.1.5下分类，(iii)CoA-转移酶，例如，在EC 2.8.3.-，诸如EC 2.8.3.12下分类，或者(iv)酰化脱氢酶，例如，在EC 1.2.1.10或EC1.2.1.76下分类，诸如由PduB或PduP编码，和EC 1.2.1.-下分类的醛脱氢酶，诸如戊二酸半醛脱氢酶，例如，在EC 1.2.1.20下分类，琥珀酸-半醛脱氢酶，例如，在EC 1.2.1.16或EC1.2.1.79下分类，或醛脱氢酶，在EC 1.2.1.3下分类进行。例如，5-氧戊酸(oxovalerate)脱氢酶诸如CpnE的基因产物，6-氧己酸脱氢酶诸如ChnE的基因产物，或7-氧庚酸脱氢酶(例如来自Sphingomonas macrogolitabida的ThnG的基因产物)可用于将5-氧戊酸转化成戊二酸。
如图4中描绘，可以通过硫酯酶，例如，在EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ IDNO:17)、YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13，多形拟杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)将戊二酰基-[acp]转化成戊二酸。
使用戊二酸甲酯作为中心前体至5-羟基戊酸的途径
如图5中描绘，可以如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-羟基戊酸：通过酯酶，在EC3.1.1.-下分类(例如estC的基因产物)，诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶将戊二酸甲酯转化成戊二酸；接着通过羧酸还原酶，例如，在EC1.2.99.6下分类，诸如car的基因产物组合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:16)基因或来自诺卡氏菌的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:17)基因编码)，或GriC和GriD的基因产物(Suzukiet al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)将戊二酸转化成戊二酸半醛；接着通过脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-下分类，诸如6-羟基己酸脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.258下分类(例如来自ChnD的基因)、5-羟基戊酸脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-下分类，诸如CpnD的基因产物(参见例如，Iwaki et al.,2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)，或4-羟基丁酸脱氢酶诸如gabD(参见例如，Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMSMicrobiology Letters,181(1):63–71)转化成5-羟基戊酸。参见图5。
如图5中描绘的，可以如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-羟基戊酸：其通过羧酸还原酶，例如，在EC 1.2.99.6下分类，诸如来自海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，组合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:16)基因或来自诺卡氏菌的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:17)基因编码)，或GriC和GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)将戊二酸甲酯转化成戊二酸半醛甲酯；接着通过EC 3.1.1.-下分类的酯酶(例如estC的基因产物)，诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶转化成戊二酸半醛；接着通过脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-下分类，诸如6-羟基己酸脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.258下分类(例如来自ChnD的基因)，5-羟基戊酸脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-下分类，诸如CpnD的基因产物，或4-羟基丁酸脱氢酶诸如gabD转化成5-羟基戊酸。
如图5中描绘，可以如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-羟基戊酸：通过羧酸还原酶，例如，在EC 1.2.99.6下分类，诸如来自海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，组合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡氏菌的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)，或GriC&GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)将戊二酸甲酯转化成戊二酸半醛甲酯；接着通过醇脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-(例如EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、或EC 1.1.1.184)下分类，诸如YMR318C的基因产物、YqhD、或具有GenBank登录号CAA81612.1的蛋白质转化成5-羟基戊酸甲酯；接着通过EC 3.1.1.-下分类的酯酶(例如estC的基因产物)诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶转化成5-羟基戊酸。
使用5-羟基戊酸作为中心前体至2,4-戊二烯酰基-CoA的途径
如图6中描绘，可以如下从5-羟基戊酸合成2,4-戊二烯酰基-CoA：通过5-羟基戊酸CoA-转移酶或4-羟基丁酸CoA-转移酶，例如，在EC 2.8.3.-诸如EC 2.8.3.14或EC 2.8.3.9下分类或者通过合酶，例如，在EC 6.2.1.-下分类，诸如EC 6.2.1.36下分类的3-羟基丙酰基-CoA合酶将5-羟基戊酸转化成5-羟基戊酰基-CoA；接着通过脱水酶诸如5-羟基戊酰基-CoA脱水酶，例如，在EC 4.2.1.-下分类(获自Clostridium viride)转化成2,4-戊二烯酰基-CoA。
培养策略
在一些实施方案中，培养策略需要实现需氧、厌氧、微需氧、或混合氧/反硝化培养条件。体外表征为氧敏感性的酶需要维持极低溶解氧浓度的微需氧培养策略(参见例如，Chayabatra&Lu-Kwang,Appl.Environ.Microbiol.,2000,66(2),493 0 498；Wilson andBouwer,1997,Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,18(2-3),116-130)。
在一些实施方案中，循环培养策略需要在实现厌氧培养条件和实现有氧培养条件之间交替。
在一些实施方案中，培养策略需要营养限制，如氮，磷酸盐或氧限制。
在一些实施方案中，可以利用除了氧外的最终电子受体诸如硝酸盐。在一些实施方案中，可以采用使用例如陶瓷膜的细胞保留策略来实现并维持补料分批或连续发酵期间的高细胞密度。
在一些实施方案中，在一种或多种C5构件块合成中对发酵补料的主要碳源可以源自生物或非生物原料。
在一些实施方案中，所述生物原料可以是或可以源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟(condensed distillers'solubles)或城市废物。
已经在几种微生物(诸如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶罗维亚酵母)中证明了源自生物柴油生产的粗制甘油的有效分解代谢(Lee et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166:1801–1813；Yang et al.,Biotechnology forBiofuels,2012,5:13；Meijnen et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90:885-893)。
已经在几种生物体(诸如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌)中在经由前体丙酰基-CoA至3-羟基戊酸的合成中证明了木质纤维素衍生的乙酰丙酸的有效分解代谢(Jaremko andYu,2011,supra；Martin and Prather,J.Biotechnol.,2009,139:61–67)。
已经在几种微生物(诸如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌)中证明了木质素衍生的芳香族化合物诸如苯甲酸类似物的有效分解代谢(Bugg et al.,Current Opinion inBiotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja et al.,FEMS Microbiol.Rev.,2008,32,736–794)。
已经在几种微生物(包括解脂耶罗维亚酵母)中证明了农业废物(诸如橄榄磨坊废水)的有效利用(Papanikolaou et al.,Bioresour.Technol.,2008,99(7):2419-2428).
已经针对几种微生物(诸如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌)证明了可发酵糖类(诸如源自纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业来源的单糖和二糖)的有效利用(参见，例如Hermann et al,J.Biotechnol.,2003,104:155–172；Wee et al.,Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2):163–172；Ohashi et al.,J.Bioscience and Bioengineering,1999,87(5):647-654)。
已经针对钩虫贪铜菌证明了源自多种农业木质纤维素来源的糠醛的有效利用(Liet al.,Biodegradation,2011,22:1215–1225).
在一些实施方案中，所述非生物原料可以是或可以源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、非挥发性残留物(NVR)或来自环己烷氧化过程的碱洗液(causticwash)废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
已经针对甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母证明了甲醇的有效分解代谢。
已经针对克鲁佛梭菌证明了乙醇的有效分解代谢(Seedorf et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133).
已经针对钩虫贪铜菌证明了CO2和H2(其可以源自天然气和其它化学和石油化学来源)的有效分解代谢(Prybylski et al.,Energy,Sustainability and Society,2012,2:11)。
已经针对多种微生物(诸如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌)证明了合成气的有效分解代谢(et al.,Applied and Environmental Microbiology,2011,77(15):5467–5475)。
已经针对多种微生物(诸如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌)证明了来自环己烷过程的非挥发性残留物废物流的有效分解代谢(Ramsay et al.,Applied andEnvironmental Microbiology,1986,52(1):152–156)。
代谢工程
本文件提供方法，所述方法涉及少于针对所有上述途径描述的所有步骤的步骤。这种方法可涉及例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多个。在这种方法包含少于所有步骤的情况下，第一个，且在一些实施方案中唯一的步骤可为所列步骤中的任何步骤。
此外，本文中描述的重组宿主可以包括上述酶中的任何组合，使得所述步骤中的一个或者多个，例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个可以在重组宿主内实施。本文件提供所列出的和遗传工程化以表达本文件中列举的任何酶的一种或者多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多种)重组形式的任何属和种的宿主细胞。如此，例如，宿主细胞可含有外源核酸，其编码催化本文中描述的任何途径的一个或者多个步骤的酶。
另外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与[acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
此外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受底物的(R)-对映异构体的情况下，存在与底物的(S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
本文件还认识到，在已经显示酶接受特定辅因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者共底物方面是泛宿主性的(promiscuous)。此外，本文件认识到，在酶对例如特定辅助因子如NADH具有高特异性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同的酶种类。
在一些实施方案中，本文中概述的途径中的酶是经由非直接或者合理酶设计方法的酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、改变立体特异性，或者改变辅助因子特异性。
在一些实施方案中，可以经由附加型或者染色体整合方法将本文概述的途径中的酶基因投入(gene dose)至所得的遗传修饰的生物体中(即，过表达)。
在一些实施方案中，可以利用基因组级别(genome-scale)系统生物学技术如通量平衡分析来设计用于将碳流量引导至2,4-戊二烯酰基-CoA的基因组级别的弱化或者敲除策略。
弱化策略包括但不限于使用转座子、同源重组(双交叉方法)、诱变、酶抑制剂和RNAi干扰。
在一些实施方案中，可以利用通量组(fluxomic)、代谢物组(metabolomic)和转录物组(transcriptomal)数据来告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将碳流量导向2,4-戊二烯酰基-CoA的过程中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。
在一些实施方案中，可以经由在选择性环境中的连续培养改善宿主微生物对高浓度的2,4-戊二烯酰基-CoA的耐受性。
在一些实施方案中，可以弱化或提升宿主微生物的内源生物化学网络以(1)确保乙酰基-CoA的胞内利用度，(2)产生NADH或NADPH不平衡，其可以经由2,4-戊二烯酰基-CoA的形成来平衡，和/或(3)防止所导致的并且包括2,4-戊二烯酰基-CoA的中心代谢物，中心前体的降解。
在需要乙酰基-CoA-CoA的胞内利用度以进行C5构件块合成的一些实施方案中，可以在宿主生物体中弱化催化水解乙酰基-CoA的内源酶诸如短链长度硫酯酶。
在需要缩合乙酰基-CoA和丙二酰基-CoA以进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些实施方案中，可以弱化催化将仅乙酰基-CoA缩合成乙酰乙酰基-CoA的一种或多种内源β-酮硫解酶，诸如AtoB或phaA的内源基因产物。
在需要乙酰基-CoA的胞内利用度以进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些实施方案中，可以弱化产生乙酸的内源磷酸乙酸转移酶，诸如pta(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。
在需要乙酰基-CoA的胞内利用度以进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些实施方案中，可以弱化编码乙酸激酶的乙酸合成途径中的内源基因，诸如ack。
在需要乙酰基-CoA和NADH的胞内利用度以进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些实施方案中，可以弱化编码催化丙酮酸降解成乳酸的酶的内源基因，诸如由ldhA编码的乳酸脱氢酶(Shen et al.,2011,见上文)。
在需要乙酰基-CoA和NADH的胞内利用度以进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些实施方案中，可以弱化编码将磷酸烯醇式丙酮酸降解成琥珀酸的酶，诸如menaquinol-延胡索酸氧化还原酶的内源基因，诸如frdBC(参见，例如Shen et al.,2011,见上文)。
在需要乙酰基-CoA和NADH的胞内利用度以进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些实施方案中，可以弱化编码催化将乙酰基-CoA降解成乙醇的酶，诸如由adhE编码的醇脱氢酶的内源基因(Shen et al.,2011,见上文)。
在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH辅因子来进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组甲酸脱氢酶基因(Shen et al.,2011,见上文)。
在一些实施方案中，可以在宿主生物体中过表达乙酰基-CoA羧化酶。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达3-磷酸甘油酸脱氢酶，3-磷酸丝氨酸氨基转移酶和磷酸丝氨酸磷酸酶中的一种或多种以产生作为S-腺苷-L-甲硫氨酸循环的甲基供体的丝氨酸。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达甲醇脱氢酶或甲醛脱氢酶以允许经由甲酸的甲醇分解代谢。
在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH或NADPH辅因子进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的情况下，可以弱化消散辅因子不平衡的转氢酶。
在一些实施方案中，可以弱化编码催化将丙酮酸降解成乙醇的酶，诸如丙酮酸脱氢酶的内源基因。
在一些实施方案中，可以弱化编码催化产生异丁醇的酶，诸如2-酮酸脱羧酶的内源基因。
在需要乙酰基-CoA的胞内利用度以进行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些实施方案中，可以在微生物中过表达重组乙酰基-CoA合成酶，诸如acs的基因产物(Satoh et al.,J.Bioscience and Bioengineering,2003,95(4):335–341)。
在一些实施方案中，可以通过弱化内源葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)将碳流量定向到戊糖磷酸循环中以提高NADPH的供应。
在一些实施方案中，可以通过过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和/或转酮醇酶将碳流量重定向到戊糖磷酸循环中以提高NADPH的供应(Lee et al.,2003,BiotechnologyProgress,19(5),1444–1449)。
在一些实施方案中，在途径中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达基因诸如编码吡啶核苷酸转氢酶的UdhA(Brigham et al.,Advanced Biofuels and Bioproducts,2012,Chapter 39,1065-1090)。
在一些实施方案中，在途径中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因诸如GapN(Brigham et al.,2012,见上文)。
在一些实施方案中，在途径中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要过量的NADPH辅因子的情况中，可以在宿主生物体中过表达重组苹果酸酶(malic enzyme)基因诸如maeA或maeB(Brigham et al.,2012,见上文)。
在一些实施方案中，在途径中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因诸如zwf(Limet al.,J.Bioscience and Bioengineering,2002,93(6),543-549)。
在一些实施方案中，在途径中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组果糖1,6二磷酸酶基因诸如fbp(Becker etal.,J.Biotechnol.,2007,132:99-109)。
在一些实施方案中，在途径中在合成C5构件块中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以弱化内源丙糖磷酸异构酶(EC 5.3.1.1)。
在一些实施方案中，在途径中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖脱氢酶诸如gdh的基因产物(Satohet al.,J.Bioscience and Bioengineering,2003,95(4):335–341)。
在一些实施方案中，可以弱化促进NADPH转化成NADH的内源酶，所述转化诸如NADH产生循环，其可以经由EC 1.4.1.2(NADH-特异性)和EC1.4.1.4(NADPH-特异性)下分类的谷氨酸脱氢酶的互变产生。
在一些实施方案中，可以弱化利用NADH和NADPH两者作为辅因子的内源谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)。
在一些实施方案中，可以经由与小的可溶性蛋白质，诸如麦芽糖结合蛋白形成的融合蛋白表达溶解膜结合烯酰基-CoA还原酶(Gloerich et al.,FEBS Letters,2006,580,2092–2096)。
在使用天然积累聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoates)的宿主的一些实施方案中，可以在宿主菌株中弱化酶内源聚羟基链烷酸酯合酶。
在使用天然积累脂质体的宿主的一些实施方案中，弱化编码涉及脂质体合成的酶的基因。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-谷氨酸脱氢酶、L-谷氨酸合成酶、或谷氨酸合酶以从作为氨基供体的2-酮戊二酸再生L-谷氨酸，用于ω-转氨酶反应。
在一些实施方案中，可以弱化酶诸如EC 1.3.1.62下分类的庚二酰基-CoA脱氢酶；酰基-CoA脱氢酶，例如，在EC 1.3.8.7或EC 1.3.8.1下分类；和/或戊二酰基-CoA脱氢酶，例如，在EC 1.3.8.6下分类的戊二酰基-CoA脱氢酶，其降解所导致的并且包括C5构件块的中心代谢物和中心前体。
在一些实施方案中，可以弱化经由辅酶A酯化活化C5构件块的内源酶，诸如例如，EC 6.2.1.6下分类的CoA-连接酶(例如戊二酰基-CoA合成酶)。
使用重组宿主产生2,4-戊二烯酰基-CoA
通常，可以通过提供宿主微生物，并且用含有如上文描述的合适的碳源的培养基培养提供的微生物生成2,4-戊二烯酰基-CoA。一般地，培养基和/或培养可以使得微生物生长到足够的密度并且有效产生2,4-戊二烯酰基-CoA。对于大规模生产过程，可以使用任何方法，诸如别处描述的(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology,2ndEdition,Editors:A.L.Demain and J.E.Davies,ASM Press；和Principles ofFermentation Technology,P.F.Stanbury and A.Whitaker,Pergamon)。简言之，用特定微生物接种含有合适的培养基的大罐(例如，100加仑、200加仑、500加仑、或更多的罐)。在接种后，培养微生物以容许产生生物量。一旦达到期望的生物量，可以将含有微生物的培养基转移到第二个罐。此第二个罐可以是任何大小。例如，第二个罐可以是较大的，较小的，或者与第一个罐相同大小的。通常，第二个罐大于第一个，使得可以对来自第一个罐的培养基添加额外的培养基。另外，此第二个罐内的培养基可以与第一个罐中使用的培养基相同或不同。
一旦转移，可以培养微生物以允许生成2,4-戊二烯酰基-CoA。一旦生成，可以使用任何方法从2,4-戊二烯酰基-CoA生成1,3-丁二烯，诸如图7中描述。本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1
使用戊二酸甲酯作为底物并且形成戊二酸半醛甲酯的羧酸还原酶的酶活性
将编码His-标签的核苷酸序列添加到分别编码SEQ ID NO:2-4，和7的羧酸还原酶(分别为GenBank登录号ACC40567.1，ABK71854.1，EIV11143.1，和ADG98140.1)的来自海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、Segniliparus rugosus、马赛分枝杆菌、和Segniliparus rotundus的基因(参见图8)，使得可以生成N端加HIS标签的羧酸还原酶。将每个修饰的基因克隆到pET Duet表达载体中，在编码来自枯草芽孢杆菌的加His标签的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的sfp基因旁，两者都在T7启动子的控制下。与来自实施例2的表达载体一起将每种表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。在以230rpm摇动的情况下，在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力下的250mL烧瓶培养物中在37℃培养每种所得的重组大肠杆菌菌株。在37℃使用自身诱导培养基诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每种团粒，并且经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液。使用Ni亲和层析从上清液中纯化羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，以10倍稀释到50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并且经由超滤浓缩。
酶活性测定在由最终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，2mM戊二酸甲酯，10mMMgCl2，1mM ATP和1mM NADPH组成的缓冲液中一式三份进行。通过向含有戊二酸甲酯的测定缓冲液中加入纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶或空载体对照，然后在室温下温育20分钟来启动酶活性测定反应。通过340nm处的吸光度监测NADPH的消耗。没有戊二酸甲酯的仅酶的对照证明NADPH的低基线消耗。参见图9。
通过sfp的基因产物增强的SEQ ID NO 2-4和7的基因产物接受戊二酸甲酯作为底物，如针对空载体对照(参见图10)和合成的戊二酸半醛甲酯确认的。
实施例2
使用戊二酰基-CoA甲酯作为底物并且形成戊二酰基-CoA的庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶的酶活性
将编码C末端的加His-标签的序列添加到编码SEQ ID NO:1的庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶的来自大肠杆菌的基因(参见图8)，使得可以产生C-末端加HIS标签的庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶。将得到的修饰基因克隆到在T7启动子控制下的pET28b+表达载体中，并将表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。将所得的重组大肠杆菌菌株在37℃下在含有100mL LB培养基和抗生素选择压力下的500mL摇瓶培养中在230rpm振荡下培养。每种培养物在18℃下使用0.3mM IPTG诱导过夜。
通过离心收集来自每个诱导的摇瓶培养物的沉淀。将每个沉淀重悬并通过超声处理裂解。通过离心分开细胞碎片与上清液。使用Ni亲和层析从上清液纯化庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶，缓冲液交换，通过超滤浓缩到20mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并在4℃贮存。
在由终浓度为25mM Tris·HCl缓冲液(pH＝7.0)和5[mM]戊二酰基-CoA甲酯构成的缓冲液中一式三份进行将戊二酰基-CoA甲酯转化为戊二酰基-CoA的酶活性测定。通过向含有戊二酸基-CoA甲酯的测定缓冲液中加入庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶至终浓度为10μM来启动酶活性测定反应，并在30℃在250rpm振荡下振荡1小时。通过LC-MS定量戊二酰基-CoA的形成。
没有酶的仅底物的对照没有显示痕量的底物戊二酰基-CoA。参见图11。SEQ IDNO.1的庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶接受戊二酰基-CoA甲酯作为底物，并且合成戊二酰基-CoA作为反应产物，如经由LC-MS确认的。参见图11。
其它实施方案
应当理解，虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制由所附权利要求书的范围限定的本发明的范围。其它方面，优点和修改在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 英威达技术有限责任公司
<120>用于产生戊二酸和戊二酸甲酯的方法
<130> 35643-0056WO1
<150> US 62/012,722
<151> 2014-06-16
<150> US 62/012,586
<151> 2014-06-16
<160> 17
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 256
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
Met Asn Asn Ile Trp Trp Gln Thr Lys Gly Gln Gly Asn Val His Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu His Gly Trp Gly Leu Asn Ala Glu Val Trp Arg Cys Ile
20 25 30
Asp Glu Glu Leu Ser Ser His Phe Thr Leu His Leu Val Asp Leu Pro
35 40 45
Gly Phe Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly Ala Leu Ser Leu Ala Asp Met
50 55 60
Ala Glu Ala Val Leu Gln Gln Ala Pro Asp Lys Ala Ile Trp Leu Gly
65 70 75 80
Trp Ser Leu Gly Gly Leu Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Thr His Pro
85 90 95
Glu Arg Val Gln Ala Leu Val Thr Val Ala Ser Ser Pro Cys Phe Ser
100 105 110
Ala Arg Asp Glu Trp Pro Gly Ile Lys Pro Asp Val Leu Ala Gly Phe
115 120 125
Gln Gln Gln Leu Ser Asp Asp Phe Gln Arg Thr Val Glu Arg Phe Leu
130 135 140
Ala Leu Gln Thr Met Gly Thr Glu Thr Ala Arg Gln Asp Ala Arg Ala
145 150 155 160
Leu Lys Lys Thr Val Leu Ala Leu Pro Met Pro Glu Val Asp Val Leu
165 170 175
Asn Gly Gly Leu Glu Ile Leu Lys Thr Val Asp Leu Arg Gln Pro Leu
180 185 190
Gln Asn Val Ser Met Pro Phe Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Asp Gly
195 200 205
Leu Val Pro Arg Lys Val Val Pro Met Leu Asp Lys Leu Trp Pro His
210 215 220
Ser Glu Ser Tyr Ile Phe Ala Lys Ala Ala His Ala Pro Phe Ile Ser
225 230 235 240
His Pro Ala Glu Phe Cys His Leu Leu Val Ala Leu Lys Gln Arg Val
245 250 255
<210> 2
<211> 1174
<212> PRT
<213> 海分枝杆菌
<400> 2
Met Ser Pro Ile Thr Arg Glu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Ile Gln Asp
1 5 10 15
Leu Tyr Ala Asn Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ala
20 25 30
Ile Thr Ala Ala Ile Glu Arg Pro Gly Leu Pro Leu Pro Gln Ile Ile
35 40 45
Glu Thr Val Met Thr Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Ala Gln Arg
50 55 60
Ser Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Gly Thr Gly His Thr Thr Leu Arg
65 70 75 80
Leu Leu Pro His Phe Glu Thr Ile Ser Tyr Gly Glu Leu Trp Asp Arg
85 90 95
Ile Ser Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser Thr Glu Gln Thr Val Lys Pro
100 105 110
Gly Asp Arg Val Cys Leu Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Ala Thr
115 120 125
Ile Asp Met Thr Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Ala Val Pro Leu Gln
130 135 140
Thr Ser Ala Ala Ile Thr Gln Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Gln
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Pro Thr Met Ile Ala Ala Ser Val Asp Ala Leu Ala Asp Ala Thr Glu
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Leu Ala Leu Ser Gly Gln Thr Ala Thr Arg Val Leu Val Phe Asp His
180 185 190
His Arg Gln Val Asp Ala His Arg Ala Ala Val Glu Ser Ala Arg Glu
195 200 205
Arg Leu Ala Gly Ser Ala Val Val Glu Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala
210 215 220
Arg Gly Asp Val Pro Arg Gly Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Gly Thr
225 230 235 240
Asp Val Ser Asp Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met Tyr Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr
260 265 270
Phe Trp Arg Lys Arg Thr Trp Phe Glu Gly Gly Tyr Glu Pro Ser Ile
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Thr Leu Asn Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly Arg Gln Ile Leu
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Tyr Gly Thr Leu Cys Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Val Ala Lys Ser
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Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu
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Leu Thr Phe Val Pro Arg Val Trp Asp Met Val Phe Asp Glu Phe Gln
340 345 350
Ser Glu Val Asp Arg Arg Leu Val Asp Gly Ala Asp Arg Val Ala Leu
355 360 365
Glu Ala Gln Val Lys Ala Glu Ile Arg Asn Asp Val Leu Gly Gly Arg
370 375 380
Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Asp Glu Met Lys
385 390 395 400
Ala Trp Val Glu Glu Leu Leu Asp Met His Leu Val Glu Gly Tyr Gly
405 410 415
Ser Thr Glu Ala Gly Met Ile Leu Ile Asp Gly Ala Ile Arg Arg Pro
420 425 430
Ala Val Leu Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Asp Leu Gly Tyr Phe
435 440 445
Leu Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Val Lys Thr Asp
450 455 460
Ser Leu Phe Pro Gly Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Val Thr Ala Asp Val
465 470 475 480
Phe Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Met Ala Glu Val
485 490 495
Gly Pro Glu Gln Phe Val Tyr Leu Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys
500 505 510
Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Thr Val Ser Lys Leu Glu Ala Val Phe
515 520 525
Gly Asp Ser Pro Leu Val Arg Gln Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Ser Ala
530 535 540
Arg Ala Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Gln Glu Ala Leu Asp
545 550 555 560
Ala Val Pro Val Glu Glu Leu Lys Ala Arg Leu Gly Asp Ser Leu Gln
565 570 575
Glu Val Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Ile Pro Arg Asp
580 585 590
Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Trp Thr Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr
595 600 605
Gly Ile Arg Lys Leu Ala Arg Pro Gln Leu Lys Lys His Tyr Gly Glu
610 615 620
Leu Leu Glu Gln Ile Tyr Thr Asp Leu Ala His Gly Gln Ala Asp Glu
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Leu Arg Ser Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Ala Pro Val Leu Val Thr
645 650 655
Val Cys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ser Asp Val
660 665 670
Gln Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala
675 680 685
Leu Ser Phe Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Asp Ile Glu Val Pro
690 695 700
Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Leu Ala Asp
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Tyr Val Glu Ala Ala Arg Lys Pro Gly Ser Ser Arg Pro Thr Phe Ala
725 730 735
Ser Val His Gly Ala Ser Asn Gly Gln Val Thr Glu Val His Ala Gly
740 745 750
Asp Leu Ser Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Ala Thr Leu Ala Glu Ala
755 760 765
Pro Arg Leu Pro Ala Ala Asn Thr Gln Val Arg Thr Val Leu Leu Thr
770 775 780
Gly Ala Thr Gly Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu
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Arg Met Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Cys Leu Val Arg Ala Lys
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Asp Pro Glu Leu Leu Ala His Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Asp His Leu
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Glu Val Leu Ala Gly Asp Lys Gly Glu Ala Asp Leu Gly Leu Asp Arg
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Gln Thr Trp Gln Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Leu Ile Val Asp Pro
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Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Ser Gln Leu Phe Gly Pro
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Asn Ala Leu Gly Thr Ala Glu Leu Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ser Lys
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Ile Lys Pro Tyr Ser Tyr Thr Ser Thr Ile Gly Val Ala Asp Gln Ile
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Pro Pro Ser Ala Phe Thr Glu Asp Ala Asp Ile Arg Val Ile Ser Ala
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Thr Arg Ala Val Asp Asp Ser Tyr Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Ser Lys
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Pro Val Ala Val Phe Arg Cys Asp Met Ile Leu Ala Asp Thr Thr Trp
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Leu Ala Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Glu Leu Ala Ala
1010 1015 1020
Asp Gly Ala Arg Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro Val Glu Phe
1025 1030 1035 1040
Ile Ala Glu Ala Ile Ser Thr Leu Gly Ala Gln Ser Gln Asp Gly Phe
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His Thr Tyr His Val Met Asn Pro Tyr Asp Asp Gly Ile Gly Leu Asp
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Glu Phe Val Asp Trp Leu Asn Glu Ser Gly Cys Pro Ile Gln Arg Ile
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Arg Phe Arg Ala Ala Val Gln Glu Ala Lys Ile Gly Pro Asp Lys Asp
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 耻垢分枝杆菌
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Glu Phe Gly Leu Ile
1170
<210> 4
<211> 1148
<212> PRT
<213> Segniliparus rugosus
<400> 4
Met Gly Asp Gly Glu Glu Arg Ala Lys Arg Phe Phe Gln Arg Ile Gly
1 5 10 15
Glu Leu Ser Ala Thr Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Ala Pro Asp Pro
20 25 30
Ala Val Val Glu Ala Val Ser Asp Pro Ser Leu Ser Phe Thr Arg Tyr
35 40 45
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Cys Ala Leu Ala Ala Pro Ser Val Gln Arg Leu Val Val Phe Asp Leu
165 170 175
Arg Gly Pro Asp Ala Ser Glu Ser Ala Ala Asp Glu Arg Arg Gly Ala
180 185 190
Leu Ala Asp Ala Glu Glu Gln Leu Ala Arg Ala Gly Arg Ala Val Val
195 200 205
Val Glu Thr Leu Ala Asp Leu Ala Ala Arg Gly Glu Ala Leu Pro Glu
210 215 220
Ala Pro Leu Phe Glu Pro Ala Glu Gly Glu Asp Pro Leu Ala Leu Leu
225 230 235 240
Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met Tyr Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Val Ser Gln Leu Trp Gly Arg Thr Pro Val Val Pro Gly
260 265 270
Met Pro Asn Ile Ser Leu His Tyr Met Pro Leu Ser His Ser Tyr Gly
275 280 285
Arg Ala Val Leu Ala Gly Ala Leu Ser Ala Gly Gly Thr Ala His Phe
290 295 300
Thr Ala Asn Ser Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Ile Ala Leu Ala
305 310 315 320
Arg Pro Thr Phe Leu Ala Leu Val Pro Arg Val Cys Glu Met Leu Phe
325 330 335
Gln Glu Ser Gln Arg Gly Gln Asp Val Ala Glu Leu Arg Glu Arg Val
340 345 350
Leu Gly Gly Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Gly Ser Ala Pro Leu Ser
355 360 365
Pro Glu Met Arg Ala Phe Met Glu Glu Val Leu Gly Phe Pro Leu Leu
370 375 380
Asp Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Ala Leu Gly Val Met Arg Asn Gly Ile
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Ile Gln Arg Pro Pro Val Ile Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Glu
405 410 415
Leu Gly Tyr Arg Thr Thr Asp Lys Pro Tyr Pro Arg Gly Glu Leu Cys
420 425 430
Ile Arg Ser Thr Ser Leu Ile Ser Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Ile
435 440 445
Thr Ala Glu Val Phe Asp Ala Gln Gly Tyr Tyr Lys Thr Gly Asp Val
450 455 460
Met Ala Glu Ile Ala Pro Asp His Leu Val Tyr Val Asp Arg Ser Lys
465 470 475 480
Asn Val Leu Lys Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Ala Val Ala Lys Leu
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545 550 555 560
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565 570 575
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595 600 605
Gln Ala Asp Glu Leu Arg Ala Leu Arg Asp Gly Ala Gly Gln Arg Pro
610 615 620
Val Val Glu Thr Val Val Arg Ala Ala Val Ala Ile Ser Gly Ser Glu
625 630 635 640
Gly Ala Glu Val Gly Pro Glu Ala Asn Phe Ala Asp Leu Gly Gly Asp
645 650 655
Ser Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala Asn Leu Leu His Asp Val Phe Glu
660 665 670
Val Glu Val Pro Val Arg Ile Ile Ile Gly Pro Thr Ala Ser Leu Ala
675 680 685
Gly Ile Ala Lys His Ile Glu Ala Glu Arg Ala Gly Ala Ser Ala Pro
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Thr Ala Ala Ser Val His Gly Ala Gly Ala Thr Arg Ile Arg Ala Ser
705 710 715 720
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Leu Arg Glu Ala His Asp Trp Cys Gly Leu Pro Val Ser Val Phe Arg
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Asp Val Ile Val Lys Tyr Ile Ser Asn Leu Gln Met Leu Gly Leu Leu
1155 1160 1165
<210> 6
<211> 1185
<212> PRT
<213> 马赛分枝杆菌
<400> 6
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195 200 205
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210 215 220
Ala Val Ile Ala Arg Gly Ala Ala Leu Pro Ala Ala Pro Leu Tyr Ala
225 230 235 240
Pro Ser Ala Gly Asp Asp Pro Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly
245 250 255
Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met His Ser Glu Asn Ile Val Arg
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Leu Gly Tyr Phe Ser Thr Asp Lys Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu
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Leu Lys Thr Asp Gly Met Phe Leu Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Val
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485 490 495
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500 505 510
Asn Val Leu Lys Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Ala Val Ala Thr Leu
515 520 525
Glu Ala Glu Tyr Ala Asn Ser Pro Val Val His Gln Ile Tyr Val Tyr
530 535 540
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Tyr Leu Leu Ala Val Val Val Pro Thr Pro
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Glu Ala Val Ala Ala Ala Lys Gly Asp Ala Ala Ala Leu Lys Thr Thr
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Ile Ala Asp Ser Leu Gln Asp Ile Ala Lys Glu Ile Gln Leu Gln Ser
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595 600 605
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Lys Pro Ala Leu Glu Thr Val Leu Lys Ala Ala Gln Ala Leu Leu Gly
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Val Ser Ser Ala Glu Leu Ala Ala Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly
675 680 685
Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Ser Phe Ser Asp Leu Leu Arg Asp Ile
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Phe Ala Val Glu Val Pro Val Gly Val Ile Val Ser Ala Ala Asn Asp
705 710 715 720
Leu Gly Gly Val Ala Lys Phe Val Asp Glu Gln Arg His Ser Gly Gly
725 730 735
Thr Arg Pro Thr Ala Glu Thr Val His Gly Ala Gly His Thr Glu Ile
740 745 750
Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile Asp Glu Ala Thr Leu
755 760 765
His Ala Ala Pro Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Ile Pro His Thr Val
770 775 780
Leu Leu Thr Gly Ser Asn Gly Tyr Leu Gly His Tyr Leu Ala Leu Glu
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820 825 830
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835 840 845
Lys His Leu Glu Val Leu Ala Gly Asp Ile Gly Asp Pro Asn Leu Gly
850 855 860
Leu Asp Ala Asp Thr Trp Gln Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Val Ile
865 870 875 880
Val His Pro Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Asn Gln Leu
885 890 895
Phe Gly Pro Asn Val Val Gly Thr Ala Glu Ile Ile Lys Leu Ala Ile
900 905 910
Thr Thr Lys Ile Lys Pro Val Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ala Val Ala
915 920 925
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930 935 940
Ile Ser Ala Val Arg Pro Ile Asp Asp Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly
945 950 955 960
Asn Ala Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu
965 970 975
Cys Gly Leu Pro Val Ala Val Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His
980 985 990
Ser Arg Tyr Thr Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp Gln Phe Thr Arg Leu
995 1000 1005
Ile Leu Ser Leu Ile Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Gln
1010 1015 1020
Ala Gln Thr Thr Gly Glu Arg Pro Leu Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro
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Gly Asp Phe Thr Ala Glu Ala Ile Thr Thr Leu Gly Thr Gln Val Pro
1045 1050 1055
Glu Gly Ser Glu Gly Phe Val Thr Tyr Asp Cys Val Asn Pro His Ala
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Asp Gly Ile Ser Leu Asp Asn Phe Val Asp Trp Leu Ile Glu Ala Gly
1075 1080 1085
Tyr Pro Ile Ala Arg Ile Asp Asn Tyr Thr Glu Trp Phe Thr Arg Phe
1090 1095 1100
Asp Thr Ala Ile Arg Gly Leu Ser Glu Lys Gln Lys Gln His Ser Leu
1105 1110 1115 1120
Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Glu Gln Pro Ser Ala Ala Glu Asn His
1125 1130 1135
Gly Val Val Pro Ala Lys Arg Phe Gln His Ala Val Gln Ala Ala Gly
1140 1145 1150
Ile Gly Pro Val Gly Gln Asp Gly Thr Thr Asp Ile Pro His Leu Ser
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Arg Arg Leu Ile Val Lys Tyr Ala Lys Asp Leu Glu Gln Leu Gly Leu
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Leu
1185
<210> 7
<211> 1186
<212> PRT
<213> Segniliparus rotundus
<400> 7
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Arg Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu Leu Leu Ala Thr Asp Pro Gln Ala
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Gly Leu Arg Leu Ala Glu Arg Val Asp Ala Ile Leu Ser Gly Tyr Ala
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65 70 75 80
Ile Thr Gly Arg Ser Ser Val Glu Leu Leu Pro Thr Phe Asp Thr Ile
85 90 95
Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Glu Arg Ala Thr Ala Ile Ala Ser Asp Leu
100 105 110
Ala His His Pro Gln Ala Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Leu Ala Ser
115 120 125
Ile Gly Phe Ile Ser Val Asp Tyr Val Ala Ile Asp Ile Ala Gly Val
130 135 140
Phe Ala Gly Leu Thr Ala Val Pro Leu Gln Thr Gly Ala Thr Leu Ala
145 150 155 160
Thr Leu Thr Ala Ile Thr Ala Glu Thr Ala Pro Thr Leu Phe Ala Ala
165 170 175
Ser Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Val Asp Ala Val Leu Ala Thr Pro
180 185 190
Ser Val Arg Arg Leu Leu Val Phe Asp Tyr Arg Ala Gly Ser Asp Glu
195 200 205
Asp Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Arg Lys Ile Ala Asp Ala Gly
210 215 220
Ser Ser Val Leu Val Asp Val Leu Asp Glu Val Ile Ala Arg Gly Lys
225 230 235 240
Ser Ala Pro Lys Ala Pro Leu Pro Pro Ala Thr Asp Ala Gly Asp Asp
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys
260 265 270
Gly Ala Met Tyr Pro Glu Arg Asn Val Ala His Phe Trp Gly Gly Val
275 280 285
Trp Ala Ala Ala Phe Asp Glu Asp Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ile
290 295 300
Asn Ile Thr Phe Leu Pro Leu Ser His Val Ala Ser Arg Leu Ser Leu
305 310 315 320
Met Pro Thr Leu Ala Arg Gly Gly Leu Met His Phe Val Ala Lys Ser
325 330 335
Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Lys Leu Ala Arg Pro Thr Asn
340 345 350
Leu Phe Leu Val Pro Arg Val Val Glu Met Leu Tyr Gln His Tyr Gln
355 360 365
Ser Glu Leu Asp Arg Arg Gly Val Gln Asp Gly Thr Arg Glu Ala Glu
370 375 380
Ala Val Lys Asp Asp Leu Arg Thr Gly Leu Leu Gly Gly Arg Ile Leu
385 390 395 400
Thr Ala Gly Phe Gly Ser Ala Pro Leu Ser Ala Glu Leu Ala Gly Phe
405 410 415
Ile Glu Ser Leu Leu Gln Ile His Leu Val Asp Gly Tyr Gly Ser Thr
420 425 430
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435 440 445
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515 520 525
Gln Gly Glu Phe Val Thr Leu Ala Lys Leu Glu Ala Ala Tyr Ser Ser
530 535 540
Ser Pro Leu Val Arg Gln Leu Phe Val Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Ser
545 550 555 560
Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Pro Asp Ala Leu Lys Lys Phe
565 570 575
Gly Val Gly Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Gly Glu Ser Leu Gln Lys
580 585 590
Ile Ala Arg Asp Glu Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Arg Asp Phe
595 600 605
Ile Ile Glu Thr Asp Pro Phe Thr Val Glu Asn Gly Leu Leu Ser Asp
610 615 620
Ala Arg Lys Ser Leu Arg Pro Lys Leu Lys Glu His Tyr Gly Glu Arg
625 630 635 640
Leu Glu Ala Met Tyr Lys Glu Leu Ala Asp Gly Gln Ala Asn Glu Leu
645 650 655
Arg Asp Ile Arg Arg Gly Val Gln Gln Arg Pro Thr Leu Glu Thr Val
660 665 670
Arg Arg Ala Ala Ala Ala Met Leu Gly Ala Ser Ala Ala Glu Ile Lys
675 680 685
Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu
690 695 700
Thr Phe Ser Asn Phe Leu His Asp Leu Phe Glu Val Asp Val Pro Val
705 710 715 720
Gly Val Ile Val Ser Ala Ala Asn Thr Leu Gly Ser Val Ala Glu His
725 730 735
Ile Asp Ala Gln Leu Ala Gly Gly Arg Ala Arg Pro Thr Phe Ala Thr
740 745 750
Val His Gly Lys Gly Ser Thr Thr Ile Lys Ala Ser Asp Leu Thr Leu
755 760 765
Asp Lys Phe Ile Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys His Leu Pro
770 775 780
Lys Pro Ala Asp Pro Pro Arg Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Asn Gly
785 790 795 800
Trp Leu Gly Arg Phe Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu Arg Leu Ala Pro
805 810 815
Ala Gly Gly Lys Leu Ile Thr Ile Val Arg Gly Lys Asp Ala Ala Gln
820 825 830
Ala Lys Ala Arg Leu Asp Ala Ala Tyr Glu Ser Gly Asp Pro Lys Leu
835 840 845
Ala Gly His Tyr Gln Asp Leu Ala Ala Thr Thr Leu Glu Val Leu Ala
850 855 860
Gly Asp Phe Ser Glu Pro Arg Leu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Trp Asn
865 870 875 880
Arg Leu Ala Asp Glu Val Asp Phe Ile Ser His Pro Gly Ala Leu Val
885 890 895
Asn His Val Leu Pro Tyr Asn Gln Leu Phe Gly Pro Asn Val Ala Gly
900 905 910
Val Ala Glu Ile Ile Lys Leu Ala Ile Thr Thr Arg Ile Lys Pro Val
915 920 925
Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ala Val Ala Ala Gly Val Glu Pro Ser Ala
930 935 940
Leu Asp Glu Asp Gly Asp Ile Arg Thr Val Ser Ala Glu Arg Ser Val
945 950 955 960
Asp Glu Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Gly Gly Glu
965 970 975
Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Arg Thr Gly Leu Pro Val Arg Val
980 985 990
Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His Gln Lys Tyr Thr Gly Gln Val
995 1000 1005
Asn Ala Thr Asp Gln Phe Thr Arg Leu Val Gln Ser Leu Leu Ala Thr
1010 1015 1020
Gly Leu Ala Pro Lys Ser Phe Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Gly Asn Arg
1025 1030 1035 1040
Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Ile Pro Val Asp Phe Thr Ala Glu Ser
1045 1050 1055
Ile Thr Thr Leu Gly Gly Asp Gly Leu Glu Gly Tyr Arg Ser Tyr Asn
1060 1065 1070
Val Phe Asn Pro His Arg Asp Gly Val Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp
1075 1080 1085
Trp Leu Ile Glu Ala Gly His Pro Ile Thr Arg Ile Asp Asp Tyr Asp
1090 1095 1100
Gln Trp Leu Ser Arg Phe Glu Thr Ser Leu Arg Gly Leu Pro Glu Ser
1105 1110 1115 1120
Lys Arg Gln Ala Ser Val Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Ala Arg Pro
1125 1130 1135
Gly Pro Ala Val Asp Gly Ser Pro Phe Arg Asn Thr Val Phe Arg Thr
1140 1145 1150
Asp Val Gln Lys Ala Lys Ile Gly Ala Glu His Asp Ile Pro His Leu
1155 1160 1165
Gly Lys Ala Leu Val Leu Lys Tyr Ala Asp Asp Ile Lys Gln Leu Gly
1170 1175 1180
Leu Leu
1185
<210> 8
<211> 382
<212> PRT
<213>荧光假单胞菌
<400> 8
Met Gln Ile Gln Gly His Tyr Glu Leu Gln Phe Glu Ala Val Arg Glu
1 5 10 15
Ala Phe Ala Ala Leu Phe Asp Asp Pro Gln Glu Arg Gly Ala Gly Leu
20 25 30
Cys Ile Gln Ile Gly Gly Glu Thr Val Val Asp Leu Trp Ala Gly Thr
35 40 45
Ala Asp Lys Asp Gly Thr Glu Ala Trp His Ser Asp Thr Ile Val Asn
50 55 60
Leu Phe Ser Cys Thr Lys Thr Phe Thr Ala Val Thr Ala Leu Gln Leu
65 70 75 80
Val Ala Glu Gly Lys Leu Gln Leu Asp Ala Pro Val Ala Asn Tyr Trp
85 90 95
Pro Glu Phe Ala Ala Ala Gly Lys Glu Ala Ile Thr Leu Arg Gln Leu
100 105 110
Leu Cys His Gln Ala Gly Leu Pro Ala Ile Arg Glu Met Leu Pro Thr
115 120 125
Glu Ala Leu Tyr Asp Trp Arg Leu Met Val Asp Thr Leu Ala Ala Glu
130 135 140
Ala Pro Trp Trp Thr Pro Gly Gln Gly His Gly Tyr Glu Ala Ile Thr
145 150 155 160
Tyr Gly Trp Leu Val Gly Glu Leu Leu Arg Arg Ala Asp Gly Arg Gly
165 170 175
Pro Gly Glu Ser Ile Val Ala Arg Val Ala Arg Pro Leu Gly Leu Asp
180 185 190
Phe His Val Gly Leu Ala Asp Glu Glu Phe Tyr Arg Val Ala His Ile
195 200 205
Ala Arg Ser Lys Gly Asn Met Gly Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Leu
210 215 220
Gln Val Met Met Arg Glu Pro Thr Ala Met Thr Thr Arg Ala Phe Ala
225 230 235 240
Asn Pro Pro Ser Ile Leu Thr Ser Thr Asn Lys Pro Glu Trp Arg Arg
245 250 255
Met Gln Gln Pro Ala Ala Asn Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Leu Ala
260 265 270
Gly Phe Tyr Ser Gly Leu Leu Asp Gly Ser Leu Leu Glu Ala Asp Met
275 280 285
Leu Glu Gln Leu Thr Arg Glu His Ser Ile Gly Pro Asp Lys Thr Leu
290 295 300
Leu Thr Gln Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Met Leu Asp Gln Gln Pro
305 310 315 320
Gln Leu Pro Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Pro Arg Ala Phe Gly His
325 330 335
Pro Arg Ser Ala Pro Val Val Arg Trp Val Leu Pro Glu His Asp Val
340 345 350
Ala Phe Gly Phe Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Leu Met Asp
355 360 365
Pro Arg Ala Gln Lys Leu Val Gly Ile Leu Ala Gly Cys Leu
370 375 380
<210> 9
<211> 246
<212> PRT
<213> 短乳杆菌
<400> 9
Met Ala Ala Asn Glu Phe Ser Glu Thr His Arg Val Val Tyr Tyr Glu
1 5 10 15
Ala Asp Asp Thr Gly Gln Leu Thr Leu Ala Met Leu Ile Asn Leu Phe
20 25 30
Val Leu Val Ser Glu Asp Gln Asn Asp Ala Leu Gly Leu Ser Thr Ala
35 40 45
Phe Val Gln Ser His Gly Val Gly Trp Val Val Thr Gln Tyr His Leu
50 55 60
His Ile Asp Glu Leu Pro Arg Thr Gly Ala Gln Val Thr Ile Lys Thr
65 70 75 80
Arg Ala Thr Ala Tyr Asn Arg Tyr Phe Ala Tyr Arg Glu Tyr Trp Leu
85 90 95
Leu Asp Asp Ala Gly Gln Val Leu Ala Tyr Gly Glu Gly Ile Trp Val
100 105 110
Thr Met Ser Tyr Ala Thr Arg Lys Ile Thr Thr Ile Pro Ala Glu Val
115 120 125
Met Ala Pro Tyr His Ser Glu Glu Gln Thr Arg Leu Pro Arg Leu Pro
130 135 140
Arg Pro Asp His Phe Asp Glu Ala Val Asn Gln Thr Leu Lys Pro Tyr
145 150 155 160
Thr Val Arg Tyr Phe Asp Ile Asp Gly Asn Gly His Val Asn Asn Ala
165 170 175
His Tyr Phe Asp Trp Met Leu Asp Val Leu Pro Ala Thr Phe Leu Arg
180 185 190
Ala His His Pro Thr Asp Val Lys Ile Arg Phe Glu Asn Glu Val Gln
195 200 205
Tyr Gly His Gln Val Thr Ser Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Leu Thr
210 215 220
Thr Gln His Met Ile Lys Val Gly Asp Leu Thr Ala Val Lys Ala Thr
225 230 235 240
Ile Gln Trp Asp Asn Arg
245
<210> 10
<211> 261
<212> PRT
<213> 植物乳杆菌
<400> 10
Met Ala Thr Leu Gly Ala Asn Ala Ser Leu Tyr Ser Glu Gln His Arg
1 5 10 15
Ile Thr Tyr Tyr Glu Cys Asp Arg Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr
20 25 30
Leu Ile Asp Ile Ala Val Leu Ala Ser Glu Asp Gln Ser Asp Ala Leu
35 40 45
Gly Leu Thr Thr Glu Met Val Gln Ser His Gly Val Gly Trp Val Val
50 55 60
Thr Gln Tyr Ala Ile Asp Ile Thr Arg Met Pro Arg Gln Asp Glu Val
65 70 75 80
Val Thr Ile Ala Val Arg Gly Ser Ala Tyr Asn Pro Tyr Phe Ala Tyr
85 90 95
Arg Glu Phe Trp Ile Arg Asp Ala Asp Gly Gln Gln Leu Ala Tyr Ile
100 105 110
Thr Ser Ile Trp Val Met Met Ser Gln Thr Thr Arg Arg Ile Val Lys
115 120 125
Ile Leu Pro Glu Leu Val Ala Pro Tyr Gln Ser Glu Val Val Lys Arg
130 135 140
Ile Pro Arg Leu Pro Arg Pro Ile Ser Phe Glu Ala Thr Asp Thr Thr
145 150 155 160
Ile Thr Lys Pro Tyr His Val Arg Phe Phe Asp Ile Asp Pro Asn Arg
165 170 175
His Val Asn Asn Ala His Tyr Phe Asp Trp Leu Val Asp Thr Leu Pro
180 185 190
Ala Thr Phe Leu Leu Gln His Asp Leu Val His Val Asp Val Arg Tyr
195 200 205
Glu Asn Glu Val Lys Tyr Gly Gln Thr Val Thr Ala His Ala Asn Ile
210 215 220
Leu Pro Ser Glu Val Ala Asp Gln Val Thr Thr Ser His Leu Ile Glu
225 230 235 240
Val Asp Asp Glu Lys Cys Cys Glu Val Thr Ile Gln Trp Arg Thr Leu
245 250 255
Pro Glu Pro Ile Gln
260
<210> 11
<211> 397
<212> PRT
<213> 齿垢密螺旋体
<400> 11
Met Ile Val Lys Pro Met Val Arg Asn Asn Ile Cys Leu Asn Ala His
1 5 10 15
Pro Gln Gly Cys Lys Lys Gly Val Glu Asp Gln Ile Glu Tyr Thr Lys
20 25 30
Lys Arg Ile Thr Ala Glu Val Lys Ala Gly Ala Lys Ala Pro Lys Asn
35 40 45
Val Leu Val Leu Gly Cys Ser Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Ser Arg Ile
50 55 60
Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Gly Val Ser Phe Glu
65 70 75 80
Lys Ala Gly Ser Glu Thr Lys Tyr Gly Thr Pro Gly Trp Tyr Asn Asn
85 90 95
Leu Ala Phe Asp Glu Ala Ala Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Ser Val Thr
100 105 110
Ile Asp Gly Asp Ala Phe Ser Asp Glu Ile Lys Ala Gln Val Ile Glu
115 120 125
Glu Ala Lys Lys Lys Gly Ile Lys Phe Asp Leu Ile Val Tyr Ser Leu
130 135 140
Ala Ser Pro Val Arg Thr Asp Pro Asp Thr Gly Ile Met His Lys Ser
145 150 155 160
Val Leu Lys Pro Phe Gly Lys Thr Phe Thr Gly Lys Thr Val Asp Pro
165 170 175
Phe Thr Gly Glu Leu Lys Glu Ile Ser Ala Glu Pro Ala Asn Asp Glu
180 185 190
Glu Ala Ala Ala Thr Val Lys Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Glu Arg
195 200 205
Trp Ile Lys Gln Leu Ser Lys Glu Gly Leu Leu Glu Glu Gly Cys Ile
210 215 220
Thr Leu Ala Tyr Ser Tyr Ile Gly Pro Glu Ala Thr Gln Ala Leu Tyr
225 230 235 240
Arg Lys Gly Thr Ile Gly Lys Ala Lys Glu His Leu Glu Ala Thr Ala
245 250 255
His Arg Leu Asn Lys Glu Asn Pro Ser Ile Arg Ala Phe Val Ser Val
260 265 270
Asn Lys Gly Leu Val Thr Arg Ala Ser Ala Val Ile Pro Val Ile Pro
275 280 285
Leu Tyr Leu Ala Ser Leu Phe Lys Val Met Lys Glu Lys Gly Asn His
290 295 300
Glu Gly Cys Ile Glu Gln Ile Thr Arg Leu Tyr Ala Glu Arg Leu Tyr
305 310 315 320
Arg Lys Asp Gly Thr Ile Pro Val Asp Glu Glu Asn Arg Ile Arg Ile
325 330 335
Asp Asp Trp Glu Leu Glu Glu Asp Val Gln Lys Ala Val Ser Ala Leu
340 345 350
Met Glu Lys Val Thr Gly Glu Asn Ala Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ala
355 360 365
Gly Tyr Arg His Asp Phe Leu Ala Ser Asn Gly Phe Asp Val Glu Gly
370 375 380
Ile Asn Tyr Glu Ala Glu Val Glu Arg Phe Asp Arg Ile
385 390 395
<210> 12
<211> 539
<212> PRT
<213> 细小裸藻
<400> 12
Met Ser Cys Pro Ala Ser Pro Ser Ala Ala Val Val Ser Ala Gly Ala
1 5 10 15
Leu Cys Leu Cys Val Ala Thr Val Leu Leu Ala Thr Gly Ser Asn Pro
20 25 30
Thr Ala Leu Ser Thr Ala Ser Thr Arg Ser Pro Thr Ser Leu Val Arg
35 40 45
Gly Val Asp Arg Gly Leu Met Arg Pro Thr Thr Ala Ala Ala Leu Thr
50 55 60
Thr Met Arg Glu Val Pro Gln Met Ala Glu Gly Phe Ser Gly Glu Ala
65 70 75 80
Thr Ser Ala Trp Ala Ala Ala Gly Pro Gln Trp Ala Ala Pro Leu Val
85 90 95
Ala Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Leu Trp Trp Trp Ala Ala Arg Arg
100 105 110
Ser Val Arg Arg Pro Leu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Pro Thr Ala Val
115 120 125
Thr His Leu Ala Pro Pro Met Ala Met Phe Thr Thr Thr Ala Lys Val
130 135 140
Ile Gln Pro Lys Ile Arg Gly Phe Ile Cys Thr Thr Thr His Pro Ile
145 150 155 160
Gly Cys Glu Lys Arg Val Gln Glu Glu Ile Ala Tyr Ala Arg Ala His
165 170 175
Pro Pro Thr Ser Pro Gly Pro Lys Arg Val Leu Val Ile Gly Cys Ser
180 185 190
Thr Gly Tyr Gly Leu Ser Thr Arg Ile Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gln
195 200 205
Ala Ala Thr Leu Gly Val Phe Leu Ala Gly Pro Pro Thr Lys Gly Arg
210 215 220
Pro Ala Ala Ala Gly Trp Tyr Asn Thr Val Ala Phe Glu Lys Ala Ala
225 230 235 240
Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Ser Leu Asn Gly Asp Ala Phe Asp
245 250 255
Ser Thr Thr Lys Ala Arg Thr Val Glu Ala Ile Lys Arg Asp Leu Gly
260 265 270
Thr Val Asp Leu Val Val Tyr Ser Ile Ala Ala Pro Lys Arg Thr Asp
275 280 285
Pro Ala Thr Gly Val Leu His Lys Ala Cys Leu Lys Pro Ile Gly Ala
290 295 300
Thr Tyr Thr Asn Arg Thr Val Asn Thr Asp Lys Ala Glu Val Thr Asp
305 310 315 320
Val Ser Ile Glu Pro Ala Ser Pro Glu Glu Ile Ala Asp Thr Val Lys
325 330 335
Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Glu Leu Trp Ile Gln Ala Leu Ser Glu
340 345 350
Ala Gly Val Leu Ala Glu Gly Ala Lys Thr Val Ala Tyr Ser Tyr Ile
355 360 365
Gly Pro Glu Met Thr Trp Pro Val Tyr Trp Ser Gly Thr Ile Gly Glu
370 375 380
Ala Lys Lys Asp Val Glu Lys Ala Ala Lys Arg Ile Thr Gln Gln Tyr
385 390 395 400
Gly Cys Pro Ala Tyr Pro Val Val Ala Lys Ala Leu Val Thr Gln Ala
405 410 415
Ser Ser Ala Ile Pro Val Val Pro Leu Tyr Ile Cys Leu Leu Tyr Arg
420 425 430
Val Met Lys Glu Lys Gly Thr His Glu Gly Cys Ile Glu Gln Met Val
435 440 445
Arg Leu Leu Thr Thr Lys Leu Tyr Pro Glu Asn Gly Ala Pro Ile Val
450 455 460
Asp Glu Ala Gly Arg Val Arg Val Asp Asp Trp Glu Met Ala Glu Asp
465 470 475 480
Val Gln Gln Ala Val Lys Asp Leu Trp Ser Gln Val Ser Thr Ala Asn
485 490 495
Leu Lys Asp Ile Ser Asp Phe Ala Gly Tyr Gln Thr Glu Phe Leu Arg
500 505 510
Leu Phe Gly Phe Gly Ile Asp Gly Val Asp Tyr Asp Gln Pro Val Asp
515 520 525
Val Glu Ala Asp Leu Pro Ser Ala Ala Gln Gln
530 535
<210> 13
<211> 269
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 13
Met Ile Asn Lys Thr Leu Leu Gln Lys Arg Phe Asn Gly Ala Ala Val
1 5 10 15
Ser Tyr Asp Arg Tyr Ala Asn Val Gln Lys Lys Met Ala His Ser Leu
20 25 30
Leu Ser Ile Leu Lys Glu Arg Tyr Ser Glu Thr Ala Ser Ile Arg Ile
35 40 45
Leu Glu Leu Gly Cys Gly Thr Gly Tyr Val Thr Glu Gln Leu Ser Lys
50 55 60
Leu Phe Pro Lys Ser His Ile Thr Ala Val Asp Phe Ala Glu Ser Met
65 70 75 80
Ile Ala Ile Ala Gln Thr Arg Gln Asn Val Lys Asn Val Thr Phe His
85 90 95
Cys Glu Asp Ile Glu Arg Leu Arg Leu Glu Glu Ser Tyr Asp Val Ile
100 105 110
Ile Ser Asn Ala Thr Phe Gln Trp Leu Asn Asn Leu Gln Gln Val Leu
115 120 125
Arg Asn Leu Phe Gln His Leu Ser Ile Asp Gly Ile Leu Leu Phe Ser
130 135 140
Thr Phe Gly His Glu Thr Phe Gln Glu Leu His Ala Ser Phe Gln Arg
145 150 155 160
Ala Lys Glu Glu Arg Asn Ile Lys Asn Glu Thr Ser Ile Gly Gln Arg
165 170 175
Phe Tyr Ser Lys Asp Gln Leu Leu His Ile Cys Lys Ile Glu Thr Gly
180 185 190
Asp Val His Val Ser Glu Thr Cys Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Glu Val
195 200 205
Lys Glu Phe Leu His Ser Ile Arg Lys Val Gly Ala Thr Asn Ser Asn
210 215 220
Glu Gly Ser Tyr Cys Gln Ser Pro Ser Leu Phe Arg Ala Met Leu Arg
225 230 235 240
Ile Tyr Glu Arg Asp Phe Thr Gly Asn Glu Gly Ile Met Ala Thr Tyr
245 250 255
His Ala Leu Phe Ile His Ile Thr Lys Glu Gly Lys Arg
260 265
<210> 14
<211> 132
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 14
Met Ser Thr Thr His Asn Val Pro Gln Gly Asp Leu Val Leu Arg Thr
1 5 10 15
Leu Ala Met Pro Ala Asp Thr Asn Ala Asn Gly Asp Ile Phe Gly Gly
20 25 30
Trp Leu Met Ser Gln Met Asp Ile Gly Gly Ala Ile Leu Ala Lys Glu
35 40 45
Ile Ala His Gly Arg Val Val Thr Val Arg Val Glu Gly Met Thr Phe
50 55 60
Leu Arg Pro Val Ala Val Gly Asp Val Val Cys Cys Tyr Ala Arg Cys
65 70 75 80
Val Gln Lys Gly Thr Thr Ser Val Ser Ile Asn Ile Glu Val Trp Val
85 90 95
Lys Lys Val Ala Ser Glu Pro Ile Gly Gln Arg Tyr Lys Ala Thr Glu
100 105 110
Ala Leu Phe Lys Tyr Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Lys Pro Arg Ala
115 120 125
Leu Pro Val Glu
130
<210> 15
<211> 286
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 15
Met Ser Gln Ala Leu Lys Asn Leu Leu Thr Leu Leu Asn Leu Glu Lys
1 5 10 15
Ile Glu Glu Gly Leu Phe Arg Gly Gln Ser Glu Asp Leu Gly Leu Arg
20 25 30
Gln Val Phe Gly Gly Gln Val Val Gly Gln Ala Leu Tyr Ala Ala Lys
35 40 45
Glu Thr Val Pro Glu Glu Arg Leu Val His Ser Phe His Ser Tyr Phe
50 55 60
Leu Arg Pro Gly Asp Ser Lys Lys Pro Ile Ile Tyr Asp Val Glu Thr
65 70 75 80
Leu Arg Asp Gly Asn Ser Phe Ser Ala Arg Arg Val Ala Ala Ile Gln
85 90 95
Asn Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Met Thr Ala Ser Phe Gln Ala Pro Glu
100 105 110
Ala Gly Phe Glu His Gln Lys Thr Met Pro Ser Ala Pro Ala Pro Asp
115 120 125
Gly Leu Pro Ser Glu Thr Gln Ile Ala Gln Ser Leu Ala His Leu Leu
130 135 140
Pro Pro Val Leu Lys Asp Lys Phe Ile Cys Asp Arg Pro Leu Glu Val
145 150 155 160
Arg Pro Val Glu Phe His Asn Pro Leu Lys Gly His Val Ala Glu Pro
165 170 175
His Arg Gln Val Trp Ile Arg Ala Asn Gly Ser Val Pro Asp Asp Leu
180 185 190
Arg Val His Gln Tyr Leu Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Leu Asn Phe Leu
195 200 205
Pro Val Ala Leu Gln Pro His Gly Ile Gly Phe Leu Glu Pro Gly Ile
210 215 220
Gln Ile Ala Thr Ile Asp His Ser Met Trp Phe His Arg Pro Phe Asn
225 230 235 240
Leu Asn Glu Trp Leu Leu Tyr Ser Val Glu Ser Thr Ser Ala Ser Ser
245 250 255
Ala Arg Gly Phe Val Arg Gly Glu Phe Tyr Thr Gln Asp Gly Val Leu
260 265 270
Val Ala Ser Thr Val Gln Glu Gly Val Met Arg Asn His Asn
275 280 285
<210> 16
<211> 224
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 16
Met Lys Ile Tyr Gly Ile Tyr Met Asp Arg Pro Leu Ser Gln Glu Glu
1 5 10 15
Asn Glu Arg Phe Met Ser Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys
20 25 30
Arg Arg Phe Tyr His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp
35 40 45
Val Leu Val Arg Ser Val Ile Ser Arg Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser
50 55 60
Asp Ile Arg Phe Ser Thr Gln Glu Tyr Gly Lys Pro Cys Ile Pro Asp
65 70 75 80
Leu Pro Asp Ala His Phe Asn Ile Ser His Ser Gly Arg Trp Val Ile
85 90 95
Cys Ala Phe Asp Ser Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Lys Thr Lys
100 105 110
Pro Ile Ser Leu Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr
115 120 125
Ser Asp Leu Leu Ala Lys Asp Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Phe Tyr
130 135 140
His Leu Trp Ser Met Lys Glu Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gly Lys Gly
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Leu Asp Ser Phe Ser Val Arg Leu His Gln Asp Gly
165 170 175
Gln Val Ser Ile Glu Leu Pro Asp Ser His Ser Pro Cys Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Tyr Glu Val Asp Pro Gly Tyr Lys Met Ala Val Cys Ala Ala His
195 200 205
Pro Asp Phe Pro Glu Asp Ile Thr Met Val Ser Tyr Glu Glu Leu Leu
210 215 220
<210> 17
<211> 222
<212> PRT
<213> 诺卡氏菌属物种NRRL 5646
<400> 17
Met Ile Glu Thr Ile Leu Pro Ala Gly Val Glu Ser Ala Glu Leu Leu
1 5 10 15
Glu Tyr Pro Glu Asp Leu Lys Ala His Pro Ala Glu Glu His Leu Ile
20 25 30
Ala Lys Ser Val Glu Lys Arg Arg Arg Asp Phe Ile Gly Ala Arg His
35 40 45
Cys Ala Arg Leu Ala Leu Ala Glu Leu Gly Glu Pro Pro Val Ala Ile
50 55 60
Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Ile Trp Pro Arg Gly Val Val Gly
65 70 75 80
Ser Leu Thr His Cys Asp Gly Tyr Arg Ala Ala Ala Val Ala His Lys
85 90 95
Met Arg Phe Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Glu Pro His Ala Thr Leu
100 105 110
Pro Glu Gly Val Leu Asp Ser Val Ser Leu Pro Pro Glu Arg Glu Trp
115 120 125
Leu Lys Thr Thr Asp Ser Ala Leu His Leu Asp Arg Leu Leu Phe Cys
130 135 140
Ala Lys Glu Ala Thr Tyr Lys Ala Trp Trp Pro Leu Thr Ala Arg Trp
145 150 155 160
Leu Gly Phe Glu Glu Ala His Ile Thr Phe Glu Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Ala Asp Ser Gly Asn Gly Thr Phe His Ser Glu Leu Leu Val Pro Gly
180 185 190
Gln Thr Asn Asp Gly Gly Thr Pro Leu Leu Ser Phe Asp Gly Arg Trp
195 200 205
Leu Ile Ala Asp Gly Phe Ile Leu Thr Ala Ile Ala Tyr Ala
210 215 220

Claims (62)

1.在重组宿主中生物合成戊二酸甲酯的方法，所述方法包括使用至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽和至少一种具有硫酯酶活性的多肽在所述宿主中将丙二酰基-[acp]和丙二酰基-CoA中的至少一种酶促转化成戊二酸甲酯。
2.权利要求1的方法，其中使用所述至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-[acp]酶促转化成丙二酰基-[acp]甲酯。
3.权利要求2的方法，其中使用至少一种具有选自下组活性的多肽将丙二酰基-[acp]甲酯酶促转化成戊二酰基-[acp]甲酯：合酶活性、脱氢酶活性、脱水酶活性、和还原酶活性。
4.权利要求3的方法，其中使用所述至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化成戊二酸甲酯。
5.权利要求1的方法，其中使用所述至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-CoA酶促转化成丙二酰基-CoA甲酯。
6.权利要求5的方法，其中使用至少一种具有选自下组活性的多肽将丙二酰基-CoA甲酯酶促转化成戊二酰基-CoA甲酯：合酶活性、β-酮硫解酶活性、脱氢酶活性、水合酶活性、和还原酶活性。
7.权利要求6的方法，其中使用所述至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-CoA甲酯酶促转化成戊二酸甲酯。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽与SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
9.权利要求3、4、或6-8中任一项的方法，其中所述具有还原酶活性的多肽与SEQ IDNO:19或20中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
10.权利要求1-9中任一项的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽在所述宿主中将戊二酸甲酯酶促转化成戊二酸半醛甲酯。
11.权利要求1的方法，其进一步包括使用至少一种具有选自下组活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化成5-氧戊酸：羧酸还原酶活性和酯酶活性。
12.权利要求10的方法，其进一步包括使用至少一种具有酯酶活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化成5-羟基戊酸。
13.权利要求12的方法，其中所述具有酯酶活性的多肽与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
14.权利要求12或权利要求13的方法，其进一步包括使用至少一种具有脱氢酶活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化成5-羟基戊酸。
15.权利要求1-9中任一项的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有酯酶活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化成戊二酸。
16.权利要求15的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽和至少一种具有EC 1.1.1.-下分类的脱氢酶活性的多肽将戊二酸酶促转化成5-羟基戊酸。
17.权利要求10-14和16中任一项的方法，其中所述具有羧酸还原酶活性的多肽与SEQID NO:2-7中任一项中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述具有硫酯酶活性的多肽与SEQ ID NO:17、18、22、和23中任一项中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其进一步包括使用至少一种具有选自下组活性的多肽将5-羟基戊酸酶促转化成2,4-戊二烯酰基-CoA：CoA-转移酶活性、合酶活性、和脱水酶活性。
20.权利要求19的方法，其中(i)具有CoA-转移酶活性或合酶活性的多肽和(ii)具有脱水酶活性的多肽将5-羟基戊酸酶促转化成2,4-戊二烯酰基-CoA。
21.权利要求19或权利要求20的方法，其进一步包括使用至少一种具有选自下组活性的多肽将2,4-戊二烯酰基-CoA酶促转化成1,3丁二烯：水合酶活性、硫酯酶活性、脱羧酶活性、脱氢酶活性、CoA-转移酶活性、和脱水酶活性。
22.权利要求21的方法，其中所述具有硫酯酶活性的多肽与SEQ ID NO:14-15中中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
23.制备戊二酸的方法，所述方法包括(i)使用具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化成戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA甲酯成戊二酰基-CoA，和(ii)使用具有硫酯酶活性、可逆的CoA-连接酶活性、CoA-转移酶活性、酰化脱氢酶活性、醛脱氢酶活性、戊二酸半醛脱氢酶活性或琥珀酸-半醛脱氢酶活性的至少一种多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化成戊二酸。
24.权利要求23的方法，其中所述具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽与SEQID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
25.权利要求23或权利要求24的方法，其中使用具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化成戊二酸。
26.权利要求23或权利要求24的方法，其中使用具有可逆的CoA-连接酶活性或CoA-转移酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化成戊二酸。
27.权利要求23或权利要求24的方法，其中使用具有酰化脱氢酶活性、醛脱氢酶活性、戊二酸半醛脱氢酶活性、或琥珀酸-半醛脱氢酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化成戊二酸。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述宿主经受需氧或微需氧培养条件下的培养策略。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中经由氮、磷酸盐或氧限制在营养限制的条件下培养所述宿主。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中使用陶瓷膜保留所述宿主以在发酵期间维持高细胞密度。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中补料到发酵的主要碳源源自生物原料。
32.权利要求31的方法，其中所述生物原料是或源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟(condensed distillers'solubles)或城市废物。
33.权利要求1-30中任一项的方法，其中补料到发酵的主要碳源源自非生物原料。
34.权利要求33的方法，其中所述非生物原料是或源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、非挥发性残留物(NVR)或来自环己烷氧化过程的碱洗液(caustic wash)废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
35.权利要求1-34中任一项的方法，其中所述宿主是原核生物。
36.权利要求35的方法，其中所述原核生物选自下组：埃希氏菌属(Escherichia)；梭菌属(Clostridia)；棒状杆菌属(Corynebacteria)；贪铜菌属(Cupriavidus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；代尔夫特菌属(Delftia)；芽孢杆菌属(Bacilluss)；乳杆菌属(Lactobacillus)；乳球菌属(Lactococcus)；和红球菌属(Rhodococcus)。
37.权利要求36的方法，其中所述原核生物选自下组：大肠杆菌(Escherichia coli)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、克鲁佛梭菌(Clostridium kluyveri)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和马红球菌(Rhodococcus equi)。
38.权利要求1-34中任一项的方法，其中所述宿主是真核生物。
39.权利要求38的方法，其中所述真核生物选自下组：曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤氏酵属(Pichia)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Arxula、和克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)。
40.权利要求的方法39，其中所述真核生物选自下组：黑曲霉(Aspergillus niger)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、Arxula adenoinivorans、和乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述宿主展现出对高浓度C5构件块(buildingblock)的耐受性，并且其中经由在选择性环境中的连续培养改善所述对高浓度C5构件块的耐受性。
42.权利要求1-41中任一项的方法，其中所述宿主表达下列外源多肽中的一种或多种，所述外源多肽具有乙酰基-CoA合成酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶；转酮醇酶；反馈抗性苏氨酸脱氨酶；吡啶核苷酸转氢酶(puridine nucleotide transhydrogenase)；甲酸脱氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；丙酰基-CoA合成酶；L-丙氨酸脱氢酶；L-谷氨酸脱氢酶；L-谷氨酸合成酶；赖氨酸转运蛋白；二羧酸转运蛋白；和/或多药物转运蛋白活性。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中所述宿主包含一种或多种具有选自下组活性的多肽的弱化：聚羟基烷酸酯合酶、乙酰基-CoA硫酯酶、乙酰基-CoA特异性β-酮硫解酶、乙酰乙酰基-CoA还原酶、形成乙酸的磷酸乙酸转移酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、menaquinol-延胡索酸氧化还原酶、产生异丁醇的2-酮酸(oxoacid)脱羧酶、形成乙醇的醇脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、消散辅因子不平衡的转氢酶、对产生了不平衡的辅因子特异的谷氨酸脱氢酶、利用NADH/NADPH的谷氨酸脱氢酶、庚二酰基-CoA脱氢酶；接受C5构件块和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；戊二酰基-CoA脱氢酶；和庚二酰基-CoA合成酶。
44.重组宿主细胞，其包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽；和具有硫酯酶活性的多肽，所述宿主产生戊二酸甲酯。
45.权利要求44的宿主，所述宿主进一步包含具有羧酸还原酶活性的外源多肽，所述宿主进一步产生戊二酸半醛甲酯。
46.权利要求44或权利要求45的宿主，所述宿主进一步包含一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：合酶活性，脱氢酶活性，脱水酶活性和还原酶活性。
47.权利要求44或权利要求45的宿主，所述宿主进一步包括一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：合酶活性，β-酮硫解酶活性，脱氢酶活性，水合酶活性，和还原酶活性。
48.权利要求44-47中任一项的宿主，其中所述具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽与SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
49.权利要求44-48中任一项的宿主，其中所述具有硫酯酶活性的多肽与SEQ ID NO:17-18中任一项中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
50.权利要求46和47中任一项的宿主，其中所述具有还原酶活性的多肽与SEQ ID NO:19或20中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
51.权利要求44-50中任一项的宿主，所述宿主进一步包括具有酯酶活性的外源多肽，所述宿主进一步产生戊二酸或5-氧戊酸。
52.权利要求44-51中任一项的宿主，所述宿主包含一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：酯酶活性、6-羟基己酸脱氢酶活性、4-羟基丁酸脱氢酶活性、5-羟基戊酸脱氢酶活性和醇脱氢酶活性，所述宿主产生5-羟基戊酸。
53.权利要求52的宿主，其进一步包括一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：CoA-转移酶活性，合酶活性，和脱水酶活性，所述宿主从5-羟基戊酸产生2,4-戊二烯酰基-CoA。
54.权利要求53的宿主，其进一步包括一种或多种具有选自下组活性的外源多肽：水合酶活性，硫酯酶活性，脱羧酶活性，脱氢酶活性，CoA-转移酶活性和脱水酶活性，所述宿主从2,4-戊二烯酰基-CoA产生1,3-丁二烯。
55.权利要求54的宿主，其中所述具有硫酯酶活性的多肽与SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
56.权利要求45-54中任一项的宿主，其中所述具有羧酸还原酶活性的多肽与SEQ IDNO:2-7中任一项中列出的任一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
57.重组宿主，所述重组宿主包含至少一种外源核酸，其编码具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽，和至少一种具有选自下组活性的多肽：硫酯酶活性、可逆的CoA-连接酶活性、CoA-转移酶活性、酰化脱氢酶活性、醛脱氢酶活性、戊二酸半醛脱氢酶活性、和琥珀酸-半醛脱氢酶活性。
58.权利要求57的重组宿主，其中所述具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。
59.生物衍生的产物、基于生物的产物或发酵衍生的产物，其中所述产物包含：
i.组合物，所述组合物包含根据权利要求1-43中任一项，或图1-7中任一项的至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，或其任何组合，
ii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，其包含i.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物，或其任何组合，
iii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，其包含i.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或其任何组合或ii.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或其任何组合，
iv.成型物质，其通过使ii.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或iii.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂或其任何组合成型获得，
v.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的配制剂，其包含i.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物、i.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物、ii.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物、iii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，或iv的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的成型物质，或其任何组合，或
vi.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体流，其包含i.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物、i.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物、ii.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物、iii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，v.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的配制剂，或iv的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的成型物质，或其任何组合。
60.提高具有羧酸还原酶活性的多肽对取代的或未取代的C4-C8二羧酸的活性的方法，所述方法包括使用具有丙二酰基-CoA甲基转移酶活性的多肽将所述C4-C8二羧酸酶促转化成HOC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酯，之后使用具有羧酸还原酶活性的多肽将所述HOC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酯酶促转化成HC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3。
61.权利要求的方法60，其进一步包括使用具有脱氢酶活性的多肽将所述HC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3转化成HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3。
62.权利要求的方法61，其进一步包括使用具有酯酶活性的多肽将所述HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酶促转化成HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OH。
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