KR20170134682A

KR20170134682A - 향상된 크로틸 알코올 생성을 위한 유전자조작 미생물 및 방법

Info

Publication number: KR20170134682A
Application number: KR1020177032150A
Authority: KR
Inventors: 스테파니 제이 쿨러; 니콜라스 이클리; 케빈 그레고리 호프; 로빈 이 오스테라우트; 프리티 파르캬; 에릭 씨 랄프; 디엔 스티븐 반
Original assignee: 게노마티카 인코포레이티드
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-07
Publication date: 2017-12-06
Also published as: WO2016164586A1; CN107750276A; EP3280808B1; EP3280808A1; US20210277426A1; BR112017021667A2; US10844404B2; US20180135082A1

Abstract

본 발명은 크로틸 알코올의 생성을 증진하거나 향상시키는 방법 및 유전자조작 미생물을 개시한다. 유전자조작 미생물은 알코올 탈수소효소, 알켄 환원효소 또는 둘 다의 효소적 활성에 유전자 변형을 포함한다. 이러한 유전자 변형에 의해, 크로틸 알코올 생성 경로가 제공되거나 개선된다.

Description

향상된 크로틸 알코올 생성을 위한 유전자조작 미생물 및 방법

본 발명은 향상된 크로틸 알코올 생성을 위한 유전자조작 미생물 및 방법에 관한 것이다.

우선권 주장

본 출원은 2015년 4월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/145,290호를 우선권으로 주장하며, 그의 개시내용은 전체가 본원에 참고로 인용된다.

파일명이 GNO0025WO Sequence Listing_ST25이고 2016년 3월 29일에 생성되었으며 크기가 31 kb인 ASCII 텍스트 파일의 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.

크로토닐 알코올, 크로토놀 또는 부트-2-엔-1-올로도 지칭되는 크로틸 알코올은 화학식 C₄H₈O의 불포화된 알코올이고, 도 1에 도시되어 있다. 크로틸 알코올은 1,3-부타디엔을 비롯한 알켄, 크로틸 할라이드, 에스테르 및 에테르로의 전구체의 역할을 하는 중요한 화학적 중간산물이며, 이들은 다시 중합체, 미세 화학물질, 농업용 화학물질 및 약제학적 물질의 생성에서 화학적 중간산물이다.

증가된 크로틸 알코올을 생성하는 유전자조작 미생물은 석유-기반 생성에 대한 매력적인 대체물이다. 그러나, 이러한 알코올이 세포에 의해 생성되고 방출되는 경우, 이러한 알코올은 배양 동안 배지 내에 축적될 수 있다. 배양 배지 조건의 변화는, 박테리아와 같은 미생물이 일반적으로 낮은 알코올 내성을 가지기 때문에 미생물의 성장 및 생존력에 영향을 미칠 수 있다.

배양 동안 배지로부터의 알코올 제거는 이러한 문제점을 해결하는 하나의 방식이다. 그러나, 이러한 제거 과정은 비용이 많이 들고 비효율적일 수 있다. 또 다른 접근법은 보다 높은 알코올 수준에 대하여 내성을 나타내는 천연 박테리아 단리물의 사용이다. 그러나, 이러한 균주는 일반적으로, 공업용 생성 또는 유전자조작에 적합하지 않다.

본 발명은 크로틸 알코올을 바이오생성물(bioproduct)로서, 또는 다른 바이오생성물의 생성을 위한 중간산물로서 생성하는 방법, 및 유전자조작 미생물을 개시한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 유전자조작 미생물을 이용하는 바이오생성물의 생성 방법을 제공하며, 여기서 크로틸 알코올이 바이오생성물이거나, 크로틸 알코올이 바이오생성물 경로 중의 중간산물(예를 들어, 1,3-부타디엔, 1,3-부탄디올, 메틸 비닐 카르비놀)이고, 방법이

크로틸 알코올 생성을 유도하는 조건 하에서, 또는 바이오생성물 생성을 유도하는 바이오생성물 경로 중의 중간산물로서 크로틸 알코올의 사용 하에서, 유전자조작 미생물을 배양하는 단계로서, 유전자조작 미생물이 (a) 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키는 알코올 탈수소효소(ADH), (b) 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키는 ADH, 또는 (c) 크로톤알데히드를 부티르알데히드로 전환시키는 알켄 환원효소, 또는 (a), (b) 및 (c)의 임의의 조합에서 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 유발하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하는 것인 단계

를 포함한다.

일부 실시형태에서, 미생물은 바이오생성물 경로의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 바이오생성물 경로가 크로틸 알코올 경로이거나 크로틸 알코올을 바이오생성물 경로 중의 중간산물로서 사용한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 유전자조작 미생물로서, (a) 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키는 알코올 탈수소효소(ADH), (b) 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키는 ADH, 또는 (c) 크로톤알데히드를 부티르알데히드로 전환시키는 알켄 환원효소, 또는 (a), (b) 및 (c)의 임의의 조합에서 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 유발하는 적어도 하나의 유전자 변형, 및 바이오생성물 경로의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 유전자조작 미생물을 개시하며, 여기서 바이오생성물 경로가 크로틸 알코올 경로이거나, 크로틸 알코올을 바이오생성물 경로 중의 중간산물로서 사용한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 유전자조작 미생물을 이용하는 바이오생성물의 생성 방법을 제공하며, 여기서 크로틸 알코올이 바이오생성물이거나, 크로틸 알코올이 바이오생성물 경로 중의 중간산물(예를 들어, 1,3-부타디엔, 1,3-부탄디올, 메틸 비닐 카르비놀)이고, 방법이

(a) 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키는 알코올 탈수소효소(ADH), (b) 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키는 ADH, 또는 (c) 크로톤알데히드를 부티르알데히드로 전환시키는 알켄 환원효소, 또는 (a), (b) 및 (c)의 임의의 조합에서 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 유발하는 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 유전자조작 미생물을 제공하는 단계; 및

크로틸 알코올 생성을 유도하는 조건 하에서, 또는 바이오생성물 생성을 유도하는 바이오생성물 경로 중의 중간산물로서 크로틸 알코올의 사용 하에서, 유전자조작 미생물을 배양하는 단계

를 포함한다.

일부 실시형태에서, 활성이 부분적으로 또는 완전히 소실되는 알코올 탈수소효소 및 알켄 환원효소는 미생물에 내재성이고, 알코올 탈수소효소는 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키고/시키거나 부티르알데히드를 부탄올로 전환시킬 수 있고, 알켄 환원효소는 크로톤알데히드를 부티르알데히드로 전환시킬 수 있다. 이들 내재 활성들은, 이들 활성이, 크로틸 알코올 또는 크로틸 알코올-유래 바이오생성물로의 경로를 포함하는 바람직한 효소 활성들과 경쟁하는 경우, 바람직하지 못한 활성들인 것으로 확인된 바 있다.

미생물은 추가로, 특히 크로톤알데히드가 부산물이고 바이오생성물 경로 중간산물이 아닌 경우, 크로톤알데히드를 크로틸 알코올로 전환시키는 효소, 예를 들어 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성)의 활성을 증가시키도록 유전자 변형될 수 있다.

이러한 개시된 방법 및 유전자조작 미생물은, 유전자가 변형되지 않은 미생물보다 더 높은 크로틸 알코올 수준에서 성장할 수 있다. 이러한 미생물은 또한, 상당히 더 많은 크로틸 알코올을 생성할 수 있다. 또한, 개시된 방법 및 미생물은 바람직하지 못하거나 낭비적인 경로로의 크로틸 알코올을 감소시키거나 제거함으로써 크로틸 알코올 수율의 효율을 증가시키고/거나 공정 비용을 감소시킬 수 있다.

도 1은 크로틸 알코올의 생성, 및 그 크로틸 알코올을 통한 아세틸-CoA, 글루타코닐-CoA, 글루타릴-CoA, 3-아미노부티릴-CoA 또는 4-히드록시부티릴-CoA로부터의 부타디엔의 생성에 대한 예시적인 경로를 보여준다. 생성물에 대한 동정된 기질의 변환 효소로는, A. 아세틸-CoA:아세틸-CoA 아실전이효소, B. 아세토아세틸-CoA 환원효소, C. 3-히드록시부티릴-CoA 탈수화효소, D. 크로토닐-CoA 환원효소(알데히드 생성), E. 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성), F. 크로틸 알코올 키나아제, G. 2-부테닐-4-포스페이트 키나아제, H. 부타디엔 신타아제(synthase), I. 크로토닐-CoA 가수분해효소, 신테타아제(synthetase), 전이효소, J. 크로토네이트 환원효소, K. 크로토닐-CoA 환원효소(알코올 생성), L. 글루타코닐-CoA 탈카르복실화효소, M. 글루타릴-CoA 탈수소효소, N. 3-아미노부티릴-CoA 탈아미노효소, O. 4-히드록시부티릴-CoA 탈수화효소, P. 크로틸 알코올 디포스포키나아제가 있다.
도 2는 크로틸 알코올(2-부텐-1-올)을 3-부텐-2-올 및/또는 부타디엔으로 변환시키기 위한 예시적인 경로를 보여준다. 효소는 A. 크로틸 알코올 키나아제, B. 2-부테닐-4-포스페이트 키나아제, C. 부타디엔 신타아제, D. 3-부텐-2-올 신타아제, E. 3-부텐-2-올 신타아제, F. 크로틸 알코올 이성화효소, 비닐이성화효소, G. 3-부텐-2-올 탈수화효소, H. 크로틸 알코올 탈수화효소, 탈수화효소/비닐이성화효소, I. 크로틸 알코올 디포스포키나아제, J. (2-부테닐-4-포스페이트 유래의) 부타디엔 신타아제이다. 크로틸 알코올은 부타디엔으로 화학적으로 탈수화될 수 있다.
도 3은 크로틸 알코올을 부산물로 전환시키기 위한 반응(단계 C, 단계 G 및/또는 단계 H), 및 부산물인 크로톤알데히드를 크로틸 알코올로 전환시키기 위한 반응(단계 B)을 보여준다. 동정된 기질을 변환시키기 위한 효소로는, B. 알데히드 환원효소(알코올 생성)라고도 하는 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성), C. 크로틸 알코올 탈수소효소, G. 크로톤알데히드 환원효소(알켄 환원효소라고도 함), H. 부티르알데히드 환원효소(알코올 생성)가 있다.
도 4a 및 도 4b는 글루코스(도 4a) 및 글루코스 + 크로틸 알코올(도 4b) 상에서 성장한 이. 콜라이 균주 K-12 아주(substr.) MG1655 및 다양한 변형들의 성장 곡선을, 배양 시간에 대한 OD420-580에서의 배양물 혼탁도(culture turbidity)의 측면에서 보여준다.
도 5a 및 도 5b는 글루코스(도 5a) 및 글루코스 + 크로틸 알코올(도 5b) 상에서 성장한 이. 콜라이 균주 ATCC 8739 및 다양한 변형들의 성장 곡선을, 배양 시간에 대한 OD420-580에서의 배양물 혼탁도의 측면에서 보여준다.
도 6의 A∼D는 다양한 nemA 및 yqhD 결실된 균주들(3-GGGF, 3-GHDO, 3-HAEF, 3-HAEG)에서 크로틸 알코올 및 부탄올 측정을 보여준다.

본원에 기재된 본 발명의 실시형태는 철저하거나 하기 상세한 설명에 개시된 정확한 형태로 본 설명을 제한하려는 것이 아니다. 그보다는, 실시형태는, 당업자가 본 설명의 원리 및 실시를 인지하고 이해할 수 있도록 선택되고 기재되어 있다.

본원에 언급된 모든 공개 및 특허들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에 개시된 공개 및 특허들은 그 개시내용에 대해서만 제공된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알코올 탈수소효소"(ADH로도 지칭됨)는 크로틸 알코올을 크로톤알데히드 및/또는 부티르알데히드를 부탄올로 전환시킬 수 있는 효소를 지칭하고, EC 1.1.1로서 분류된 것들을 포함한다. 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키는 효소는 또한 본원에서, 크로틸 알코올 탈수소효소(크로틸 ADH)로도 지칭된다. 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키는 효소는 또한 본원에서, 부티르알데히드 환원효소(알코올 생성)로도 지칭된다.

용어 "알켄 환원효소"는 크로톤알데히드를 부티르알데히드로 전환시킬 수 있는 효소를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이오생성"은 미생물 합성을 지칭한다. 용어 "생성" 및 "생합성"은 요망되거나 참조된 성분 또는 생성물의 미생물 합성을 지칭하는 경우, 상호호환적으로 사용된다.

용어 "유전자조작된"은 참조된 종의 천연 균주, 야생형 균주 또는 부모 숙주 균주에서 정상적으로는 발견되지 않는 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 미생물 유기체 또는 미생물을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은, 숙주 미생물 유기체 내로 도입되는 참조된 분자 또는 참조된 활성을 지칭한다. 분자는 예를 들어, 코딩 핵산을 숙주 유전 물질 내에 도입, 예컨대 숙주 염색체 내에 통합함으로써 도입되거나, 플라스미드와 같은 비-염색체 유전 물질로서 도입될 수 있다. 따라서, 이러한 용어가 코딩 핵산의 발현에 관하여 사용되는 경우, 상기 용어는 발현 가능한 형태의 코딩 핵산을 미생물 유기체 내에 도입하는 것을 지칭한다. 이러한 용어가 생합성 활성 또는 바이오생성물에 관하여 사용되는 경우, 상기 용어는 부모 숙주 유기체 내에 도입되는 활성을 지칭한다. 공급원은 예를 들어, 부모 숙주 미생물 유기체 내에 도입 후, 참조된 활성을 발현하는 상동성(homologous) 또는 이종성(heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 이에, 외인성은, 변형의 부재 시와 상이한 내재성 유전자 또는 이의 코딩된 효소의 발현을 초래하는, 내재성 유전자의 조절 영역 또는 내재성 유전자의 조절 단백질에의 유전자 변형을 포함한다. 따라서, 용어 "내인성"은 숙주에 존재하는 참조된 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게는, 이러한 용어가 코딩 핵산의 발현에 관하여 사용되는 경우, 상기 용어는 미생물 유기체 내에 함유된 코딩 핵산의 발현을 지칭한다. 용어 "이종성"은 참조된 종 이외의 공급원으로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭하며, 반면, "상동성"은 숙주 미생물 유기체로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 이에, 개시된 코딩 핵산의 외인성 발현은 이종성 코딩 핵산 또는 상동성 코딩 핵산 중 어느 하나, 또는 둘 다를 이용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 변형"은, 핵산, 대사적 폴리펩타이드를 코딩하거나 발현하기 위해 결실 또는 도입되는 폴리펩타이드, 효소의 발현의 변경, 다른 핵산 첨가, 핵산 결실 및/또는 다른 기능적 파괴(other functional disruption)를 지칭한다. 이러한 변형은 예를 들어, 참조된 종에 대한 이종성, 상동성, 또는 이종성 및 상동성 둘 다인 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역 및 이의 기능성 단편에서 수행될 수 있다. 부가적인 변형은 예를 들어, 비-코딩 조절 영역을 포함하며, 이러한 영역에서의 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시킨다. 용어 "유전자 변경"은 유전자 변형과 상호호환적으로 사용된다.

용어 "대사적 변형"은 이의 천연 발생 상태로부터 변경되는 생화학적 반응을 지칭한다. 따라서, 유전자조작 미생물은 대사성 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 이의 기능성 단편에서 유전자 변형을 가질 수 있다.

용어 "미생물(microbial)," "미생물 유기체(microbial organism)" 또는 "미생물(microorganism)"은 미소 세포(microscopic cell)로서 존재하는 유기체를 지칭하며, 미세한 크기를 가진 원핵 세포, 진핵 세포 또는 유기체를 포함하고, 모든 종들의 박테리아, 고세균 및 진정세균뿐만 아니라 효모 및 진균류와 같은 진핵 미생물을 포함한다. 이러한 용어는 또한, 바이오생성물의 생성을 위해 배양될 수 있는 임의의 종의 세포를 포함한다.

용어 "부모 미생물 유기체" 또는 이의 문법적 등가물(및 부모 숙주 미생물, 또는 숙주 미생물 포함)은 유전자 변형의 맥락에서 사용되는 경우, 특정한 유전자 변형이 이루어지지는 않았지만 동일한 유전적 구성(makeup)을 가진 부모 미생물 또는 균주를 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 미생물 유기체의 균주가, 유전자 생성물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 수행하는 데 사용되는 경우, 부모 균주는 이종성 유전자가 도입되는 출발 균주일 것이다. 유사하게는, 유전자 파괴 또는 유전자 결실과 같이 발현을 감소시키기 위한 유전자 변형이 수행된 부모 미생물 유기체의 경우, 이러한 부모 미생물 유기체는 유전자 파괴 또는 결실을 제외하고는 동일한 유전적 배경을 가질 것이다. 그러나, 부모 미생물 유기체는, 단일 또는 다중 유전자 변형이 고려되는지의 여부에 따라, 유전자 첨가 및/또는 파괴인 1개 초과의 유전자 변형만큼 상이할 수 있는 것으로 이해된다. 당업자는, 이러한 부모 미생물 유기체의 의미를, 이러한 미생물 유기체가 당업계에서 이해되는 바와 같이 하나 이상의 유전자 변형의 효과를 관찰하기 위한 적절한 대조군인 것으로 여겨진다는 점에서 쉽게 이해할 것이다.

용어, "부분적인 소실," "감소된 활성" 등은, 부모 미생물 유기체 또는 이의 내재성 효소에서 측정된 수준보다 더 낮은 활성 수준을 나타내는 미생물의 효소 또는 단리된 효소를 지칭한다. 이 용어는 또한, 해당 효소적 활성의 제거(elimination)를 포함할 수 있다.

본 발명은 ADH 효소적 활성, 알켄 환원효소적 활성 또는 둘 다에 대한 유전자 변형을 가진 유전자조작 미생물을 개시한다. 이러한 유전자조작 미생물은, 개시된 유전자 변형을 갖지 않는 부모 숙주 균주 또는 미생물과 비교하여, 더 큰 크로틸 알코올 양(예를 들어 역가(titer))을 축적할 수 있고, 더 큰 크로틸 알코올 이용 가능성을 가질 뿐만 아니라, 더 높은 크로틸 알코올 수준에서 성장할 수 있다. 이러한 유전자조작 미생물은 크로틸 알코올의 발효 생산에 사용될 수 있다. 유전자조작 미생물은 또한, 개선된 크로틸 알코올 경로, 및 중간산물로서 크로틸 알코올을 통하는 다른 바이오생성물 경로를 제공하는 데 유용할 수 있다. 또한, 개시된 방법 및 미생물은, 크로틸 알코올을, 일부가 미생물의 건강상태에 악영향을 미칠 수 있는 원치 않는 대사산물 또는 중간산물로 전환시키는 바람직하지 못하거나 낭비적인 경로를 감소시키거나 제거함으로써 크로틸 알코올 수율의 효율을 증가시키고/거나 공정 비용을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 부모 균주와 비교하여 더 큰 크로틸 알코올 이용 가능성을 가짐으로써, 더 많은 크로틸 알코올이 관심 바이오생성물, 부타디엔, 1,3-부탄디올 또는 메틸 비닐 카르비놀, 또는 관심 바이오생성물로의 중간산물로 효소적으로 전환될 수 있다. 세포는 당업계에 알려진 방법 및 배지를 사용하여 적합한 배지 내에서 배양된다.

조작되어야 하는 부모 숙주 미생물 유기체로서 역할을 할 수 있는 예시적인 미생물로는 예를 들어, 메틸로토프(methylotoph), 또는 메틸로토프인 것으로 유전자조작 미생물을 포함하여 발효 공정에 적용 가능한 박테리아, 효모, 진균류 또는 여러 가지 다른 미생물들 중 임의의 미생물 등이 있다. 예시적인 박테리아로는, 아시네토박터(Acinetobacter), 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 안에로비오스피릴룸(Anaerobiospirillum), 악티노바실러스(Actinobacillus), 카스텔라멜라(Castellamella), 만하이미아(Mannheimia), 바실러스(Bacillus), 자이모모나스(Zymomonas), 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 클로스트리듐(Clostridium), 슈도모나스(Pseudomonas), 타우에라(Thauera) 및 자이모모나스로부터 선택되는 속(genus)이 있다.

다른 예시적인 박테리아로는, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라(Klebsiella oxytoca), 안에로비오스피릴룸 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 카스텔라멜라 캐니(Castellamella caeni), 카스텔라멜라 대제오넨시스(Castellamella daejeonensis), 카스텔라멜라 데프라그란스(Castellamella defragrans), 카스텔라멜라 데니트리피칸스(Castellamella denitrificans), 카스텔라멜라 긴센기솔리(Castellamella ginsengisoli), 카스텔라멜라 히루디니스(Castellamella hirudinis), 만하이미아 숙시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 타우에라 아미노아로마티카(Thauera aminoaromatica), 타우에라 아로마티카(Thauera aromatica), 타우에라 부타니보란스(Thauera butanivorans), 타우에라 클로로벤조이카(Thauera chlorobenzoica), 타우에라 휴미레두센스(Thauera humireducens), 타우에라 리날로올렌티스(Thauera linaloolentis), 타우에라 메쉐르니첸시스(Thauera mechernichensis), 타우에라 페닐아세티카(Thauera phenylacetica), 타우에라 셀렌아티스(Thauera selenatis), 타우에라 테르페니카(Thauera terpenica) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 선택되는 종이 있다.

예시적인 효모 또는 진균류로는, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마륵시아누스(Kluyveromyces marxianus), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리재(Rhizobus oryzae), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 등으로부터 선택되는 종이 있다.

이. 콜라이는 유전자 조작에 적합한 잘 특성화된 미생물 유기체이기 때문에, 특히 유용한 부모 숙주 유기체이다. 특히 유용한 다른 숙주 미생물로는 사카로마이세스 세레비시애와 같은 효모가 있다. 임의의 적합한 미생물은 대사적 변형 및/또는 유전자 변형을 도입하여 유전자조작 미생물을 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 유전자조작 미생물은 요망되는 바이오생성물을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 실시형태에서, 이. 콜라이로는, 균주 이. 콜라이 Str K-12 아주 MG1655 및 이. 콜라이 ATCC 8739 변이체가 있다. 일 실시형태에서, 숙주 유기체는 바실러스 서브틸리스가 아니다.

<알코올 탈수소효소>

일부 실시형태에서, ADH 활성을 코딩하는 유전자는 결실되거나 파괴된다. 유전자 결실 또는 파괴를 표적으로 하는 개시된 ADH 효소는 또한, 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH) 및/또는 NADPH를 전자 공여자로서 사용하는 ADH 효소를 포함한다.

일부 실시형태에서, 크로틸 알코올의 양 및/또는 크로틸 알코올에 대한 내성의 증가는, 크로톤알데히드로의 크로틸 알코올 및/또는 부탄올로의 부티르알데히드의 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 개시된 ADH 유전자의 파괴에 의해 유발될 수 있다.

ADH 활성의 결실은 ADH 활성의 감소 또는 부분적이거나 완전 소실을 초래하고, 도 3에서 효소 C로서 도시된 바와 같다. ADH의 결실은 (예를 들어 C 및/또는 H로서 도시된 바와 같이) 크로틸 알코올 방향으로 과정을 구동한다. 일부 실시형태에서, 결실되는 ADH 효소는 유전자조작 미생물에 고유하거나 내인성이다. 내재 활성은, 이들 활성이 크로틸 알코올 또는 크로틸 알코올-유래 바이오생성물을 포함하는 바람직한 효소 활성들과 경쟁하는 경우, 바람직하지 못한 활성으로서 동정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 크로틸 알코올을 크로톤알데히드 및/또는 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키기 위한 효소는 동일하다. 다른 실시형태에서, 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키기 위한 효소는 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키기 위한 효소와 상이하다.

표 1은 파괴되거나 결실될 수 있는 예시적인 ADH 유전자를 열거하고 있다.

파괴되거나 결실될 수 있는 다른 ADH 유전자는, 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 산화시키는 데 적합할 수도 있는 알릴 알코올 상에서 활성인 ADH 효소를 포함한다(도 3, 효소 C 참조). 예시적인 알릴 알코올 탈수소효소는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 NtRed-1 효소이다(문헌[Matsushima et al, Bioorg. Chem. 36: 23-8 (2008)]). 유사한 효소는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) MB1에서 특성화되었으나, 이러한 효소는 현재까지 유전자와 연관이 있지는 않았다(문헌[Malone et al, Appl. Environ. Microbiol 65: 2622-30 (1999)]). 또 다른 알릴 알코올 탈수소효소는 카스텔라니엘라 데프라그란스(Castellaniella defragrans), 카르포글립푸스 락티스(Carpoglyphus lactis) 및 오시뭄 바실리쿰(Ocimum basilicum)의 게라니올(geraniol) 탈수소효소이다(문헌[Lueddeke et al, AEM 78:2128-36 (2012)]). 광범위한 기질 특이성을 가진 알코올 탈수소효소 또한, 본원에서 적용 가능하며, 예컨대 C2-C14에 대한 중간-사슬 알코올 탈수소효소를 코딩하는 alrA(문헌[Tani et al., Appl. Environ. Microbiol. 66:5231-5235 (2000)]), 이. 콜라이 유래의 yqhD, yahK, adhE 및 fucO(문헌[Sulzenbacher et al., J Mol Biol 342:489-502 (2004)), 및 부티리알데히드를 부탄올로 전환시키는 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) 유래의 bdh I 및 bdh II(문헌[Walter et al, J. Bacteriol. 174:7149-7158 (1992)]) 등이 있다. 이. 콜라이의 YqhD는 NADPH를 보조인자로서 사용하는 광범위한 알데히드의 환원을 촉매하며, C(3)보다 더 긴 사슬 길이에 바람직하다(문헌[Sulzenbacher et al, J Mol Biol 342:489-502 (2004);Perez et al., J Biol.Chem. 283:7346-7353 (2008)]). 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래의 adhA 유전자 생성물은 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부티르알데히드 및 아크롤레인(acrolein)을 포함하여 다수의 알데히드 상에서 활성을 가진 것으로 나타나 있다(문헌[Kinoshita et al., App. Microbiol. Biotechnol. 22:249-254 (1985)]).

파괴되거나 결실될 수 있는 다른 ADH 유전자는 표 2에 열거된 것들을 포함한다.

유전자 파괴 또는 결실을 표적으로 할 수 있는 부가적인 ADH 효소는 개시된 ADH 서열에 대한 서열 상동성을 기반으로 동정될 수 있다. 일부 실시형태에서, ADH 효소는, 표 5에 나타낸 서열 번호 11 내지 서열 번호 14에서 전장 단백질 서열의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가진 ADH 효소를 포함한다. 예시적인 결실은 서열 번호 1 내지 서열 번호 4에 나타나 있다.

개시된 ADH 효소는 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 및/또는 부티르알데히드를 부탄올로 전환시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, ADH에 대한 유전자 변형(예를 들어 결실 또는 파괴)은 ADH 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 유발한다. 일부 실시형태에서, ADH 유전자 또는 활성의 결실은 내재성 유전자 또는 효소의 결실이다. 또 다른 실시형태에서, 크로틸 알코올을 크로톤알데히드 및/또는 부티르알데히드를 부탄올로 전환시킬 수 있는 ADH 활성을 코딩하는 내재성 ADH 유전자의 결실이다. 일부 실시형태에서, adh 유전자에서의 결실은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 adh 유전자에서의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 결실은 이. 콜라이-코딩된 adh 유전자에서의 결실이다. 다른 실시형태에서, 결실은 본원에서 서열 번호 1 내지 서열 번호 4로 개시되어 있고 표 5에 나타난 바와 같이 하나 이상의 서열에 관한 것이다.

변형될 수 있는 ADH 효소는 예를 들어, 유전자 adhE, adhP, yqhD, yahK에 의해 코딩된 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미생물은 adhE, adhP, yqhD, yahK 유전자 또는 이들의 조합에 결실 또는 파괴를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형은 단일 유전자에서 유전자 결실을 포함할 수 있고, ΔadhE, ΔadhP, ΔyqhD 및 ΔyahK로서 표시될 수 있다. 델타 기호는 유전자 결실을 의미한다. 결실은 1개 초과의 결실, 2개, 3개 또는 4개의 결실과 같은 다중 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 요망되는 adh 유전자에서의 2개의 결실은 (ΔadhEΔadhP), (ΔadhE ΔadhP), (ΔadhEΔyqhD) 및 (ΔadhEΔyahK)로서 표시될 수 있으며; 요망되는 adh 유전자에서의 3개의 결실은 (ΔadhEΔadhP ΔyqhD), (ΔadhEΔadhP ΔyahK)로서 표시될 수 있고, 요망되는 adh 유전자에서의 4개의 결실은 (ΔadhEΔadhP ΔyqhD ΔyahK)로서 표시될 수 있다. 개시된 adh 유전자, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드에 대한 이러한 유전자 결실은 ADH 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 초래한다.

일부 실시형태에서, 활성의 부분 소실 또는 완전 소실은 크로틸 알코올을 크로톤알데히드 및/또는 부티르알데히드를 부탄올로 전환시킬 수 있는 ADH 활성에서이다. ADH 활성의 부분 소실 또는 완전 소실은 미생물이 더 높은 크로틸 알코올 수준에서 성장하도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 일부 실시형태에서는 미생물이 부모 숙주 미생물 또는 유전자 변형을 갖지 않는 미생물과 비교하여 크로틸 알코올 상에서 더 빠른 속도로 성장하도록 할 수 있다. 다른 실시형태에서, adh 유전자에의 유전자 변형(예를 들어 결실)은 미생물이 더 높은 크로틸 알코올 수준을 축적하도록 할 수 있다.

외인성 유전자의 도입 방법은 크로틸 알코올 경로 및 다른 경로들을 참조로 하여 하기에 보다 완전하게 기재되어 있다.

<알켄 환원효소 활성>

일부 실시형태에서, 알켄 환원효소에 대한 유전자 변형(예를 들어 결실)은 알켄 환원효소 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 유발할 수 있다. 개시된 알켄 환원효소는 또한, 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NADH) 및/또는 NADPH를 전자 공여자로서 사용할 수 있다.

일부 실시형태에서, 크로틸 알코올의 양 또는 크로틸 알코올에 대한 내성의 증가는 개시된 알켄 환원효소의 파괴에 의해 유발될 수 있으며, 이러한 환원효소는 그렇지 않다면 부티르알데히드로의 크로톤알데히드의 전환을 촉매한다. 알켄 환원효소 유전자의 결실은 도 3에서 효소 G로서 도시되어 있는 알켄 환원효소 활성의 감소 또는 부분적이거나 완전 소실을 초래하여, 크로틸 알코올 방향으로 과정을 구동한다. 이는 즉, 크로틸 알코올이 예를 들어 도 3에 도시된 바와 같이, 크로톤알데히드를 통해 부탄올로 되는 것과 같이 다른 경로로 들어가는 것을 방지한다. 일부 실시형태에서, 결실된 알켄 환원효소는 유전자조작 미생물에 고유하거나 내인성이다. 내재 활성은, 이들 활성이 크로틸 알코올 또는 크로틸 알코올-유래 바이오생성물을 포함하는 바람직한 효소 활성들과 경쟁하는 경우 바람직하지 못한 활성으로서 동정될 수 있다.

본 발명은 또한, 2-엔-알 환원효소 또는 α,β-엔-알 환원효소 활성을 포함하는 알켄 환원효소-코딩 유전자, 또는 광범위한 α,β-불포화된 알케날을 수용하는 효소의 결실/파괴를 고려한다. 다른 실시형태에서, 알켄 환원효소 활성은 또한, N-에틸말레이미드 환원효소 활성을 가진 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 감소/제거될 수 있다. 놀랍게도, nemA 유전자 생성물은 크로톤알데히드와 같은 2-엔-알 상에서 활성인 것으로 발견되었다.

일부 실시형태에서, 알켄 환원효소 활성은 또한, 이. 콜라이 K12 하위그룹 유래의 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 감소/제거될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 알켄 환원효소는 이. 콜라이 균주 K12 아주 MG1655 또는 이. 콜라이 ATCC 8739 변이체 유래이다. 또 다른 실시형태에서, 알켄 환원효소 활성은 표 5의 GI: 732684441, 서열 번호 15 서열의 효소이다. 또 다른 실시형태에서, 유전자 결실 또는 파괴를 표적으로 하는 알켄 환원효소 활성은 표 5에 나타낸 바와 같은 서열 번호 5에 의해 코딩된다. 일부 실시형태에서, 활성의 감소 또는 제거를 표적으로 하는 개시된 알켄 환원효소 활성은 이. 콜라이 유래의 nemA 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 크로톤알데히드를 부티르알데히드로 전환시킬 수 있는 내재성 또는 내인성 유전자는 미생물에서 결실되어 있다.

다른 실시형태는 유전자 파괴 또는 결실을 표적으로 할 수 있는 비. 서브틸리스 유래의 ygjM 유전자에 의해 코딩된 알켄 환원효소 활성, NADH-의존적 플라빈 산화환원효소 또는 다른 종에서의 이의 호모로그(homolog) 또는 파라로그(paralog)를 포함한다. 다른 박테리아 호모로그는 PETN(펜타에리트리톨 테트라니트레이트) 환원효소(문헌[French C. E., Nicklin S., Bruce N. C. Sequence and properties of pentaerythritol tetranitrate reductase from Enterobacter cloacae PB2, J. Bacteriol. 178:6623-6627, 1996]), GTN(글리세롤 트리니트레이트) 환원효소(문헌[Snape et al., Purification, properties, and Sequence of glycerol trinitrate reductase from Agrobacterim radiobacter. J. Bacteriol. 179:7796-7802, 1997]), MR(모르피논 환원효소)(문헌[French et al., Bacterial morpinone reductase is related to Old Yellow Enzyme. Biochem. J. 312:671-678, 1995]), 2-사이클로헥사논 환원효소(문헌[Rohde et al., Thermoregulated expression and characterization of an NAD(P)H-dependent 2-cyclohexen-1-one reductase in the plant pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. glycinea. J. Bacteriol. 181 :814-822, 1999]), 및 슈도모나스 에스피.(Pseudomonas sp.) 유래의 생체이물(xenobiotic) 환원효소 A 및 B(문헌[Blehert et al. Cloning and sequence analysis of two Pseudomonas flavoprotein xenobiotic reductases. J. Bacteriol. 181:6254-6263, 1999])를 포함한다.

유전자 파괴 또는 결실을 표적으로 할 수 있는 부가적인 알켄 환원효소는 개시된 nemA, ygjM 및 본원에 기재된 다른 서열들에 대한 서열 상동성을 기반으로 동정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 알켄 환원효소는 nemA, ygjM 및 본원에 기재된 다른 알켄 환원효소들의 전장 단백질 서열의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대하여 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가진다.

이에 일부 실시형태에서, 미생물은 ΔnemA 유전자 또는 ΔygjM 유전자 또는 이들의 호모로그 및 이들의 조합(예를 들어 ΔnemAΔygjM)에 결실 또는 파괴를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, ygjM 유전자는 바실러스 서브틸리스 유래일 수 있다. 다른 실시형태에서, 이. 콜라이 유래의 nemA 유전자가 결실될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이. 콜라이에서 yjgM 유전자의 호모로그 또는 파라로그가 결실될 수 있으며; nemA 유전자의 호모로그 또는 파라로그는 바실러스 서브틸리스 또는 다른 종들로부터 유래될 수 있다.

개시된 nemA 및/또는 ygjM 유전자, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드에 대한 이러한 유전자 결실은 알켄 환원효소 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 초래한다. 크로톤알데히드로부터 부티르알데히드로의 전환을 유도하는 알켄 환원효소 활성의 부분 소실 또는 완전 소실은 미생물이 더 높은 크로틸 알코올 수준에서 성장하도록 할 수 있을 뿐만 아니라 일부 실시형태에서는 부모 숙주 미생물 또는 유전자 변형을 갖지 않는 미생물과 비교하여 크로틸 알코올 상에서 더 빠른 속도로 성장하도록 할 수 있다. 다른 실시형태에서, 알켄 환원효소 유전자 또는 활성에 대한 유전자 변형(예를 들어 결실)은 미생물이 더 높은 크로틸 알코올 수준을 축적하도록 할 수 있다.

알켄 환원효소는 또한, 아세토박테리움, 아크로모박터(Achromobacter), 아크레모늄(Acremonium), 아그로박테리움(Agrobacterium), 알칼리게네스(Alcaligenes), 바실러스, 브라디리조븀(Bradyrhizobium), 부르크홀데리아(Burkholderia), 칼로라마토르(Caloramator), 카스텔라니엘라, 세팔로스포륨(Cephalosporium), 클로스트리듐 에스케리키아, 유박테리움(Eubacterium), 필리팍토르(Filifactor), 푸소박테리움(Fusobacterium), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 메소리조븀(Mesorhizobium), 모오렐라(Moorella), 오크로박트룸(Ochrobactrum), 옥살로파구스(Oxalophagus), 옥소박터(Oxobacter), 패니바실러스(Paenibacillus), 슈도모나스, 랄스토니아(Ralstonia), 리조븀(Rhizobium), 로도토룰라(Rhodotorula), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 시노리조븀(Sinorhizobium), 스포로할로박터(Sporohalobacter), 신트로포스포라(Syntrophospora), 타우에라, 테르모안에로박터(Thermoanaerobacter), 테르모안에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 틸라클리듐(Tilachlidium), 비브리오(Vibrio), 크산토박터(Xanthobacter) 또는 예르시니아(Yersinia) 속의 미생물에서 감소/제거될 수 있다.

α,β-에노에이트 환원효소 활성을 가진 다른 효소로는, 아크레모늄 스트릭툼(Acremonium strictum) CBS114157(기탁일 2003년 12월 19일; 부다페스트 조약의 협약 하에 기탁됨), 클로스트리듐 티로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) DSM1460(Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen 하에 입수 가능함), 모오렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica) DSM1974(Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen 하에 입수 가능함)(1980년 1월 1일까지 클로스트리듐 테르모아세티쿰(Clostridium thermoaceticum)이라고 명명되었던, 마찬가지로 DSM1974 하의 효소), 오크로박트룸 안트로피(Ochrobactrum anthropi) NCIMB41200(기탁일 2003년 12월 16일; 부다페스트 조약의 협약 하에 기탁됨) 또는 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri) DSM555(Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen 하에 입수 가능함) 유래의 효소 등이 있다.

일부 실시형태에서, 알켄 환원효소 및 ADH 유전자는 결실된다. 일부 실시형태에서, nemA와 함께 ADH 유전자 adhE , adhP , yqhD , yahK, 또는 이들의 다양한 조합이 결실된다. 예를 들어, 유전자조작 미생물은 nemA에서, 그리고 adhE , adhP , yqhD 및 yahK로부터 선택된 단일 유전자 또는 (adhE,adhP), (adhE,adhP) 또는 (adhE,yqhD), (adhE,yahK), (adhE,adhP,yqhD), (adhE,adhP,yahK) 및 (adhE , adhP,yqhD,yahK)로부터 선택된 다중 유전자에서 유전자 결실을 가질 수 있다.

또 다른 실시형태에서, ygjM과 함께 ADH 유전자 adhE , adhP , yqhD , yahK, 또는 이들의 다양한 조합이 결실된다. 예를 들어, 유전자조작 미생물은 ygjM, 및 adhE, adhP , yqhD 및 yahK로부터 선택된 단일 유전자 또는 (adhE,adhP), (adhE,adhP), 또는 (adhE,yqhD), (adhE,yahK), (adhE,adhP,yqhD), (adhE,adhP,yahK) 및 (adhE,adhP,yqhD,yahK)로부터 선택된 다중 유전자에서 유전자 결실을 가질 수 있다.

또 다른 실시형태에서, nemA와 함께 ADH 유전자 adhE , adhP , yqhD , yahK , 또는 이들의 다양한 조합이 이. 콜라이에서 결실된다. 또 다른 실시형태에서, ygjM와 함께 ADH 유전자, 및 adhE , adhP , yqhD , yahK, 또는 이들의 다양한 조합의 호모로그 또는 파라로그가 바실러스 서브틸리스에서 결실된다.

ADH 및/또는 알켄 환원효소를 코딩하는 유전자 파괴 또는 유전자 결실을 포함하는 개시된 유전자 변형은, 전체 유전자의 결실, 유전자 일부의 결실, 전사 또는 번역에 필요한 조절 서열의 결실 또는 다른 변형, 절단된(truncated) 유전자 생성물(예를 들어 효소)을 초래하는 유전자의 일부의 결실, 또는 코딩된 유전자 생성물의 활성을 감소(검출 가능하지 않은 활성 수준까지 감소시키는 것을 포함)시키는 다양한 돌연변이 전략들 중 임의의 전략을 포함한다. 파괴는 광범위하게는, 효소를 코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부의 결실을 포함할 수 있고, 또한 다른 유형의 유전자 변형, 예를 들어 정지 코돈의 도입, 격자 이동 돌연변이, 유전자 일부의 도입 또는 제거, 조건부 민감성 돌연변이(예를 들어 온도 민감성)의 도입, 및 분해 신호의 도입을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니며, 이러한 유전자 변형은 mRNA 전사 수준 및/또는 안정성에 영향을 미치며, 효소를 코딩하는 유전자의 업스트림에 있는 프로모터 또는 억제자를 변경시키고, 스템 루프(stem loop)의 삽입 또는 RBS의 제거 또는 불활성화와 같이 mRNA 번역을 변경시킨다.

다양한 실시형태에서, 유전자 변형은, 폴리펩타이드 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 초래하는 DNA, 이러한 DNA로부터 코딩된 mRNA 및 상응하는 아미노산 서열에 대해 이루어질 수 있다. 폴리펩타이드 활성의 부분적인, 감소된 또는 완전 소실을 가진 세포를 제조하기 위해 많은 상이한 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 보편적인 돌연변이 생성 또는 녹아웃 기술을 사용하여 파괴된 조절 서열 또는 폴리펩타이드-코딩 서열을 갖도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci USA (2000), 97(12): 6640-6645, and Methods in Yeast Genetics (1997 edition), Adams et al., Cold Spring Harbor Press (1998), and Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (3rd edition), edited by Richard H. Baltz, Arnold L. Demain, Julian E. Davies]를 참조한다.

하나의 특히 유용한 유전자 파괴 방법은 완전한 유전자 결실로서, 이는 유전자 변형된 미생물에서 유전적 복귀(genetic reversion)의 발생을 감소시키거나 제거하기 때문이다. 이에, 생성물이 효소인 유전자의 파괴는 효소적 기능을 파괴시킨다. 대안적으로, 안티센스 기술은 특정 폴리펩타이드의 활성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는, 폴리펩타이드의 번역을 방지하는 안티센스 분자를 코딩하는 cDNA를 함유하도록 조작될 수 있다. 유전자 침묵이 또한, 특정 폴리펩타이드의 활성을 감소시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Metabolic Engineering of Escherichia coli Using Synthetic Small Reulatory RNAs. Na D, Yoo SM, Chung H, Park H, Park JH, Lee SY; Nature Biotechnology. 2013 Feb 31(2):170-4] 참조).

일부 실시형태에서, 활성의 부분적 감소는 감소된 기능성 활성이다. 기능적 활성은 성장기 또는 정지기 중 어느 하나 또는 둘 다 동안에 감소될 수 있다. 고찰된 바와 같이, 감소된 활성은 예를 들어, 유전자를 결실시키거나, 유전자 발현을 저하시키거나, 유전자에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 활성 또는 이용 가능성을 저하시킴으로써 달성될 수 있다. 유전자는 직접 변형될 수 있는데, 예를 들어 더 약한 프로모터, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입의 사용에 의해 변형될 수 있거나, 예를 들어 이의 조절 유전자를 변형시킴으로써 조정될 수 있다.

결과적인 유전자 파괴 또는 결실은 효소적 활성의 부분적인, 감소된 또는 완전 소실을 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 해당 효소에 대한 공지된 표준 조건 하에서 지시된 생성물(들)로의 지시된 기질(들)의 효소적 전환은, 표준 명시된 조건 하에 내재성(비-변형된) 또는 부모 숙주 효소에 의한 동일한 생화학적 전환에 대한 효소적 활성보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 더 작다.

감소된 효소적 활성을 가진 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 효소 활성 검정법이 사용되어, 감소된 효소 활성을 가진 세포를 동정할 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., New York 2007]을 참조한다. ADH 및 알켄 환원효소의 감소를 확인하는 데 사용될 수 있는 다른 검정법으로는 GC/MS 분석이 있다. 다른 예에서, NADH/NADPH의 수준은 분광분석적으로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, NADH/NADPH는 ABCAM™사로부터 입수 가능한 NADH/NADPH 검정법 키트(ab65349)를 사용하여 색채학적으로 모니터링될 수 있다.

유전자 결실은 돌연변이 유전자 결실 접근법, 및/또는 이들 효소 중 하나 이상의 발현이 감소되거나 발현되지 않는 균주로부터 출발하는 방법, 및/또는 당업자에게 알려진 다른 방법들에 의해 달성될 수 있다. 유전자 결실은 비제한적으로 Red/ET 방법을 포함하여 다수의 알려진 특정한 방법들 중 임의의 방법에 의해 유도될 수 있다.

Red/ET 재조합은 당업자에게 알려져 있으며, 문헌[Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci USA (2000), 97(12): 6640-6645]에 기재되어 있다. 다른 결실 방법은 Stewart 등에 의해 등록된 미국 특허 6,355,412 및 미국 특허 6,509,156에 기재된 것들을 포함한다. 이들 참조는 각각 이러한 방법의 교시를 위해 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 방법을 위한 물질 및 키트는 Gene Bridges™사로부터 입수 가능하고, 상기 방법은 제조업체의 지시에 따라 진행될 수 있다. 이러한 방법은 λ-파지 유래의 재조합효소에 의해 수행되는 상동성 재조합을 통해 표적 유전자를 선택 마커로 대체하는 단계를 수반한다. λ-레드 재조합효소를 발현하는 숙주 유기체는, 표적 유전자와 상동성인 말단 영역(일반적으로 약 50 bp, 대안적으로 약 300 bp 이하)의 측면에 있는 선별 마커를 코딩하는 선형 DNA 생성물을 이용하여 형질변환된다. 그런 다음, 이러한 마커는 FLP-재조합효소, 또는 또 다른 재조합효소, 예컨대 Cre를 운반하는 플라스미드 벡터에 의해 수행되는 또 다른 재조합 단계에 의해 제거될 수 있다.

미생물 염색체 DNA 중 일부의 표적화된 결실, 또는 미생물 염색체에의 외래 유전 물질의 첨가는 숙주 세포의 대사를 변경시켜, 요망되지 않는 대사산물의 생성을 감소시키거나 제거하기 위해 수행될 수 있다. 이는 다른 유전자 변형과 조합하여 사용될 수 있다.

미생물은 추가로, 크로톤알데히드를 크로틸 알코올로 전환시키는 효소의 활성을 증가시키도록 유전적으로 조작될 수 있다(예를 들어 도 1에서 E 및 도 3에서 B 참조). 일부 실시형태에서, 효소는 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성)이다. 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성)의 증가는 특히, 크로톤알데히드가 부산물이고 바이오생성물 경로 중간산물이 아닌 경우에 사용된다.

일부 실시형태에서, 일부 미생물은 크로톤알데히드를 크로틸 알코올로 전환시키는 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 일부 미생물은 미생물 내에 도입된 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성)를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 증가될 수 있는 외인성 핵산은 서열 번호 1 내지 서열 번호 4, 및 서열 번호 11 내지 서열 번호 14로서 개시된 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 개시된 adh 및/또는 알켄 환원효소 유전자가 결실된 유전자조작 미생물은 또한, 알데히드를 알코올로 전환시킬 수 있는 ADH 활성을 가진 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 서열 번호 12 및 서열 번호 14의 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 미생물은 유전자 yqhD 및/또는 yahK를 발현한다.

크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성) 활성을 나타내는 효소는 크로톤알데히드로부터 크로틸 알코올을 형성할 수 있다. 하기 효소는 이러한 활성을 천연적으로 가질 수 있거나, 이러한 활성을 나타내도록 조작될 수 있다. 알데히드로부터 알코올로의 전환을 촉매하는 효소(예를 들어 알코올 탈수소효소 또는 동등하게는 알데히드 환원효소)를 코딩하는 예시적인 유전자는, C2-C14에 대한 중간-사슬 알코올 탈수소효소(문헌[Tani et al, Appl.Environ.Microbiol. 66:5231-5235 (2000)]), 사카로마이세스 세레비시애 유래의 ADH2(문헌[Atsumi et al, Nature 451 :86-89 (2008)]), C(3)보다 더 긴 분자에 대해 선호도를 가진 이. 콜라이 유래의 yqhD(문헌[Sulzenbacher et al., J. Mol. Biol. 342:489-502 (2004)]), 및 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키는 씨. 아세토부틸리쿰 유래의 bdhI 및 bdhII(문헌[Walter et al, J. Bacteriol. 174:7149-7158 (1992)])를 코딩하는 유전자를 포함한다. 자이모모나스 모빌리스 유래의 ADH1은 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부티르알데히드 및 아크롤레인을 포함하여 다수의 알데히드 상에서 활성을 가진 것으로 언급되어 있다(문헌[Kinoshita, Appl. Microbiol. Biotechnol. 22:249-254 (1985)]). 클로스트리듐 베이제린키이(Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052 유래의 Cbei_2181은 크로톤알데히드를 크로틸 알코올로 전환시킬 수 있는 또 다른 유용한 알코올 탈수소효소를 코딩한다.

4-히드록시부티레이트 탈수소효소 활성을 나타내는 효소(EC 1.1.1.61) 또한, 이러한 범주에 속한다. 이러한 효소는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)(문헌[Bravo et al., J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004)]), 클로스트리듐 클루이베리(문헌[Wolff et al., Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)]) 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(문헌[Breitkreuz et al, J.Biol. Chem. 278:41552- 41556 (2003)])에서 특성화되어 있다.

<크로틸 알코올 경로>

ADH 및/또는 알켄 환원효소 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 유발하는 유전자 결실 또는 파괴를 가진 개시된 유전자조작 미생물은 크로틸 알코올, 또는 크로틸 알코올을 중간산물로서 사용하여 생성되는 다른 바이오생성물의 생성에 사용될 수 있다. 이러한 개시된 유전자조작 미생물은 또한, 크로틸 알코올 경로를 포함할 수 있다. 크로틸 알코올을 생성하거나 크로틸 알코올을 바이오생성물을 위한 중간산물로서 사용하기 위한 많은 미생물 및 효소적 경로들이 알려져 있다. 예를 들어, 도 1을 참조로, 유전자조작 미생물은 다음의 경로들: EF; ABCDE; ABCK; ABCIJE; LK, MK, NK, OK; LDE; MDE; NDE, ODE; LIJE, MIJE; NIJE; 0IJE, 및 A, B, C, D, E, F, I, J, K, L,M, N 및 O 중 임의의 하나 이상의 각각의 조합 중 하나를 가질 수 있다. 도 1에 기재된 크로틸 알코올로의 경로 또는 크로틸 알코올로부터 부타디엔으로의 전환에 대한 상세한 사항은 예를 들어 부타디엔의 생합성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2011/140171에서 찾을 수 있다. 일부 실시형태에서, ADH, 알켄 환원효소 또는 둘 다가 결실된 유전자조작 미생물은 도 1에 도시된 단계 및 효소들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 크로틸 생성을 위한 다른 예시적인 경로는, 부타디엔의 생합성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2011/140171 및 포르메이트 동화에 의한 부타디엔 및 관련 화합물의 생성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2014/152434에 기재된 것들을 포함한다. 크로틸 알코올 생성을 위한 다른 예시적인 경로는 2014년 7월 3일에 출원된 미국 출원 62/020,901 및 2014년 11월 21일에 출원된 미국 출원 62/082,747을 포함하며, 이들은 둘 다, 불포화를 가진 4C-5C 화합물의 생성을 위한 미생물 및 이와 관련된 방법이라는 명칭을 가진다. 크로틸 알코올로의 또 다른 예시적인 경로 또는 크로틸 알코올로부터 부타디엔으로의 전환은, 크로틸 알코올로부터 부타디엔의 효소적 생성 방법이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2013/057194, 및 1,3 부타디엔의 생합성 방법이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2013/188546을 포함한다.

이들 인용된 특허 또는 특허 출원은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.

선택된 숙주 미생물 유기체의 크로틸 알코올 생합성 경로 구성성분에 따라, 유전자조작 미생물은 적어도 하나의 외인성으로 발현되는 크로틸 알코올 경로-코딩 핵산 및 하나 이상의 크로틸 알코올 생합성 경로에 대한 최대의 모든 코딩 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 크로틸 알코올 생합성은 경로 효소 또는 단백질이 결여된 숙주에서, 상응하는 코딩 핵산의 외인성 발현을 통해 구축될 수 있다. 크로틸 알코올 경로의 모든 효소 또는 단백질들이 결여된 숙주에서는, 이러한 경로의 모든 효소 또는 단백질들의 외인성 발현이 포함될 수 있으며, 그렇더라도, 경로의 모든 효소 또는 단백질들은 심지어 숙주가 경로 효소 또는 단백질 중 적어도 하나를 함유하고 있더라도 발현될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 크로틸 알코올 생성 경로의 효소 또는 단백질, 예컨대 아세틸-CoA:아세틸-CoA 아실전이효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소, 3-히드록시부티릴-CoA 탈수화효소, 크로토닐-CoA 환원효소(알데히드 생성), 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성), 크로틸 알코올 키나아제(도 1, 단계 A 내지 단계 E)를 코딩하는 모든 핵산 및/또는 폴리펩타이드들의 외인성 발현이 포함될 수 있다.

<크로틸 알코올을 통한 바이오생성물>

일단 크로틸 알코올이, 개시된 유전자조작 미생물 및 방법에 의해 수득되거나 생성되는 경우, 크로틸 알코올은 요망되는 바이오생성물(예를 들어 부타디엔, 1,3-부탄디올, 메틸 비닐 카르비놀)로 전환될 수 있다. 예를 들어, 크로틸 알코올은 추가로, 생합성 공정, 화학적 공정 또는 효소적 공정에 의한 3-부텐-2-올(메틸 비닐 카르비놀(MVC)로도 지칭됨) 및/또는 부타디엔의 바이오생성에서 중간산물로서 사용될 수 있다.

도 1 및 도 2는 크로틸 알코올로부터 부타디엔으로의 예시적인 경로를 제공한다. 도 2는 다음의 중간산물들: 2-부테닐-4-포스페이트, 2-부테닐-4-디포스페이트 및/또는 3-부텐-2-올 중 하나 이상을 통한 부타디엔으로의 예시적인 경로를 제공한다. 선택적으로, 크로틸 알코올은 3-부텐-1-올 또는 3-부텐-2-올로부터의 전환을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 크로틸 알코올-생성 경로를 통해 이러한 경로 내에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 크로틸 알코올은 도 1의 경로에 의해 생성된 다음, 도 2의 경로 내에 도입된다.

도 2를 참조로, 유전자조작 미생물 유기체는 다음의 경로들: D; DG; AD; ADG; E; EG; BE; BEG; ABE; ABEG; IE; IEG; F; FG; G; H; J; AJ; A; AB; ABC 및 단계 D, E, F 중 임의의 하나 이상과 도 2의 단계들 중 임의의 하나 이상의 각각의 조합 중 임의의 하나를 가질 수 있으며, 여기서, A, B, C, G 또는 H 중 적어도 하나가 존재하며, 그런 다음 (i) 적어도 하나의 다른 신규 단계 또는 경로가 존재한다. 도 2에 기재된 경로에 대한 추가의 상세한 사항은 예를 들어 PCT 국제 출원 공개 WO 2011/140171, 포르메이트 동화에 의한 부타디엔 및 관련 화합물의 생성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2014/152434, 및 경쇄 알케놀(light alkenol)의 효소적 탈수화에 의한 휘발성 다이엔의 생성이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2014/033129, 둘 다 불포화를 가진 4C-5C 화합물의 생성을 위한 미생물 및 이와 관련된 방법이라는 명칭의 2014년 7월 3일에 출원된 미국 출원 62/020,901, 및 2014년 11월 21일에 출원된 미국 출원 62/082,747, 및 본원에 기재된 다른 참조문헌들에서 확인된다. 예를 들어, 도 2의 단계 F, G 또는 H에 적합한 효소는 EC 4.2.1 부류에 있을 수 있으며, 이 중 EC 4.2.1.127로 지정된 리날로올 탈수화효소 또는 이의 변이체가 특히 관심을 받는다. 리날로올 탈수화효소의 변이체는 PCT 국제 출원 공개 WO 2014/184345에 보고되어 있다. 또 다른 미생물 및 경로는, 1,3 부타디엔의 생합성 방법이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2013/188546에서 확인될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 부모 세포는 도 1에 도시된 바와 같이 크로틸 알코올로의 경로를 포함하는 미생물, 및 리날로올 탈수화효소와 같은 탈수화효소를 포함한다.

부타디엔의 생성을 위한 다른 예시적인 경로는 부타디엔의 생합성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 PCT 국제 출원 공개 WO 2011/140171; 둘 다 불포화를 가진 4C-5C 화합물의 생성을 위한 미생물 및 이와 관련된 방법이라는 명칭의 2014년 7월 3일에 출원된 미국 출원 62/020,901, 및 2014년 11월 21일에 출원된 미국 출원 62/082,747에 기재된 것들을 포함한다.

부타디엔, 크로틸 알코올, 3-부텐-2-올, 경로 효소 또는 단백질에 대한 코딩 핵산의 공급원은 예를 들어, 코딩된 유전자 생성물이 참조된 반응을 촉매할 수 있는 임의의 종을 포함할 수 있다. 이러한 종은 원핵 유기체 및 진핵 유기체를 둘 다 포함하며, 비제한적으로, 고세균 및 진정세균을 포함하여 박테리아, 및 효모, 식물, 곤충, 동물 및 인간을 포함한 포유류를 포함하여 진핵생물을 포함한다.

이러한 공급원을 위한 예시적인 종으로는 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 에스케리키아 페르구소니이(Escherichia fergusonii)를 포함한 에스케리키아(Escherichia) 종, 카스텔라니엘라 데프라그란스, 타우에라 리날로올렌티스(Thauera linaloolentis), 타우에라 테르페니카(Thauera terpenica), 메타노칼도코커스 쟌나쉬이(Methanocaldococcus jannaschii), 렙토스피라 인테르로간스(Leptospira interrrogans), 게오박터 술푸르레두센스(Geobacter sulfurreducens), 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 로세이플렉수스 에스피. RS-1(Roseiflexus sp. RS-1), 클로로플렉수스 아그레간스(Chloroflexus aggregans), 아크로모박터 자일로속시단스(Achromobacter xylosoxydans), 클로스트리듐 클루이베리, 클로스트리듐 심비오숨(Clostridium symbiosum), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 르?O다흘리이(Clostridium ljungdahlii)를 포함한 클로스트리다 종, 트리코모나스 바기날리스 G3(Trichomonas vaginalis G3), 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 악시도아미노코커스 페르멘탄스(Acidaminococcus fermentans), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 푸소박테리움 모르티페룸(Fusobacterium mortiferum)을 포함한 푸소박테리움(Fusobacterium) 종, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 호모 사피엔스, 사카로마이세스 세레비시애를 포함한 사카로마이세스 종, 아스페르길루스 테레우스, 아스페길루스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 니거를 포함한 아스페르길루스 종, 기브베렐라 제애(Gibberella zeae), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 서브에스피. 프라투베르쿨로시스(subsp. pratuberculosis)를 포함하여 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium)을 포함한 미코박테리움 종, 살리니스포라 아레니콜라(Salinispora arenicola), 슈도모나스 에스피. CF600(Pseudomonas sp. CF600), 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함한 슈도모나스 종, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 랄스토니아 유트로파 JMP134, 랄스토니아 유트로파 H16, 랄스토니아 픽케티이(Ralstonia pickettii)를 포함한 랄스토니아 종, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실러스 메가테리움을 포함한 바실러스(Bacillus) 종, 페디코커스 펜토사세우스(Pedicoccus pentosaceus), 클로로플렉수스 아루란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 클로로플렉수스 아그레간스(Chloroflexus aggregans)를 포함한 클로로플렉수스 종, 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 메타노칼도코커스 쟌나쉬이(Methanocaldococcus jannaschii), 렙토스피라 인테르로간스(Leptospira interrrogans), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 살모넬라 엔테리카 세로바(Salmonella enterica serovar)를 포함한 살모넬라 종, 티피무리움(Typhimurium), 쉐와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis), 쉐와넬라 종 MR-4를 포함한 쉐와넬라 종, 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 게오바실러스 스테아로테르모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 세라티아 마르케센스(Serratia marcescens), 비브리오 콜레래(Vibrio cholerae), 유박테리움 바르케리(Eubacterium barkeri), 박테로이데스 카필로수스(Bacteroides capillosus), 아르캐오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 아르캐오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 할로아르쿨라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui), 피로바쿨룸 애로필룸 균주 IM2(Pyrobaculum aerophilum str. IM2), 리조븀 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum)을 포함한 리조븀 종, 뿐만 아니라 상응하는 유전자에 대한 공급원 유기체로서 본원에 개시되거나 입수 가능한 다른 예시적인 종들 등이 있다.

그러나, 395개의 미생물 게놈 및 여러 가지 효모, 진균류, 식물 및 포유류 게놈을 포함하여 현재 550개가 넘는 종에 이용 가능한 완전한 게놈 서열(이들 중 1/2 초과는 NCBI와 같은 공개 데이터베이스 상에서 입수 가능함)을 이용하면, 필수적인 부타디엔, 크로틸 알코올, 3-부텐-2-올을 코딩하는 유전자의 동정, 예를 들어, 알려진 유전자의 호모로그, 오르토로그(ortholog), 파라로그 및 비오르토로그(nonortholog) 유전자 대체를 포함하여 관련된 종 또는 거리가 먼 종에서 하나 이상의 유전자에 대한 생합성 활성, 및 유기체들 사이의 유전자 변경의 교환은 일상적이고, 당업계에 잘 알려져 있다. 이에, 이. 콜라이와 같은 특정 유기체에 관하여 본원에 기재된 부타디엔, 크로틸 알코올, 3-부텐-2-올의 생합성을 가능하게 하는 대사적 변경은 원핵 유기체 및 진핵 유기체를 포함한 다른 미생물에도 쉽게 적용될 수 있다. 본원에 제공된 교시 및 지도를 고려하여, 당업자는 하나의 유기체에서 예시된 대사적 변경이 다른 유기체에도 동일하게 적용될 수 있음을 알 것이다.

부타디엔을 생성하기 위한 직접적인 발효 외에도, 크로틸 알코올 또는 3-부텐-2-올(메틸 비닐 카르비놀)은 분리되고, (임의의 용도를 위해) 정제된 다음, 금속-기반 촉매를 수반하는 제2 단계에서 부타디엔으로 탈수화될 수 있으며, 예를 들어 도 2를 참조한다. 적합한 생성물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은: 부타디엔의 생합성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 2011년 11월 10일에 공개된 WO2011140171 A2; 방향족 물질, 2,4-펜타다이에노에이트 및 1,3-부타디엔의 생합성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 2012년 2월 9일에 공개된 WO2012018624A2; 부타디엔의 생합성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 2011년 11월 10일에 공개된 WO2011140171 A2; 알켄의 생성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 2013년 3월 21일에 공개된 WO2013040383A1; 부타디엔의 생성을 위한 미생물 및 이와 관련된 방법이라는 명칭의 2012년 12월 27일에 공개된 WO2012177710A1; 부타디엔의 생합성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 2012년 8월 9일에 공개된 WO2012106516A1; 2,4-펜타다이에노에이트, 부타디엔, 프로필렌, 1,3-부탄디올 및 관련 알코올의 생성을 위한 미생물 및 방법이라는 명칭의 2013년 2월 28일에 공개된 WO2013028519A1; 및 2013년 3월 15일에 출원된 미국 61/799255에서 확인된다.

화학적 공정은 부타디엔으로의 탈수화를 포함한다. 알코올 탈수화는 당업계에 알려져 있고, 다양한 열적 공정들을 포함할 수 있으며, 이러한 공정들은 둘 다 촉매화된 공정 및 비-촉매화된 공정일 수 있다. 일부 실시형태에서, 촉매화된 열적 탈수화는 산화금속 촉매 또는 실리카를 이용한다. 일부 실시형태에서, 이러한 공정은 촉매의 존재 하에 화학적 탈수화에 의한 것이다. 예를 들어, 크로틸 알코올은 비스무트 몰리브데이트에 걸쳐 탈수화되어(문헌[Adams, C.R. J. Catal. 10:355-361, 1968]), 1,3-부타디엔이 수득될 수 있는 것으로 나타나 있다(예를 들어 도 2 참조).

탈수화는 알코올기의 활성화, 및 E1 또는 E2 제거와 같은 표준 제거 메커니즘에 의한 후속적인 제거에 의해 달성될 수 있다. 활성화는 알코올기를 할로겐, 예컨대 요오드화물, 염화물 또는 브롬화물로 전환시킴으로써 달성될 수 있다.

활성화는 또한, 알코올을 양호한 이탈기로 전환시키는 설포닐, 포스페이트 또는 다른 활성화 관능기에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화기는 설페이트, 또는 토실레이트, 메실레이트, 노실레이트, 브로실레이트 및 트리플레이트로부터 선택되는 설페이트 에스테르이다. 일부 실시형태에서, 이탈기는 포스페이트 또는 포스페이트 에스테르이다. 이러한 일부 실시형태에서, 탈수화제는 오산화인이다.

크로틸 알코올을 부타디엔으로 전환시키기 위한 전형적인 공정에서, 크로틸 알코올은 순수한(neat) 상태로 또는 용매 내에서, 증기의 존재 또는 부재 하에, 반응 용기 또는 튜브의 내부에서 40℃ 내지 400℃ 범위의 온도까지 가열된 고체 무기, 유기 또는 금속-함유 탈수화 촉매에 걸쳐 통과하여, 물이 제거되고 부타디엔이 기체로서 방출되며, 이러한 기체는 응축(부타디엔 bp = -4.4℃)되고, 추가의 가공, 저장 또는 사용을 위해 저장고에 수합된다. 전형적인 촉매로는, 비스무트 몰리브데이트, 인산염-인산, 산화세륨, 카올린-철 산화물, 카올린-인산, 실리카-알루미나 및 알루미나 등이 있을 수 있다. 전형적인 공정 처리량은 0.1 kg/h 내지 20,000 kg/h의 범위이다. 전형적인 용매는 톨루엔, 헵탄, 옥탄, 에틸벤젠 및 자일렌이다.

다른 실시형태에서, 부타디엔은 WO 2013/057194에 개시된 바와 같이 크로틸 포스페이트 또는 크로틸 디포스페이트를 통한 크로틸 알코올의 효소적 전환, 또는 예를 들어 PCT 국제 출원 공개 WO 2014/033129 또는 WO 2014/184345에 보고된 바와 같이 EC 4.2.1 부류, 바람직하게는 리날로올 탈수화효소에 의한 효소적 탈수화(이성질화 탈수)를 통한 크로틸 알코올의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다.

실시형태는 본원에서, 일반적으로 대사 반응, 이의 반응물 또는 생성물을 참조로 하거나, 구체적으로는 참조된 대사 반응, 반응물 또는 생성물과 연관이 있거나 촉매작용하는 효소, 또는 연관이 있는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자를 참조로 하여 기재되어 있다. 본원에서 다르게 표현적으로 언급되지 않는 한, 당업자는 반응에 관한 참조가 또한 반응의 반응물 및 생성물에 관한 참조를 구성함을 이해할 것이다. 유사하게는, 본원에서 다르게 표현적으로 언급되지 않는 한, 반응물 또는 생성물에 관한 참조는 또한, 반응을 참조하고, 이들 대사성 구성성분 중 임의의 구성성분에 관한 참조는 또한, 참조된 반응, 반응물 또는 생성물을 촉매하는 효소 또는 이에 관여된 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자들을 참조한다. 마찬가지로, 대사 생화학, 효소학 및 게놈학의 잘 알려진 분야를 고려하여, 본원에서 유전자 또는 코딩 핵산에 관한 참조가 또한, 상응하는 코딩된 효소, 및 이러한 효소가 촉매하는 반응, 또는 이러한 반응뿐만 아니라 상기 반응의 반응물 및 생성물과 연관된 단백질에 관한 참조를 구성한다.

1개 초과의 외인성 핵산이 미생물 유기체 내에 포함되는 경우, 이러한 1개 초과의 외인성 핵산은 상기 고찰된 바와 같이 참조된 코딩 핵산 또는 생합성 활성을 지칭하는 것으로 이해된다. 추가로, 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 1개 초과의 외인성 핵산은 개별 핵산 분자, 폴리시트론 핵산 분자 또는 이들의 조합 상에서 숙주 미생물 유기체 내에 도입될 수 있고 여전히 1개 초과의 외인성 핵산인 것으로 간주될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 미생물 유기체는 요망되는 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 2개 이상의 외인성 핵산을 발현하도록 조작될 수 있다. 요망되는 활성을 코딩하는 2개의 외인성 핵산이 숙주 미생물 유기체 내에 도입되는 경우, 이러한 2개의 외인성 핵산은 예를 들어 단일 플라스미드 상에서, 개별 플라스미드 상에서 단일 핵산으로서 도입될 수 있으며, 단일 부위 또는 다중 부위들에서 숙주 염색체 내에 통합될 수 있고, 여전히 2개의 외인성 핵산으로서 간주될 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게는, 2개 초과의 외인성 핵산은 예를 들어 단일 플라스미드 상에서, 개별 플라스미드 상에서 임의의 요망되는 조합으로 숙주 유기체 내에 도입될 수 있으며, 단일 부위 또는 다중 부위들에서 숙주 염색체 내에 통합될 수 있고, 여전히 2개 초과의 외인성 핵산, 예를 들어 3개의 외인성 핵산으로서 간주될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 참조된 외인성 핵산 또는 생합성 활성의 수는 숙주 유기체 내에 도입된 개별 핵산의 수가 아니라 코딩 핵산의 수 또는 생합성 활성의 수를 지칭한다.

유전자조작 미생물 유기체는 안정한 유전자 변경을 함유할 수 있으며, 이는 유전자 변경의 소실 없이 5세대 초과 동안 배양될 수 있는 미생물을 지칭한다. 일반적으로, 안정한 유전자 변경은 10세대 초과 동안 지속되며, 약 25세대 초과 동안 지속되고, 무한정 지속을 포함하여 50세대 초과 동안 지속되는 변형을 포함한다.

당업자는, 본원에 예시된 대사적 변형을 포함하여 유전자 변경이, 적합한 숙주 유기체들, 예컨대 이. 콜라이 및 이들의 상응하는 대사 반응, 또는 요망되는 유전 물질, 예컨대 요망되는 대사 경로를 위한 유전자에 대한 적합한 공급원 유기체에 관하여 기재되어 있음을 이해할 것이다. 그러나, 여러 가지 광범위한 유기체들의 완전한 게놈 시퀀싱 및 게놈학 및 분자생물학 영역에서 높은 수준의 기술이 주어진다면, 당업자는 본원에 제공된 교시 및 지도를 필수적으로 모든 다른 유기체들에도 쉽게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본원에 예시된 이. 콜라이 대사 변경은, 참조된 종 이외의 종으로부터 유래된 동일하거나 유사한 코딩 핵산을 혼입함으로써 다른 종에 쉽게 적용될 수 있다. 이러한 유전자 변경으로는 예를 들어, 일반적으로 종 호모로그의 유전자 변경, 특히 오르토로그, 파라로그 또는 비파라로그 유전자 대체가 있다.

오르토로그는 수직형 가계(vertical descent)와 관련이 있고 상이한 유기체들에서 실질적으로 동일하거나 동등한 기능을 책임지는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들어, 마우스 에폭사이드 가수분해효소 및 인간 에폭사이드 가수분해효소는 에폭사이드 가수분해의 생물학적 기능을 위한 오르토로그인 것으로 간주될 수 있다. 유전자는, 예를 들어 이들 유전자가 이들이 상동성임을 가리킬 정도로 충분한 양의 서열 유사성을 공유하는 경우 수직형 가계에 의해 관련이 있거나, 공통의 조상으로부터 진화에 의해 관련이 있다. 유전자는 또한, 이들 유전자가 이들이 공통의 조상으로부터 1차 서열 유사성이 동정될 수 없을 정도까지 진화하였음을 가리킬 정도로 충분한 양의 3차원 구조를 공유하지만 본질적으로 서열 유사성은 아닌 경우에도 오르토로그인 것으로 간주될 수 있다. 오르토로그인 유전자는 약 25% 내지 100% 아미노산 서열 동일성의 서열 유사성을 가진 단백질을 코딩할 수 있다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질을 코딩하는 유전자 또한, 이들의 3차원 구조가 또한 유사성을 나타내는 경우 수직형 가계에 의해 발생된 것으로 간주될 수 있다.

오르토로그는 예를 들어 진화를 통해 구조 또는 전반적인 활성이 달라진(diverged) 유전자들 또는 이들의 코딩된 유전자 생성물들을 포함한다. 예를 들어, 하나의 종이 2개의 기능을 나타내는 유전자 생성물을 코딩하는 경우, 및 이러한 기능들이 제2 종에서 별개의 유전자로 분리된 경우, 3개의 유전자들 및 이들의 상응하는 생성물들은 오르토로그인 것으로 간주된다. 생화학적 생성물의 생성을 위해, 당업자는, 도입되거나 파괴되는 대사 활성을 갖는 오르토로그 유전자가 유전자조작 미생물의 구축을 위해 선택되어야 함을 이해할 것이다. 구분 가능한 활성을 나타내는 오르토로그의 일례는, 별개의 활성이 2개 이상의 종들 사이에 또는 단일 종 내에서 별개의 유전자 생성물로 분리된 바 있다.

이와는 대조적으로, 파라로그는 예를 들어, 복제(duplication) 및 후속해서 진화적 발산(evolutionary divergence)과 관계가 있고 유사하거나 공통이지만 동등하지 않는 기능을 가진 호모로그이다. 파라로그는 예를 들어 동일한 종 또는 상이한 종으로부터 기원하거나 유래될 수 있다. 예를 들어, 마이크로솜의 에폭사이드 가수분해효소(에폭사이드 가수분해효소 I) 및 가용성 에폭사이드 가수분해효소(에폭사이드 가수분해효소 II)는 이들이 공통의 조상으로부터 공동진화한 2개의 별개의 효소를 나타내며 동일한 종에서 별개의 반응을 촉매하고 별개의 기능을 갖기 때문에, 파라로그인 것으로 간주될 수 있다. 파라로그는 동일한 종으로부터 유래되며 서로 상당한 서열 유사성을 가진 단백질이며, 이들은 상동성이거나 공통의 조상으로부터 공동진화를 통해 관련이 있음을 제시한다.

비오르토로그 유전자 대체는 상이한 종에서 참조된 유전자 기능을 치환할 수 있는 하나의 종 유래의 비오르토로그 유전자이다. 치환은 예를 들어, 상이한 종에서 참조된 기능과 비교하여, 기원의 종에서 실질적으로 동일하거나 유사한 기능을 수행할 수 있는 것을 포함한다. 일반적으로, 비오르토로그 유전자 대체가, 참조된 기능을 코딩하는 공지된 유전자와 구조적으로 관련이 있는 것으로 동정 가능할 것이라고 하더라도, 구조적으로는 관련성이 더 낮지만 기능적으로는 유사한 유전자들 및 이들의 상응하는 유전자 생성물들은 여전히, 이러한 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이 해당 용어의 의미에 속할 것이다. 기능적 유사성은 예를 들어, 치환되고자 하는 기능을 코딩하는 유전자와 비교하여, 비오르토로그 유전자 생성물의 활성 부위 또는 결합 영역에서 적어도 어느 정도의 구조적 유사상을 필요로 한다. 따라서, 비오르토로그 유전자는 예를 들어 파라로그 또는 관련이 없는 유전자를 포함한다.

따라서, 생합성 능력을 가진 개시된 유전자조작 미생물 유기체의 동정 및 구축에서, 당업자는, 본원에 제공된 교시 및 지도를 특정 종에 적용함으로써 대사적 변형의 동정이 오르토로그의 동정 및 포함 또는 불활성화를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 파라로그 및/또는 비오르토로그 유전자 대체가, 유사하거나 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉매작용할 수 있는 효소를 코딩하는 참조된 미생물에 존재하는 한, 당업자는 또한, 이들 진화적으로 관련이 있는 유전자들을 이용할 수 있다.

오르토로그, 파라로그 및 비오르토로그 유전자 대체는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 조사는 비교된 서열들 사이에서 서열 동일성 및 유사성을 드러낼 것이다. 이러한 유사성을 기반으로 당업자는, 상기 유사성이, 단백질들이 공통의 조상으로부터 진화를 통해 관련된 것임을 가리키기에 충분할 정도로 높은지 확인할 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 알고리즘, 예컨대 Align, BLAST, Clustal W 및 다른 알고리즘들은 원(raw) 서열 유사성 또는 동일성을 비교하고 확인하며, 또한 중량 또는 점수로 지정될 수 있는, 서열 내 갭의 존재 또는 유의성(significance)을 확인한다. 이러한 알고리즘은 또한, 당업계에 알려져 있고, 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 동일성을 확인하는 데에 유사하게 적용 가능하다. 관련성을 확인하기 위한 충분한 유사성에 대한 파라미터들은 통계학적 유사성, 또는 무작위 폴리펩타이드에서 유사한 매치를 발견할 기회, 및 확인된 매치의 유의성을 계산하기 위한 잘 알려진 방법을 기반으로 컴퓨터화된다. 2개 이상의 서열들의 컴퓨터 비교는 또한 요망되는 경우, 당업자에 의해 시각적으로 최적화될 수 있다. 관련된 유전자 생성물 또는 단백질들은 높은 유사성, 예를 들어 25% 내지 100% 서열 동일성을 가진 것으로 예상될 수 있다. 관련이 없는 단백질은, 충분한 크기의 데이터베이스가 스캐닝(scanning)되는 경우, 우연히 발생할 것으로 예상되는 것과 실질적으로 동일한 동일성을 가질 수 있다(약 5%). 5% 내지 24%의 서열은, 비교된 서열들이 관련되어 있다고 결론을 내리기에 충분한 호모로그를 나타낼 수 있거나 나타내지 않을 수 있다. 데이터 세트의 크기가 주어진 경우 이러한 매치의 유의성을 확인하기 위한 부가적인 통계학적 분석이 수행되어, 이들 서열의 관련성을 확인할 수 있다.

BLAST 알고리즘을 사용하여 2개 이상의 서열들의 관련성을 확인하기 위한 예시적인 파라미터들은 예를 들어, 하기에 나타나 있을 수 있다. 간략하게는, 아미노산 서열 정렬은 BLASTP 버전 2.2.29+(Jan-06-2014) 및 다음의 파라미터들: 매트릭스: 0 BLOSUM62; 갭 오픈(gap open): 11; 갭 익스텐션(gap extension): 1; x_드랍오프(dropoff): 50; 예상: 10.0; 단어 크기: 3; 필터: 온(on)을 사용하여 수행될 수 있다. 핵산 서열 정렬은 BLASTN 버전 2.2.29+(Jan-06-2014) 및 다음의 파라미터들: 매치: 1; 미스매치: -2; 갭 오픈: 5; 갭 익스텐션: 2; x_드랍오프: 50; 예상: 10.0; 단어 크기: 11; 필터: 오프(off)를 사용하여 수행될 수 있다. 당업자는, 비교의 엄격성을 증가시키거나 감소시키고, 예를 들어 2개 이상의 서열들의 관련성을 확인하기 위해 상기 파라미터들에 어떤 변형이 이루어질 수 있는지 알 것이다.

다양한 실시형태들에 있어서, 유전자 변형은 개시된 경로들 중 임의의 경로에서 동정된 효소 또는 이러한 효소의 효소적 활성의 조절, 및 따라서 궁극적인 활성을 변화시키는 것에 관한 변형들을 포함하여 다양한 유전자 조작들을 포함한다. 이러한 유전자 변형은, 선택된 및/또는 동정된 배양 조건 하에서 효소 활성 및/또는 선택성의 변화를 초래하는 전사적 변형, 번역 변형 및 번역후 변형, 및/또는 크로틸 알코올 생성과 관련된 효소의 복사수 및/또는 돌연변이체를 증가시키기 위한 것과 같이 부가적인 핵산 서열의 제공에 관한 것일 수 있다. 이러한 유전자 변형을 달성하기 위한 구체적인 방법 및 접근법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 내인성 유전적 요소의 발현 증가; 억제자 유전자의 기능성 감소; 이종성 유전적 요소의 도입; 크로틸 알코올을 생성하기 위한 효소적 전환 단계를 촉매작용하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 복사수의 증가; 효소 비활성(specific enzyme activity)을 증가시키기 위해 돌연변이화된 단백질을 제공하기 위한 유전적 요소의 돌연변이화; 과발현; 저발현(under-expressing); 샤페론의 과발현; 단백질 분해효소(protease)의 녹아웃; 피드백 저해의 변경 또는 변형; 억제자 및/또는 경쟁적 저해자에 대한 손상된 결합 부위 중 하나 이상을 가진 효소 변이체의 제공; 억제자 유전자의 녹아웃; mRNA 안정성을 개선하기 위한 진화, 선택 및/또는 다른 접근법뿐만 아니라 유효 수준의 개선을 달성하기 위한 유효 복사수 및 프로모터를 가진 플라스미드의 사용 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 무작위 돌연변이 생성은 이들 또는 다른 언급된 접근법들 중 임의의 접근법에 속할 수 있는 유전자 변형을 제공하기 위해 수행될 수 있다. 유전자 변형은 추가로 광범위하게는, 관심 핵산에서 하나 이상의 핵산의 (삽입을 포함한) 첨가, (예컨대 돌연변이에 의한) 결실 및 치환에 속한다. 다양한 실시형태에서, 유전자 변형은 효소의 효소적 비활성(specific activity) 및/또는 턴오버 수(turnover number)를 개선시킨다. 제한되고자 하는 것은 아니지만, 변화는 하기들: K_m; k_cat; 및 K_cat/K_m= 촉매 효율 중 하나 이상에 의해 측정될 수 있다.

일 실시형태에서, ADH 및/또는 알켄 환원효소 활성이 부분적으로 또는 완전히 소실된 유전자조작 미생물은 크로톤알데히드 및/또는 크로틸 알코올에 대해 개선된 내성을 가진다. 일부 실시형태에서, 유전자조작 미생물은 ADH 및/또는 알켄 환원효소 활성의 완전한 또는 부분적인 소실을 유발하는 유전자 변형, 및 크로틸 알코올을 중간산물로서 사용하는 크로틸 알코올 및/또는 다른 경로를 포함하는 유전자 변형을 포함한다. 이들 다양한 실시형태는, 부모 균주의 성장에 유해한 크로틸 알코올 농도에서 이들의 성장을 검정함으로써 평가될 수 있다. 크로틸 알코올에 대한 내성은 크로틸 알코올 농도, 성장 조건 및 특정한 조작된 균주에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 실시예 2에 나타낸 바와 같이, adh 및/또는 nemA의 결실은, 변형되지 않은 부모 균주를 능가하는 개선된 성장을 보여주었다.

유전자조작 미생물 및 방법은 크로틸 알코올을 포함하는 배지에서의 이들의 성장의 측면에서 기재될 수 있다. 성장은 선택적으로, 세포가 성장하는 다른 배지 구성성분, 온도 및 다른 조건들과 같은 다른 파라미터의 측면에서 한정될 수 있다. 배양 동안 배지 조건은, 세포에 의한 배지 영양분의 소모 및 고갈, 및 배지 내 바이오생성물, 예컨대 크로틸 알코올의 양의 증가에 의해 유발되는 바와 같이 끊임없이 변화될 것으로 이해된다. 이에, 세포의 성장 속도는 배양 동안 소정의 포인트에서 변화될 수 있다. 세포의 성장 및 성장 속도는 선택적으로, 배지 구성성분의 소정의 양 또는 배지 구성성분의 소정의 범위에서 기재될 수 있다.

배양은 미생물을 성장시키거나(증식기), 정지기에서 유지시키는 것을 포함한다. 크로틸 알코올 또는 이의 다운스트림 생성물의 생성은 증식기 또는 정지기 중 하나의 기, 또는 둘 다의 기에서 발생할 수 있다.

일부 실시형태에서, 유전자조작 미생물 세포의 성장은 소정량의 크로틸 알코올을 함유하는 배지에서 성장하는 이러한 세포의 능력의 측면에서 기재되어 있으며, 여기서, 이러한 세포의 성장은, 크로틸 알코올에 대한 내성을 제공하고/거나 크로틸 생성을 증가시키는 하나 이상의 유전자에 대해 유전자 변형을 갖지 않는 부모 균주와 비교하여 측정된다. 예를 들어, ADH 및/또는 알켄 환원효소 활성을 코딩하는 유전자에서의 결실은, 참조된 유전자 변형을 갖지 않는 부모 숙주 균주 또는 미생물의 성장 속도와 비교하여, 배지에서 1.1배 이상의 성장 속도의 증가를 나타낸다. 성장 속도의 증가는 0.001 중량% 내지 약 2 중량%의 크로틸 알코올을 함유하는 배지에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 유전자조작 미생물은 유전자 변형을 갖지 않는 부모 숙주 균주의 성장 속도의 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 및 2.5배의 성장 속도를 나타낼 수 있다. 다른 실시형태에서, 유전자조작 미생물은 유전자 변형을 갖지 않는 부모 숙주 균주의 성장 속도의 약 1.1배 내지 약 3배, 또는 약 1.2배 내지 약 2.5배의 성장 속도를 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, 유전자조작 미생물은 0.001%(w/v) 초과의 크로틸 알코올, 또는 0.01%(w/v), 0.1%(w/v), 0.5%(w/v), 1%(w/v) 또는 2%(w/v) 초과의 크로틸 알코올을 갖는 배지에서 성장된다.

일부 실시형태에서, 유전자조작 미생물은 0.138 mM 초과의 크로틸 알코올, 또는 1.38 mM, 13.8 mM, 69 mM, 138 mM 또는 276 mM 초과의 크로틸 알코올을 갖는 배지에서 성장된다.

일 실시형태에서, 적합한 ADH 및/또는 알켄 환원효소는 숙주 세포 생리학적 조건에서 반응을 최적으로 촉매작용한다. 또 다른 실시형태에서, 사용하기에 적합한 ADH 및/또는 알데히드 환원효소는 약 pH 4 내지 약 pH 9에서 반응을 최적으로 촉매작용한다. 또 다른 실시형태에서, 사용하기에 적합한 ADH 및/또는 알켄 환원효소는 약 pH 5 내지 약 pH 8에서 반응을 최적으로 촉매작용한다. 또 다른 실시형태에서, 사용하기에 적합한 ADH 및/또는 알켄 환원효소는 약 pH 6 내지 약 pH 7에서 반응을 최적으로 촉매작용한다. 또 다른 실시형태에서, 적합한 ADH 및/또는 알켄 환원효소는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7에서 반응을 최적으로 촉매작용한다. 또 다른 실시형태에서, 사용하기에 적합한 ADH 및/또는 알켄 환원효소는 약 pH 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5 또는 9에서 반응을 최적으로 촉매작용한다. 또 다른 실시형태에서, 사용하기에 적합한 ADH 및/또는 알켄 환원효소는 약 pH 7에서 반응을 최적으로 촉매작용한다.

일 실시형태에서, 사용하기에 적합한 ADH 및/또는 알켄 환원효소는 약 70℃ 이하에서 반응을 최적으로 촉매작용한다. 또 다른 실시형태에서, 적합한 ADH 및/또는 알켄 효소는 약 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 70℃에서 반응을 최적으로 촉매작용한다. 또 다른 실시형태에서, 적합한 ADH 및/또는 알켄 환원효소는 약 30℃에서 반응을 최적으로 촉매작용한다

실시예

실시예 1

균주 구축/결실 방법

알코올 탈수소효소; adhE(GI: 732684842), yqhD(GI: 16130909), adhP(GI: 732684610), yahK(GI.-1657523) 및 N-에틸말레이미드 환원효소, nemA(GI: 732684441)를 이. 콜라이 ATCC 8739 C 변이체 및 이. 콜라이 균주 K-12 아주 MG1655로부터 결실시켰다. 균주들을 문헌[Datsenko and Wanner, Proc Natl Acad Sci U S A (2000), 97(12): 6640-6645]에 기재된 바와 같이 λ 레드 재조합을 사용하여 구축하였다. 간략하게는, 균주들을, 아리비노스 유도성 λ 레드 재조합효소 유전자, 및 카르베니실린(carbenicillin) 내성을 부여하는 bla 내성 카세트를 함유하는 pRED 플라스미드를 이용하여 형질변환시켰다. 그런 다음, pRED 플라스미드를 운반하는 형질변환체를 100 ㎍/mL 카르베니실린 및 134 mM 아리비노스에서 성장시키고, 구성적으로 발현되는 sacB 및 kan 유전자를 함유하는 sacB-kan 카세트의 측면에서 결실되어야 하는 유전자를 표적으로 하는 호모로그 암(arm)을 함유하는 선형 DNA 구축물을 이용하여 형질변환시켰다. kan 유전자는 카나마이신 내성을 부여하고, 50 ㎍/mL 카나마이신 상에서 성장 시, sacB-kan 카세트가 통합된 세포를 선별할 수 있다. sacB 유전자는 수크로스 민감성을 부여하고, 카운터 민감성 압력(cassette)이 통합된 sacB-kan 카세트를 더 이상 갖지 않는 세포를 선별할 수 있게 한다. 세포를 100 ㎍/mL 카르베니실린 및 50 ㎍/mL 카나마이신의 존재 하에 성장시켜, sacB-kan 카세트의 통합 및 pRed 플라스미드의 존재를 확인하였다. 그런 다음, 세포를 134 mM 아리비노스를 이용하여 유도하고, 요망되는 결실의 측면에 있는 염색체 DNA에 대해 DNA 상동성을 가진 sacB-kan 카세트를 대체하는 선형 DNA 구축물로 형질변환시켜, 요망되는 DNA 서열을 효과적으로 결실시켰다(각각의 균주에 대한 결실된 DNA 서열에 대해서는 표 5를 참조). sacB-kan 카세트의 대체는 303 mM 수크로스에서의 성장에 의해 선별되었다. 염색체 결실을 PCR 증폭 및 시퀀싱에 의해 확인하였다(증폭 및 시퀀싱에 사용된 프라이머에 대해서는 표 5를 참조).

이러한 실시예에서, 유기체에서의 1개 초과의 유전자의 결실을 위해, 제1 결실을 가진 균주를 구축하고, 각각의 후속적인 유전자 결실에 사용하였다.

표 5: 서열 목록에서 사용되고 기록된 염색체 및 프라이머로부터 결실된 DNA 서열.

실시예 2

크로틸 알코올 내성 연구

이. 콜라이 균주 K-12 아주 MG1655 균주 48(야생형) 및 다중 결실(ΔyahkΔadhPΔyqhDΔadhE)을 가진 3-FEDB; 및 이. 콜라이 ATCC 8739 C 균주(야생형) 및 이의 변이체들 3-FISC(ΔadhE), 3-GAEB(ΔadhEΔyqhD), 3-GBOG(ΔadhEΔyqhDΔadhP), 및 3-GDOB(ΔadhEΔyqhDΔadhPΔyahK)를 글리세롤 동결 스탁으로부터 LB 아가(agar) 상에서 단일 콜로니를 위해 심었다(struck). 1개 균주당 4개의 단일 콜로니를 고르고, 딥웰(deep well) 96웰 플레이트 내 1 mL LB + 55.7 mM 글루코스 내에 접종하고, 37℃에서 밤새(16시간 내지 20시간) 성장시켰다. 밤새 배양한 배양물의 광학 밀도를 측정하고, 세포를 OD₆₀₀=1까지 정상화(normalize)한 다음, 스핀 다운(spin down)시켰다. 세포를 1 mL의 M9 최소 배지 + 11.1 mM 글루코스에서 재현탁화시켰다. 그런 다음, 세포를 스핀 다운시키고, 1 mL M9 + 11.1 mM 글루코스에서 다시 세척하였다. 바이오스크린 허니콤 2개 플레이트(카탈로그 번호 9502550)에 198 ㎕ M9 + 11.1 mM 글루코스 또는 M9 + 11.1 mM 글루코스 + 138 mM 크로틸 알코올(Sigma-Aldrich)을 충전시켰다. 세척된 세포 2 ㎕ 를 각각의 웰에 N=4에서 첨가하였다. 바이오스크린 허니콤 2개 플레이트를, 37℃에서 15분마다 OD_420-580에서 혼탁도를 판독하도록 설정된 인큐베이터 시스템인 바이오스크린 C MBR(Oy Growth Curves Ab Ltd) 기계 상에 로딩하였다. 성장 곡선 데이터에 대해서는, 도 4a(이. 콜라이 균주 K-12 아주 MG1655 균주) 및 도 4b(이. 콜라이 ATCC 8739 C 변이체 균주)를 참조한다.

도 4a는, 야생형 또는 부모 균주 및 유전자조작 미생물이 크로틸 알코올의 부재 시 성장한 경우, 유사한 성장 속도를 나타냄을 보여준다. 도 4b는, 138 mM 크로틸 알코올의 존재 시 성장한 경우, 야생형 또는 부모 균주의 성장은 저해되는 반면, 유전자조작 미생물 3-FEDB(ΔyahKΔadhPΔyqhDΔadhE)는 크로틸 알코올 상에서 초기 지연 성장(lag grew)을 나타냄을 보여준다.

도 5a는, 야생형 또는 부모 균주 및 유전자조작 미생물이 크로틸 알코올의 부재 시 성장한 경우, 유사한 불규칙한 성장 속도를 나타냄을 보여준다. 도 5b는, 138 mM 크로틸 알코올의 존재 시 성장한 경우, 야생형 또는 부모 균주의 성장은 3-FIDC(ΔadhE) 및 3-GAEB(ΔadhEΔyqhD)와 같이 저해되는 반면, 유전자조작 미생물 3-GBOG(ΔyahKΔadhPΔyqhDΔadhE) 및 3-GBOB(ΔadhEΔyqhDΔadhP)는 크로틸 알코올 상에서 초기 지연 성장을 나타냄을 보여준다.

실시예 3

NemA 입증 실험

균주(ATCC 8739 C 변이체) 3-GGGF(yqhD+nemA+ 부모 균주), 3-GHDO(ΔyqhD), 3-HAEF(ΔnemA) 및 3-HAEG(ΔyqhDΔnemA)를 글리세롤 스탁으로부터 LB 아가 플레이트 상으로 심고, 밤새(16시간 내지 20시간) 성장시켰다. 단일 콜로니를 고르고, 배플드 플라스크(baffled flask) 내 30 mL M9 + 27.8 mM 글루코스 + 10 mM 크로틸 알코올 내에 접종하고, 밤새(16시간 내지 20시간) 성장시켰다. 밤새 배양한 배양물을 OD₆₀₀=0.1에서, 배플드 플라스크 내 새로운 30 mL M9 + 55.7 mM 글루코스 + 10 mM 크로틸 알코올 내에 접종하였다. 크로틸 알코올 상에서 성장시킨 후, 1 mL 시료를 4시간, 8시간 및 27시간째에 취하였다. 시료를 스핀 다운시키고, 상층액을 분석적 분석을 위해 처리하였다. 액체 시료 중 크로틸 알코올 및 n-부탄올의 GCMS 분석을 액체 주사에 의해 수행하였다. 부탄올의 감소를 GCMS 크로마토그램 및 라인 그래프에서 정량화하였다.

GCMS 방법을 다음의 휘발성 화합물들: n-부탄올(n-ButOH) 및 크로틸 알코올(Crot-OH)을 모니터링하기 위해 개발하였다. 이 방법은 낮은 mM 범위(0.5 mM 내지 100 mM에서 선형)에서 검출 한계에서 양호한 민감성을 가진다. 이러한 검정법의 민감성은 화합물에 따라 다르며, 사용된 조건 하에서의 휘발성 및 분압의 함수, 및 MS 이온화/단편화 효율에 따라 다르다. 크로틸 알코올 및 n-부탄올 표준은 Sigma-Aldrich사에서 구매하였다.

질량-민감성 검출기(MSD) 5973에 접속되어 있으며 전자 충격 이온화(EI) 방식으로 작동하는 Agilent 기체 크로마토그래프 6890N을 분석에 사용하였다. 30 m x 0.25 mm 내경(i.d.) x 0.25 ㎛ 필름 두께의 INOWAX 컬럼(Agilent - 19091N-133)을 선택하였다. 시료를 직접 주사 방식으로 작동하는 ALS 오토샘플러에 의해 주사하였다. 사용된 파라미터는: 주사 부피 1.0 ㎕(분할비(split ratio) 20:1), 250℃ 유입구 온도이었다. 헬륨을 담체 기체로서 사용하고, 유속을 1.3 mL/min에서 유지시켰다. 관심 분석물의 양호한 해상(resolution) 및 최소의 매트릭스 간섭을 보장하기 위해, 온도 프로그램을 최적화하였다: 오븐을 초기에 40℃에서 1분 동안 유지시킨 다음, 1℃/min의 속도로 41℃까지 경사 상승(ramp)시킨 다음, 두번째로 35℃/min의 속도로 60℃까지 경사 상승시키고, 마지막으로 100℃/min의 속도로 250℃까지 경사 상승시킨 다음, 4.06분 동안 유지시켰다(총 진행 시간 10분). 낮은 질량 MS 조정 파일 세팅 및 28-150 m/z 질량범위 스캔을 사용하여 데이터를 획득하였다. 관심 분석물의 정량화에 사용된 전형적인 체류 시간(RT) 및 특징적인 질량 단편을 표 6에 열거한다. 표준 믹스의 전형적인 GCMS 크로마토그램은 하기에 지칭된 도면에 제시되어 있다. 정량화는 이차 맞춤(quadratic fit)(전형적으로 0까지 강제화됨(forced to zero))을 사용하여 표준 곡선을 기반으로 수행하였다. GCMS 데이터를 Agilent MSD Productivity ChemStation 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.

도 6a 내지 도 6d에 보고된 바와 같이, 크로틸 알코올-함유 배지 상에서 성장된 유기체의 GC/MS 크로마토그래프를 기반으로 4시간, 8시간 및 27시간째에 n-프로판올, 부탄올 및 크로틸 알코올에 대해 검정 시, 유전자조작 미생물 3-GHDO(ΔyqhD), 3-HAEF(ΔnemA) 및 다중 결실을 가진 3-HAEG(ΔnemAΔyqhD)는 검출 가능한 부탄올 생성을 나타내지 않은 반면, 이들은 크로틸 알코올 및 프로판올 생성을 나타내었다.

Claims

유전자조작 미생물을 이용하는 바이오생성물(bioproduct)의 생성 방법으로서, 크로틸 알코올이 바이오생성물이거나, 크로틸 알코올이 바이오생성물 경로 중의 중간산물이고, 방법이
크로틸 알코올 생성을 유도하는 조건 하에서, 또는 바이오생성물 생성을 유도하는 바이오생성물 경로 중의 중간산물로서 크로틸 알코올의 사용 하에서, 유전자조작 미생물을 배양하는 단계로서, 유전자조작 미생물이 (a) 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키는 알코올 탈수소효소(ADH), (b) 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키는 ADH, 또는 (c) 크로톤알데히드를 부티르알데히드로 전환시키는 알켄 환원효소, 또는 (a), (b) 및 (c)의 임의의 조합에서 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 유발하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하는 것인 단계
를 포함하는 것인 생성 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 바이오생성물 경로의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 바이오생성물 경로가 크로틸 알코올 경로이거나 크로틸 알코올을 바이오생성물 경로 중의 중간산물로서 사용하는 것인 생성 방법.
유전자조작 미생물로서,
(a) 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키는 알코올 탈수소효소(ADH), (b) 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키는 ADH, 또는 (c) 크로톤알데히드를 부티르알데히드로 전환시키는 알켄 환원효소, 또는 (a), (b) 및 (c)의 임의의 조합에서 활성의 부분 소실 또는 완전 소실을 유발하는 적어도 하나의 유전자 변형, 및
바이오생성물 경로의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산으로서, 여기서 바이오생성물 경로가 크로틸 알코올 경로이거나 크로틸 알코올을 바이오생성물 경로 중의 중간산물로서 사용하는 것인 외인성 핵산
을 포함하는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 알코올 탈수소효소가 크로틸 알코올을 크로톤알데히드로 전환시키거나, 부티르알데히드를 부탄올로 전환시키거나, 또는 둘 다인 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 적어도 2, 3 또는 4 가지 유전자에서 유전자 변형을 갖는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 적어도 2, 3 또는 4 가지 유전자에서 유전자 결실을 갖는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ADH 활성이 adhE, adhP, yqhD 및 yahK 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 유전자에 의해 코딩되는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 adhE, adhP, yqhD 및 yahK로부터 선택된 단일 유전자, 또는 (adhE,adhP), (adhE,adhP), 또는 (adhE,yqhD), (adhE,yahK), (adhE,adhP,yqhD), (adhE,adhP,yahK), 및 (adhE,adhP,yqhD,yahK)로부터 선택된 다중 유전자에서 유전자 결실을 갖는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 소실이 활성의 완전 소실인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, ADH의 부분 소실 또는 완전 소실이 크로틸 알코올로부터 크로톤알데히드로의 축적 또는 전환, 또는 부티르알데히드로부터 부탄올로의 축적 또는 전환, 또는 둘 다를 감소시키는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 알켄 환원효소 활성이 EC 번호: 1.3.1.- 부류로부터 선택되는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 알켄 환원효소의 부분 소실 또는 완전 소실이 부티르알데히드 및/또는 부탄올의 축적 또는 전환을 감소시키는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 알켄 환원효소 활성이 nemA 유전자 또는 yqjM 또는 둘 다에 의해 코딩되는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 nemA 유전자 또는 yqjM 유전자 또는 둘 다에서 유전자 결실을 갖는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 이. 콜라이에서 nemA 결실을 갖는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 비. 서브틸리스(B. subtilis)에서 yqjM 결실을 갖는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 nemA에서, 그리고 adhE , adhP , yqhD 및 yahK로부터 선택된 단일 유전자, 또는 (adhE,adhP), (adhE,adhP), 또는 (adhE,yqhD), (adhE,yahK), (adhE,adhP,yqhD), (adhE,adhP,yahK), 및 (adhE,adhP,yqhD,yahK)로부터 선택된 다중 유전자에서 유전자 결실을 갖는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제17항에 있어서, 유전자조작 미생물이 이. 콜라이에서 결실이 있는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 yqjM에서, 그리고 adhE , adhP , yqhD 및 yahK로부터 선택된 단일 유전자, 또는 (adhE,adhP), (adhE,adhP), 또는 (adhE,yqhD), (adhE,yahK), (adhE,adhP,yqhD), (adhE,adhP,yahK), 및 (adhE,adhP,yqhD,yahK)로부터 선택된 다중 유전자에서 유전자 결실을 갖는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제19항에 있어서, 유전자조작 미생물이 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 결실이 있는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 또는 내재성 ADH 효소와 비교하여, 알데히드를 알코올로 전환시키는 방향으로 반응을 구동하는 활성의 증가를 일으키는 유전자 변형을 추가로 포함하는 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 활성의 증가가 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성)를 포함하는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 크로틸 알코올 바이오생성물 경로가 아세틸-CoA:아세틸-CoA 아실전이효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소, 3-히드록시부티릴-CoA 탈수화효소, 크로토닐-CoA 환원효소(알데히드 생성), 크로톤알데히드 환원효소(알코올 생성), 크로토닐-CoA 가수분해효소, 신테타아제(synthetase), 또는 전이효소, 크로토네이트 환원효소, 크로토닐-CoA 환원효소(알코올 생성), 글루타코닐-CoA 탈카르복실화효소, 글루타릴-CoA 탈수소효소, 3-아미노부티릴-CoA 탈아미노효소 또는 4-히드록시부티릴-CoA 탈수화효소를 포함하는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 크로틸 알코올 생성 방향으로 반응을 구동하는 다음의 효소들: 아세틸-CoA:아세틸-CoA 아실전이효소, 아세토아세틸-CoA 환원효소, 3-히드록시부티릴-CoA 탈수화효소, 글루타코닐-CoA 탈카르복실화효소, 글루타릴-CoA 탈수소효소, 3-아미노부티릴-CoA 탈아미노효소 및 4-히드록시부티릴-CoA 탈수화효소 중 하나 이상을 포함하는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 크로틸 알코올을 1,3 -부타디엔으로 전환시키는 효소를 포함하거나, 효소가 리날로올 탈수화효소 또는 이의 변이체인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 크로틸 알코올이 3-부텐-2-올 및/또는 부타디엔으로 전환되는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 크로틸 알코올로부터 부타디엔으로의 전환이, 촉매의 존재 하에서의 화학적 탈수화; 크로틸 알코올로부터 부타디엔으로의 효소적 전환, 또는 크로틸 알코올을 부타디엔으로 전환시킬 수 있는 유전자조작 미생물의 성장에 의한 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 다음의 효소들: 크로틸 알코올 키나아제, 2-부테닐-4-포스페이트 키나아제, 부타디엔 신타아제(synthase), 3-부텐-2-올 신타아제, 3-부텐-2-올 신타아제, 크로틸 알코올 이성화효소, 3-부텐-2-올 탈수화효소, 크로틸 알코올 탈수화효소, 크로틸 알코올 디포스포키나아제, 크로틸 알코올 탈수화효소/비닐 이성화효소를 코딩하는 외인성 핵산들 중 하나 이상을 포함하는, 크로틸 알코올로부터 부타디엔으로의 경로를 포함하는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 아시네토박터(Acinetobacter), 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 안에로비오스피릴룸(Anaerobiospirillum), 악티노바실러스(Actinobacillus), 카스텔라니엘라(Castellaniella), 만하이미아(Mannheimia), 바실러스(Bacillus), 자이모모나스(Zymomonas), 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 클로스트리듐(Clostridium), 슈도모나스(Pseudomonas), 타우에라(Thauera) 및 자이모모나스 속(genus)으로부터 선택되는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12MG1655 또는 에스케리키아 콜라이 ATCC 8739 C 변이체인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이, 유전자 변형을 갖지 않는 부모 숙주 미생물과 비교하여, 크로틸 알코올 상에서 증가된 성장을 나타내는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자조작 미생물이 약 0.138 mM 내지 약 138 mM의 크로틸 알코올을 함유하는 배지 상에서 성장하는 것인 생성 방법 또는 유전자조작 미생물.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 생성 방법 또는 유전자조작 유기체에 의해 생성된 크로틸 알코올, 메틸비닐 카르비놀 또는 부타디엔을 포함하는 세포 배양 조성물.