TW201816109A - 包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌及其相關方法。詳言之，本發明提供一種細菌，其包括作用於非天然受質以產生多種產物及中間物的磷酸丁醯基轉移酶(Ptb)及丁酸激酶(Buk)(Ptb-Buk)。在某些實施例中，本發明係關於將Ptb-Buk引入能夠自氣體受質產生產物的固定C1之微生物中。

Description

包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌

隨著當前醱酵及代謝工程改造之發展，已鑑別及開發各種產物之醱酵途徑(Clomburg，《應用微生物學與生物技術(Appl Microbiol Biotechnol)》，86：419-434,2010；Peralta-Yahya，《生物技術期刊(Biotechnol J)》，5：147-162,2010；Cho，《生物技術進展(Biotechnol Adv)》，pii：S0734-9750(14)00181-5,2014)。然而，所有此等醱酵途徑均為耗能(ATP)或最多能量(ATP)平衡的，從而限制能量限制系統中之產物產量且將產物產生與微生物生長分開。本發明藉由提供獲得多種產物(包括酸、烯烴、醛、醇及二醇)之新穎醱酵途徑及路徑提供克服此等限制之產能(ATP)路徑。此等路徑直接與微生物生長偶合且提供高產物產量。

詳言之，本發明係關於涉及Ptb-Buk之醱酵路徑。磷酸丁醯基轉移酶(Ptb)(EC 2.3.1.19)天然催化丁醯基-CoA與磷酸酯之反應，形成CoA及丁醯基磷酸酯。丁酸激酶(Buk)(EC 2.7.2.7)天然催化丁醯基磷酸酯與ADP之反應，形成丁酸酯(butyrate/butanoate)及ATP。因此，此等酶一起(Ptb-Buk)天然催化丁醯基-CoA向丁酸酯之轉化且經由受質 層面磷酸化(SLP)產生一個ATP。

本發明者已發現Ptb為混雜的且能夠接受多種醯基-CoA及烯醯基-CoA作為受質，使得Ptb-Buk可用於將多種醯基-CoA及烯醯基-CoA分別轉化為其相應酸或烯酸酯，同時經由受質層面磷酸化產生ATP。

此外，與醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)及醇去氫酶組合，經由Ptb-Buk系統形成之酸可進一步轉化為其各別醛、醇或二醇。AOR(EC 1.2.7.5)催化酸與經還原鐵氧化還原蛋白(其可例如由氧化CO或氫氣產生)之反應，形成醛及經氧化鐵氧化還原蛋白。醇去氫酶(EC 1.1.1.1及EC 1.1.1.2)可將醛及NAD(P)H轉化為醇及NAD(P)。

因此，將Ptb-Buk及/或AOR引入異源物質中提供一種以高產量形成天然及非天然產物(諸如酸、烯烴、酮、醛、醇及二醇)之新穎替代途徑，因此克服目前先進技術之限制。

本發明提供一種經基因工程改造之細菌，其包括外源磷酸丁醯基轉移酶(Ptb)及外源丁酸激酶(Buk)(Ptb-Buk)。一般而言，Ptb-Buk作用於非天然受質，例如除丁醯基-CoA及/或丁醯基磷酸酯以外之受質，且產生非天然產物，例如除丁醯基磷酸酯或丁酸酯以外之產物。在某些實施例中，Ptb-Buk將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯、將3-羥基異戊醯基-CoA轉化為3-羥基異戊酸酯，將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯，或將2-羥基異丁醯基-CoA轉化為2-羥基異丁酸酯。

所述細菌可產生酸、烯烴、酮、醛、醇或二醇中之一或多者。更特定言之，所述細菌可產生丙酮或其前驅物、異丙醇或其前驅物、異丁烯或其前驅物、3-羥基丁酸酯或其前驅物、1,3-丁二醇或其前驅物、2-羥基異丁酸酯或其前驅物、己二酸或其前驅物、1,3-己二醇或其前驅物、3-甲基-2-丁醇或其前驅物、2-丁烯-1-醇或其前驅物、異戊酸酯或其前驅物或異戊醇或其前驅物中之一或多者。所述細菌通常不產生丁醇。

所述細菌可進一步包括磷酸轉乙醯酶(Pta)及乙酸激酶(Ack)之斷裂性突變。所述細菌可進一步包括硫酯酶之斷裂性突變。在另一實施例中，本發明提供一種經基因工程改造之細菌，其包括外源Ptb-Buk及外源或內源醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶。

本發明進一步提供一種產生產物之方法，其包括在受質存在下培養任一上述實施例之細菌。產物可為例如丙酮或其前驅物、異丙醇或其前驅物、異丁烯或其前驅物、3-羥基丁酸酯或其前驅物、1,3-丁二醇或其前驅物、2-羥基異丁酸酯或其前驅物、己二酸或其前驅物、1,3-己二醇或其前驅物、3-甲基-2-丁醇或其前驅物、2-丁烯-1-醇或其前驅物、異戊酸酯或其前驅物或異戊醇或其前驅物。通常，受質為氣體受質，包括例如CO、CO₂及H₂中之一或多者。在一個實施例中，氣體受質為合成氣。在另一實施例中，氣體受質為工業廢氣。

圖1為自乙醯基-CoA產生各種產物(包含丙酮、異丙醇、 異丁烯、3-羥基丁酸酯、1,3-丁二醇及2-羥基異丁酸酯)之代謝路徑之圖。乙醯基-CoA可由任何適合受質產生，諸如碳水化合物(例如糖)受質或氣體受質。在本發明中，乙醯基-CoA通常由氣體受質產生。粗體箭頭指示可藉由Ptb-Buk催化之步驟。

圖2為展示藉由Ptb-Buk天然催化之反應(亦即將丁醯基-CoA轉化為丁酸酯且產生一個ATP)的圖。

圖3為比較CoA-轉移酶、硫酯酶及Ptb-Buk之活性的圖。

圖4為展示用包括外源基因之質體修飾之大腸桿菌BL21(D3)中的平均丙酮產量的圖。此資料展現Ptb-Buk在大腸桿菌中將乙醯乙醯基-CoA活體內轉化為乙醯乙酸酯的能力。

圖5為展示誘導帶有pACYC-ptb-buk與pCOLA-thlA-adc質體(表現硫解酶、Ptb-Buk及乙醯乙酸去羧酶)之大腸桿菌BL21(DE3)的作用的圖。

圖6為如下路徑之圖，所述路徑經設計以使用Ptb-Buk產生丙酮，同時再循環在產生(R)-3-羥基丁醯基-CoA中所產生之還原等效物及由Ptb-Buk產生之ATP。

圖7為展示醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)、鐵氧化還原蛋白及Adh在於自產乙醇梭菌(C.autoethanogenum)中產生1,3-丁二醇中之作用的圖。更一般而言，可使用AOR催化酸向醛之轉化，且可使用Adh催化醛向醇/二醇之轉化。

圖8為展示用於產生(R)-3-羥基丁酸酯及2-羥基異丁酸酯之Ptb-Buk的立體特異性的圖。圖8中之術語「天然」係指天然硫酯酶。

圖9為展示經由使用替代性路徑1進行3-羥基異戊醯基 -CoA與3-羥基異戊酸酯之Ptb-Buk轉化產生異丁烯的圖。

圖10為展示經由使用替代性路徑2進行3-羥基異戊醯基-CoA與3-羥基異戊酸酯之Ptb-Buk轉化產生異丁烯的圖。

圖11為展示經由3-丁醛去氫酶(Bld)產生1,3-丁二醇之圖。

圖12為展示相對於對照使用Ptb-Buk系統於自產乙醇梭菌中產生異丙醇的圖。○pMTL85147-thlA-adc，●pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc。

圖13A-F為展示在不同濃度誘導劑IPTG(0、50、100μM)存在下用大腸桿菌中之模組質體產生3-羥基丁酸酯、乙酸酯、乙醇及丙酮的圖。圖13A：pACYC-ptb-buk、pCOLA-thlA-adc、pCDF-phaB。圖13B：pACYC-ptb-buk、pCOLA-thlA-adc、pCDF-phaB-bdh1。圖13C：pCOLA-thlA-adc、pCDF-phaB-bdh1。圖13D：pCOLA-thlA-adc。圖13E：pCDF-phaB-bdh1。圖13F：pCDF-phaB。

圖14為質體pMTL8225-budA：：thlA-phaB之質體圖。

圖15為相較於野生型(W)，自產乙醇梭菌之4個純系(1、4、7、9)中用硫解酶(thlA)及3-羥基丁醯基-CoA去氫酶(phaB)基因置換乙醯乳酸合成酶(budA)基因之PCR驗證的凝膠影像。如藉由相較於野生型PCR片段尺寸較大所見，所有純系為陽性。

圖16為展示分批醱酵自產乙醇梭菌budA：：thlAphaB菌株之醱酵概況且展現自氣體形成3-羥基丁酸酯及1,3-丁二醇的圖。

圖17A為展示經由硫解酶、3-羥基丁醯基-CoA去氫酶 (Bld)及丁醛去氫酶產生1,3-BDO的圖。圖17B為展示bld表現對生長之影響的圖。

圖18A為展示自產乙醇梭菌pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA中自氣體受質形成3-羥基丁酸酯及1,3-丁二醇的圖。圖18B為展示相同培養物中乙酸酯還原為乙醇的圖。

圖19為展示菌株自產乙醇梭菌pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA之醱酵概況的圖，所述菌株展現於連續培養物(在指示時，用既定稀釋速率D連續補充培養基)中自氣體受質形成3-羥基丁酸酯及1,3-丁二醇。

圖20A及圖20B為展示相較於野生型(WT)，表現來自質體pMTL82256-Ptb-Buk之Ptb-Buk系統的自產乙醇梭菌中對一系列醯基-CoA(乙醯乙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA及2-羥基異丁醯基-CoA)之CoA水解活性增加的圖。

圖21A及圖21B為展示相較於自產乙醇梭菌LZ1560或LZ1561中所見之醯基-CoA水解活性，具有不活化硫酯酶之自產乙醇梭菌菌株(CT2640=硫酯酶1，CT 1524=硫酯酶2，CT1780=硫酯酶3)的活性降低的圖。

圖22為展示相較於野生型自產乙醇梭菌，具有斷裂硫酯酶3 CAETHG_1780之自產乙醇梭菌菌株中特定異丙醇產生增加的圖。

圖23A-D為展示野生型自產乙醇梭菌及具有斷裂硫酯酶3(CAETHG_1780)之菌株相較於野生型自產乙醇梭菌的生長(圖23A)及異丙醇(圖23B)、乙酸酯(圖23C)及乙醇(圖23D)產生概況的圖。

圖24為pMTL8225-pta-ack：：ptb-buk之質體圖。

圖25為指示用ptb及buk基因及ermB卡匣置換pta及ack基因之凝膠影像。

圖26為展示藉由過度表現醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶基因aor1使3-羥基丁酸酯向1,3-BDO之轉化增加的圖。

圖27為展示相較於對照(BL21菌株)，硫酯酶TesB、Pta-Ack及Ptb-Buk系統對乙醯乙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA及2-羥基異丁醯基-CoA之CoA水解之活性的圖。Ptb-Buk展示最高活性，而Pta-Ack展示無活性。

圖28A及28B為展示經由Ptb-Buk以及(S)-特異性(Hbd)(圖28A)或(R)-特異性3-羥基丁酸酯(PhaB)(圖28B)去氫酶產生3-羥基丁酸酯的圖。

圖29A-D為展示2-羥基異丁酸(2-HIB)及2-羥基丁酸酯(2-HB)之LC-MS/MS偵測的圖。圖29A：1mM 2-HIB標準物。圖29B：1mM 2-HB標準物。圖29C：0.5mM 2-HB及2-HIB標準物。圖29D：展示自氣體產生2-HIB及2-HB之自產乙醇梭菌樣品的重複樣。

圖30為展示2-羥基異丁酸(8.91分鐘)產生之GC-MS確認的一組圖。第一圖：自產乙醇梭菌+pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-tesB。第二圖：自產乙醇梭菌+pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-ptb-buk(光譜)。第三圖：大腸桿菌+pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-tesB。第四圖：大腸桿菌+pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-ptb-buk。

圖31為即時PCR之一組圖，其展示大腸桿菌、自產乙醇 梭菌LZ1561(30℃下)及自產乙醇梭菌LZ1561(37℃下)中2-HIBA路徑之基因(來自pta-ack啟動子及對應地Wood-Ljungdahl操縱子的啟動子的thlA、hba、meaBhcmA、hcmB)的表現。

圖32為展示包括Ptb-Buk、AOR及Adh之微生物中各種產物之產生的圖。

圖33為展示螢火蟲螢光素酶(Luc)與Ptb-Buk系統偶合以特性化Ptb-Buk變異體的圖。

圖34為產生各種產物(包含己二酸)之代謝路徑的圖。粗體箭頭指示可藉由Ptb-Buk催化之步驟。

圖35為產生各種產物(包含1,3-己二醇、2-甲基-2-丁醇及2-丁烯-1-醇)之代謝路徑的圖。粗體箭頭指示可藉由Ptb-Buk催化之步驟。

圖36為產生各種產物(包含異戊酸酯及異戊醇)之代謝路徑的圖。粗體箭頭指示可藉由Ptb-Buk催化之步驟。

圖37為各種生長點之含有質體pMTL82256-thlA-ctfAB之自產乙醇梭菌中3-HB產生的圖。

圖38A為展示菌株自產乙醇梭菌pta-ack：：ptb-buk+pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc之生長及乙醇及2,3-丁二醇產生概況的圖。圖38B為展示菌株自產乙醇梭菌pta-ack：：ptb-buk+pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc之異丙醇及3-HB產生概況的圖。

圖39為經由組合已知鏈伸長路徑(Hbd、Crt、Bcd-EtfAB、Thl)與Ptb-Buk+AOR/Adc-Adh產生一系列C₄、C₆、C₈、C₁₀、C₁₂、C14醇、酮、烯醇或二醇之路徑流程的圖。

圖40為展示藉由各種生長點之用質體pMTL83159-phaB-thlA轉型之自產乙醇梭菌產生3-HB及1,3-BDO的圖。

圖41為展示藉由各種生長點之包括budA基因剔除及pMTL-HBD-ThlA之自產乙醇梭菌產生3-HB及1,3-BDO的圖。

圖42A為展示自產乙醇梭菌pMTL83159-phaB-thlA+pMTL82256醱酵中3-HB之產生的圖。圖42B為展示自產乙醇梭菌pMTL83159-phaB-thlA+pMTL82256-buk-ptb醱酵中3-HB之產生的圖。

圖43為展示硫酯酶基因剔除(△CAETHG_1524)、表現質體pMTL83156-phaB-thlA且含有及不含Ptb-Buk表現質體pMTL82256-buk-ptb的自產乙醇梭菌菌株中3-HB之產生的圖。

圖44為展示表現質體pMTL82256-hbd-thlA(2pf)且含有及不含AOR過度表現質體pMTL83159-aor1(+aor1)之自產乙醇梭菌菌株中乙醇及1,3-BDO產生的圖。

圖1及圖34-36之代謝路徑

圖1及圖34-36為自受質產生如下各種酸、烯烴、酮、醛、醇及二醇產物之代謝路徑的圖，包含丙酮、異丙醇、異丁烯、3-羥基丁酸酯(R及S-異構體)、1,3-丁二醇、2-羥基異丁酸酯、己二酸、1,3-己二醇、2-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、異戊酸酯及異戊醇。粗體箭頭指示可藉由Ptb-Buk催化之步驟。對於圖1及圖34-36中詳述之各步驟及酶促路徑，提供例示性酶。然而，一般技術者可已知其他適合酶。

步驟1展示乙醯基-CoA向乙醯乙醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由硫解酶(亦即乙醯基-CoA乙醯基轉移酶)(EC 2.3.1.9)催化。硫解酶可為例如來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)之ThlA(WP_010966157.1)(SEQ ID NO：1)、來自鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)之PhaA(WP_013956452.1)(SEQ ID NO：2)、來自鉤蟲貪銅菌之BktB(WP_011615089.1)(SEQ ID NO：3)或來自大腸桿菌(Escherichia coli)之AtoB(NP_416728.1)(SEQ ID NO：4)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌(Clostridium ljungdahlii)及拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟具有天然活性。

步驟2展示乙醯乙醯基-CoA向乙醯乙酸酯之轉化。此步驟可藉由CoA-轉移酶(亦即乙醯基-CoA：乙醯乙醯基-CoA轉移酶)(EC 2.8.3.9)催化。CoA-轉移酶可為例如CtfAB，一種雜二聚體，其包括來自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)之次單位CtfA及CtfB(CtfA，WP_012059996.1)(SEQ ID NO：5)(CtfB，WP_012059997.1)(SEQ ID NO：6)。此步驟亦可藉由硫酯酶(EC 3.1.2.20)催化。硫酯酶可為例如來自大腸桿菌之TesB(NP_414986.1)(SEQ ID NO：7)。此步驟亦可藉由例如來自自產乙醇梭菌或永達爾梭菌之推定硫酯酶催化。詳言之，已鑑別自產乙醇梭菌中之三種推定硫酯酶：(1)「硫酯酶1」(AGY74947.1；標註為棕櫚醯基-CoA水解酶；SEQ ID NO：8)，(2)「硫酯酶2」(AGY75747.1；標註為4-羥苯甲醯基-CoA硫酯酶；SEQ ID NO：9)，及(3)「硫酯酶3」(AGY75999.1；標註為推定硫酯酶；SEQ ID NO：10)。 亦已鑑別永達爾梭菌中之三種推定硫酯酶：(1)「硫酯酶1」(ADK15695.1；標註為預測醯基-CoA硫酯酶1；SEQ ID NO：11)，(2)「硫酯酶2」(ADK16655.1；標註為預測硫酯酶；SEQ ID NO：12)，及(3)「硫酯酶3」(ADK16959.1；標註為預測硫酯酶；SEQ ID NO：13)。此步驟亦可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(或大腸桿菌)中之天然酶(諸如來自自產乙醇梭菌之硫酯酶)可催化此步驟且產生一定量之下游產物。然而，可能需要引入外源酶或過度表現內源酶來產生所要水準之下游產物。另外，在某些實施例中，可能需要向內源酶(諸如內源硫酯酶)中引入斷裂性突變來降低或去除與所引入Ptb-Buk之競爭。

步驟3展示乙醯乙酸酯向丙酮之轉化。此步驟可藉由乙醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.4)催化。乙醯乙酸去羧酶可為例如來自拜氏梭菌之Adc(WP_012059998.1)(SEQ ID NO：14)。此步驟亦可藉由α-酮基異戊酸去羧酶(EC 4.1.1.74)催化。α-酮基異戊酸去羧酶可為例如來自雷特氏乳球菌(Lactococcus lactis)之KivD(SEQ ID NO：15)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。另外，大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。罕見地，乙醯乙酸酯向丙酮之轉化可自發發生。然而，自發轉化高度低效且不太可能產生所要水準之下游產物。

步驟4展示丙酮向異丙醇之轉化。此步驟可藉由一級：二級醇去氫酶(EC 1.1.1.2)催化。一級：二級醇去氫酶 可為例如來自自產乙醇梭菌之SecAdh(AGY74782.1)(SEQ ID NO：16)、來自永達爾梭菌之SecAdh(ADK15544.1)(SEQ ID NO：17)、來自拉氏梭菌之SecAdh(WP_013239134.1)(SEQ ID NO：18)或來自拜氏梭菌之SecAdh(WP_026889046.1)(SEQ ID NO：19)。此步驟亦可藉由一級：二級醇去氫酶(EC 1.1.1.80)催化，諸如來自布氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter brokii)之SecAdh(3FSR_A)(SEQ ID NO：20)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性(Köpke，應用與環境微生物學(Appl Environ Microbiol),80：3394-3403,2014)。然而，大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。將自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中此酶之基因含量下調或基因剔除使得丙酮而非異丙醇產生且聚積(WO 2015/085015)。

步驟5展示丙酮向3-羥基異戊酸酯之轉化。此步驟可藉由羥基異戊酸合成酶催化，諸如來自小家鼠(Mus musculus)之羥甲基戊二醯基-CoA合成酶(HMG-CoA合成酶)(EC 2.3.3.10)(SEQ ID NO：21)(US 2012/0110001)。羥甲基戊二醯基-CoA合成酶可經工程改造以改良活性。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟6展示3-羥基異戊酸酯向異丁烯(isobutylene/isobutene)之轉化。此步驟可藉由羥基異戊酸磷酸化酶/去羧酶催化。此步驟亦可藉由甲羥戊酸二磷酸去羧酶(羥基異戊酸去羧酶)(EC 4.1.1.33)催化。甲羥戊酸二磷酸去羧酶可為例如來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之 Mdd(CAA96324.1)(SEQ ID NO：22)或來自乾熱嗜酸菌(Picrophilus torridus)之Mdd(WP_011178157.1)(SEQ ID NO：23)(US 2011/0165644；van Leeuwen，應用微生物學與生物技術(Appl Microbiol Biotechnol),93：1377-1387,2012)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟7展示丙酮向3-羥基異戊醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由3-羥基異戊醯基-CoA合成酶催化。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟8展示3-羥基異戊醯基-CoA向3-羥基異戊酸酯之轉化。此步驟可藉由CoA-轉移酶(亦即乙醯基-CoA：乙醯乙醯基-CoA轉移酶)(EC 2.8.3.9)催化。CoA-轉移酶可為例如CtfAB，一種雜二聚體，其包括來自拜氏梭菌之次單位CtfA及CtfB(CtfA，WP_012059996.1)(SEQ ID NO：5)(CtfB，WP_012059997.1)(SEQ ID NO：6)。此步驟亦可藉由硫酯酶(EC 3.1.2.20)催化。硫酯酶可為例如來自大腸桿菌之TesB(NP_414986.1)(SEQ ID NO：7)。此步驟亦可藉由例如來自自產乙醇梭菌或永達爾梭菌之推定硫酯酶催化。詳言之，已鑑別自產乙醇梭菌中之三種推定硫酯酶：(1)「硫酯酶1」(AGY74947.1；標註為棕櫚醯基-CoA水解酶；SEQ ID NO：8)，(2)「硫酯酶2」(AGY75747.1；標註為4-羥苯甲醯基-CoA硫酯酶；SEQ ID NO：9)，及(3)「硫酯酶3」(AGY75999.1；標註為推定硫酯酶；SEQ ID NO：10)。亦已鑑別永達爾梭菌中之三種推定硫酯酶：(1)「硫酯酶1」(ADK15695.1；標註 為預測醯基-CoA硫酯酶1；SEQ ID NO：11)，(2)「硫酯酶2」(ADK16655.1；標註為預測硫酯酶；SEQ ID NO：12)，及(3)「硫酯酶3」(ADK16959.1；標註為預測硫酯酶；SEQ ID NO：13)。此步驟亦可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(或大腸桿菌)中之天然酶(諸如來自自產乙醇梭菌之硫酯酶)可催化此步驟且產生一定量之下游產物。然而，可能需要引入外源酶或過度表現內源酶來產生所要水準之下游產物。另外，在某些實施例中，可能需要向內源酶(諸如內源硫酯酶)中引入斷裂性突變來降低或去除與所引入Ptb-Buk之競爭。

步驟9展示乙醯基-CoA向3-甲基-2-側氧基戊酸酯之轉化。此步驟涵蓋參與異白胺酸生物合成路徑之多個酶促反應，所述路徑天然存在於多種細菌中，包含自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(及大腸桿菌)。參與乙醯基-CoA向3-甲基-2-側氧基戊酸酯之轉化的酶可包含甲基蘋果酸合成酶(EC 2.3.1.182)、3-異丙基蘋果酸去水酶(EC 4.2.1.35)、3-異丙基蘋果酸去氫酶(EC 1.1.1.85)、乙醯乳酸合成酶(EC 2.2.1.6)、酮醇酸還原異構酶(EC 1.1.1.86)及/或二羥酸去水酶(EC 4.2.1.9)。甲基蘋果酸合成酶可為例如來自自產乙醇梭菌之CimA(AGY76958.1)(SEQ ID NO：24)或來自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)之CimA(NP_248395.1)(SEQ ID NO：25)。3-異丙基蘋果酸去水酶可為例如來自自產乙醇梭菌之LeuCD(WP_023162955.1， LeuC；AGY77204.1，LeuD)(分別為SEQ ID NO：26及27)或來自大腸桿菌之LeuCD(NP_414614.1，LeuC；NP_414613.1，LeuD)(分別為SEQ ID NO：28及29)。3-異丙基蘋果酸去氫酶可為例如來自自產乙醇梭菌之LeuB(WP_023162957.1)(SEQ ID NO：30)或來自大腸桿菌之LeuB(NP_414615.4)(SEQ ID NO：31)。乙醯乳酸合成酶可為例如來自自產乙醇梭菌之IlvBN(AGY74359.1，IlvB；AGY74635.1，IlvB；AGY74360.1，IlvN)(分別為SEQ ID NO：32、33及34)或來自大腸桿菌之IlvBN(NP_418127.1，IlvB；NP_418126.1，IlvN)(分別為SEQ ID NO：35及36)。酮醇酸還原異構酶可為例如來自自產乙醇梭菌之IlvC(WP_013238693.1)(SEQ ID NO：37)或來自大腸桿菌之IlvC(NP_418222.1)(SEQ ID NO：38)。二羥酸去水酶可為例如來自自產乙醇梭菌之IlvD(WP_013238694.1)(SEQ ID NO：39)或來自大腸桿菌之IlvD(YP_026248.1)(SEQ ID NO：40)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。

步驟10展示3-甲基-2-側氧基戊酸酯向2-甲基丁醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由酮基異戊酸氧化還原酶(EC 1.2.7.7)催化。酮基異戊酸氧化還原酶可為例如來自熱自養甲烷熱桿菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)之VorABCD(WP_010876344.1，VorA；WP_010876343.1，VorB；WP_010876342.1，VorC；WP_010876341.1，VorD)(分別為SEQ ID NO：41-44)或來自強烈火球菌(Pyrococcus furiosus)之VorABCD(WP_011012106.1，VorA；WP_011012105.1， VorB；WP_011012108.1，VorC；WP_011012107.1，VorD)(分別為SEQ ID NO：45-48)。VorABCD為4-次單位酶。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟11展示2-甲基丁醯基-CoA向2-甲基巴豆醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由2-甲基丁醯基-CoA去氫酶(EC 1.3.99.12)催化。2-甲基丁醯基-CoA去氫酶可為例如來自除蟲鏈黴菌(Streptomyces avermitilis)之AcdH(AAD44196.1或BAB69160.1)(SEQ ID NO：49)或來自天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)之AcdH(AAD44195.1)(SEQ ID NO：50)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟12展示2-甲基巴豆醯基-CoA向3-羥基異戊醯基基-CoA之轉化。此步驟可藉由巴豆酸酶/3-羥基丁醯基-CoA去水酶(EC 4.2.1.55)催化。巴豆酸酶/3-羥基丁醯基-CoA去水酶可為例如來自拜氏梭菌之Crt(ABR34202.1)(SEQ ID NO：51)、來自丙酮丁醇梭菌之Crt(NP_349318.1)(SEQ ID NO：52)或來自黃色黏球菌(Myxococcus xanthus)之LiuC(WP_011553770.1)。此步驟亦可藉由巴豆醯基-CoA羧化酶-還原酶(EC 1.3.1.86)催化。巴豆醯基-CoA羧化酶-還原酶可為例如來自齒垢密螺旋體(Treponema denticola)之Ccr(NP_971211.1)(SEQ ID NO：53)。此步驟亦可藉由巴豆醯基-CoA還原酶(EC 1.3.1.44)催化。巴豆醯基-CoA還原酶可為例如來自纖細裸藻(Euglena gracilis)之Ter(AAW66853.1)(SEQ ID NO：54)。此步驟亦可藉由3-羥基丙醯基-CoA去水 酶(EC 4.2.1.116)催化。此3-羥基丙醯基-CoA去水酶可為例如來自勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)之Msed_2001(WP_012021928.1)。此步驟亦可藉由烯醯基-CoA水合酶催化。此烯醯基-CoA水合酶(4.2.1.17)可為例如來自炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)之YngF(WP_000787371.1)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟13展示乙醯乙醯基-CoA向3-羥基丁醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由3-羥基丁醯基-CoA去氫酶(EC 1.1.1.157)催化。3-羥基丁醯基-CoA去氫酶可為例如來自拜氏梭菌之Hbd(WP_011967675.1)(SEQ ID NO：55)、來自丙酮丁醇梭菌之Hbd(NP_349314.1)(SEQ ID NO：56)或來自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)之Hbd1(WP_011989027.1)(SEQ ID NO：57)。此步驟亦可藉由乙醯乙醯基-CoA還原酶(EC 4.2.1.36)催化。乙醯乙醯基-CoA還原酶可為例如來自鉤蟲貪銅菌之PhaB(WP_010810131.1)(SEQ ID NO：58)。此步驟亦可藉由乙醯乙醯基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)催化。值得注意的是，PhaB為R特異性且Hbd為S特異性的。另外，來自克氏梭菌之Hbd1具有NADPH依賴性，且來自丙酮丁醇梭菌及拜氏梭菌之Hbd具有NADH依賴性。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟14展示3-羥基丁醯基-CoA向3-羥基丁酸酯之轉化。此步驟可藉由硫酯酶(EC 3.1.2.20)催化。硫酯酶可為例如來自大腸桿菌之TesB(NP_414986.1)(SEQ ID NO： 7)。此步驟亦可藉由例如來自自產乙醇梭菌或永達爾梭菌之推定硫酯酶催化。詳言之，已鑑別自產乙醇梭菌中之三種推定硫酯酶：(1)「硫酯酶1」(AGY74947.1；標註為棕櫚醯基-CoA水解酶；SEQ ID NO：8)，(2)「硫酯酶2」(AGY75747.1；標註為4-羥苯甲醯基-CoA硫酯酶；SEQ ID NO：9)，及(3)「硫酯酶3」(AGY75999.1；標註為推定硫酯酶；SEQ ID NO：10)。亦已鑑別永達爾梭菌中之三種推定硫酯酶：(1)「硫酯酶1」(ADK15695.1；標註為預測醯基-CoA硫酯酶1；SEQ ID NO：11)，(2)「硫酯酶2」(ADK16655.1；標註為預測硫酯酶；SEQ ID NO：12)，及(3)「硫酯酶3」(ADK16959.1；標註為預測硫酯酶；SEQ ID NO：13)。此步驟亦可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(或大腸桿菌)中之天然酶(諸如來自自產乙醇梭菌之硫酯酶)可催化此步驟且產生一定量之下游產物。然而，可能需要引入外源酶或過度表現內源酶來產生所要水準之下游產物。另外，在某些實施例中，可能需要向內源酶(諸如內源硫酯酶)中引入斷裂性突變來降低或去除與所引入Ptb-Buk之競爭。

步驟15展示3-羥基丁酸酯向乙醯乙酸酯之轉化。此步驟可藉由3-羥基丁酸去氫酶(EC 1.1.1.30)催化。3-羥基丁酸去氫酶可為例如來自皮氏羅爾斯頓菌(Ralstonia pickettii)之Bdh1(BAE72684.1)(SEQ ID NO：60)或來自皮氏羅爾斯頓菌之Bdh2(BAE72685.1)(SEQ ID NO：61)。逆向反應，即乙醯乙酸酯向3-羥基丁酸酯轉化，可藉由不同 3-羥基丁酸去氫酶(EC 1.1.1.30)催化。舉例而言，乙醯乙酸酯向3-羥基丁酸酯之轉化可藉由來自自產乙醇梭菌之Bdh(AGY75962)(SEQ ID NO：62)催化。永達爾梭菌及拉氏梭菌很可能含有具有類似活性之酶。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟16展示3-羥基丁酸酯向3-羥基丁醛之轉化。此步驟可藉由醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(EC 1.2.7.5)催化。醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)可為例如來自自產乙醇梭菌之AOR(WP_013238665.1；WP_013238675.1)(分別為SEQ ID NO：63及64)或來自永達爾梭菌之AOR(ADK15073.1；ADK15083.1)(分別為SEQ ID NO：65及66)。在其他實施例中，醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶可來自或可源自例如以下來源中之任一者，其序列可公開獲得：

AOR催化酸與經還原鐵氧化還原蛋白之反應，形成醛及經氧化鐵氧化還原蛋白。在產乙酸菌中，此反應可與均產生經還原鐵氧化還原蛋白之氧化CO(經由CO去氫酶，EC 1.2.7.4)或氫氣(經由鐵氧化還原蛋白依賴性氫化酶，EC 1.12.7.2或1.12.1.4)偶合(Köpke，《生物技術新見(Curr Opin Biotechnol)》，22：320-325,2011；Köpke，《美國科學院院報(PNAS USA)》，107：13087-13092,2010)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。然而，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中可能需要過度表現內源AOR或引入外源AOR來提高產物產量。或者，可將外源AOR引入不天然包括AOR之微生物(例如大腸桿菌)中。詳言之，共表現Ptb-Buk與AOR(及視情況共表現Adh)可使得此類微生物能夠產生新穎非天然產物。

步驟17展示3-羥基丁醛向1,3-丁二醇之轉化。此步驟可藉由醇去氫酶(EC 1.1.1.1.或1.1.1.2)催化。醇去氫酶可將醛及NAD(P)H轉化為醇及NAD(P)。醇去氫酶可為例如來自自產乙醇梭菌(AGY76060.1)(SEQ ID NO：67)、永達爾梭菌(ADK17019.1)(SEQ ID NO：68)或拉氏梭菌之Adh；來自丙酮丁醇梭菌之BdhB(NP_349891.1)(SEQ ID NO：69)；來自拜氏梭菌之Bdh(WP_041897187.1)(SEQ ID NO：70)；來自永達爾梭菌之Bdh1(YP_003780648.1)(SEQ ID NO：71)；來自自產乙醇梭菌之Bdh1(AGY76060.1)(SEQ ID NO：72)；來自永達爾梭菌之Bdh2(YP_003782121.1)(SEQ ID NO：73)、來自自產乙醇梭菌之Bdh2(AGY74784.1)(SEQ ID NO：74)、來自丙酮丁醇梭菌之AdhE1(NP_149325.1)(SEQ ID NO： 75)、來自丙酮丁醇梭菌之AdhE2(NP_149199.1)(SEQ ID NO：76)、來自拜氏梭菌之AdhE(WP_041893626.1)(SEQ ID NO：77)、來自自產乙醇梭菌之AdhE1(WP_023163372.1)(SEQ ID NO：78)或來自自產乙醇梭菌之AdhE2(WP_023163373.1)(SEQ ID NO：79)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。然而，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中可能需要過度表現內源醇去氫酶或引入外源醇去氫酶來提高產物產量。大腸桿菌對此步驟很可能不具有天然活性。

步驟18展示3-羥基丁醯基-CoA向3-羥基丁醛之轉化。此步驟可藉由丁醛去氫酶(EC 1.2.1.57)催化。丁醛去氫酶可為例如來自糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)之Bld(AAP42563.1)(SEQ ID NO：80)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟19展示3-羥基丁醯基-CoA向2-羥基異丁醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由2-羥基異丁醯基-CoA變位酶(EC 5.4.99.-)催化。2-羥基異丁醯基-CoA變位酶可為例如來自三碳變形菌(Aquincola tertiaricarbonis)之HcmAB(AFK77668.1，大次單位；AFK77665.1，小次單位)(分別為SEQ ID NO：81及82)或來自Kyrpidia tusciae之HcmAB(WP_013074530.1，大次單位；WP_013074531.1，小次單位)(分別為SEQ ID NO：83及84)。儘管伴隨蛋白MeaB(AFK77667.1，三碳變形菌；WP_013074529.1，Kyrpidia tusciae)(分別為SEQ ID NO：85及86)不為HcmAB功能所 要，但已描述MeaB藉由再活化HcmAB改良HcmAB之活性(Yaueva，生物化學雜誌(J Biol Chem),287：15502-15511,2012)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟20展示2-羥基異丁醯基-CoA向2-羥基異丁酸酯之轉化。此步驟可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟21展示乙醯基-CoA向丁二醯基-CoA之轉化。此步驟涵蓋參與還原TCA路徑中之多個酶促反應，所述路徑天然存在於多種細菌中，包含自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(及大腸桿菌)(Brown，《生物燃料生物技術(Biotechnol Biofuels)》，7：40,2014；美國專利9,297,026)。參與乙醯基-CoA向丁二醯基-CoA之轉化的酶可包含丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(PFOR)(EC 1.2.7.1)、丙酮酸羧化酶(PYC)(EC 6.4.1.1)、蘋果酸酶/蘋果酸去氫酶(EC 1.1.1.38、EC 1.1.1.40)、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)(EC：2.7.9.1)、PEP羧激酶(PCK)(EC 4.1.1.49)、反丁烯二酸水合酶/反丁烯二酸酶(EC 4.2.1.2)、反丁烯二酸還原酶(EC 1.3.5.1)/丁二酸去氫酶(EC 1.3.5.4)及丁二醯基-CoA合成酶(EC 6.2.1.5)。丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶可例如來自自產乙醇梭菌(AGY75153，AGY77232)或大腸桿菌(NP_415896)。丙酮酸羧化酶可例如來自自產乙醇梭菌 (AGY75817)。蘋果酸酶/蘋果酸去氫酶可例如來自自產乙醇梭菌(AGY76687)或大腸桿菌(NP_416714、NP_417703)。丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)可例如來自自產乙醇梭菌(AGY76274、AGY77114)。PEP羧激酶(PCK)可例如來自自產乙醇梭菌(AGY76928)或大腸桿菌(NP_417862)。反丁烯二酸水合酶/反丁烯二酸酶可例如來自自產乙醇梭菌(AGY76121、AGY76122)或大腸桿菌(NP_416128、NP_416129、NP_418546)。反丁烯二酸還原酶/丁二酸去氫酶可例如來自自產乙醇梭菌(AGY74573、AGY74575、AGY75257、AGY77166)或大腸桿菌(NP_415249、NP_415250、NP_415251、NP_415252、NP_418575、NP_418576、NP_418577、NP_418578)。丁二醯基-CoA合成酶可例如來自大腸桿菌(NP_415256、NP_415257)。

步驟22展示乙醯基-CoA及丁二醯基-CoA向3-側氧基-己二醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由β-酮基己二醯基-CoA硫解酶(EC 2.3.1.16)催化。酮基異戊酸酯氧化還原酶可為例如來自大腸桿菌之PaaJ(WP_001206190.1)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟23展示3-側氧基-己二醯基-CoA向3-羥基己二醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由3-羥基丁醯基-CoA去氫酶(EC 1.1.1.157)或乙醯乙醯基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)催化。3-羥基丁醯基-CoA去氫酶或乙醯乙醯基-CoA水合酶可為例如來自拜氏梭菌之Hbd(WP_011967675.1)(SEQ ID NO：55)、來自丙酮丁醇梭菌之Hbd(NP_349314.1)(SEQ ID NO： 56)、來自克氏梭菌之Hbd1(WP_011989027.1)(SEQ ID NO：57)或來自鉤蟲貪銅菌之PaaH1(WP_010814882.1)。值得注意的是，PhaB為R特異性的且Hbd為S特異性的。另外，來自克氏梭菌之Hbd1具有NADPH依賴性且來自丙酮丁醇梭菌及拜氏梭菌之Hbd具有NADH依賴性。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟24展示羥基己二醯基-CoA向2,3-去氫己二醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由烯醯基-CoA水合酶(EC：4.2.1.17)或烯醯基-CoA還原酶(EC：1.3.1.38)催化。烯醯基-CoA水合酶或烯醯基-CoA還原酶可為例如來自丙酮丁醇梭菌之Crt(NP_349318.1)或來自豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)之PhaJ(032472)(Seq.ID No.52)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟25展示2,3-去氫己二醯基-CoA向己二醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由反-2-烯醯基-CoA還原酶(EC 1.3.8.1、EC 1.3.1.86、EC 1.3.1.85、EC 1.3.1.44)催化。反-2-烯醯基-CoA還原酶可為例如來自丙酮丁醇梭菌之Bcd(NP_349317.1)，其與電子黃素蛋白EtfAB(NP_349315、NP_349316)形成複合物；來自山丘鏈黴菌(Streptomyces collinus)之Ccr(AAA92890)；來自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)之Ccr(YP_354044.1)；來自齒垢密螺旋體之Ter(NP_971211.1)或來自纖細裸藻之Ter(AY741582.1)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知 天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟26展示己二醯基-CoA向己二酸之轉化。此步驟可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(或大腸桿菌)中之天然酶(諸如來自自產乙醇梭菌之硫酯酶)可催化此步驟且產生一定量之下游產物。然而，可能需要引入外源酶或過度表現內源酶來產生所要水準之下游產物。另外，在某些實施例中，可能需要向內源酶(諸如內源硫酯酶)中引入斷裂性突變來降低或去除與所引入Ptb-Buk之競爭。

步驟27展示3-羥基丁醯基-CoA向巴豆醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由巴豆醯基-CoA水合酶(巴豆酸酶)(EC 4.2.1.17)或巴豆醯基-CoA還原酶(EC 1.3.1.38)催化。巴豆醯基-CoA水合酶(巴豆酸酶)或巴豆醯基-CoA還原酶可為例如來自丙酮丁醇梭菌之Crt(NP_349318.1)(SEQ ID NO：52)或來自豚鼠氣單胞菌之PhaJ(O32472)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟28展示巴豆醯基-CoA向巴豆酸酯之轉化。此步驟可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(或大腸桿菌)中之天然酶(諸如來自自產乙醇梭菌之硫酯酶)可催化此步驟且產生一定量之下游產物。然而，可能 需要引入外源酶或過度表現內源酶來產生所要水準之下游產物。另外，在某些實施例中，可能需要向內源酶(諸如內源硫酯酶)中引入斷裂性突變來降低或去除與所引入Ptb-Buk之競爭。

步驟29展示巴豆酸酯向巴豆醛之轉化。此步驟可藉由醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(EC 1.2.7.5)催化。醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶之例示性來源描述在本申請案他處。AOR催化酸與經還原鐵氧化還原蛋白之反應，形成醛及經氧化鐵氧化還原蛋白。在產乙酸菌中，此反應可與均產生經還原鐵氧化還原蛋白之氧化CO(經由CO去氫酶，EC 1.2.7.4)或氫氣(經由鐵氧化還原蛋白依賴性氫化酶，EC 1.12.7.2或1.12.1.4)偶合(Köpke，《生物技術新見》，22：320-325,2011；Köpke，《美國科學院院報》，107：13087-13092,2010)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。然而，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中可能需要過度表現內源AOR或引入外源AOR來提高產物產量。強烈火球菌之AOR已展現轉化巴豆醛及巴豆酸酯之活性(Loes，細菌學雜誌(J Bacteriol),187：7056-7061,2005)。或者，可將外源AOR引入不天然包括AOR之微生物(例如大腸桿菌)中。詳言之，共表現Ptb-Buk與AOR(及視情況共表現Adh)可使得此類微生物能夠產生新穎非天然產物。

步驟30展示巴豆醛向2-丁烯-1-醇之轉化。此步驟可藉由醇去氫酶(EC 1.1.1.1.或1.1.1.2)催化。醇去氫酶可將醛及NAD(P)H轉化為醇及NAD(P)。醇去氫酶可為例如來自自產乙醇梭菌(AGY76060.1)(SEQ ID NO：67)、永達 爾梭菌(ADK17019.1)(SEQ ID NO：68)或拉氏梭菌之Adh；來自丙酮丁醇梭菌之BdhB(NP_349891.1)(SEQ ID NO：69)；來自拜氏梭菌之Bdh(WP_041897187.1)(SEQ ID NO：70)；來自永達爾梭菌之Bdh1(YP_003780648.1)(SEQ ID NO：71)；來自自產乙醇梭菌之Bdh1(AGY76060.1)(SEQ ID NO：72)；來自永達爾梭菌之Bdh2(YP_003782121.1)(SEQ ID NO：73)、來自自產乙醇梭菌之Bdh2(AGY74784.1)(SEQ ID NO：74)、來自丙酮丁醇梭菌之AdhE1(NP_149325.1)(SEQ ID NO：75)、來自丙酮丁醇梭菌之AdhE2(NP_149199.1)(SEQ ID NO：76)、來自拜氏梭菌之AdhE(WP_041893626.1)(SEQ ID NO：77)、來自自產乙醇梭菌之AdhE1(WP_023163372.1)(SEQ ID NO：78)或來自自產乙醇梭菌之AdhE2(WP_023163373.1)(SEQ ID NO：79)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。然而，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中可能需要過度表現內源醇去氫酶或引入外源醇去氫酶來提高產物產量。大腸桿菌對此步驟很可能不具有天然活性。

步驟31展示巴豆醯基-CoA向丁醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由丁醯基-CoA去氫酶或反-2-烯醯基-CoA還原酶(EC 1.3.8.1、EC 1.3.1.86、EC 1.3.1.85、EC 1.3.1.44)催化。丁醯基-CoA去氫酶或反-2-烯醯基-CoA還原酶可為例如來自丙酮丁醇梭菌之Bcd(NP_349317.1)，其與電子黃素蛋白EtfAB(NP_349315、NP_349316)形成複合物；來自山丘鏈黴菌之Ccr(AAA92890)；來自類球紅細菌之Ccr(YP_354044.1)；來自齒垢密螺旋體之Ter(NP_971211.1)； 或來自纖細裸藻之Ter(AY741582.1)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟32展示丁醯基-CoA向乙醯丁醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由硫解酶或醯基-CoA乙醯基轉移酶(EC 2.3.1.9)催化。硫解酶可為例如來自丙酮丁醇梭菌之ThlA(WP_010966157.1)(SEQ ID NO：1)、來自克氏梭菌之ThlA1(EDK35681)、來自克氏梭菌之ThlA2(EDK35682)、來自克氏梭菌之ThlA3(EDK35683)、來自鉤蟲貪銅菌之PhaA(WP_013956452.1)(SEQ ID NO：2)、來自鉤蟲貪銅菌之BktB(WP_011615089.1)(SEQ ID NO：3)或來自大腸桿菌之AtoB(NP_416728.1)(SEQ ID NO：4)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟具有天然活性。

步驟33展示乙醯丁醯基-CoA向乙醯丁酸酯之轉化。此步驟可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(或大腸桿菌)中之天然酶(諸如來自自產乙醇梭菌之硫酯酶)可催化此步驟且產生一定量之下游產物。然而，可能需要引入外源酶或過度表現內源酶來產生所要水準之下游產物。另外，在某些實施例中，可能需要向內源酶(諸如內源硫酯酶)中引入斷裂性突變來降低或去除與所引入Ptb-Buk之競爭。

步驟34展示乙醯丁酸酯向乙醯基丙酮之轉化。 此步驟可藉由乙醯乙酸去羧酶(EC 4.1.1.4)催化。乙醯乙酸去羧酶可為例如來自拜氏梭菌之Adc(WP_012059998.1)(SEQ ID NO：14)。此步驟亦可藉由α-酮基異戊酸去羧酶(EC 4.1.1.74)催化。α-酮基異戊酸去羧酶可為例如來自雷特氏乳球菌之KivD(SEQ ID NO：15)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。此外，大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。罕見地，乙醯乙酸酯向丙酮之轉化可自發發生。然而，自發轉化高度低效且不太可能產生所要水準之下游產物。

步驟35展示乙醯基丙酮向3-甲基-2-丁醇之轉化。此步驟可藉由一級：二級醇去氫酶(EC 1.1.1.2)催化。一級：二級醇去氫酶可為例如來自自產乙醇梭菌之SecAdh(AGY74782.1)(SEQ ID NO：16)、來自永達爾梭菌之SecAdh(ADK15544.1)(SEQ ID NO：17)、來自拉氏梭菌之SecAdh(WP_013239134.1)(SEQ ID NO：18)或來自拜氏梭菌之SecAdh(WP_026889046.1)(SEQ ID NO：19)。此步驟亦可藉由一級：二級醇去氫酶(EC 1.1.1.80)催化，諸如來自布氏嗜熱厭氧桿菌之SecAdh(3FSR_A)(SEQ ID NO：20)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性(Köpke，《應用與環境微生物學(Appl Environ Microbiol)》，80：3394-3403,2014)。然而，大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。將自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中此酶之基因含量下調或基因剔除使得乙醯基丙酮而非3-甲基-2-丁醇產生且聚積(WO 2015/085015)。

步驟36展示乙醯丁醯基-CoA向3-羥基己醯基 -CoA之轉化。此步驟可藉由3-羥基丁醯基-CoA去氫酶(EC 1.1.1.157)或乙醯乙醯基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)催化。3-羥基丁醯基-CoA去氫酶或乙醯乙醯基-CoA可為例如來自拜氏梭菌之Hbd(WP_011967675.1)(SEQ ID NO：55)、來自丙酮丁醇梭菌之Hbd(NP_349314.1)(SEQ ID NO：56)、來自克氏梭菌之Hbd1(WP_011989027.1)(SEQ ID NO：57)、來自克氏梭菌之Hbd2(EDK34807)或來自鉤蟲貪銅菌之PaaH1(WP_010814882.1)。值得注意的是，PhaB為R特異性的且Hbd為S特異性的。另外，來自克氏梭菌之Hbd1具有NADPH依賴性且來自丙酮丁醇梭菌及拜氏梭菌之Hbd具有NADH依賴性。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟37展示3-羥基丁醯基-CoA向3-羥基己酸酯之轉化。此步驟可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(或大腸桿菌)中之天然酶(諸如來自自產乙醇梭菌之硫酯酶)可催化此步驟且產生一定量之下游產物。然而，可能需要引入外源酶或過度表現內源酶來產生所要水準之下游產物。另外，在某些實施例中，可能需要向內源酶(諸如內源硫酯酶)中引入斷裂性突變來降低或去除與所引入Ptb-Buk之競爭。

步驟38展示3-羥基己酸酯向1,3-己醛之轉化。此步驟可藉由醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(EC 1.2.7.5)催 化。醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶之例示性來源描述在本申請案他處。AOR催化酸與經還原鐵氧化還原蛋白之反應，形成醛及經氧化鐵氧化還原蛋白。在產乙酸菌中，此反應可與均產生經還原鐵氧化還原蛋白之氧化CO(經由CO去氫酶，EC 1.2.7.4)或氫氣(經由鐵氧化還原蛋白依賴性氫化酶，EC 1.12.7.2或1.12.1.4)偶合(Köpke，《生物技術新見》，22：320-325,2011；Köpke，《美國科學院院報》，107：13087-13092,2010)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。然而，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中可能需要過度表現內源AOR或引入外源AOR來提高產物產量。或者，可將外源AOR引入不天然包括AOR之微生物(例如大腸桿菌)中。詳言之，共表現Ptb-Buk與AOR(及視情況共表現Adh)可使得此類微生物能夠產生新穎非天然產物。

步驟39展示1,3-己醛向1,3-己二醇之轉化。此步驟可藉由醇去氫酶(EC 1.1.1.1或1.1.1.2)催化。醇去氫酶可將醛及NAD(P)H轉化為醇及NAD(P)。醇去氫酶可為例如來自自產乙醇梭菌(AGY76060.1)(SEQ ID NO：67)、永達爾梭菌(ADK17019.1)(SEQ ID NO：68)或拉氏梭菌之Adh；來自丙酮丁醇梭菌之BdhB(NP_349891.1)(SEQ ID NO：69)；來自拜氏梭菌之Bdh(WP_041897187.1)(SEQ ID NO：70)；來自永達爾梭菌之Bdh1(YP_003780648.1)(SEQ ID NO：71)；來自自產乙醇梭菌之Bdh1(AGY76060.1)(SEQ ID NO：72)；來自永達爾梭菌之Bdh2(YP_003782121.1)(SEQ ID NO：73)、來自自產乙醇梭菌之Bdh2(AGY74784.1)(SEQ ID NO：74)、來自丙酮丁醇梭菌之AdhE1(NP_149325.1)(SEQ ID NO： 75)、來自丙酮丁醇梭菌之AdhE2(NP_149199.1)(SEQ ID NO：76)、來自拜氏梭菌之AdhE(WP_041893626.1)(SEQ ID NO：77)、來自自產乙醇梭菌之AdhE1(WP_023163372.1)(SEQ ID NO：78)或來自自產乙醇梭菌之AdhE2(WP_023163373.1)(SEQ ID NO：79)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。然而，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中可能需要過度表現內源醇去氫酶或引入外源醇去氫酶來提高產物產量。大腸桿菌對此步驟很可能不具有天然活性。

步驟40展示乙醯乙醯基-CoA向3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由羥甲基戊二醯基-CoA合成酶(HMG-CoA合成酶)(EC 2.3.3.10)催化。HMG-CoA合成酶廣泛包括多個屬及生物界且包括例如來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之MvaS(WP_053014863.1)、來自釀酒酵母之ERG13(NP_013580.1)、來自小家鼠之HMGCS2(NP_032282.2)及EC 2.3.3.10類酶之多種其他成員。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟41展示3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA向3-甲基葡糖基-CoA之轉化。此步驟可藉由3-羥基丁醯基-CoA去水酶(EC 4.2.1.55)催化。3-羥基丁醯基-CoA去水酶可為例如來自黃色黏球菌之LiuC(WP_011553770.1)。此步驟亦可藉由短鏈-烯醯基-CoA水合酶(EC 4.2.1.150)或烯醯基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)催化。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟 不具有已知天然活性。

步驟42展示3-甲基葡糖基-CoA向2-甲基巴豆醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由甲基巴豆醯基-CoA去羧酶(與戊烯二酸酯-CoA轉移酶(EC 2.8.3.12)具有高結構類似性)(例如來自黃色黏球菌之aibAB(WP_011554267.1及WP_011554268.1))催化。此步驟亦可藉由甲基巴豆醯基-CoA羧化酶(EC 6.4.1.4)催化，例如來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)之LiuDB(NP_250702.1及NP_250704.1)或來自阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)之MCCA及MCCB(NP_563674.1及NP_567950.1)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟43展示甲基巴豆醯基-CoA向異戊醯基-CoA之轉化。此步驟可藉由氧化還原酶(鋅結合去氫酶)催化。此氧化還原酶(鋅結合去氫酶)可為例如來自黃色黏球菌之AibC(WP_011554269.1)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有已知天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

步驟44展示異戊醯基-CoA向異戊酸酯之轉化。此步驟可藉由CoA-轉移酶(亦即乙醯基-CoA：乙醯乙醯基-CoA轉移酶)(EC 2.8.3.9)催化。CoA-轉移酶可為例如CtfAB，一種雜二聚體，其包括來自拜氏梭菌之次單位CtfA及CtfB(CtfA，WP_012059996.1)(SEQ ID NO：5)(CtfB，WP_012059997.1)(SEQ ID NO：6)。此步驟亦可藉由硫酯酶(EC 3.1.2.20)催化。硫酯酶可為例如來自大腸桿菌之TesB (NP_414986.1)(SEQ ID NO：7)。此步驟亦可藉由例如來自自產乙醇梭菌或永達爾梭菌之推定硫酯酶催化。詳言之，已鑑別自產乙醇梭菌中之三種推定硫酯酶：(1)「硫酯酶1」(AGY74947.1；標註為棕櫚醯基-CoA水解酶；SEQ ID NO：8)，(2)「硫酯酶2」(AGY75747.1；標註為4-羥苯甲醯基-CoA硫酯酶；SEQ ID NO：9)，及(3)「硫酯酶3」(AGY75999.1；標註為推定硫酯酶；SEQ ID NO：10)。亦已鑑別永達爾梭菌中之三種推定硫酯酶：(1)「硫酯酶1」(ADK15695.1；標註為預測醯基-CoA硫酯酶1；SEQ ID NO：11)，(2)「硫酯酶2」(ADK16655.1；標註為預測硫酯酶；SEQ ID NO：12)，及(3)「硫酯酶3」(ADK16959.1；標註為預測硫酯酶；SEQ ID NO：13)。此步驟亦可藉由磷酸丁醯基轉移酶(EC 2.3.1.19)+丁酸激酶(EC 2.7.2.7)催化。磷酸丁醯基轉移酶及丁酸激酶之例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌(或大腸桿菌)中之天然酶(諸如來自自產乙醇梭菌之硫酯酶)可催化此步驟且產生一定量之下游產物。然而，可能需要引入外源酶或過度表現內源酶來產生所要水準之下游產物。另外，在某些實施例中，可能需要向內源酶(諸如內源硫酯酶)中引入斷裂性突變來降低或去除與所引入Ptb-Buk之競爭。

步驟45展示異戊酸酯向異戊醛之轉化。此步驟可藉由醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(EC 1.2.7.5)催化。醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)可為例如來自自產乙醇梭菌之AOR(WP_013238665.1；WP_013238675.1)(分別為SEQ ID NO：63及64)或來自永達爾梭菌之AOR (ADK15073.1；ADK15083.1)(分別為SEQ ID NO：65及66)。醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶之其他例示性來源描述在本申請案他處。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。然而，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中可能需要過度表現內源AOR或引入外源AOR來提高產物產量。或者，可將外源AOR引入不天然包括AOR之微生物(例如大腸桿菌)中。詳言之，共表現Ptb-Buk與AOR(及視情況共表現Adh)可使得此類微生物能夠產生新穎非天然產物。

步驟46展示異戊醛向異戊醇之轉化。此步驟可藉由醇去氫酶(EC 1.1.1.1.或1.1.1.2)催化。醇去氫酶可將醛及NAD(P)H轉化為醇及NAD(P)。醇去氫酶可為例如來自自產乙醇梭菌(AGY76060.1)(SEQ ID NO：67)、永達爾梭菌(ADK17019.1)(SEQ ID NO：68)或拉氏梭菌之Adh；來自丙酮丁醇梭菌之BdhB(NP_349891.1)(SEQ ID NO：69)；來自拜氏梭菌之Bdh(WP_041897187.1)(SEQ ID NO：70)；來自永達爾梭菌之Bdh1(YP_003780648.1)(SEQ ID NO：71)；來自自產乙醇梭菌之Bdh1(AGY76060.1)(SEQ ID NO：72)；來自永達爾梭菌之Bdh2(YP_003782121.1)(SEQ ID NO：73)、來自自產乙醇梭菌之Bdh2(AGY74784.1)(SEQ ID NO：74)、來自丙酮丁醇梭菌之AdhE1(NP_149325.1)(SEQ ID NO：75)、來自丙酮丁醇梭菌之AdhE2(NP_149199.1)(SEQ ID NO：76)、來自拜氏梭菌之AdhE(WP_041893626.1)(SEQ ID NO：77)、來自自產乙醇梭菌之AdhE1(WP_023163372.1)(SEQ ID NO：78)或來自自產乙醇梭菌之AdhE2(WP_023163373.1) (SEQ ID NO：79)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟具有天然活性。然而，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中可能需要過度表現內源醇去氫酶或引入外源醇去氫酶來提高產物產量。大腸桿菌對此步驟很可能不具有天然活性。

步驟47展示異戊醯基-CoA向異戊醛之轉化。此步驟可藉由丁醛去氫酶(EC 1.2.1.57)催化。丁醛去氫酶可為例如來自糖乙酸多丁醇梭菌之Bld(AAP42563.1)(SEQ ID NO：80)。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌對此步驟不具有天然活性。大腸桿菌對此步驟不具有已知天然活性。

Ptb-Buk之概述

本發明提供利用Ptb-Buk酶系統之新穎路徑。自然界中，在一系列丁酸酯產生微生物中發現此酶系統，諸如產生丁酸酯之梭菌屬(Clostridia)或丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)。詳言之，磷酸丁醯基轉移酶(Ptb)(EC 2.3.1.19)天然催化丁醯基-CoA+磷酸酯之反應，形成CoA+丁醯基磷酸酯，且丁酸激酶(Buk)(EC 2.7.2.7)天然催化丁醯基磷酸酯與ADP之反應，形成丁酸酯及ATP。因此，此等酶一起(Ptb-Buk)天然催化丁醯基-CoA向丁酸酯之轉化且經由受質層面磷酸化產生一個ATP(圖2)。然而，本發明者已發現Ptb為混雜的且能夠接受多種醯基-CoA及烯醯基-CoA作為受質，使得可使用Ptb-Buk分別將多種醯基-CoA及烯醯基-CoA轉化為其相應酸或烯酸酯，而同時產生ATP。已報導Ptb在活體外對一系列醯基-CoA(包含乙醯乙醯基-CoA)具有活性(Thompson，《應用與環境微生物學》，56：607-613,1990)。 先前未展示乙醯乙醯基-磷酸酯可作為Buk之受質。儘管已知Buk接受寬受質範圍(Liu，《應用微生物學與生物技術(Appl Microbiol Biotechnol)》，53：545-552,2000)，但活體內未展示活性。

另外，本發明者已發現引入外源Ptb-Buk使得特定微生物能夠產生有用產物，包含丙酮、異丙醇、異丁烯、3-羥基丁酸酯、1,3-丁二醇及2-羥基異丁酸酯，以及其他產物，諸如丙酸酯、己酸酯及辛酸酯。

依賴於Ptb-Buk之新穎路徑相較於依賴於CoA-轉移酶產生產物之其他已知及現有路徑(如在典型梭菌丙酮-丁醇-乙醇(ABE)醱酵路徑中)或依賴於硫酯酶產生產物之其他已知及現有路徑提供幾大優勢(Jones，《微生物學評論(Microbiol Rev)》，50：484-524,1986；Matsumoto，《應用微生物學與生物技術》，97：205-210,2013；May，《代謝工程(Metabol Eng)》，15：218-225,2013)(圖3)。詳言之，此等新穎路徑(1)不依賴於CoA-轉移酶反應所要之特定分子(諸如有機酸，例如丁酸酯或乙酸酯)之存在或產生，且(2)使得可經由受質層面磷酸化產生硫酯酶或CoA-轉移酶反應中不守恆之ATP。在將Ptb-Buk系統用於其他反應(諸如3-羥基丁醯基-CoA向3-羥基丁酸酯之轉化)時，相同優勢亦適用。因此，此等新穎路徑可產生高得多的生產效價及速率，其藉由在不共產生非所要副產物(諸如乙酸酯)下產生額外能量及產生標靶產物達成。

特定言之，在市售規模下，微生物產生乙酸酯(或CoA轉移酶反應所要之其他有機酸)作為副產物為不適宜 的，因為乙酸酯自標靶產物轉移碳，因此影響標靶產物之效率及產率。另外，乙酸酯可能對微生物具有毒性及/或可充當污染性微生物之生長的受質。此外，乙酸酯之存在使得較難回收及分離標靶產物及控制醱酵條件以促進標靶產物之產生。

經由受質層面磷酸化產生ATP可用作產物合成之動力，尤其在ATP限制性系統中。詳言之，已知產乙酸細菌依靠熱力學生命邊緣生存(Schuchmann，《自然評論：微生物(Nat Rev Microbiol)》，12：809-821,2014)。因此，已描述迄今分離之所有產乙酸微生物產生乙酸酯(Drake，《產乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes)》，於《原核生物(The Prokaryotes)》中，第3版，第354-420頁，New York,NY,Springer,2006)，因為產生乙酸酯向微生物提供經由Pta(磷酸轉乙醯酶)(EC 2.3.1.8)及Ack(乙酸激酶)(EC 2.7.2.1)自受質層面磷酸化直接產生ATP的選擇。儘管諸如膜梯度及與離子或質子易位系統(例如Rnf複合物)(Schuchmann，《自然評論：微生物》，12：809-821,2014)偶合之電分叉酶之機制使此等微生物中之ATP守恆，但直接ATP產生仍對其存活很關鍵。因而，在引入不允許ATP產生之異源路徑時，乙酸酯作為副產物產生(Schiel-Bengelsdorf，《歐洲生化學會聯合會快報(FEBS Lett)》，586：2191-2198,2012)。然而，本文所述之Ptb-Buk路徑向微生物提供替代機制以經由受質層面磷酸化產生ATP，因此，避免乙酸酯產生。詳言之，在其他方面為必需之乙酸酯形成酶(諸如Pta-Ack)(Nagarajan，《微生物細胞工廠(Microb Cell Factories)》，12：118,2013)可 用Ptb-Buk替換以作為ATP產生之替代方式。由於微生物可隨後依賴於經由Ptb-Buk產生ATP，故此系統提供確保最大通量通過使用Ptb-Buk之新穎路徑的動力。產生ATP亦可能對於需要ATP之下游路徑很關鍵。舉例而言，自丙酮醱酵產生異丁烯需要ATP。在使用CoA-轉移酶或硫酯酶時乙醯基-CoA向異丁烯之整個路徑耗費ATP，而在使用Ptb-Buk時所述路徑為能量平衡的。

提供Ptb及Buk之例示性來源。然而，應瞭解，可使用Ptb及Buk之其他合適來源。另外，Ptb及Buk可經工程改造以改良活性及/或編碼Ptb-Buk之基因可經密碼子優化以表現於特定宿主微生物中。

磷酸丁醯基轉移酶可來自或可源自例如以下來源，其序列可公開獲得：

在一較佳實施例中，磷酸丁醯基轉移酶為來自丙酮丁醇梭菌(WP_010966357；SEQ ID NO：87)或拜氏梭菌(WP_026886639；SEQ ID NO：88)(WP_041893500；SEQ ID NO：89)之Ptb。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌天然不含磷酸丁醯基轉移酶。

丁酸激酶可來自或可源自例如以下來源，其序列可公開獲得：

在一較佳實施例中，丁酸激酶為來自丙酮丁醇梭菌(WP_010966356；SEQ ID NO：90)或拜氏梭菌(WP_011967556；SEQ ID NO：91)(WP_017209677；SEQ ID NO：92)(WP_026886638；SEQ ID NO：93)(WP_041893502；SEQ ID NO：94)之Buk。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌天然不含丁酸激酶。

由於Ptb-Buk已展示作用於大量受質，故可合理地假定若Ptb-Buk對所要受質不展現任何活性，則其可經工程改造以對所述受質達成活性。一種策略可為(但不限於)基於與或未與受質結合之Ptb及Buk的可獲得晶體結構的合理設計，其中改變結合袋以容納新穎受質，或經由飽和突變誘發進行。在獲得活性時，其可進一步經由反覆酶工程改造循環改良。此等工程改造操作將與測試酶活性之分析組合。此等類型之策略先前已證實有效(參見例如Huang，《自然(Nature)》，537：320-327,2016；Khoury，《生物技術趨勢(Trends Biotechnol)》，32：99-109,2014；Packer，《自然綜述：遺傳學(Nature Rev Genetics)》，16：379-394,2015；Privett，《美國科學院院報》，109：3790-3795,2012)。

為改良Ptb-Buk對特定醯基-CoA受質之受質特異性，來自公共資料庫之Ptb-Buk變異體或所產生之Ptb-Buk突變體(例如由定向進化)可使用高通量分析篩選，亦即在大腸桿菌中過度表現Ptb-Buk酶對，添加測試受質及用生物發光分析篩選ATP產生。所述分析可使用關聯ATP濃度與螢火蟲螢光素酶生物發光的公認實踐。此分析對多孔盤形式之順應性將有助於較佳跨越新穎Ptb-Buk組合有效篩選受質(圖33)。

藉由篩選ATP產生而非受質消除或產物聚積，所述分析避免CoA基團之量測自發性水解。然而，文獻中所述 之替代方法為使用游離CoA，可使用已確立分析使用愛爾曼氏試劑(5,5'-二硫基雙-(2-硝基苯甲酸)或DTNB)(Thompson,應用與環境微生物學，56：607-613,1990.)量測以評估Ptb-Buk反應之偶合效率(圖33)。醯基-CoA及相應游離酸及磷酸化中間物亦可在驗證階段使用LC-MS/MS期間量測。

在高通量篩選方法中，由於蛋白質定量中涉及之勞力，難以收集動力學資料。替代地，對於含有Ptb-Buk酶之大腸桿菌溶解物之各製劑，可將對各相關受質之活性(以每單位時間之發光的形式量測)與對陽性對照受質(丁醯基-CoA)及對乙醯基-CoA(生理學受質，其很可能提供針對標靶醯基-CoA的酶活性位點之最大競爭)之活性比較。

為確保所述分析不會因為天然磷酸轉乙醯酶(Pta)及/或乙酸激酶(Ack)活性而產生偏倚，分析亦可在已剔除pta及/或ack基因之大腸桿菌菌株中評估。

產生丙酮及異丙醇

丙酮及異丙醇為重要工業溶劑，其中合併市場規模為8百萬噸且總市場值為$85-110億。另外，丙酮及異丙醇為如下有價值之下游產物的前驅物，包含聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，其總市場值為$70億；異丁烯，其總市場值為$250-290億；及丙烯，其總市場值為$1250億。另外，近年來已報導自丙酮噴出燃料之途徑。當前，工業丙酮生產直接關聯石化酚生產，因為其為異丙苯製程之副產物。約92體積%丙酮輸出為自異丙苯產生酚之副產物。此對環境與市場均具有顯著影響。在異丙苯製程中，每莫耳酚產生一莫耳亞硫酸鈉積聚，從而造成嚴重廢料處理問題及對自然環境及人類健 康之挑戰。酚之世界市場需求預期減少或減退，而對丙酮之需求預測上升。正開發由直接氧化苯產生酚之替代途徑且預期不久即商業化；此可使丙酮產生完全去除。

丙酮已以工業規模生產約100年，其作為ABE醱酵中丁醇之副產物。儘管在20世紀下半葉，工業ABE醱酵由於低油價及高糖成本而衰退，但近年來其已復蘇，其中在近幾年建造了數個商業工廠。多個群體亦已展現在異源宿主中自糖產生丙酮，藉由數個學術群體證實，所述宿主經由代謝工程改造及合成生物方法表現來自ABE醱酵生物體、尤其大腸桿菌及酵母菌之相應酶。然而，與釋放生物質之多醣組分所要的預處理相關的低產量及高成本使得經由標準醱酵產生丙酮並不經濟，因為當前生物化學轉化技術不利用生物質之木質素組分，木質素組分可構成此物質之高達40%。

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生丙酮或其前驅物。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生丙酮或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生丙酮所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

經由步驟1、2及3獲得丙酮：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、2及3之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生丙酮或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟2藉由Ptb-Buk催化。步驟1、2及 3之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。若微生物源自天然含有能夠將丙酮轉化為異丙醇(步驟4)之一級：二級醇去氫酶的親本微生物(例如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌)，則所述微生物可經修飾以阻斷或剔除一級：二級醇去氫酶之表現(例如藉由破壞編碼一級：二級醇去氫酶之基因)，使得微生物產生丙酮，而不將其轉化為異丙醇(WO 2015/085015)。

經由步驟1、13、14、15及3獲得丙酮：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13、14、15及3之外源酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生丙酮或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟14藉由Ptb-Buk催化。步驟1、13、14、15及3之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。若微生物源自天然含有能夠將丙酮轉化為異丙醇(步驟4)之一級：二級醇去氫酶的親本微生物(例如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌)，則所述微生物可經修飾以阻斷或剔除一級：二級醇去氫酶之表現(例如藉由破壞編碼一級：二級醇去氫酶之基因)，使得微生物產生丙酮，而不將其轉化為異丙醇(WO 2015/085015)。

在一個實施例中，微生物可包括超過一種產生丙酮之路徑。

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生異丙醇或其前驅物。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生異丙醇或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉 氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生異丙醇所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

經由步驟1、2、3及4獲得異丙醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、2、3及4之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生異丙醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟2藉由Ptb-Buk催化。步驟1、2、3及4之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。若微生物源自天然含有能夠將丙酮轉化為異丙醇(步驟4)之一級：二級醇去氫酶的親本微生物(例如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌)，則步驟4不需要引入外源酶來產生異丙醇。然而，調節微生物例如以過度表現天然一級：二級醇去氫酶可增加異丙醇產生。

經由步驟1、13、14、15、3及4獲得異丙醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13、14、15、3及4之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生異丙醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟14藉由Ptb-Buk催化。步驟1、13、14、15、3及4之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。若微生物源自天然含有能夠將丙酮轉化為異丙醇(步驟4)之一級：二級醇去氫酶的親本微生物(例如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌)，則步驟4不需要引入外源酶來產生異丙醇。然而，調節微生物 例如以過度表現天然一級：二級醇去氫酶可增加異丙醇產生。

在一個實施例中，微生物可包括超過一種產生異丙醇之路徑。

產生異丁烯

異丁烯為重要化學構築嵌段，其中市場規模為超過1500萬噸且總市場值為$250-290億。除異丁烯於化學方法中及作為燃料添加劑之用途(15 Mt/yr)以外，其亦可轉化為異辛烷，一種用於汽油車之可直接使用之高效燃料。全球生物能源(Global Bioenergies)已提交關於自丙酮醱酵產生異丁烯之專利申請案，但所揭示途徑均不包括Ptb-Buk(WO 2010/001078；EP 2295593；WO 2011/076691；van Leeuwen，《應用微生物學與生物技術》，93：1377-1387,2012)。

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生異丁烯或其前驅物。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生異丁烯或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生異丁烯所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

圖1展示獲得異丁烯之兩種替代途徑。第一種途徑包括經由步驟1、2、3、5及6產生異丁烯。第二種途徑包括經由步驟1、2、3、7、8及6產生異丁烯。步驟2及8可藉由Ptb-Buk催化。因此，各途徑可涉及Ptb-Buk。

經由步驟1、2、3、5及6獲得異丁烯：在一個 實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、2、3、5及6之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生異丁烯或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟2藉由Ptb-Buk催化。步驟1、2、3、5及6之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。若微生物源自天然含有能夠將丙酮轉化為異丙醇(步驟4)之一級：二級醇去氫酶的親本微生物(例如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌)，則所述微生物可經修飾以阻斷或剔除一級：二級醇去氫酶之表現(例如藉由破壞編碼一級：二級醇去氫酶之基因)，以阻止丙酮轉化為異丙醇且使丙酮向異丁烯之轉化達最大。

經由步驟1、2、3、7、8及6獲得異丁烯：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、2、3、7、8及6之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生異丁烯或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟2及/或步驟8藉由Ptb-Buk催化。步驟1、2、3、7、8及6之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。若微生物源自天然含有能夠將丙酮轉化為異丙醇(步驟4)之一級：二級醇去氫酶的親本微生物(例如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌)，則所述微生物可經修飾以阻斷或剔除一級：二級醇去氫酶之表現(例如藉由破壞編碼一級：二級醇去氫酶之基因)，以阻止丙酮轉化為異丙醇且使丙酮向異丁烯之轉化達最大。

產生3-羥基丁酸酯

3-羥基丁酸酯(3-HB)為β-羥基酸家族中之四碳 羧酸。3-羥基丁酸酯為油性皮膚清潔之美容成分，一種抗衰老乳膏調配物之中間物，一種聚羥基丁酸酯(PHB)之中間物，一種可生物降解聚合物樹脂，及用於新穎生物塑膠之與其他聚羥基酸之共單體。另外，3-羥基丁酸酯特別用於生物相容性及可生物降解奈米複合物，尤其用於醫學植入物，C3/C4化學品之中間物，對掌性構築嵌段及精細化學品。儘管藉由生長於葡萄糖上之重組大腸桿菌產生(R)-及(S)-3-羥基丁酸酯，但尚未展現自生長於氣體受質上之微生物產生3-羥基丁酸酯(Tseng，《應用與環境微生物學》，75：3137-3145,2009)。值得注意的是，先前展現於大腸桿菌中之所述系統不可直接轉移至產乙酸菌(包含自產乙醇梭菌)中，因為產乙酸菌中存在天然硫酯酶。儘管大腸桿菌亦具有可作用於3-HB-CoA之硫酯酶TesB，但Tseng展示背景活性極小(<0.1g/L)。儘管已報導大腸桿菌中立體純異構體之產生，但本發明者意外發現可在自產乙醇梭菌中產生異構體之混合物。在不受限於此理論的情況下，此很可能歸因於天然異構酶活性。此使得(S)-特異性3-羥基丁醯基-CoA去氫酶(Hbd)之組合能夠與(R)-特異性Ptb-Buk組合而使產量最佳化。為產生立體純異構體，此活性可剔除。綜合而言，本發明使得能夠相較於大腸桿菌中之低產量產生數公克/公升3-HB，且可使用Ptb-Buk與(R)或(S)-特異性3-羥基丁醯基-CoA去氫酶及天然自產乙醇梭菌硫酯酶之任何組合。

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生3-羥基丁酸酯或其前驅物。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生3-羥基丁酸酯或其前驅物之方 法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生3-羥基丁酸酯所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

圖1展示獲得3-羥基丁酸酯之兩種替代途徑。第一種途徑包括經由步驟1、2及15產生3-羥基丁酸酯。第二種途徑包括經由步驟1、13及14產生3-羥基丁酸酯。步驟2及14可藉由Ptb-Buk催化。因此，各途徑可涉及Ptb-Buk。在一個實施例中，微生物可包括超過一種產生3-羥基丁酸酯之路徑，其中Ptb-Buk可催化超過一個步驟(例如步驟2及14)。

經由步驟1、2及15獲得3-羥基丁酸酯：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、2及15之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生3-羥基丁酸酯或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟2藉由Ptb-Buk催化。步驟1、2及15之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

經由步驟1、13及14獲得3-羥基丁酸酯：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13及14之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生3-羥基丁酸酯或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟14藉由Ptb-Buk催化。步驟1、13及14之酶的例示性類型及來源描 述在本申請案他處。

產生1,3-丁二醇

1,3-丁二醇(1,3-BDO)常用作食品調味劑之溶劑且為用於特定聚胺基甲酸酯及聚酯樹脂中之共單體。更重要的是，1,3-丁二醇可以催化方式轉化為1,3-丁二烯(Makshina，《化學會評論(Chem Soc Rev)》，43：7917-7953,2014)。丁二烯用於製造橡膠、塑膠、潤滑劑、乳膠及其他產品。儘管現今生產之大量丁二烯用於汽車輪胎中之橡膠，但其亦可用於生產己二腈，其可用於製備耐綸6,6。丁二烯之總需求正在上升。在2011年，估算需要1050萬噸，價值$400億。

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生1,3-丁二醇或其前驅物。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生1,3-丁二醇或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生1,3-丁二醇所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

在某些實施例中，微生物可產生1,3-丁二醇，且不共產生乙醇(或僅產生少量乙醇，例如少於0.1-1.0g/L乙醇或少於1-10g/L乙醇)。

圖1展示獲得1,3-丁二醇之三種替代途徑。第一途徑包括經由步驟1、2、15、16及17產生1,3-丁二醇。第二途徑包括經由步驟1、13、14、16及17產生1,3-丁二醇。 第三途徑包括經由步驟1、13、18及17產生1,3-丁二醇。步驟2及14可藉由Ptb-Buk催化。因此，至少第一及第二途徑可涉及Ptb-Buk在一個實施例中，微生物可包括超過一種產生1,3-丁二醇之路徑。在一相關實施例中，Ptb-Buk可催化超過一個步驟(例如步驟2及14)。

經由步驟1、2、15、16及17獲得1,3-丁二醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、2、15、16及17之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生1,3-丁二醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟2藉由Ptb-Buk催化。步驟1、2、15、16及17之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

經由步驟1、13、14、16及17獲得1,3-丁二醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13、14、16及17之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生1,3-丁二醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟14藉由Ptb-Buk催化。步驟1、13、14、16及17之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

經由步驟1、13、18及17獲得1,3-丁二醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13、18及17之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生1,3-丁二醇或其前驅物(圖11)。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。步驟1、13、18及17之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。類似途徑展現 於大腸桿菌中，但未展現於產乙酸菌(諸如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌)中(Kataoka，《生物學與生物工程雜誌(J Biosci Bioeng)》，115：475-480,2013)。儘管使用Ptb-Buk可產生(R)-1,3-丁二醇，但不需要使用Ptb-Buk之此途徑可產生(S)-1,3-丁二醇。

產生2-羥基異丁酸酯

2-羥基異丁酸酯(2-HIB)為一種四碳羧酸，其可充當多種聚合物之構築嵌段。甲基丙烯酸之甲酯(其可藉由2-羥基異丁酸酯去水或經由相應醯胺合成)聚合形成聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)以製造丙烯酸玻璃、耐久塗層及油墨。對於單獨之此化合物，總市場超過3百萬噸。其他分支鏈C4羧酸(例如2-羥基異丁酸酯之氯及胺基衍生物)以及異丁烯二醇及其氧化物亦用於聚合物中及用於諸多其他應用。

Ptb-Buk系統之立體特異性尤其適用於克服當前先進技術對於2-羥基異丁酸酯製備之限制。Ptb-Buk與硫酯酶均為混雜的，使得對3-羥基丁醯基-CoA之側向活性可自標靶路徑分流資源而產生2-羥基異丁醯基-CoA(參見例如圖1及圖8)。然而，Ptb-Buk能夠在立體異構體之間進行區分且作用於(R)-3-羥基丁醯基-CoA，而非(S)-3-羥基丁醯基-CoA。相比之下，硫酯酶不能在3-羥基丁醯基-CoA立體異構體之間進行區分。在一較佳實施例中，(S)-特異性乙醯乙醯基-CoA水合酶(EC 4.2.1.119)(步驟13)經選擇與Ptb-Buk(步驟20)組合以避免產生3-羥基丁酸酯所造成之損失且使2-羥基異丁酸酯產量達最大(圖8)。3-羥基丁醯基-CoA之(S)-特定形式亦為2-羥基異丁醯基-CoA變位酶(EC 5.4.99.-)(步驟19) 之較佳受質(Yaneva，《生物化學雜誌》，287：15502-15511,2012)。

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生2-羥基異丁酸酯或其前驅物。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生2-羥基異丁酸酯或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生2-羥基異丁酸酯所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

經由步驟1、13、19及20獲得2-羥基丁酸酯：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13、19及20之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生2-羥基丁酸酯或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟20藉由Ptb-Buk催化。步驟1、13、19及20之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

在某些實施例中，本發明亦提供一種能夠自受質產生2-羥基丁酸酯(2-HB)或其前驅物之微生物。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生2-羥基丁酸酯或其前驅物之方法。在不欲受限於任何特定理論之情況下，本發明者認為所觀測到之2-羥基丁酸酯之產生可歸因於微生物(諸如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌)中之非特異性變位酶活性。

產生己二酸

己二酸為最重要的二羧酸，其估算市場大於US $45億，其中每年生產約25億公斤。超過60%之所生產己二酸正用作生產耐綸之單體前驅物，且直至2019年，己二酸之總市場預期達到US $75億。當前，己二酸幾乎僅藉由石化法生產，例如藉由羰基化丁二烯。

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生己二酸或其前驅物(圖34)。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生己二酸或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生己二酸所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

經由步驟22、23、24、25及26獲得己二酸：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟22、23、24、25及26之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生己二酸或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟26藉由Ptb-Buk催化。步驟22、23、24、25及26之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

經由步驟21、22、23、24、25及26獲得己二酸：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟21、22、23、24、25及26之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生己二酸或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中， 步驟26藉由Ptb-Buk催化。步驟21、22、23、24、25及26之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

在一個實施例中，微生物可包括超過一種產生己二酸之路徑。

產生1,3-己二醇

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生1,3-己二醇或其前驅物(圖35)。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生1,3-己二醇或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生1,3-己二醇所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

圖35中描繪之路徑以3-羥基丁醯基-CoA開始，如圖1中所描繪，其可經由步驟1及13產生。

經由步驟1、13、27、31、32、36、37、38及39獲得1,3-己二醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13、27、31、32、36、37、38及39之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生1,3-己二醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟37藉由Ptb-Buk催化。步驟1、13、27、31、32、36、37、38及39之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

產生3-甲基-2-丁醇

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生3- 甲基-2-丁醇或其前驅物(圖35)。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生3-甲基-2-丁醇或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生3-甲基-2-丁醇所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

圖35中描繪之路徑以3-羥基丁醯基-CoA開始，如圖1中所描繪，其可經由步驟1及13產生。

經由步驟1、13、27、31、32、33、34及35獲得3-甲基-2-丁醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13、27、31、32、33、34及35之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生3-甲基-2-丁醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟33藉由Ptb-Buk催化。步驟1、13、27、31、32、33、34及35之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

產生2-丁烯-1-醇

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生2-丁烯-1-醇或其前驅物(圖35)。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生2-丁烯-1-醇或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生2-丁烯-1-醇所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性 不存在或低的情況下，外源酶。

圖35中描繪之路徑以3-羥基丁醯基-CoA開始，如圖1中所描繪，其可經由步驟1及13產生。

經由步驟1、13、27、28、29及30獲得2-丁烯-1-醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、13、27、28、29及30之酶，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生2-丁烯-1-醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟28藉由Ptb-Buk催化。步驟1、13、27、28、29及30之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

產生異戊酸酯

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生異戊酸酯或其前驅物(圖36)。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生異戊酸酯或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生異戊酸酯所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

經由步驟1、40、41、42、43及44獲得異戊酸酯：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、40、41、42、43及44之微生物，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生異戊酸酯或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟44藉由Ptb-Buk催化。步驟1、40、41、42、43及 44之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

產生異戊醇

本發明提供一種微生物，其能夠自受質產生異戊醇或其前驅物(圖36)。本發明進一步提供一種藉由在受質存在下培養此類微生物產生異戊醇或其前驅物之方法。在較佳實施例中，所述微生物源自選自由自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌組成之群的親本微生物。然而，微生物亦可源自完全不同微生物，例如大腸桿菌。對於產生異戊醇所述之酶促路徑可包括內源酶，及在內源酶活性不存在或低的情況下，外源酶。

經由步驟1、40、41、42、43、44、45及46獲得異戊醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、40、41、42、43、44、45及46之微生物，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生異戊醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。在一較佳實施例中，步驟44藉由Ptb-Buk催化。步驟1、40、41、42、43、44、45及46之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

經由步驟1、40、41、42、43、47及46獲得異戊醇：在一個實施例中，本發明提供一種微生物，其包括步驟1、40、41、42、43、47及46之微生物，藉由所述酶，所述微生物能夠自受質(諸如氣體受質)產生異戊醇或其前驅物。通常，此路徑中之至少一種酶為微生物之外源酶。步驟1、40、41、42、43、47及46之酶的例示性類型及來源描述在本申請案他處。

在一個實施例中，微生物可包括超過一種產生異戊醇之路徑。

產生其他產物

本發明提供一種微生物，其包括外源Ptb-Buk及外源或內源醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)。此類微生物可自產自例如氣體受質之乙醯基-CoA產生例如1-丙醇、1-丁醇、1-己醇及1-辛醇或其前驅物(圖32)。本發明進一步提供一種藉由在氣體受質存在下培養此類微生物產生1-丙醇、1-丁醇、1-己醇及1-辛醇或其前驅物之方法。自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌天然包括AOR。然而，AOR可與表現外源Ptb-Buk組合過度表現於此類微生物中。或者，外源AOR及外源Ptb-Buk可表現於除自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌以外之微生物(諸如大腸桿菌)中。

產生前驅物及中間物

圖1、34、35及36中所描繪之路徑可經修改以產生上述產物之前驅物或中間物。詳言之，可於宿主微生物中插入本文所述任一路徑之部分酶促路徑以獲得前驅物或中間物之產生。

定義及背景

術語「遺傳修飾」或「遺傳工程改造」泛指對微生物之基因組或核酸之操作。同樣，術語「經基因工程改造」係指微生物包括所操作之基因組或核酸。遺傳修飾方法包含例如異源基因表現、基因或啟動子插入或缺失、核酸突變、經改變之基因表現或不活化、酶工程改造、定向進化、基於知識之設計、隨機突變誘發方法、基因改組及密碼子最佳化。

「重組」指示核酸、蛋白質或微生物為遺傳修飾、工程改造或重組之產物。一般而言，術語「重組」係指核酸、蛋白質或微生物含有來源於多個來源之遺傳物質或由來源於多個來源(諸如兩種或更多種不同品系或種屬的微生物)之遺傳物質編碼。如本文所用，術語「重組」亦可用於描述微生物包括突變核酸或蛋白質，包含突變形式之內源性核酸或蛋白質。

「內源」係指核酸或蛋白質存在或表現於產生本發明微生物之野生型或親本微生物中。舉例而言，內源性基因為天然地存在於產生本發明微生物之野生型或親本微生物中之基因。在一個實施例中，內源性基因之表現可藉由諸如外源性啟動子之外源性調控元件控制。

「外源」係指核酸或蛋白質不存在於產生本發明微生物之野生型或親本微生物中。在一個實施例中，外源基因或酶可源自異源(亦即不同)品系或種屬且引入或表現於本發明微生物中。在另一實施例中，外源性基因或酶可以人工方式或以重組方式形成且引入或表現於本發明微生物中。外源性核酸可經改適以整合至本發明微生物之基因組中或保持於本發明微生物中之額外染色體態(例如質體)中。

「酶活性」或簡單地「活性」泛指酶活性，包含(但不限於)酶之活性、酶之量或酶催化反應之可利用性。因此，「提高」酶活性包含提高酶之活性、提高酶之量或提高酶催化反應之可利用性。類似地，「降低」酶活性包含降低酶之活性、降低酶之量或降低酶催化反應之可利用性。

關於酶活性，「受質」為酶所作用之分子且「產 物」為藉由酶之作用產生的分子。因此，「天然受質」為野生型微生物中酶天然作用之分子，且「天然產物」為野生型微生物中藉由酶之作用天然產生的分子。舉例而言，丁醯基-CoA為Ptb及丁醯基磷酸酯之天然受質且為Buk之天然受質。另外，丁醯基磷酸酯為Ptb之天然產物且丁酸酯為Buk之天然產物。同樣，「非天然受質」為在野生型微生物中酶不天然作用之分子，且「非天然產物」為野生型微生物中不藉由酶之作用天然產生之分子。天然或非天然的能夠作用於多種不同受質之酶通常稱為「混雜」酶。本發明者已發現Ptb為混雜的且能夠接受多種醯基-CoA及烯醯基-CoA作為受質，使得可使用Ptb-Buk分別將多種醯基-CoA及烯醯基-CoA轉化為其相應酸或烯酸酯，而同時產生ATP。因此，在較佳實施例中，本發明之Ptb-Buk作用於非天然受質(亦即除丁醯基-CoA及/或丁醯基磷酸酯以外之受質)而產生非天然產物(亦即除丁醯基磷酸酯及/或丁酸酯以外之產物)。

術語「丁醯基-CoA(butyryl-CoA)」可在本文中與「丁醯基-CoA(butanoyl-CoA)」互換使用。

術語「產能」或其類似術語可在本文中與「能量守恆」或其類似術語互換使用。此等術語均常用於文獻中。

「突變」係指本發明微生物中之核酸或蛋白質相較於產生本發明微生物之野生型或親本微生物經修飾。在一個實施例中，突變可為編碼酶之基因的缺失、插入或取代。在另一實施例中，突變可為酶中一或多種胺基酸之缺失、插入或取代。

詳言之，「斷裂性突變」為減少或去除(亦即「干 擾」)基因或酶之表現或活性的突變。斷裂性突變可使基因或酶部分失活、完全失活或缺失。斷裂性突變可為基因剔除(KO)突變。斷裂性突變可為減少、阻止或阻斷藉由酶產生之產物之生物合成的任何突變。斷裂性突變可包含例如編碼酶之基因的突變、參與編碼酶之基因之表現的遺傳調控元件的突變、引入產生降低或抑制酶之活性的蛋白質的核酸或引入抑制酶之表現的核酸(例如反義RNA、siRNA、CRISPR)或蛋白質。可使用此項技術中已知之任何方法引入斷裂性突變。

引入斷裂性突變產生如下本發明之微生物，其不產生標靶產物或實質上不產生標靶產物或相較於產生本發明微生物之親本微生物產生減少量之標靶產物。舉例而言，本發明之微生物可不產生標靶產物或比親本微生物所產生之標靶產物少至少約1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。舉例而言，本發明之微生物可產生少於約0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0g/L標靶產物。

「密碼子最佳化」係指核酸(諸如基因)突變以使特定品系或種屬之核酸的轉譯最佳化或改良。密碼子最佳化可產生較快的轉譯速率或較高的轉譯準確性。在一較佳實施例中，本發明基因針對梭菌、尤其自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中之表現進行密碼子最佳化。在另一較佳實施例中，本發明基因針對自產乙醇梭菌LZ1561中之表現進行密碼子最佳化，自產乙醇梭菌LZ1561以DSMZ寄存編號DSM23693寄存。

「過度表現」係指本發明微生物中核酸或蛋白質 之表現相較於產生本發明微生物之野生型或親本微生物增加。過度表現可藉由此項技術中已知的任何手段達成，包含改變基因複本數、基因轉錄率、基因轉譯率或酶降解率。

術語「變異體」包含序列不同於參考核酸及蛋白質之序列(諸如先前技術中所揭示或本文中所例示之參考核酸及蛋白質之序列)的核酸及蛋白質。本發明可使用變異核酸或蛋白質實施，所述變異核酸或蛋白質之功能與參考核酸或蛋白質實質上相同。舉例而言，變異蛋白可執行與參考蛋白質實質上相同的功能或催化與參考蛋白質實質上相同的反應。變異基因可編碼與參考基因相同或實質上相同的蛋白質。變異啟動子啟動一或多個基因之表現的能力可與參考啟動子實質上相同。

此類核酸或蛋白質在本文中可稱為「功能等效變異體」。舉例而言，核酸之功能等效變異體可包括對偶基因變異體、基因片段、突變基因、多形現象及其類似者。來自其他微生物之同源基因亦為功能等效變異體之實例。其包含諸如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或永達爾梭菌之種屬中之同源基因，其詳情在諸如基因庫或NCBI之網站上可公開獲得。功能等效變異體亦包含由於針對特定微生物之密碼子最佳化而引起序列變化之核酸。核酸之功能等效變異體較佳與參考核酸具有至少約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%或更大的核酸序列一致性(同源性百分比)。蛋白質之功能等效變異體較佳與參考蛋白質具有至少約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%或更大的胺基酸一致性(同源性百分比)。變異核酸或蛋白質之功能等效性可以使用此項技 術中已知之任何方法評估。

核酸可使用此項技術中已知之任何方法傳遞至本發明之微生物。舉例而言，核酸可以裸核酸形式傳遞，或可用一或多種試劑(諸如脂質體)調配。核酸可視情況為DNA、RNA、cDNA或其組合。限制抑制劑可用於特定實施例中。其他載體可包含質體、病毒、噬菌體、黏質體及人工染色體。在一較佳實施例中，使用質體將核酸傳遞至本發明之微生物。舉例而言，轉型(包含轉導或轉染)可藉由電穿孔、超音波處理、聚乙二醇介導之轉型、化學或天然感受態、原生質體轉型、原噬菌體誘導或結合達成。在具有活性限制酶系統之某些實施例中，可能需要在將核酸引入微生物中之前甲基化所述核酸。

此外，核酸可經設計以包括調控元件，諸如啟動子，以提高或以其他方式控制特定核酸之表現。啟動子可為組成性啟動子或誘導性啟動子。理想地，啟動子為Wood-Ljungdahl路徑啟動子、鐵氧化還原蛋白啟動子、丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子、Rnf複合物操縱子之啟動子、ATP合成酶操縱子之啟動子或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子之啟動子。

「微生物」為微觀生物，尤其為細菌、古細菌、病毒或真菌。本發明微生物通常為細菌。如本文所用，「微生物」之敍述應理解為涵蓋「細菌」。

「親本微生物」為用於產生本發明微生物之微生物。親本微生物可為天然存在之微生物(亦即，野生型微生物)或先前經修飾之微生物(亦即，突變或重組微生物)。本 發明細菌可經修飾以表現或過度表現一或多種在親本微生物中不表現或不過度表現之酶。類似地，本發明微生物可經修飾以含有一或多個親本微生物不含之基因。本發明之微生物亦可經修飾以不表現或表現較少量之一或多種表現於親本微生物中之酶。在一個實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。在一較佳實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌LZ1561，其以DSMZ寄存編號DSM23693寄存。

術語「源自」指示核酸、蛋白質或微生物自不同(例如，親本或野生型)核酸、蛋白質或微生物進行修飾或改適，以便產生新穎核酸、蛋白質或微生物。此類修飾或改適通常包含核酸或基因之插入、缺失、突變或取代。一般而言，本發明微生物源自親本微生物。在一個實施例中，本發明微生物源自自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。在一較佳實施例中，本發明之微生物源自以DSMZ寄存編號DSM23693寄存之自產乙醇梭菌LZ1561。

本發明之微生物可基於功能特徵進一步分類。舉例而言，本發明之微生物可為或可源自固定C1之微生物、厭氧菌、產乙酸菌、產乙醇菌、羧基氧化菌及/或甲烷氧化菌。表1提供微生物之代表性清單且鑑別其功能特徵。

「C1」係指一碳分子，例如CO、CO₂、CH₄或CH₃OH。「C1-氧合物」係指亦包括至少一個氧原子之一碳分子，例如CO、CO₂或CH₃OH。「C1--碳源」係指充當本發明微生物之部分或唯一碳源之一碳分子。舉例而言，C1碳源可包括中CO、CO₂、CH₄、CH₃OH或CH₂O₂之一或多者。較佳地，C1-碳源包括CO及CO₂中之一者或兩者。「固定C1之微生物」為能夠自C1-碳源產生一或多種產物的微生物。通常， 本發明之微生物為固定C1之細菌。在一較佳實施例中，本發明之微生物源自表1中鑑別之固定C1之微生物。

「厭氧菌」為生長不需要氧氣之微生物。若氧氣以高於某一臨限值存在，則厭氧菌可消極反應或甚至死亡。通常，本發明之微生物為厭氧菌。在一較佳實施例中，本發明之微生物源自表1中鑑別之厭氧菌。

「產乙酸菌」為產生或能夠產生乙酸酯(或乙酸)作為厭氧呼吸之產物的微生物。通常，產乙酸菌為使用Wood-Ljungdahl路徑作為其能量守恆及合成乙醯CoA及乙醯CoA衍生產物(諸如乙酸酯)之主要機制的絕對厭氧細菌(Ragsdale，《生物化學與生物物理學學報》，1784：1873-1898,2008)。產乙酸菌使用乙醯基-CoA路徑作為(1)自CO₂還原合成乙醯基-CoA之機制，(2)接受電子、能量守恆之最終過程，(3)固定(同化)合成細胞碳中之CO₂的機制(Drake，《產乙酸原核生物》，於《原核生物》中，第3版，第354頁，New York,NY,2006)。所有天然存在之產乙酸菌為固定C1、厭氧、自養及非甲烷氧化的。通常，本發明之微生物為產乙酸菌。在一較佳實施例中，本發明之微生物源自表1中鑑別之產乙酸菌。

「產乙醇菌」為產生或能夠產生乙醇之微生物。通常，本發明之微生物為產乙醇菌。在一較佳實施例中，本發明之微生物源自表1中鑑別之產乙醇菌。

「自養生物」為能夠在不存在有機碳的情況下生長之微生物。取而代之，自養生物使用無機碳源，諸如CO及/或CO₂。通常，本發明之微生物為自養生物。在一較佳實施 例中，本發明之微生物源自表1中鑑別之產自養生物。

「一氧化碳氧化菌」為能夠使用CO作為唯一碳源之微生物。通常，本發明之微生物為一氧化碳氧化菌。在一較佳實施例中，本發明之微生物源自表1中鑑別之羧基氧化菌。

「甲烷氧化菌」為能夠使用甲烷作為唯一碳源及能量來源之微生物。在某些實施例中，本發明之微生物源自甲烷氧化菌。

更廣泛地，本發明之微生物可源自表1中鑑別之任何屬或種屬。

在一較佳實施例中，本發明微生物源自包括自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌種屬之梭菌的叢集。此等種屬首先藉由Abrini，《微生物學檔案(Arch Microbiol)》，161：345-351,1994(自產乙醇梭菌)，Tanner，《國際系統細菌學雜誌(Int J System Bacteriol)》，43：232-236,1993(永達爾梭菌)及Huhnke,WO 2008/028055(拉氏梭菌)報導及表徵。

此三種種屬具有諸多類似性。詳言之，此等物種均為梭菌屬之固定C1、厭氧、產乙酸、產乙醇及一氧化碳營養型成員。此等種屬具有類似基因型、表現型、能量守恆及醱酵代謝模式。此外，此等物種叢集於16S rRNA DNA具有大於99%一致性之梭菌rRNA同源組I中，具有約22-30mol%之DNA G+C含量，為革蘭氏陽性的，具有類似形態及大小(0.5-0.7×3-5μm之間的對數生長細胞)，為嗜溫性的(最佳生長於30-37℃下)，具有約4-7.5之類似pH範圍(其中最佳pH為約5.5-6)，不具有細胞色素且經由Rnf錯合物使能量守恆。 另外，已在此等種屬中展示羧酸還原為其對應醇(Perez，《生物技術與生物工程(Biotechnol Bioeng)》，110：1066-1077,2012)。重要的是，此等種屬亦全部展示在含CO氣體下強力自養生長、產生乙醇及乙酸酯(或乙酸)作為主要醱酵產物，且在某些條件下產生少量2,3-丁二醇及乳酸。

然而，此三種種屬亦具有多種差異。此等種屬分離自不同來源：自產乙醇梭菌分離自兔腸道，永達爾梭菌分離自雞舍廢棄物，且拉氏梭菌分離自淡水沈積物。此等物種在各種糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸鹽、檸檬酸鹽)、胺基酸(例如精胺酸、組胺酸)以及其他受質(例如甜菜鹼、丁醇)之利用方面不同。此外，此等種屬在對某些維生素(例如硫胺素、生物素)之營養缺陷性方面不同。此等種屬在Wood-Ljungdahl路徑基因及蛋白質之核酸及胺基酸序列方面不同，但已發現此等基因及蛋白質之一般組織及數目在所有種屬中相同(Köpke，《生物技術新見》，22：320-325,2011)。

因此，總體而言，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌之許多特徵並非為所述種屬所特異性的，而是梭菌屬之固定C1、厭氧、產乙酸、產乙醇及一氧化碳營養型成員之此叢集之一般特徵。然而，由於此等種屬實際上為相異的，故此等種屬中之一者之基因修飾或操作可在此等種屬中之另一者中具有不同作用。舉例而言，可觀測到生長、效能或產物產生之差異。

本發明之微生物亦可源自自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌之分離株或突變體。自產乙醇梭菌之分離株 及突變體包含JA1-1(DSM10061)(Abrini，《微生物學檔案》，161：345-351,1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)及LZ1561(DSM23693)。永達爾梭菌之分離株及突變體包含ATCC 49587(Tanner，《國際系統細菌學雜誌》，43：232-236,1993)、PETCT(DSM13528,ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)及OTA-1(Tirado-Acevedo，《使用永達爾梭菌自合成氣產生生物乙醇(Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii)》，《博士畢業論文(PhD thesis)》，North Carolina State University,2010)。拉氏梭菌之分離株及突變體包含PI 1(ATCC BAA-622，ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。

然而，在一些實施例中，本發明之微生物為除自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌以外的微生物。舉例而言，微生物可選自由以下組成之群：大腸桿菌、釀酒酵母、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharbutyricum)、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、帝奧梭菌、克氏梭菌、巴斯德梭菌、水腫梭菌(Clostridium novyi)、艱難梭菌、熱纖梭菌(Clostridium thetmocellum)、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌、植物醱酵梭菌(Clostridium phytofermentans)、雷特氏乳球菌、枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、運動醱酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、穀胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、里氏木菌(Trichoderma reesei)、鉤蟲貪銅菌、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、 胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)及扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)。

「受質」係指本發明微生物之碳源及/或能量來源。通常，受質為氣體受質，且包括C1-碳源，例如CO、CO₂及/或CH₄。較佳地，受質包括含有CO或CO+CO₂之C1-碳源。受質可進一步包括其他非碳組分，諸如H₂、N₂或電子。

受質一般包括至少一定量之CO，諸如約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mol%CO。受質可包括一定範圍之CO，諸如約20-80、30-70或40-60mol%CO。較佳地，受質包括約40-70mol%CO(例如鋼鐵廠或高爐氣體)、約20-30mol%CO(例如鹼性氧氣轉爐氣體)或約15-45mol%CO(例如合成氣)。在一些實施例中，受質可包括相對低量之CO，諸如約1-10或1-20mol%CO。本發明之微生物通常將受質中之至少一部分CO轉化為產物。在一些實施例中，受質不包括或實質上不包括CO。

受質可包括一定量之H₂。舉例而言，受質可包括約1、2、5、10、15、20或30mol%H₂。在一些實施例中，受質可包括相對高量之H₂，諸如約60、70、80或90mol%H₂。在其他實施例中，受質不包括或實質上不包括H₂。

受質可包括一定量之CO₂。舉例而言，受質可包括約1-80或1-30mol%CO₂。在一些實施例中，受質可包括小於約20、15、10或5mol%CO₂。在另一實施例中，受質不包括或實質上不包括CO₂。

儘管受質通常為氣態，但受質亦可以替代形式提供。舉例而言，受質可使用微泡分散發生器溶解於含CO氣體 飽和液體中。另外舉例而言，受質可吸附至固體載體上。

受質及/或C1-碳源可為作為工業製程之副產物獲得或來自一些其他來源(諸如來自汽車排出之煙或生物質氣化)的廢氣。在某些實施例中，工業製程選自由以下各者組成之群：含鐵金屬產品製造(諸如鋼鐵廠製造)、非鐵產品製造、石油精煉製程、煤炭氣化、電力生產、碳黑生產、氨生產、甲醇生產及焦炭製造。在此等實施例中，受質及/或C1-碳源可在排放至大氣中之前使用任何便利方法自工業製程捕獲。

受質及/或C1-碳源可為合成氣，諸如藉由煤炭或精煉廠殘餘物氣化、生物質或木質纖維素材料氣化或天然氣重整獲得的合成氣。在另一實施例中，合成氣可獲自城市固體廢物或工業固體廢物之氣化。

受質之組成可對反應效率及/或成本具有顯著影響。舉例而言，氧氣(O₂)之存在可降低厭氧醱酵製程之效率。視受質之組成而定，可能需要處理、擦洗或過濾受質以移除任何非所需雜質，諸如毒素、非所需組分或粉塵粒子及/或增加所需組分之濃度。

本發明之微生物可經培養以產生一或多種產物。舉例而言，自產乙醇梭菌產生或可經工程改造以產生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸酯(WO 2007/117157)、丁醇(WO 2008/115080及WO 2012/053905)、丁酸酯(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342)、乳酸酯(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522及 WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、異丙醇(WO 2012/115527)、脂質(WO 2013/036147)、3-羥基丙酸酯(3-HP)(WO 2013/180581)、異戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO 2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/0369152)及1-丙醇(WO 2014/0369152)。除一或多種目標產物以外，本發明之微生物亦可產生乙醇、乙酸及/或2,3-丁二醇。在某些實施例中，微生物生物質自身可視為產物。

「天然產物」為藉由未經遺傳修飾之微生物產生之產物。、舉例而言，乙醇、乙酸酯及2,3-丁二醇為自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌之天然產物。「非天然產物」為由經遺傳修飾微生物產生而非由產生經遺傳修飾微生物的未經遺傳修飾微生物產生的產物。

在本文中可互換提及之術語「中間物」及「前驅物」係指所觀測或標靶產物之上游的酶促路徑中的分子實體。

「選擇性」係指標靶產物之產量與藉由微生物產生的所有醱酵產物之產量的比率。本發明之微生物可經工程改造而以特定選擇性或最小選擇性產生產物。在一個實施例中，標靶產物占藉由本發明微生物產生之所有醱酵產物之至少約5%、10%、15%、20%、30%、50%或75%。在一個實施例中，標靶產物占藉由本發明微生物產生之所有醱酵產物之至少10%，使得本發明之微生物對標靶產物之選擇性為至少10%。在另一實施例中，標靶產物占藉由本發明微生物產生之所有醱酵產物的至少30%，使得本發明之微生物對標靶產物之選擇性為至少30%。

「提高效率」及其類似物術語包含(但不限於)提高增長率、產物產生速率或體積、每消耗單位體積之受質的產物體積或產物選擇性。效率可相對於產生本發明微生物之親本微生物之效能量測。

通常，在生物反應器中進行培養。術語「生物反應器」包含培養/醱酵裝置，其由一或多個容器、塔或管道配置組成，諸如連續攪拌槽反應器(CSTR)、固定細胞反應器(ICR)、滴流床反應器(TBR)、氣泡柱、氣升式醱酵罐、靜態混合器或適合於氣-液接觸之其他容器或其他裝置。在一些實施例中，生物反應器可包括第一生長反應器及第二培養/醱酵反應器。可將受質提供給此等反應器中之一者或兩者。如本文所用，術語「培養」及「醱酵」可互換使用。此等術語涵蓋培養/醱酵製程之生長階段及產物生物合成階段。

通常在含有足以允許微生物生長之營養物、維生素及/或礦物質之水性培養基中維持培養物。較佳地，水性培養基為厭氧微生物生長培養基，諸如最小厭氧微生物生長培養基。適合培養基為此項技術中所熟知。

培養/醱酵有利地應該在適用於產生標靶產物之條件下進行。通常，培養/醱酵在厭氧條件下執行。應考慮到的反應條件包含壓力(或分壓)、溫度、氣體流速、液體流速、培養基pH、培養基氧化還原電位、攪拌速率(若使用連續攪拌槽反應器)、接種物水準、確保液相中之氣體不會變成限制因素的最大氣體受質濃度及避免產物抑制的最大產物濃度。詳言之，可控制受質之引入速率以確保液相中之氣體之濃度不會變成限制因素，因為在氣體限制條件下，培養物可能消 耗產物。

在高壓下操作生物反應器允許增加自氣相至液相之氣體質量轉移速率。因此，在高於大氣壓之壓力下執行培養/醱酵通常較佳。此外，因為指定氣體轉化率在某種程度上為受質滯留時間之函數，且滯留時間指示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可以大大減小所需生物反應器之體積，因此降低培養/醱酵設備之資金成本。此又意謂當生物反應器維持在高壓而非大氣壓下時，滯留時間(定義為生物反應器中之液體體積除以輸入氣體流速)可減少。最佳反應條件將部分地視所用特定微生物而定。然而，一般而言，較佳在高於大氣壓之壓力下操作醱酵。此外，由於既定氣體轉化速率部分為受質滯留時間之函數，且獲得所需滯留時間又規定生物反應器之所需體積，故使用加壓系統可極大地減小所需生物反應器之體積，因此降低醱酵設備之資金成本。

標靶產物可使用任何方法或此項技術中已知方法之組合自醱酵培養液分離或純化，包括例如分餾、蒸發、滲透蒸發、氣體汽提、相分離及萃取醱酵，包含例如液-液萃取。在某些實施例中，標靶產物藉由以下步驟自醱酵培養液回收：自生物反應器連續移除培養液之一部分，分離微生物細胞與培養液(藉由過濾便利地進行)及自培養液回收一或多種標靶產物。醇及/或丙酮可例如藉由蒸餾回收。酸可例如藉由吸附於活性炭上回收。較佳將所分離微生物細胞返回生物反應器。亦較佳將移除標靶產物後剩餘之不含細胞之滲透物返回生物反應器。可將其他營養物(諸如B維生素)添加至不含細胞之滲透物中以在培養基返回生物反應器前進行補 充。

實例

以下實例進一步說明本發明，但當然不應視為以任何方式限制其範疇。

實例1

此實例展現Ptb-Buk在大腸桿菌中將乙醯乙醯基-CoA活體內轉化為乙醯乙酸酯之能力及其產生丙酮、異丙醇、3-羥基丁酸酯及異丁烯之用途。

設計且建構依賴於Ptb-Buk系統自乙醯乙醯基-CoA產生乙醯乙酸酯之路徑。此以模組方式使用pDUET載體系統(Novagen)進行。一個模組在質體pACYC上含有來自拜氏梭菌NCIMB8052之ptb-buk基因(基因庫NC_009617，位置232027..234147；Cbei_0203-204；NCBI-GeneID 5291437-38)。另一模組在質體pCOLA上含有丙酮丁醇梭菌之硫解酶基因thlA(基因庫NC_001988，位置82040..83218；CA_P0078；NCBI-GeneID 1116083)及拜氏梭菌NCIMB8052之乙醯乙酸去羧酶基因adc(基因庫NC_009617，位置4401916..4402656；Cbei_3835；NCBI-GeneID 5294996)。ptb及buk基因擴增自拜氏梭菌NCIMB8052之基因組DNA且thlA及adc擴增自現有丙酮質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc(WO 2012/115527)，且在pDUET載體中所存在之T7啟動子控制下經由不依賴於限制之選殖用環形聚合酶延伸選殖(CPEC)方法(Quan，《公共科學圖書館(PloS One)》，4：e6441,2009)進行選殖。

用於擴增ptb及buk基因之寡核苷酸：

用於擴增thlA及adc基因之寡核苷酸：

建構質體pACYC-ptb-buk(SEQ ID NO：105)及pCOLA-thlA-adc(SEQ ID NO：106)後，將其個別地一起轉型至大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)中，且在28℃下，於1.5mL培養物中於12孔盤中在160rpm迴旋搖動下使用含葡萄糖之M9基本培養基(Sambrook，《分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第3卷，Cold Spring Harbour Press,1989)一式四份進行生長實驗(圖4)。以0.1之OD600nm接種培養物，且在生長2小時後用不同濃度IPTG(0、50、100μM)誘導。使用培養盤膠帶密封培養盤且用綠色尖針刺穿各孔以提供微好氧條件。進行生長以再進行64小時誘導。實驗重複三次。

使用氣相層析(GC)分析，使用配備有Supelco聚乙二醇(PEG)60μm固相微提取纖維、Restek Rtx-1(30m ×0.32μm×5μm)管柱及火焰電離偵測器(FID)之Agilent 6890N頂空GC量測丙酮濃度以及其他代謝物(諸如異丁烯)濃度。將樣品(4mL)轉移至20-ml頂空小瓶中，接著在50℃下培育(暴露)纖維10分鐘。使樣品在250℃下在注射器中歷時9分鐘解吸附。用如下烘箱程式進行層析：40℃(保持5分鐘)，且以10℃/分鐘直至200℃，繼而在220℃下保持5分鐘。管柱流速為1mL/min，其中使用氫氣作為載氣。將FID保持在250℃下，其中使用40ml/min之氫氣、450ml/min之空氣及15ml/min之氮氣作為補充氣體。

立即顯而易見在帶有pACYC-ptb-buk與pCOLA-thlA-adc質體之菌株(表現硫解酶、Ptb-Buk及乙醯乙酸去羧酶)中產生丙酮。量測到平均最終丙酮產量為0.19g/L，而在無質體對照、培養基對照及單一質體對照pACYC-ptb-buk(表現Ptb-Buk)或pCOLA-thlA-adc質體(表現硫解酶及乙醯乙酸去羧酶)中無丙酮產生(低於可信賴偵測極限)。帶有pACYC-ptb-buk與pCOLA-thlA-adc質體之菌株(表現硫解酶、Ptb-Buk及乙醯乙酸去羧酶)的未誘導培養物不產生顯著量之丙酮。

大腸桿菌BL21(DE3)中之平均丙酮產量：

此實驗明確展現Ptb-Buk能夠進行乙醯乙醯基-CoA向乙醯乙酸酯之轉化，可替代CoA-轉移酶或硫酯酶用於 產生丙酮，其使用圖1之包括步驟1、2及3之途徑例示。

熟知異丙醇可由丙酮藉由添加一級：二級醇去氫酶製備(Köpke，《應用與環境微生物學》，80：3394-3403,2014)(圖1中之步驟4)，且異丁烯可由丙酮經由添加羥基異戊酸合成酶(圖1中之步驟5)及去羧酶(圖1中之步驟6)製備(van Leeuwen，《應用微生物學與生物技術》，93：1377-1387,2012)。可建構如下路徑，其包含以上所展現之具有基因thlA、ptb-buk及adc及一級：二級醇去氫酶基因(例如基因庫寄存編號NC_022592，pos.609711..610766；CAETHG_0553；NCBI-GeneID：17333984)經由Ptb-Buk進行之丙酮途徑，所述路徑使得可在大腸桿菌中經由Ptb-Buk系統產生異丙醇，其包括圖1之步驟1、2、3及4。類似地，可建構如下路徑，其包含以上所展現之具有基因thlA、ptb-buk及adc及羥基異戊酸合成酶及去羧酶之基因經由Ptb-Buk將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯的丙酮途徑，所述路徑使得可在大腸桿菌中經由Ptb-Buk系統產生異丁烯，其包括圖1之步驟1、2、3、5及6。乙醯乙酸酯亦可經由3-羥基丁酸去氫酶Bdh轉化為3-羥基丁酸酯。其可與Ptb-Buk將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯組合用於在表現基因thlA、ptb-buk及bdh之菌株中產生3-羥基丁酸酯，從而產生包括圖1之步驟1、2及15之路徑。

實例2

此實例展現Ptb-Buk在自產乙醇梭菌中將乙醯乙醯基-CoA活體內轉化為乙醯乙酸酯之能力及Ptb-Buk在自氣體受質產生丙酮、異丙醇、3-羥基丁酸酯及異丁烯中之用途。

為展示Ptb-Buk系統亦可自氣體受質合成丙酮、異丙醇或異丁烯，建構如下質體，其在梭菌啟動子控制下在穿梭載體上含有與實例1相同之基因，thl+ptb-buk+adc，使得所述質體可表現於產乙酸菌(諸如自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌)中。

pMTL質體為用於將環形dna經由大腸桿菌結合引入梭菌中的穿梭質體系統(Heap，《微生物學方法雜誌(J Microbiol Methods)》，78：79-85,2009)。使用分子生物學中之常見技術將相關基因(亦即hbd、phaB、thlA、ptb、buk及aor1)選殖於質體之lacZ區中，所述技術包含dna限制消化，繼而接合，且在超過一片dna片段同時選殖於質體中時使用金門dna組裝技術(golden gate dna assembly technology)。所建構質體藉由DNA測序檢驗。

產生丙酮及異丙醇先前展現於在來自Wood-Ljungdahl基因叢集之梭菌啟動子之控制下使用編碼thl+ctfAB+adc之質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc(WO 2012/115527)的自產乙醇梭菌中。在此質體中，編碼CoA轉移酶之ctfAB基因直接用編碼Ptb-Buk系統之ptb-buk基因置換。此如實例1中所述使用CPEC方法進行。所得質體為pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc。

下文描述用於擴增ptb-buk及選殖於pMTL8317-thl-ptb-buk-adc中之寡核苷酸。

自產乙醇梭菌DSM10061及DSM23693(DSM10061之衍生物)源自DSMZ(德國微生物及細胞培養物收集中心(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures),Inhoffenstraße 7 B,38124 Braunschweig,Germany)。

使用標準厭氧技術(Hungate，《微生物學方法(Meth Microbiol)》，3B：117-132,1969；Wolfe，《微生物生理學進展(Adv Microb Physiol)》，6：107-146,1971)使菌株在37℃下於pH 5.6之PETC培養基中生長。將30psi含CO鋼鐵廠氣體(自紐西蘭鋼鐵站(New Zealand Steel site)(Glenbrook,NZ)收集)或具有44%CO、32%N₂、22%CO₂、2%H₂之相同組成之合成氣體摻合物用作自養生長之受質。對於固體培養基，添加1.2%細菌瓊脂(BD,Franklin Lakes,NJ 07417,USA)。

合成構築體，隨後經由結合轉型至自產乙醇中。對此，首先使用標準熱衝擊轉型將表現載體引入所述結合供體菌株大腸桿菌HB101+R702(CA434)(Williams，《普通微生物學雜誌(J Gen Microbiol)》，1136：819-826,1990)(供體)中。在37℃下於SOC培養基(Sambrook，《分子選殖：實驗室手冊》，第3卷，Cold Spring Harbour Press,1989)中回收供體細胞歷時1小時，隨後塗佈於含有100μg/ml大觀黴素(spectinomycin)及25μg/ml氯黴素(chloramphenicol)之LB培養基(Sambrook，《分子選殖：實驗室手冊》，第3卷，Cold Spring Harbour Press,1989)盤上。在37℃下培育 LB盤隔夜。第二天，用數個供體群落接種5ml含有100μg/ml大觀黴素及25μg/ml氯黴素之LB等分試樣，且在37℃下培育，震盪約4小時或直至密集可見培養物但尚未進入固定相為止。在室溫下藉由在4000rpm下離心2分鐘於微型離心管中收集1.5ml供體培養物，且丟棄上清液。將供體細胞輕輕再懸浮於500μl無菌PBS緩衝液(Sambrook，《分子選殖：實驗室手冊》，第3卷，Cold Spring Harbour Press,1989)中，在4000rpm下離心2分鐘且丟棄PBS上清液。將集結粒引入厭氧腔室中且輕輕再懸浮於200μl指數期後期之自產乙醇梭菌培養物(接受者)中。將結合混合物(供體與接受者細胞之混合物)點樣於PETC-MES+果糖瓊脂盤上且使其乾燥。在點不再可見濕潤時，將培養盤引入用合成氣加壓至25-30psi的壓力罐中且在37℃下培育約24小時。培育24小時後，藉由使用10μl接種環輕輕刮擦自培養盤移出結合混合物。將所移出混合物懸浮於200-300μl PETC培養基中。將100μl結合混合物之等分試樣塗佈於補充15μg/ml甲碸黴素(thiamphenicol)之PETC培養基瓊脂盤上以選擇具有質體之轉型體，所述質體經由表現氯黴素乙醯基轉移酶賦予對甲碸黴素之耐藥性。

將具有pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc質體之自產乙醇梭菌之三個獨特群落接種於2mL含有15μg/ml甲碸黴素之PETC-MES培養基中且在37℃下在100rpm迴旋震盪下自養生長三天。用10mL含15μg/ml甲碸黴素之PETC-MES培養基於血清瓶中稀釋培養物至OD_600nm=0.05，且在37℃下在100rpm迴旋震盪下自養生長五天，每天取樣量測生物質 及代謝物。同時，檢驗對照菌株，其中表現質體在Wood-Ljungdahl叢集啟動子控制下僅編碼thl及adc，不含催化自乙醯乙醯基-CoA形成乙醯乙酸酯的ctfAB或ptb-buk基因(pMTL85147-thlA-adc)。將培養物進行取樣歷時五天以監測代謝物及生物質聚積。

異丙醇濃度以及乙醇、乙酸、2,3-丁二醇及乳酸之濃度藉由高效液相層析(HPLC)於Agilent LC上在35℃下用折射率(RI)偵測來量測。藉由用100μL 5-磺基水楊酸溶液(1 w/v%，於1M硫酸中)稀釋400μL製備樣品，繼而在14,000rpm下離心3分鐘；將上清液轉移至玻璃瓶中以進行分析。藉由以0.7mL/min及在65℃下在等度條件下使用5mM硫酸移動相於Alltech IOA-2000管柱(150mm×6.5mm×8μm)上注射10μL進行分離。

在一些情況下，使用較長HPLC方法改良峰分離。在此方法中，異丙醇、乙醇、乙酸酯、2,3-丁二醇以及3-羥基丁酸酯(其不使用較短方法分離)濃度藉由高效液相層析(HPLC)在35℃下在Agilent 1260 Infinity LC上用折射率(RI)偵測量測。藉由用100μL 5-磺基水楊酸溶液(1 w/v%，於1M硫酸中)稀釋400μL製備樣品，繼而在14,000rpm下離心3分鐘；將上清液轉移至玻璃瓶中以進行分析。藉由以0.6mL/min及在35℃下在等度條件下使用5mM硫酸移動相於Aminex HPX-87H管柱(300mm×7.8mm×9μm)上注射10μL進行分離。

具有pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc之自產乙醇梭菌每公克生物質產生高達0.804g異丙醇之IPA，而具有 pMTL85147-thlA-adc且不含Ptb-Buk之對照自產乙醇梭菌不產生IPA(圖12)。

此實驗明確展現在使用氣體受質時Ptb-Buk能夠進行異丙醇路徑中乙醯乙醯基-CoA向乙醯乙酸酯之轉化。在氣體醱酵產乙酸菌(諸如自產乙醇梭菌)中可使用Ptb-Buk替代CoA轉移酶或硫酯酶，使用包括圖1之步驟1、2、3及4之途徑例示。

自產乙醇梭菌含有天然一級：二級醇去氫酶，其將丙酮轉化為異丙醇(Köpke，《應用與環境微生物學》，80：3394-3403,2014)。已展現，剔除此基因去除自產乙醇梭菌中丙酮向異丙醇之轉化(WO 2015/085015)。在此基因剔除之背景下，可使用包括圖1之步驟1、2及3之相同基因經由Ptb-Buk系統自氣體原料產生丙酮(而非異丙醇)。向此菌株添加羥基異戊酸合成酶及去羧酶基因(van Leeuwen，《應用微生物學與生物技術》，93：1377-1387,2012)將使得自產乙醇梭菌或類似細菌中能夠自氣體產生異丁烯，其包括圖1之步驟1、2、3、5及6。

乙醯乙酸酯亦可經由3-羥基丁酸去氫酶Bdh轉化為3-羥基丁酸酯。3-羥基丁酸去氫酶在自產乙醇梭菌(AGY75962)及如永達爾梭菌(ADK16920.1)之其他產乙酸菌之基因組中鑑別。此活性可與Ptb-Buk(或CoA轉移酶)將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯組合以在表現基因thlA、ptb-buk(或ctfAB)及bdh之菌株中產生3-羥基丁酸酯，得到包括圖1之步驟1、2及15之路徑。自產乙醇梭菌中展現經由此途徑形成低水準之3-羥基丁酸酯(至多2g/L)。此 等水準可藉由過度表現Bdh基因提高，Bdh基因僅以低水準天然表現。

在一個實驗中，如實例2中所述用質體pMTL82256-thlA-ctfAB將自產乙醇梭菌轉型。自六個生物學複本在如實例2中所述之自養條件下監測產生10天。10天後3-HB之平均值為1.86±0.14g/L。在第10天，產生1,3-丁二醇(自3-HB)，平均效價為0.38±0.05g/L(圖37)。不形成丙酮或異丙醇。此展現3-HB可經由乙醯乙酸酯用天然酶有效產生。

在某些實施例中，可能需要剔除或阻斷3-羥基丁酸去氫酶(諸如Bdh)之表現以阻止消耗碳而獲得3-HB，因此提高產物(諸如丙酮、異丙醇及異丁烯)產量。

實例3

此實例展現在大腸桿菌中Ptb-Buk將(R)-3-羥基丁醯基-CoA活體內轉化為(R)-3-羥基丁酸酯以製備(R)-羥基丁酸酯、丙酮、異丙醇或異丁烯之能力。

設計且建構如下路徑，其依賴於Ptb-Buk系統自(R)-3-羥基丁醯基-CoA產生(R)-3-羥基丁酸酯。另外，3-羥基丁酸去氫酶(Bdh)可用於將(R)-3-HB轉化為乙醯乙酸酯。已報導皮氏羅爾斯頓菌具有兩種3-羥基丁酸去氫酶Bdh1及Bdh2，其能夠將3-羥基丁酸酯活體外轉化為乙醯乙酸酯(Takanashi，《生物學與生物工程雜誌》，101：501-507,2006)。設計一種路徑，其利用此酶產生丙酮(圖1之步驟1、13、14、15、3)，同時將產生(R)-3-羥基丁醯基-CoA中所產生之還原等效物及由Ptb-Buk產生的ATP再循環(圖6)。

以模組方式使用pDUET載體系統(Novagen)建構路徑。將以上實例中所述之兩個模組(表現Ptb-Buk之pACYC-ptb-buk及表現硫解酶及乙醯乙酸去羧酶之pCOLA-thlA-adc)與兩個單獨含有鉤蟲貪銅菌之任一(R)-特異性3-羥基丁酸去氫酶phaB(WP_010810131.1)之額外模組(pCDF-phaB)及一個具有皮氏羅爾斯頓菌之3-羥基丁酸去氫酶bdh1基因(BAE72684.1)的模組(pCDF-phaB-bdh1)在載體pCDF中一起使用。phaB與bdh1基因均合成自GeneArt且經由限制非依賴性選殖用環形聚合酶延伸選殖(CPEC)方法(Quan，公共科學圖書館，4：e6441,2009)在T7啟動子控制下選殖。

用於擴增bdh1基因之寡核苷酸：

用於擴增phaB基因之寡核苷酸：

建構質體pACYC-ptb-buk(SEQ ID NO：105)、pCOLA-thlA-adc(SEQ ID NO：106)、pCDF-phaB(SEQ ID NO：119)及pCDF-phaB-bdh1(SEQ ID NO：120)後，將其個別地轉型及組合於大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)中，且在28 ℃下，在160rpm迴旋震盪下，於1.5mL 12孔盤中之培養物中使用含葡萄糖之M9基本培養基一式四份進行生長實驗。以0.1之OD600nm接種培養物，且在生長2小時後用不同濃度IPTG(0、50、100μM)誘導。使用BioRad培養盤膠帶密封培養盤且用綠色尖針刺穿各孔以提供微好氧條件。進行生長以再進行64小時誘導。實驗重複3次。如先前實例中所述量測代謝物。

含有質體pACYC-ptb-buk、pCOLA-thlA-adc及pCDF-phaB之組合的培養物產生1.65-2.4g/L(R)-3-羥基丁酸酯(視誘導劑水準而定)以及僅極小量之副產物(圖13A-F)，從而展現所述Ptb-Buk系統將(R)-3-羥基丁醯基-CoA轉化為(R)-3-羥基丁酸酯且支持生長之效率(圖13A-F)。在亦表現bdh1之培養物(含有質體pACYC-ptb-buk、pCOLA-thlA-adc及pCDF-phaB-bdh1之組合)中，僅在培養基中發現少量(R)-3-羥基丁酸酯，同時發現0.89-1.16g/L丙酮(視誘導劑水準而定)，從而指示bdh1基因有效將(R)-3-羥基丁酸酯轉化為乙醯乙酸酯且進一步轉化為丙酮。在缺乏Ptb-Buk之所有質體組合中，未發現3-羥基丁酸酯或丙酮(圖13A-F)。在此等培養物中，乙酸酯水準顯著較高。

此實驗明確展現Ptb-Buk能夠進行(R)-3-羥基丁酸酯-CoA向3-羥基丁酸酯之轉化，以及Bdh1能夠藉由再循環產生(R)-3-羥基丁醯基-CoA中所產生之還原等效物將3-羥基丁酸酯活體內進一步轉化為乙醯乙酸酯。所述實驗亦突顯了Ptb-Buk能夠支持生長，因此乙酸酯產生變得不必要。在包括圖1之步驟1、13及14之菌株中例示(R)-3-羥基丁酸酯形 成之產生。經由包括圖1之步驟1、13、14、15及3之途徑例示丙酮產生。

熟知異丙醇可由丙酮藉由添加一級：二級醇去氫酶製備(圖1中之步驟4)(Köpke，《應用與環境微生物學》，80：3394-3403,2014)，且異丁烯可由丙酮經由添加羥基異戊酸合成酶(圖1中之步驟5)及去羧酶(圖1中之步驟6)製備(van Leeuwen，《應用微生物學生物技術》，93：1377-1387,2012)。可建構如下路徑，其包含以上所展現之具有基因thlA、ptb-buk及adc及一級：二級醇去氫酶基因(例如基因庫寄存編號NC_022592，pos.609711..610766；CAETHG_0553；NCBI-GeneID：17333984)經由Ptb-Buk進行之丙酮途徑，所述路徑使得可在大腸桿菌中經由Ptb-Buk系統產生異丙醇(圖1之步驟1、13、14、15、3及4)。類似地，可建構如下路徑，其包含以上展現之具有基因thlA、ptb-buk及adc及羥基異戊酸合成酶及去羧酶之基因經由Ptb-Buk進行的丙酮途徑，所述路徑使得可在大腸桿菌中經由Ptb-Buk系統產生異丁烯(圖1之步驟1、13、14、15、3、5及6)。

實例4

此實例展現自產乙醇梭菌中(R)-3-羥基丁酸酯及1,3-丁二醇之產生。其亦展現在不存在2,3-丁二醇時1,3-丁二醇之產生。

建構自產乙醇梭菌之菌株，其中2,3-丁二醇產生之天然路徑失活且經(R)-3-羥基丁醯基-CoA形成之基因置換。此藉由用硫解酶(丙酮丁醇梭菌之thlA；GenBank NC_001988，位置82040..83218；CA_P0078；NCBI-GeneID 1116083)及(R)-特異性3-羥基丁酸去氫酶(鉤蟲貪銅菌之phaB；基因庫WP_010810131.1)之基因置換自產乙醇梭菌之基因組上的乙醯乳酸去羧酶基因(budA)達成，得到菌株自產乙醇梭菌budA：：thlAphaB。

為用thlA及phaB基因置換budA基因，將在tet3n0四環素誘導性啟動子下含大腸桿菌毒素基因mazF(用於逆向選擇)之質體pMTL8225-budA：：thlA-phaB(圖14)、budA基因之約1kb上游同源臂、loxP位點側接之thlA、phaB、ermB卡匣及budA基因之約1kb下游同源臂組裝於質體pMTL-tet3no上。

budA之約1kb上游及下游同源臂自自產乙醇梭菌用引子SN01/SN02及SN07/SN08 PCR擴增。thlA及phaB基因自鉤蟲貪銅菌之基因組DNA使用引子SN03/SN04mod PCR擴增。側接loxP位點之ermB卡匣使用引子SN05mod/SN06 PCR擴增。合成側接FseI及PmeI之tet3no啟動子且用限制酶FseI及PmeI處理且清洗。使用GeneArt無縫選殖套組(來自Life Technologies)組裝PCR產物及經消化載體，且使用插入片段中無突變之質體pMTL8225-budA：：thlA-phaB(SEQ ID NO：121)藉由如先前實例中所述結合轉型自產乙醇梭菌。

結合及於甲氧苄啶(trimethoprim)及克拉黴素(clarithromycin)上選擇後，將9個群落於PETC-MES瓊脂盤上劃線兩次，其中使用克拉黴素及無水四環素誘導mazF基因表現。來自克拉黴素及無水四環素之群落的budA基因應已經thlA及phaB基因及ermB卡匣置換。此藉由PCR使用側接同 源臂及KAPA聚合酶之引子Og31f/Og32r檢驗(圖15)。

約3.3kb條帶擴增自野生型菌株，而約5.7kb條帶擴增自群落1、4、7及9，指示budA基因經thlA、phaB及ermB卡匣置換。以上事件藉由將所有4個純系之PCR產物測序進一步確認。在所得修飾下，藉由budA基因上游之啟動子驅使thlA及phaB基因表現。

進行用自產乙醇梭菌budA：：thlA-phaB菌株醱酵。在37℃下，在合成氣體(50%CO、18%CO₂、2%H₂及30%N₂)下，使培養物生長，將其連續饋入生物反應器中。最初將氣體流速設定在50ml/min下，在實驗過程中增至400ml/min，同時將攪拌自200rpm增至500rpm。進行醱酵接近5天。如以上實例中所述量測代謝物。

1,3-丁二醇及其他代謝物(諸如2-羥基異丁酸)之濃度使用氣相層析(GC)分析使用配備有Agilent CP-SIL 5CB-MS(50m×0.25μm×0.25μm)管柱、自動進樣器及火焰電離偵測器(FID)之Agilent 6890N GC量測。樣品藉由如 下步驟製備：用400μL乙腈稀釋400μL樣品，繼而在14,000rpm下3分鐘離心；將上清液轉移至玻璃瓶中且於Thermo SpeedVac中乾燥樣品。乾燥後，隨後將樣品懸浮於400μL N,O-雙三氟乙醯胺(BSTFA)及吡啶(3：1比率)之溶液中且在60℃下於密封玻璃瓶中加熱60分鐘。使用1μL注射量、30比1之分離比及250℃之入口溫度將樣品轉移至自動進樣器中以供分析。用如下烘箱程式執行層析：70℃(不保持)至3℃/分鐘勻變至110℃至15℃/min勻變至230℃，繼而40℃/min最終勻變至310℃，保持3分鐘。管柱流速為1.8mL/min，其中使用氦氣作為載氣。將FID保持在320℃下，其中使用40ml/min之氫氣、400ml/min之空氣及20ml/min之氦氣作為補充氣體。

意外地，表現thlA及phaB之自產乙醇梭菌budA：：thlA-phaB菌株中自氣體產生多達1.55g/L 3-羥基丁酸酯(圖16)。天然硫酯酶可將所形成之3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯。在基因組序列中，鑑別三種推定硫酯酶。

甚至更驚訝地，亦發現隨著3-羥基丁酸酯形成，亦存在多達150mg/L之1,3-丁二醇形成(圖16)。此可歸因於天然醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)及醇去氫酶活性。兩個AOR基因及數個醇去氫酶存在於自產乙醇梭菌之基因組中(Mock，《細菌學雜誌》，197：2965-2980,2015)。3-羥基丁酸酯之此還原藉由經還原鐵氧化還原蛋白提供能量，因此可與提供經還原鐵氧化還原蛋白之CO氧化(CO+Fd_ox□CO₂+Fd_red)直接偶合(圖7)。

亦展現自氣體經由替代途徑使用來自糖乙酸多 丁醇梭菌之丁醛去氫酶Bld(AAP42563.1)(SEQ ID NO：80)產生1,3-BDO。合成bld基因且與相同硫解酶(丙酮丁醇梭菌之thlA)及(R)-特異性3-羥基丁酸去氫酶(鉤蟲貪銅菌之phaB)一起選殖於質體pMTL8315-Pfdx-thlA-phaB-bld(SEQ ID NO：132)中。自以上質體經由下表中之引子擴增Bld及phaB基因且選殖於現有質體pMTL85147-thlA(WO 2012/115527)中。

將所得構築體轉型至上述自產乙醇梭菌中且於含50-mL PETC培養基且在30psi下用含CO鋼鐵廠氣體(自紐西蘭鋼鐵站(Glenbrook,NZ)收集)或具有44%CO、32%N₂、22%CO₂、2%H₂之相同組成之合成氣體摻合物加壓的血清瓶中進行生長實驗。

展現經由此途徑自氣體產生1,3-BDO(圖17A)，但產量低於(至多67mg/L 1,3-BDO)經由AOR途徑所得，且與AOR途徑相比，在表現bld基因時相較於野生型自產乙醇梭菌生長受影響(圖17B)。

在另一實驗中，在如實例2中所述之自養條件下進行瓶實驗中，用如實例2中所述之質體pMTL83159-phaB-thlA轉型的自產乙醇梭菌分別產生0.33及0.46g/L 3-HB(圖40)。

實例5

此實例展現自產乙醇梭菌中(S)-3-羥基丁酸酯及 1,3-丁二醇之產生。

建構如下質體，其在鐵氧化還原蛋白啟動子(自自產乙醇梭菌分離之P_fdx；SEQ ID NO：138)或丙酮酸-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子(自自產乙醇梭菌分離之P_pfor；SEQ ID NO：139)下表現硫解酶(來自丙酮丁醇梭菌之thlA；SEQ ID NO：136)及(S)-特異性3-羥基丁酸去氫酶(來自克氏梭菌之hbd1；SEQ ID NO：137)。如下建構質體：將P-hbd1-rbs2-thlA拼裝在一起且藉由分子選殖中之如下常規方法選殖於pMTL83151載體(Heap，《微生物學方法雜誌》，78：79-85,2009)中，包含限定性酶消化繼而接合、重疊延伸聚合酶鏈反應、無縫選殖(Thermo Fisher Scientific)及GeneArt IIs型(Thermo Fisher Scientific)。將操縱子P-hbd1-rbs2-thlA選殖於質體之多個選殖區中所見之限制位點NotI與XhoI之間。P為組成性啟動子，其含有完整核糖體結合位點(rbs)。rbs2(SEQ ID NO：140)為表現thlA之核糖體結合位點。逐步程序為自現有模板擴增P、hbd1及thlA，其中引子如下所列。

聚合酶鏈反應如下使用Kapa Taq PCR套組(Kapa Biosystems)執行。退火溫度設定在56℃，且延伸1分鐘。重複PCR反應30個循環。之後，使用DNA Clean & Concentrator套組(Zymo Research Corporation)將PCR產物去鹽。

藉由遵循所提供之方案使用FastDigest NotI及FastDigest XhoI(Thermo Fisher Scientific)進行NotI/XhoI雙重消化，繼而使用FastAP鹼性磷酸酶(Thermo Fisher Scientific)及所提供之方案用鹼性磷酸酯處理製備pMTL83151質體主鏈。隨後，用DNA Clean & Concentrator套組(Zymo Research Corporation)將經消化主鏈去鹽。

使用GeneArt IIs型套組(Thermo Fisher Scientific)進行PCR產物及質體主鏈之組裝。隨後自大腸桿菌質體表現宿主使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)分離所得質體。

為引入由所述操縱子組成之經組裝之質體pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA及pMTL8315-Ppfor-hbd1-thlA，首先藉由化學轉型將質體引入大腸桿菌CA434菌株中。之後，藉由將經轉型CA434菌株與自產乙醇梭菌生產宿主於固體LB-瓊脂培養基上混合，且在壓力下在實例2中所述之由一氧化碳及氫氣組成的混合物存在下於厭氧環境中培育進行結合。自產乙醇梭菌在結合後藉由在厭氧條件下連續生長於含有適當抗生素及甲氧苄氨嘧啶(trimethroprim)之固體培養基上選擇以移除剩餘大腸桿菌CA434菌株。

使帶有所引入之由操縱子P-hbd1-rbs2-thlA組成之pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA或pMTL8315-Ppfor-hbd1-thlA 質體之自產乙醇梭菌菌株於用橡膠隔膜緊密密封且封蓋且在30psi下用含CO鋼鐵廠氣體(自紐西蘭鋼鐵站(Glenbrook, NZ)收集)或具有44%CO、32%N₂、22%CO₂、2%H₂之相同組成之合成氣體摻合物加壓的250-mL Schott瓶中於10-mL PETC培養基中生長。如先前實例中所述量測代謝物。

意外地，表現thlA及hbd1之自產乙醇梭菌培養物中由氣體產生3-羥基丁酸酯(圖18A)。天然硫酯酶可將所形成之3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯。在基因組序列中，鑑別三種推定硫酯酶。在帶有pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA之菌株中，發現多達2.55g/L 3-羥基丁酸酯(圖18A)。

甚至更驚人地，亦發現3-羥基丁酸酯隨時間轉化為1,3-丁二醇，在生長結束時，帶有質體pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA之菌株中產生多達1.1g/L 1,3-丁二醇(圖18A)。此可歸因於天然醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)及醇去氫酶活性。兩個AOR基因及數個醇去氫酶存在於自產乙醇梭菌之基因組中(Mock，《細菌學雜誌》，197：2965-2980,2015)。3-羥基丁酸酯之此還原(及乙酸酯還原為乙醇；圖18B)藉由經還原鐵氧化還原蛋白提供能量，因此可與提供經還原鐵氧化還原蛋白之CO氧化(CO+Fd_ox□CO₂+Fd_red)直接偶合(圖7)。

帶有質體pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA之自產乙醇梭菌之相同菌株亦在連續醱酵中測試。如先前實例中所述進行醱酵，但培養物隨著用新鮮培養基之稀釋率連續變化，在第2天約0.05，隨後在第3天增加至1.0。觀測到多達7g/L之高3-羥基丁酸酯產量，且1,3-BDO產量為0.5g/L。

為改良(S)-3-羥基丁酸酯及1,3-丁二醇之產生且避免丁二醇之另一形式(2,3-丁二醇)合成，將質體pMTL-HBD-ThlA引入具有失活之2,3-丁二醇路徑之菌株中，在所述菌株中乙醯乳酸去羧酶基因BudA缺失(U.S.9,297,026)。此budA剔除去除獲得2,3-BDO之主要路徑，從而提高對3-HB及1,3-BDO產生之特異性。當pMTL-HBD-ThlA表現於budA缺失菌株中時，對於3-HB與1,3-BDO獲得總共15mol%C(圖41)。

作為比較，在表現相同質體pMTL83159-hbd-thlA但不剔除budA之菌株中，在穩態下產生3-HB及1,3-BDO之總特異性僅為6.9%。

實例6

此實例展現在自產乙醇梭菌中Ptb-Buk系統對一系列醯基-CoA有效，包含乙醯乙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA及2-羥基異丁醯基-CoA。

Ptb-Buk系統自自產乙醇梭菌中之質體表現且使用CoA水解分析量測其活性。對此，將來自拜氏梭菌 NCIMB8052之ptb-buk基因(基因庫NC_009617，位置232027..234147；Cbei_0203-204；NCBI-GeneID 5291437-38)自拜氏梭菌NCIMB8052之基因組DNA擴增，且藉由分子選殖中之如下常規方法在丙酮酸-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子(自自產乙醇梭菌分離之P_pfor；SEQ ID NO：139)控制下選殖於pMTL83151載體(Heap，《微生物學方法雜誌》，78：79-85,2009)中，包含如實例5中所述之限定性酶消化繼而接合、重疊延伸聚合酶鏈反應、無縫選殖(Thermo Fisher Scientific)及GeneArt IIs型(Thermo Fisher Scientific)。下文描述寡核苷酸。

如先前實例中所述將所得質體pMTL82256-ptb-buk(SEQ ID NO：153)引入自產乙醇梭菌中。

如下執行醯基-CoA水解分析。藉由離心(在4℃下，14,000rpm，1分鐘)收集OD 2(指數期後期)之自產乙醇梭菌細胞。將細胞再懸浮於500μl溶解緩衝液(磷酸鉀緩衝液，pH 8)中。使用凍融循環(視情況選用)，以振幅20於冰上音波處理6×30秒溶解細胞。將樣品在4℃下以14,000rpm離心10分鐘且移出具有可溶性蛋白質之上清液。量測蛋白濃度，例如用Bradford分析。

分析混合物含有：484μl磷酸鉀緩衝液(pH 8.0)、1μl DTNB(最終濃度0.1mM)、10μl細胞溶解物及5μl CoA(最終濃度500μM)。除蛋白質外，將所有組分混合於石 英比色管(1ml比色管，讀取長度為1cm)中。藉由添加細胞溶解物開始分析，繼而在30℃下在分光光度計中在405nm下反應3分鐘。操作無溶解物之對照以量測醯基-CoA之自分解。

為測定活性，計算曲線之線性部分(通常在前30秒)的斜率。標準化蛋白質量且將斜率除以蛋白質量。使用消光係數(14,150M^-1 cm^-1)計算比活性(M/s/mg)。扣除陰性對照之活性。

所述分析用乙醯乙醯基-CoA執行，一種3-羥基丁醯基-CoA(3-HB-CoA)與2-羥基異丁醯基-CoA(2-HB-CoA)之外消旋混合物。潛在受質限制所致的3-HB-CoA及2-HIB-CoA之人工低水解速率之可能性藉由使用不同濃度(500μM及200μM)之醯基-CoA進行自產乙醇梭菌溶解物之重複分析解決。

分析結果展示對於一系列醯基-CoA(包含乙醯乙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA及2-羥基異丁醯基-CoA)，表現Ptb-Buk系統之帶有質體pMTL82256-ptb-buk之自產乙醇梭菌的溶解物中的CoA水解顯著增加(圖20A-B)。值得注意的是，對於野生型自產乙醇梭菌不水解之2-羥基異丁醯基-CoA形式之醯基-CoA，亦存在CoA水解。對於乙醯乙醯基-CoA及3-羥基丁醯基-CoA，觀測到一些天然CoA水解活性。

實例7

此實例展現破壞所鑑別天然硫酯酶基因藉由增加可獲得之醯基-CoA(諸如乙醯乙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA或2-羥基異丁醯基-CoA)之彙集改良Ptb-Buk及CoA 轉移酶系統之效率。

與在醯基-CoA轉化為其各別酸期間能量以ATP形式守恆的Ptb-Buk系統相比，若CoA簡單水解，則能量不守恆。

在水解酶分析中，發現在自產乙醇梭菌中，對於乙醯乙醯基-CoA及3-羥基丁醯基-CoA存在天然水解活性。

用乙醯乙醯基-CoA(一種3-羥基丁醯基-CoA(3-HB-CoA)與2-羥基異丁醯基-CoA(2-HB-CoA)之外消旋混合物)進行醯基-CoA水解分析如先前實例中所述進行。分析結果展示乙醯乙醯基-CoA及3-HB-CoA裂解，而非2-HIB-CoA，且證實天然活性存在於自產乙醇梭菌中(圖11)。

分析自產乙醇梭菌之基因組可鑑別三種推定CoA-硫酯酶(硫酯-水解酶)，其可引起乙醯乙醯基-CoA或3-羥基丁醯基-CoA硫酯鍵之裂解。其亦存在於其他產乙酸菌(諸如永達爾梭菌)中。

此等三種推定CoA硫酯酶失活產生較高產物效價，從而改良Ptb-Buk系統之效率。三種推定硫酯酶使用ClosTron技術失活。簡言之，II型Ltr之靶向域使用ClosTron網站再程式化且再靶向ClosTron質體定購自DNA 2.0。使用結合將靶向硫酯酶1之ClosTron剔除載體 pMTL007C-E2-Cau-2640-571s(CAETHG_0718)、靶向硫酯酶2之pMTL007C-E2-PBor3782-166s(CAETHG_1524)及靶向硫酯酶3之pMTL007C-E2-PBor4039-199s(CAETHG_1780)引入自產乙醇梭菌中。

藉由選擇補充有5μg/ml克拉黴素之PETC進行用於整合之選擇且藉由整合II型內含子成功失活藉由跨越插入位點PCR確認。

使用上述分析量測對野生型自產乙醇梭菌與推定基因中之一者失活之各自產乙醇梭菌的乙醯乙醯基-CoA的CoA水解酶活性。經展示，具有失活之推定硫酯酶的所有三種菌株對乙醯乙醯基-CoA及3-羥基丁醯基-CoA展示較低水解活性(圖21A-B)。

為展示降低之CoA水解酶活性從而增加之乙醯乙醯基-CoA彙集有益於乙醯乙醯基-CoA衍生產物之產生，將編碼thl+ctfAB+adc之異丙醇質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc(WO 2012/115527)引入野生型自產乙醇梭菌菌株及具有失活之硫酯酶1的菌株中。在37℃下，在110rpm震盪下，在1L Schott瓶中，在40ml PETC培養基中，用Co氣體技術性一式三份地進行生長實驗。合成氣體(50%CO、18%CO₂、2%H₂及30%N₂)用作唯一能量及碳源。進行一次頂空交換且在37℃下在合成氣體(50%CO、18%CO₂、2%H₂及30%N₂)下充氣至21psi(1.5巴)。一天兩次採集用於OD及分析之樣品。

相較於野生型，具有失活之硫酯酶3 CAETHG_1780的菌株產生顯著較高水準之異丙醇(圖22及 圖23A-D)。

類似地，剔除自產乙醇梭菌中之硫酯酶將提高3-羥基丁醯基-CoA之彙集，從而使得Ptb-Buk可更有效地利用3-羥基丁醯基-CoA且引起丙酮、異丙醇、異丁烯、(R)-3-羥基丁酸酯、1,3-丁二醇及/或2-羥基異丁酸之較高產生。當將實例5之pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA引入具有中斷之硫酯酶2CAETHG_1524之自產乙醇梭菌菌株中時，消除3-羥基丁酸酯合成(相較於當在自產乙醇梭菌野生型菌株中表現此質體時發現的多達2.55g/L3-羥基丁酸酯)。此菌株中不存在對3-羥基丁醯基-CoA之競爭活性。

此等結果展示藉由降低硫酯酶活性，可獲得Ptb-Buk系統及產物合成之較高CoA彙集。

另外，3-HB及1,3-BDO之產生可藉由過度表現Ptb-Buk增加。在對照實驗中，藉由所述實驗如實例2中所述之自產乙醇梭菌用來自實例4之質體pMTL83159-phaB-thlA加上pMTL82256轉型(Heap，《微生物學方法雜誌》，78：79-85,2009)，其中pMTL82256為用作背景對照之空質體，此類菌株之醱酵使得在第10天以最高效價產生1.68g/L之3-HB(圖42A)。當pMTL82256-buk-ptb替代空質體pMTL82256與pMTL83159-phaB-thlA共表現於自產乙醇梭菌中時，醱酵在較早時間-第4天產生4.76g/L的較高效價3-HB(圖42B)。

缺失天然硫酯酶提高Ptb-Buk系統之效率，其偏好(R)-3-HB-CoA。基因組中硫酯酶基因之基因座缺失且經由稱為同源重組之常見分子生物學技術用buk-ptb dna片段置 換。藉由buk-ptb取代硫酯酶基因藉由PCR，繼而瓊脂糖凝膠電泳及dna測序確認。

在瓶實驗中，當在上述硫酯酶缺失突變體中表現pMTL83156-phaB-thlA而不表現ptb-buk時，所產生之3-HB之平均最大效價為0.50±0.05g/L，類似於使用未經修飾自產乙醇梭菌菌株獲得的效價。當pMTL82256-buk-ptb與pMTL83156-phaB-thlA質體共表現於硫酯酶基因剔除菌株中時，3-HB之產量增至1.29±0.10g/L(圖43)。

實例8

此實例展現可用Ptb-buk系統去除產乙酸菌自產乙醇梭菌乙酸酯產生系統。

經描述，所有產乙酸微生物均產生乙酸酯(Drake，《產乙酸原核生物》，於《原核生物》中，第3版，第354-420頁，New York,NY,Springer,2006)，因為產生乙酸酯向微生物提供經由Pta(磷酸轉乙醯酶)及Ack(磷酸轉乙醯酶-乙酸激酶)自受質層面磷酸化直接產生ATP的選擇。因此，認為天然乙酸形成酶(諸如Pta-Ack)在產乙酸菌中是必需的(Nagarajan，《微生物細胞工廠》，12：118,2013)。由於Ptb-Buk提供一種產生能量之替代方式，故可用Ptb-Buk置換天然Pta-Ack系統。

自產乙醇梭菌中之pta及ack基因在一個操縱子中。為用ptb及buk基因置換pta及ack基因，將在四環素誘導性啟動子下含mazF逆向選擇標記物之質體pMTL8225-pta-ack：：ptb-buk(圖24)、約1kb上游同源臂、loxP位點側接之ptb、buk、ermB卡匣及約1kb下游同源臂組裝(SEQ ID NO：160)。

約1kb上游及下游同源臂自自產乙醇梭菌用引子SN22f/SN23r及SN28f/SN29r PCR擴增。ptb及buk基因自pIPA_16質體使用引子SN24f/SN25r PCR擴增。將具有loxP位點之ermB卡匣使用引子SN26f/SN27r PCR擴增。將質體主鏈用引子SN30f/SN31r PCR擴增。將KAPA聚合酶用於所有PCR擴增。使用GeneArt無縫選殖套組(來自Life Technologies)組裝PCR產物，且使用插入片段中無突變之質體藉由如先前所述結合轉型自產乙醇梭菌。

結合及於甲氧苄啶及克拉黴素上選擇後，將7個群落於PETC-MES瓊脂盤上劃線兩次，其中使用克拉黴素及無水四環素誘導mazF基因表現。來自克拉黴素及無水四環素之群落之pta及ack基因應已經ptb及buk基因及ermB卡匣置換。此藉由PCR使用側接同源臂及KAPA聚合酶之引子Og29f/Og30r檢驗(圖25)。約4.6kb條帶擴增自野生型菌株，而約5.7kb條帶擴增自群落1及4-7，指示pta及ack基因經ptb及buk基因及ermB卡匣置換。以上事件藉由將來自純系4-7之PCR產物測序進一步確認。

在所得修飾下，ptb及buk基因之表現藉由pta基因上游之啟動子驅使。

如上所述用實例2之異丙醇產生質體pMTL85147-thlA-adc轉型所得菌株自產乙醇梭菌pta-ack：：ptb-buk，其中pta-ack操縱子經ptb-buk操縱子置換。在自養條件下進行生長研究且分析代謝最終產物。未觀測到乙酸酯產生，而除乙醇及2,3-丁二醇以外，仍產生異丙醇(多達0.355g/L)及3-HB(多達0.29g/L)(圖39A及39B)。此展現使用Ptb-Buk系統可在不產生乙酸酯的情況下自氣體受質CO及/或CO₂及H₂產生異丙醇及3-HB。

若丙酮而非異丙醇為標靶產物，則可使用以上所述且WO 2015/085015中詳細描述之方法將一級：二級醇去氫酶基因(SEQ ID NO：17)自此菌株自產乙醇梭菌pta-ack：：ptb-buk進一步剔除。向此菌株中引入質體pMTL85147-thlA-adc使得以上文對於異丙醇所述類似之水準產生丙酮，且不共產生乙酸酯。乙醇、2,3-丁二醇及3-HB可為進一步產物。

藉由進一步剔除，亦可去除此等產物，例如剔除乙醯乳酸去羧酶基因BudA得到不能產生2,3-丁二醇之菌株(U.S.9,297,026)。3-HB產生可藉由缺失3-羥基丁酸去氫酶基因Bdh(SEQ ID NO：62)減少或去除。

實例9

此實例展現藉由過度表現醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶基因aor1改良3-羥基丁酸酯向1,3-BDO之轉化。

使用pMTL82251質體主鏈過度表現自產乙醇梭菌aor1基因。選擇pMTL82251質體，因為其具有不同複製來源及抗生素標記物，而且可與含有hbd1及thlA之實例5中所用之質體共表現。質體主鏈之製備及組裝反應遵循上列程序進行，首先藉由將自產乙醇梭菌鐵氧化還原蛋白啟動子引入質體pMTL82251中產生質體pMTL82256，隨後添加aor1基因，形成質體pMTL82256-aor1。使用以下引子。

將所得質體pMTL82256-aor1轉型於大腸桿菌CA434菌株中後，對先前自產乙醇梭菌1,3-BDO產生宿主執行結合。因此，在不同複製來源及選擇標記物下，所得自產乙醇梭菌菌株帶有兩個質體，一個用於過度表現hbd1及thlA，且另一個用於過度表現aor1。遵循以上程序將1,3-BDO之產生表徵且定量。

結果明確展示1,3-BDO產生可藉由過度表現aor1改良。同樣，其他醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶基因可表現於自產乙醇梭菌中以促進3-羥基丁酸酯向1,3-丁二醇轉化。

為改良1,3-BDO產生，過度表現AOR以改良3-HB向3-HB-醛之轉化。為進行此操作，將pMTL82256-hbd-thlA 及pMTL83159-aor1共表現於自產乙醇梭菌中。相較於僅帶有pMTL82256-hbd-thlA之菌株，aor1共表現菌株產生較多乙醇及1,3-BDO(圖44)。

實例10

此實例展現允許2-羥基異丁酸產生而不產生非所需副產物的Ptb-Buk之立體特異性。

2-羥基異丁酸可在大腸桿菌及自產乙醇梭菌中藉由引入將乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA之硫解酶及3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、將3-羥基丁醯基-CoA轉化為2-羥基異丁醯基-CoA之2-羥基異丁醯基-CoA變位酶及可水解CoA酶以形成2-羥基異丁酸產生。3-羥基丁醯基-CoA去氫酶可為(R)或(S)-特異性的，且所述酶根據圖1之步驟1、13、19及20將2-羥基異丁醯基-CoA轉化為2-羥基丁酸酯。此最後一個步驟可經由硫酯酶或Ptb-Buk系統進行。

將三種潛在候選基因大腸桿菌硫酯酶II型TesB、自產乙醇梭菌磷酸乙醯基轉移酶/乙酸激酶對及拜氏梭菌丁醯基轉移酶/丁酸激酶對經由上述方法及以下引子選殖於大腸桿菌pDUET T7表現載體中。

將所得質體pDUET-pta-ack(SEQ ID NO：185)、pDUET-ptb-buk(SEQ ID NO：186)、pDUET-tesB(SEQ ID NO：187)引入大腸桿菌BL21(DE3)中進行表現，隨後測定其對乙醯乙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA及2-羥基異丁醯基-CoA活性。結果展示於圖27中。大腸桿菌BL21對所有三種受質具有小但可量測活性量。Pta-Ack不產生高於背景值之活性，而硫酯酶TesB與Ptb-Buk對所有三種受質(包含2-羥基異丁醯基-CoA)展示高活性。

硫酯酶TesB與Ptb-Buk對線性乙醯乙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA之活性高於分支鏈2-羥基異丁醯基-CoA。此在路徑中產生問題，因為其造成路徑在3-羥基丁醯基-CoA處提早封端，尤其當活性高於對2-羥基異丁醯基-CoA變位酶活性時。

然而，與硫酯酶相比，Ptb-Buk能夠在立體異構體之間區分且僅(或偏好)作用於(R)-3-羥基丁醯基-CoA而非(S)-3-羥基丁醯基-CoA。此藉由在大腸桿菌中表現Ptb-Buk系統以及pDuet系統中之ThlA及(S)-特異性Hbd(圖28A)或(R)-特異性phaB(圖28B)展現。如實例1及3中所述建構構築體。生長研究確認僅在Ptb-Buk與(S)-特異性Hbd但非(R)-特異性phaB組合表現時形成顯著量之3-羥基丁酸酯。

因此，經由(S)-特異性3-羥基丁醯基-CoA去氫酶及Ptb-Buk之途徑提供顯著優勢，因為Ptb-Buk系統(不同於硫酯酶)對(S)-3-羥基丁醯基-CoA無活性，但(S)-3-羥基丁醯 基-CoA亦為2-羥基異丁醯基-CoA變位酶之較佳異構體(Yaueva，《生物化學雜誌》，287：15502-15511,2012)。所產生之2-羥基異丁醯基-CoA可隨後經由Ptb-Buk使用以產生2-羥基異丁酸且(不同於硫酯酶)2-羥基異丁醯基-CoA水解提供額外能量(圖8)。

模組構築體經設計以比較路徑之效能。將在基因meaB、hcmA及hcmB前含有Wood-Ljnngdahl啟動子之基因卡匣進行密碼子最佳化且合成(SEQ ID NO：188)。HcmA及hcmB編碼2-羥基異丁醯基-CoA變位酶且meaB編碼來自三碳變形菌之伴隨蛋白，在所述構築體中，hcmA及meaB基因以所述一種蛋白質(SEQ ID NO：189)形式融合在一起(Yaneva，《生物化學雜誌》，287：15502-15511,2012)。使用限制酶KpnI及NcoI將基因卡匣選殖於含有硫解酶(來自丙酮丁醇梭菌之thlA；SEQ ID NO：136)及(S)-特異性3-羥基丁酸去氫酶(來自丙酮丁醇梭菌之hbd；SEQ ID NO：190)之質體(pMTL83155-thlA-hbd)或含有(R)-特異性3-羥基丁酸(來自富養羅爾斯頓菌(R.eutropha)之phaB)之質體(pMTL83155-thlA-phaB)中，分別形成質體pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB(SEQ ID NO：191)及pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB(SEQ ID NO：192)。將經密碼子最佳化之2-羥基異丁醯基-CoA變位酶卡匣次選殖於大腸桿菌Top-10中僅在一些初始選殖併發情況後成功；發現2-羥基異丁醯基-CoA變位酶卡匣僅可在較低溫度(28℃)下選殖於質體中。

藉由首先擴增自產乙醇梭菌之磷酸乙醯基轉移 酶(SEQ ID NO：193)之啟動子區，且使用NotI及NdeI限制位點選殖於載體pMTL83151(FJ797647.1；Heap，《微生物學方法雜誌》，78：79-85,2009)中，隨後在雙重接合反應中經由NdeI及KpnI引入基因thlA及hbd或對應地引入phaB產生載體pMTL83155-thlA-hbd及pMTL83155-thlA-phaB。

另外，建構用於表現ptb-buk或tesB之相容質體模組。對此，自基因組DNA擴增各別基因且引入實例9中所述之質體pMTL82256中，隨後使用NdeI及NcoI及無縫選殖套組(Life technologies)引入ptb-buk或phaB，形成質體pMTL82256-ptb-buk(SEQ ID NO：194)及pMTL82256-tesB(SEQ ID NO：195)。

藉由如先前實例中所述以如下組合轉型將質體pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB、pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB、pMTL82256-ptb-buk及pMTL82256-tesB引入大腸桿菌Top-10(所有步驟在28℃下)及自產乙醇梭菌中：pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-ptb-buk、pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-tesB、pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-ptb-buk及pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-tesB。

在30℃下用大腸桿菌在LB培養基中進行生長實驗4天，且在30及37℃下在30psi含CO-鋼鐵廠氣體(自紐西蘭鋼鐵站(Glenbrook,NZ)收集)存在下用自產乙醇梭菌在PETC培養基中進行生長實驗6天。如上所述量測代謝物。除藉由GC-MS量測以外，亦使用液相層析串聯質譜 (LC-MS/MS)及¹H核磁共振(NMR)光譜法確認2-羥基異丁酸產生。

於耦接至ABSciex 4000 QTRAP質譜儀(ABSciex,Concord,Canada)之Dionex UltiMate 3000液相層析系統(Dionex,California,USA)上獲得液相層析串聯質譜(LC-MS/MS)資料。液相層析系統藉由Chromeleon軟體(Dionex)控制，且層析分離藉由於配備有預柱Security Guard Gemini-NX C18 4mm×2mm I.D.柱之Gemini-NX C18 150mm×2mm I.D.，3μm 110Å粒子管柱(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)上注射10μL達成。控制管柱烘箱溫度，在整個採集中維持在55℃下且移動相為如下：7.5mM用冰醋酸調節至pH 4.95(±0.05)之三丁胺水溶液(溶離劑A)及乙腈(溶離劑B)。在整個梯度分佈中維持移動相流速在300μL/min下且不經分離直接引入質譜儀中。質譜儀藉由Analyst 1.5.2軟體(ABSciex)控制且配備有以負電離模式操作之TurboV電噴射源。使用以下經先前最佳化(因此通用)參數採集預定多反應監測(MRM)資料：離子噴霧電壓-4500V，噴霧劑(GS1)、助劑(GS2)、簾幕(CUR)氣體及碰撞(CAD)氣體分別為60、60、20及平均數(任意單位)，經由N300DR氮氣發生器(Peak Scientific,Massachusetts,USA)產生。助劑氣體溫度維持在350℃下。入口電位(EP)為-10伏。此方法亦能夠偵測及分離2-羥基丁酸。

¹H核磁共振(NMR)光譜法場強為400MHz。樣品藉由用400μL用D₂O製備之20mM磷酸酯緩衝液稀釋400μL樣品且含有三甲基矽烷基丙酸(TMSP)作為內標製備 (pH值為7)。隨後將樣品轉移至玻璃NMR管(5mm×8吋)，且藉由¹H NMR，在27℃之溫度下，用30°激發脈衝、15秒鬆弛延遲及64次掃描使用針對水抑制之預飽和分析。採集後，使用Agilent VnmrJ軟體將光譜轉換、平化及積分。使用已知濃度之TMSP使用在1.36ppm(單峰)下共振進行2-羥基異丁酸定量。

在異養生長之大腸桿菌以及自養生長之自產乙醇梭菌中，可在構築體pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-tesB(在自產乙醇梭菌中，在LC-MS/MS方法中1.5mg/L，且在GC-MS中8mg/L；在大腸桿菌中，在LC-MS/MS方法中0.5mg/L，且在GC-MS中2mg/L)及pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-ptb-buk(在自產乙醇梭菌中，在LC-MS/MS方法中15mg/L，且在GC-MS中75mg/L；在大腸桿菌中，在LC-MS/MS方法中1.1mg/L，且在GC-MS中8.5mg/L)中偵測到2-羥基異丁酸，但在包含對照之所有其他構築體中未偵測到。迄今為止，最高產量發生在帶有質體pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB+pMTL82256-ptb-buk之菌株(比所有其他途徑高10倍)中，所述菌株具有最佳路徑，其含有硫解酶、(S)-特異性(S)-特異性3-羥基丁醯基-CoA去氫酶、2-羥基異丁醯基-CoA變位酶及Ptb-Buk系統(圖29A-D)。意外地，發現此菌株中亦產生2-羥基丁酸酯(2-HB)(在自產乙醇梭菌中，藉由LC-MS/MS多達64mg/L，且藉由GC-MS多達50mg/L；在大腸桿菌中，藉由LC-MS/MS多達12mg/L，且藉由GC-MS多達9.5mg/L)，指示非特異性變位酶活性(圖30)。tesB菌 株中亦發現此現象，但同樣具有顯著較低之水準(在自產乙醇梭菌中，在LC-MS-MS中18mg/L，且在GC-MS中9mg/L)。亦藉由NMR確認2-羥基異丁酸之產生。

另外，亦進行qRT-PCR以證實基因thlA、hbd、meaBhcmA及hcmB之表現(圖31)。

RT-PCR圖展示在P _pta-ack 啟動子下，thlA基因產物表現水準略高於hbd(如所期望，在操縱子中具有第二基因)，且hmcB展示表現量微低於meaBhcmA。自產乙醇梭菌中在30℃下之表現亦低於37℃下及大腸桿菌30℃下之表現。對於特定循環數，參見下文。

(S)-3-羥基丁酸與(R)-3-羥基丁酸之比率藉由於Agilent 1260 Infinity LC上高效液相層析(HPLC)量測，其中在210nm下進行UV偵測。樣品藉由在14,000rpm下離心3分鐘，繼而蒸發200μL上清液至乾製備。隨後將集結粒再懸浮於100%異丙醇中且在加熱下音波處理1小時。重複離心且將上清液轉移至HPLC小瓶以供分析。藉由以1.5mL/min且在40℃下在等度條件下使用95-5含有0.1%三氟乙酸之己烷-異丙醇移動相注射5μL於TCI對掌性MB-S管柱(250 mm×4.6mm×3μm)上達成分離。

已進行產生3-HB之立體特異性分析。意外地發現在自產乙醇梭菌中產生異構體之混合物。酶Hbd及PhaB經描述為立體特異性的，PhaB為R-特異性的且Hbd為S-特異性的，且在大腸桿菌中表現此等酶時，觀測到立體純產物(Tseng，《應用與環境微生物學》1,75：3137-3145,2009)。

下表指示平衡時3-HB之(R)及(S)-形式的分佈經由自產乙醇梭菌中之三種不同途徑產生。此等資料表明自產乙醇梭菌中存在異構酶。

剔除天然異構酶可防止3-HB之(R)形式與(S)形式相互轉化。或者，表現或過度表現異構酶可產生新穎ptb-buk途徑。舉例而言，可使用Hbd產生(S)-3-HB，異構酶可將(S)-3-HB轉化為(R)-3-HB，且ptb-buk可作用於(R)-3-HB以產生相關產物。

實例11

此實例展現經由Ptb-Buk轉化3-羥基異戊醯基-CoA及3-羥基異戊酸酯產生異丁烯。

已描述產生異丁烯之不同途徑，例如經由羥基異戊酸合成酶及去羧酶將丙酮轉化為異丁烯(van Leeuwen，《應用微生物學生物技術》，93：1377-1387,2012)。然而，羥基異戊酸去羧酶步驟為需要ATP之步驟且此酶之動力學可能並不理想。已鑑別兩個使用Ptb-Buk系統獲得異丁烯之替代途徑，其經由3-羥基異戊醯基-CoA進行，活體外已展示3-羥基異戊 醯基-CoA為Ptb-Buk系統之可用受質(Liu，《應用微生物學生物技術》，53：545-552,2000)。

替代路徑1由將丙酮轉化為3-羥基異戊醯基-CoA之合成酶組成(圖9)。

替代性路徑2經由細菌(諸如大腸桿菌或自產乙醇梭菌)常見之異白胺酸生物合成的已知中間物3-甲基-2-側氧基戊酸酯進行(圖10)。

實例12

此實例描述表徵Ptb-Buk變異體之方法。

鑒於Ptb-Buk之受質混雜性，很可能不同胺基酸序列之Ptb-Buk系統對既定受質具有不同偏好。為鑑別有利於所要受質(例如乙醯乙醯基-CoA、3-羥基丁醯基-CoA、2-羥基異丁醯基-CoA、乙醯基-CoA及/或丁醯基-CoA)之Ptb-Buk系統，需要高通量篩選。此類篩選可藉由使螢火蟲螢光素酶(Luc)與Ptb-Buk系統偶合來完成(圖33)。Luc與D-螢光素反應，從而產生氧化螢光素、二氧化碳及光。除鎂及分子氧以外，Luc需要ATP以使反應進行。ATP為由Ptb-Buk在提供適當醯基-CoA或烯醯基-CoA受質時產生的產物。因此，Ptb-Buk對不同受質之反應速率及偏好可藉由定量由含有Ptb-Buk、Luc、d-螢光素、鎂、分子氧、磷酸酯、ADP及醯基-CoA或烯醯基-CoA之反應產生的光之量比較。

實例13

此實例使用基因組規模模型化以展示非天然產物高選擇性可使用Ptb-Buk達成。此外，經展示使用Ptb-Buk可准許細胞生長與產物產生偶合，從而使得可建構穩定及高 產量之醱酵菌株。

使用類似於Marcellin，《綠合化學(Green Chem)》，18：3020-3028,2006所述之自產乙醇梭菌之基因組規模代謝模型。產生併入額外代謝反應之此模型之變異體，其各呈現不同遺傳修飾微生物以形成非天然產物。對於各非天然產物路徑產生三種模型型式，其併入硫酯酶、乙酸酯CoA-轉移酶或Ptb-Buk反應。

最大選擇性使用通量平衡分析(FBA)使用來自MATLAB R2014a(Mathworks,Inc.)之COBRA Toolbox v2.0的指令碼計算，其中Gurobi6.0.4版作為求解程序(Gurobi Optimization,Inc.)。交換反應限定為表示用CO作為碳源及能量之化學上定義最小生長培養基。使用演化算法搜尋併入多達十個基因剔除的菌株設計之存在，所述基因剔除使標靶非天然化學產生與生長偶合。

FBA預測使用Ptb-Buk或CoA轉移酶之路徑由於經由受質層面磷酸化獲得ATP而提供最高產物選擇性。結果在表2中說明。然而，應注意基因組規模模型及FBA分析之一個限制為不能捕獲酶動力學。CoA轉移酶反應需要特定基礎水準之乙酸酯以產生官能性，因此由於需要存在基礎水準之乙酸酯，故使用CoA轉移酶之實際上最大選擇性少於100%。

需要建構如下菌株，其中必須產生標靶非天然化學物質以用於細胞生長。FBA預測在大多數情況下，在使用硫酯酶或CoA轉移酶時難以將標靶化學物質產生與生長偶合；而天然產物乙酸酯及乙醇將有助於此。然而，在使用Ptb-Buk時，存在多種生長偶合化學物質產生菌株設計，其通常併入對磷酸轉乙醯酶-乙酸激酶反應之破壞。表3概括各菌株之生長偶合能力。

儘管Ptb-Buk與CoA轉移酶均可支持高選擇性，但通量平衡分析預測在大多數情況下，僅Ptb-Buk可建構偶合非天然化學物質產生與生長之穩定、高產量醱酵菌株。

實例14

此實例展現經由Ptb-Buk自氣體原料產生己二酸。

大腸桿菌中自糖產生己二酸已藉由利用Ptb-Buk 之路徑描述(Yu，《生物技術與生物工程》，111：2580-2586,2014)。但產量很低，在μg/L範圍內。在不欲受限於任何特定理論之情況下，本發明者認為此很可能由形成還原力及剩餘ATP中缺乏驅動力所致。使用如CO及H₂之經還原氣體受質及產乙酸細菌(諸如自產乙醇梭菌)，可克服此當前限制。與於較多經氧化糖上異養生長之大腸桿菌相比，CO及H₂氧化提供足夠驅動力以藉由3-羥基丁醯基-CoA去氫酶或乙醯乙醯基-CoA水合酶將3-側氧基-己二醯基-CoA還原為3-羥基己二醯基-CoA及藉由烯醯基-CoA水解酶或烯醯基-CoA還原酶將2,3-去氫己二醯基-CoA還原為己二醯基-CoA(圖34，步驟23及25)。與異養生長於糖上由糖酵解產生剩餘ATP之大腸桿菌相比，產乙酸細菌依靠高能生命極限生存，因此如Ptb-Buk系統之ATP產生反應具有強驅動力，從而保證己二醯基-CoA有效轉化為己二酸(圖34步驟26)。

為在自產乙醇梭菌中自氣體產生己二酸，將來自大腸桿菌之編碼丁二醯基-CoA合成酶的基因(NP_415256、NP_415257)、來自大腸桿菌之酮基異戊酸氧化還原酶PaaJ(WP_001206190.1)、來自拜氏梭菌之3-羥基丁醯基-CoA去氫酶(WP_011967675.1)、來自丙酮丁醇梭菌之反-2-烯醯基-CoA還原酶Crt(NP_349318.1)、來自丙酮丁醇梭菌之反-2-烯醯基-CoA還原酶Bcd(NP_349317.1)及電子黃素蛋白EtfAB(NP_349315、NP_349316)選殖於表現質體上，隨後如上所述轉型於來自先前實例之自產乙醇梭菌菌株pta-ack：：ptb-buk或CAETHG_1524：：ptb-buk中。根據圖34中描繪之步驟產生己二酸。

實例15

此實例展現經由Ptb-Buk及AOR產生包含2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁醇、1,3-己二醇(HDO)之各種產物。

如實例6中展現，Ptb-Buk為高度混雜的且作用於作為受質之各種CoA或可經工程改造以使用一系列非天然CoA作為受質。同樣，AOR酶已展示作用於各種受質。此兩種酶一起可將各種CoA經由其酸轉化為醛，隨後可經由醇去氫酶進一步轉化為醇、酮或烯醇，對於醇去氫酶，自然界中存在各種變體。儘管在標準條件下，經由AOR用鐵氧化還原蛋白將酸還原為醛為吸能的(Thauer，《細菌學評論(Bacteriol Rev)》，41：100-180,1977)且因此不可行，意外地，在一氧化碳營養型產乙酸菌(諸如在低pH下操作且用CO或H2作為受質之自產乙醇梭菌)中為此情形(Mock，《細菌學雜誌》，197：2965-2980,2015)。對於產乙酸菌之一個常見限制為其為ATP限制性的，依靠熱力學生命邊緣生存(Schuchmann，《自然評論：微生物》，12：809-821,2014)，其可藉由偶合此酸還原與經由Ptb-Buk系統自CoA以ATP相關形式形成酸克服。

Ptb-Buk系統及AOR系統已展現於以上用於獲得數種不同產物之實例中，但可延伸至其他產物，例如產生2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁醇、1,3-己二醇(HDO)。2-丁烯-1-醇可經由Ptb-Buk、AOR及醇去氫酶自巴豆醯基-CoA產生(圖35)。1,3-己二醇可經由Ptb-Buk、AOR及醇去氫酶自3-羥基-己醯基-CoA產生(圖35)。藉由組合Ptb-Buk、Adc及醇去氫酶(諸如天然一級：二級醇去氫酶)，可由乙醯丁醯基-CoA形成3-甲基-2-丁醇。

所有此等前驅物，即巴豆醯基-CoA、3-羥基-己醯基-CoA或乙醯丁醯基-CoA可藉由經由例如克氏梭菌(Barker，《美國科學院院報》，31：373-381,1945；Seedorf，《美國科學院院報》，105：2128-2133,2008)及其他梭菌之已知醱酵路徑還原及延長先前實例中所述之乙醯基-CoA、乙醯乙醯基-CoA及3-HB-CoA形成。所涉及之酶包含巴豆醯基-CoA水合酶(巴豆酸酶)或巴豆醯基-CoA還原酶、丁醯基-CoA去氫酶或反-2-烯醯基-CoA還原酶、硫解酶或醯基-CoA乙醯基轉移酶及3-羥基丁醯基-CoA去氫酶或乙醯乙醯基-CoA水合酶(圖35)。將來自克氏梭菌或其他梭菌之各別基因選殖於表現質體上(U.S.2011/0236941)，隨後如上所述轉型於來自先前實例之自產乙醇梭菌菌株pta-ack：：ptb-buk或CAETHG_1524：：ptb-buk中以產生2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁醇、1,3-己二醇(HDO)。2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁醇及1,3-己二醇(HDO)可為其他下游產物之前驅物。

儘管其僅為少數實例，但應顯而易見此路徑可使用相同酶或其經工程改造之對較長鏈長具有特異性之變異體進一步延長而產生一系列C4、C6、C8、C10、C12、C14醇、酮、烯醇或二醇(圖39)。亦可藉由在硫解酶步驟中使用別處所述之不同於乙醯基-CoA之引子或增量劑單元獲得不同類型之分子(Cheong，《自然生物技術(Nature Biotechnol)》，34：556-561,2016)。

本文中所引用之所有參考文獻(包括公開案、專利申請案及專利)特此以引用之方式併入，其引用程度如同個別及特定地指示各參考文獻以引用之方式併入且於本文中 全文闡述一般。在本說明書中對任何先前技術之提及並非且不應視為承認先前技術形成任何國家所致力領域之公共常識的一部分。

除非本文中另外指示或明顯與上下文相矛盾，否則在描述本發明之情況下(尤其在以下申請專利範圍之情況下)，使用術語「一」及「所述」及類似指示物應理解為涵蓋單數與複數。除非另外說明，否則術語「包括」、「具有」、「包含」及「含有」應理解為開放性術語(亦即意謂「包含(但不限於)」)。除非本文中另外指示，否則本文中數值範圍之敍述僅意欲充當個別提及屬於該範圍之各獨立值之速記方法，且各獨立值併入本說明書中，如同在本文中個別敍述一般。除非本文另外指示或與上下文明顯矛盾，否則本文中描述之所有方法可以任何適合順序進行。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)之使用僅意欲更好地說明本發明而非限制本發明之範疇。本說明書中之語言不應解釋為指示實踐本發明所必需之任何未主張要素。

本文中描述本發明之較佳實施例。在閱讀以上描述之後，彼等較佳實施例之變化形式對於一般技術者可變得顯而易見。本發明者期望熟習此項技術者適當時採用此等變化，且本發明者意欲以不同於本文中特定所述之方式實踐本發明。相應地，若適用法律允許，則本發明包括在此隨附之申請專利範圍中所陳述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文中另外指示或另外上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素以其所有可能變化形式之任何組合。

<110> 紐西蘭商藍瑟科技紐西蘭有限公司

<120> 包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌

<130> LT117TW1

<160> 195

<170> PatentIn version 3.5

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<213> 丙酮丁醇梭菌

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<213> 鉤蟲貪銅菌

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<213> 拜氏梭菌

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<212> PRT

<213> 拜氏梭菌

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<211> 282

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<213> 皮氏羅爾斯頓菌

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<213> 自產乙醇梭菌

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<213> 拜氏梭菌

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<213> 自產乙醇梭菌

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<213> 永達爾梭菌

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<212> PRT

<213> 自產乙醇梭菌

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<212> PRT

<213> 丙酮丁醇梭菌

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<213> 丙酮丁醇梭菌

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<213> 拜氏梭菌

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<213> 自產乙醇梭菌

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<213> Kyrpidia tusciae

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<213> 三碳變形菌

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<212> PRT

<213> Kyrpidia tusciae

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<212> PRT

<213> 丙酮丁醇梭菌

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<213> 拜氏梭菌

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<213> 拜氏梭菌

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<213> 丙酮丁醇梭菌

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<213> 拜氏梭菌

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<213> 拜氏梭菌

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<213> 拜氏梭菌

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<213> 拜氏梭菌

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<221> misc_feature

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<221> misc_feature

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<223> 合成聚核苷酸

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<221> misc_feature

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<223> 合成聚核苷酸

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<221> misc_feature

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<223> 合成聚核苷酸

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<221> misc_feature

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<220>

<223> 合成聚核苷酸

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<221> misc_feature

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<220>

<223> 合成聚核苷酸

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<221> misc_feature

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<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

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<213> 丙酮丁醇梭菌

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<221> misc_feature

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<213> 克氏梭菌

<220>

<221> misc_feature

<223> hbd1

<400> 137

<210> 138

<211> 176

<212> DNA

<213> 自產乙醇梭菌

<220>

<221> misc_feature

<223> 鐵氧化還原蛋白啟動子

<400> 138

<210> 139

<211> 474

<212> DNA

<213> 自產乙醇梭菌

<220>

<221> misc_feature

<223> 丙酮酸-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子

<400> 139

<210> 140

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<223> 核糖體結合位點rbs2

<221> misc_feature

<400> 140

<210> 141

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Pfdx-F1，正向

<400> 141

<210> 142

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Pfdx-R1，反向

<400> 142

<210> 143

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Ppfor-F1，正向

<400> 143

<210> 144

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Ppfor-R1，反向

<400> 144

<210> 145

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> hbd1-F1，正向

<400> 145

<210> 146

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> hbd1-R1，反向

<400> 146

<210> 147

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> thlA-F1，正向

<400> 147

<210> 148

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> thlA-R1，反向

<400> 148

<210> 149

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Ppfor-F2，正向

<400> 149

<210> 150

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Ppfor-R2，反向

<400> 150

<210> 151

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Ptb-Buk-F2，正向

<400> 151

<210> 152

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Ptb-Buk-F2，反向

<400> 152

<210> 153

<211> 7884

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pMTL82256-ptb-buk，質體

<400> 153

<210> 154

<211> 436

<212> PRT

<213> 自產乙醇梭菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 硫酯酶1

<400> 154

<210> 155

<211> 60

<212> PRT

<213> 永達爾梭菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 硫酯酶2

<400> 155

<210> 156

<211> 128

<212> PRT

<213> 自產乙醇梭菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 硫酯酶3

<400> 156

<210> 157

<211> 436

<212> PRT

<213> 永達爾梭菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 硫酯酶1

<400> 157

<210> 158

<211> 137

<212> PRT

<213> 自產乙醇梭菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 硫酯酶2

<400> 158

<210> 159

<211> 128

<212> PRT

<213> 永達爾梭菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 硫酯酶3

<400> 159

<210> 160

<211> 11184

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pMTL8225-pta-ack：：ptb-buk，質體

<400> 160

<210> 161

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN22f

<400> 161

<210> 162

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN23r

<400> 162

<210> 163

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN24f

<400> 163

<210> 164

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN25r

<400> 164

<210> 165

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN26f

<400> 165

<210> 166

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN27r

<400> 166

<210> 167

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN28f

<400> 167

<210> 168

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN29r

<400> 168

<210> 169

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN30f

<400> 169

<210> 170

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> SN31r

<400> 170

<210> 171

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Og29f

<400> 171

<210> 172

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Og30r

<400> 172

<210> 173

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Pfdx-F1，正向

<400> 173

<210> 174

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> Pfdx-R1，反向

<400> 174

<210> 175

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> aor1-F1，正向

<400> 175

<210> 176

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> aor1-R1，反向

<400> 176

<210> 177

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pETDuet-pta-ack-ack-DuetI2-R1

<400> 177

<210> 178

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pETDuet-pta-ack-DuetI2-ack-F1

<400> 178

<210> 179

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pETDuet-pta-ack-DuetI2-pta-R1

<400> 179

<210> 180

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pETDuet-pta-ack-pta-DuetI2-F1

<400> 180

<210> 181

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pETDuet-tesB-DuetI2-tesB-F1

<400> 181

<210> 182

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pETDuet-tesB-DuetI2-tesB-R1

<400> 182

<210> 183

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pETDuet-tesB-tesB-DuetI2-F1

<400> 183

<210> 184

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pETDuet-tesB-testB-DuetI2-R1

<400> 184

<210> 185

<211> 7606

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pDUET-pta-ack，質體

<400> 185

<210> 186

<211> 7492

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pDUET-ptb-buk，質體

<400> 186

<210> 187

<211> 6233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pDUET-tesB，質體

<400> 187

<210> 188

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> 基因meaB、hcmA及hcmB前含有Wood-Ljungdahl啟動子之經密碼子最佳化基因卡匣promoter in front of the genes meaB,hcmA and hcmB

<400> 188

<210> 189

<211> 894

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> hcmA及meaB融合物

<400> 189

<210> 190

<211> 849

<212> DNA

<213> 丙酮丁醇梭菌

<220>

<221> misc_feature

<223> hbd

<400> 190

<210> 191

<211> 10647

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB

<400> 191

<210> 192

<211> 10539

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB

<400> 192

<210> 193

<211> 487

<212> DNA

<213> 自產乙醇梭菌

<220>

<221> misc_feature

<223> 磷酸乙醯基轉移酶之啟動子區

<400> 193

<210> 194

<211> 7884

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pMTL82256-ptb-buk

<400> 194

<210> 195

<211> 6624

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> pMTL82256-tesB

<400> 195

Claims (46)

1. 一種經基因工程改造之細菌，其包括外源磷酸丁醯基轉移酶(Ptb)及外源丁酸激酶(Buk)(Ptb-Buk)，其中所述Ptb-Buk作用於非天然受質以產生非天然產物。
2. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述Ptb-Buk作用於除丁醯基-CoA及/或丁醯基磷酸酯以外之受質。
3. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述Ptb-Buk產生除丁醯基磷酸酯或丁酸酯以外的產物。
4. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌不產生丁醇。
5. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌產生酸、烯烴、酮、醛、醇或二醇中之一或多者。
6. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌產生丙酮或其前驅物、異丙醇或其前驅物、異丁烯或其前驅物、3-羥基丁酸酯或其前驅物、1,3-丁二醇或其前驅物、2-羥基異丁酸酯或其前驅物、己二酸或其前驅物、1,3-己二醇或其前驅物、3-甲基-2-丁醇或其前驅物、2-丁烯-1-醇或其前驅物、異戊酸酯或其前驅物或異戊醇或其前驅物中之一或多者。
7. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述Ptb-Buk將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)，將3-羥基異戊醯基-CoA轉化為3-羥基異戊酸酯(步驟8)，將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)，將2-羥基異丁醯基-CoA轉化為2-羥基異丁酸酯(步驟20)，將巴豆醯基-CoA轉化為巴豆酸酯(步驟28)，將乙醯丁醯基 -CoA轉化為乙醯丁酸酯(步驟33)或將異戊醯基-CoA轉化為異戊酸酯(步驟44)。
8. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌產生1-丙醇、1-己醇及1-辛醇中之一或多者。
9. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌為固定C1之細菌。
10. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌源自選自由以下組成之群的親本細菌：自產乙醇梭菌( Clostridium autoethanogenum)、永達爾梭菌( Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌( Clostridium ragsdalei)、大腸桿菌( Escherichia coli)、釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、丙酮丁醇梭菌( Clostridium acetobuiylicum)、拜氏梭菌( Clostridium beijerinckii)、糖丁酸梭菌( Clostridium saccharbutyricum)、糖乙酸多丁醇梭菌( Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、丁酸梭菌( Clostridium butyricum)、帝奧梭菌( Clostridium diolis)、克氏梭菌( Clostridium kluyveri)、巴斯德梭菌( Clostridium pasterianium)、水腫梭菌( Clostridium novyi)、艱難梭菌( Clostridium difficile)、熱纖梭菌( Clostridium thermocellum)、解纖維梭菌( Clostridium cellulolyticum)、嗜纖維梭菌( Clostridium cellulovorans)、植物醱酵梭菌( Clostridium phytofermentans)、雷特氏乳球菌( Lactococcus lactis)、枯草桿菌( Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌( Bacillus licheniformis)、運動醱酵單胞菌( Zymomonas mobilis)、產酸克雷伯氏菌( Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌( Klebsiella pneumonia)、穀胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)、里氏木菌( Trichoderma reesei)、鉤蟲貪銅菌( Cupriavidus necator)、惡臭假單胞菌( Pseudomonas putida)、胚芽乳桿菌( Lactobacillus plantarum)及扭脫甲基桿菌( Methylobacterium extorquens)。
11. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌進一步包括外源或內源醛：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)。
12. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌進一步包括磷酸轉乙醯酶(Pta)及乙酸激酶(Ack)之斷裂性突變。
13. 如申請專利範圍第1項所述之細菌，其中所述細菌進一步包括硫酯酶之斷裂性突變。
14. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生丙酮或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之酶及將乙醯乙酸酯轉化為丙酮(步驟3)之酶，其中將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之所述酶為Ptb-Buk，或(b)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA(步驟13)之酶、將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)之酶、將3-羥基丁酸酯轉化為乙醯乙酸酯(步驟15)之酶及將乙醯乙酸酯轉化為丙酮(步驟3)之酶，其 中將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)之所述酶為Ptb-Buk。
15. 如申請專利範圍第14項所述之細菌，其中所述細菌產生丙酮或其前驅物。
16. 如申請專利範圍第14項所述之細菌，其中所述細菌進一步包括一級：二級醇去氫酶之斷裂性突變。
17. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生異丙醇或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之酶、將乙醯乙酸酯轉化為丙酮(步驟3)之酶及將丙酮轉化為異丙醇(步驟4)之酶，其中將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之所述酶為Ptb-Buk，或(b)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA(步驟13)之酶、將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)之酶、將3-羥基丁酸酯轉化為乙醯乙酸酯(步驟15)之酶、將乙醯乙酸酯轉化為丙酮(步驟3)之酶及將丙酮轉化為異丙醇(步驟4)之酶，其中將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)之所述酶為Ptb-Buk。
18. 如申請專利範圍第17項所述之細菌，其中所述細菌產生異丙醇或其前驅物。
19. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生異丁烯或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之 酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之酶、將乙醯乙酸酯轉化為丙酮(步驟3)之酶、將丙酮轉化為3-羥基異戊酸酯(步驟5)之酶及將3-羥基異戊酸酯轉化為異丁烯(步驟6)之酶，其中將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之所述酶為Ptb-Buk，或(b)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之酶、將乙醯乙酸酯轉化為丙酮(步驟3)之酶、將丙酮轉化為3-羥基異戊醯基-CoA(步驟7)之酶、將3-羥基異戊醯基-CoA轉化為3-羥基異戊酸酯(步驟8)之酶及將3-羥基異戊酸酯轉化為異丁烯(步驟6)之酶，其中將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之所述酶及/或將3-羥基異戊醯基-CoA轉化為3-羥基異戊酸酯(步驟8)之所述酶為Ptb-Buk。
20. 如申請專利範圍第19項所述之細菌，其中所述細菌產生異丁烯或其前驅物。
21. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生3-羥基丁酸酯或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之酶及將乙醯乙酸酯轉化為3-羥基丁酸酯(步驟15)之酶，其中將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之所述酶為Ptb-Buk，(b)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA(步驟 13)之酶及將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)之酶，其中將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)之所述酶為Ptb-Buk，或(c)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之酶及將乙醯乙酸酯轉化為3-羥基丁酸酯(步驟15)之酶，其中將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之所述酶為硫酯酶。
22. 如申請專利範圍第21項所述之細菌，其中所述細菌產生3-羥基丁酸酯或其前驅物。
23. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生1,3-丁二醇或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之酶、將乙醯乙酸酯轉化為3-羥基丁酸酯(步驟15)之酶、將3-羥基丁酸酯轉化為3-羥基丁醛(步驟16)之酶及將3-羥基丁醛轉化為1,3-丁二醇(步驟17)之酶，其中將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)之所述酶為Ptb-Buk，(b)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA(步驟13)之酶、將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)之酶、將3-羥基丁酸酯轉化為3-羥基丁醛(步驟16)之酶及將3-羥基丁醛轉化為1,3-丁二醇(步驟17)之酶，其中將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步 驟14)之所述酶為Ptb-Buk，或(c)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA(步驟13)之酶、將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁醛(步驟18)之酶及將3-羥基丁醛轉化為1,3-丁二醇(步驟17)之酶。
24. 如申請專利範圍第23項所述之細菌，其中所述細菌產生1,3-丁二醇或其前驅物。
25. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生2-羥基異丁酸酯或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基丁醯基-CoA(步驟13)之酶、將3-羥基丁醯基-CoA轉化為2-羥基異丁醯基-CoA(步驟19)之酶及將2-羥基異丁醯基-CoA轉化為2-羥基異丁酸酯(步驟20)之酶，其中將2-羥基異丁醯基-CoA轉化為2-羥基異丁酸酯(步驟20)之所述酶為Ptb-Buk。
26. 如申請專利範圍第25項所述之細菌，其中所述細菌產生2-羥基異丁酸酯或其前驅物。
27. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生己二酸或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為丁二醯基-CoA(步驟21)之酶、將丁二醯基-CoA轉化為3-側氧基-己二醯基-CoA(步驟22)之酶、將3-側氧基-己二醯基-CoA轉化為3-羥基己二醯基-CoA(步驟23)之酶、將3-羥基己二醯基-CoA轉化為2,3-去氫己二醯基-CoA(步驟24)之酶、將2,3-去氫己 二醯基-CoA轉化為己二醯基-CoA(步驟25)之酶及將己二醯基-CoA轉化為己二酸(步驟26)之酶，其中將己二醯基-CoA轉化為己二酸(步驟26)之所述酶為Ptb-Buk，或(b)將乙醯基-CoA轉化為3-側氧基-己二醯基-CoA(步驟22)之酶、將3-側氧基-己二醯基-CoA轉化為3-羥基己二醯基-CoA(步驟23)之酶、將3-羥基己二醯基-CoA轉化為2,3-去氫己二醯基-CoA(步驟24)之酶、將2,3-去氫己二醯基-CoA轉化為己二醯基-CoA(步驟25)之酶及將己二醯基-CoA轉化為己二酸(步驟26)之酶，其中將己二醯基-CoA轉化為己二酸(步驟26)之所述酶為Ptb-Buk。
28. 如申請專利範圍第27項所述之細菌，其中所述細菌產生己二酸或其前驅物。
29. 一種經基因工程改造之細菌，其用於自3-羥基丁醯基-CoA產生1,3-己二醇或其前驅物，所述細菌包括：(a)將3-羥基丁醯基-CoA轉化為巴豆醯基-CoA(步驟27)之酶、將巴豆醯基-CoA轉化為丁醯基基-CoA(步驟31)之酶、將丁醯基-CoA轉化為乙醯丁醯基-CoA(步驟32)之酶、將乙醯丁醯基-CoA轉化為3-羥基己醯基-CoA(步驟36)之酶、將3-羥基己醯基-CoA轉化為3-羥基己酸酯(步驟37)之酶、將3-羥基己酸酯轉化為1,3-己醛(步驟38)之酶及將1,3-己醛轉化為1,3-己二醇(步驟39)之酶。
30. 如申請專利範圍第29項所述之細菌，其中所述細菌產生1,3-己二醇或其前驅物。
31. 一種經基因工程改造之細菌，其用於自3-羥基丁醯基-CoA 產生3-甲基-2-丁醇或其前驅物，所述細菌包括：(a)將3-羥基丁醯基-CoA轉化為巴豆醯基-CoA(步驟27)之酶、將巴豆醯基-CoA轉化為丁醯基基-CoA(步驟31)之酶、將丁醯基-CoA轉化為乙醯丁醯基-CoA(步驟32)之酶、將乙醯丁醯基-CoA轉化為乙醯丁酸酯(步驟33)之酶、將乙醯丁酸酯轉化為乙醯基丙酮(步驟34)之酶及將乙醯基丙酮轉化為3-甲基-2-丁醇(步驟35)之酶，其中將乙醯丁醯基-CoA轉化為乙醯丁酸酯(步驟33)之所述酶為Ptb-Buk。
32. 如申請專利範圍第31項所述之細菌，其中所述細菌產生3-甲基-2-丁醇或其前驅物。
33. 一種經基因工程改造之細菌，其用於自3-羥基丁醯基-CoA產生2-丁烯-1-醇或其前驅物，所述細菌包括：(a)將3-羥基丁醯基-CoA轉化為巴豆醯基-CoA(步驟27)之酶、將巴豆醯基-CoA轉化為巴豆酸酯(步驟28)之酶、將巴豆酸酯轉化為巴豆醛(步驟29)之酶及將巴豆醛轉化為2-丁烯-1-醇(步驟30)之酶，其中將巴豆醯基-CoA轉化為巴豆酸酯(步驟28)之所述酶為Ptb-Buk。
34. 如申請專利範圍第33項所述之細菌，其中所述細菌產生3-甲基-2-丁醇或其前驅物。
35. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生異戊酸酯或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA(步驟40)之酶、將3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA轉 化為3-羥基-3-甲基葡糖基-CoA(步驟41)之酶、將3-羥基-3-甲基葡糖基-CoA轉化為2-甲基巴豆醯基-CoA(步驟42)之酶、將2-甲基巴豆醯基-CoA轉化為異戊醯基-CoA(步驟43)之酶及將異戊醯基-CoA轉化為異戊酸酯(步驟44)之酶，其中將異戊醯基-CoA轉化為異戊酸酯(步驟44)之所述酶為Ptb-Buk。
36. 如申請專利範圍第35項所述之細菌，其中所述細菌產生異戊酸酯或其前驅物。
37. 一種經基因工程改造之細菌，其用於產生異戊醇或其前驅物，所述細菌包括：(a)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA(步驟40)之酶、將3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA轉化為3-羥基-3-甲基葡糖基-CoA(步驟41)之酶、將3-羥基-3-甲基葡糖基-CoA轉化為2-甲基巴豆醯基-CoA(步驟42)之酶、將2-甲基巴豆醯基-CoA轉化為異戊醯基-CoA(步驟43)之酶、將異戊醯基-CoA轉化為異戊酸酯(步驟44)之酶、將異戊醯基轉化為異戊醛(步驟45)之酶及將異戊醛轉化為異戊醇(步驟46)之酶，其中將異戊醯基-CoA轉化為異戊酸酯(步驟44)之所述酶為Ptb-Buk，或(b)將乙醯基-CoA轉化為乙醯乙醯基-CoA(步驟1)之酶、將乙醯乙醯基-CoA轉化為3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA(步驟40)之酶、將3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA轉化為3-羥基-3-甲基葡糖基-CoA(步驟41)之酶、將3-羥基-3-甲基葡糖基-CoA轉化為2-甲基巴豆醯基-CoA(步驟 42)之酶、將2-甲基巴豆醯基-CoA轉化為異戊醯基-CoA(步驟43)之酶、將異戊醯基-CoA轉化為異戊醛(步驟45)之酶及將異戊醛轉化為異戊醇(步驟46)之酶。
38. 如申請專利範圍第37項所述之細菌，其中所述細菌產生異戊醇或其前驅物。
39. 如申請專利範圍第1項至第38項中任一項所述之細菌，其中所述細菌為固定C1之細菌。
40. 如申請專利範圍第1項至第38項中任一項所述之細菌，其中所述細菌源自選自由以下組成之群的親本細菌：自產乙醇梭菌、永達爾梭菌、拉氏梭菌、大腸桿菌、釀酒酵母、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、丁酸梭菌、帝奧梭菌、克氏梭菌、巴斯德梭菌、水腫梭菌、艱難梭菌、熱纖梭菌、解纖維梭菌、嗜纖維梭菌、植物醱酵梭菌、雷特氏乳球菌、枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、運動醱酵單胞菌、產酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、穀胺酸棒狀桿菌、里氏木菌、鉤蟲貪銅菌、惡臭假單胞菌、胚芽乳桿菌及扭脫甲基桿菌。
41. 一種產生產物之方法，其包括在受質存在下培養如申請專利範圍第1項至第40項中任一項所述之細菌，藉由所述方法所述細菌產生所述產物。
42. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中所述細菌產生丙酮或其前驅物、異丙醇或其前驅物、異丁烯或其前驅物、3-羥基丁酸酯或其前驅物、1,3-丁二醇或其前驅物、2-羥基異丁酸酯或其前驅物、己二酸或其前驅物、1,3-己二醇或其前驅物、3-甲基-2-丁醇或其前驅物、2-丁烯-1- 醇或其前驅物、異戊酸酯或其前驅物或異戊醇或其前驅物中之一或多者。
43. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中所述Ptb-Buk將乙醯乙醯基-CoA轉化為乙醯乙酸酯(步驟2)，將3-羥基異戊醯基-CoA轉化為3-羥基異戊酸酯(步驟8)，將3-羥基丁醯基-CoA轉化為3-羥基丁酸酯(步驟14)，將2-羥基異丁醯基-CoA轉化為2-羥基異丁酸酯(步驟20)，將巴豆醯基-CoA轉化為巴豆酸酯(步驟28)，將乙醯丁醯基-CoA轉化為乙醯丁酸酯(步驟33)或將異戊醯基-CoA轉化為異戊酸酯(步驟44)。
44. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中所述受質為包括CO、CO ₂及H ₂中之一或多者的氣體受質。
45. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中所述氣體受質為合成氣。
46. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中所述氣體受質為工業廢氣。