EA043734B1 - Генетически сконструированная бактерия, содержащая энергогенерирующий ферментативный путь - Google Patents
Генетически сконструированная бактерия, содержащая энергогенерирующий ферментативный путь Download PDFInfo
- Publication number
- EA043734B1 EA043734B1 EA201890952 EA043734B1 EA 043734 B1 EA043734 B1 EA 043734B1 EA 201890952 EA201890952 EA 201890952 EA 043734 B1 EA043734 B1 EA 043734B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- coa
- enzyme
- converts
- clostridium
- aldehyde
- Prior art date
Links
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title claims description 70
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 66
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 325
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 286
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 273
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 273
- 241001656809 Clostridium autoethanogenum Species 0.000 claims description 259
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 claims description 256
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 255
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 255
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 169
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 138
- 108700024126 Butyrate kinases Proteins 0.000 claims description 131
- 108700024327 Phosphate butyryltransferases Proteins 0.000 claims description 127
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 111
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 109
- 241000186566 Clostridium ljungdahlii Species 0.000 claims description 108
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 claims description 104
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 claims description 101
- 241001611023 Clostridium ragsdalei Species 0.000 claims description 98
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 86
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 78
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 65
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 65
- 229920001791 ((R)-3-Hydroxybutanoyl)(n-2) Polymers 0.000 claims description 55
- QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 0.000 claims description 53
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical group CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 53
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-M acetoacetate Chemical compound CC(=O)CC([O-])=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 48
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- FFVUICCDNWZCRC-ZSJPKINUSA-N 2-hydroxyisobutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C)(C)O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 FFVUICCDNWZCRC-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 37
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 32
- 108010084715 isopropanol dehydrogenase (NADP) Proteins 0.000 claims description 29
- BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-M 2-hydroxyisobutyrate Chemical compound CC(C)(O)C([O-])=O BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 claims description 23
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 claims description 23
- MXLMTQWGSQIYOW-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-butanol Chemical compound CC(C)C(C)O MXLMTQWGSQIYOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N butyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 15
- WCASXYBKJHWFMY-NSCUHMNNSA-N 2-Buten-1-ol Chemical compound C\C=C\CO WCASXYBKJHWFMY-NSCUHMNNSA-N 0.000 claims description 12
- AXFYFNCPONWUHW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyisovaleric acid Chemical compound CC(C)(O)CC(O)=O AXFYFNCPONWUHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- PEVZKILCBDEOBT-CITAKDKDSA-N 3-hydroxyisovaleryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(C)(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 PEVZKILCBDEOBT-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 12
- AVIYEYCFMVPYST-UHFFFAOYSA-N hexane-1,3-diol Chemical compound CCCC(O)CCO AVIYEYCFMVPYST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- GTLLKMCVRPVGBK-UHFFFAOYSA-N 3-methylbutaneperoxoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)OO GTLLKMCVRPVGBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 10
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 claims description 8
- SPNAEHGLBRRCGL-BIEWRJSYSA-N adipoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 SPNAEHGLBRRCGL-BIEWRJSYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 7
- ZFXICKRXPZTFPB-FZHFFJAKSA-N (Z)-2,3-dehydroadipoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)\C=C/CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZFXICKRXPZTFPB-FZHFFJAKSA-N 0.000 claims description 6
- OTEACGAEDCIMBS-FOLKQPSDSA-N 3-hydroxyadipyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OTEACGAEDCIMBS-FOLKQPSDSA-N 0.000 claims description 6
- VKKKAAPGXHWXOO-BIEWRJSYSA-N 3-oxoadipyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VKKKAAPGXHWXOO-BIEWRJSYSA-N 0.000 claims description 6
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 claims description 5
- 241001611022 Clostridium carboxidivorans Species 0.000 claims description 4
- 241000186587 Clostridium scatologenes Species 0.000 claims description 4
- 241000193459 Moorella thermoacetica Species 0.000 claims description 4
- 241000186339 Thermoanaerobacter Species 0.000 claims description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000328950 Clostridium drakei Species 0.000 claims description 3
- 241001468167 Clostridium magnum Species 0.000 claims description 3
- 241000204376 Sporomusa ovata Species 0.000 claims description 3
- 241000217849 Sporomusa sphaeroides Species 0.000 claims description 3
- 241001468163 Acetobacterium woodii Species 0.000 claims description 2
- 241000037909 Alkalibaculum Species 0.000 claims description 2
- 241001464894 Blautia producta Species 0.000 claims description 2
- 241001656810 Clostridium aceticum Species 0.000 claims description 2
- 241001171821 Clostridium coskatii Species 0.000 claims description 2
- 241000193161 Clostridium formicaceticum Species 0.000 claims description 2
- 241000186398 Eubacterium limosum Species 0.000 claims description 2
- 241000178985 Moorella Species 0.000 claims description 2
- 241001509483 Oxobacter pfennigii Species 0.000 claims description 2
- 241000543642 Sporomusa silvacetica Species 0.000 claims description 2
- HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanal Chemical compound CC(O)CC=O HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 324
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 192
- 239000000047 product Substances 0.000 description 145
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 142
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 121
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 115
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 100
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 90
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 78
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 46
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 42
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 40
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 40
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 36
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 34
- 101150096860 thlA gene Proteins 0.000 description 34
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 description 32
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 31
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 30
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 28
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 27
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 24
- BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisobutyric acid Chemical compound CC(C)(O)C(O)=O BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 23
- 101150054092 buk gene Proteins 0.000 description 22
- 101150031417 buk1 gene Proteins 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N 3-benzyl-5-[(2-nitrophenoxy)methyl]oxolan-2-one Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1OCC1OC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)C1 AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 21
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 241000894007 species Species 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 20
- 108090000124 3-hydroxybutyrate dehydrogenases Proteins 0.000 description 19
- 101150110984 phaB gene Proteins 0.000 description 19
- 102000034279 3-hydroxybutyrate dehydrogenases Human genes 0.000 description 18
- 102000002932 Thiolase Human genes 0.000 description 18
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 description 18
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 18
- 101100297400 Rhizobium meliloti (strain 1021) phaAB gene Proteins 0.000 description 17
- 101100280476 Streptococcus pneumoniae (strain ATCC BAA-255 / R6) fabM gene Proteins 0.000 description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- 101150015366 budA gene Proteins 0.000 description 17
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 108010055682 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Proteins 0.000 description 16
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 16
- 101150006589 adc gene Proteins 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 101150056596 azin2 gene Proteins 0.000 description 16
- 101150031273 BDH1 gene Proteins 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 15
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 15
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 15
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 14
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 14
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 14
- 101001028272 Escherichia coli (strain K12) Long-chain acyl-CoA thioesterase FadM Proteins 0.000 description 13
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 description 13
- 241001112693 Lachnospiraceae Species 0.000 description 13
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 13
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical compound C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N Butyraldehyde Chemical compound CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 101000693728 Homo sapiens S-acyl fatty acid synthase thioesterase, medium chain Proteins 0.000 description 12
- 102100025541 S-acyl fatty acid synthase thioesterase, medium chain Human genes 0.000 description 12
- 108091022873 acetoacetate decarboxylase Proteins 0.000 description 12
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N (S)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 11
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 11
- 108010023922 Enoyl-CoA hydratase Proteins 0.000 description 11
- 102000011426 Enoyl-CoA hydratase Human genes 0.000 description 11
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- 101150108780 pta gene Proteins 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 101150101337 Bdh2 gene Proteins 0.000 description 10
- 241000186570 Clostridium kluyveri Species 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- JSHMCUNOMIZJDJ-UHFFFAOYSA-N butanoyl dihydrogen phosphate Chemical compound CCCC(=O)OP(O)(O)=O JSHMCUNOMIZJDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-M (R)-3-hydroxybutyrate Chemical compound C[C@@H](O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-M 0.000 description 9
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 9
- 101100119095 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) ermB gene Proteins 0.000 description 9
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 8
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 8
- 241000118652 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Species 0.000 description 8
- 108010000775 Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase Proteins 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000789 acetogenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N 0.000 description 7
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 7
- 241000928018 Caldivirga maquilingensis IC-167 Species 0.000 description 7
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 7
- 241001675829 Ferroglobus placidus DSM 10642 Species 0.000 description 7
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 7
- 241000461168 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Species 0.000 description 7
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 7
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 7
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 3-hydroxybutyryl aldehyde Chemical class 0.000 description 6
- 108030005660 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratases Proteins 0.000 description 6
- YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 3-methylbutanal Chemical compound CC(C)CC=O YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100028889 Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial Human genes 0.000 description 6
- 241000205274 Methanosarcina mazei Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 241001467519 Pyrococcus sp. Species 0.000 description 6
- 241000047166 Thermococcus sibiricus MM 739 Species 0.000 description 6
- 241001495444 Thermococcus sp. Species 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010031234 carbon monoxide dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- RWGFKTVRMDUZSP-UHFFFAOYSA-N cumene Chemical compound CC(C)C1=CC=CC=C1 RWGFKTVRMDUZSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 6
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N valeric aldehyde Natural products CCCCC=O HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMWATMXOQQZNBX-DKBZLLMOSA-N 2-methylcrotonoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(/C)=C/C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 PMWATMXOQQZNBX-DKBZLLMOSA-N 0.000 description 5
- 101710090359 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase Proteins 0.000 description 5
- 241000114861 Aciduliprofundum boonei T469 Species 0.000 description 5
- 102100022714 Acyl-coenzyme A thioesterase 13 Human genes 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000543897 Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 Species 0.000 description 5
- 241001110912 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 Species 0.000 description 5
- 241000193469 Clostridium pasteurianum Species 0.000 description 5
- 241001508458 Clostridium saccharoperbutylacetonicum Species 0.000 description 5
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 5
- 108010036781 Fumarate Hydratase Proteins 0.000 description 5
- 102100036160 Fumarate hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 5
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 108010035473 Palmitoyl-CoA Hydrolase Proteins 0.000 description 5
- 108090000472 Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) Proteins 0.000 description 5
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 5
- 241001203471 Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N crotonoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)/C=C/C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002309 gasification Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 5
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N (S)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N 0.000 description 4
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 4
- 241000601487 Acidilobus saccharovorans 345-15 Species 0.000 description 4
- 241001329407 Aciduliprofundum sp. Species 0.000 description 4
- 102100025854 Acyl-coenzyme A thioesterase 1 Human genes 0.000 description 4
- 101710175445 Acyl-coenzyme A thioesterase 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000276439 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000070528 Caldisphaera lagunensis DSM 15908 Species 0.000 description 4
- 241000643379 Candidatus Korarchaeum cryptofilum Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108700040197 Enoyl-CoA Hydratase 2 Proteins 0.000 description 4
- 241001267419 Eubacterium sp. Species 0.000 description 4
- 241000085256 Fervidicoccus fontis Kam940 Species 0.000 description 4
- 241000164875 Firmicutes bacterium Species 0.000 description 4
- 241001398756 Halalkalicoccus jeotgali B3 Species 0.000 description 4
- 241000531259 Hyperthermus Species 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000863422 Myxococcus xanthus Species 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000736843 Pyrobaculum aerophilum Species 0.000 description 4
- 241000947431 Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 Species 0.000 description 4
- 241000065785 Pyrobaculum oguniense TE7 Species 0.000 description 4
- 241001222730 Pyrococcus horikoshii OT3 Species 0.000 description 4
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 4
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 101710182361 Pyruvate:ferredoxin oxidoreductase Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 102100024639 Short-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 241000268867 Staphylothermus hellenicus DSM 12710 Species 0.000 description 4
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 241000696041 Thermococcus onnurineus Species 0.000 description 4
- 241000205174 Thermofilum Species 0.000 description 4
- 241001491085 Thermofilum pendens Hrk 5 Species 0.000 description 4
- 241000343917 Thermoproteus tenax Kra 1 Species 0.000 description 4
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 4
- 101710081312 Trans-2-enoyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 108010011384 acyl-CoA dehydrogenase (NADP+) Proteins 0.000 description 4
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 101150048352 mazF gene Proteins 0.000 description 4
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 4
- OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N thiamphenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CO)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N 0.000 description 4
- 229960003053 thiamphenicol Drugs 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 3
- 108010063585 (R)-citramalate synthase Proteins 0.000 description 3
- WHBMMWSBFZVSSR-VKHMYHEASA-N (S)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRQDDZWMEGEOOO-UHFFFAOYSA-N 2-trimethylsilylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)[Si](C)(C)C HRQDDZWMEGEOOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108030005924 3-hydroxypropionyl-CoA dehydratases Proteins 0.000 description 3
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxovaleric acid Chemical compound CCC(C)C(=O)C(O)=O JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DUJGMZAICVPCBJ-VDAHYXPESA-N 4-amino-1-[(1r,4r,5s)-4,5-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1 DUJGMZAICVPCBJ-VDAHYXPESA-N 0.000 description 3
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108700001448 Aldo-keto reductase family 1 member A1 Proteins 0.000 description 3
- 241000848220 Aquincola tertiaricarbonis Species 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 3
- 241000186542 Clostridium baratii Species 0.000 description 3
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 3
- 241000949098 Coprococcus comes Species 0.000 description 3
- 241000359383 Desulfurococcus amylolyticus Species 0.000 description 3
- 241000343919 Desulfurococcus amylolyticus DSM 16532 Species 0.000 description 3
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 description 3
- 102000057412 Diphosphomevalonate decarboxylases Human genes 0.000 description 3
- 108700035271 EC 1.1.1.2 Proteins 0.000 description 3
- 241001379910 Ephemera danica Species 0.000 description 3
- 241000195619 Euglena gracilis Species 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241001131718 Haloarcula hispanica ATCC 33960 Species 0.000 description 3
- 241000756428 Haloarcula hispanica N601 Species 0.000 description 3
- 241000981400 Haloferax volcanii DS2 Species 0.000 description 3
- 241001199007 Halogeometricum borinquense DSM 11551 Species 0.000 description 3
- 241000557006 Halorubrum Species 0.000 description 3
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000002284 Hydroxymethylglutaryl-CoA Synthase Human genes 0.000 description 3
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 241001019595 Natronomonas moolapensis Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 241000670334 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Species 0.000 description 3
- 241000514899 Pyrobaculum islandicum DSM 4184 Species 0.000 description 3
- 241000881945 Pyrobaculum sp. Species 0.000 description 3
- 241000432808 Pyrococcus abyssi GE5 Species 0.000 description 3
- 241001120653 Pyrococcus yayanosii CH1 Species 0.000 description 3
- 241000007219 Pyrolobus fumarii 1A Species 0.000 description 3
- 108010031852 Pyruvate Synthase Proteins 0.000 description 3
- 241000589625 Ralstonia pickettii Species 0.000 description 3
- 241001069493 Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 Species 0.000 description 3
- 241000847591 Thermococcus barophilus MP Species 0.000 description 3
- 241000357036 Thermococcus cleftensis Species 0.000 description 3
- 241001054916 Thermococcus litoralis DSM 5473 Species 0.000 description 3
- 241000857763 Thermodesulfovibrio yellowstonii DSM 11347 Species 0.000 description 3
- 241000870821 Thermoproteus uzoniensis 768-20 Species 0.000 description 3
- 241000589892 Treponema denticola Species 0.000 description 3
- 108010084631 acetolactate decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PASOAYSIZAJOCT-UHFFFAOYSA-N butanoic acid Chemical compound CCCC(O)=O.CCCC(O)=O PASOAYSIZAJOCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 3
- MLUCVPSAIODCQM-NSCUHMNNSA-N crotonaldehyde Chemical compound C\C=C\C=O MLUCVPSAIODCQM-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 3
- MLUCVPSAIODCQM-UHFFFAOYSA-N crotonaldehyde Natural products CC=CC=O MLUCVPSAIODCQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N crotonic acid Chemical compound C\C=C\C(O)=O LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 3
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- UYVZIWWBJMYRCD-ZMHDXICWSA-N isovaleryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(C)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 UYVZIWWBJMYRCD-ZMHDXICWSA-N 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000009628 steelmaking Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 3
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LYNVNYDEQMMNMZ-XGXNYEOVSA-N 2-methylbutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LYNVNYDEQMMNMZ-XGXNYEOVSA-N 0.000 description 2
- MWMOPIVLTLEUJO-UHFFFAOYSA-N 2-oxopropanoic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.CC(=O)C(O)=O MWMOPIVLTLEUJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyhexanoic acid Chemical compound CCCC(O)CC(O)=O HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxypropionate Chemical compound OCCC([O-])=O ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010028984 3-isopropylmalate dehydratase Proteins 0.000 description 2
- 102100026105 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 5-sulfosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C1O YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 2
- 102000005345 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001203192 Archaeoglobus profundus DSM 5631 Species 0.000 description 2
- 241000006176 Archaeoglobus veneficus SNP6 Species 0.000 description 2
- 101100389345 Bacillus subtilis (strain 168) ndoA gene Proteins 0.000 description 2
- 101000782236 Bothrops leucurus Thrombin-like enzyme leucurobin Proteins 0.000 description 2
- 241000193174 Butyrivibrio crossotus Species 0.000 description 2
- 108010068197 Butyryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000156241 Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 Species 0.000 description 2
- 102100031668 Chromodomain Y-like protein Human genes 0.000 description 2
- 101710168556 Chromodomain Y-like protein Proteins 0.000 description 2
- 241000070918 Cima Species 0.000 description 2
- 241001522206 Clostridium algidicarnis Species 0.000 description 2
- 241001147768 Clostridium argentinense Species 0.000 description 2
- 241001509415 Clostridium botulinum A Species 0.000 description 2
- 241001509496 Clostridium celatum Species 0.000 description 2
- 241000193169 Clostridium cellulovorans Species 0.000 description 2
- 241000206044 Clostridium chauvoei Species 0.000 description 2
- 241000788977 Clostridium colicanis Species 0.000 description 2
- 241000272479 Clostridium diolis Species 0.000 description 2
- 241000779784 Clostridium hydrogeniformans Species 0.000 description 2
- 241001147791 Clostridium paraputrificum Species 0.000 description 2
- 241000429427 Clostridium saccharobutylicum Species 0.000 description 2
- 241000936120 Clostridium senegalense Species 0.000 description 2
- 241001318996 Clostridium sulfidigenes Species 0.000 description 2
- 241000186520 Clostridium tetanomorphum Species 0.000 description 2
- 101710188748 Crotonyl-CoA hydratase Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000605762 Desulfovibrio vulgaris Species 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700034992 EC 1.1.1.80 Proteins 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 2
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 description 2
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003983 Flavoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010057573 Flavoproteins Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- 241001003011 Geobacter sulfurreducens PCA Species 0.000 description 2
- 101150019065 HBD gene Proteins 0.000 description 2
- 241000423295 Haloarcula marismortui ATCC 43049 Species 0.000 description 2
- 241001054902 Haloferax mediterranei ATCC 33500 Species 0.000 description 2
- 241000546751 Halopiger xanaduensis Species 0.000 description 2
- 101000958922 Homo sapiens Diphosphomevalonate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000323143 Ignicoccus hospitalis Species 0.000 description 2
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical compound CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000102542 Kara Species 0.000 description 2
- 108010000200 Ketol-acid reductoisomerase Proteins 0.000 description 2
- 241001468178 Kyrpidia tusciae Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 241001042243 Methanocella arvoryzae MRE50 Species 0.000 description 2
- 241001276824 Methanocella conradii HZ254 Species 0.000 description 2
- 241000921850 Methanocella paludicola SANAE Species 0.000 description 2
- 241001507079 Methanohalobium evestigatum Z-7303 Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101000958925 Panax ginseng Diphosphomevalonate decarboxylase 1 Proteins 0.000 description 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 101710104378 Putative malate oxidoreductase [NAD] Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000439254 Pyrobaculum neutrophilum V24Sta Species 0.000 description 2
- 241001115170 Pyrococcus furiosus DSM 3638 Species 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 2
- 241000711837 Roseburia sp. Species 0.000 description 2
- 108030005950 Short-chain-enoyl-CoA hydratases Proteins 0.000 description 2
- 101000581497 Solanum tuberosum 2-methylacyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 241000205077 Staphylothermus marinus Species 0.000 description 2
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 241000145545 Streptomyces collinus Species 0.000 description 2
- 102000011929 Succinate-CoA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010075728 Succinate-CoA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000295829 Thermococcus gammatolerans EJ3 Species 0.000 description 2
- 241000981880 Thermococcus kodakarensis KOD1 Species 0.000 description 2
- 241000438192 Thermoplasma acidophilum DSM 1728 Species 0.000 description 2
- 241000435340 Thermoplasma volcanium GSS1 Species 0.000 description 2
- 241001119038 Thermosphaera aggregans DSM 11486 Species 0.000 description 2
- 241000868182 Thermus thermophilus HB8 Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108010087331 glutaconate CoA-transferase Proteins 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 108010072869 indolepyruvate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 108010071806 methylcrotonoyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 2
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- VAAHKRMGOFIORX-SNIDVWGTSA-N s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 3-hydroxyhexanethioate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VAAHKRMGOFIORX-SNIDVWGTSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 101150026728 tesB gene Proteins 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 2
- AOFUBOWZWQFQJU-SNOJBQEQSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolane-2,3,4-triol;(2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AOFUBOWZWQFQJU-SNOJBQEQSA-N 0.000 description 1
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 1
- NEJDKFPXHQRVMV-UHFFFAOYSA-N (E)-2-Methyl-2-buten-1-ol Natural products CC=C(C)CO NEJDKFPXHQRVMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- AFENDNXGAFYKQO-GSVOUGTGSA-N (R)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108010062721 (R)-2-methylmalate dehydratase Proteins 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N (R)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- PUPZLCDOIYMWBV-SCSAIBSYSA-N (R)-butane-1,3-diol Chemical compound C[C@@H](O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N (R)-flurbiprofen Chemical compound FC1=CC([C@H](C(O)=O)C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- PUPZLCDOIYMWBV-BYPYZUCNSA-N (S)-butane-1,3-diol Chemical compound C[C@H](O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 1-Butene Chemical compound CCC=C VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSGWCUXYFMVTPH-MPVICIIESA-N 2-hydroxyisovaleryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(O)C(C)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OSGWCUXYFMVTPH-MPVICIIESA-N 0.000 description 1
- BTVWZWFKMIUSGS-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropane-1,2-diol Chemical compound CC(C)(O)CO BTVWZWFKMIUSGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108030002957 Acetate CoA-transferases Proteins 0.000 description 1
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 description 1
- 241000567147 Aeropyrum Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000605902 Butyrivibrio Species 0.000 description 1
- MGONSHHJTCSVHI-UHFFFAOYSA-N C(CC(=O)C)(=O)OP(=O)(O)O Chemical compound C(CC(=O)C)(=O)OP(=O)(O)O MGONSHHJTCSVHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000716167 Caloramator australicus Species 0.000 description 1
- 241000062075 Caloramator sp. Species 0.000 description 1
- 241001395745 Candidatus Caldiarchaeum Species 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001665089 Chloroflexus aurantiacus J-10-fl Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000423302 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Species 0.000 description 1
- 241000306276 Clostridium akagii Species 0.000 description 1
- 241000719667 Clostridium arbusti Species 0.000 description 1
- 241000445964 Clostridium autoethanogenum DSM 10061 Species 0.000 description 1
- 101100322572 Clostridium beijerinckii (strain ATCC 51743 / NCIMB 8052) adc gene Proteins 0.000 description 1
- 241001335108 Clostridium bornimense Species 0.000 description 1
- 241000193455 Clostridium cadaveris Species 0.000 description 1
- 241001331740 Clostridium lundense Species 0.000 description 1
- 241000186581 Clostridium novyi Species 0.000 description 1
- 241000193470 Clostridium sporogenes Species 0.000 description 1
- 241001464949 Coprococcus eutactus Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 241000301255 Desulfurococcus mucosus DSM 2162 Species 0.000 description 1
- 108700040484 Diphosphomevalonate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 108700033402 EC 1.1.1.38 Proteins 0.000 description 1
- 108700034993 EC 1.1.1.86 Proteins 0.000 description 1
- 108700034911 EC 3.1.2.- Proteins 0.000 description 1
- 101150014913 ERG13 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100021822 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241001531192 Eubacterium ventriosum Species 0.000 description 1
- 241001531182 Eubacterium xylanophilum Species 0.000 description 1
- 241000228882 Fervidicella metallireducens Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000546770 Halopiger Species 0.000 description 1
- 241001417305 Halopiger xanaduensis SH-6 Species 0.000 description 1
- 101000839020 Homo sapiens Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010063370 Homoaconitate hydratase Proteins 0.000 description 1
- 241001603562 Ignisphaera aggregans DSM 17230 Species 0.000 description 1
- NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N Isooctane Chemical compound CC(C)CC(C)(C)C NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000933069 Lachnoclostridium phytofermentans Species 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000157876 Metallosphaera sedula Species 0.000 description 1
- 101100395468 Metallosphaera sedula (strain ATCC 51363 / DSM 5348 / JCM 9185 / NBRC 15509 / TH2) Msed_2001 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 1
- 241001003007 Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 Species 0.000 description 1
- 241000947423 Methanocorpusculum labreanum Z Species 0.000 description 1
- 241001491087 Methanoculleus marisnigri JR1 Species 0.000 description 1
- 241001306965 Methanolobus psychrophilus Species 0.000 description 1
- 241000039716 Methanomethylovorans hollandica DSM 15978 Species 0.000 description 1
- 241001592722 Methanosaeta harundinacea 6Ac Species 0.000 description 1
- 241001013737 Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Species 0.000 description 1
- 241001139408 Methanosarcina acetivorans C2A Species 0.000 description 1
- 241000205275 Methanosarcina barkeri Species 0.000 description 1
- 241001538098 Methanosphaerula palustris Species 0.000 description 1
- 241001649418 Methanospirillum hungatei JF-1 Species 0.000 description 1
- 241001302042 Methanothermobacter thermautotrophicus Species 0.000 description 1
- 241000767818 Methanothrix thermoacetophila PT Species 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001472016 Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Species 0.000 description 1
- 241000078163 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Species 0.000 description 1
- 241000186544 Moorella thermoautotrophica Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide Chemical compound C[Si](C)(C)O\C(C(F)(F)F)=N\[Si](C)(C)C XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N 0.000 description 1
- 102100032457 NAD-dependent malic enzyme, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000172870 Natrialba magadii ATCC 43099 Species 0.000 description 1
- 241001417623 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Species 0.000 description 1
- 241000975077 Natrinema sp. Species 0.000 description 1
- 241001417618 Natronobacterium gregoryi SP2 Species 0.000 description 1
- 241000007221 Natronococcus occultus SP4 Species 0.000 description 1
- 241000765915 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150052992 PTBP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027506 Peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001632455 Picrophilus torridus Species 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 229920001273 Polyhydroxy acid Polymers 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000205226 Pyrobaculum Species 0.000 description 1
- 241000403986 Pyrobaculum oguniense Species 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 description 1
- 241000836453 Pyrococcus furiosus COM1 Species 0.000 description 1
- 241000134686 Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 Species 0.000 description 1
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 description 1
- 206010039792 Seborrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000204388 Sporomusa Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 101001125870 Streptomyces venezuelae Thioesterase PikA5 Proteins 0.000 description 1
- 241001136694 Subdoligranulum Species 0.000 description 1
- 102100035726 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000202694 Thermoanaerobacter wiegelii Species 0.000 description 1
- 241000520824 Thermobrachium celere Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 1
- 241000193453 [Clostridium] cellulolyticum Species 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N adiponitrile Chemical compound N#CCCCCC#N BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004099 anaerobic respiration Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 101150052778 bdh gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001277 beta hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- UVMPXOYNLLXNTR-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;ethanol;propan-2-one Chemical compound CCO.CC(C)=O.CCCCO UVMPXOYNLLXNTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFAZFSACZIVZDV-UHFFFAOYSA-N butan-2-one Chemical compound CCC(C)=O.CCC(C)=O RFAZFSACZIVZDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diol Chemical compound CCCC(O)O CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPLCYFWQZHLPFH-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diol;butane-2,3-diol Chemical compound CCCC(O)O.CC(O)C(C)O UPLCYFWQZHLPFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N butene Natural products CC=CC IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 description 1
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000571 coke Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- JVSWJIKNEAIKJW-UHFFFAOYSA-N dimethyl-hexane Natural products CCCCCC(C)C JVSWJIKNEAIKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000004508 fractional distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000002816 fuel additive Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000003988 headspace gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- QKGYJVXSKCDGOK-UHFFFAOYSA-N hexane;propan-2-ol Chemical compound CC(C)O.CCCCCC QKGYJVXSKCDGOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M hexanoate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004434 industrial solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001450 methanotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000037312 oily skin Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 238000005373 pervaporation Methods 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 238000005504 petroleum refining Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- DIIBXMIIOQXTHW-UHFFFAOYSA-N pirozadil Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)OCC=2N=C(COC(=O)C=3C=C(OC)C(OC)=C(OC)C=3)C=CC=2)=C1 DIIBXMIIOQXTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950008646 pirozadil Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001225 polyester resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004645 polyester resin Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920005749 polyurethane resin Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000010248 power generation Methods 0.000 description 1
- 238000000079 presaturation Methods 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 101150048333 ptb gene Proteins 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- OFTARKWRQHIGAM-BIKQFFATSA-N s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 3-hydroxybutanethioate;s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C)(C)O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OFTARKWRQHIGAM-BIKQFFATSA-N 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 108090000308 trans-2-enoyl-CoA reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 239000002912 waste gas Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/240850, поданной 13 октября 2015 г., полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.
Уровень техники
Благодаря недавним успехам в ферментативном и метаболическом конструировании (инженерии) были идентифицированы и разработаны ферментативные маршруты для получения различных продуктов (Clomburg, Appl Microbiol Biotechnol, 86: 419-434, 2010; Peralta-Yahya, Biotechnol J, 5: 147-162, 2010; Cho, Biotechnol Adv, pii: S0734-9750(14)00181-5, 2014. Однако все указанные ферментативные маршруты являются энерго(АТФ)-потребляющими или, в лучшем случае, энергетически (АТФ-) нейтральными, что ограничивает выход продукта в энергетически ограниченных системах и рассинхронизирует продуцирование продукта и рост микроорганизма. Согласно настоящему изобретению предложены энергогенерирующие (АТФ-генерирующие) пути, позволяющие преодолеть указанные ограничения, обеспечивая новые ферментативные маршруты и пути для получения различных продуктов, в том числе кислот, алкенов, альдегидов, спиртов и диолов. Указанные пути прямо сопряжены с ростом микроорганизма и обеспечивают высокий выход продуктов.
В частности, настоящее изобретение относится к ферментативным путям, включающим Ptb-Buk. Фосфатбутирилтрансфераза (Ptb) (EC 2.3.1.19) в норме катализирует реакцию бутаноил-КоА и фосфата с образованием КоА и бутаноилфосфата. Бутираткиназа (Buk) (EC 2.7.2.7) в норме катализирует реакцию бутаноилфосфата и АДФ с образованием бутирата (бутаноата) и АТФ. Соответственно, указанные ферменты совместно (Ptb-Buk) в норме катализируют преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерируют одну молекулу АТФ по механизму субстратного фосфорилирования (SLP).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной и способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, Ptb-Buk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ по механизму субстратного фосфорилирования.
Кроме того, в комбинации с альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (AOR) и алкогольдегидрогеназой, кислоты, образованные с помощью системы Ptb-Buk, могут быть далее преобразованы в соответствующие альдегиды, спирты или диолы. AOR (EC 1.2.7.5) катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина (который может, например, образовываться в результате окисления CO или водорода) с образованием альдегида и окисленного ферредоксина.
Алкогольдегидрогеназа (EC 1.1.1.1 и EC 1.1.1.2) может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф).
Введение Ptb-Buk и/или AOR в гетерологичный вид, соответственно, обеспечивает новый альтернативный способ получения нативных и ненативных продуктов, таких как кислоты, алкены, кетоны, альдегиды, спирты и диолы, с высоким выходом, таким образом преодолевая ограничения существующего уровня техники.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложена генетически сконструированная (т.е. генноинженерная) бактерия, содержащая экзогенную фосфатбутирилтрансферазу (Ptb) и экзогенную бутираткиназу (Buk) (Ptb-Buk). В общем случае, указанная Ptb-Buk действует на ненативный субстрат, например, субстрат, отличный от бутаноил-КоА и/или бутаноилфосфата, и продуцирует ненативный продукт, например, продукт, отличный от бутаноилфосфата или бутирата. Согласно некоторым вариантам реализации указанная Ptb-Buk преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3гидроксиизовалерат, 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, или 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират.
Указанная бактерия может продуцировать что-либо одно или более из кислоты, алкена, кетона, альдегида, спирта или диола. Более конкретно, указанная бактерия может продуцировать что-либо одно или более из ацетона или его предшественника, изопропанола или его предшественника, изобутилена или его предшественника, 3-гидроксибутирата или его предшественника, 1,3-бутандиола или его предшественника, 2-гидроксиизобутирата или его предшественника, адипиновой кислоты или ее предшественника, 1,3-гександиола или его предшественника, 3-метил-2-бутанола или его предшественника, 2-бутен-1-ола или его предшественника, изовалерата или его предшественника, или изоамилового спирта или его предшественника. Указанная бактерия, как правило, не продуцирует бутанол.
Указанная бактерия может дополнительно содержать разрушающую мутацию в фосфотрансацетилазе (Pta) и ацетаткиназе (Ack). Указанная бактерия может дополнительно содержать разрушающую мутацию в тиоэстеразе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена генетически сконструированная бактерия, содержащая экзогенную Ptb-Buk и экзогенную или эндогенную альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения продукта, включающий культивирование бактерии согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации в присутствии субстрата. Указанный продукт может представлять собой, например, ацетон или его предшественник, изопропанол или его предшественник, изобутилен или его предшественник, 3-гидроксибутират или его
- 1 043734 предшественник, 1,3-бутандиол или его предшественник, 2-гидроксиизобутират или его предшественник, адипиновую кислоту или ее предшественник, 1,3-гександиол или его предшественник, 3-метил-2бутанол или его предшественник, 2-бутен-1-ол или его предшественник, изовалерат или его предшественник, или изоамиловый спирт или его предшественник. Обычно указанный субстрат представляет собой газообразный субстрат, содержащий, например, что-либо одно или более из CO, CO2 и H2. Согласно одному варианту реализации указанный газообразный субстрат представляет собой сингаз. Согласно другому варианту реализации указанный газообразный субстрат представляет собой отходящий промышленный газ.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата, 1,3-бутандиола и 2гидроксиизобутирата из ацетил-КоА. Ацетил-КоА может быть получен из любого подходящего субстрата, такого как углеводный (например, сахарный) субстрат или газообразный субстрат. Согласно настоящему изобретению ацетил-КоА часто получают из газообразного субстрата. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.
Фиг. 2 представляет собой диаграмму, отражающую реакции, естественным образом катализируемые Ptb-Buk, а именно, преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерацию одной молекулы АТФ.
Фиг. 3 представляет собой диаграмму сравнения активности КоА-трансферазы, тиоэстеразы и PtbBuk.
Фиг. 4 представляет собой график, отражающий средние показатели продуцирования ацетона в E. coli BL21 (D3), модифицированной плазмидами, содержащими экзогенные гены. Указанные данные демонстрируют способность Ptb-Buk к преобразованию ацетоацетил-КоА в ацетоацетат в E.coli in vivo.
Фиг. 5 представляет собой график, отражающий эффект индукции E. coli BL21 (DE3), несущей как плазмиду pACYC-ptb-buk, так и плазмиду pCOLA-thlA-adc (экспрессирующие тиолазу, Ptb-Buk и ацетоацетатдекарбоксилазу).
Фиг. 6 представляет собой диаграмму пути, разработанного для применения Ptb-Buk для получения ацетона, с повторным использованием восстанавливающих эквивалентов, получаемых при продуцировании (R)-3-гидроксибутирuл-КоА и АТФ, генерируемой Ptb-Buk.
Фиг. 7 представляет собой диаграмму, отражающую роль альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы (AOR), ферредоксина и Adh при продуцировании 1,3-бутандиола в С. autoethanogenum. Чаще всего AOR может применяться для катализа преобразование кислоты в альдегид, a Adh может применяться для катализа преобразования альдегида в спирт/диол.
Фиг. 8 представляет собой диаграмму, отражающую стереоспецифичность Ptb-Buk при продуцировании (R)-3-гидроксибутирата и 2-гидроксиизобутирата. Термин нативный на фиг. 8 относится к нативной тиоэстеразе.
Фиг. 9 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование изобутена с помощью PtbBuk-преобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерата с применением альтернативного пути 1.
Фиг. 10 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование изобутена с помощью PtbBuk-преобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерата с применением альтернативного пути 2.
Фиг. 11 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование 1,3-бутандиола с помощью 3 -бутиральдегиддегидрогеназы (Bld).
Фиг. 12 представляет собой график, отражающий продуцирование изопропанола в С. autoethanogenum с применением системы Ptb-Buk относительно контроля oPMTL85i47-thlA-adc, • pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.
Фиг. 13A-F представляют собой графики, отражающие продуцирование 3-гидроксибутирата, ацетата, этанола и ацетона с применением модульных плазмид у E. coli с разными концентрациями индуктора ИТПТ (0, 50, 100 мкМ). Фиг. 13А: pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB. Фиг. 13В:
pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13С: pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13D: pCOLA-thlA-adc. Фиг. 13E: pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13F: pCDF-phaB.
Фиг. 14 представляет собой плазмидную карту плазмиды pMTL8225-budA::thlA-phaB.
Фиг. 15 представляет собой снимок геля ПЦР-верификации замены генов ацетолактатсинтазы (budA) генами тиолазы (thlA) и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (phaB) у С. autoethanogenum для 4 клонов (1, 4, 7, 9) по сравнению с диким типом (W). Все клоны являются положительными, что видно по большему размеру ПЦР-фрагментов по сравнению с диким типом.
Фиг. 16 представляет собой график, отражающий профиль ферментации для периодической ферментации штамма С. autoethanogenum budA::thlAphaB и демонстрирующий образование 3гидроксибутирата и 1,3-бутандиола из газа.
Фиг. 17А представляет собой график, отражающий продуцирование 1,3-BDO с помощью тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (Bld) и бутиральдегиддегидрогеназы. Фиг. 17В представляет собой график, отражающий влияние экспрессии bld на рост.
- 2 043734
Фиг. 18А представляет собой график, отражающий образование 3-гидроксибутирата и 1,3бутандиола из газообразного субстрата в С autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA. Фиг. 18В представляет собой график, отражающий восстановление ацетата в этанол в той же культуре. Фиг. 19 представляет собой график, отражающий профиль ферментации штамма С. autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA, демонстрирующий образование 3-гидроксибутирата и 1,3-бутандиола из газообразного субстрата в непрерывной культуре (где это указано, среду непрерывно восполняли с заданной скоростью разведения D).
Фиг. 20А и 20В представляют собой графики, отражающие увеличенную активность гидролиза КоА в отношении диапазона ацил-КоА (ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирилКоА) у С. autoethanogenum, экспрессирующего систему Ptb-Buk из плазмиды pMTL82256-ptb-buk, по сравнению с диким типом (WT).
Фиг. 21А и 21В представляют собой графики, отражающие сниженную активность гидролиза ацилКоА у штаммов С. autoethanogenum с инактивированной тиоэстеразой (СТ2640 = тиоэстераза 1, СТ1524 = тиоэстераза 2, СТ1780 = тиоэстераза 3) по сравнению с активностью, обнаруживаемой у C. autoethanogenum LZ1560 или LZ1561.
Фиг. 22 представляет собой график, отражающий увеличенное специфическое продуцирование изопропанола у штамма С. autoethanogenum с разрушенной тиоэстеразой 3 CAETHG_1780 по сравнению с С. autoethanogenum дикого типа.
Фиг. 23A-D представляют собой графики, отражающие рост (фиг. 23А) и профили продуцирования изопропанола (фиг. 23В), ацетата (фиг. 23С) и этанола (фиг. 23D) у С. autoethanogenum дикого типа и штамма с разрушенной тиоэстеразой 3 (CAETHG_1780), по сравнению с С. autoethanogenum дикого типа.
Фиг. 24 представляет собой плазмидную карту pMTL8225-pta-ack::ptb-buk.
Фиг. 25 представляет собой снимок геля, отражающий замену генов pta и ack на гены ptb и buk и кассету ermB.
Фиг. 26 представляет собой график, отражающий увеличенное преобразование 3-гидроксибутирата в 1,3-BDO за счет избыточной экспрессии гена альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы aor1.
Фиг. 27 представляет собой график, отражающий активность тиоэстеразы TesB, Pta-Ack и системы Ptb-Buk на гидролиз КоА ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирил-КоА по сравнению с контролем (штамм BL21). Ptb-Buk демонстрирует максимальную активность, тогда как PtaAck демонстрирует отсутствие активности.
Фиг. 28А и 28В представляют собой графики, отражающие продуцирование 3-гидроксибутирата с помощью Ptb-Buk в комбинации с ^-специфической (Hbd) (фиг. 28А) или ^-специфической 3гидроксибутиратдегидрогеназой (PhaB) (фиг. 28В).
Фиг. 29A-D представляют собой графики, отражающие ЖХ-МС/МС-детекцию 2гидроксиизомасляной кислоты (2-ГИБ) и 2-гидроксибутирата (2-ГБ). Фиг. 29А: 1 мМ стандарт 2-ГИБ. Фиг. 29В: 1 мМ стандарт 2-ГБ. Фиг. 29С: 0,5 мМ стандарт 2-ГБ и 2-ГИБ. Фиг. 29D: дупликат образца С. autoethanogenum, демонстрирующий продуцирование 2-ГИБ и 2-ГБ из газа.
Фиг. 30 представляет собой группу графиков, отражающих ГХ-МС-подтверждение продуцирования 2-гидроксиизомасляной кислоты (8,91 мин).
Первая панель: С. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Вторая панель: С. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk (спектр). Третья панель: Е. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Четвертая панель: Е. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk.
Фиг. 31 представляет собой группу графиков ПЦР в реальном времени, отражающих экспрессию генов пути 2-ШВА (thlA, hba, meaBhcmA, hcmB из промотора pta-ack и, соответственно, промотора оперона Вуда-Льюнгдаля) в E.coli, С. autoethanogenum LZ1561 при 30°С, и С. autoethanogenum LZ1561 при 37°С.
Фиг. 32 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование различных продуктов в микроорганизме, содержащем Ptb-Buk, AOR и Adh.
Фиг. 33 представляет собой диаграмму, отражающую сопряжение люциферазы светлячков (Luc) с системой Ptb-Buk для характеризации вариантов Ptb-Buk.
Фиг. 34 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе адипиновой кислоты. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.
Фиг. 35 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе 1,3-гександиола, 2-метил-2-бутанола и 2-бутен-1-ола. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.
Фиг. 36 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе изовалерата и изоамилового спирта. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.
- 3 043734
Фиг. 37 представляет собой график продуцирования 3-ГБ в С. autoethanogenum, содержащем плазмиду pMTL82256-thlA-ctfAB, в различных точках роста.
Фиг. 38А представляет собой график, отражающий рост и профиль продуцирования этанола и 2,3бутандиола у штамма С. awtoetf?a«ogrnwwpta-ack::ptb-buk + pMTL85147^^ Фиг. 38В представляет собой график, отражающий профиль продуцирования изопропанола и 3-ГБ у штамма С. autoethanogenum pta-ack: :ptb-buk + pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.
Фиг. 39 представляет собой диаграмму схемы пути продуцирования диапазона спиртов, кетонов, енолов или диолов С4, C6, C8, C10, С12, С14 посредством комбинирования известного пути удлинения цепи (Hbd, Crt, Bcd-EtfAB, ТЫ) с Ptb-Buk + AOR/Adc-Adh.
Фиг. 40 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO С. autoethanogenum, трансформированным плазмидой pMTL83159-phaB-thlA, в различных точках роста.
Фиг. 41 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO С. autoethanogenum, содержащим нокаут budA и pMTL-HBD-ThlA, в различных точках роста.
Фиг. 42А представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ при ферментации С. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256. Фиг. 42В представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ при ферментации С. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256-buk-ptb.
Фиг. 43 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ штаммом С. autoethanogenum, с нокаутом тиоэстеразы (ΔCAETHG_1524), экспрессирующим плазмиду pMTL83156-phaB-thlA, содержащим и не содержащим экспрессионную плазмиду Ptb-Buk pMTL82256-buk-ptb.
Фиг. 44 представляет собой график, отражающий продуцирование этанола и 1,3-BDO у штамма С. autoethanogenum, экспрессирующего плазмиду pMTL82256-hbd-thlA (2pf) содержащего и не содержащего плазмиду для избыточной экспрессии AOR pMTL83159-aor1 (+aorl).
Подробное описание изобретения Метаболические пути на фиг. 1 и 34-36
Фиг. 1 и 34-36 представляют собой диаграммы метаболических путей продуцирования различных продуктов кислот, алкенов, кетонов, альдегидов, спиртов и диолов, в том числе ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата (R- и S-изомеров), 1,3-бутандиола, 2-гидроксиизобутирата, адипиновой кислоты, 1,3-гександиола, 2-метил-2-бутанола, 2-бутен-1-ола, изовалерата и изоамилового спирта из субстрата. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk. Примеры ферментов приведены для каждого из этапов и ферментативных путей, подробно представленных на фиг. 1 и 34-36. Однако специалисту в данной области техники могут быть известны дополнительные подходящие ферменты.
Этап 1 отражает преобразование ацетил-Ко А в ацетоацетил-КоА. Указанный этап может быть катализирован тиолазой (т.е. ацетил-КоА-ацетилтрансферазой) (EC 2.3.1.9). Указанная тиолаза может представлять собой, например, ThlA из Clostridium, acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), PhaA из Cupriavidus necator (WP_013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB из Cupriavidus necator (WP_011615089.1) (SEQ ID NO: 3) или AtoB из Escherichia coli (NP_416728.1) (SEQ ID NO: 4). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 2 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в ацетоацетат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9), и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацилКоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12), и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрес- 4 043734 сия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 3 отражает преобразование ацетоацетата в ацетон. Указанный этап может быть катализирован ацетоацетатдекарбоксилазой (EC 4.1.1.4). Указанная ацетоацетатдекарбоксилаза может представлять собой, например, Adc из Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). Указанный этап может также быть катализирован альфа-кетоизовалератдекарбоксилазой (EC 4.1.1.74). Указанная альфакетоизовалератдекарбоксилаза может представлять собой, например, KivD из Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Кроме того, Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. В редких случаях преобразование ацетоацетата в ацетон может происходить спонтанно. Однако спонтанное преобразование очень неэффективно; маловероятно, что оно может приводить к продуцированию выходных продуктов на желаемых уровнях.
Этап 4 отражает преобразование ацетона в изопропанол. Указанный этап может быть катализирован первичной: вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.2). Указанная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
SecAdh из
Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh из Clostridium ljungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh из Clostridium ragsdalei (WPJH3239134.1) (SEQ ID NO: 18) или SecAdh из Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).
Указанный этап может также быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.80), такой как SecAdh из Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Однако Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Нокдаун или нокаут указанного фермента у Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei приводит к продуцированию и накоплению ацетона, а не изопропанола (WO 2015/085015).
Этап 5 отражает преобразование ацетона в 3-гидроксиизовалерат. Указанный этап может быть катализирован гидроксиизовалератсинтазой, например, гидроксиметилглутарил-КоА-синтазой (ГМГ-КоАсинтазой) (EC 2.3.3.10) из Mus musculus (SEQ ID NO: 21) (US 2012/0110001).
Гидроксиметилглутарил-КоА-синтаза может быть сконструирована таким образом, чтобы ее активность увеличивалась. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 6 отражает преобразование 3-гидроксиизовалерата в изобутилен (изобутен). Указанный этап может быть катализирован гидроксиизовалератфосфорилазой/декарбоксилазой. Указанный этап может также быть катализирован мевалонатдифосфатдекарбоксилазой (гидроксиизовалератдекарбоксилазой) (EC 4.1.1.33). Указанная мевалонатдифосфатдекарбоксилаза может представлять собой, например,
Mdd из Saccharomyces cerevisiae (САА96324.1) (SEQ ID NO:
22) или Mdd из Picrophilus torridus (WP_011178157.1) (SEQ ID NO: 23) (US 2011/0165644; van Leeuwen, ApplMicrobiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012).
Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 7 отражает преобразование ацетона в 3-гидроксиизовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксиизовалерил-КоА-синтазой. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 8 отражает преобразование 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3-гидроксиизовалерат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетической тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium, autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9) и (3) тиоэстераза
- 5 043734 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 9 отражает преобразование ацетил-КоА в 3-метил-2-оксопентаноат. Указанный этап охватывает ряд ферментативных реакций, вовлеченных в путь биосинтез изолейцина, который естественным образом присутствует у многих бактерий, в том числе Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (и Escherichia coli). Ферменты, вовлеченные в преобразование ацетил-КоА в 3-метил-2-оксопентаноат, могут включать цитрамалатсинтазу (EC 2.3.1.182), 3-изопропилмалатдегидратазу (EC 4.2.1.35), 3-изопропилмалатдегидрогеназу (EC 1.1.1.85), ацетолактатсинтазу (EC 2.2.1.6), кетол-кислотную редуктоизомеразу (EC 1.1.1.86) и/или дигидроксикислотную дегидратазу (EC 4.2.1.9). Указанная цитрамалатсинтаза может представлять собой, например, CimA из Clostridium autoethanogenum (AGY76958.1) (SEQ ID NO: 24) или CimA из Methanocaldococcus jannaschii (NP_248395.1) (SEQ ID NO: 25). Указанная 3-изопропилмалатдегидратаза может представлять собой, например, LeuCD из Clostridium autoethanogenum (WP_023162955.1, LeuC; AGY77204.1, LeuD) (последовательности SEQ ID NO: 26 и 27, соответственно) или LeuCD из Escherichia coli (NP_414614.1, LeuC; NP_414613.1, LeuD) (последовательности SEQ ID NO: 28 и 29, соответственно). Указанная 3изопропилмалатдегидрогеназа может представлять собой, например, LeuB из Clostridium autoethanogenum (WP_023162957.1) (SEQ ID NO: 30) или LeuB из Escherichia coli (NP_414615.4) (SEQ ID NO: 31). Указанная ацетолактатсинтаза может представлять собой, например, IlvBN из Clostridium autoethanogenum (AGY74359.1, IlvB; AGY74635.1, IlvB; AGY74360.1, IlvN) (последовательности SEQ ID NO: 32, 33 и 34, соответственно) или IlvBN из Escherichia coli (NP_418127.1, IlvB; NP_418126.1, IlvN) (последовательности SEQ ID NO: 35 и 36, соответственно). Указанная кетол-кислотная редуктоизомераза может представлять собой, например, IlvC из Clostridium autoethanogenum (WP_013238693.1) (SEQ ID NO: 37) или IlvC из Escherichia coli (NP_418222.1) (SEQ ID NO: 38). Указанная дигидроксикислотная дегидратаза может представлять собой, например, IlvD из Clostridium autoethanogenum (WP_013238694.1) (SEQ ID NO: 39) или IlvD из Escherichia coli (YP_026248.1) (SEQ ID NO: 40). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 10 отражает преобразование 3-метил-2-оксопентоаа в 2-метилбутаноил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кетоизовалератоксидоредуктазой (EC 1.2.7.7). Указанная кетоизовалератоксидоредуктаза может представлять собой, например, VorABCD из Methanothermobacter thermautotrophicus (WP_010876344.1, VorA; WP_010876343.1, VorB; WP_010876342.1, VorC; WP_010876341.1, VorD) (последовательности SEQ ID NO: 41-44, соответственно) или VorABCD из Pyrococcus furiosus (WP_011012106.1, VorA; WP_011012105.1, VorB; WP_011012108.1, VorC; WP_011012107.1, VorD) (последовательности SEQ ID NO: 45-48, соответственно). VorABCD представляет собой 4-субъединичный фермент. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 11 отражает преобразование 2-метилбутаноил-КоА в 2-метилкротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 2-метилбутаноил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.3.99.12). Указанная 2метилбутаноил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой, например, AcdH из Streptomyces avermitilis (AAD44196.1 или ВАВ69160.1) (SEQ ID NO: 49) или AcdH из Streptomyces coelicolor (AAD44195.1) (SEQ ID NO: 50). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 12 отражает преобразование 2-метилкротонил-КоА в 3-гидроксиизовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кротоназой/3-гидроксибутирил-КоА-дегидратазой (EC 4.2.1.55). Указанная кротоназа/3-гидроксибутирил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, Crt из Clostridium beijerinckii (ABR34202.1) (SEQ ID NO: 51), Crt из Clostridium acetobutylicum (Np_349318.1) (SEQ ID NO: 52) или LiuC из Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). Указанный этап может также быть катализирован кротонил-КоА-карбоксилазой-редуктазой (EC 1.3.1.86). Указанная кротонил-КоА-карбоксилаза
- 6 043734 редуктаза может представлять собой, например, Ccr из Treponema denticola (NP_971211.1) (SEQ ID NO: 53). Указанный этап может также быть катализирован кротонил-КоА-редуктазой (EC 1.3.1.44). Указанная кротонил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Ter из Euglena gracilis (AAW66853.1) (SEQ ID NO: 54). Указанный этап может также быть катализирован 3-гидроксипропионил-КоАдегидратазой (EC 4.2.1.116). Указанная 3-гидроксипропионил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, Msed_2001 из Metallosphaera sedula (WP_012021928.1). Указанный этап может также быть катализирован эноил-КоА-гидратазой. Указанная эноил-КоА-гидратаза (4.2.1.17) может представлять собой, например, YngF из Bacillus anthracis (WP_000787371.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 13 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.1.1.157). Указанная 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой, например, Hbd из Clostridium beijerinckii (WP_011967675.1) (SeQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NP_349314.1) (SEQ ID NO: 56) или Hbd1 из Clostridium kluyveri (WP_011989027.1) (SEQ ID NO: 57). Указанный этап может также быть катализирован ацетоацетил-КоА-редуктазой (EC 4.2.1.36). Указанная ацетоацетил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, PhaB из Cupriavidus necator (WP_010810131.1) (SEQ ID NO: 58). Указанный этап может также быть катализирован ацетоацетил-КоА-гидратазой (EC 4.2.1.119). Следует отметить, что PhaB является R-специфической, a Hbd является S-специфической. Кроме того, Hbd1 из Clostridium, kluyveri является НАДФН-зависимой, а Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 14 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. Указанный этап может быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9) и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 15 отражает преобразование 3-гидроксибутирата в ацетоацетат. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутиратдегидрогеназой (EC 1.1.1.30). Указанная 3-гидроксибутиратдегидрогеназа может представлять собой, например, Bdh1 из Ralstonia pickettii (ВАЕ72684.1) (SEQ ID NO: 60) или Bdh2 из Ralstonia pickettii (BAE72685.1) (SEQ ID NO: 61). Указанная обратная реакция, преобразование ацетоацетата в 3-гидроксибутират, может быть катализирована другими 3гидроксибутиратдегидрогеназными (EC 1.1.1.30) ферментами. Например, преобразование ацетоацетата в 3-гидроксибутират может быть катализировано Bdh из Clostridium autoethanogenum (AGY75962) (SEQ ID NO: 62). Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei предположительно содержат ферменты с аналогичной активностью. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 16 отражает преобразование 3-гидроксибутирата в 3-гидроксибутирилальдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза (AOR) может представлять собой, например, AOR из Clostridium autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (последовательности SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно) или AOR из Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (последовательности SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно). Согласно дополнительным вариантам реализации указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза, например, может представлять собой любой источник или может про
- 7 043734 исходить из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:
Описание | Микроорганизм | Номер доступа | GenelD |
альдегид: ферредо ксино ксидоре дуктаза | Acidilobus saccharovorans 345-15 | NC-014374.1 | 9498931 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Acidilobus saccharovorans 345-15 | NC__014374.1 | 9499504 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Acidilobus saccharovorans 345-15 | NC_014374.1 | 9499550 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Acidilobus saccharovorans 345-15 | NC_014374.1 | 9498997 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum boonei T469 | NC 013926.1 | 8828075 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum boonei T469 | NC 013926.1 | 8828511 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum boonei T469 | NC 013926.1 | 8828305 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum boonei T469 | NC 013926.1 | 8827762 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum boonei T469 | NC_013926.1 | 8827370 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum sp. A4AR08-339 | NC 019942.1 | 14306579 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum sp. MAR08-339 | NC 019942.1 | 14306982 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum sp. MAR08-339 | NC 019942.1 | 14306639 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aciduliprofundum sp. MAR08-339 | NC019942.1 | 14307339 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Aeropyrum pemix KI | NC 000854.2 | 1444491 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 | NC 000917.1 | 1483287 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 | NC_000917.1 | 1483233 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 | NC_000917.1 | 1483554 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 | NC_000917.1 | 1485513 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus profundus DSM 5631 | NCJH3741.1 | 8738726 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus profundus DSM 5631 | NC 013741.1 | 8740019 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 | NC 021169.1 | 15392228 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 | NC_021169.1 | 15393814 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 | NC_021169.1 | 15391826 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 | NC_021169.1 | 15393763 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 | NC_021169.1 | 15393491 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus veneficus SNP6 | NC_015320.1 | 10393142 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Archaeoglobus veneficus SNP6 | NC 015320.1 | 10395048 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldisphaera lagunensis DSM 15908 | NC_019791.1 | 14212403 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldisphaera lagunensis DSM 15908 | NCO19791.1 | 14211524 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldisphaera lagunensis DSM 15908 | NC__019791.1 | 14212092 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldisphaera lagunensis DSM 15908 | NC_019791.1 | 14212561 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldivirga maquilingensis IC-167 | NC 009954.1 | 5710116 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldivirga maquilingensis IC-167 | NC_009954.1 | 5710117 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldivirga maquilingensis IC-167 | NC 009954.1 | 5709088 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldivirga maquilingensis IC-167 | NC 009954.1 | 5708891 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldivirga maquilingensis IC-167 | NC 009954.1 | 5710478 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldivirga maquilingensis IC-167 | NC009954.1 | 5710457 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Caldivirga maquilingensis IC-167 | NC 009954.1 | 5709696 |
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Candidatus Caldiarchaeum | NC 022786.1 | 17602865 |
subterraneum | |||
шп>дегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Candidatus Korarchaeum cryptofilum | NC 010482.1 | 6094361 |
OPF8 | |||
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Candidatus Korarchaeum cryptofilum | NC 010482.1 | 6094198 |
OPF8 | |||
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Candidatus Korarchaeum cryptofilum | NC 010482.1 | 6093546 |
OPF8 | |||
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза | Candidatus Korarchaeum cryptofilum | NC010482.1 | 6093319 |
OPF8 |
- 8 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 | NC_010482.1 | 6094057 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 ' ' | NC_010482.1 | 6093563 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Chloroflexus aurantiacus J-10-fl | NC_010175.1 | 5828639 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | NC_003030.1 | 1118201 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Clostridium botulinum А, штамм ATCC 3502 | NC_009495.1 | 5187636 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Clostridium botulinum А, шт. Hall | NC_009698.1 | 5400593 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfovibrio vulgaris, шт. Hildenborough | NC_002937.3 | 2796664 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfovibrio vulgaris, шт. Hildenborough | NC_002937.3 | 2795337 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfurococcus fermentans DSM 16532 | NC-018001.1 | 13061477 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfurococcus fermentans DSM 16532 | NC_018001.1 | 13061068 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfurococcus fermentans DSM 16532 | NC_018001.1 | 13062247 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfurococcus kamchatkensis 1221η | NC_011766.1 | 7171099 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfurococcus kamchatkensis 1221η | NC_011766.1 | 7171759 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfurococcus kamchatkensis 1221η | NC_011766.1 | 7170725 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Desulfurococcus mucosus DSM 2162 | NCJ)14961.1 | 10152801 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ferroglobus placidus DSM 10642 | NC__013849.1 | 8778536 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ferroglobus placidus DSM 10642 | NC_013849.1 | 8779007 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ferroglobus placidus DSM 10642 | NC_013849.1 | 8778940 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ferroglobus placidus DSM 10642 | NC_013849.1 | 8779639 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ferroglobus placidus DSM 10642 | NC_013849.1 | 8778820 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ferroglobus placidus DSM 10642 | NC013849.1 | 8778745 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ferroglobus placidus DSM 10642 | NC__013849.1 | 8779874 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Fervidicoccus fontis Kam940 | NC_017461.1 | 12449263 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Fervidicoccus fontis Kam940 | NC-017461.1 | 12449994 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Fervidicoccus fontis Kam940 | NC-017461.1 | 12449294 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Fervidicoccus fontis Kam940 | NC_017461.1 | 12449682 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Geobacter sulfurreducens PCA | NC_002939.5 | 2685730 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Geobacter sulfurreducens PCA | NC_002939.5 | 2687039 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halalkalicoccus jeotgali B3 | NC-014297.1 | 9418623 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halalkalicoccus jeotgali B3 | NC_P 14297.1 | 9418760 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halalkalicoccus jeotgali B3 | NC_014297,1 | 9420819 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halalkalicoccus jeotgali B3 | NC_014297.1 | 9418748 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloarcula hispanica ATCC 33960 | NC_015948.1 | 11051410 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloarcula hispanica ATCC 33960 | NCP15948.1 | 11050783 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloarcula hispanica ATCC 33960 | NC_015948.1 | 11051433 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloarcula hispanica N601 | NC_023013.1 | 23805333 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloarcula hispanica N601 | NC-023013.1 | 23805138 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloarcula hispanica N601 | NC_023013.1 | 23804665 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloarcula marismortui ATCC 43049 | NC__006396.1 | 3127969 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloarcula marismortui ATCC 43049 | NC_006396.1 | 3129232 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloferax mediterranei ATCC 33500 | NCP17941.2 | 13028168 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloferax mediterranei ATCC 33500 | NC_017941.2 | 13028399 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloferax volcanii DS2 | NCP13964.1 | 8919329 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloferax volcanii DS2 | NC_013964.1 | 8919033 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloferax volcanii DS2 | NC_013967.1 | 8926544 |
- 9 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halogeometricum borinquense DSM 11551 | NC_014735.1 | 9989054 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halogeometricum borinquense DSM 11551 | NC_014729.1 | 9994424 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halogeometricum borinquense DSM 11551 | NC_014729.1 | 9992444 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | галофильная архея DL31 | NC__015954.1 | 11095016 |
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза | галофильная архея DL31 | NC__015954.1 | 11095541 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | галофильная архея DL31 | NC_015954.1 | 11094595 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | галофильная архея DL31 | NC__015954.1 | 11096497 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | галофильная архея DL31 | NC_015954.1 | 11094563 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | галофильная архея DL31 | NC__015954.1 | 11095602 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halopiger xanaduensis SH-б | NC__015666.1 | 10799161 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halopiger xanaduensis SH-б | NC_015658.1 | 10795465 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halopiger xanaduensis SH-6 | NC_015666.1 | 10798686 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Halopiger xanaduensis SH-6 | NC_015666.1 | 10796679 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 | NC_012029.1 | 7400122 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 | NC__012029.1 | 7400291 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 | NC__012029.1 | 7400689 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloterrigena turkmenica DSM 5511 | NC_013744.1 | 8744461 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloterrigena turkmenica DSM 5511 | NC__013744.1 | 8744695 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloterrigena turkmenica DSM 5511 | NC__013743.1 | 8740954 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloterrigena turkmenica DSM 5511 | NC__013745.1 | 8745418 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Haloterrigena turkmenica DSM 5511 | NC_013743.1 | 8742968 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloterrigena turkmenica DSM 5511 | NQ013743.1 | 8741246 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloterrigena turkmenica DSM 5511 | NC__013743.1 | 8741269 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Haloterrigena turkmenica DSM 5511 | NC_013745.1 | 8745313 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Hyperthermus butilicus DSM 5456 | NC_008818.1 | 4781896 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Hyperthermus butilicus DSM 5456 | NC_008818.1 | 4782266 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Hyperthermus butilicus DSM 5456 | NC-008818.1 | 4782804 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Hyperthermus butilicus DSM 5456 | NC_008818.1 | 4781774 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ignicoccus hospitalis ΚΙΝ4/Ί | NC__009776.1 | 5562477 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ignicoccus hospitalis ΚΙΝ4/Ί | NC009776.1 | 5562774 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Ignisphaera aggregans DSM 17230 | NC__014471.1 | 9716798 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanocaldococcusjannaschii DSM 2661 | NC_000909.1 | 1452083 |
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanocella arvoryzae MRE50 | NC__009464.1 | 5142690 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanocella arvoryzae MRE50 | NC-009464.1 | 5143773 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanocella conradii HZ254 | NC_017034.1 | 11972399 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanocella conradii HZ254 | NC__017034.1 | 11971349 |
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanocella paludicola SANAE | NC__013665.1 | 8680711 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanocella paludicola SANAE | NC013665.1 | 8680676 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanocorpusculum labreanum Z | NC_008942.1 | 4795790 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanoculleus marisnigri JR1 | NC_009051.1 | 4847673 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanohalobium evestigatum Z-7303 | NC_014253.1 | 9347460 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanohalobium evestigatum Z-7303 | NC-014253.1 | 9347022 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanolobus psychrophilus RI 5 | NC-018876.1 | 13845119 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Methanomethylovorans hollandica DSM 15978 | NC-019977.1 | 14408029 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Methanosaeta harundinacea 6Ac | NC-017527.1 | 12511443 |
- 10 043734 альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид: ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза
Methanosaeta thermophila PT Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina barkeri, шт. Fusaro Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl
Methanosphaerula palustris El-9c Methano spirillum hungatei JF-1 Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema sp. J7-2
Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4
Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Pyrobaculum aerophilum, шт. IM2 Pyrobaculum aerophilum, шт. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, шт. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, шт. IM2 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514
NC_008553.1
NC_015676.1
NC__003552.1
NC_003552.1
NC_003552.1
NCJ)07355.1
NC_003901.1
NC-003901.1
NC003901.1
NC_020389.1
NC-020389.1
NC__020389.1
NC_011832.1
NC__007796.1
NC_016112.1
NC_007644.1
NC_007644.1
NC_007644.1
NC-013922.1
NC-013922.1
NC__013 923.1
NC__013922.1
NC_019962.1
NC_019962.1
NC__019962.1
NC-018224.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NCJH9974.1
NC019974.1
NCJH9974.1
NC__019974.1
NC-020388.1
NC-020388.1
NC_020388.1
NC__007427.1
NC-007426.1
NC__007426.1
NC__007426.1
NC__003364.1
NC-003364.1
NC_003364.1
NC-003364.1
NC-009376.1
NC-009376.1
NC_009376.1
4462364 10822365 1475882 1474856 1473602 3625763 1479263 1481668 1480987 14656065 14656771 14654304 7271108 3924565 11361147 3831332 3830998 3831866 8824961 8823392 8826737 8825516 14335278 14333050 14333754 13349954 14210296 14207133 14209682 14207576 14206941 14206532 14403316 14405255 14403781 14402014 14651997 14652892 14651999 3694680 3702508 3702507 3702509 1464236 1464102 1465126 1465445 5055904 5055700 5054881
- 11 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum arsenaticum DSM13514 | NC_009376.1 | 5054644 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 | NC 009376.1 | 5054547 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum calidifontis JCM11548 | NC_009073.1 | 4910224 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 | NC_009073.1 | 4908822 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 | NC_009073.1 | 4909927 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 | NC_009073.1 | 4910099 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum islandicum DSM 4184 | NC 008701.1 | 4617364 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum islandicum DSM 4184 | NC_008701.1 | 4616724 |
альдегид :ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum islandicum DSM 4184 | NC 008701.1 | 4617494 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum neutrophilum V24Sta | NC_010525.1 | 6165427 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum neutrophilum V24Sta | NC_010525.1 | 6164958 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum neutrophilum V24Sta | NC_010525.1 | 6164976 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum oguniense TE7 | NC__016885.1 | 11853778 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum oguniense TE7 | NC_016885.1 | 11854024 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum oguniense TE7 | NC_016885.1 | 11856490 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum oguniense TE7 | NC_016885.1 | 11856176 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum oguniense ΊΈ7 | NC_016885.1 | 11854908 |
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum sp. 1860 | NC_016645.1 | 11594868 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum sp. 1860 | NC_016645.1 | 11596631 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrobaculum sp. 1860 | NC_016645.1 | 11594049 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus abyssi GE5 | NC_000868.1 | 1496313 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus abyssi GES | NC_000868.1 | 1495669 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus abyssi GE5 | NC_000868.1 | 1496580 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus abyssi GE5 | NC_000868.1 | 1495287 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus furiosus GOMI | NC_018092.1 | 13302148 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus furiosus GOMI | NC_018092.1 | 13301806 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus furiosus COM1 | NC_018092.1 | 13301219 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus furiosus GOMI | NC_018092.1 | 13300785 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus furiosus DSM 3638 | NC-003413.1 | 1468181 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus furiosus DSM 3638 | NC_003413.1 | 1469073 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus fiiriosus DSM 3638 | NC_003413.1 | 1469843 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus horikoshii OT3 | NC_000961.1 | 1443218 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus horikoshii OT3 | NC_000961.1 | 1443341 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus horikoshii OT3 | NC000961.1 | 1443932 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus horikoshii OT3 | NC_000961.1 | 1443598 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus sp. NA2 | NC_015474.1 | 10555029 |
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus sp. NA2 | NC__015474.1 | 10554020 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus sp. NA2 | NCJ)15474.1 | 10555341 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus sp. ST04 | NC_017946.1 | 13022107 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus sp. ST04 | NC_017946.1 | 13022436 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus sp. ST04 | NC-017946.1 | 13021314 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus yayanosii CH1 | NC_015680.1 | 10837518 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus yayanosii CH1 | NC_015680.1 | 10837112 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrococcus yayanosii CH1 | NC_015680.1 | 10837264 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrolobus fumarii 1A | NC_015931.1 | 11138144 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrolobus fumarii 1A | NCJ115931.1 | 11138776 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Pyrolobus fumarii 1A | NC_pi5931.1 | 11139127 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 | NC_007643.1 | 3833668 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Staphylothermus hellenicus DSM 12710 | NC_014205.1 | 9234557 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Staphylothermus hellenicus DSM 12710 | NC_014205.1 | 9233414 |
- 12 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Staphylothermus hellenicus DSM12710 | NC 014205.1 | 9234134 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Staphylothermus hellenicus DSM 12710 | NC 014205.1 | 9234110 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Staphylothermus marinus Fl | NC 009033.1 | 4907444 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Staphylothermus marinus Fl | NC_009033.1 | 4907343 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 | NC 013522.1 | 8630284 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 | NC_013522.1 | 8630027 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 | NC_013522.1 | 8630623 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.Bl | NC 015958.1 | 11082596 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus barophilus MP | NC__014804.1 | 10041639 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus barophilus MP | NC__014804.1 | 10041106 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus barophilus MP | NC_014804.1 | 10042460 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus cleftensis | NC_018015.1 | 13037745 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus cleftensis | NC_018015.1 | 13038896 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus cleftensis | NC_018015.1 | 13037242 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus gammatolerans EJ3 | NC__012804.1 | 7988317 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза. | Thermococcus gammatolerans EJ3 | NC_012804.1 | 7987451 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus kodakarensis KOD1 | NC-006624.1 | 3233851 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus kodakarensis KOD1 | NC-006624.1 | 3233735 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus litoralis DSM 5473 | NC_022084.1 | 16550741 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus litoralis DSM 5473 | NC_022084.1 | 16548761 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus litoralis DSM 5473 | NC-022084.1 | 16550885 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus onnurineus NAI | NC__011529.1 | 7018383 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus onnurineus NAI | NC__011529.1 | 7016739 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus onnurineus NAI | NC011529.1 | 7017051 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus onnurineus NAI | NC_011529.1 | 7017476 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sibiricus MM 739 | NC_012883.1 | 8096638 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sibiricus MM 739 | NC_012883.1 | 8096005 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sibiricus MM 739 | NC_012883.1 | 8096629 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sibiricus MM 739 | NC_012883.1 | 8095463 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sibiricus MM 739 | NC__012883.1 | 8096131 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sibiricus MM 739 | NC__012883.1 | 8096636 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sp. 4557 | NQ015865.1 | 11015504 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sp. 4557 | NC_015865.1 | 11015249 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sp. 4557 | NC_015865.1 | 11015571 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sp. AM4 | NC__016051.1 | 7419050 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sp. AM4 | NC__016051.1 | 7418514 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermococcus sp. AM4 | NC__016051.1 | 7420292 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 | NC__011296.1 | 6941429 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 ' | NC_011296.1 | 6943174 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 ' | NC_011296.1 | 6941905 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Thermofilum pendens Hrk 5 | NC_008698.1 | 4602054 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermofilum pendens Hrk 5 | NC_008698.1 | 4601386 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermofilum pendens Hrk 5 | NCJ)08698.1 | 4600878 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Thermofilum pendens Hrk 5 | NC_008698.1 | 4600730 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermofilum sp. 1910b | NC_022093.1 | 16572780 |
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза | Thermofilum sp. 1910b | NC_022093.1 | 16572926 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermofilum sp. 1910b | NC_022093.1 | 16573009 |
- 13 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermofilum sp. 1910b | NC_022093.1 | 16574342 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermogladius cellulolyticus 1633 | NC_017954.1 | 13012904 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoplasma acidophilum DSM1728 | NC__002578.1 | 1456355 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoplasma acidophilum DSM 1728 | NC__002578.1 | 1456646 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoplasma volcanium GSS1 | NC 002689.2 | 1441901 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoplasma volcanium GSS1 | NC_002689.2 | 1441379 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoproteus tenax Kra 1 | NC_016070.1 | 11262174 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoproteus tenax Kra 1 | NC__016070.1 | 11262275 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoproteus tenax Kra 1 | NC 016070.1 | 11262652 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoproteus tenax Kra 1 | NC 016070.1 | 11262926 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoproteus uzoniensis 768-20 | NC 015315.1 | 10361668 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoproteus uzoniensis 768-20 | NC_015315.1 | 10361250 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermoproteus uzoniensis 768-20 | NC_pi5315.1 | 10360972 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermosphaera aggregans DSM 11486 | NC_014160.1 | 9165115 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermosphaera aggregans DSM 11486 | NC 014160.1 | 9165462 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermus thermophilus HB8 | NC 006461.1 | 3168554 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Thermus thermophilus HB8 | NC 006461.1 | 3168612 |
альдегид:ферредоксиноксидоред}гктаза | Vulcanisaeta distributa DSM 14429 | NC014537.1 | 9753145 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta distributa DSM 14429 | NC_014537.1 | 9750947 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta distributa DSM 14429 | NC 014537.1 | 9750989 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta distributa DSM 14429 | NC_014537.1 | 9753486 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta distributa DSM 14429 | NCJH4537.1 | 9751414 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 | NC 015151.1 | 10288238 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 | NC_pi5151.1 | 10288894 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 | NC_015151.1 | 10288574 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 | NC_015151.1 | 10288827 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 | NC 015151.1 | 10288607 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 | NC_015151.1 | 10288523 |
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза | Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 | NC 015151.1 | 10288815 |
AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СО-дегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Сшт Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые негативные продукты.
Этап 17 отражает преобразование 3-гидроксибутирилальдегида в 1,3-бутандиол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или
Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из
Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum. (NP 149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
- 14 043734
Этап 18 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутирилальдегид. Указанный этап может быть катализирован бутиральдегиддегидрогеназой (EC 1.2.1.57). Указанная бутиральдегиддегидрогеназа может представлять собой, например, Bld из Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 19 отражает преобразование 3-гадроксибутирил-КоА в 2-гидроксиизобутирил-КоА.
Указанный этап может быть катализирован 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазой (EC 5,4.99.-). Указанная 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутаза может представлять собой, например, HcmAB из Aquincola tertiaricarbonis (AFK77668.1, большая субъединица; AFK77665.1, малая субъединица) (последовательности SEQ ID NO: 81 и 82, соответственно) или HcmAB из Kyrpidia tusciae (WP_013074530.1, большая субъединица; WP_013074531.1, малая субъединица) (последовательности SEQ ID NO: 83 и 84, соответственно). Было описано улучшение активности HcmAB шапероном MeaB (AFK77667.1, Aquincola tertiaricarbonis; WP_013074529.1, Kyrpidia tusciae) (последовательности SEQ ID NO: 85 и 86, соответственно) путем реактивации HcmAB, хотя MeaB не является необходимым для функции HcmAB, (Yaneva, J Biol Chem, 287: 15502-15511, 2012). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 20 отражает преобразование 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2-гидроксиизобутират. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+ бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 21 отражает преобразование ацетил-КоА в сукцинил-КоА. Указанный этап охватывает ряд ферментативных реакций, вовлеченных в восстановительный ЦТК-путь, который естественным образом присутствует во многих бактериях, в том числе Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (и Escherichia coli) (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014; патент США № 9297026). Ферменты, вовлеченные в преобразование ацетил-КоА в сукцинил-КоА, могут включать пируват:ферредоксиноксидоредуктазу (PFOR) (EC 1.2.7.1), пируваткарбоксилазу (PYC) (EC 6.4.1.1), маликфермент/малатдегидрогеназу (EC 1.1.1.38, ЕС 1.1.1.40), пируватфосфатдикиназу (PPDK) (ЕС:2.7.9.1), РЕР-карбоксикиназу (PCK) (EC 4.1.1.49), фумаратгидратазу/фумаразу (EC 4.2.1.2), фумаратредуктазу (EC 1.3.5.1)/сукцинатдегидрогеназу (EC 1.3.5.4) и сукцинил-КоА-синтетазу (EC 6.2.1.5). Указанная пируват:ферредоксиноксидоредуктаза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY75153, AGY77232) или Escherichia coli (NP_415896). Пируваткарбоксилаза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY75817). Указанная малик-фермент/малатдегидрогеназа может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76687) или Escherichia coli (NP_416714, NP_417703). Указанная пируватфосфатдикиназа (PPDK) может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76274, AGY77114). Указанная РЕР-карбоксикиназа (PCK) может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76928) или Escherichia coli (NP_417862). Указанная фумаратгидратаза/фумараза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76121, AGY76122) или Escherichia coli (NP_416128, NP_416129, NP_418546). Указанная фумаратредуктаза/сукцинатдегидрогеназа может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY74573, AGY74575, AGY75257, AGY77166) или Escherichia coli (NP_415249, NP_415250, NP_415251, NP_415252, NP_418575, NP_418576, NP_418577, NP_418578). Указанная сукцинил-КоАсинтетаза может происходить, например, из Escherichia coli (NP_415256, NP_415257).
Этап 22 отражает преобразование ацетил-КоА и сукцинил-КоА в 3-оксоадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован Р-кетоадипил-КоА-тиолазой (EC 2.3.1.16). Указанная кетоизовалератоксидоредуктаза может представлять собой, например, PaaJ из Escherichia coli (WP_001206190.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 23 отражает преобразование 3-оксо-адипил-КоА в 3-гидроксиадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.1.1.157) или ацетоацетил-КоАгидратазой (EC 4.2.1.119). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегадрогеназа или ацетоацетил-КоАгидратаза может представлять собой, например,
Hbd из Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NPJ49314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl из Clostridium kluyveri (WP 011989027.1) (SEQ ID NO: 57) или PaaHl из Cupriavidus necator (WP 010814882.1).
Следует отметить, что PhaB является R-специфической и Hbd является S-специфической. Кроме то- 15 043734 го, Hbd1 из Clostridium kluyveri является НАДФЫ-зависимой, a Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и
Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 24 отражает преобразование 3-гидроксиадипил-КоА в 2,3-дегидроадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован эноил-КоА-гидратазой (ЕС: 4,2.1.17) или эноил-КоА-редуктазой (ЕС: 1,3.1.38). Указанная эноил-КоА-гидратаза или эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, CrtH3C. acetobutylicum (032472) (Seq. ID No. 52). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 25 отражает преобразование 2,3-дегидроадипил-КоА в адипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован транс-2-эноил-КоА-редуктазой (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Указанная транс-2-эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Bcd из С. acetobutylicum (NP_349317.1), которая образует комплекс с флавопротеинами электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr из Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr из Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter из Treponema denticola (NP_971211.1) или Ter из Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 26 отражает преобразование адипил-КоА в адипиновую кислоту. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 27 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в кротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кротонил-КоА-гидратазой (кротоназой) (EC 4.2.1.17) или кротонил-КоА-редуктазой (EC 1.3.1.38). Указанная кротонил-КоА-гидратаза (кротоназа) или кротонил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, клин' acetobutylicum (NP_349318.1) (SEQIDNO:52) или PhaJ из Aeromonas caviae (032472). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 28 отражает преобразование кротонил-КоА в кротонат. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 29 отражает преобразование кротоната в кротональдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СОдегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Curr Opin Bioteclmol 22: 320-325, 2011; Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Была продемонстрирована активность AOR Pyrococcus furiosus в отношении преобразования кротональдегида и кротоната (Loes, J Bacteriol, 187: 7056-7061, 2005). Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорга- 16 043734 низму продуцировать новые ненативные продукты.
Этап 30 отражает преобразование кротональдегида в 2-бутен-1-ол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID
NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или Clostridium ragsdalei, BdhB из
Clostridium acetobutylicum (NP 349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO:
71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium
Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из
Clostridium acetobutylicum (NP_149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ
ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназа или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 31 отражает преобразование кротонил-КоА в бутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован бутирил-КоА-дегидрогеназой или транс-2-эноил-КоА-редуктазой (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Указанная бутирил-КоА-дегидрогеназа или транс-2-эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Bcd из С. acetobutyiicum (NP_349317.1), которая образует комплекс с флавопротеинами электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr из Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr из Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter из Treponema denticola (NP_971211.1) или Ter из Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 32 отражает преобразование бутирил-КоА в ацетобутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован тиолазой или ацил-КоА-ацетилтрансферазой (EC 2.3.1.9). Указанная тиолаза может представлять собой, например,
ТЫА из Clostridium acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), ThlAl из Clostridium kluyveri (EDK35681), ТЫА2 из Clostridium kluyveri (EDK35682), ТЫАЗ из Clostridium, kluyveri (EDK35683), PhaA из Cupriavidus necator (WP 013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB из Cupriavidus necator (WPJH1615089.1) (SEQ ID NO: 3) или AtoB из Escherichia coli (NP 416728.1) (SEQ ID NO: 4).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 33 отражает преобразование ацетобутирил-КоА в ацетобутират. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 34 отражает преобразование ацетобутирата в ацетилацетон. Указанный этап может быть катализирован ацетоацетатдекарбоксилазой (EC 4.1.1.4). Указанная ацетоацетатдекарбоксилаза может представлять собой, например, Adc из Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). Указанный этап может также быть катализирован альфа-кетоизовалератдекарбоксилазой (EC 4.1.1.74). Указанная альфа-кетоизовалератдекарбоксилаза может представлять собой, например, KivD из Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Кроме того, Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. В редких случаях преобразование ацетоацетата в ацетон может происходить спонтанно. Однако спонтанное преобразование
- 17 043734 очень неэффективно; маловероятно, что оно может приводить к продуцированию выходных продуктов на желаемых уровнях.
Этап 35 отражает преобразование ацетилацетона в 3-метил-2-бутанол. Указанный этап может быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.2). Указанная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
SecAdh из
Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh из Clostridium Ijungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh из Clostridium ragsdalei (WP013239134.1) (SEQ ID NO: 18) или SecAdh из Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).
Указанный этап может также быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.80), такой как SecAdh из Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Однако Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Нокдаун или нокаут указанного фермента у Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei приводит к продуцированию и накоплению ацетилацетона, а не 3-метил-2-бутанола (WO 2015/085015).
Этап 36 отражает преобразование ацетобутирил-КоА в 3-гидроксигексаноил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидротеназой (EC 1.1.1.157) или ацетоацетил-КоАгидратазой (EC 4.2.1.119). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа или ацетоацетил-КоАгидратаза может представлять собой, например,
Hbd из Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NP 349314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl из Clostridium kluyveri (WP011989027.1) (SEQ ID NO: 57), Hbd2 из Clostridium kluyveri (EDK34807) или PaaHl из Cupriavidus necator (WP 010814882.1).
Следует отметить, что PhaB является R-специфической и Hbd является S-специфической. Кроме того, Hbd1 из Clostridium kluyveri является НАДФН-зависимой, a Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 37 отражает преобразование 3-гидроксигексаноил-КоА в 3-гидроксигексаноат. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+ бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 38 отражает преобразование 3-гидроксигексаноата в 1,3-гексальдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СОдегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Curr Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые ненативные продукты.
Этап 39 отражает преобразование 1,3-гексальдегида в 1,3-гександиол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
- 18 043734
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 40 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА. Указанный этап может быть катализирован гидроксиметилглутарил-КоА-синтазой (ГМГ-КоА-синтазой) (EC 2.3.3.10). ГМГ-КоА-синтазы распространены во многих родах и царствах жизни и включают, например, MvaS из Staphylococcus aureus (WP_053014863.1), ERG13 из Saccharomyces cerevisiae (NP_013580.1), HMGCS2 из Mus musculus (NP_032282.2) и многих других представителей группы ферментов ЕС 2.3.3.10. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 41 отражает преобразование 3-гидрокси-3-метилглютаноил-КоА в 3-метилглюконил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидратазой (EC 4.2.1.55). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, LiuC из Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). Указанный этап может также быть катализирован короткоцепочечной эноилКоА-гидратазой (EC 4.2.1.150) или эноил-КоА-гидратазой (EC 4.2.1.17). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 42 отражает преобразование 3-метилглюконил-КоА в 2-метилкротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован метилкротонил-КоА-декарбоксилазой (обладающей высоким структурным сходством с глютаконат-КоА-трансферазой (EC 2.8.3.12)), например, aibAB из Myxococcus xanthus (WP_011554267.1 и WP_011554268.1). Указанный этап может также быть катализирован метилкротоноил-КоА-карбоксилазой (EC 6,4.1.4), например, LiuDB из Pseudomonas aeruginosa (NP_250702.1 и NP_250704.1) или МССА и МССВ из Arabidopsis thaliana (NP_563674.1 и NP_567950.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 43 отражает преобразование метилкротонил-КоА в изовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован оксидоредуктазой, цинк-связывающей дегидрогеназой. Указанный оксидоредуктаза, цинк-связывающая дегидрогеназа может представлять собой, например, AibC из Myxococcus xanthus (WP_011554269.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 44 отражает преобразование изовалерил-КоА в изовалерат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9), и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетической тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацилКоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная
- 19 043734 тиоэстераза; SEQ ID NO: 12), и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 45 отражает преобразование изовалерата в изовалеральдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза (AOR) может представлять собой, например, AOR из Clostridium. autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (последовательности SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно) или AOR из Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (последовательности SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно). Дополнительные примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые негативные продукты.
Этап 46 отражает преобразование изовалеральдегида в изоамиловый спирт. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
Adh из Clostridium autoethanogenum (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или
Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP_023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 47 отражает преобразование изовалерил-КоА в изовалеральдегид. Указанный этап может быть катализирован бутиральдегиддегидрогеназой (EC 1.2.1.57). Указанная бутиральдегиддегидрогеназа может представлять собой, например, Bld из Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei предположительно не обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Обзор Ptb-Buk
Согласно настоящему изобретению предложены новые пути, задействующие ферментную систему Ptb-Buk. В природе указанная ферментная система обнаруживается у ряда продуцирующих бутират микроорганизмов, такие как продуцирующие бутират Clostridia или Butyrivibrio. В частности, фосфатбутирилтрансфераза (Ptb) (EC 2.3.1.19) естественным образом катализирует реакцию бутаноила-КоА и фосфата с образованием КоА+бутаноилфосфата и бутираткиназы (Buk) (EC 2.7.2.7) естественным образом катализирует реакцию бутаноилфосфата и АДФ с образованием бутирата (бутаноата) и АТФ. Соответственно, указанные ферменты совместно (Ptb-Buk) естественным образом катализируют преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерируют одну молекулу АТФ посредством субстратного фосфорилирования (фиг. 2). Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной и
- 20 043734 способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, PtbBuk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ. Было описано, что Ptb активна в отношении диапазона ацил-КоА, в том числе ацетоацетил-КоА, in vitro (Thompson, Appl Environ Microbiol, 56: 607-613, 1990). Ранее не было показано, что ацетоацетил-фосфат может быть субстратом Buk. Хотя известно, что Buk воспринимает широкий диапазон субстратов (Liu, Appl Microbiol Biotechnol, 53: 545552, 2000), активность in vivo не была показана.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение экзогенной Ptb-Buk позволяет определенным микроорганизмам продуцировать подходящие продукты, в том числе ацетон, изопропанол, изобутилен, 3-гидроксибутират, 1,3-бутандиол и 2-гидроксиизобутират, а также другие продукты такие как пропионат, капроат и октонат.
Новые пути на основе Ptb-Buk обеспечивают ряд значимых преимуществ по сравнению с другими известными существующими маршрутами продуцирования продуктов, основанными на КоАтрансферазе - как в классическом клостридиалъном ферментативном пути ацетон-бутанол-этанол (ABE) или тиоэстеразе (Jones, Microbiol Rev, 50: 484-524, 1986; Matsumoto, Appl Microbiol Biotechnol, 97: 205210, 2013; May, Metabol Eng, 15: 218-225, 2013) (фиг. 3). В частности, указанные новые пути (1) не зависят от присутствия или продуцирования конкретных молекул, таких как органические кислоты, например, бутирата или ацетата, необходимых для КоА-трансферазной реакции, и (2) обеспечивают генерацию АТФ посредством субстратного фосфорилирования, не сохраняющуюся при тиоэстеразной или КоАтрансферазной реакции. Те же преимущества присутствуют при применении системы Ptb-Buk для других реакций, таких как преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. Соответственно, указанные новые пути отличаются потенциально значительно большими титрами продукции и скоростями за счет генерации дополнительной энергии и продуцирования целевых продуктов без ко-продукции нежелательных побочных продуктов, таких как ацетат.
Нежелательно, в частности, при промышленном масштабе, чтобы микроорганизмы продуцировали ацетат (или другие органические кислоты, необходимые для КоА-трансферазной реакции) в качестве побочного продукта, поскольку ацетат перенаправляет углерод от целевых продуктов и, соответственно, влияет на эффективность и выход целевых продуктов. Кроме того, ацетат может быть токсическим для микроорганизмов и/или может служить в качестве субстрата для роста загрязняющих микроорганизмов. Кроме того, присутствие ацетата усложняет выделение и разделение целевых продуктов и контроль за условиями ферментации, благоприятствующими получению целевых продуктов.
Генерация АТФ по механизму субстратного фосфорилирования может применяться в качестве движущей силы для синтеза продуктов, в частности, в ограниченных по АТФ системах. В частности, ацетогенные бактерии, как известно, живут на термодинамическом пределе существования (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014). Соответственно, продуцирование ацетата было описано у всех ацетогенных микроорганизмов, выделенных к настоящему времени (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, pages 354-420, New York, NY, Springer, 2006), поскольку продуцирование ацетата обеспечивает микроорганизму возможность прямо генерировать АТФ при субстратном фосфорилировании с помощью Pta (фосфотрансацетилазы) (EC 2.3.1.8) и Ack (ацетаткиназы) (EC 2.7.2.1). Несмотря на наличие механизмов сохранения АТФ в указанных микроорганизмах, такие как мембранные градиенты и электроразделительные ферменты, сопряженные с системами переноса ионов или протонов, например, Rnf-комплекс (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), прямая генерация АТФ остается критически важной для их выживания. В результате при введении гетерологичных путей, не позволяющих генерировать АТФ, происходит продуцирование ацетата в качестве побочного продукта (Schiel-Bengelsdorf, FEBS Lett, 586: 2191-2198, 2012). Однако пути Ptb-Buk, описанные в настоящем документе, обеспечивают альтернативный механизм генерации АТФ для микроорганизма по механизму субстратного фосфорилирования и, соответственно, позволяют избежать продуцирования ацетата. В частности, ацетат-образующие ферменты, такие как Pta-Ack, которые в ином случае имели бы существенное значение (Nagarajan, Microb Cell Factories, 12:118, 2013), могут быть заменены на Ptb-Buk в качестве альтернативного способа генерации АТФ. Поскольку после этого микроорганизм может генерировать АТФ за счет Ptb-Buk, указанная система предоставляет движущую силу, обеспечивающую максимальный поток через новые пути, задействующие Ptb-Buk. Генерация АТФ может также быть критически важным для нижерасположенных путей, требующих АТФ. Например, ферментативное продуцирование изобутилена из ацетона требует АТФ. Хотя полный путь от ацетил-КоА к изобутилену потребляет АТФ при использовании КоА-трансферазы или тиоэстеразы, при использовании Ptb-Buk указанный путь является энергетически нейтральным.
Приведены примеры источников Ptb и Buk. Однако следует понимать, что могут быть доступны другие подходящие источники Ptb и Buk. Кроме того, Ptb и Buk могут быть сконструированы для улучшения активности, и/или гены, кодирующие Ptb-Buk, могут быть кодон-оптимизированы для экспрессии, в частности, в микроорганизмах-хозяевах.
Фосфатбутирилтрансфераза может представлять собой любой источник или может происходить, например, из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:
- 21 043734
Описание | Микроорганизм | Номер доступа |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | EKQ52186 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 009167896 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium saccharoperbutylacetonicum | WP_015390396 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium saccharobutylicum | WP 022743598 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium beijerinckii | WP 026886639 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium beijerinckii | WP 041893500 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium butyricum | WP_003410761 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | CDB14331 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium botulinum | WP 049180512 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | CDB74819 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium paraputrificum | WP 027098882 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 024615655 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium celatum | WP 005211129 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium baratii | WP 039312969 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium intestinale | WP 021800215 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 042402499 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP_032117069 |
- 22 043734
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium perfringens | ABG85761 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium botulinum | WP_003374233 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium perfringens | WP 004460499 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium perfringens | WP 003454254 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium perfringens | WP_041707926 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium perfringens | BAB82054 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 008681116 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium chauvoei | WP 021876993 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium colicanis | WP 002598839 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium cadaveris | WP_027637778 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium acetobutylicum | WP__010966357 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium pasteurianum | WP015617430 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium arbusti | WP 010238988 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium pasteurianum | WP 003445696 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium scatologenes | WP 029160341 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 032120461 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium drakei | WP 032078800 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP_021281241 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium argentinense | WP 039635970 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium akagii | WP 026883231 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 053242611 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridi um carb oxi div orans | WP 007063154 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP„03 5292411 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sulfidigenes | WP__035133394 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium tetanomorphum | WP 035147564 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium hydrogeniformans | WP 027633206 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 040212965 |
фосфатбутирилтрансфераза | Candidatus Clostridium | WP__040327613 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 040192242 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP__050606427 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium lundense | WP 027625137 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium algidicarnis | WP 029451333 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP035306567 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium acetobutylicum | AAA75486 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium botulinum | WP 025775938 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium botulinum | WP 045541062 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium botulinum | WP003357252 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium botulinum | WP 030037192 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium bornimense | WP 044039341 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium botulinum | WP_041346554 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 053468896 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия порядка Clostridiales | WP 034572261 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium tetani | WP 023439553 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия порядка Clostridiales | ERI95297 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium botulinum | WPJ147403027 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium tetani | WP_011100667 |
- 23 043734
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium tetani | WP_035111554 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium senegalense | WP_010295062 |
фосфатбутирилтрансфераза | Caloramator sp. | WP__027307587 |
фосфатбутирилтрансфераза | Thermobrachium celere | WP_018661036 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium cellulovorans | WP_010073683 |
фосфатбутирилтрансфераза | Coprococcus comes | CDB84786 |
фосфатбутирилтрансфераза | Coprococcus comes | WP008371924 |
фосфатбутирилтрансфераза | Eubacterium sp. | CCZ03827 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | CCZ05442 |
фосфатбутирилтрансфераза | Caloramator australicus | WP008907395 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | CCY59505 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP_035626368 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP_027440767 |
фосфатбутирилтрансфераза | Fervidicella metallireducens | WP035381340 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | CCX89274 |
фосфатбутирилтрансфераза | Eubacterium xylanophilum | WP026834525 |
фосфатбутирилтрансфераза | Roseburia sp. | CDF44203 |
фосфатбутирилтрансфераза | Butyrivibrio crossotus | WP005600912 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP_027117626 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | CDA68345 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия семейства LJeptostreptococcaceae | WP026899905 |
фосфатбутирилтрансфераза | Butyrivibrio crossotus | CCY77124 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | CDE44914 |
фосфатбутирилтрансфераза | Coprococcus eutactus | WP_004853197 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия Firmicutes | CCY23248 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP027111007 |
фосфатбутирилтрансфераза | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP_016293387 |
фосфатбутирилтрансфераза | Clostridium sp. | WP 046822491 |
Согласно предпочтительному варианту реализации фосфатбутирилтрансфераза представляет собой Ptb из
Clostridium acetobutylicum (WP 010966357; SEQ ID NO: 87) или
Clostridium beijerinckii (WP026886639; SEQ ID NO: 88) (WP 041893500; SEQ ID NO: 89).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei естественным образом не содержат фосфатбутирилтрансферазу.
Указанная бутираткиназа может представлять собой любой источник или может происходить, например, из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:
Описание | Микроорганизм | Номер доступа |
бутираткиназа | Clostridium pasteurianum | ALB48406 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | CDB14330 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | CDB74820 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | EKQ52187 |
бутираткиназа | Clostridium perfringens | Q0SQK0 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP002582660 |
-24043734
бутираткиназа | Clostridium colicanis | WP 002598838 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP003371719 |
бутираткиназа | Clostridium perfringens | WP__003454444 |
бутираткиназа | Clostridium perfringens | WP 004459180 |
бутираткиназа | Clostridium celatum | WP__005211128 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 008681112 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 008681114 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 009167897 |
бутираткиназа | Clostridium perfringens | WPjniO 10889 |
бутираткиназа | Clostridium beijerinckii | WP_011967556 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP__012422882 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP__012450845 |
бутираткиназа | Clostridium saccharoperbutylacetonicum | WP 015390397 |
бутираткиназа | Clostridium beijerinckii | WP_017209677 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP__017825911 |
бутираткиназа | Clostridium chauvoei | WP 021876994 |
бутираткиназа | Clostridium saccharobutylicum | WP 022743599 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 024615656 |
бутираткиназа | Clostridium perfringens | WP 025648345 |
бутираткиназа | Clostridium beijerinckii | WP026886638 |
бутираткиназа | Clostridium paraputrificum | WPJ127098883 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 032117070 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP 035786166 |
бутираткиназа | Clostridium baratii | WP-039312972 |
бутираткиназа | Clostridium diolis | WP03 9772701 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP_0410823 88 |
бутираткиназа | Clostridium beijerinckii | WP 041893502 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP__042402497 |
бутираткиназа | Clostridium baratii | WP_045725505 |
бутираткиназа | Clostridium perfringens | WP 049039634 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP 049180514 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP 053341511 |
бутираткиназа | Clostridium butyricum | ABU40948 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | CDE44915 |
бутираткиназа | Clostridium senegalense | WP_010295059 |
бутираткиназа | Clostridium intestinale | WP__021800216 |
бутираткиназа | Eubacterium ventriosum | WP 005363839 |
бутираткиназа | Бактерия порядка Clostridiales | WP 02165703 8 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 021281242 |
бутираткиназа | Clostridium sporogenes | WP 045520059 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 050606428 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP 012048334 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP-012343352 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP 003401518 |
бутираткиназа | Clostridium argentinense | WP 039635972 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP__003357547 |
- 25 043734
бутираткиназа | Clostridium hydrogeniformans | WP_027633205 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP 03 3066487 |
бутираткиназа | Roseburia sp. | CDF44202 |
бутираткиназа | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP027111008 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | CDA68344 |
бутираткиназа | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP022782491 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP_012101111 |
бутираткиназа | Clostridium carboxidivorans | WP_007063155 |
бутираткиназа | Clostridium botulinum | WP 041346556 |
бутираткиназа | Clostridium drakei | WP_03 2078801 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP__03 2120462 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 053468897 |
бутираткиназа | Бактерия Firmicutes | CCZ27888 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP_03 53 06569 |
бутираткиназа | Coprococcus comes | CDB84787 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 035292410 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | CCX89275 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP040212963 |
бутираткиназа | Clostridium pasteurianum | WP 003445697 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WPJ153242610 |
бутираткиназа | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP_016299320 |
бутираткиназа | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP022785085 |
бутираткиназа | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP_016281561 |
бутираткиназа | Eubacterium sp. | CDA28786 |
бутираткиназа | Clostridium scatologenes | WP029160342 |
бутираткиназа | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP_016228168 |
бутираткиназа | Clostridium pasteurianum | WPJ) 15617429 |
бутираткиназа | Clostridium algidicarnis | WP029451332 |
бутираткиназа | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP_016293 388 |
бутираткиназа | Clostridium sulfidigenes | WP035133396 |
бутираткиназа | Clostridium tetani | WP__0 111 00666 |
бутираткиназа | Clostridium tetanomorphum | WP_03 5147567 |
бутираткиназа | Subdoligranulum vanabile | WP_007045828 |
бутираткиназа | Eubacterium sp. | CCZ03826 |
бутираткиназа | Бактерия Firmicutes | CDF07483 |
бутираткиназа | Eubacterium sp. | CDB13677 |
бутираткиназа | Clostridium sp. | WP 008400594 |
бутираткиназа | Clostridium tetani | WP_023439552 |
бутираткиназа | Бактерия порядка Clostridiales | WP022787536 |
бутираткиназа | Бактерия семейства Lachnospiraceae | WP027434709 |
бутираткиназа | Бактерия Firmicutes | CCY23249 |
бутираткиназа | Clostridium acetobutylicum | WP 010966356 |
Согласно предпочтительному варианту реализации указанная бутираткиназа представляет собой Buk из
Clostridium acetobutylicum (WP O10966356; SEQ ID NO: 90) или Clostridium beijerinckii (WP_011967556; SEQ ID NO: 91) (WP_017209677; SEQ ID NO: 92) (WP_026886638; SEQ ID NO: 93) (WP 041893502; SEQ ID NO: 94).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei естественным образом не содержат бутираткиназу.
Поскольку Ptb-Buk, как было показано, функционирует на широком диапазоне субстратов, разумно предположить, что в случае, когда Ptb-Buk не проявляет какой-либо активности в отношении требуемого субстрата, Ptb-Buk может быть сконструирована таким образом, чтобы добиться активности в отношении представляющего интерес субстрата. Может быть использована (однако без ограничений) стратегия рационального дизайна на основании доступных кристаллических структур Ptb и Buk, содержащих и не содержащих связанный субстрат, при этом связывающий карман может подвергаться изменениям для приведения в соответствие новому субстрату, или посредством насыщающего мутагенеза. После получе
- 26 043734 ния активности указанная активность может быть дополнительно усилена путем проведения многократных циклов ферментного конструирования. Указанные работы по конструированию могут быть скомбинированы с анализами для тестирования ферментной активности. Ранее была подтверждена эффективность указанных видов стратегий (см., например, Huang, Nature, 537: 320-327, 2016; Khoury, Trends Biotechnol, 32: 99-109, 2014; Packer, Nature Rev Genetics, 16: 379-394, 2015; Privett, PNAS USA, 109: 37903795, 2012).
Для улучшения субстратной специфичности Ptb-Buk в отношении специфического ацил-КоА субстрата может быть проведен скрининг вариантов Ptb-Buk из общедоступных баз данных или полученных мутантных Ptb-Buk (например, путем направленной эволюции) с применением высокопроизводительного анализа, а именно, избыточной экспрессии пары ферментов Ptb-Buk у E.coli, добавления экспериментального субстрата и скрининга на продуцирование АТФ с применением анализа биолюминесценции. В указанном анализе может быть использована устоявшаяся практика соотнесения концентрации АТФ с биолюминесценцией, обусловленной ферментом - люциферазой светлячков. Возможность проведения указанного анализа в формате многолуночного планшета облегчает эффективный скрининг на субстратную специфичность новых комбинаций Ptb-Buk (фиг. 33).
За счет проведения скрининга на продуцирование АТФ, а не на истощение субстрата или накопления продукта, указанный анализ позволяет избежать измерения спонтанного гидролиза КоА-группы. Однако альтернативный описанный в литературе подход заключается в использовании свободного КоА, который может быть измерен с помощью известного анализа с применением реактива Эллмана (5,5'дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) или DTNB) (Thompson, Appl Environ Microbiol, 56: 607-613, 1990.) для оценки эффективности сопряжения реакций Ptb-Buk (фиг. 33). Ацил-КоА и соответствующие им свободные кислоты и промежуточные фосфорсодержащие продукты могут также быть измерены в течение фазы валидации с применением ЖХ-МС/МС.
При применении способов высокопроизводительного скрининга кинетические данные собирать сложно ввиду трудоемкости количественного определения белков. Вместо этого для каждого состава лизата E.coli, содержащего ферменты Ptb-Buk, активность в отношении каждого представляющего интерес субстрата (измеряемая как люминесценция на единицу времени) может быть сравнена с активностью в отношении положительного контрольного субстрата (бутирил-КоА) и в отношении ацетил-КоА (физиологический субстрат, предположительно обеспечивающий максимальную конкуренцию для активных участков фермента, направленных против целевого ацил-КоА).
Для предотвращения смещения результатов анализа из-за активности нативной фосфотрансацетилазы (Pta) и/или ацетаткиназы (Ack) указанный анализ может также быть проведен на штамме E. coli с нокаутированными генами pta и/или ack.
Получение ацетона и изопропанола
Ацетон и изопропанол представляют собой имеющие важное значение промышленные растворители, совокупный объем рынка которых составляет 8 млн тонн, а стоимость мирового рынка составляет 8,5-11 млрд долларов. Кроме того, ацетон и изопропанол являются предшественниками ценных выходных продуктов, в том числе полиметилметакрилата (РММА), стоимость мирового рынка которого составляет 7 млрд долларов, изобутилена, стоимость мирового рынка которого составляет 25-29 млрд долларов, и пропилена, стоимость мирового рынка которого составляет 125 млрд долларов. Кроме того, недавно был описан маршрут для получения авиатоплива из ацетона. В настоящее время промышленное получение ацетона прямо связано с получением фенола нефтехимическим способом, поскольку он представляет собой побочный продукт процесса обработки кумола. Около 92% выхода ацетона по объему представляет собой сопутствующий продукт при получении фенола из кумола. Это связано с серьезными последствиями как для окружающей среды, так и для рынка. В процессе обработки кумола на каждый моль фенола приходится один моль образующегося сульфита натрия, что порождает серьезные проблемы, связанные с обработкой отходов, и создает угрозу для природной среды и здоровья человека. Ожидается, что мировой спрос на фенол ожидает стагнация или падение, тогда как спрос на ацетон, предположительно, будет возрастать. Разрабатываются и, согласно ожиданиям, скоро будут коммерциализированы альтернативные маршруты получения фенола путем прямого окисления бензена; это может привести к полной элиминации производства ацетона.
Ацетон получают в промышленных масштабах на протяжении почти 100 лет, в качестве побочного продукта бутанола в ходе ацетон-бутанол-спиртовой (ABE) ферментации. Хотя промышленная АВЕферментация сошла на нет во второй половине 20 века из-за низких цен на нефть и высокой стоимости сахара, недавно она была возобновлена, и на протяжении последних нескольких лет было построено несколько коммерческих заводов. Несколькими академическими группами было также продемонстрировано получение ацетона из сахара у гетерологичных хозяев, которые экспрессируют соответствующие ферменты АВЕ-ферментирующих организмов, в частности E.coli и дрожжей, путем метаболического конструирования и применения методов синтетической биологии. Однако незначительный выход и высокая стоимость, ассоциированные с предварительной обработкой, необходимой для высвобождения полисахаридного компонента биомассы, делает получение ацетона посредством стандартной ферментации экономически неоправданным, поскольку в современных технологиях биохимического преобразова- 27 043734 ния не используется лигниновый компонент биомассы, который может составлять до 40% от указанного материала.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать ацетон или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения ацетона или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования ацетона могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение ацетона путем осуществления этапов 1, 2 и 3: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2 и 3, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать ацетон или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2 и 3 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii или Clostridium ragsdalei), указанный микроорганизм может быть модифицирован для нокдауна или нокаута экспрессии первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы (например, путем разрушения гена, кодирующего указанную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу), таким образом, что указанный микроорганизм продуцирует ацетон без его преобразования в изопропанол (WO 2015/085015).
Получение ацетона путем осуществления этапов 1, 13, 14, 15 и 3: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий экзогенные ферменты для этапов 1, 13, 14, 15 и 3, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать ацетон или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 14 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 14, 15 и 3 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную: вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, или Clostridium ragsdalei), указанный микроорганизм может быть модифицирован для нокдауна или нокаута экспрессии первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы (например, путем разрушения гена, кодирующего указанную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу), таким образом, что указанный микроорганизм продуцирует ацетон без его преобразования в изопропанол (WO 2015/085015).
Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования ацетона.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать изопропанол или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения изопропанола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования изопропанола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение изопропанола путем осуществления этапов 1, 2, 3 и 4: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2, 3 и 4, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изопропанол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2, 3 и 4 описаны в различных разделах настоящей заявки. В том случае, когда микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium, ragsdalei), введение экзогенного фермента для этапа 4 не является необходимым для получения изопропанола. Однако модификация указанного микроорганизма, например, для сверхэкспрессии нативной первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы, может
- 28 043734 приводить к усиленному продуцированию изопропанола.
Получение изопропанола путем осуществления этапов 1, 13, 14, 15, 3 и 4: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 14, 15, 3 и 4, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изопропанол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 14 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 14, 15, 3 и 4 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei), введение экзогенного фермента для этапа 4 не является необходимым для продуцирования изопропанола. Однако модификация микроорганизма, например, для избыточной экспрессии нативной первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы может приводить к усиленному продуцированию изопропанола.
Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования изопропанола.
Получение изобутилена
Изобутилен относится к основным химическим строительным блокам с объемом рынка, превышающим 15 млн тонн, и стоимостью мирового рынка, составляющей 25-29 млрд долларов. Помимо применения в химии и в качестве топливной присадки (15 Мт/год), изобутилен может быть преобразован в изооктан, высокоэффективное альтернативное топливо для автомобилей с бензиновыми двигателями. Global Bioenergies были поданы патентные заявки, относящиеся к ферментативному продуцированию изобутена (т.е. изобутилена) из ацетона, однако ни в один из раскрытых маршрутов не входит Ptb-Buk (WO 2010/001078; EP 2295593; WO 2011/076691; van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012).
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать изобутилен или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения изобутилена или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования изобутилена могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
На фиг. 1 показаны два альтернативных маршрута продуцирования изобутилена. Первый включает получение изобутилена путем осуществления этапов 1, 2, 3, 5 и 6. Второй включает получение изобутилена путем осуществления этапов 1, 2, 3, 7, 8 и 6. Этапы 2 и 8 могут быть катализированы Ptb-Buk. Соответственно, каждый маршрут может включать Ptb-Buk.
Получение изобутилена путем осуществления этапов 1,2, 3, 5 и 6: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2, 3, 5 и 6, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изобутилен или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2, 3, 5 и 6 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei), указанный микроорганизм может быть модифицирован для нокдауна или нокаута экспрессии первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы (например, путем разрушения гена, кодирующего указанную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу), для предотвращения преобразования ацетона в изопропанол и максимизации преобразования ацетона в изобутилен.
Получение изобутилена путем осуществления этапов 1, 2, 3, 7, 8 и 6: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2, 3, 7, 8 и 6, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изобутилен или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 и/или этап 8 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2, 3, 7, 8 и 6 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную: вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, или Clostridium ragsdalei),
- 29 043734 указанный микроорганизм может быть модифицирован для нокдауна или нокаута экспрессии первичной:
вторичной алкогольдегидрогеназы (например, путем разрушения гена, кодирующего указанную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу) для предотвращения преобразования ацетона в изопропанол и максимизации преобразования ацетона в изобутилен.
Получение 3-гидроксибутирата
3-Гидроксибутират (3-ГБ) представляет собой четырехуглеродную карбоновую кислоту из семейства бета-гидроксикислот. 3-Гидроксибутират представляет собой косметический ингредиент для очищения кожи жирного типа, промежуточный продукт при приготовлении антивозрастных кремов, промежуточный продукт при получении полигидроксибутирата (РНВ), биоразлагаемой полимерной смолы и комономер для других полигидроксикислот при получении новых биопластиков. Кроме того, частные варианты применения 3-гидроксибутирата включают применение в составе биосовместимых и биоразлагаемых нанокомпозитов, в частности, медицинских имплантатов, применение в качестве промежуточного продукта химических С3/С4-продуктов, хиральных строительных блоков и продуктов тонкой химии. Несмотря на продуцирование (R)- и (S)-3-гидроксибутuрата рекомбинантной E. coli, растущей на глюкозе, продуцирование 3-гидроксибутирата микроорганизмами, растущими на газообразных субстратах, продемонстрировано не было (Tseng, Appl Environ Microbiol, 75: 3137-3145, 2009). Отметим, что указанная система, ранее продемонстрированная на E.coli, не могла быть прямо перенесена на ацетогены, в том числе С. autoethanogenum, ввиду присутствия в ацетогенах нативной тиоэстеразы. Хотя E.coli также содержит тиоэстеразу TesB, которая может действовать на 3-ГБ-КоА, Tseng показал, что фоновая активность минимальна (<0,1 г/л). При том, что сообщалось о продуцировании чистых стереоизомеров Е. coli, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что С. autoethanogenum продуцировал смесь изомеров. Без связи с конкретной теорией, это предположительно является результатом активности нативной изомеразы. Это позволяет сочетать комбинацию ^-специфической 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназы (Hbd) с ^-специфической Ptb-Buk для оптимизированного продуцирования. Для получения чистых стереоизомеров указанная активность может быть нокаутирована. В совокупности, настоящее изобретение обеспечивает получение нескольких г/л 3-ГБ, в отличие от низких уровней продукции в E.coli, с применением Ptb-Buk в любой комбинации с (R)- или ^-специфической 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой, и нативной тиоэстеразы Clostridium autoethanogenum.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 3гидроксибутират или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 3-гидроксибутирата или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 3-гидроксибутирата могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
На фиг. 1 показаны два альтернативных маршрута продуцирования 3-гидроксибутирата. Первый предусматривает продуцирование 3-гидроксибутирата путем осуществления этапов 1, 2 и 15. Второй предусматривает продуцирование 3-гидроксибутирата путем осуществления этапов 1, 13 и 14. Этапы 2 и 14 могут быть катализированы Ptb-Buk. Соответственно, каждый маршрут может задействовать Ptb-Buk. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования 3-гидроксибутирата, при этом Ptb-Buk может катализировать более чем один этап (например, этапы 2 и 14).
Получение 3-гидроксибутирата путем осуществления этапов 1, 2 и 15: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2 и 15, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 3-гидроксибутират или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2 и 15 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 3-гидроксибутирата путем осуществления этапов 1, 13 и 14: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13 и 14, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 3-гидроксибутират или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 14 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13 и 14 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 1,3-бутандиола
1,3-Бутандиол (1,3-BDO) часто применяют в качестве растворителя для пищевых вкусоароматических агентов; он представляет собой комономер для применения в некоторых полиуретановых и полиэфирных смолах. Что еще более важно, 1,3-бутандиол может быть каталитически преобразован в 1,3-
- 30 043734 бутадиен (Makshina, Chem Soc Rev, 43:7917-7953,2014). Бутадиен применяют для получения резины, пластиков, смазывающих веществ, латекса и других продуктов. Хотя большая часть получаемого в настоящее время бутадиена используется для изготовления резины для автомобильных шин, он может также быть использован для получения адипонитрила, который может применяться при изготовлении нейлона 6,6. Мировой спрос на бутадиен в настоящее время растет. В 2011 г. подсчитанный спрос составил 10,5 млн тонн, оцениваемых в 40 млрд долларов.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 1,3бутандиол или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 1,3-бутандиола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 1,3-бутандиола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм может продуцировать 1,3бутандиол без ко-продукции этанола (или продуцируя только незначительное количество этанола, например, менее чем 0,1-1,0 г/л этанола или менее чем 1-10 г/л этанола).
На фиг. 1 показаны три альтернативных маршрута продуцирования 1,3-бутандиола. Первый предусматривает продуцирование 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 2, 15, 16 и 17. Второй предусматривает продуцирование 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 13, 14, 16 и 17. Третий предусматривает продуцирование 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 13, 18 и 17. Этапы 2 и 14 могут быть катализированы Ptb-Buk. Соответственно, по меньшей мере первый и второй маршруты могут задействовать Ptb-Buk. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования 1,3-бутандиола. Согласно родственному варианту реализации Ptb-Buk может катализировать более чем один этап (например, этапы 2 и 14).
Получение 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 2, 15, 16 и 17: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2, 15, 16 и 17, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 1,3-бутандиол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk.
Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2, 15, 16 и 17 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 13, 14, 16 и 17: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 14, 16 и 17, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 1,3-бутандиол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 14 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 14, 16 и 17 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 13, 18 и 17: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 18 и 17, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 1,3-бутандиол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат (фиг. 11). Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 18 и 17 описаны в различных разделах настоящей заявки. Наличие аналогичного маршрута было продемонстрировано у E. coli, однако не в ацетогенах, таких как Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (Kataoka, J Biosci Bioeng, 115: 475480, 2013). Хотя применение Ptb-Buk приводит к продуцированию (R)-1,3-бутандиола, указанный маршрут, не требующий применения Ptb-Buk, может приводить к продуцированию (S)-1,3-бутандиола.
Получение 2-гидроксиизобутирата
2-Гидроксиизобутират (2-ГИБ) представляет собой четырехуглеродную карбоновую кислоту, которая может служить в качестве строительных блоков для многих типов полимеров. Сложный метиловый эфир метакриловой кислоты, который может быть синтезирован путем обезвоживания 2гидроксиизобутирата или применения соответствующего амида, полимеризуют с образованием полиметилметакрилата (РММА) для получения акрилового стекла, прочных покрытий и чернил. Объем мирового рынка одного только указанного соединения превышает 3 млн тонн. Другие разветвленные карбоновые С4-кислоты, например, хлоро- и аминопроизводные 2-гидроксиизобутирата, а также изобутиленгликоль и его оксид, также используют в полимерах и для многих других применений.
Стереоспецифичность системы Ptb-Buk, в частности, подходит для преодоления ограничений существующего уровня техники в отношении получения 2-гидроксиизобутирата. И Ptb-Buk, и тиоэстеразы
- 31 043734 являются неизбирательными, таким образом, побочная активность с 3-гидроксибутирил-КоА может отвлекать ресурсы из целевых путей продуцирования 2-гидроксиизобутирил-КоА (см., например, фиг. 1 и 8). Однако Ptb-Buk способна различать стереоизомеры и действует на (R)-3-гидроксибутирил-КоА, но не на (S)-3-гидроксибутирил-КоА. Напротив, тиоэстеразы неспособны различать стереоизомеры 3гидроксибутирил-КоА. Согласно предпочтительному варианту реализации выбирают ^-специфическую ацетоацетил-КоА-гидратазу (EC 4.2.1.119) (этап 13) в комбинации с Ptb-Buk (этап 20), чтобы избежать потерь с образованием 3-гидроксибутирата и максимизировать выход 2-гидроксиизобутирата (фиг. 8). Указанная ^-специфическая форма 3-гидроксибутирил-КоА также представляет собой предпочтительный субстрат 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазы (EC 5.4.99.) (этап 19) (Yaneva, J Biol Chem, 287: 1550215511, 2012).
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 2гидроксиизобутират или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 2-гидроксиизобутирата или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 2-гидроксиизобутирата могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение 2-гидроксиизобутирата путем осуществления этапов 1, 13, 19 и 20: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 19 и 20, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 2-гидроксиизобутират или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 20 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 19 и 20 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен также микроорганизм, способный продуцировать 2-гидроксибутират (2-ГБ) или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 2-гидроксибутирата или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Без связи с конкретной теорией, авторы настоящего изобретения считают, что наблюдаемое продуцирование 2гидроксибутирата обусловлено неспецифической мутазной активностью у таких микроорганизмов, как Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei.
Получение адипиновой кислоты
Адипиновая кислота представляет собой наиболее важную дикарбоновую кислоту, рынок которой оценивается более чем в 4,5 млрд долларов США при ежегодном уровне производства, составляющем приблизительно 2,5 млрд кг. Более 60% полученной адипиновой кислоты используют в качестве мономерного предшественника для получения нейлона; стоимость мирового рынка адипиновой кислоты предположительно достигнет 7,5 млрд долларов США к 2019 г. В настоящее время практически всю адипиновую кислоту получают петрохимически, например, путем карбонилирования бутадиена.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать адипиновую кислоту или ее предшественники из субстрата (фиг. 34). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения адипиновой кислоты или ее предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования адипиновой кислоты могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение адипиновой кислоты путем осуществления этапов 22, 23, 24, 25 и 26: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 22, 23, 24, 25 и 26, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать адипиновую кислоту или ее предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 26 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 22, 23, 24, 25 и 26 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение адипиновой кислоты путем осуществления этапов 21, 22, 23, 24, 25 и 26: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 21, 22, 23, 24, 25 и 26, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать адипиновую кислоту или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганиз- 32 043734 ма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 26 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 21, 22, 23, 24, 25 и 26 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования адипиновой кислоты.
Получение 1,3-гександиола
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 1,3гександиол или его предшественники из субстрата (фиг. 35). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 1,3-гександиола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 1,3-гександиола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Пути, представленные на фиг. 35, начинаются с 3-гидроксибутирил-КоА, который может быть получен путем осуществления этапов 1 и 13, как показано на фиг. 1.
Получение 1,3-гександиола путем осуществления этапов 1, 13, 27, 31, 32, 36, 37, 38 и 39: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 27, 31, 32, 36, 37, 38 и 39, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 1,3-гександиол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 37 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 27, 31, 32, 36, 37, 38 и 39 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 3-метил-2-бутанола
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 3-метил2-бутанол или его предшественники из субстрата (фиг. 35). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 3-метил-2-бутанола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 3-метил-2-бутанола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Пути, представленные на фиг. 35, начинаются с 3-гидроксибутирил-КоА, который может быть получен путем осуществления этапов 1 и 13, как показано на фиг. 1.
Получение 3-метил-2-бутанола путем осуществления этапов 1, 13, 27, 31, 32, 33, 34 и 35: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 27, 31, 32, 33, 34 и 35, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 3-метил-2-бутанол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 33 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 27, 31, 32, 33, 34 и 35 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 2-бутен-1-ола
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 2-бутен1-ол или его предшественники из субстрата (фиг. 35). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 2-бутен-1-ола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 2-бутен-1-ола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Пути, представленные на фиг. 35, начинаются с 3-гидроксибутирил-КоА, который может быть получен путем осуществления этапов 1 и 13, как показано на фиг. 1.
Получение 2-бутен-1-ола путем осуществления этапов 1, 13, 27, 28, 29 и 30: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 27, 28, 29 и 30, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 2-бутен-1-ол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочти- 33 043734 тельному варианту реализации этап 28 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 27, 28, 29 и 30 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение изовалерата
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать изовалерат или его предшественники из субстрата (фиг. 36). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения изовалерата или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования изовалерата могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение изовалерата путем осуществления этапов 1, 40, 41, 42, 43 и 44: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 40, 41, 42, 43 и 44, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изовалерат или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 44 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 40, 41, 42, 43 и 44 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение изоамилового спирта
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать изоамиловый спирт или его предшественники из субстрата (фиг. 36). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения изоамилового спирта или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования изоамилового спирта могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение изоамилового спирта путем осуществления этапов 1, 40, 41, 42, 43, 44, 45 и 46: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов I, 40, 41, 42, 43, 44, 45 и 46, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изоамиловый спирт или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 44 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 40, 41, 42, 43, 44, 45 и 46 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение изоамилового спирта путем осуществления этапов 1, 40, 41, 42, 43, 47 и 46: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 40, 41, 42, 43, 47 и 46, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изоамиловый спирт или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 40, 41, 42, 43, 47 и 46 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования изоамилового спирта.
Получение дополнительных продуктов
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, содержащий экзогенную Ptb-Buk и экзогенную или эндогенную альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу (AOR). Такой микроорганизм может продуцировать, например, 1-пропанол, 1-бутанол, 1-гексанол и 1-октанол или их предшественники из ацетил-КоА, генерированного, например, из газообразного субстрата (фиг. 32). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 1-пропанола, 1-бутанола, 1-гексанола и 1-октанола или их предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии газообразного субстрата. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei естественным образом содержат AOR. Однако AOR может быть избыточно экспрессирован в таких микроорганизмах в комбинации с экспрессией экзогенной Ptb-Buk. Как вариант, экзогенная AOR и экзогенная Ptb-Buk могут быть экспрессированы в микроорганизме, отличном от Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei, таком как Escherichia coli.
Получение предшественников и промежуточных продуктов
Пути, представленные на фиг. 1, 34, 35 и 36, могут быть модифицированы для получения предшественников или промежуточных продуктов вышеупомянутых продуктов. В частности, части любых фер- 34 043734 ментативных путей, описанных в настоящем документе, могут быть введены в микроорганизм-хозяина для продуцирования предшественников или промежуточных продуктов.
Определения и уровень техники
Термин генетическая модификация или генетическое конструирование в широком смысле относится к манипуляциям с геномом или нуклеиновыми кислотами микроорганизма. Аналогичным образом, термин генетически сконструированный относится к микроорганизму, содержащего подвергшиеся манипуляциям геном или нуклеиновые кислоты. Способы генетической модификации включают, например, гетерологичную генную экспрессию, инсерции или делеции генов или промоторов, мутации нуклеиновых кислот, измененную генную экспрессию или инактивацию генов, конструирование ферментов, направленную эволюцию, интеллектуальный дизайн, способы случайного мутагенеза, перестановку генов и кодон-оптимизацию.
Рекомбинантный указывает на то, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм представляет собой продукт генетической модификации, конструирования или рекомбинации. В общем случае, термин рекомбинантный относится к нуклеиновой кислоте, белку или микроорганизму, который содержит генетический материал или кодируемый генетическим материалом, происходящим из нескольких источников, таких как два или более разных штаммов или видов микроорганизмов. В настоящем документе термин рекомбинантный могут также применяться для описания микроорганизма, который содержит мутированную нуклеиновую кислоту или белок, в том числе мутированную форму эндогенной нуклеиновой кислоты или белка.
Эндогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, которая или который присутствует или экспрессируется в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Например, эндогенный ген представляет собой ген, естественным образом присутствующий в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации экспрессию эндогенного гена может контролировать экзогенный регуляторный элемент, такой как экзогенный промотор.
Экзогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, которая или который не присутствует в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации экзогенный ген или фермент может происходить из гетерологичного (т.е. другого) штамма или вида, и быть введен в микроорганизм или экспрессирован в микроорганизме согласно настоящему изобретению. Согласно другому варианту реализации экзогенный ген или фермент может быть получен искусственным или рекомбинантным способом, и введен в микроорганизм или экспрессирован в микроорганизме согласно настоящему изобретению. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут быть адаптированы для интеграции в геном микроорганизма согласно настоящему изобретению или для сохранения в экстрахромосомном состоянии в микроорганизме согласно настоящему изобретению, например, в плазмиде.
Ферментная активность или просто активность относится к ферментативной активности в широком смысле, в том числе, однако не ограничиваясь перечисленным, активности фермента, количеству фермента или доступности фермента для катализа реакции. Соответственно, увеличенная ферментная активность включает увеличение активности фермента, увеличение количества фермента или увеличение доступности фермента для катализа реакции. Аналогичным образом, уменьшенная ферментная активность включает уменьшение активности фермента, уменьшение количества фермента или уменьшение доступности фермента для катализа реакции.
В отношении ферментной активности субстрат представляет собой молекулу, на которую действует фермент, а продукт представляет собой молекулу, продуцируемую под действием фермента. Нативный субстрат, соответственно, представляет собой молекулу, на которую действует фермент естественным образом в микроорганизме дикого типа, а нативный продукт представляет собой молекулу, естественным образом продуцируемую под действием фермента в указанном микроорганизме дикого типа. Например, бутаноил-КоА представляет собой нативный субстрат Ptb, а бутаноилфосфат представляет собой нативный субстрат Buk. Кроме того, бутаноилфосфат представляет собой нативный продукт Ptb, а бутират (бутаноат) представляет собой нативный продукт Buk. Аналогичным образом, ненативный субстрат представляет собой молекулу, на которую фермент не действует естественным образом в микроорганизме дикого типа, а ненативный продукт представляет собой молекулу, не продуцируемую естественным образом под действием фермента в указанном микроорганизме дикого типа. Фермент, который способен действовать на несколько разных субстратов, нативный или ненативный, как правило, называют неизбирательным ферментом. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной и способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, Ptb-Buk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ. Соответственно, согласно предпочтительным вариантам реализации Ptb-Buk согласно настоящему изобретению действует на ненативные субстраты (т.е. субстраты, отличные от бутаноил-КоА и/или бутаноилфосфата), обеспечивая получение ненативных продуктов (т.е. продуктов, отличных от бутаноилфосфата и/или бутирата
- 35 043734 (бутаноата)).
Термин бутирил-КоА в настоящем документе может применяться взаимозаменяемо с термином бутаноил-КоА.
Термин энергогенерирующий или т.п. может применяться взаимозаменяемо в настоящем документе с термином сохраняющий энергию или т.п. Оба указанных термина часто используются в опубликованных источниках.
Мутированный относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые были модифицированы в микроорганизме согласно настоящему изобретению по сравнению с микроорганизмом дикого типа или исходным микроорганизмом, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации указанная мутация может представлять собой делецию, инсерцию или замену в гене, кодирующем фермент. Согласно другому варианту реализации указанная мутация может представлять собой делецию, инсерцию или замену одной или более аминокислот в ферменте.
В частности, разрушающая мутация представляет собой мутацию, которая уменьшает или элиминирует (т.е. разрушает) экспрессию или активность гена или фермента. Разрушающая мутация может частично инактивировать, полностью инактивировать или удалять указанный ген или фермент. Разрушающая мутация может представлять собой нокаутную (КО) мутацию. Разрушающая мутация может представлять собой любую мутацию, которая уменьшает, предотвращает или блокируют биосинтез продукта, продуцируемого ферментом. Разрушающая мутация может включать, например, мутацию в гене, кодирующем фермент, мутацию в генетическом регуляторном элементе, вовлеченном в экспрессию гена, кодирующего фермент, введение нуклеиновой кислоты, которая продуцирует белок, уменьшающий или ингибирующий активность фермента, или введение нуклеиновой кислоты (например, антисмысловой РНК, миРНК, CRJSPR) или белка, который ингибирует экспрессию фермента. Разрушающая мутация может быть введена с применением любого способа, известного в данной области техники.
Введение разрушающей мутации приводит к получению микроорганизма согласно настоящему изобретению, который не продуцирует целевого продукта, по существу не продуцирует целевого продукта или продуцирует пониженное количество целевого продукта по сравнению с исходным микроорганизмом, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может не продуцировать целевого продукта или продуцирует по меньшей мере приблизительно на 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% меньше целевого продукта, чем исходный микроорганизм. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может продуцировать менее чем приблизительно 0,001; 0,01; 0,10; 0,30; 0,50 или 1,0 г/л целевого продукта.
Кодон-оптимизация относится к мутации нуклеиновой кислоты, такой как ген, для оптимизированной или улучшенной трансляции указанной нуклеиновой кислоты у конкретного штамма или вида. Кодон-оптимизация может приводить к более высоким скоростям трансляции или большей точности трансляции. Согласно предпочтительному варианту реализации гены согласно настоящему изобретению кодон-оптимизированы для экспрессии у Clostridium, в частности, у Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно дополнительному предпочтительному варианту реализации гены согласно настоящему изобретению кодон-оптимизированы для экспрессии у Clostridium autoethanogenum LZ1561, внесенного в DSMZ под номером доступа DSM23693.
Избыточно экспрессируемый относится к увеличению экспрессии нуклеиновой кислоты или белка в микроорганизме согласно настоящему изобретению по сравнению с микроорганизмом дикого типа или исходным микроорганизмом, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Избыточная экспрессия может быть достигнута с применением любых способов, известных в данной области техники, в том числе модификации числа копий гена, скорости генной транскрипции, скорости генной трансляции или скорости ферментного разложения.
Термин варианты включает нуклеиновые кислоты и белки, последовательность которых варьирует относительно последовательности референсной нуклеиновой кислоты и референсного белка, например, последовательности референсной нуклеиновой кислоты и референсного белка, известной из уровня техники или описанной на примерах в настоящем документе. Практическая реализация настоящего изобретения может быть осуществлена с применением вариантов нуклеиновых кислот или белков, которые выполняют по существу ту же функцию, что и референсная нуклеиновая кислота или референсный белок. Например, вариант белка может выполнять по существу ту же функцию или катализируют по существу ту же реакцию, что и референсный белок. Вариант гена может кодировать тот же или по существу тот же белок, что и референсный ген. Вариант промотора может обладать по существу такой же способностью в отношении способствования экспрессии одного или более генов, что и референсный промотор.
Такие нуклеиновые кислоты или белки могут называться в настоящем документе функционально эквивалентными вариантами. Например, функционально эквивалентные варианты нуклеиновой кислоты могут включать аллельные варианты, фрагменты гена, мутированные гены, полиморфизмы и т.п. Гомологичные гены из других микроорганизмов также представляют собой примеры функционально эквивалентных вариантов. Они включают гомологичные гены таких видов, как Clostridium acetobutylicum, Clos- 36 043734 tridium, beijerinckii или Clostridium ljungdahlii, подробную информацию о которых можно найти в открытом доступе на таких Интернет-сайтах, как сайты Genbank или NCBI. Функционально эквивалентные варианты также включают нуклеиновые кислоты, последовательность которых варьирует в результате кодон-оптимизации для конкретного микроорганизма. Функционально эквивалентный вариант нуклеиновой кислоты предпочтительно отличается по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или большей идентичностью последовательности нуклеиновых кислот (процент гомологии) последовательности референсной нуклеиновой кислоты. Функционально эквивалентный вариант белка предпочтительно отличается по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или более идентичностью аминокислот (процент гомологии) последовательности референсного белка. Функциональная эквивалентность варианта нуклеиновой кислоты или белка может быть оценена с применением любого способа, известного в данной области техники.
Нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в микроорганизм согласно настоящему изобретению с применением любого способа, известного в данной области техники. Например, нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в виде депротеинизированных нуклеиновых кислот или в составе с одним или более агентами, например, в виде липосом. Указанные нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК, РНК, кДНК или их комбинации, согласно необходимости. Согласно определенным вариантам реализации могут применяться ингибиторы рестрикции. Дополнительные векторы могут включать плазмиды, вирусы, бактериофаги, космиды и искусственные хромосомы. Согласно предпочтительному варианту реализации нуклеиновые кислоты доставляют в микроорганизм согласно настоящему изобретению с применением плазмиды. Например, трансформация (в том числе трансдукция или трансфекция) может быть достигнута путем электропорации, обработки ультразвуком, полиэтиленгликоль-опосредованной трансформации, химической или природной компетентности, трансформации протопластов, индукции профага или конъюгации. Согласно определенным вариантам реализации, предусматривающим системы активных рестрикционных ферментов, может быть необходимо метилирование нуклеиновой кислоты до введения указанной нуклеиновой кислоты в микроорганизм.
Кроме того, могут быть разработаны нуклеиновые кислоты, содержащие регуляторный элемент, такой как промотор, для увеличения или контроля экспрессии конкретной нуклеиновой кислоты иным образом. Указанный промотор может представлять собой конститутивный промотор или индуцируемый промотор. В идеале, указанный промотор представляет собой промотор пути Вуда-Льюнгдаля, промотор ферредоксина, промотор пируват:ферредоксиноксидоредуктазы, промотор оперона Rnf-комплекса, промотор оперона АТФ-синтазы или промотор оперона фосфотрансацетилазы/ацетаткиназы.
Микроорганизм представляет собой микроскопический организм, в частности, бактерию, архею, вирус или гриб. Микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой, как правило, бактерию. Следует понимать, что в настоящем документе при упоминании микроорганизма подразумевается и бактерия.
Исходный микроорганизм представляет собой микроорганизм, применяемый для получения микроорганизм согласно настоящему изобретению. Указанный исходный микроорганизм может представлять собой встречающиеся в природе микроорганизм (т.е. микроорганизм дикого типа) или микроорганизм, который был модифицирован ранее (т.е. мутантный или рекомбинантный микроорганизм). Указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть модифицирован для экспрессии или избыточной экспрессии одного или более ферментов, которые не экспрессировались или не экспрессировались избыточно в исходном микроорганизме. Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть модифицирован так, что он содержит один или более генов, которые не содержались в исходном микроорганизме. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может также быть модифицирован таким образом, чтобы не экспрессировать один или более ферментов или экспрессировать их меньшие количества по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно одному варианту реализации указанный исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum LZ1561, внесенный в DSMZ под номером доступа DSM23693.
Термин происходящий из указывает на то, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм модифицирован или адаптирован из другой нуклеиновой кислоты, другого белка или микроорганизма (например, исходной нуклеиновой кислоты, исходного белка или микроорганизма; или нуклеиновой кислоты, белка или микроорганизма дикого типа), с получением новой нуклеиновой кислоты, нового белка или микроорганизма. Такие модификации или адаптации, как правило, включают инсерцию, делецию, мутацию или замену нуклеиновых кислот или генов. В общем случае, микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из исходного микроорганизма. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из Clostridium autoethano
- 37 043734 genum LZ1561, внесенного в DSMZ под номером доступа DSM23693.
Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть дополнительно классифицирован на основании функциональных характеристик. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может представлять собой С1-фиксирующий микроорганизм или может происходить из С1фиксирующего микроорганизма, анаэроба, ацетогена, этанологена, карбоксидотрофа и/или метанотрофа. В табл. 1 приведен репрезентативный перечень микроорганизмов и идентифицированы их функциональ ные характеристики.
Таблица 1
C1 -фиксируюгци! | Анаэроб | Ацетоген | Этанологен | Автотроф | Карбоксидотроф | Метанотроф | |
Acetobacterium woodii | + | + | + | +/-1 | - | - | - |
Alkalibaculum bacchii | + | + | + | + | + | + | - |
Blautia producta | + | + | + | - | + | + | - |
Butyribacterium methylotrophicum | + | + | + | + | + | + | - |
Clostridium aceticum | + | + | + | - | + | + | - |
Clostridium autoethanogenum | + | + | + | + | + | + | - |
Clostridium carboxidivorans | + | + | + | + | + | + | - |
Clostridium coskatii | + | + | + | + | + | + | - |
Clostridium, drakei | + | + | + | - | + | + | - |
Clostridium formicoaceticum | + | + | + | - | + | + | - |
Clostridium Ijungdahlii | + | + | + | + | + | + | - |
Clostridium magnum | + | + | + | - | + | +/-2 | - |
Clostridium ragsdalei | + | + | + | + | + | + | - |
Clostridium scatologenes | + | + | + | - | + | + | - |
Eubacterium limosum | + | + | + | - | + | + | - |
Moorella thermautotrophica | + | + | + | + | + | + | - |
Moorella thermoacetica (ранее Clostridium thermoaceticum) | + | + | + | з | + | + | |
Oxobacter pfennigii | + | + | + | - | + | + | - |
Sporomusa ovata | + | + | + | - | + | +/-4 | - |
Sporomusa silvacetica | + | + | + | + | +/-5 | » | |
Sporomusa sphaeroides | + | + | + | - | + | +/-6 | - |
Thermoanaerobacter kiuvi | + | + | + | - | + | - | - |
1Acetobacterium woodi может продуцировать этанол из фруктозы, однако не из газа.
2Не было исследовано, может ли Clostridium magnum расти на CO.
3Был описан один штамм Moorella thermoacetica, Moorella sp. HUC22-1, продуцирующий этанол из газа.
4Не было исследовано, может ли Sporomusa ovata расти на CO.
5Не было исследовано, может ли Sporomusa silvacetica расти на CO.
6Не было исследовано, может ли Sporomusa sphaeroides расти на CO.
С1 относится к содержащей один атом углерода молекуле, например, СО, CO2, CH4 или CH3OH. С1-оксигенат относится к содержащей один атом углерода молекуле, которая также содержит по меньшей мере один атом кислорода, например, СО, CO2 или CH3OH. С1-источник углерода относится к содержащей один атом углерода молекуле, которая служит в качестве частичного или единственного источника углерода для микроорганизма согласно настоящему изобретению. Например, С1-источник углерода может содержать что-либо одно или более из СО, CO2, CH4, CH3OH или СН2О2. Предпочтительно С1-источник углерода содержит что-либо одно из CO и CO2 или и первое, и второе. С1фиксирующий микроорганизм представляет собой микроорганизм, который обладает способностью продуцировать один или более продуктов из С1-источника углерода. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой С1-фиксирующую бактерию. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из С1фиксирующего микроорганизма, идентифицированного в табл. 1.
Анаэроб представляет собой микроорганизм, которому не требуется кислород для роста. Анаэроб может негативно реагировать или даже погибать при присутствии кислорода в количестве, превышающем определенный порог. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой анаэроба. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из анаэроба, идентифицированного в табл. 1.
Ацетоген представляет собой микроорганизм, который продуцирует или способен продуцировать ацетат (или уксусную кислоту) как продукт анаэробного дыхания. Обычно ацетогены являются облигатно анаэробными бактериями, использующими путь Вуда-Льюнгдаля в качестве основного механизма сохранения энергии и синтеза происходящих из ацетил-КоА и ацетил-КоА продуктов, таких как ацетат (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). Ацетогены используют путь ацетил-КоА в каче- 38 043734 стве (1) механизма восстановительного синтеза ацетил-КоА из CO2, (2) конечного электроноакцепторного сохраняющего энергию процесса, (3) механизма фиксации (ассимиляции) CO2 при синтезе клеточного углерода (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006). Все встречающиеся в природе ацетогены являются С1-фиксирующими, анаэробными, аутотрофными и неметанотрофными. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой ацетоген. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из ацетогена, идентифицированного в табл. 1.
Этанологен представляет собой микроорганизм, который продуцирует или способен продуцировать этанол. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой этанологен. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из этанологена, идентифицированного в табл. 1.
Автотроф представляет собой микроорганизм, способный к росту в отсутствие органического углерода. Вместо него автотрофы используют неорганические источники углерода, такие как CO и/или CO2. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой автотрофа. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из автотрофа, идентифицированного в табл. 1.
Карбоксидотроф представляет собой микроорганизм, способный к утилизации CO в качестве единственного источника углерода. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой карбоксидотроф. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из карбоксидотрофа, идентифицированного в табл. 1.
Метанотроф представляет собой микроорганизм, способный к утилизации метана в качестве единственного источника углерода и энергии. Согласно некоторым вариантам реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из метанотрофа.
В более широком смысле микроорганизм согласно настоящему изобретению может происходить из любого рода или вида, идентифицированного в табл. 1.
Согласно предпочтительному варианту реализации указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из кластера Clostridia, содержащего виды Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Указанные виды были впервые описаны и охарактеризованы в источниках: Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993 (Clostridium ljungdahlii) и Huhnke, WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).
Указанные три вида во многом аналогичны. В частности, все указанные виды являются С1фиксирующими анаэробными ацетогенными этанологенными и карбоксидотрофными представителями рода Clostridium. Указанные виды обладают аналогичными генотипами и фенотипами, способами сохранения энергии и ферментативным метаболизмом. Кроме того, указанные виды кластеризованы в клостридиальную группу гомологии рРНК I, с идентичной более чем на 99% 16S рРНК ДНК, имеют содержание G+С в ДНК, составляющее приблизительно 22-30 мол.%, являются грамположительными, имеют аналогичную морфологию и размер (клетки на стадии логарифмического роста имеют размер 0,5-0,7х3-5 мкм), являются мезофильными (оптимальный рост при 30-37°С), отличаются аналогичными диапазонами значений pH, приблизительно 4-7,5 (с оптимальным значением pH, составляющим приблизительно 5,5-6), не содержат цитохромов и сохраняют энергию с помощью Rnf-комплекса. Также у указанных видов было продемонстрировано восстановление карбоновых кислот до соответствующих спиртов (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Важно отметить, что все указанные виды также демонстрируют выраженный аутотрофный рост на СО-содержащие газах, продуцируют этанол и ацетат (или уксусную кислоту) в качестве основных продуктов ферментации, и продуцируют незначительные количества 2,3бутандиола и молочной кислоты в определенных условиях.
Однако указанные три вида также имеют ряд отличий. Указанные виды были выделены из разных источников: Clostridium autoethanogenum из ЖКТ кролика, Clostridium ljungdahlii из отходов курятников, и Clostridium ragsdalei из пресноводных отложений. Указанные виды различаются утилизацией различных Сахаров (например, рамнозы, арабинозы), кислот (например, глюконата, цитрата), аминокислот (например, аргинина, гистидина) и других субстратов (например, бетаина, бутанола). Кроме того, указанные виды различаются ауксотрофностью по определенным витаминам (например, тиамину, биотину). Указанные виды отличают различия в последовательностях нуклеиновых кислот и аминокислот генов и белков пути Вуда-Льюнгдаля, хотя общая организация и число указанных генов и белков, как было обнаружено, одинакова у всех видов (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).
Соответственно, в целом, многие из характеристик Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei не являются специфическими для данного вида, а представляют собой общие характеристики указанного кластера С1-фиксирующих, анаэробных, ацетогенных, этанологенных и карбоксидотрофных представителей рода Clostridium. Однако поскольку указанные виды фактически являются отдельными видами, генетическая модификация или манипуляции, произведенные с одним из указанных видов, могут не оказывать идентичного эффекта на другой вид из указанных видов. Например, могут наблюдаться различия в росте, производительности или продуцировании продукта.
Микроорганизм согласно настоящему изобретению может также происходить из изолята или му
- 39 043734 танта Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii или Clostridium ragsdalei.
Изоляты и мутанты Clostridium autoethanogenum включают JAI-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200) и LZ1561 (DSM23693). Изоляты и мутанты Clostridium ljungdahlii включают ATCC 49587 (Tanner, IntJSystBacterial, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (US 5593886), C-01 (ATCC 55988) (US 6368819), O52 (ATCC 55989) (US 6368819) и OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010). Изоляты и мутанты Clostridium ragsdalei включают PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO 2008/028055).
Однако согласно некоторым вариантам реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм, отличный от Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Например, указанный микроорганизм может быть выбран из группы, состоящей из
Escherichia coll, Saccharomyces cerevisiae, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharbutyricum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium butyricum, Clostridium diolis, Clostridium kluyveri, Clostridium pasterianium, Clostridium novyi, Clostridium difficile, Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium cellulovorans, Clostridium phytofermentans, Lactococcus lacks, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Zymomonas mobilis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Corynebacterium glutamicum, Trichoderma reesei, Cupriavidus necator, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum nMethylobacterium extorquens.
Субстрат относится к источнику углерода и/или энергии для микроорганизма согласно настоящему изобретению. Обычно указанный субстрат является газообразным и содержит С1-источник углерода, например СО, CO2 и/или CH4. Предпочтительно указанный субстрат содержит С1-источник углерода в виде CO или CO+CO2. Указанный субстрат может дополнительно содержать другие неуглеродные компоненты, такие как H2, N2, или электроны.
Субстрат обычно содержит по меньшей мере некоторое количество СО, например, приблизительно 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мол.% CO. Субстрат может содержать различное количество СО, например, приблизительно 20-80, 30-70 или 40-60 мол.% CO. Предпочтительно, субстрат содержит приблизительно 40-70 мол.% CO (например, газ сталелитейного производства или доменный газ), приблизительно 20-30 мол.% CO (например, отходящий газ кислородно-конвертерного процесса) или приблизительно 15-45 мол.% CO (например, сингаз). Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат может содержать относительно небольшое количество СО, например, приблизительно 1-10 или 1-20 мол.% CO. Микроорганизм согласно настоящему изобретению, как правило, преобразует по меньшей мере часть CO в субстрате в продукт. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат не содержит или по существу не содержит CO.
Субстрат может содержать некоторое количество H2. Например, субстрат может содержать приблизительно 1, 2, 5, 10, 15, 20 или 30 мол.% H2. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат может содержать относительно большое количество Нг, например, приблизительно 60, 70, 80 или 90 мол.% H2. Согласно дополнительным вариантам реализации указанный субстрат не содержит или по существу не содержит H2.
Субстрат может содержать некоторое количество CO2. Например, субстрат может содержать приблизительно 1-80 или 1-30 мол.% CO2. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат может содержать менее чем приблизительно 20, 15, 10 или 5 мол.% CO2. Согласно другому варианту реализации указанный субстрат не содержит или по существу не содержит CO2.
Хотя субстрат, как правило, является газообразным, он может также быть представлен альтернативными формами. Например, указанный субстрат может быть растворен в жидкости, насыщенной СОсодержащим газом с применением генератора микропузырьковых дисперсий. Согласно дополнительному примеру субстрат может быть адсорбирован на твердой подложке.
Субстрат и/или С1-источник углерода может представлять собой отработанный газ, получаемый в виде побочного продукта промышленного процесса или из некоторого другого источника, например, из выхлопных газов автомобилей или при газификации биомассы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный промышленный процесс выбран из группы, состоящей из производства продуктов из черных металлов, такого как сталелитейное производство, производства продуктов из цветных металлов, процессов переработки нефти, газификации угля, получения электроэнергии, получения сажистых веществ, получения аммиака, получения метанола и производства кокса. Согласно указанным вариантам реализации указанный субстрат и/или С1-источник углерода может быть захвачен из промышленного процесса до того, как он будет выброшен в атмосферу, с применением любого удобного способа.
- 40 043734
Указанный субстрат и/или С1-источник углерода может представлять собой сингаз, такой как сингаз, полученный путем газификации угля или остатков нефтепереработки, газификации биомассы или лигноцеллюлозного материал, или риформинга природного газа. Согласно другому варианту реализации указанный сингаз может быть получен при газификации твердых бытовых отходов или твердых промышленных отходов.
Состав субстрата может оказывать значимое влияние на эффективность и/или стоимость реакции. Например, присутствие кислорода (O2) может снижать эффективность процесса анаэробной ферментации. В зависимости от состава субстрата могут быть желательны обработка, очистка или фильтрация субстрата для удаления каких-либо нежелательных загрязняющих примесей, таких как токсины, нежелательные компоненты или пылевые частицы, и/или увеличения концентрации желательных компонентов.
Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть культивирован для продуцирования одного или более продуктов. Например, Clostridium autoethanogenum продуцирует или может быть сконструирован таким образом, чтобы продуцировать этанол (WO 2007/117I57), ацетат (WO 2007/117157), бутанол (WO 2008/115080 и WO 2012/053905), бутират (WO 2008/115080), 2,3-бутандиол (WO 2009/151342), лактат (WO 2011/112103), бутен (WO 2012/024522), бутадиен (WO 2012/024522), метилэтилкетон (2-бутанон) (WO 2012/024522 и WO 2013/185123), этилен (WO 2012/026833), ацетон (WO 2012/115527), изопропанол (WO 2012/115527), липиды (WO 2013/036147), 3-гидроксипропионат (3-НР) (WO 2013/180581), изопрен (WO 2013/180584), жирные кислоты (WO 2013/191567), 2-бутанол (WO 2013/185123), 1,2-пропандиол (WO 2014/0369152) и 1-пропанол (WO 2014/0369152). Помимо одного или более целевых продуктов микроорганизм согласно настоящему изобретению может также продуцировать этанол, ацетат и/или 2,3-бутандиол. Согласно некоторым вариантам реализации собственно биомасса микроорганизмов может считаться продуктом.
Нативный продукт представляет собой продукт, продуцируемый генетически немодифицированным микроорганизмом. Например, этанол, ацетат и 2,3-бутандиол представляют собой нативные продукты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Негативный продукт представляет собой продукт, продуцируемый генетически модифицированным микроорганизмом, однако не продуцируемый генетически немодифицированным микроорганизмом, из которого происходит указанный генетически модифицированный микроорганизм.
Термины промежуточный продукт и предшественник, которые могут называться взаимозаменяемо в настоящем документе, относятся к молекулярному объекту, расположенному выше по ходу ферментативного пути относительно наблюдаемого или целевого продукта.
Селективность относится к отношению продуцирования целевого продукта к продуцированию всех продуктов ферментации микроорганизма. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть сконструирован таким образом, чтобы продуцировать продукты с определенной селективностью или с минимальной селективностью. Согласно одному варианту реализации целевой продукт составляет по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% или 75% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации указанный целевой продукт составляет по меньшей мере 10% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению, таким образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению отличается селективностью в отношении целевого продукта, составляющей по меньшей мере 10%. Согласно другому варианту реализации указанный целевой продукт составляет по меньшей мере 30% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению, таким образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению отличается селективностью в отношении целевого продукта, составляющей по меньшей мере 30%.
Увеличение эффективности, увеличенная эффективность и т.п. включает, не ограничиваясь перечисленными, увеличение скорости роста, скорости или объема продуцирования продукта, отношения объема продукта к объему потребленного субстрата или селективности продукта. Эффективность может быть измерена относительно производительности исходного микроорганизма, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению.
Обычно культивирование осуществляют в биореакторе. Термин биореактор включает устройство для культивирования/ферментации, состоящее из одного или более сосудов, колонн или трубок, например, проточный реактор с мешалкой (CSTR), реактор с иммобилизованными клетками (ICR), реактор с орошаемым слоем (TBR), барботажную колонку, газлифтный ферментер, статический смеситель или другой сосуд или другое устройство, подходящее для газожидкостного контакта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный биореактор может содержать первый реактор для роста и второй реактор для культивирования/ферментации. Субстрат может быть добавлен в один или в оба указанных реактора. В настоящем документе термины культура, культивирование и ферментация используются взаимозаменяемо. Указанные термины охватывают как фазу роста, так и фазу биосинтеза продукта в процессе культивирования/ферментации.
Культуру обычно поддерживают на водной культуральной среде, которая содержит питательные вещества, витамины и/или минеральные вещества, достаточные для обеспечения роста указанного мик- 41 043734 роорганизма. Предпочтительно, указанная водная культуральная среда представляет собой ростовую среду для анаэробных микроорганизмов, такую как минимальная ростовая среда для анаэробных микроорганизмов. Подходящие среды хорошо известны в данной области техники.
Культивирование/ферментацию предпочтительно проводят в подходящих условиях для продуцирования целевого продукта. Обычно культивирование/ферментацию осуществляют в анаэробных условиях. Учитываемые реакционные условия включают давление (или парциальное давление), температура, скорость потока газа, скорость потока жидкости, pH среды, редокс-потенциал среды, скорость перемешивания (при использовании проточного реактора с мешалкой), уровень инокулята, максимальные концентрации газового субстрата для того, чтобы газ в жидкой фазе не становился ограничивающим фактором, и максимальные концентрации продукта, чтобы избежать ингибирования продуктом. В частности, можно контролировать скорость введения субстрата для того, чтобы концентрация газа в жидкой фазе не становилась ограничивающим фактором, поскольку культура может потреблять продукты в условиях ограниченной доступности газа.
Эксплуатация биореактора при повышенном давлении позволяет увеличить скорость массопереноса газа из газовой фазы в жидкую фазу. Соответственно, обычно предпочтительно проведение культивирования/ферментации при давлении, превышающем атмосферное давление. Также, поскольку определенная скорость преобразования газа является, отчасти, функцией от времени удерживания субстрата, а время удерживания определяет требуемый объем биореактора, применение систем под давлением может значительно снижать требуемый объем биореактора и, следовательно, капитальную стоимость оборудования для культивирования/ферментации. Это, в свою очередь, означает, что время удерживания, определяемое как результат деления объема жидкости в биореакторе на скорость входящего потока газа, может быть снижено при поддержании повышенного, а не атмосферного давления в биореакторах. Оптимальные реакционные условия отчасти зависят от конкретного используемого микроорганизма. Однако, в целом, предпочтительно осуществление ферментации при давлении, превышающем атмосферное давление. Также, поскольку определенная скорость преобразования газа является, отчасти, функцией от времени удерживания субстрата, а достижение требуемого времени удерживания, в свою очередь, определяет требуемый объем биореактора, применение систем под давлением может значительно снижать требуемый объем биореактора, и, следовательно, капитальную стоимость оборудования для ферментации.
Целевые продукты могут быть отделены или очищены из ферментативного бульона с применением любого способа или комбинации способов, известных в данной области техники, включая, например, фракционную дистилляцию, испарение, первапорацию, отдувку газом, фазовое разделение и экстрактивную ферментацию, в том числе например, жидкостно-жидкостную экстракцию. Согласно некоторым вариантам реализации целевые продукты выделяют из ферментативного бульона путем непрерывного удаления части бульона из биореактора, отделения клеток микроорганизма из бульона (которое удобно осуществлять путем фильтрации) и извлечения из бульона одного или более целевых продуктов. Спирты и/или ацетон можно выделить, например, путем дистилляции. Кислоты могут быть выделены, например, путем адсорбции на активированном угле. Отделенные клетки микроорганизма предпочтительно возвращают в биореактор. Бесклеточный пермеат, остающийся после извлечения целевых продуктов, также предпочтительно возвращают в биореактор. Дополнительные питательные вещества (такие как витамины В) могут быть добавлены в бесклеточный пермеат для восполнения среды перед ее возвращением в биореактор.
Примеры
Приведенные ниже примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, однако, разумеется, не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие его объем.
Пример 1.
В указанном примере продемонстрирована способность Ptb-Buk к преобразованию ацетоацетилКоА в ацетоацетат у E.coli in vivo и применение Ptb-Buk при получении ацетона, изопропанола, 3гидроксибутирата и изобутилена.
Разрабатывали и конструировали пути на основе системы Ptb-Buk для получения ацетоацетата из ацетоацетил-КоА. Это осуществляли модульным способом с применением векторной системы pDUET (Novagen). Один модуль содержал гены ptb-buk из С. beijerinckii NCIMB8052 (GenBank NC_009617, позиция 232027..234147; Cbei_0203-204; NCBI-GeneID 5291437-38) на плазмиде pACYC. Другой модуль содержал ген тиолазы thlA С. acetobutylicum (Genbank NC_001988, позиция 82040..83218; СА_Р0078; NCBI-GeneID 1116083) и ген ацетоацетатдекарбоксилазы adc С. beijerinckii NCIMB8052 (Genbank NC_009617, позиция 4401916..4402656; Cbei_3835; NCBI-GeneID 5294996) на плазмиде pCOLA. Гены Ptb и buk амплифицировали из геномной ДНК С. beijerinckii NCIMB8052, а гены thlA и adc из существующей плазмиды для ацетона pMTL85147-thlA-ctfAB-adc (WO 2012/115527) и клонировали под контролем промотора Т7, присутствующего в векторах pDUET, посредством независимого от рестрикции клонирования с применением метода кольцевого полимеразного удлинения (СРЕС) (Quan, PloS One, 4:е6441, 2009).
Олигонуклеотиды, используемые для амплификации генов ptb и buk:
- 42 043734
SEQ ID NO: | Название | Последовательность | Направле ние |
95 | pACYCDuet-ptb-buk pACYC-ptb-Rl | AAGTTTTTACTCATATGTATATC TCCTTCTTATACTTAAC | обратный |
96 | pACYCDuet-ptb-buk - ptbpACYC-Fl | AGAAGGAGATATACATATGAGT AAAAACTTTGATGAGTTA | прямой |
97 | pACYCDuet-ptb-buk buk-pACYC-Rl | ACCAGACTCGAGGGTACCTAGT AAACCTTAGCTTGTTC | обратный |
98 | pACYCDuet-ptb-buk pACYC-buk-Fl | TAAGGTTTACTAGGTACCCTCG AGTCTGGTAAAGAAAC | прямой |
Олигонуклеотиды, используемые для амплификации генов thlA и adc:
SEQ ID NO: | Название | Последовательность | Направлен ие |
99 | pCOLADuet-thlA-adc - thlA-adc-Rl | ACATATGTATATCTCCTTCTTACT AGCACTTTTCTAGCAATATTG | обратный |
100 | pCOLADuet-thlA-adc - adc- ThlA-Fl | AGTAAGAAGGAGATATACATAT GTTAGAAAGTGAAGTATCTAAAC | прямой |
101 | pCOLADuet-thlA-adc - adcpCOLA-Rl | CAGACTCGAGGGTACCTTATTTT ACTGAAAGATAATCATGTAC | обратный |
102 | pCOLADuet-thlA-adc pCOLA-adc-Fl | TCTTTCAGTAAAATAAGGTACCC TCGAGTCTGGTAAAGAAAC | прямой |
103 | pCOLADuet-thlA-adc thlA-pCOLA-Fl | GAAGGAGATATACATATGAAAG AAGTTGTAATAGCTAGTG | прямой |
104 | pCOLADuet-thlA-adc pCOLA-thlA-Rl | ACAACTTCTTTCATATGTATATCT CCTTCTTATACTTAAC | обратный |
После конструирования плазмид pACYC-ptb-buk (SEQ ID NO: 105) и pCOLA-thlA-adc (SEQ ID NO: 106), ими индивидуально и совместно трансформировали E. coli BL21 (DE3) (Novagen) и проводили эксперименты с ростом в 4 повторностях в 1,5 мл культур в 12-луночных планшетах при 28°С с орбитальным встряхиванием при 160 об/мин с применением минимальной среды М9 (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) с глюкозой (фиг. 4). Указанные культуры инокулировали с плотностью, соответствующей OD600 нм=0,1 и индуцировали разными концентрациями ИПТГ (0, 50, 100 мкМ) через 2 ч роста (фиг. 5). Указанные планшеты герметично закрывали с применением липкой пленки для планшетов и над каждой лункой иглой с зеленым концом делали прокол для обеспечения микроаэробных условий. Рост продолжался в течение дополнительных 64 ч индукции. Указанный эксперимент проводили в трех повторностях.
Концентрации ацетона, а также концентрации других метаболитов, таких как изобутилен, измеряли с применением газохроматографического (ГХ) анализа, используя систему для парофазной ГХ Agilent 6890N, оснащенную полиэтиленгликолевым (ПЭГ) волокном 60 мкм Supelco для твердофазной микроэкстракции, колонкой Restek Rtx-1 (30 мх0,32 мкмх5 мкм) и пламенно-ионизационным детектором (FID). Образцы (4 мл) переносили в 20 мл флакон для парофазного анализа, над которым инкубировали (экспонировали) волокно в течение 10 мин при 50°С. Образец десорбировали в инжекторе при 250°С в течение 9 мин. Хроматографию проводили с использованием программы термостата на 40°С (5-минутное удерживание) и от 10°С/мин до 200°С, с последующим 5-минутным удерживанием при 220°С. Скорость потока через колонку составляла 1 мл/мин, водород использовали в качестве газа-носителя. Температуру FID поддерживали на уровне 250°С; 40 мл/мин водорода, 450 мл/мин воздуха и 15 мл/мин азота использовали в качестве поддувочного газа.
Было совершенно очевидно, что штамм, несущий как плазмиду pACYC-ptb-buk, так и плазмиду pCOLA-thlA-adc (экспрессирующий тиолазу, Ptb-Buk и ацетоацетатдекарбоксилазу), продуцировал ацетон. Средний измеренный итоговый показатель продуцирования ацетона составил 0,19 г/л, при этом продуцирование ацетона отсутствовало в контроле без плазмид, в контрольной среде и в несущих одну плазмиду контролях с pACYC-ptb-buk (экспрессирующих Ptb-Buk) или pCOLA-thlA-adc (экспрессирующих тиолазу и ацетоацетатдекарбоксилазу) (ниже достоверного предела детекции). Неиндуцированная культура штамма, несущего как плазмиду pACYC-ptb-buk, так и плазмиду pCOLA-thlA-adc (экспрессирующего тиолазу, Ptb-Buk и ацетоацетатдекарбоксилазу), не продуцировала ацетон в поддающихся оценке количествах.
Средние показатели продуцирования ацетона у E.coli BL21 (DE3)
Штамм | Ацетон (г/л) |
Thl+Ptb-Buk+Adc [A coli BL21 (DE3) + pACYC-ptb-buk + pCOLA-thlA-adc] | 0,19±0,04 |
Thl+Adc отдельно [Е. coli BL21 (DE3) + pCOLA-thlA-adc] | 0,04±0,01 |
Ptb-Buk отдельно [E. coli BL21 (DE3) + pACYC-ptb-buk] | 0,03±0,01 |
Без контрольной плазмиды {E. coli BL21 (DE3)] | 0,04±0,01 |
Контрольная среда | 0,03±0,01 |
Настоящий эксперимент ясно демонстрирует, что Ptb-Buk способна осуществлять преобразование ацетоацетил-КоА в ацетоацетат и может быть использован вместо КоА-трансферазы или тиоэстеразы для продуцирования ацетона, что показано на примере маршрута, включающего этапы 1, 2, и 3 согласно фиг. 1.
Хорошо известно, что изопропанол может быть продуцирован из ацетона путем добавления пер
- 43 043734 вичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014) (этап 4 на фиг. 1), и что изобутилен может быть продуцирован из ацетона путем добавления гидроксиизовалератсинтазы (этап 5 на фиг. 1) и декарбоксилазы (этап 6 на фиг. 1) (van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012). Можно сконструировать путь, включающий продемонстрированный выше маршрут продуцирования ацетона с помощью Ptb-Buk, используя гены thlA, ptb-buk и adc, а также ген первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (например, под номером доступа Genbank NC_022592, поз. 609711..610766; CAETHG_0553; NCBI-GeneID: 17333984), что обеспечит продуцирование изопропанола с помощью системы Ptb-Buk у E.coli, включающее этапы 1, 2, 3 и 4 согласно фиг. 1. Аналогичным образом, может быть сконструирован путь, который включает представленный выше маршрут продуцирования ацетона с помощью Ptb-Buk-преобразования ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, с использованием генов thlA, ptb-buk и adc и генов гидроксиизовалератсинтазы и декарбоксилазы, обеспечивающий продуцирование изобутилена с помощью системы Ptb-Buk у E.coli, содержащей этапы 1, 2, 3, 5 и 6 согласно фиг. 1. Ацетоацетат может также быть преобразован в 3-гидроксибутират с помощью 3гидроксибутиратдегидрогеназы Bdh. Указанное преобразование может быть скомбинировано с Ptb-Bukпреобразованием ацетоацетил-КоА в ацетоацетат для продуцирования 3-гидроксибутирата у штамма, экспрессирующего гены thlA, ptb-buk и bdh, с получением пути, содержащего этапы 1, 2 и 15 согласно фиг. 1.
Пример 2.
В указанном примере продемонстрирована способность Ptb-Buk к преобразованию ацетоацетилКоА в ацетоацетат у С. autoethanogenum in vivo, и применение Ptb-Buk при получении ацетона, изопропанола, 3-гидроксибутирата и изобутилена из газообразного субстрата.
Чтобы продемонстрировать, что система Ptb-Buk также позволяет синтезировать ацетон, изопропанол или изобутилен из газообразных субстратов, конструировали плазмиду, которая содержит те же гены, что и описанные в примере 1, thl+ptb-buk+adc, под контролем клостридиального промотора на челночном векторе, что обеспечивает экспрессию в ацетогенах, таких как С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei.
Плазмида pMTL представляет собой челночную плазмидную систему для введения кольцевой DNA в Clostridia посредством конъюгации E.coli (Heap, J Microbiol Methods, 78: 79-85, 2009). Представляющие интерес гены (т.е. hbd, phaB, thlA, ptb, buk и aorl) клонировали в область lacZ указанных плазмид с применением общих техник молекулярной биологии, в том числе рестрикционного расщепления ДНК с последующим лигированием, и технологии сборки ДНК Golden Gate, согласно которой в плазмиду клонируют одновременно более одной части фрагментов ДНК. Сконструированные плазмиды верифицируют посредством ДНК-секвенирования.
Продуцирование ацетона и изопропанола ранее было продемонстрировано у С. autoethanogenum с применением плазмиды pMTL85147-thlA-ctfAB-adc, кодирующей thl+ctfAB+ adc (WO 2012/115527) под контролем клостридиального промотора из генного кластера Вуда-Льюнгдаля. В указанной плазмиде гены ctfAB, кодирующие КоА-трансферазу, прямо заменяли генами ptb-buk, кодирующими систему PtbBuk. Это осуществляли согласно описанию в примере 1 с применением способа СРЕС. Итоговая плазмида: pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.
Олигонуклеотиды, использованные для амплификации ptb-buk и клонирования в pMTL8317-thl-ptbbuk-adc, опис аны ниже._____________________________________________________________
SEQ ID NO: | Название | Последовательность | Направле ние |
107 | thlA-ptb-Rl | ATTTCCTCCCTTTCTAGCACTTT TCTAGCAATATTG | Обратный |
108 | adc-buk-Fl | TAAGGTTTACTAAGGAGGTTGT TTTATGTTAGAAAG | Прямой |
109 | thlA-ptb-Fl | GCTAGAAAAGTGCTAGAAAGG GAGGAAATGAACATG | Прямой |
ПО | Buk-adc-Rl | AAAACAACCTCCTTAGTAAACC TTAGCTTGTTCTTC | Обратный |
С. autoethanogenum DSM10061 и DSM23693 (дериват DSM1G061) получали из DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Инхоффенштрассе 7 В, 38124 Брауншвейг, Германия).
Штаммы культивировали при 37°С на среде РЕТС при pH 5,6 с применением стандартных анаэробных техник (Hungate, Meth Microbiol, ЗВ: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microb Physiol, 6:107-146, 1971). Содержащий 30 фунтов/кв.дюйм CO газ сталелитейных производств (собранный на объекте New Zealand Steel в Гленбруке, Новая Зеландия) или синтетическую смесь газов с таким же составом, 44% СО, 32% N2, 22% CO2, 2% H2, использовали в качестве субстрата для аутотрофного роста. Для получения твердой среды добавляли 1,2 % бакто-агара (BD, Франклин Лейке, Нью-Джерси 07417, США).
Синтезировали конструкцию и затем трансформировали С. autoethanogenum посредством конъюгации. Для этого экспрессионный вектор сначала вводили в конъюгативный донорный штамм E. coli HB101+R702(CA434) (Williams, J Gen Microbiol, 1136: 819-826, 1990) (донор) с применением стандартной трансформации методом теплового шока. Донорные клетки восстанавливали в среде SOC (Sambrook,
- 44 043734
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) при 37°C в течение 1 ч до высевания на чашки со средой LB (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989), содержащей 100 мкг/мл спектиномицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола. Чашки с LB инкубировали при 37°С в течение ночи. На следующий день аликвоты объемом 5 мл, содержащие LB с 100 мкг/мл спектиномицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола, инокулировали несколькими донорными колониями и инкубировали при 37°С, встряхивали в течение приблизительно 4 ч, или до наблюдаемой видимой плотности культуры, но до наступления стационарной фазы. 1,5 мл донорной культуры собирали в микроцентрифужную пробирку при комнатной температуре путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 2 мин; супернатант утилизировали. Донорные клетки аккуратно ресуспендировали в 500 мкл стерильного буфера ФСБ (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 2 мин; супернатант ФСБ утилизировали. Осадок вводили в анаэробную камеру и аккуратно ресуспендировали в 200 мкл культуры С. autoethanogenum (реципиента) во время поздней экспоненциальной фазы. Указанную смесь для конъюгации (смесь донорных и реципиентных клеток) наносили на чашки с PETC-MES +фруктозный агар и оставляли для высыхания. Когда пятна при визуальном осмотре переставали быть влажными, чашки помещали в сосуд для использования под давлением, нагнетали сингаз до 25-30 фунтов/кв. дюйм и инкубировали при 37°С в течение ~24 ч. Через 24 ч инкубирования смесь для конъюгации извлекали из чашек, аккуратно соскребая ее с применением инокуляционной петли на 10 мкл. Извлеченную смесь суспендировали в 200-300 мкл среды РЕТС. Аликвоты указанной смеси для конъюгации объемом 100 мкл высевали на чашки с агаровой средой РЕТС с добавлением 15 мкг/мл тиамфеникола для выбора трансформантов, несущих плазмиду, которая придает устойчивость к тиамфениколу за счет экспрессии хлорамфениколацетилтрансферазы.
Три отдельных колонии С. autoethanogenum, несущие плазмиду pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc, инокулировали в 2 мл среды PETC-MES с 15 мкг/мл тиамфеникола, и культивировали в автотрофных условиях при 37°С с орбитальным встряхиванием на 100 об/мин в течение трех дней. Культуры разводили до OD600 нм=0,05 с 10 мл среды PETC-MES с 15 мкг/мл тиамфеникола в бутылях для сыворотки и культивировали в автотрофных условиях при 37°С с орбитальным встряхиванием на 100 об/мин в течение пяти дней, ежедневно отбирая образцы для измерения биомассы и метаболитов. Параллельно изучали контрольный штамм, в котором экспрессионная плазмида кодировали только thl и adc под контролем промотора кластера Вуда-Льюнгдаля, без генов ctfAB или ptb-buk для катализа образования ацетоацетата из ацетоацетил-КоА (pMTL85147-thlA-adc). Образцы культур отбирали в течение пяти дней для мониторинга накопления метаболитов и биомассы.
Концентрации изопропанола, а также концентрации этанола, уксусной кислоты, 2,3-бутандиола и молочной кислоты измеряли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на Agilent LC с рефрактометрической (RI) детекцией при 35°С. Образцы получали путем разведения 400 мкл с 100 мкл раствора 5-сульфосалициловой кислоты (1 мас./об.% в 1М серной кислоте), с последующим 3-минутным центрифугированием при 14000 об/мин; супернатант переносили в стеклянный флакон для анализа. Разделение проводили, вводя пробу объемом 10 мкл на колонку Alltech IOA-2000 (150 ммх6,5 ммх8 мкм) со скоростью 0,7 мл/мин при 65°С в изократических условиях, с применением 5 мМ серной кислоты в качестве подвижной фазы.
В некоторых случаях использовали более длительный метод ВЭЖХ для улучшения разделения пиков. Согласно указанному способу концентрации изопропанола, этанола, ацетата, 2,3-бутандиола, а также 3-гидроксибутирата (который не подлежит разделению с применением более краткого метода) измеряли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на Agilent 1260 Infinity LC с рефрактометрической (RI) детекцией при 35°С. Образцы получали путем разведения 400 мкл с 100 мкл раствора 5-сульфосалициловой кислоты (1 мас./об.% в 1М серной кислоте), с последующим 3-минутным центрифугированием при 14000 об/мин; супернатант переносили в стеклянный флакон для анализа. Разделение проводили, вводя пробу объемом 10 мкл на колонку Aminex HPX-87H (300 ммх7,8 ммх9 мкм) со скоростью 0,6 мл/мин при 35°С в изократических условиях, с применением 5 мМ серной кислоты в качестве подвижной фазы. autoethanogenum, несущий pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc. продуцировал изопропанол в количестве до 0,804 г ИПА/г биомассы, тогда как контрольный штамм С- autoethanogenum с pMTL85147-thlA-adc, не содержащей Ptb-Buk, не продуцировал ИПА (фиг. 12).
Настоящий эксперимент ясно демонстрирует, что Ptb-Buk способна осуществлять преобразование ацетоацетил-КоА в ацетоацетат в пути изопропанола при использовании газообразного субстрата. PtbBuk может быть использована вместо КоА-трансферазы или тиоэстеразы ферментирующим газ ацетогеном, таким как С. autoethanogenum, что показано на примере использования маршрута, включающего этапы 1, 2, 3 и 4 согласно фиг. 1.
С. autoethanogenum содержит нативную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу которая преобразует ацетон в изопропанол (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Было продемонстрировано, что нокаут указанного гена элиминирует преобразование ацетона в изопропанол у С. autoethanogenum (WO 2015/085015). На фоне указанного нокаута становится возможным получение ацето-
- 45 043734 на (а не изопропанола) с помощью системы Ptb-Buk из газообразного сырья с применением тех же генов, включающее этапы 1, 2 и 3 согласно фиг. 1. Добавление генов гидроксиизовалератсинтазы и декарбоксилазы (van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93:1377-1387, 2012) в указанный штамм обеспечивает продуцирование изобутилена из газа у С. autoethanogenum или аналогичных бактерий, включающее этапы 1,
2, 3, 5 и 6 согласно фиг. 1.
Ацетоацетат может таюке быть преобразован в 3-гидроксибутират с помощью 3гидроксибутиратдегидрогеназы Bdh. 3-гидроксибутиратдегидрогеназа была идентифицирована в геноме С. autoethanogenum (AGY75962) и других ацетогенов, таких как С. ljungdahlii (ADK16920.1). Указанная активность может быть скомбинирована с Ptb-Buk- (или КоА-трансферазным) преобразованием ацетоацетил-КоА в ацетоацетат для продуцирования 3-гидроксибутирата штаммом, экспрессирующим гены thlA, ptb-buk (или ctfAB) и bdh, что дает путь, содержащий этапы 1, 2 и 15 согласно фиг. 1. Для С. autoethanogenum были продемонстрированы низкие уровни образования 3-гидроксибутирата (до 2 г/л) через указанный маршрут. Указанные уровни могут быть увеличены путем избыточной экспрессии гена Bdh, который естественным образом экспрессируется на незначительных уровнях.
В одном эксперименте С. autoethanogenum, трансформировали плазмидой pMTL82256-thlA-ctfAB согласно описанию в примере 2. Продуцирование отслеживали в течение 10 дней на шести биологических репликатах в аутотрофных условиях согласно описанию в примере 2. Средний показатель для 3-ГБ через 10 дней составил 1,86±0,14 г/л. На 10 день средний титр продуцируемого 1,3-бутандиола (из 3-ГБ) составил 0,38±0,05 г/л (фиг. 37). Не происходило образования ацетона или изопропанола. Это показывает, что 3-ГБ может быть эффективно продуцирован нативными ферментами через ацетоацетат.
Согласно некоторым вариантам реализации может быть желательным нокаут или нокдаун экспрессии 3-гидроксибутиратдегидрогеназ, таких как Bdh, для предотвращения утечки углерода в 3-ГБ и, соответственно, стимуляции продуцирования таких продуктов, как ацетон, изопропанол и изобутилен.
Пример 3.
В указанном примере продемонстрирована способность Ptb-Buk к преобразованию (R)-3гидроксибутирил-КоА в (R)-3-гидроксибутират в E.coli in vivo для продуцирования (R)гидроксибутирата, ацетона, изопропанола или изобутилена.
Разрабатывали и сконструировали пути, основанные на системе Ptb-Buk, для получения (R)-3гидроксибутирата из (R)-3-гидроксибутирил-КоА. Кроме того, использовали 3-гидроксибутиратдегидрогеназу (Bdh) для преобразования (R)-3-ГБ в ацетоацетат. Описано содержание у Ralstonia pickettii двух 3-гидроксибутиратдегидрогеназ, Bdh1 и Bdh2, способных к преобразованию 3гидроксибутират в ацетоацетат да vitro (Takanashi, J Biosci Bioeng, 101:501-507, 2006). Один разработанный путь включал применение указанного фермента для продуцирования ацетона (этапы 1, 13, 14, 15, 3 согласно фиг. 1), с повторным использованием восстанавливающих эквивалентов, полученных при продуцировании (R)-3-гидроксибутирил-КоА, и АТФ, генерированной Ptb-Buk (фиг. 6).
Указанные пути конструировали модульным способом с применением векторной системы pDUET (Novagen). Указанные два модуля, описанные в примере выше (pACYC-ptb-buk для экспрессии Ptb-Buk; и pCOLA-thlA-adc для экспрессии тиолазы и ацетоацетатдекарбоксилазы) использовали совместно с двумя дополнительными модулями, каждый из которых содержал (R)-специфическую 3гидроксибутиратдегидрогеназу phaB Cupravidus necator (WP_010810131.1) (pCDF-phaB), а один содержал также ген 3-гидроксибутиратдегидрогеназы bdh1 Rasltonia pickettii (BAE72684.1) (pCDF-phaB-bdh1) в векторе pCDF. Оба гена, phaB и bdh1, были синтезированы с помощью GeneArt и клонированы под контролем промотора Т7, присутствующего при независимом от рестрикции клонировании с применением метода кольцевого полимеразного удлинения (СРЕС) (Quan, PloS One, 4:e6441, 2009).
Олигонуклеотиды, используемые для амплификации гена bdh1:_______________________
SEQ ID NO: | Название | Последовательность | Направлен ие |
111 | pDuet-insert2-Rl | CATATGTATATCTCCTTCTTATAC TTAAC | прямой |
112 | insert2-pDuet-Fl | GTTAAGTATAAGAAGGAGATATA CATATG | прямой |
113 | pDuet-insert2-Fl | CCTCGAGTCTGGTAAAGAAAC | прямой |
114 | insert2-pDuet-Rl | GTTTCTTTACCAGACTCGAGG | прямой |
Олигонуклеотиды, используемые для амплификации гена phaB:
SEQ ID NO: | Название | Последовательность | Направлен ие |
115 | pCDF-phaB -pACYC- phaB-Rl | CTATTCTTTGTGTCATGGTATATC TCCTTATTAAAG | прямой |
116 | pCDF-phaB - phaBpACYC-Fl | ATAAGGAGATATACCATGACACA AAGAATAGCATAC | прямой |
- 46 043734
117 | pCDF-phaB - pACYCphaB-Fl | TGGTTTACACATGGGATAAGATC CGAATTCGAGCTC | прямой |
118 | pCDF-phaB - phaBpACYC-Rl | AGCTCGAATTCGGATCTTATCCC ATGTGTAAACCAC | прямой |
После конструирования плазмид pACYC-ptb-buk (SEQ ID NO: 105), pCOLA-thlA-adc (SEQ
ID NO: 106), pCDF-phaB (SEQ ID NO: 119) и pCDF-phaB-bdhl (SEQ ID NO: 120) ими трансформировали индивидуально и в комбинациях E.coli BL21 (DE3) (Novagen) и проводили эксперименты с ростом в 4 повторностях в культуре объемом 1,5 мл в 12-луночных планшетах при 28°С с орбитальным встряхиванием при 160 об/мин с применением минимальной среды М9 с глюкозой. Культуры инокулировали с плотностью, соответствующей OD600hm=0,1, и через 2 ч роста индуцировали разными концентрациями ИПТГ (0, 50, 100 мкМ). Указанные планшеты герметично закрывали с применением липкой пленки для планшетов BioRad и над каждой лункой иглой с зеленым концом делали прокол для обеспечения микроаэробных условий. Рост продолжался в течение дополнительных 64 ч индукции. Указанный эксперимент проводили в 3 повторностях. Метаболиты измеряли согласно описанию в предыдущих примерах.
Культуры, содержащие комбинацию плазмид pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc и pCDF-phaB, продуцировали 1,65-2,4 г/л (R)-3-гидроксибутирата (в зависимости от уровня индуктора) с очень незначительным количеством побочных продуктов (фиг. 13A-F), демонстрируя эффективность системы Ptb-Buk для преобразования (R)-3-гидроксибутирил-КоА в (R)-3-гидроксибутират и поддержания роста (фиг. 13A-F). В культуральной среде в культурах, которые также экспрессировали bdh1 (содержащих комбинацию плазмид pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc и pCDF-phaB-bdhl) были обнаружены только незначительные количества (К)-3-гидроксибутирата, тогда как ацетон был обнаружен в количестве от 0,89 до 1,16 г/л (в зависимости от уровня индуктора), что указывает на эффективность гена bdh1 для преобразования (R)-3гидроксибутирата в ацетоацетат, и далее в ацетон. Ни 3-гидроксибутират, ни ацетон не были обнаружены при любых комбинациях плазмид без Ptb-Buk (фиг. 13 A-F). В указанных культурах уровни ацетата уровни были значимо выше.
Настоящий эксперимент ясно демонстрирует, что Ptb-Buk способна осуществлять преобразование (К)-3-гидроксибутират-КоА в 3-гидроксибутират, а также что Bdh1 способен к преобразованию in vivo 3гидроксибутирата далее в ацетоацетат путем повторного использования восстанавливающих эквивалентов, полученных при продуцировании (К)-3-гидроксибутирил-КоА. Настоящий эксперимент также выявляет, что Ptb-Buk способна поддерживать рост и, соответственно, продуцирование ацетата перестает быть необходимостью. Продуцирование (R)-3-гидроксибутирата было показано на примере штамма, содержащего этапы 1, 13 и 14 согласно фиг. 1. Продуцирование ацетона было показано на примере маршрута, который содержит этапы 1, 13, 14, 15 и 3 согласно фиг. 1.
Хорошо известно, что изопропанол может быть продуцирован из ацетона путем добавления первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (этап 4 на фиг. 1) (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 33943403, 2014), и что изобутилен может быть продуцирован из ацетона путем добавления гидроксиизовалератсинтазы (этап 5 на фиг. 1) и декарбоксилазы (этап 6 на фиг. 1) (van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012). Можно сконструировать путь, который включает продемонстрированный выше маршрут продуцирования ацетона с помощью Ptb-Buk, используя гены thlA, ptb-buk и adc, а также ген первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (например, Genbank NC_022592, позиция 609711..610766; CAETHG_0553; NCBI-GeneID: 17333984), что обеспечит продуцирование изопропанола с помощью системы Ptb-Buk у E. coli (этапы 1, 13, 14, 15, 3 и 4 согласно фиг. 1). Аналогичным образом, можно сконструировать путь, который включает продемонстрированный выше маршрут продуцирования ацетона с помощью Ptb-Buk, используя гены thlA, ptb-buk и adc, а также гены гидроксиизовалератсинтазы и декарбоксилазы, что обеспечит продуцирование изобутилена с помощью системы Ptb-Buk у E. coli (этапы 1, 13, 14, 15, 3, 5 и 6 согласно фиг. 1).
Пример 4.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование (R)-3-гидроксибутирaтa и 1,3бутандиола у С. autoethanogenum. Также продемонстрировано продуцирование 1,3-бутандиола в отсутствие 2,3-бутандиола.
Конструировали штамм C.autoethanogenum, в котором нативный путь продуцирования 2,3бутандиола инактивировали и заменяли на гены, обеспечивающие образование (К)-3-гидроксибутирилКоА. Это было достигнуто путем замены гена ацетолактатдекарбоксилазы (budA) в геноме С. autoethanogenum на гены тиолазы (thlA С. acetobutylicum; GenBank NC_001988, позиция 82040..83218; СА_Р0078; NCBI-GeneID 1116083) и ^-специфической 3-гидроксибутиратдегидрогеназы (phaB Cupravidus necator, GenBank WP_010810131.1), с получением в результате штамма С. autoethanogenum budA::thlAphaB.
Для замены гена budA на гены thlA u phaB плазмиду pMTL8225-budA::thlA-phaB (фиг. 14) с геном токсина E.coli mazF под контролем тетрациклинового индуцируемого промотора tet3n0 (для контрселекции), плечо гомологии размером -1Кб в 3'-5' направлении от гена budA, thlA, phaB, кассету ermB, фланкированную сайтами loxP, и плечо гомологии размером -1Кб в 5'-3' направлении от гена budA собирали
- 47 043734 на плазмиде pMTL-tet3no.
Плечи гомологии размером -1Кб в 3'-5' и 5'-3' направлении от budA амплифицировали с помощью ПЦР из С. autoethanogenum с праймерами SN01/SN02 и SN07/SN08. Гены thlA и phaB гены амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК Cupriavidus necator с применением праймеров SN03/SN04mod. Кассету ermB, фланкированную сайтами loxP, амплифицировали с помощью ПЦР с применением праймеров SN05mod/SN06. Промотор tet3no, фланкированный FseI и PmeI, синтезировали, обрабатывали рестрикционными ферментами FseI и PmeI, и очищали. ПЦР-продукты и расщепленный вектор собирали с применением набора для клонирования GeneArt Seamless от Life Technologies; плазмиду pMTL8225budA::thlA-phaB (SEQ ID NO: 121) без мутаций во встроенных фрагментах применяли для трансформации С. autoethanogenum путем конъюгации согласно описанию в предыдущих примерах.
После конъюгации и выбора на триметоприме и кларитромицине, 9 колоний методом штриха в двух повторностях высевали на чашки с агаром PETC-MES с кларитромицином и ангидротетрациклином для индукции экспрессии генов mazF. В колониях в присутствии кларитромицина и ангидротетрациклина гены budA должны быть заменены на гены thlA и phaB и кассету ermB. Это верифицировали посредством ПЦР с применением праймеров Og31f/Og32r, фланкирующих плечи гомологии, и полимеразы КАРА (фиг. 15).
Полосу, соответствующую -3,3 Кб, амплифицируют из штамма дикого типа, тогда как полосу, соответствующую -5,7 Кб, амплифицировали из колоний 1, 4, 7 и 9, что указывает на замену гена budA на thlA, phaB и кассету ermB. Вышеуказанное событие дополнительно подтверждали путем секвенирования ПЦР-продуктов из всех 4 клонов. После итоговой модификации экспрессию генов thlA и phaB запускает промотор в 3'-5' направлении от гена budA.____________________________________________
SEQ ID NO: | Описание | Последовательность |
122 | SN01 | ATTTACAAATTCGGCCGGCCTACCTCCTCGTATAAATAAGATG |
123 | SN02 | CTAGCTATTACAACTTCTTTCATATTACATTCACCTCTATGTC |
124 | SN03 | GACATAGAGGTGAATGTAATATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAG |
125 | SN04mod | GTATAGCATACATTATACGAACGGTATTATCCCATGTGTAAACC ACCGT |
126 | SN05mod | TTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTTAGAAGCAAACT TAAG |
127 | SN06 | GTCTAGTGITTTTTTCTATCAATACTCTAGATACCGTTCGTATAG C |
128 | SN07 | TGTATGCTATACGAACGGTAAGTATTGATAGAAAAAAACACTA GAC |
129 | SN08 | CAAAAAGGAGTTTAAACAAAAAGTCATAAACCTGGATAAC |
130 | Og31f | CCGTTTCTCACAACAACAATACCAG |
131 | Og32r | AAACCACCTTGACGATGAAACCATA |
Осуществляли ферментацию штамма С. autoethanogenum budA::thlA-phaB. Культуру выращивали при 37°С с синтетическим газом (50% СО, 18% CO2, 2 % H2 и 30% N2), который постоянно подавали в биореактор. Исходную скорость потока газа устанавливали на уровне 50 мл/мин, с последующим увеличением до 400 мл/мин в ходе эксперимента, а скорость перемешивания увеличивали от 200 об/мин до 500 об/мин. Ферментацию осуществляли на протяжении почти 5 дней. Метаболиты измеряли согласно описанию в примерах выше.
Концентрацию 1,3-бутандиола и других метаболитов, таких как 2-гидроксиизомасляная кислота, измеряли с применением газохроматографического (ГХ) анализа, используя систему для ГХ Agilent 6890N, оснащенную колонкой Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 мх0,25 мкмх0,25 мкм), автоматическим пробозаборником и пламенно-ионизационным детектором (FID). Образцы получали путем разведения 400 мкл образца 400 мкл ацетонитрила с последующим 3-минутным центрифугированием при 14000 об/мин; супернатант переносили в стеклянный флакон и высушивали образец в Thermo SpeedVac. После высыхания образцы суспендировали в растворе, содержащем 400 мкл N,О-бис(трифторацетамида) (BSTFA) и пиридин (в соотношении 3:1) и нагревали в герметично закрытом стеклянном флаконе в течение 60 мин при 60°С. Образцы переносили в автоматический пробозаборник для анализа, вводя пробу объемом 1 мкл, с коэффициентом деления 30:1 и температурой на входе, составляющей 250°С. Хроматографию проводили с использованием программы термостата от 70°С (без удерживания) с нарастанием до 110°С со скоростью 3°С/мин, с нарастанием до 230°С со скоростью 15°С/мин, с последующим итоговым нарастанием со скоростью 40°С/мин до 310°С с 3-минутным удерживанием. Скорость потока через колонку составляла 1,8 мл/мин, гелий использовали в качестве газа-носителя. Температуру FID поддерживали на уровне 320°С; 40 мл/мин водорода, 400 мл/мин воздуха и 20 мл/мин гелия использовали в качестве поддувочного газа.
Неожиданным образом, штамм С. autoethanogenum budA::thlA-phaB, экспрессирующий thlA и phaB, продуцировал до 1,55 г/л 3-гидроксибутирата из газа (фиг. 16). Нативная тиоэстераза может конвертировать образующийся 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. В геномной последовательности были идентифицированы три гипотетических тиоэстеразы.
Что еще более неожиданно, было обнаружено, что помимо образования 3-гидроксибутирата, про
- 48 043734 исходило также образование до 150 мг/л 1,3-бутандиола (фиг. 16). Это может быть обусловлено активностью нативных альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы (AOR) и алкогольдегидрогеназы. В геноме С. autoethanogenum присутствуют два гена AOR и несколько генов алкогольдегидрогеназ (Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015). Указанное восстановление 3-гидроксибутирата приводит в действие восстановленный ферредоксин, и, соответственно, оно может быть прямо сопряжено с окислением СО, обеспечивающим образование восстановленного ферредоксина (СО+Fdox^CO2+Fdred) (фиг. 7).
Было также продемонстрировано продуцирование 1,3-BDO из газа через альтернативный маршрут с применением бутиральдегиддегидрогеназы Bld из Clostridium saccharoperbutylacetomcum (ААР42563.1) (SEQ ID NO: 80).
Ген bld синтезировали и клонировали совместно с той же тиолазой (thlA С. acetobutylicum) и (R)специфической 3-гидроксибутиратдегидрогеназой (phaB Cupravidus necator) в плазмиду pMTL8315-Pfdx-thlA-phaB-bld (SEQ ID NO: 132).
Гены Bld и phaB амплифицировали из вышеуказанной плазмиды с помощью праймеров, представленных в табл. ниже, и клонировали в существующую плазмиду pMTL85147-thlA (WO 2012/115527).
SEQ ID NO: | Праймер | Последовательность | Направление |
133 | bld-phaB-Fl | ACATGGGATAAGAAGGAGATATACATATGATAA AAG | прямой |
134 | bld-pMTL-Rl | CGTCGACTCTAGATTAACCTGCTAAAACACATCT TC | прямой |
135 | pMTL-bld-Fl | GTGTTTTAGCAGGTTAATCTAGAGTCGACGTCAC GC | прямой |
Итоговой конструкцией трансформировали С. autoethanogenum согласно описанию выше и проводили эксперимент с ростом в бутылях для сыворотки с 50 мл среды РЕТС, нагнетая до достижения давления 30 фунтов/кв. дюйм СО-содержащий газ сталелитейных производств (собранный на объекте New Zealand Steel в Гленбруке, Новая Зеландия) или синтетической смеси газов с таким же составом, 44% СО, 32% N2, 22% СО2, 2% Н2.
Было продемонстрировано продуцирование 1,3-BDO через указанный маршрут из газа (фиг. 17А), однако уровни продуцирования были ниже (до 67 мг/л 1,3-BDO), чем через маршрут с AOR и, в отличие от маршрута с AOR, наблюдалось влияние на рост при экспрессии гена bld относительно С. autoethanogenum дикого типа (фиг. 17В).
В другом эксперименте С. autoethanogenum, трансформированный плазмидой pMTL83159-phaBthlA согласно описанию в примере 2, продуцировал 0,33 и 0,46 г/л 3-ГБ и 1,3-BDO, соответственно, в эксперименте в бутылях в аутотрофных условиях согласно описанию в примере 2 (фиг. 40).
Пример 5.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование (S)-3-гидроксибутирата и 1,3бутандиола у С. autoethanogenum.
Конструировали плазмиду, которая экспрессирует тиолазу (thlA из С. acetobutylicum: SEQ ID NO: 136) и ^-специфическую 3-гидроксибутиратдегидрогеназу (hbd1 из С. kluyveri; SEQ ID NO: 137) под контролем либо промотора ферредоксина (Pfdx, выделенный из С. autoethanogenum; SEQ ID NO: 138), либо промотора пируват-ферредоксиноксидоредуктазы (Ppfor, выделенный из С. autoethanogenum: SEQ ID NO: 139). Указанную плазмида конструировали следующим образом: P-hbd1-rbs2-thlA собирали вместе и клонировали в вектор pMTL83151 (Heap, J Microbiol Meth, 78:79-85, 2009), используя рутинные способы молекулярного клонирования, в том числе расщепление рестрикционными ферментами с последующим лигированием, полимеразную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами, бесшовное клонирование (Thermo Fisher Scientific) и метод GeneArt Type IIs (Thermo Fisher Scientific). Оперон P-hbd1-rbs2thlA клонировали между сайтами рестрикции NotI и XhoI, обнаруживаемыми в области множественного клонирования плазмиды. Р является конститутивным промотором, который содержит интактный сайт связывания рибосомы (rbs). rbs2 (SEQ ID NO: 140) представляет собой сайт связывания рибосомы для экспрессии thlA. Осуществляли поэтапные процедуры амплификации Р, hbd1 и thlA с существующих матриц с праймерами, представленными ниже.
- 49 043734
SEQ ID NO: | Название | Последовательность | Направление |
141 | Pfdx-Fl | AAAGGTCTCCGGCCGCGCTCACTATCTGCG GAACC | прямой |
142 | Pfdx-Rl | TTTGGTCTCGAATTCTGTAACACCTCCTTAA TTTTTAG | обратный |
143 | Ppfor-Fl | AAAGGTCTCCGGCCGCAAAATAGTTGATAA TAATGCAGAG | прямой |
144 | Ppfor-Rl | TTTGGTCTCGAATTCCTCTCCTTTTCAAGCAT ATA | обратный |
145 | hbdl-Fl | AAAGGTCTCGAATTCAAAGATCTATGTCTAT TAAATCAGTTGCAG | прямой |
146 | hbdl-Rl | TTTGGTCTCCCTCCTTTCTATTTCTAATATGC GAAAAATCCTTTACC | обратный |
147 | thlA-Fl | AAAGGTCTCAGGAGGTGTTACATATGAAAG AAGTTGTAATAGCTAGTGC | прямой |
148 | thlA-Rl | TTTGGTCTCCTCGAGTATGGATCCCTAGCAC TTTTCTAGCAATATTGC | обратный |
Полимеразные цепные реакции проводили согласно описанию ниже с применением набора для ПЦР Кара Taq PCR Kit (Кара Biosystems). Температуру отжига устанавливали на уровне 56°С, удлинение в течение 1 мин. Проводили 30 циклов повторных ПЦР-реакций. После этого ПЦР-продукты обессоливали с применением набора DNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research Corporation).
Остов плазмиды pMTL83151 получали, проводя двойное расщепление NotI/XhoI с применением FastDigest NotI и FastDigest XhoI (Thermo Fisher Scientific), следуя предоставленному протоколу, с последующей обработкой щелочным фосфатом, с применением щелочной фосфатазы FastAP (Thermo Fisher Scientific) и следуя предоставленным протоколам. Затем расщепленный остов обессоливали с применением набора DNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research Corporation).
Сборку ПЦР-продуктов и остова плазмиды осуществляли с применением набора GeneArt Type IIs (Thermo Fisher Scientific). Затем итоговую плазмиду выделяли из экспрессирующего плазмиду хозяина E. coli с применением набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
Для введения собранных плазмид pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA и pMTL8315-Ppfor-hbdl-thlA, состоящих из оперонов, сначала плазмиду вводили в штамм E. coli CA434 посредством химической трансформации. После этого выполняли конъюгацию путем смешивания трансформированного штамма СА434 с хозяином-продуцентом С. autoethanogenum на твердой агаровой среде LB, и инкубации в анаэробной среде под давлением со смесью, состоящей из монооксида углерода и водорода, согласно описанию в примере 2. После конъюгации проводили отбор С. autoethanogenum на основании успешного роста на твердой среде, содержащей подходящий антибиотик и триметоприм для удаления оставшегося штамма E. coli CA434, в анаэробных условиях.
Штаммы С. autoethanogenum, несущие введенную плазмиду pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA или pMTL8315-Ppfor-hbdl-thlA, состоящую из оперона P-hbdl-rbs2-thlA, культивировали в 10 мл среды РЕТС в бутыли Schott объемом 250 мл, герметично закрывали резиновой пробкой и крышкой, и нагнетали до достижения давления 30 фунтов/кв. дюйм СО-содержащий газ сталелитейных производств (собранный на объекте New Zealand Steel в Гленбруке, Новая Зеландия) или синтетическую смесь газов с таким же составом, 44% СО, 32% N2, 22% CO2, 2% H2. Метаболиты измеряли согласно описанию в предыдущих примерах.
Неожиданным образом, в культурах С. autoethanogenum, экспрессирующих thlA и hbd1, присутствовал 3-гидроксибутират, продуцированный из газа (фиг. 18А). Нативная тиоэстераза может преобразовывать образующийся 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. В геномной последовательности были идентифицированы три гипотетических тиоэстеразы. В штамме, несущем pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA, обнаруживалось до 2,55 г/л 3-гидроксибутирата (фиг. 18А).
Что еще более неожиданно, было также обнаружено, что 3-гидроксибутират со временем преобразуется в 1,3-бутандиол; к окончанию роста штамм, несущий плазмиду pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA, продуцировал до 1,1 г/л 1,3-бутандиола (фиг. 18А). Это может быть обусловлено активностью нативных альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы (AOR) и алкогольдегидрогеназы. В геноме С. autoethanogenum присутствуют два гена AOR и несколько алкогольдегидрогеназ (Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015). Указанное восстановление 3-гидроксибутирата (и восстановление ацетата до этанола; фиг. 18В) приводит в действие восстановленный ферредоксин, и, соответственно, оно может быть прямо сопряжено с окислением СО, обеспечивающим образование восстановленного ферредоксина (СО+Fdox^CO2+Fdred) (фиг. 7).
Тот же самый штамм С. autoethanogenum, несущий плазмиду pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA, также тестировали в ходе непрерывной ферментации. Ферментацию осуществляли согласно описанию в предыдущем примере, однако культивирование переводили в непрерывный режим со скоростью разведения свежей средой, составляющей примерно 0,05, на 2 день и затем увеличивали до 1,0 на 3 день. Наблюдался высокий уровень продуцирования 3-гидроксибутирата, до 7 г/л, при продуцировании 1,3-BDO на уровне 0,5 г/л.
- 50 043734
Чтобы улучшить продуцирование (S)-3-rugpOKCu6yTupama и 1,3-бутандиола и избежать синтеза другой формы бутандиола (2,3-бутандиола), плазмиду pMTL-HBD-ThlA вводили в штамм с инактивированным путем продуцирования 2,3-бутандиола, у которого был удален ген ацетолактатдекарбоксилазы BudA (US9297026). Указанный нокаут budA элиминировал основной путь, ведущий к 2,3-BDO, увеличивая специфичность в отношении продуцирования 3-ГБ и 1,3-BDO. При экспрессии pMTL-HBD-ThlA штаммов с делецией budA достигалась специфичность, составляющая 15% (С-мол.%) как для 3-ГБ, так и для 1,3-BDO (фиг. 41).
Селективность (С-мол.%)
Ацетат14,7
Этанол64,9
2,3-BDO1,3
Биомасса3,7
3-ГБ10,4
1,3- BDO 5,0
Для сравнения, в штамме, экспрессирующем ту же плазмиду, pMTL83159-hbd-thlA, без нокаута budA, общая специфичность в отношении продуцирования 3-ГБ и 1,3-BDO в стационарном состоянии составляла только 6,9%
Селективность _________________________(С-мол.%)
Ацетат0,4
Этанол84,3
2,3-BDO6,2
Биомасса2,2
3-ГБ3,5
1,3-BDO3,4
Пример 6.
В указанном примере продемонстрировано, что система Ptb-Buk эффективна у С. autoethanogenum в отношении диапазона ацил-КоА, в том числе ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2гидроксиизобутирил-КоА
Систему Ptb-Buk экспрессировали из плазмиды в С. autoethanogenum и ее активность измеряли с применением анализа гидролиза КоА. Для этого гены ptb-buk из С. beijerinckii NCIMB8052 (GenBank NC_009617, позиция 232027..234147; Cbei_0203-204; NCBI-GeneID 5291437-38) амплифицировали из геномной ДНК С. beijerinckii NCIMB8052 и клонировали под контролем промотора пируватферредоксиноксидоредуктазы (Ppfor, выделенный из С. autoethanogenum; SEQ ID NO: 139) в вектор pMTL82251 (Heap, J Microbiol Meth, 78:79-85, 2009) с применением рутинных способов молекулярного клонирования, в том числе расщепления рестрикционными ферментами с последующим лигированием, полимеразной цепной реакции с перекрывающимися праймерами, бесшовного клонирования (Thermo Fisher Scientific) и GeneArt Type IIs (Thermo Fisher Scientific) согласно описанию в примере 5. Олигонуклеотиды описаны ниже.
SEQ ID NO: | Название | Последовательность | Направление |
149 | Ppfor-F2 | aaacagctatgaccgcGGCCGCAAAATAGT | прямой |
150 | Ppfor-R2 | ttactcatTGGATTCCTCTCCTTT | обратный |
151 | Ptb-Buk-F2 | ggaatccaATGAGTAAAAACTTTGATGAG | прямой |
152 | Ptb-Buk-R2 | caggcctcgagatctcCTAGTAAACCTTAGCTTGTTC | обратный |
Итоговую плазмиду pMTL82256-ptb-buk (SEQ ID NO: 153) вводили в С. Autoethanogenum согласно описанию в предыдущих примерах.
Анализы на гидролиз Ацил-КоА проводили следующим образом. Клетки С. autoethanogenum собирали при плотности OD 2 (поздняя экспоненциальная фаза) путем центрифугирования (14000 об/мин в течение 1 мин при 4°С). Клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера для лизиса (калий-фосфатный буфер, pH 8). Клетки лизировали с использованием циклов замораживания-размораживания (необязательно), обрабатывали ультразвуком 6x30 с амплитудой 20 на льду. Образцы центрифугировали в течение 10 мин при 14000 об/мин и 4°С и извлекали супернатант с растворимыми белками. Концентрацию белка измеряли, например, с помощью анализа методом Бредфорда.
Смесь для анализа содержала: 484 мкл калий-фосфатного буфера с pH 8,0, 1 мкл DTNB (конечная концентрация - 0,1 мМ), 10 мкл клеточного лизата и 5 мкл КоА (конечная концентрация - 500 мкМ). Все компоненты смешивали в кварцевой кювете (кювета объемом 1 мл с длиной считываемого пути 1 см), за исключением белка. Анализ начинали с добавления клеточного лизата с последующей реакцией в спектрофотометре при 405 нм, 30°С в течение 3 мин. Контроль без лизата анализировали для измерения автолиза ацил-КоА.
- 51 043734
Для определения активности рассчитывали наклон в линейной части кривой (обычно в течение первых 30 с). Количество белка нормировали и наклон делили на количество белка. Коэффициент экстинкции (14,150 М-1 см-1) использовали для расчета специфической активности в М/с/мг. Вычитали активность отрицательного контроля.
Анализ проводили с ацетоацетил-КоА, рацемической смесью 3-гидроксибутирил-КоА (3-ГБ-КоА) и 2-гидроксиизобутирил-КоА (2-ГИБ-КоА). Возможность искусственно низких скоростей гидролиза 3-ГБКоА и 2-ГИБ-КоА из-за потенциальных ограничений доступности субстрата изучали, повторяя анализы на гидролиз в лизатах С. autoethanogenum с использованием разных концентраций ацил-КоА, 500 и 200 мкМ.
Результаты анализа указывают на значимое увеличение гидролиза КоА в лизатах С. autoethanogenum, несущего плазмиду pMTL82256-ptb-buk, экспрессирующую систему Ptb-Buk, в отношении диапазона ацил-КоА, в том числе ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирил-КоА (фиг. 20А-В). Примечательно, что наблюдается также гидролиз КоА таких ацил-КоА, как 2гидроксиизобутирил-КоА, которые С. autoethanogenum дикого типа не гидролизует. Наблюдалась некоторая нативная активность гидролиза КоА в отношении ацетоацетил-КоА и 3-гидроксибутирил-КоА.
Пример 7.
В указанном примере продемонстрировано, что разрушение идентифицированных нативных генов тиоэстеразы повышает эффективность системы Ptb-Buk и КоА-трансферазы за счет увеличения популяции доступных ацил-КоА, таких как ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА или 2гидроксиизобутирил-КоА.
В отличие от системы Ptb-Buk, где энергия сохраняется в форме АТФ при преобразовании ацилКоА в соответствующие кислоты, при простом гидролизе КоА сохранения энергии не происходит.
В анализах на гидролазу было обнаружено, что у С. autoethanogenum присутствует нативная активность гидролиза в отношении ацетоацетил-КоА и 3-гидроксибутирил-КоА.
Анализы на гидролиз ацил-КоА проводили с ацетоацетил-КоА, рацемической смесью 3гидроксибутирил-КоА (3-ГБ-КоА) и 2-гидроксиизобутирил-КоА (2-ГИБ-КоА) согласно описанию в предыдущем примере. Результаты указанного анализа указывают на расщепление ацетоацетил-КоА и 3-ГБКоА, однако не 2-ГИБ-КоА, и подтверждают наличие нативной активности у С. autoethanogenum (фиг. 11).
Анализ генома С. autoethanogenum привел к идентификации трех гипотетических КоА-тиоэстераз (гидролаз сложных тиоэфиров), которые могут отвечать за расщепление тиоэфирной связи ацетоацетилКоА или 3-гидроксибутирил-КоА. Они также присутствуют у других ацетогенов, таких как С. ljungdahlii.
Описание | Аннотация | С. autoethanogenum | SEQ ID NO: | C. Ijungdahlii | SEQ ID NO: |
Тиоэстераза 1 (CAETHGJ)718) | Пальмитоил-КоАгидролаза | AGY74947.1 | 154 | ADK 15695.1 | 157 |
Тиоэстераза 2 (CAETHGJ524) | 4- Гидроксибензоил- КоА-тиоэстераза | AGY75 747.1 | 155 | ADK16655.1 | 158 |
Тиоэстераза 3 (CAETHGJ780) | Г ипотетическая тиоэстераза | AGY75 999.1 | 156 | ADK16959.1 | 159 |
Инактивация указанных трех гипотетических КоА-тиоэстераз приводит к более высоким титрам продуктов, увеличивая эффективность системы Ptb-Buk. Указанные три гипотетических тиоэстеразы инактивировали с применением технологии ClosTron. Вкратце, нацеливающий домен Ltr типа II перепрограммировали, используя интернет-сайт ClosTron, и перенаправленные плазмиды ClosTron заказывали у DNA 2.0. Нокаутные векторы ClosTron pMTL007C-E2-Cau-2640-571s, нацеленный на тиоэстеразу 1 (CAETHG_0718), pMTL007C-E2-PBor3 782- 166s, нацеленный на тиоэстеразу 2 (CAETHG_1524), и pMTL007C-E2-PBor4039-199s, нацеленный на тиоэстеразу 3 (CAETHG_1780), вводили в С. autoethanogenum с применением конъюгации.
Выбор на основании интеграции проводили путем отбора на среде РЕТС с добавлением 5 мкг/мл кларитромицина; успешную инактивацию в результате интеграции интрона типа II подтверждали с помощью ПЦР для всего сайта встраивания.
Активность КоА-гидролазы в отношении ацетоацетил-КоА как С. autoethanogenum дикого типа, так и каждого из С. autoethanogenum с одним из гипотетических инактивированных генов измеряли с применением описанного выше анализа. Было показано, что все три штамма с инактивированными гипотетическими тиоэстеразами демонстрируют меньшую активность гидролиза в отношении ацетоацетил-КоА и 3-гидроксибутирил-КоА (фиг. 21А-В).
Чтобы продемонстрировать, что уменьшение активности КоА-гидролазы и, соответственно, увеличение популяции ацетоацетил-КоА, является благоприятным для продуцирования происходящих из ацетоацетил-КоА продуктов, плазмиду с изопропанолом pMTL85147-thlA-ctfAB-adc, кодирующую
- 52 043734 thl+ctfAB+adc (WO 2012/115527), вводили в штамм С. autoethanogenum дикого типа и штамм с инактивированной тиоэстеразой 1. Эксперимент с ростом проводили в 40 мл среды РЕТС в бутыли Schott объемом 1 л в технических трипликатах с газом Со при 37°С при встряхивании на 110 об/мин. Синтетический газ (50% СО, 18% CO2, 2% H2 и 30% N2) использовали в качестве единственного источника энергии и углерода. Паровую фазу заменяли один раз и заполняли синтетическим газом, доводя давление до 21 фунт/кв. дюйм (1,5 бар) при 37°С (50% СО, 18% CO2, 2% Н2 и 30% N2). Образцы для определения OD и аналитических данных собирали дважды в сутки.
Штамм с инактивированной тиоэстеразой 3 CAETHG_1780 продуцировал значимо более высокие уровни изопропанола по сравнению со штаммом дикого типа (фиг. 22 и 23A-D).
Аналогичным образом, нокаут тиоэстераз у С. autoethanogenum может увеличивать популяцию 3гидроксибутирил-КоА, обеспечивая более эффективную утилизацию 3-гидроксибутирил-КоА парой PtbBuk и приводя к более высоким уровням продуцируемых ацетона, изопропанола, изобутилена, (R)-3гидроксибутирата, 1,3-бутандиола и/или 2-гидроксиизомасляной кислоты. При введении плазмиды pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA из примера 5 в штамм С. autoethanogenum. с разрушенной тиоэстеразой 2 CAETHG_1524 синтез 3-гидроксибутирата прекращался (при этом при экспрессии указанной плазмиды в штамме С. autoethanogenum дикого типа наблюдали до 2,55 г/л 3-гидроксибутирата). В указанном штамме отсутствует конкурентная активность в отношении 3-гидроксибутирил-КоА.
Указанные результаты демонстрируют, что путем уменьшения активности тиоэстераз можно добиться более высоких уровней популяции КоА, доступного для системы Ptb-Buk и синтеза продуктов.
Кроме того, продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO может быть увеличено путем избыточной экспрессии ptb-buk. В контрольном эксперименте, когда С. autoethanogenum согласно описанию в примере 2 трансформировали плазмидами pMTL83159-phaB-thlA из примера 4, плюс pMTL82256 (Heap, J Microbiol Methods, 78: 79-85, 2009), последняя из которых представляет собой пустую плазмиду, используемую в качестве фонового контроля, ферментация такого штамма приводила к продуцированию 3-ГБ с максимальным титром 1,68 г/л на 10 день (фиг. 42А). Когда вместо пустой плазмиды pMTL82256 в С. autoethanogenum с pMTL83159-phaB-thlA коэкспрессировали плазмиду pMTL82256-buk-ptb, ферментация приводила к получению более высокого титра 3-ГБ, 4,76 г/л, в более ранний период, на 4 день (фиг. 42В).
Удаление нативных тиоэстераз повышает эффективность системы Ptb-Buk, которой свойственно предпочтение (R)-3-ГБ-KoA. Локус гена тиоэстеразы в геноме удаляли и заменяли на фрагмент ДНК bukptb посредством обычной молекулярно-биологической методики, известной как гомологичная рекомбинация. Замену гена тиоэстеразы на buk-ptb подтверждали с помощью ПЦР, с последующим электрофорезом в агарозном геле и секвенированием ДНК.
В эксперименте в бутылях, когда pMTL83156-phaB-thlA экспрессировали без ptb-buk у мутанта с делецией тиоэстеразы, описанного выше, средний максимальный титр продуцированного 3-ГБ составлял 0,50±0,05 г/л, аналогично титру, полученному с применением немодифицированного штамма С. autoethanogenum. При коэкспрессии pMTL82256-buk-ptb с плазмидой pMTL83156-phaB-thlA в штамме с нокаутированной тиоэстеразой продуцирование 3-ГБ увеличивалось до 1,29±0,10 г/л (фиг. 43).
Пример 8
В указанном примере продемонстрирована возможность элиминации системы продуцирования ацетата у ацетогена С. autoethanogenum системой Ptb-Buk.
Продуцирование ацетата описано у всех ацетогенных микроорганизмов (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes , 3rd edition, pages 354-420, New York, NY, Springer, 2006), поскольку продуцирование ацетата обеспечивает микроорганизму возможность прямо генерировать АТФ при субстратном фосфорилировании с помощью Pta (фосфотрансацетилазы) и Ack (фосфотрансацетилазыацетаткиназы). Нативные образующие ацетат ферменты, такие как Pta-Ack, соответственно, считаются имеющими существенное значение для ацетогенов (Nagarajan, Microb Cell Factories, 12: 118, 2013). Поскольку Ptb-Buk обеспечивает альтернативный способ генерирования энергии, становится возможной замена нативной системы Pta-Ack на Ptb-Buk.
Гены pta и ack у С. autoethanogenum находятся в одном опероне. Для замены генов pta и ack генами ptb и buk собирали плазмиду, pMTL8225-pta-ack::ptb-buk (фиг. 24), с контрселективным маркером mazF под контролем тетрациклинового индуцируемого промотора, плечом гомологии размером ~1Кб в 3'-5' направлении, ptb, buk, кассетой ermB, фланкированной сайтами loxP и плечом гомологии размером ~1Кб в 5'-3' направлении (SEQ ID NO: 160).
Плечи гомологии размером ~1Кб в 3'-5' и 5'-3' направлении амплифицировали с помощью ПЦР из С. autoethanogenum с праймерами SN22f/ SN23r и SN28f/ SN29r. Ptb и buk гены амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pIPA_16 с применением праймеров SN24f/SN25r. Кассету ermB с сайтами loxP амплифицировали с помощью ПЦР с применением праймеров SN26f/SN27r. Остов плазмиды амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами SN30f/SN31r. Полимеразу КАРА использовали для всех ПЦРамплификаций. ПЦР-продукты собирали с применением набора для клонирования GeneArt Seamless от Life Technologies; плазмиду без мутаций во встраиваемых фрагментах применяли для трансформации С. autoethanogenum путем конъюгации согласно описанию выше.
- 53 043734
После конъюгации и выбора на триметоприме и кларитромицине, 7 колоний методом штриха в двух повторностях высевали на чашки с агаром PETC-MES с кларитромицином и ангидротетрациклином для индукции экспрессии генов mazF. В колониях в присутствии кларитромицина и ангидротетрациклина гены pta и ack должны быть заменены на гены ptb и buk и кассету ermB. Это верифицировали посредством ПЦР с применением праймеров Og29f/Og30r, фланкирующих плечи гомологии, и полимеразы КАРА (фиг. 25). Полосу, соответствующую ~4,6 Кб амплифицировали из штамма дикого типа, а полосы, соответствующие ~5,7 Кб амплифицировали из колоний 1 и 4-7, что указывает на замену генов pta и ack генами ptb и buk и кассетой ermB. Вышеуказанное событие дополнительно подтверждали путем секвенирования ПЦР-продуктов из клонов 4-7.
После итоговой модификации экспрессию генов ptb и buk запускает промотор в 3'-5' направлении от гена pta. ___________________________________________________________________________________
SEQ ID NO: | Название | Последовательность |
161 | SN22f | TTTACAAATTCGGCCGGCCAAAGATTGCTCTATGTTTAAGCT |
162 | SN23r | CATCAAAGITTTTACTCATCAATTTCATGTTCATTTCCTCCCT |
163 | SN24f | AGGGAGGAAATGAACATGAAATTGATGAGTAAAAACTTTGATGAGT |
164 | SN25r | GTATAGCATACATTATACGAACGGTACTAGTAAACCTTAGCTTGTTCT TC |
165 | SN26f | GAAGAACAAGCTAAGGTTTACTAGTACCGTTCGTATAATGTATGCTAT AC |
166 | SN27r | AGAGATGAGCATTAAAAGTCAAGTCTACCGTTCGTATAGCATACA |
167 | SN28f | TGTATGCTATACGAACGGTAGACTTGACTTTTAATGCTCATCTCT |
168 | SN29r | CATGAGATTATCAAAAAGGAGTTTAAATATCTATTTTGTCCTTAGGA |
169 | SN30f | TCCTAAGGACAAAATAGATATTTAAACTCCTTTTTGATAATCTCATG |
170 | SN31r | AGCTTAAACATAGAGCAATCTTTGGCCGGCCGAATTTGTAAA |
171 | Og29f | AGCCACATCCAGTAGATTGAACTTT |
172 | Og30r | AATTCGCCCTACGATTAAAGTGGAA |
Итоговый штамм С. autoethanogenum pta-ack::ptb-buk, в котором оперон pta-ack заменяли на оперон ptb-buk, трансформировали согласно описанию выше обеспечивающей продуцирование изопропанола плазмидой pMTL85147-thlA-adc из примера 2. Проводили исследование роста в аутотрофных условиях и анализировали конечные продукты метаболизма. Продуцирования ацетата не наблюдалась, тогда как изопропанол (до 0,355 г/л) и 3-ГБ (до 0,29 г/л) по-прежнему продуцировался наряду с этанолом и 2,3бутандиолом (фиг. 39А и 39В). Это демонстрирует, что возможно продуцирование изопропанола и 3-ГБ без продуцирования ацетата из газообразных субстратов, CO и/или CO2 и H2 с применением системы PtbBuk.
В том случае, если целевым продуктом является ацетон, а не изопропанол, ген первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (SEQ ID NO: 17) может быть дополнительно нокаутирован в указанном штамме С. autoethanogenum pta-ack::ptb-buk с применением способов, описанных выше и подробно описанных в WO 2015/085015. Введение плазмиды pMTL85147-thlA-adc в указанный штамм приводит к продуцированию ацетона на уровнях, аналогичных уровням, описанным выше для изопропанола, без ко-продукции ацетата. Этанол, 2,3-бутандиол и 3-ГБ могут представлять собой дополнительные продукты.
Дополнительные нокауты могут позволить элиминировать также и указанные продукты, например, нокаут гена ацетолактатдекарбоксилазы BudA приводит к получению штамма, неспособного продуцировать 2,3-бутандиол (US9297026). Продуцирование 3-ГБ может быть снижено или элиминировано путем удаления гена 3-гидроксибутиратдегидрогеназы Bdh (SEQ ID NO: 62).
Пример 9
В указанном примере продемонстрировано улучшение преобразования 3-гидроксибутирата в 1,3BDO путем избыточной экспрессии гена альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы aor1.
Остов плазмиды pMTL82251 использовали для избыточной экспрессии гена aorl С. autoethanogenum. Плазмида pMTL82251 была выбрана, поскольку она имеет другую точку начала репликации и маркерный антибиотик, однако может быть коэкспрессирована с плазмидой, используемой в примере 5, содержавшей hbd1 и thlA. Получение остова плазмиды и реакцию сборки осуществляли после проведения процедур, представленных выше, с получением сначала плазмиды pMTL82256 путем введения промотора ферредоксина С. autoethanogenum в плазмиду pMTL82251 с последующим добавлением генов aorl с образованием плазмиды pMTL82256-aor1. Использовали перечисленные ниже праймеры.
- 54 043734
SEQ ID NO: | Название | Последовательность | Направление |
173 | Pfdx-Fl | AAAGGTCTCCGGCCGCGCTCACTATCTGCGGAACC | прямой |
174 | Pfdx-Rl | TTTGGTCTCGAATTCTGTAACACCTCCTTAA1TTTT AG | обратный |
175 | aorl-Fl | AAAGGTCTCGAATTCAAAGATCTATGTATGGTTAT GATGGTAAAGTATTAAG | прямой |
176 | aorl-RI | TTTGGTCTCCTCGAGTATGGATCCCTAGAACTTACC TATATATTCATCTAATCC | обратный |
После трансформации штамма Е. coli CA434 итоговой плазмидой pMTL82256-aor1 выполняли конъюгацию с предыдущим хозяином-продуцентом С. autoethanogenum 1,3-BDO. Соответственно, итоговый штамм С. autoethanogenum был носителем двух плазмид, одна из которых избыточно экспрессировала hbd1 и thlA, а другая - aor1, с разными точками начала репликации и селективным маркером. Продуцирование 1,3-BDO характеризовали и количественно описывали согласно процедурам, представленным выше.
Результаты ясно показывают, что продуцирование 1,3-BDO может быть улучшено путем избыточной экспрессии aor1. Аналогичным образом, в С. autoethanogenum могут быть экспрессированы другие гены альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы для облегчения преобразования 3-гидроксибутирата в 1,3бутандиол.
Для улучшения продуцирования 1,3-BDO AOR избыточно экспрессировали для улучшения преобразования 3-ГБ в 3-ГБ-альдегид. С этой целью pMTL82256-hbd-thlA и pMTL83159-aor1 коэкспрессировали в С. autoethanogenum. По сравнению со штаммом, несущим отдельно pMTL82256-hbd-thlA, штамм с коэкспрессией aorl продуцировал больше этанола и 1,3-BDO (фиг. 44).
Пример 10
В указанном примере продемонстрирована стереоспецифичность Ptb-Buk, позволяющая получать 2-гидроксиизомасляную кислоту без получения нежелательных побочных продуктов.
2-гидроксиизомасляная кислота может быть продуцирована в E. coli и С. autoethanogenum путем введения тиолазы и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы для преобразования ацетил-КоА в 3гидроксибутирил-КоА, фермента 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазы для преобразования 3гидроксибутирил-КоА в 2-гидроксиизобутирил-КоА, и фермента, который может гидролизовать КоА с образованием 2-гидроксиизомасляной кислоты. 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа может быть либо (R)-, либо ^-специфической, и фермент, преобразующий 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксибутират в соответствии с этапом 1, 13, 19 и 20 согласно фиг. 1. Указанный последний этап может быть осуществлен с помощью тиоэстеразы или системы Ptb-Buk.
Три потенциальных кандидатных гена, тиоэстераза Е. coli типа II TesB, пару фосфатацетилтрансфераза/ацетаткиназа из С. autoethanogenum и пару бутирилтрансфераза/бутираткиназа из С. beijerinckii клонировали в экспрессионные векторы E. coli pDUET T7 с применением способов, описанных выше, и праймеров, приведенных ниже.
SEQ ID NO: | Праймер | Последовательность |
177 | pETDuet-pta-ack ack-DuetI2-Rl | GGGTACCTTATTTATTTTCAACTATTTCTTTTGTATC |
178 | pETDuet-pta-ack DuetI2 -ack-Fl | TTGAAAATAAATAAGGTACCCTCGAGTCTGGTAAAG |
179 | pETDuet-pta-ack DuetI2-pta-Rl | TTTTTTCCATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAAC |
180 | pETDuet-pta-ack pta-DuetI2-Fl | AGGAGATATACATATGGAAAAAATTTGGAGTAAGGC |
181 | pETDuet-tesB DuetI2-tesB-Fl | GAAATCATAATTAAGGTACCCTCGAGTCTGGTAAAG |
182 | pETDuet-tesB - DuetI2-tesB-Rl | CCTGACTCATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAAC |
183 | pETDuet-tesB - tesB- DuetI2-Fl | AAGAAGGAGATATACATATGAGTCAGGCACTTAAAA |
184 | pETDuet-tesB testB-DuetI2-Rl | AGGGTACCTTAATTATGATTTCTCATAACACCTTC |
- 55 043734
Полученные плазмиды pDUET-pta-ack (SEQ IDNO: 185), pDUET-ptb-buk (SEQ ID NO: 186), pDUET-tesB (SEQ ID NO: 187) вводили в BL21(DE3) E. coli для экспрессии и затем анализировали активность в отношении ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирил-КоА. Результаты показаны на фиг. 27. BL21 E. coli обладает незначительной, но измеряемой активностью в отношении всех трех субстратов. Для Pta-Ack было показано отсутствие активности, превышающей фоновую, тогда как и тиоэстераза TesB, и Ptb-Buk показали высокую активность в отношении всех трех субстратов, в том числе 2-гидроксиизобутирил-КоА.
Активность и тиоэстеразы TesB, и Ptb-Buk была выше в отношении линейного ацетоацетил-КоА, 3гидроксибутирил-КоА, по сравнению с разветвленным 2-гадроксиизобутирил-КоА. Это создает проблему для указанного пути, поскольку приводит к ранней терминации пути на уровне 3-гидроксибутирилКоА, в частности, из-за активности, более высокой, чем активность в отношении фермента 2гидроксиизобутирил-КоА-мутазы.
Однако Ptb-Buk, в отличие от тиоэстераз, способна различать стереоизомеры и действует исключительно (или преимущественно) на (R)-3-гидроксибутирил-КоА, но не на (S)-3-гидроксибутирил-КоА. Это было продемонстрировано путем экспрессии системы Ptb-Buk либо с ThlA и ^-специфической Hbd (фиг. 28А) или ^-специфической phaB (фиг. 28В) в системе pDuet у Е. coli. Указанные конструкции конструировали согласно описанию в примерах 1 и 3. Исследования роста подтвердили, что образование поддающихся оценке количеств 3-гидроксибутирата происходило только при экспрессии Ptb-Buk в комбинации с ^специфической Hbd, но не с ^-специфической phaB.
Соответственно, маршрут через ^-специфическую 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу и PtbBuk обеспечивает значимые преимущества, поскольку система Ptb-Buk (в отличие от тиоэстеразы) не активна в отношении (S)-3-гидроксибутирил-КоА, но (S)-3-гидроксибутирил-КоА также является предпочтительным изомером для 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазы (Yaneva, J Biol Chem, 287:15502-15511, 2012). Продуцированная 2-гидроксиизобутирил-КоА может затем быть использована Ptb-Buk для продуцирования 2-гидроксиизомасляной кислоты, и (в отличие от тиоэстеразы) гидролиз 2гидроксиизобутирил-КоА обеспечивает дополнительную энергию (фиг. 8).
Разрабатывали модульные конструкции для сравнения производительности указанного пути. Генную кассету, содержащую промотор Вуда-Льюнгдаля перед генами meaB, hcmA и hcmB, кодоноптимизировали и синтезировали (SEQ ID NO: 188). HcmA и hcmB кодируют 2-гидроксиизобутирилКоА-мутазу, а meaB - шаперон из Aquincola tertiaricarbonis; в указанной конструкции гены hcmA и meaB сливали в один белок согласно описанию (SEQ ID NO: 189) (Yaneva, J Biol Chem, 287: 15502-15511, 2012). Генную кассету клонировали либо в плазмиду, содержащую тиолазу (thlA из С. acetobutylicum: SEQ ID NO: 136) и ^-специфическую 3-гидроксибутиратдегидрогеназу (hbd из С. acetobutylicum·, SEQ ID NO: 190) (pMTL83155-thLA-hbd), либо ^-специфическую 3гидроксибутиратдегидрогеназу (p^B^R- eutropha) (pMTL83155-thlA-phaB), с применением рестрикционных ферментов Kpnl и Ncol, с образованием плазмид pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB (SEQ ID NO: 191) и pMTL83155-thlA-phaB-PwlmeaBhcmA-hcmB (SEQ ID NO: 192), соответственно. Субклонирование кодон-оптимизированной 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазной кассеты в Е. coli Top-10 прошло успешно, однако после некоторых начальных сложностей; было обнаружено, что 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазная кассета может быть клонирована в плазмиду при более низкой температуре (28°С).
Для получения векторов pMTL83I55-thlA-hbd и PMTL83155-thlA-PhaB сначала амплифици ровали промоторную область фосфатацетилтрансферазы С. autoethanogenum (SEQ ID NO: 193) и клонировали в вектор pMTL83151 (FJ797647.1; Heap, J Microbiol Meth, 78:79-85, 2009) с применением сайтов рестрикции NotI и NdeI до введения генов thlA и hbd или, соответственно, phaB, с помощью NdeI и KpnI в реакции двойного лигирования.
Кроме того, собирали совместимые плазмидные модули для экспрессии ptb-buk или tesB.
Для этого соответствующие гены амплифицировали из геномной ДНК и вводили в плазмиду pMTL82256, описанную в примере 9, а затем вводили ptb-buk или phaB с применением NdeI и NcoI и набора для клонирования Seamless (Life Technologies) с образованием плазмид pMTL82256-ptb-buk (SEQ ID NO: 194) и pMTL82256-tesB (SEQ ID NO: 195).
Плазмиды pMTL83155 -thlA -hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB, pMTL83155-thlA-phaB-Pwl meaBhcmA-hcmB, pMTL82256-ptb-buk и pMTL82256-tesB вводили в E. coli Top-10 (все этапы проводили при 28°С) и С. autoethanogenum путем трансформации согласно описанию в предыдущих примерах, в следующих комбинациях:
- 56 043734 pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk, pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB, pMTL83155thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk и pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmAhcmB + pMTL82256-tesB.
Эксперименты с ростом проводили на E. coli в среде LB при 30°С в течение 4 дней, и с С autoethanogenum на среде РЕТС с содержащим 30 фунтов/кв. дюйм CO газом сталелитейных производств (собранным на объекте New Zealand Steel в Гленбруке, Новая Зеландия) при 30°С и 37°С в течение 6 дней. Метаболиты измеряли согласно описанию выше. Помимо измерения с помощью ГХ-МС, продуцирование 2-гидроксиизомасляной кислоты также подтверждали с применением жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) и 1Н ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии.
Данные жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) регистрировали с использованием системы жидкостной хроматографии Dionex UltiMate 3000 (Dionex, Калифорния, США), сопряженной с масс-спектрометром ABSciex 4000 QTRAP (ABSciex, Конкорд, Канада). Указанной системой жидкостной хроматографии управляли через программное обеспечение Chromeieon (Dionex), и хроматографическое разделение проводили, вводя пробу объемом 10 мкл на колонку Gemini-NX C18 150 ммх2 мм (внутр. диаметр), с гранулами 3 мкм и пористостью 110 A (Phenomenex, Ашаффенбург, Германия), оснащенную предколонкой-картриджем Security Guard Gemini-NX C18 4 ммх2 мм (внутр. диаметр). Температуру термостата колонки контролировали и поддерживали на уровне 55°С на всем протяжении сбора данных; использовали следующие подвижные фазы: 7,5 мМ водный трибутиламин со значением pH, доведенным до 4,95 (±0,05) с ледяной уксусной кислотой (элюент А) и ацетонитрил (элюент В). Скорость потока подвижных фаз поддерживали на уровне 300 мкл/мин для всего профиля градиента; и подвижные фазы вводили прямо в масс-спектрометр без деления потока. Масс-спектрометром управляли с использованием программного обеспечения Analyst 1.5.2 (ABSciex), он был оснащен источником электроспрея TurboV, эксплуатируемом в режиме отрицательной ионизации. Использовали следующие оптимизированные ранее (и, соответственно, общие) показатели для получения запланированных данных методом мониторинга множественных реакций (MRM): напряжение ионного распыления 4500В, распылитель (GS1), вспомогательный газ (GS2), газовая завеса (CUR) и газ для соударений (CAD) - 60, 60, 20 и Среднее (условные единицы), соответственно, получены с помощью генератора азота N300DR (Peak Scientific, Массачусетс, США). Температуру вспомогательного газа поддерживали на уровне 350°С. Входной потенциал (ЕР) составлял -10 Вольт. Указанный способ также позволяет детектировать и отделять 2-гидроксимасляную кислоту.
1Н ядерная магнитно-резонансная (ЯМР) спектроскопия при напряженности поля 400 МГц. Образцы получали путем разведения 400 мкл образца 400 мкл 20 мМ фосфатного буфера, приготовленного с D2O и содержащего триметилсилилпропионовую кислоту (TMSP) в качестве внутреннего стандарта (pH=7). Указанные образцы затем переносили в стеклянную пробирку для ЯМР (5 ммх8 дюймов) и анализировали посредством 1Н ЯМР с применением предварительного насыщения для подавления сигнала воды с импульсом возбуждения 30°, релаксационной задержкой 15 с и 64 сканированиями при температуре 27°С. После получения спектра его трансформировали, сглаживали и интегрировали с применением программного обеспечения Agilent VnmrJ. TMSP в известной концентрации использовали для количественного определения 2-гидроксиизобутирата с использованием резонанса в области 1,36 м.д. (синглет).
И в E. coli, растущей в гетеротрофных условиях, и в С. autoethanogenum, растущей в автотрофных условиях, 2-гидроксиизомасляная кислота может быть детектирована в конструкциях pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB (1,5 мг/л согласно способу ЖХ-МС/МС, и 8 мг/л при ГХ-МС в С. autoethanogenum; 0,5 мг/л согласно способу ЖХ-МС/МС и 2 мг/л согласно ГХ-МС у E. coli) и pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB+ pMTL82256-ptb-buk (15 мг/л согласно способу ЖХ-МС/МС и 75 мг/л согласно ГХ-МС у С. autoethanogenum; 1,1 мг/л согласно способу ЖХ-МС/МС и 8,5 мг/л согласно ГХ-МС у E. coli), однако не в каких других конструкциях, в том числе контрольной. Безусловно, максимальное продуцирование происходило в штамме, несущем плазмиду pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82236-ptb-buk (в до раз выше, чем для всех других маршрутов), содержащем оптимальный путь с тиолазой, (S)-специфической ^-специфической 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой, 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазой и системой Ptb-Buk (фиг. 29A-D). Неожиданным образом, также обнаружено, что указанный штамм продуцирует 2гидроксибутират (2-ГБ) (до 64 мг/л согласно ЖХ-МС/МС и 50 мг/л согласно ГХ-МС у С. autoethanogenum.; 12 мг/л согласно ЖХ-МС/МС и 9,5 мг/л согласно ГХ-МС у E. coli), что указывает на неспецифическую мутазную активность (фиг. 30). То же самое было обнаружено в штамме tesB, однако в данном случае на значимо более низких уровнях (18 мг/л согласно ЖХ-МС/МС и 9 мг/л согласно ГХ-МС у С. autoethanogenum). Продуцирование 2-гидроксиизомасляной кислоты также подтверждали с помощью ЯМР.
Кроме того, проводили также количественную ПЦР в реальном времени (кРВ-ПЦР) для подтвер- 57 043734 ждения экспрессии генов thlA, hbd, meaBhcmA и hcmB (фиг. 31).
Графики РВ-ПЦР показывают, что продукт гена thlA экспрессируется на немного более высоких уровнях с промотором Ppta-ack, чем hbd (что ожидалось для второго гена в опероне), и что htncB демонстрирует немного более низкие уровни экспрессии, чем meaBhcmA. Также при 30°С в С. autoethanogenum, наблюдаются более низкие уровни экспрессии, чем при 37°С, и в E.coli при 30°С. Циклоспецифические значения приведены ниже.
Условия | Мишень | Среднее Cq | Стандартное отклонение Cq |
Е. coli / 30 °C | thlA | 18,26 | 0,243 |
hbd | 20,6 | 0,603 | |
meaBhcmA | 16,20 | 0,108 | |
hmcB | 18,30 | 0,666 | |
С. autoethanogenum / 30 °C | thlA | 26,10 | 0,169 |
Hbd | 27,54 | 0,415 | |
meaBhcmA | 20,63 | 0,604 | |
hmcB | 22,64 | 0,697 | |
С. autoethanogenum / 37 °C | thlA | 18,48 | 0,069 |
hbd | 21,85 | 0,222 | |
meaBhcmA | 16,72 | 0,119 | |
hmcB | 19,62 | 0,173 |
Отношение (S)-3-гидроксимасляной кислоты к (R)-3-гидроксимасляной кислоте измеряли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на системе для ЖХ Agilent 1260 Infinity с УФ-детекцией на 210 нм. Образцы получали путем центрифугирования при 14000 об/мин в течение 3 минут, с последующим испарением 200 мкл супернатанта до сухого остатка. Затем осадок ресуспендировали в 100% изопропаноле и обрабатывали ультразвуком при нагревании в течение 1 ч. Центрифугирование повторяли и супернатант переносили во флакон для ВЭЖХ для анализа. Разделение осуществляли, вводя пробу объемом 5 мкл на колонку TCI Chiral MB-S (250 ммх4,6 ммх3 мкм) со скоростью 1,5 мл/мин и 40°С в изократических условиях, с применением в качестве подвижной фазы 955 гексан-изопропанола с 0,1% трифторуксусной кислоты.
Проводили стереоспепифический анализ продуцированной 3-ГБ. Неожиданным образом было обнаружено, что С. autoethanogenum продуцировал смесь изомеров. Согласно описаниям, ферменты Hbd и PhaB являются стереоспецифическими, PhaB является R-специфическим, Hbd - S-специфическим; при экспрессии указанных ферментов в E.coli наблюдали стереоизомерически чистый продукт (Tseng, Appl Environ Microbiol, 75:3137-3145, 2009).
Приведенная ниже таблица указывает на равновесное распределение (R)- и (S)-форм 3-ГБ, продуцированных посредством трех разных маршрутов у С. autoethanogenum. Эти данные указывают на присутствие изомеразы в С. autoethanogenum.
Маршрут | % R-формы | % S-формы |
ThlA - PhaB | 55 ±7 | 53 ±5 |
ThlA - HBD | 12 ±3 | 88 ±3 |
ThlA - ctfAB | 16 ±7 | 84 ±7 |
Нокаут нативных изомераз может предотвращать взаимопревращение (R)- и (S)-форм 3-ГБ. Как вариант, экспрессия или избыточная экспрессия изомераз может обеспечивать новые маршруты для ptbbuk. Например, Hbd может быть использована для получения (S)-3-ГБ, изомераза может преобразовывать (S)-3-ГБ в (R)-3-ГБ, и ptb-buk может действовать на (R)-3-ГБ с продуцированием представляющих интерес продуктов.
Пример 11.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование изобутилена с помощью Ptb-Bukпреобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерат.
Были описаны разные маршруты продуцирования изобутилена, например, преобразование ацетона в изобутилен с помощью гидроксиизовалератсинтазы и декарбоксилазы (van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93:1377-1387, 2012). Однако этап гидроксиизовалератдекарбоксилазы является этапом, требующим АТФ, и кинетика указанного фермента может быть неидеальной. Были идентифицированы два ведущих к изобутилену задействующих систему Ptb-Buk альтернативных маршрута через 3- 58 043734 гидроксиизовалерил-КоА, который, как было показано in vitro, представляет собой подходящий субстрат для системы Ptb-Buk (Liu, Appl Microbiol Biotechnol, 53:545-552, 2000).
Альтернативный путь 1 состоит из синтазы, которая преобразует ацетон в 3-гидроксиизовалерилКоА (фиг. 9).
Альтернативный путь 2 проходит через известный промежуточный продукт биосинтеза изолейцина 3-метил-2-оксопентаноат, общий для бактерий, таких как E. coli или С. autoethanogenum (фиг. 10).
Пример 12.
В указанном примере описаны способы определения характеристик вариантов Ptb-Buk.
Принимая во внимание субстратную неизбирательность Ptb-Buk, предполагают, что системы PtbBuk с варьирующими последовательностями аминокислот обладают варьирующими предпочтениями в отношении определенных субстратов. Для идентификации системы Ptb-Buk, отдающей предпочтение требуемому субстрату (например, ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА, 2-гидроксиизобутирилКоА, ацетил-КоА и/или бутирил-КоА), желательно проведение высокопроизводительного скрининга. Такой скрининг может осуществляться путем сопряжения люциферазы светлячков (Luc) с системой PtbBuk (фиг. 33). Luc вступает в реакцию с D-люциферином с генерацией оксилюциферина, диоксида углерода и света. Помимо магния и молекулярного кислорода, для развития реакции с Luc требуется АТФ. АТФ представляет собой продукт, генерируемый Ptb-Buk при наличии подходящего ацил-КоА- или эноил-КоА-субстрата. Соответственно, сравнение скоростей реакции и предпочтений Ptb-Buk для различных субстратов может быть осуществлено на основании количественного определения количества света, генерируемого в ходе реакции с Ptb-Buk, Luc, d-люциферином, магнием, молекулярным кислородом, фосфатом, АДФ, и ацил-КоА или эноил-КоА.
Пример 13.
В указанном примере используется моделирование на уровне генома, чтобы продемонстрировать возможность достижения высокой селективности в отношении ненативных продуктов при применении Ptb-Buk. Кроме того, на указанном примере продемонстрировано, что применение Ptb-Buk может обеспечивать сопряжение клеточного роста с продуцированием продукта, что позволяет конструировать стабильные высокопродуктивные штаммы для ферментации.
Использовали метаболическую модель на уровне генома С. autoethanogenum, аналогичную описанной в источнике: Marcellin, Green Chem, 18: 3020-3028, 2006. Были созданы варианты указанной модели, содержащие дополнительные метаболические реакции, каждая из которых представляет отличный генетически модифицированный микроорганизм для получения ненативных продуктов. Для каждого пути получения ненативного продукта создавали три версии модели, включающей либо тиоэстеразную, либо ацетат-КоА-трансферазную, либо Ptb-Buk-реакцию.
Показатели максимальной селективности вычисляли с помощью анализа баланса потоков (FBA) с применением скриптов COBRA Toolbox v2.0 из MATLAB R2014a (The Mathworks, Inc.) с Gurobi версии 6.0.4 в качестве решающей программы (Gurobi Optimization, Inc.). Обменные реакции ограничивали для представления химически заданной минимальной ростовой среды с CO в качестве источника углерода и энергии. Для поиска существующих вариантов дизайна штамма, включающих до 10 генных нокаутов и обеспечивающих сопряжение продуцирования целевого ненативного химического вещества с ростом, использовали эволюционный алгоритм.
Согласно прогнозу на основании FBA, пути, задействующие Ptb-Buk или КоА-трансферазу, обеспечивают самые высокие показатели селективности продуктов за счет образования АТФ при субстратном фосфорилировании. Результаты представлены в табл. 2. Однако следует отметить, что одним из ограничений моделей на уровне генома и FBA-анализа является то, что не учитывается кинетика ферментов. Для функциональной КоА-трансферазной реакции требуется определенный базовый уровень ацетата, соответственно, в реальности максимальная селективность при применении КоА-трансферазы будет составлять менее чем 100% ввиду необходимости присутствия некоторого базового уровня ацетата.
- 59 043734
Таблица 2. Анализ баланса потоков (FBA), отражающий максимальные возможные показатели селективности ненативных продуктов у С. autoethanogenum в отношении совокупности продуктов и ________________________кандидатных ферментов___________________
Ненативный продукт | Максимальный % селективности (С в целевом продукте/С во всех продуктах ферментации) | ||
Тиоэстераза | КоА-трансфераза | Ptb-Buk | |
Ацетон | 82,0 | 100 | 100 |
Изопропанол | 82,1 | 100 | 100 |
Изобутилен | 55,9 | 80,2 | 80,2 |
3 -Г идроксибутират | 86,0 | 100 | 100 |
1,3-Бутандиол | 88,6 | 100 | 100 |
2-Г идроксиизобутират | 86,0 | 100 | 100 |
Желательно конструировать штаммы, в которых продуцирование целевых ненативных химических веществ необходимо для роста клеток. Согласно прогнозу на основании FBA, в большинстве случаев при сопряжении продуцирования целевого химического вещества с ростом при использовании тиоэстеразы или КоА-трансферазы возникнут затруднения; вместо этого предпочтение будет отдано нативным продуктам, ацетату и этанолу. Однако существует множество вариантов дизайна штаммов, обеспечивающих сопряжение роста и продуцирования химических веществ при использовании Ptb-Buk, часто предусматривающих разрушение фосфотрансацетилазных-ацетаткиназных реакций. В табл. 3 обобщены данные относительно способности сопряжения с ростом для каждого штамма.
Таблица 3. Потенциал для сопряжения ненативного химического продуцирования с ростом у С. autoethanogenum при росте на СО, с реконфигурацией метаболической сети с нокаутом до 10 генов
Ненативный продукт | Способность к сопряжению продуцирования ненативных химических веществ с ростом | ||
Тиоэстераза | КоА-трансфераза | Ptb-Buk | |
Ацетон | Нет | Нет | Есть |
Изопропанол | Нет | Нет | Есть |
Изобутилен | Нет | Нет | Нет |
3-Гидроксибутират | Нет | Нет | Есть |
1,3-Бутандиол | Нет | Есть | Есть |
2-Г идроксиизобутират | Нет | Нет | Есть |
Хотя и Ptb-Buk, и КоА-трансфераза могут поддерживать высокую селективность, согласно прогнозу на основании анализа баланса потоков в большинстве случаев только Ptb-Buk может обеспечивать конструирование стабильных высокопродуктивных штаммов для ферментации, обеспечивающее сопряжение продуцирования ненативных химических веществ с ростом.
Пример 14.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование адипиновой кислоты с помощью PtbBuk из газообразного сырья.
Было описано продуцирование E.coli адипиновой кислоты из сахара через путь, задействующий Ptb-Buk (Yu, Biotechnol Bioeng, 111: 2580-2586, 2014). Однако уровень продуцирования был низким, в диапазоне мкг/л. Без связи с конкретной теорией, авторы настоящего изобретения считают, что это предположительно обусловлено отсутствием движущей силы в форме восстановительной способности и профицита АТФ. Применение восстановленного газообразного субстрата, такого как СО и Н2, и ацетогенной бактерии, такой как С. autoethanogenum, может обеспечивать преодоление указанного существующего ограничения. Окисление СО и Н2 обеспечивает достаточную движущую силу для восстановления 3-оксо-адипил-КоА до 3-гидроксиадипил-КоА 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой или ацетоацетил-КоА-гидратазой, и 2,3-дегидроадипил-КоА до адипил-КоА эноил-КоА-гидролазой или эноилКоА-редуктазой (фиг. 34, этапы 23 и 25), в отличие от E.coli, растущих в гетеротрофных условиях на более окисленных сахарах. Ацетогенные бактерии существуют на энергетическом пределе жизни и, соответственно, генерирующие АТФ реакции, такие как система Ptb-Buk, обладают выраженной движущей силой, что обеспечивает эффективное преобразование адипил-КоА в адипиновую кислоту (фиг. 34, этап
-60043734
26), в отличие от E.coli, растущей в гетеротрофных условиях на сахарах, с генерацией профицита АТФ за счет гликолиза.
Для продуцирования адипиновой кислоты из газа в С. autoethanogenum гены, кодирующие сукцинил-КоА-синтетазу, из E. coli (NP_415256, NP_415257), кетоизовалератоксидоредуктазу PaaJ из E. coli (WP_001206190.1), 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу Hbd из Clostridium beijerinckii (WP_011967675.1), транс-2-эноил-КоА-редуктазу Crt из С. acetobutylicum (NP_349318.1), транс-2-эноилКоА-редуктазу Bcd из С. acetobutylicum (NP_349317.1) и флавопротеины электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316) клонируют на экспрессионную плазмиду, а затем трансформируют согласно описанию выше штаммы С. autoethanogenum pta-ack::ptb-buk или CAETHG_1524::ptb-buk из приведенных выше примеров. Адипиновую кислоту получают в соответствии с этапами, представленными на фиг. 34.
Пример 15.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование различных продуктов, в том числе 2бутен-1-ола, 3-метил-2-бутанола, 1,3-гександиола (HDO), с помощью Ptb-Buk и AOR.
Как продемонстрировано в примере 6, Ptb-Buk является в значительной степени неизбирательной и действует на широкий диапазон КоА в качестве субстратов, или может быть сконструирована таким образом, чтобы использовать диапазон не встречающихся в природе КоА в качестве субстратов. Аналогичным образом, фермент AOR, как было показано, действует на широкий диапазон субстратов. Вместе указанные два фермента могут преобразовывать широкий диапазон КоА через соответствующие кислоты в альдегиды, которые затем могут быть преобразованы в спирты, кетоны или енолы с помощью алкогольдегидрогеназ, широкий спектр которых существует в природе. Хотя в стандартных условиях восстановление кислот с ферредоксином в альдегиды с помощью AOR является эндотермическим (Thauer, Bacteriol Rev, 41: 100-180, 1977), и, соответственно, его реализация нецелесообразна, неожиданным образом, оно имеет место у карбоксидотрофных ацетогенов, таких как С. autoethanogenum, функционирующих при низких значениях pH, при CO или Н2 в качестве субстрата (Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015). Одно из общих ограничений при работе с ацетогенами заключается в том, что они ограничены по АТФ, существуя на термодинамическом пределе жизни (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), что может быть преодолено за счет сопряжения указанного восстановления кислот с АТФ-связанным образованием кислот из КоА с помощью системы Ptb-Buk.
Применение системы Ptb-Buk и системы AOR было продемонстрировано в приведенных выше примерах для нескольких разных продуктов, однако может быть расширено на дополнительные продукты, например, получение 2-бутен-1-ола, 3-метил-2-бутанола, 1,3-гександиола (HDO). 2-бутен-1-ол может быть продуцирован с помощью Ptb-Buk, AOR и алкогольдегидрогеназы из кротонил-КоА (фиг. 35). 1,3Гександиол может быть продуцирован с помощью Ptb-Buk, AOR и алкогольдегидрогеназы из 3гидроксигексаноил-КоА (фиг. 35). Путем комбинирования Ptb-Buk, Adc и алкогольдегидрогеназы (такой как нативная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа) может быть продуцирован 3-метил-2-бутанол из ацетобутирил-КоА.
Все указанные предшественники, кротонил-КоА, 3-гидроксигексаноил-КоА или ацетобутирил-КоА, могут быть получены путем восстановления и удлинения ацетил-КоА, ацетоацетил-КоА и 3-ГБ-КоА, согласно описанию в предыдущих примерах, посредством известных ферментативных путей, например, у Clostridium kluyveri (Barker, PNAS USA, 31:373-381, 1945; Seedorf, PNAS USA, 105: 2128-2133, 2008) и других Clostridia. Задействованные ферменты включают кротонил-КоА-гидратазу (кротоназу) или кротонил-КоА-редуктазу, бутирил-КоА-дегидрогеназу или транс-2-эноил-КоА-редуктазу, тиолазу или ацилКоА-ацетилтрансферазу, и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу или ацетоацетил-КоА-гидратазу (фиг. 35). Соответствующие гены из С. kluyveri или других Clostridia были клонированы в экспрессионную плазмиду (U.S. 2011/0236941) и затем согласно описанию выше трансформировали штаммы С. autoethanogenum pta-ack::ptb-buk или CAETHG_1524::ptb-buk из приведенных выше примеров для получения 2бутен-1-ола, 3-метил-2-бутанола, 1,3-гександиола (HDO). 2-бутен-1-ол, 3-метил-2-бутанол и 1,3гександиол (HDO) могут быть предшественниками для дальнейших выходных продуктов.
Хотя было представлено всего несколько примеров, следует понимать, что указанный путь может быть дополнительно расширен с применением тех же ферментов или их сконструированных вариантов, обладающих специфичностью в отношении более длинных цепей, для получения диапазона спиртов, кетонов, енолов или диолов С4, С6, С8, Сю, С12, С14 (фиг. 39). Молекулы другого типа могут быть получены также с применением праймеров или удлиняющих звеньев, отличных от ацетил-КоА, на тиолазном этапе, согласно существующим описаниям (Cheong, Nature Biotechnol, 34: 556-561, 2016).
Все источники, в том числе публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылок в той же степени, как если бы каждый источник был индивидуальным конкретным образом включен посредством ссылки и полностью приведен в настоящем документе. Ссылка на какой-либо предшествующий уровень техники в настоящем описании не предполагает, и не должна быть истолкована как признание того, что предшествующий уровень техники входит в известный уровень техники в рассматриваемой области в какой-либо стране.
Применение терминов в единственном числе, включая сопровождаемые определением указан-
Claims (15)
- ный(ая,ое) и аналогичных объектов в контексте описания настоящего изобретения (в частности, в контексте приведенной ниже формулы изобретения) должны рассматриваться как охватывающие термины как в единственном, так и во множественном числе, если в настоящем документе не указано иное или если это явным образом не противоречит контексту. Термины состоящий, имеющий, включающий и содержащий должны рассматриваться как неограничивающие (т.е. означающие в том числе, но не ограничиваясь перечисленным), если не указано иное. Подразумевается, что указание диапазонов значений в настоящем документе служит исключительно в качестве краткого способа индивидуального указания каждого отдельного значения, попадающего в указанный диапазон, если в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в настоящее описание в той же степени, как если бы оно было индивидуальным образом указано в настоящем документе. Все способы, описанные в настоящем документе, могут быть реализованы в любом подходящем порядке, если в настоящем документе не указано иное или если это иным образом явно не противоречит контексту. Применение всех и каждого примеров, или примеры выражений (например, такие как) в настоящем документе предназначено исключительно для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения, если не указано иное. Никакая формулировка в настоящем описании не должна быть истолкована как подразумевающая, что какой-либо не заявленный элемент имеет существенное значение для практической реализации настоящего изобретения.Предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения описаны в настоящем документе. Специалисты в данной области техники после прочтения приведенного выше описания смогут обнаружить очевидные варианты указанных предпочтительных вариантов реализации. Авторы настоящего изобретения ожидают, что специалисты в соответствующих случаях будут применять такие варианты, и предполагают, что практическая реализация настоящего изобретения может осуществляться иным образом, чем, в частности, это описано в настоящем документе. Соответственно, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета изобретения, описанного в формуле изобретения, прилагаемой к настоящему документу, в рамках, установленных применимым законодательством. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных вариантах охвачена настоящим изобретением, если в настоящем документе не указано иное или если это иным образом явно не противоречит контексту.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Генетически сконструированная бактерия, содержащая экзогенную фосфатбутирилтрансферазу (Ptb) и экзогенную бутираткиназу (Buk) (Ptb-Buk), где Ptb-Buk действует на субстрат ацил-КоА или эноил-КоА, отличный от бутаноил-КоА, где указанная бактерия представляет собой С1-фиксирующую бактерию, которая содержит путь Вуда-Льюнгдаля, где указанная бактерия выбрана изAcetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, и Thermoanaerobacter kiuvi и где указанная бактерия продуцирует одно или более из ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата, 1,3бутандиола, 2-гидроксиизобутирата, адипиновой кислоты, 1,3-гександиола, 3-метил-2-бутанола, 2-бутен1-ола, этанола, иное чем бутират.
- 2. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия не продуцирует бутанол.
- 3. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная Ptb-Buk преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират.
- 4. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия дополнительно содержит экзогенную или эндогенную альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу (AOR).
- 5. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия дополнительно содержит разрушающую мутацию в фосфотрансацетилазе (Pta) и ацетаткиназе (Ack).
- 6. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия дополнительно содержит разрушающую мутацию в тиоэстеразе.
- 7. Бактерия по п.1, содержащая:(а) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, и фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, фермент, который преобразует 3-гидроксибутират в ацетоацетат, и фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, при этом фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, представляет собой Ptb-Buk.- 62 043734
- 8. Бактерия по п.7, характеризующаяся тем, что указанная бактерия дополнительно содержит разрушающую мутацию в первичной:вторичной алкогольдегидрогеназе.
- 9. Бактерия по п.1, содержащая:(a) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, и фермент, который преобразует ацетон в изопропанол, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, фермент, который преобразует 3-гидроксибутират в ацетоацетат, фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, и фермент, который преобразует ацетон в изопропанол, при этом фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, представляет собой Ptb-Buk.
- 10. Бактерия по п.1, содержащая:(a) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, фермент, который преобразует ацетон в 3-гидроксиизовалерат, и фермент, который преобразует 3-гидроксиизовалерат в изобутилен, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, фермент, который преобразует ацетон в 3-гидроксиизовалерил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксиизовалерилКоА в 3-гидроксиизовалерат, и фермент, который преобразует 3-гидроксиизовалерат в изобутилен, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, и/или фермент, который преобразует 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3-гидроксиизовалерат, представляет собой Ptb-Buk.
- 11. Бактерия по п.1, содержащая:(a) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, и фермент, который преобразует ацетоацетат в 3-гидроксибутират, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, при этом фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, представляет собой Ptb-Buk.
- 12. Бактерия по п.1, содержащая:(a) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, и фермент, который преобразует ацетоацетат в 3-гидроксибутират, фермент, который преобразует 3-гидроксибутират в 3-гидроксибутиральдегид, и фермент, который преобразует 3-гидроксибутиральдегид в 1,3-бутандиол, при этом фермент, который преобразует ацетоацетилКоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, фермент, который преобразует 3-гидроксибутират в 3-гидроксибутиральдегид, и фермент, который преобразует 3-гидроксибутиральдегид в 1,3-бутандиол, при этом фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, представляет собой Ptb-Buk.
- 13. Бактерия по п.1, содержащая:(а) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 2гидроксиизобутирил-КоА, и фермент, который преобразует 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират, при этом фермент, который преобразует 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират, представляет собой Ptb-Buk.
- 14. Бактерия по п.1, содержащая:(a) ферменты, которые преобразуют ацетил-КоА в сукцинил-КоА, фермент, который преобразует сукцинил-КоА в 3-оксоадипил-КоА, фермент, который преобразует 3-оксоадипил-КоА в 3гидроксиадипил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксиадипил-КоА в 2,3-дегидроадипил-КоА, фермент, который преобразует 2,3-дегидроадипил-КоА в адипил-КоА, и фермент, который преобразует адипил-КоА в адипиновую кислоту, при этом фермент, преобразующий адипил-КоА в адипиновую кислоту, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в 3-оксоадипил-КоА, фермент, который преобразует 3-оксоадипил-КоА в 3-гидроксиадипил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксиадипил-КоА в 2,3-дегидроадипил-КоА, фермент, который преобразует 2,3-дегидроадипил-КоА в адипил-КоА, и фермент, который преобразует адипил-КоА в адипиновую кислоту, при этом фермент, который преобразует адипил-КоА в адипиновую кислоту, представляет собой Ptb-Buk.
- 15. Бактерия по п.1, содержащая:-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/240,850 | 2015-10-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA043734B1 true EA043734B1 (ru) | 2023-06-19 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10316337B2 (en) | Genetically engineered bacterium for the production of isobutylene | |
AU2012221176B2 (en) | Recombinant microorganisms and uses therefor | |
US20090111154A1 (en) | Butanol production by recombinant microorganisms | |
US20100221800A1 (en) | Microorganism engineered to produce isopropanol | |
CA3079761A1 (en) | Microorganisms and methods for the biological production of ethylene glycol | |
CA2899587C (en) | Recombinant microorganisms comprising nadph dependent enzymes and methods of production thereof | |
US20160024532A1 (en) | Atp driven direct photosynthetic production of fuels and chemicals | |
WO2012135731A2 (en) | Alcohol production from recombinant microorganisms | |
WO2012099934A2 (en) | Butanol production by microorganisms having nadh coupling | |
US9434963B2 (en) | Process for butanol production | |
US20160138049A1 (en) | OXYGEN-TOLERANT CoA-ACETYLATING ALDEHYDE DEHYDROGENASE CONTAINING PATHWAY FOR BIOFUEL PRODUCTION | |
TWI811184B (zh) | 包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌 | |
EA043734B1 (ru) | Генетически сконструированная бактерия, содержащая энергогенерирующий ферментативный путь | |
TW202128984A (zh) | 包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌 | |
CA3228407A1 (en) | Microbial fermentation for the production of isoprenoid alcohols and derivatives |