EA043734B1 - Генетически сконструированная бактерия, содержащая энергогенерирующий ферментативный путь - Google Patents

Генетически сконструированная бактерия, содержащая энергогенерирующий ферментативный путь Download PDF

Info

Publication number
EA043734B1
EA043734B1 EA201890952 EA043734B1 EA 043734 B1 EA043734 B1 EA 043734B1 EA 201890952 EA201890952 EA 201890952 EA 043734 B1 EA043734 B1 EA 043734B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
coa
enzyme
converts
clostridium
aldehyde
Prior art date
Application number
EA201890952
Other languages
English (en)
Inventor
Михаэль Кёпке
Расмус Овергорд Енсен
Джеймс Брюс Ярнтон Хэйкок Берендорфф
Райан Эдвард Хилл
Дармави Джуминага
Александер Пол Мюллер
Original Assignee
ЛанцаТек НЗ, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ЛанцаТек НЗ, Инк. filed Critical ЛанцаТек НЗ, Инк.
Publication of EA043734B1 publication Critical patent/EA043734B1/ru

Links

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/240850, поданной 13 октября 2015 г., полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.
Уровень техники
Благодаря недавним успехам в ферментативном и метаболическом конструировании (инженерии) были идентифицированы и разработаны ферментативные маршруты для получения различных продуктов (Clomburg, Appl Microbiol Biotechnol, 86: 419-434, 2010; Peralta-Yahya, Biotechnol J, 5: 147-162, 2010; Cho, Biotechnol Adv, pii: S0734-9750(14)00181-5, 2014. Однако все указанные ферментативные маршруты являются энерго(АТФ)-потребляющими или, в лучшем случае, энергетически (АТФ-) нейтральными, что ограничивает выход продукта в энергетически ограниченных системах и рассинхронизирует продуцирование продукта и рост микроорганизма. Согласно настоящему изобретению предложены энергогенерирующие (АТФ-генерирующие) пути, позволяющие преодолеть указанные ограничения, обеспечивая новые ферментативные маршруты и пути для получения различных продуктов, в том числе кислот, алкенов, альдегидов, спиртов и диолов. Указанные пути прямо сопряжены с ростом микроорганизма и обеспечивают высокий выход продуктов.
В частности, настоящее изобретение относится к ферментативным путям, включающим Ptb-Buk. Фосфатбутирилтрансфераза (Ptb) (EC 2.3.1.19) в норме катализирует реакцию бутаноил-КоА и фосфата с образованием КоА и бутаноилфосфата. Бутираткиназа (Buk) (EC 2.7.2.7) в норме катализирует реакцию бутаноилфосфата и АДФ с образованием бутирата (бутаноата) и АТФ. Соответственно, указанные ферменты совместно (Ptb-Buk) в норме катализируют преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерируют одну молекулу АТФ по механизму субстратного фосфорилирования (SLP).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной и способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, Ptb-Buk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ по механизму субстратного фосфорилирования.
Кроме того, в комбинации с альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (AOR) и алкогольдегидрогеназой, кислоты, образованные с помощью системы Ptb-Buk, могут быть далее преобразованы в соответствующие альдегиды, спирты или диолы. AOR (EC 1.2.7.5) катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина (который может, например, образовываться в результате окисления CO или водорода) с образованием альдегида и окисленного ферредоксина.
Алкогольдегидрогеназа (EC 1.1.1.1 и EC 1.1.1.2) может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф).
Введение Ptb-Buk и/или AOR в гетерологичный вид, соответственно, обеспечивает новый альтернативный способ получения нативных и ненативных продуктов, таких как кислоты, алкены, кетоны, альдегиды, спирты и диолы, с высоким выходом, таким образом преодолевая ограничения существующего уровня техники.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложена генетически сконструированная (т.е. генноинженерная) бактерия, содержащая экзогенную фосфатбутирилтрансферазу (Ptb) и экзогенную бутираткиназу (Buk) (Ptb-Buk). В общем случае, указанная Ptb-Buk действует на ненативный субстрат, например, субстрат, отличный от бутаноил-КоА и/или бутаноилфосфата, и продуцирует ненативный продукт, например, продукт, отличный от бутаноилфосфата или бутирата. Согласно некоторым вариантам реализации указанная Ptb-Buk преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3гидроксиизовалерат, 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, или 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират.
Указанная бактерия может продуцировать что-либо одно или более из кислоты, алкена, кетона, альдегида, спирта или диола. Более конкретно, указанная бактерия может продуцировать что-либо одно или более из ацетона или его предшественника, изопропанола или его предшественника, изобутилена или его предшественника, 3-гидроксибутирата или его предшественника, 1,3-бутандиола или его предшественника, 2-гидроксиизобутирата или его предшественника, адипиновой кислоты или ее предшественника, 1,3-гександиола или его предшественника, 3-метил-2-бутанола или его предшественника, 2-бутен-1-ола или его предшественника, изовалерата или его предшественника, или изоамилового спирта или его предшественника. Указанная бактерия, как правило, не продуцирует бутанол.
Указанная бактерия может дополнительно содержать разрушающую мутацию в фосфотрансацетилазе (Pta) и ацетаткиназе (Ack). Указанная бактерия может дополнительно содержать разрушающую мутацию в тиоэстеразе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена генетически сконструированная бактерия, содержащая экзогенную Ptb-Buk и экзогенную или эндогенную альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения продукта, включающий культивирование бактерии согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации в присутствии субстрата. Указанный продукт может представлять собой, например, ацетон или его предшественник, изопропанол или его предшественник, изобутилен или его предшественник, 3-гидроксибутират или его
- 1 043734 предшественник, 1,3-бутандиол или его предшественник, 2-гидроксиизобутират или его предшественник, адипиновую кислоту или ее предшественник, 1,3-гександиол или его предшественник, 3-метил-2бутанол или его предшественник, 2-бутен-1-ол или его предшественник, изовалерат или его предшественник, или изоамиловый спирт или его предшественник. Обычно указанный субстрат представляет собой газообразный субстрат, содержащий, например, что-либо одно или более из CO, CO2 и H2. Согласно одному варианту реализации указанный газообразный субстрат представляет собой сингаз. Согласно другому варианту реализации указанный газообразный субстрат представляет собой отходящий промышленный газ.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата, 1,3-бутандиола и 2гидроксиизобутирата из ацетил-КоА. Ацетил-КоА может быть получен из любого подходящего субстрата, такого как углеводный (например, сахарный) субстрат или газообразный субстрат. Согласно настоящему изобретению ацетил-КоА часто получают из газообразного субстрата. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.
Фиг. 2 представляет собой диаграмму, отражающую реакции, естественным образом катализируемые Ptb-Buk, а именно, преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерацию одной молекулы АТФ.
Фиг. 3 представляет собой диаграмму сравнения активности КоА-трансферазы, тиоэстеразы и PtbBuk.
Фиг. 4 представляет собой график, отражающий средние показатели продуцирования ацетона в E. coli BL21 (D3), модифицированной плазмидами, содержащими экзогенные гены. Указанные данные демонстрируют способность Ptb-Buk к преобразованию ацетоацетил-КоА в ацетоацетат в E.coli in vivo.
Фиг. 5 представляет собой график, отражающий эффект индукции E. coli BL21 (DE3), несущей как плазмиду pACYC-ptb-buk, так и плазмиду pCOLA-thlA-adc (экспрессирующие тиолазу, Ptb-Buk и ацетоацетатдекарбоксилазу).
Фиг. 6 представляет собой диаграмму пути, разработанного для применения Ptb-Buk для получения ацетона, с повторным использованием восстанавливающих эквивалентов, получаемых при продуцировании (R)-3-гидроксибутирuл-КоА и АТФ, генерируемой Ptb-Buk.
Фиг. 7 представляет собой диаграмму, отражающую роль альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы (AOR), ферредоксина и Adh при продуцировании 1,3-бутандиола в С. autoethanogenum. Чаще всего AOR может применяться для катализа преобразование кислоты в альдегид, a Adh может применяться для катализа преобразования альдегида в спирт/диол.
Фиг. 8 представляет собой диаграмму, отражающую стереоспецифичность Ptb-Buk при продуцировании (R)-3-гидроксибутирата и 2-гидроксиизобутирата. Термин нативный на фиг. 8 относится к нативной тиоэстеразе.
Фиг. 9 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование изобутена с помощью PtbBuk-преобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерата с применением альтернативного пути 1.
Фиг. 10 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование изобутена с помощью PtbBuk-преобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерата с применением альтернативного пути 2.
Фиг. 11 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование 1,3-бутандиола с помощью 3 -бутиральдегиддегидрогеназы (Bld).
Фиг. 12 представляет собой график, отражающий продуцирование изопропанола в С. autoethanogenum с применением системы Ptb-Buk относительно контроля oPMTL85i47-thlA-adc, • pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.
Фиг. 13A-F представляют собой графики, отражающие продуцирование 3-гидроксибутирата, ацетата, этанола и ацетона с применением модульных плазмид у E. coli с разными концентрациями индуктора ИТПТ (0, 50, 100 мкМ). Фиг. 13А: pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB. Фиг. 13В:
pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13С: pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13D: pCOLA-thlA-adc. Фиг. 13E: pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13F: pCDF-phaB.
Фиг. 14 представляет собой плазмидную карту плазмиды pMTL8225-budA::thlA-phaB.
Фиг. 15 представляет собой снимок геля ПЦР-верификации замены генов ацетолактатсинтазы (budA) генами тиолазы (thlA) и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (phaB) у С. autoethanogenum для 4 клонов (1, 4, 7, 9) по сравнению с диким типом (W). Все клоны являются положительными, что видно по большему размеру ПЦР-фрагментов по сравнению с диким типом.
Фиг. 16 представляет собой график, отражающий профиль ферментации для периодической ферментации штамма С. autoethanogenum budA::thlAphaB и демонстрирующий образование 3гидроксибутирата и 1,3-бутандиола из газа.
Фиг. 17А представляет собой график, отражающий продуцирование 1,3-BDO с помощью тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (Bld) и бутиральдегиддегидрогеназы. Фиг. 17В представляет собой график, отражающий влияние экспрессии bld на рост.
- 2 043734
Фиг. 18А представляет собой график, отражающий образование 3-гидроксибутирата и 1,3бутандиола из газообразного субстрата в С autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA. Фиг. 18В представляет собой график, отражающий восстановление ацетата в этанол в той же культуре. Фиг. 19 представляет собой график, отражающий профиль ферментации штамма С. autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA, демонстрирующий образование 3-гидроксибутирата и 1,3-бутандиола из газообразного субстрата в непрерывной культуре (где это указано, среду непрерывно восполняли с заданной скоростью разведения D).
Фиг. 20А и 20В представляют собой графики, отражающие увеличенную активность гидролиза КоА в отношении диапазона ацил-КоА (ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирилКоА) у С. autoethanogenum, экспрессирующего систему Ptb-Buk из плазмиды pMTL82256-ptb-buk, по сравнению с диким типом (WT).
Фиг. 21А и 21В представляют собой графики, отражающие сниженную активность гидролиза ацилКоА у штаммов С. autoethanogenum с инактивированной тиоэстеразой (СТ2640 = тиоэстераза 1, СТ1524 = тиоэстераза 2, СТ1780 = тиоэстераза 3) по сравнению с активностью, обнаруживаемой у C. autoethanogenum LZ1560 или LZ1561.
Фиг. 22 представляет собой график, отражающий увеличенное специфическое продуцирование изопропанола у штамма С. autoethanogenum с разрушенной тиоэстеразой 3 CAETHG_1780 по сравнению с С. autoethanogenum дикого типа.
Фиг. 23A-D представляют собой графики, отражающие рост (фиг. 23А) и профили продуцирования изопропанола (фиг. 23В), ацетата (фиг. 23С) и этанола (фиг. 23D) у С. autoethanogenum дикого типа и штамма с разрушенной тиоэстеразой 3 (CAETHG_1780), по сравнению с С. autoethanogenum дикого типа.
Фиг. 24 представляет собой плазмидную карту pMTL8225-pta-ack::ptb-buk.
Фиг. 25 представляет собой снимок геля, отражающий замену генов pta и ack на гены ptb и buk и кассету ermB.
Фиг. 26 представляет собой график, отражающий увеличенное преобразование 3-гидроксибутирата в 1,3-BDO за счет избыточной экспрессии гена альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы aor1.
Фиг. 27 представляет собой график, отражающий активность тиоэстеразы TesB, Pta-Ack и системы Ptb-Buk на гидролиз КоА ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирил-КоА по сравнению с контролем (штамм BL21). Ptb-Buk демонстрирует максимальную активность, тогда как PtaAck демонстрирует отсутствие активности.
Фиг. 28А и 28В представляют собой графики, отражающие продуцирование 3-гидроксибутирата с помощью Ptb-Buk в комбинации с ^-специфической (Hbd) (фиг. 28А) или ^-специфической 3гидроксибутиратдегидрогеназой (PhaB) (фиг. 28В).
Фиг. 29A-D представляют собой графики, отражающие ЖХ-МС/МС-детекцию 2гидроксиизомасляной кислоты (2-ГИБ) и 2-гидроксибутирата (2-ГБ). Фиг. 29А: 1 мМ стандарт 2-ГИБ. Фиг. 29В: 1 мМ стандарт 2-ГБ. Фиг. 29С: 0,5 мМ стандарт 2-ГБ и 2-ГИБ. Фиг. 29D: дупликат образца С. autoethanogenum, демонстрирующий продуцирование 2-ГИБ и 2-ГБ из газа.
Фиг. 30 представляет собой группу графиков, отражающих ГХ-МС-подтверждение продуцирования 2-гидроксиизомасляной кислоты (8,91 мин).
Первая панель: С. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Вторая панель: С. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk (спектр). Третья панель: Е. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Четвертая панель: Е. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk.
Фиг. 31 представляет собой группу графиков ПЦР в реальном времени, отражающих экспрессию генов пути 2-ШВА (thlA, hba, meaBhcmA, hcmB из промотора pta-ack и, соответственно, промотора оперона Вуда-Льюнгдаля) в E.coli, С. autoethanogenum LZ1561 при 30°С, и С. autoethanogenum LZ1561 при 37°С.
Фиг. 32 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование различных продуктов в микроорганизме, содержащем Ptb-Buk, AOR и Adh.
Фиг. 33 представляет собой диаграмму, отражающую сопряжение люциферазы светлячков (Luc) с системой Ptb-Buk для характеризации вариантов Ptb-Buk.
Фиг. 34 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе адипиновой кислоты. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.
Фиг. 35 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе 1,3-гександиола, 2-метил-2-бутанола и 2-бутен-1-ола. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.
Фиг. 36 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе изовалерата и изоамилового спирта. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.
- 3 043734
Фиг. 37 представляет собой график продуцирования 3-ГБ в С. autoethanogenum, содержащем плазмиду pMTL82256-thlA-ctfAB, в различных точках роста.
Фиг. 38А представляет собой график, отражающий рост и профиль продуцирования этанола и 2,3бутандиола у штамма С. awtoetf?a«ogrnwwpta-ack::ptb-buk + pMTL85147^^ Фиг. 38В представляет собой график, отражающий профиль продуцирования изопропанола и 3-ГБ у штамма С. autoethanogenum pta-ack: :ptb-buk + pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.
Фиг. 39 представляет собой диаграмму схемы пути продуцирования диапазона спиртов, кетонов, енолов или диолов С4, C6, C8, C10, С12, С14 посредством комбинирования известного пути удлинения цепи (Hbd, Crt, Bcd-EtfAB, ТЫ) с Ptb-Buk + AOR/Adc-Adh.
Фиг. 40 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO С. autoethanogenum, трансформированным плазмидой pMTL83159-phaB-thlA, в различных точках роста.
Фиг. 41 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO С. autoethanogenum, содержащим нокаут budA и pMTL-HBD-ThlA, в различных точках роста.
Фиг. 42А представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ при ферментации С. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256. Фиг. 42В представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ при ферментации С. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256-buk-ptb.
Фиг. 43 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ штаммом С. autoethanogenum, с нокаутом тиоэстеразы (ΔCAETHG_1524), экспрессирующим плазмиду pMTL83156-phaB-thlA, содержащим и не содержащим экспрессионную плазмиду Ptb-Buk pMTL82256-buk-ptb.
Фиг. 44 представляет собой график, отражающий продуцирование этанола и 1,3-BDO у штамма С. autoethanogenum, экспрессирующего плазмиду pMTL82256-hbd-thlA (2pf) содержащего и не содержащего плазмиду для избыточной экспрессии AOR pMTL83159-aor1 (+aorl).
Подробное описание изобретения Метаболические пути на фиг. 1 и 34-36
Фиг. 1 и 34-36 представляют собой диаграммы метаболических путей продуцирования различных продуктов кислот, алкенов, кетонов, альдегидов, спиртов и диолов, в том числе ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата (R- и S-изомеров), 1,3-бутандиола, 2-гидроксиизобутирата, адипиновой кислоты, 1,3-гександиола, 2-метил-2-бутанола, 2-бутен-1-ола, изовалерата и изоамилового спирта из субстрата. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk. Примеры ферментов приведены для каждого из этапов и ферментативных путей, подробно представленных на фиг. 1 и 34-36. Однако специалисту в данной области техники могут быть известны дополнительные подходящие ферменты.
Этап 1 отражает преобразование ацетил-Ко А в ацетоацетил-КоА. Указанный этап может быть катализирован тиолазой (т.е. ацетил-КоА-ацетилтрансферазой) (EC 2.3.1.9). Указанная тиолаза может представлять собой, например, ThlA из Clostridium, acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), PhaA из Cupriavidus necator (WP_013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB из Cupriavidus necator (WP_011615089.1) (SEQ ID NO: 3) или AtoB из Escherichia coli (NP_416728.1) (SEQ ID NO: 4). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 2 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в ацетоацетат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9), и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацилКоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12), и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрес- 4 043734 сия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 3 отражает преобразование ацетоацетата в ацетон. Указанный этап может быть катализирован ацетоацетатдекарбоксилазой (EC 4.1.1.4). Указанная ацетоацетатдекарбоксилаза может представлять собой, например, Adc из Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). Указанный этап может также быть катализирован альфа-кетоизовалератдекарбоксилазой (EC 4.1.1.74). Указанная альфакетоизовалератдекарбоксилаза может представлять собой, например, KivD из Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Кроме того, Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. В редких случаях преобразование ацетоацетата в ацетон может происходить спонтанно. Однако спонтанное преобразование очень неэффективно; маловероятно, что оно может приводить к продуцированию выходных продуктов на желаемых уровнях.
Этап 4 отражает преобразование ацетона в изопропанол. Указанный этап может быть катализирован первичной: вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.2). Указанная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
SecAdh из
Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh из Clostridium ljungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh из Clostridium ragsdalei (WPJH3239134.1) (SEQ ID NO: 18) или SecAdh из Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).
Указанный этап может также быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.80), такой как SecAdh из Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Однако Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Нокдаун или нокаут указанного фермента у Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei приводит к продуцированию и накоплению ацетона, а не изопропанола (WO 2015/085015).
Этап 5 отражает преобразование ацетона в 3-гидроксиизовалерат. Указанный этап может быть катализирован гидроксиизовалератсинтазой, например, гидроксиметилглутарил-КоА-синтазой (ГМГ-КоАсинтазой) (EC 2.3.3.10) из Mus musculus (SEQ ID NO: 21) (US 2012/0110001).
Гидроксиметилглутарил-КоА-синтаза может быть сконструирована таким образом, чтобы ее активность увеличивалась. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 6 отражает преобразование 3-гидроксиизовалерата в изобутилен (изобутен). Указанный этап может быть катализирован гидроксиизовалератфосфорилазой/декарбоксилазой. Указанный этап может также быть катализирован мевалонатдифосфатдекарбоксилазой (гидроксиизовалератдекарбоксилазой) (EC 4.1.1.33). Указанная мевалонатдифосфатдекарбоксилаза может представлять собой, например,
Mdd из Saccharomyces cerevisiae (САА96324.1) (SEQ ID NO:
22) или Mdd из Picrophilus torridus (WP_011178157.1) (SEQ ID NO: 23) (US 2011/0165644; van Leeuwen, ApplMicrobiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012).
Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 7 отражает преобразование ацетона в 3-гидроксиизовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксиизовалерил-КоА-синтазой. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 8 отражает преобразование 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3-гидроксиизовалерат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетической тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium, autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9) и (3) тиоэстераза
- 5 043734 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 9 отражает преобразование ацетил-КоА в 3-метил-2-оксопентаноат. Указанный этап охватывает ряд ферментативных реакций, вовлеченных в путь биосинтез изолейцина, который естественным образом присутствует у многих бактерий, в том числе Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (и Escherichia coli). Ферменты, вовлеченные в преобразование ацетил-КоА в 3-метил-2-оксопентаноат, могут включать цитрамалатсинтазу (EC 2.3.1.182), 3-изопропилмалатдегидратазу (EC 4.2.1.35), 3-изопропилмалатдегидрогеназу (EC 1.1.1.85), ацетолактатсинтазу (EC 2.2.1.6), кетол-кислотную редуктоизомеразу (EC 1.1.1.86) и/или дигидроксикислотную дегидратазу (EC 4.2.1.9). Указанная цитрамалатсинтаза может представлять собой, например, CimA из Clostridium autoethanogenum (AGY76958.1) (SEQ ID NO: 24) или CimA из Methanocaldococcus jannaschii (NP_248395.1) (SEQ ID NO: 25). Указанная 3-изопропилмалатдегидратаза может представлять собой, например, LeuCD из Clostridium autoethanogenum (WP_023162955.1, LeuC; AGY77204.1, LeuD) (последовательности SEQ ID NO: 26 и 27, соответственно) или LeuCD из Escherichia coli (NP_414614.1, LeuC; NP_414613.1, LeuD) (последовательности SEQ ID NO: 28 и 29, соответственно). Указанная 3изопропилмалатдегидрогеназа может представлять собой, например, LeuB из Clostridium autoethanogenum (WP_023162957.1) (SEQ ID NO: 30) или LeuB из Escherichia coli (NP_414615.4) (SEQ ID NO: 31). Указанная ацетолактатсинтаза может представлять собой, например, IlvBN из Clostridium autoethanogenum (AGY74359.1, IlvB; AGY74635.1, IlvB; AGY74360.1, IlvN) (последовательности SEQ ID NO: 32, 33 и 34, соответственно) или IlvBN из Escherichia coli (NP_418127.1, IlvB; NP_418126.1, IlvN) (последовательности SEQ ID NO: 35 и 36, соответственно). Указанная кетол-кислотная редуктоизомераза может представлять собой, например, IlvC из Clostridium autoethanogenum (WP_013238693.1) (SEQ ID NO: 37) или IlvC из Escherichia coli (NP_418222.1) (SEQ ID NO: 38). Указанная дигидроксикислотная дегидратаза может представлять собой, например, IlvD из Clostridium autoethanogenum (WP_013238694.1) (SEQ ID NO: 39) или IlvD из Escherichia coli (YP_026248.1) (SEQ ID NO: 40). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 10 отражает преобразование 3-метил-2-оксопентоаа в 2-метилбутаноил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кетоизовалератоксидоредуктазой (EC 1.2.7.7). Указанная кетоизовалератоксидоредуктаза может представлять собой, например, VorABCD из Methanothermobacter thermautotrophicus (WP_010876344.1, VorA; WP_010876343.1, VorB; WP_010876342.1, VorC; WP_010876341.1, VorD) (последовательности SEQ ID NO: 41-44, соответственно) или VorABCD из Pyrococcus furiosus (WP_011012106.1, VorA; WP_011012105.1, VorB; WP_011012108.1, VorC; WP_011012107.1, VorD) (последовательности SEQ ID NO: 45-48, соответственно). VorABCD представляет собой 4-субъединичный фермент. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 11 отражает преобразование 2-метилбутаноил-КоА в 2-метилкротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 2-метилбутаноил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.3.99.12). Указанная 2метилбутаноил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой, например, AcdH из Streptomyces avermitilis (AAD44196.1 или ВАВ69160.1) (SEQ ID NO: 49) или AcdH из Streptomyces coelicolor (AAD44195.1) (SEQ ID NO: 50). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 12 отражает преобразование 2-метилкротонил-КоА в 3-гидроксиизовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кротоназой/3-гидроксибутирил-КоА-дегидратазой (EC 4.2.1.55). Указанная кротоназа/3-гидроксибутирил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, Crt из Clostridium beijerinckii (ABR34202.1) (SEQ ID NO: 51), Crt из Clostridium acetobutylicum (Np_349318.1) (SEQ ID NO: 52) или LiuC из Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). Указанный этап может также быть катализирован кротонил-КоА-карбоксилазой-редуктазой (EC 1.3.1.86). Указанная кротонил-КоА-карбоксилаза
- 6 043734 редуктаза может представлять собой, например, Ccr из Treponema denticola (NP_971211.1) (SEQ ID NO: 53). Указанный этап может также быть катализирован кротонил-КоА-редуктазой (EC 1.3.1.44). Указанная кротонил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Ter из Euglena gracilis (AAW66853.1) (SEQ ID NO: 54). Указанный этап может также быть катализирован 3-гидроксипропионил-КоАдегидратазой (EC 4.2.1.116). Указанная 3-гидроксипропионил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, Msed_2001 из Metallosphaera sedula (WP_012021928.1). Указанный этап может также быть катализирован эноил-КоА-гидратазой. Указанная эноил-КоА-гидратаза (4.2.1.17) может представлять собой, например, YngF из Bacillus anthracis (WP_000787371.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 13 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.1.1.157). Указанная 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой, например, Hbd из Clostridium beijerinckii (WP_011967675.1) (SeQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NP_349314.1) (SEQ ID NO: 56) или Hbd1 из Clostridium kluyveri (WP_011989027.1) (SEQ ID NO: 57). Указанный этап может также быть катализирован ацетоацетил-КоА-редуктазой (EC 4.2.1.36). Указанная ацетоацетил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, PhaB из Cupriavidus necator (WP_010810131.1) (SEQ ID NO: 58). Указанный этап может также быть катализирован ацетоацетил-КоА-гидратазой (EC 4.2.1.119). Следует отметить, что PhaB является R-специфической, a Hbd является S-специфической. Кроме того, Hbd1 из Clostridium, kluyveri является НАДФН-зависимой, а Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 14 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. Указанный этап может быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9) и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 15 отражает преобразование 3-гидроксибутирата в ацетоацетат. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутиратдегидрогеназой (EC 1.1.1.30). Указанная 3-гидроксибутиратдегидрогеназа может представлять собой, например, Bdh1 из Ralstonia pickettii (ВАЕ72684.1) (SEQ ID NO: 60) или Bdh2 из Ralstonia pickettii (BAE72685.1) (SEQ ID NO: 61). Указанная обратная реакция, преобразование ацетоацетата в 3-гидроксибутират, может быть катализирована другими 3гидроксибутиратдегидрогеназными (EC 1.1.1.30) ферментами. Например, преобразование ацетоацетата в 3-гидроксибутират может быть катализировано Bdh из Clostridium autoethanogenum (AGY75962) (SEQ ID NO: 62). Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei предположительно содержат ферменты с аналогичной активностью. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 16 отражает преобразование 3-гидроксибутирата в 3-гидроксибутирилальдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза (AOR) может представлять собой, например, AOR из Clostridium autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (последовательности SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно) или AOR из Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (последовательности SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно). Согласно дополнительным вариантам реализации указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза, например, может представлять собой любой источник или может про
- 7 043734 исходить из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:
Описание Микроорганизм Номер доступа GenelD
альдегид: ферредо ксино ксидоре дуктаза Acidilobus saccharovorans 345-15 NC-014374.1 9498931
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Acidilobus saccharovorans 345-15 NC__014374.1 9499504
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Acidilobus saccharovorans 345-15 NC_014374.1 9499550
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Acidilobus saccharovorans 345-15 NC_014374.1 9498997
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum boonei T469 NC 013926.1 8828075
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum boonei T469 NC 013926.1 8828511
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum boonei T469 NC 013926.1 8828305
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum boonei T469 NC 013926.1 8827762
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum boonei T469 NC_013926.1 8827370
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum sp. A4AR08-339 NC 019942.1 14306579
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum sp. MAR08-339 NC 019942.1 14306982
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum sp. MAR08-339 NC 019942.1 14306639
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aciduliprofundum sp. MAR08-339 NC019942.1 14307339
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Aeropyrum pemix KI NC 000854.2 1444491
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 NC 000917.1 1483287
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 NC_000917.1 1483233
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 NC_000917.1 1483554
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 NC_000917.1 1485513
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus profundus DSM 5631 NCJH3741.1 8738726
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus profundus DSM 5631 NC 013741.1 8740019
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC 021169.1 15392228
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC_021169.1 15393814
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC_021169.1 15391826
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC_021169.1 15393763
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC_021169.1 15393491
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus veneficus SNP6 NC_015320.1 10393142
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Archaeoglobus veneficus SNP6 NC 015320.1 10395048
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldisphaera lagunensis DSM 15908 NC_019791.1 14212403
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldisphaera lagunensis DSM 15908 NCO19791.1 14211524
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldisphaera lagunensis DSM 15908 NC__019791.1 14212092
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldisphaera lagunensis DSM 15908 NC_019791.1 14212561
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 5710116
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldivirga maquilingensis IC-167 NC_009954.1 5710117
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 5709088
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 5708891
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 5710478
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldivirga maquilingensis IC-167 NC009954.1 5710457
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 5709696
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Candidatus Caldiarchaeum NC 022786.1 17602865
subterraneum
шп>дегид:ферредоксиноксидоредуктаза Candidatus Korarchaeum cryptofilum NC 010482.1 6094361
OPF8
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Candidatus Korarchaeum cryptofilum NC 010482.1 6094198
OPF8
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Candidatus Korarchaeum cryptofilum NC 010482.1 6093546
OPF8
альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза Candidatus Korarchaeum cryptofilum NC010482.1 6093319
OPF8
- 8 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 NC_010482.1 6094057
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 ' ' NC_010482.1 6093563
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Chloroflexus aurantiacus J-10-fl NC_010175.1 5828639
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Clostridium acetobutylicum ATCC 824 NC_003030.1 1118201
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Clostridium botulinum А, штамм ATCC 3502 NC_009495.1 5187636
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Clostridium botulinum А, шт. Hall NC_009698.1 5400593
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfovibrio vulgaris, шт. Hildenborough NC_002937.3 2796664
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfovibrio vulgaris, шт. Hildenborough NC_002937.3 2795337
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfurococcus fermentans DSM 16532 NC-018001.1 13061477
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfurococcus fermentans DSM 16532 NC_018001.1 13061068
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfurococcus fermentans DSM 16532 NC_018001.1 13062247
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfurococcus kamchatkensis 1221η NC_011766.1 7171099
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfurococcus kamchatkensis 1221η NC_011766.1 7171759
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfurococcus kamchatkensis 1221η NC_011766.1 7170725
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Desulfurococcus mucosus DSM 2162 NCJ)14961.1 10152801
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ferroglobus placidus DSM 10642 NC__013849.1 8778536
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ferroglobus placidus DSM 10642 NC_013849.1 8779007
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ferroglobus placidus DSM 10642 NC_013849.1 8778940
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ferroglobus placidus DSM 10642 NC_013849.1 8779639
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ferroglobus placidus DSM 10642 NC_013849.1 8778820
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ferroglobus placidus DSM 10642 NC013849.1 8778745
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ferroglobus placidus DSM 10642 NC__013849.1 8779874
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Fervidicoccus fontis Kam940 NC_017461.1 12449263
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Fervidicoccus fontis Kam940 NC-017461.1 12449994
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Fervidicoccus fontis Kam940 NC-017461.1 12449294
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Fervidicoccus fontis Kam940 NC_017461.1 12449682
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Geobacter sulfurreducens PCA NC_002939.5 2685730
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Geobacter sulfurreducens PCA NC_002939.5 2687039
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halalkalicoccus jeotgali B3 NC-014297.1 9418623
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halalkalicoccus jeotgali B3 NC_P 14297.1 9418760
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halalkalicoccus jeotgali B3 NC_014297,1 9420819
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halalkalicoccus jeotgali B3 NC_014297.1 9418748
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloarcula hispanica ATCC 33960 NC_015948.1 11051410
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloarcula hispanica ATCC 33960 NCP15948.1 11050783
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloarcula hispanica ATCC 33960 NC_015948.1 11051433
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloarcula hispanica N601 NC_023013.1 23805333
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloarcula hispanica N601 NC-023013.1 23805138
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloarcula hispanica N601 NC_023013.1 23804665
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloarcula marismortui ATCC 43049 NC__006396.1 3127969
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloarcula marismortui ATCC 43049 NC_006396.1 3129232
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloferax mediterranei ATCC 33500 NCP17941.2 13028168
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloferax mediterranei ATCC 33500 NC_017941.2 13028399
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloferax volcanii DS2 NCP13964.1 8919329
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloferax volcanii DS2 NC_013964.1 8919033
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloferax volcanii DS2 NC_013967.1 8926544
- 9 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halogeometricum borinquense DSM 11551 NC_014735.1 9989054
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halogeometricum borinquense DSM 11551 NC_014729.1 9994424
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halogeometricum borinquense DSM 11551 NC_014729.1 9992444
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза галофильная архея DL31 NC__015954.1 11095016
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза галофильная архея DL31 NC__015954.1 11095541
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза галофильная архея DL31 NC_015954.1 11094595
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза галофильная архея DL31 NC__015954.1 11096497
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза галофильная архея DL31 NC_015954.1 11094563
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза галофильная архея DL31 NC__015954.1 11095602
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halopiger xanaduensis SH-б NC__015666.1 10799161
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halopiger xanaduensis SH-б NC_015658.1 10795465
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halopiger xanaduensis SH-6 NC_015666.1 10798686
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Halopiger xanaduensis SH-6 NC_015666.1 10796679
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 NC_012029.1 7400122
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 NC__012029.1 7400291
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 NC__012029.1 7400689
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC_013744.1 8744461
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC__013744.1 8744695
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC__013743.1 8740954
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC__013745.1 8745418
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC_013743.1 8742968
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NQ013743.1 8741246
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC__013743.1 8741269
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC_013745.1 8745313
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Hyperthermus butilicus DSM 5456 NC_008818.1 4781896
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Hyperthermus butilicus DSM 5456 NC_008818.1 4782266
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Hyperthermus butilicus DSM 5456 NC-008818.1 4782804
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Hyperthermus butilicus DSM 5456 NC_008818.1 4781774
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ignicoccus hospitalis ΚΙΝ4/Ί NC__009776.1 5562477
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ignicoccus hospitalis ΚΙΝ4/Ί NC009776.1 5562774
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Ignisphaera aggregans DSM 17230 NC__014471.1 9716798
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanocaldococcusjannaschii DSM 2661 NC_000909.1 1452083
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза Methanocella arvoryzae MRE50 NC__009464.1 5142690
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanocella arvoryzae MRE50 NC-009464.1 5143773
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanocella conradii HZ254 NC_017034.1 11972399
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanocella conradii HZ254 NC__017034.1 11971349
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза Methanocella paludicola SANAE NC__013665.1 8680711
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanocella paludicola SANAE NC013665.1 8680676
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanocorpusculum labreanum Z NC_008942.1 4795790
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanoculleus marisnigri JR1 NC_009051.1 4847673
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanohalobium evestigatum Z-7303 NC_014253.1 9347460
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanohalobium evestigatum Z-7303 NC-014253.1 9347022
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanolobus psychrophilus RI 5 NC-018876.1 13845119
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Methanomethylovorans hollandica DSM 15978 NC-019977.1 14408029
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Methanosaeta harundinacea 6Ac NC-017527.1 12511443
- 10 043734 альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид: ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза
Methanosaeta thermophila PT Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina barkeri, шт. Fusaro Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl
Methanosphaerula palustris El-9c Methano spirillum hungatei JF-1 Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema sp. J7-2
Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4
Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Pyrobaculum aerophilum, шт. IM2 Pyrobaculum aerophilum, шт. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, шт. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, шт. IM2 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514
NC_008553.1
NC_015676.1
NC__003552.1
NC_003552.1
NC_003552.1
NCJ)07355.1
NC_003901.1
NC-003901.1
NC003901.1
NC_020389.1
NC-020389.1
NC__020389.1
NC_011832.1
NC__007796.1
NC_016112.1
NC_007644.1
NC_007644.1
NC_007644.1
NC-013922.1
NC-013922.1
NC__013 923.1
NC__013922.1
NC_019962.1
NC_019962.1
NC__019962.1
NC-018224.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NC_019792.1
NCJH9974.1
NC019974.1
NCJH9974.1
NC__019974.1
NC-020388.1
NC-020388.1
NC_020388.1
NC__007427.1
NC-007426.1
NC__007426.1
NC__007426.1
NC__003364.1
NC-003364.1
NC_003364.1
NC-003364.1
NC-009376.1
NC-009376.1
NC_009376.1
4462364 10822365 1475882 1474856 1473602 3625763 1479263 1481668 1480987 14656065 14656771 14654304 7271108 3924565 11361147 3831332 3830998 3831866 8824961 8823392 8826737 8825516 14335278 14333050 14333754 13349954 14210296 14207133 14209682 14207576 14206941 14206532 14403316 14405255 14403781 14402014 14651997 14652892 14651999 3694680 3702508 3702507 3702509 1464236 1464102 1465126 1465445 5055904 5055700 5054881
- 11 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum arsenaticum DSM13514 NC_009376.1 5054644
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 NC 009376.1 5054547
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum calidifontis JCM11548 NC_009073.1 4910224
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 NC_009073.1 4908822
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 NC_009073.1 4909927
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 NC_009073.1 4910099
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum islandicum DSM 4184 NC 008701.1 4617364
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum islandicum DSM 4184 NC_008701.1 4616724
альдегид :ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum islandicum DSM 4184 NC 008701.1 4617494
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum neutrophilum V24Sta NC_010525.1 6165427
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum neutrophilum V24Sta NC_010525.1 6164958
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum neutrophilum V24Sta NC_010525.1 6164976
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum oguniense TE7 NC__016885.1 11853778
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum oguniense TE7 NC_016885.1 11854024
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum oguniense TE7 NC_016885.1 11856490
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum oguniense TE7 NC_016885.1 11856176
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum oguniense ΊΈ7 NC_016885.1 11854908
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum sp. 1860 NC_016645.1 11594868
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum sp. 1860 NC_016645.1 11596631
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrobaculum sp. 1860 NC_016645.1 11594049
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus abyssi GE5 NC_000868.1 1496313
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus abyssi GES NC_000868.1 1495669
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus abyssi GE5 NC_000868.1 1496580
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus abyssi GE5 NC_000868.1 1495287
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus furiosus GOMI NC_018092.1 13302148
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus furiosus GOMI NC_018092.1 13301806
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus furiosus COM1 NC_018092.1 13301219
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus furiosus GOMI NC_018092.1 13300785
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus furiosus DSM 3638 NC-003413.1 1468181
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus furiosus DSM 3638 NC_003413.1 1469073
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus fiiriosus DSM 3638 NC_003413.1 1469843
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus horikoshii OT3 NC_000961.1 1443218
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus horikoshii OT3 NC_000961.1 1443341
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus horikoshii OT3 NC000961.1 1443932
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus horikoshii OT3 NC_000961.1 1443598
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus sp. NA2 NC_015474.1 10555029
альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus sp. NA2 NC__015474.1 10554020
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus sp. NA2 NCJ)15474.1 10555341
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus sp. ST04 NC_017946.1 13022107
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus sp. ST04 NC_017946.1 13022436
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus sp. ST04 NC-017946.1 13021314
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus yayanosii CH1 NC_015680.1 10837518
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus yayanosii CH1 NC_015680.1 10837112
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrococcus yayanosii CH1 NC_015680.1 10837264
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrolobus fumarii 1A NC_015931.1 11138144
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrolobus fumarii 1A NCJ115931.1 11138776
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Pyrolobus fumarii 1A NC_pi5931.1 11139127
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 NC_007643.1 3833668
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Staphylothermus hellenicus DSM 12710 NC_014205.1 9234557
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Staphylothermus hellenicus DSM 12710 NC_014205.1 9233414
- 12 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Staphylothermus hellenicus DSM12710 NC 014205.1 9234134
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Staphylothermus hellenicus DSM 12710 NC 014205.1 9234110
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Staphylothermus marinus Fl NC 009033.1 4907444
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Staphylothermus marinus Fl NC_009033.1 4907343
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 NC 013522.1 8630284
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 NC_013522.1 8630027
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 NC_013522.1 8630623
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.Bl NC 015958.1 11082596
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus barophilus MP NC__014804.1 10041639
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus barophilus MP NC__014804.1 10041106
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus barophilus MP NC_014804.1 10042460
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus cleftensis NC_018015.1 13037745
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus cleftensis NC_018015.1 13038896
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus cleftensis NC_018015.1 13037242
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus gammatolerans EJ3 NC__012804.1 7988317
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза. Thermococcus gammatolerans EJ3 NC_012804.1 7987451
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus kodakarensis KOD1 NC-006624.1 3233851
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus kodakarensis KOD1 NC-006624.1 3233735
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus litoralis DSM 5473 NC_022084.1 16550741
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus litoralis DSM 5473 NC_022084.1 16548761
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus litoralis DSM 5473 NC-022084.1 16550885
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus onnurineus NAI NC__011529.1 7018383
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus onnurineus NAI NC__011529.1 7016739
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus onnurineus NAI NC011529.1 7017051
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus onnurineus NAI NC_011529.1 7017476
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sibiricus MM 739 NC_012883.1 8096638
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sibiricus MM 739 NC_012883.1 8096005
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sibiricus MM 739 NC_012883.1 8096629
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sibiricus MM 739 NC_012883.1 8095463
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sibiricus MM 739 NC__012883.1 8096131
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sibiricus MM 739 NC__012883.1 8096636
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sp. 4557 NQ015865.1 11015504
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sp. 4557 NC_015865.1 11015249
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sp. 4557 NC_015865.1 11015571
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sp. AM4 NC__016051.1 7419050
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sp. AM4 NC__016051.1 7418514
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermococcus sp. AM4 NC__016051.1 7420292
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 NC__011296.1 6941429
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 ' NC_011296.1 6943174
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 ' NC_011296.1 6941905
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Thermofilum pendens Hrk 5 NC_008698.1 4602054
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermofilum pendens Hrk 5 NC_008698.1 4601386
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermofilum pendens Hrk 5 NCJ)08698.1 4600878
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Thermofilum pendens Hrk 5 NC_008698.1 4600730
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermofilum sp. 1910b NC_022093.1 16572780
альдегвдферредоксиноксидоредуктаза Thermofilum sp. 1910b NC_022093.1 16572926
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermofilum sp. 1910b NC_022093.1 16573009
- 13 043734
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermofilum sp. 1910b NC_022093.1 16574342
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermogladius cellulolyticus 1633 NC_017954.1 13012904
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoplasma acidophilum DSM1728 NC__002578.1 1456355
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoplasma acidophilum DSM 1728 NC__002578.1 1456646
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoplasma volcanium GSS1 NC 002689.2 1441901
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoplasma volcanium GSS1 NC_002689.2 1441379
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoproteus tenax Kra 1 NC_016070.1 11262174
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoproteus tenax Kra 1 NC__016070.1 11262275
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoproteus tenax Kra 1 NC 016070.1 11262652
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoproteus tenax Kra 1 NC 016070.1 11262926
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoproteus uzoniensis 768-20 NC 015315.1 10361668
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoproteus uzoniensis 768-20 NC_015315.1 10361250
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermoproteus uzoniensis 768-20 NC_pi5315.1 10360972
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermosphaera aggregans DSM 11486 NC_014160.1 9165115
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermosphaera aggregans DSM 11486 NC 014160.1 9165462
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermus thermophilus HB8 NC 006461.1 3168554
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Thermus thermophilus HB8 NC 006461.1 3168612
альдегид:ферредоксиноксидоред}гктаза Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NC014537.1 9753145
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NC_014537.1 9750947
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NC 014537.1 9750989
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NC_014537.1 9753486
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NCJH4537.1 9751414
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC 015151.1 10288238
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC_pi5151.1 10288894
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC_015151.1 10288574
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC_015151.1 10288827
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC 015151.1 10288607
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC_015151.1 10288523
альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC 015151.1 10288815
AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СО-дегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Сшт Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые негативные продукты.
Этап 17 отражает преобразование 3-гидроксибутирилальдегида в 1,3-бутандиол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или
Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из
Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum. (NP 149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
- 14 043734
Этап 18 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутирилальдегид. Указанный этап может быть катализирован бутиральдегиддегидрогеназой (EC 1.2.1.57). Указанная бутиральдегиддегидрогеназа может представлять собой, например, Bld из Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 19 отражает преобразование 3-гадроксибутирил-КоА в 2-гидроксиизобутирил-КоА.
Указанный этап может быть катализирован 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазой (EC 5,4.99.-). Указанная 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутаза может представлять собой, например, HcmAB из Aquincola tertiaricarbonis (AFK77668.1, большая субъединица; AFK77665.1, малая субъединица) (последовательности SEQ ID NO: 81 и 82, соответственно) или HcmAB из Kyrpidia tusciae (WP_013074530.1, большая субъединица; WP_013074531.1, малая субъединица) (последовательности SEQ ID NO: 83 и 84, соответственно). Было описано улучшение активности HcmAB шапероном MeaB (AFK77667.1, Aquincola tertiaricarbonis; WP_013074529.1, Kyrpidia tusciae) (последовательности SEQ ID NO: 85 и 86, соответственно) путем реактивации HcmAB, хотя MeaB не является необходимым для функции HcmAB, (Yaneva, J Biol Chem, 287: 15502-15511, 2012). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 20 отражает преобразование 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2-гидроксиизобутират. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+ бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 21 отражает преобразование ацетил-КоА в сукцинил-КоА. Указанный этап охватывает ряд ферментативных реакций, вовлеченных в восстановительный ЦТК-путь, который естественным образом присутствует во многих бактериях, в том числе Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (и Escherichia coli) (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014; патент США № 9297026). Ферменты, вовлеченные в преобразование ацетил-КоА в сукцинил-КоА, могут включать пируват:ферредоксиноксидоредуктазу (PFOR) (EC 1.2.7.1), пируваткарбоксилазу (PYC) (EC 6.4.1.1), маликфермент/малатдегидрогеназу (EC 1.1.1.38, ЕС 1.1.1.40), пируватфосфатдикиназу (PPDK) (ЕС:2.7.9.1), РЕР-карбоксикиназу (PCK) (EC 4.1.1.49), фумаратгидратазу/фумаразу (EC 4.2.1.2), фумаратредуктазу (EC 1.3.5.1)/сукцинатдегидрогеназу (EC 1.3.5.4) и сукцинил-КоА-синтетазу (EC 6.2.1.5). Указанная пируват:ферредоксиноксидоредуктаза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY75153, AGY77232) или Escherichia coli (NP_415896). Пируваткарбоксилаза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY75817). Указанная малик-фермент/малатдегидрогеназа может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76687) или Escherichia coli (NP_416714, NP_417703). Указанная пируватфосфатдикиназа (PPDK) может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76274, AGY77114). Указанная РЕР-карбоксикиназа (PCK) может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76928) или Escherichia coli (NP_417862). Указанная фумаратгидратаза/фумараза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76121, AGY76122) или Escherichia coli (NP_416128, NP_416129, NP_418546). Указанная фумаратредуктаза/сукцинатдегидрогеназа может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY74573, AGY74575, AGY75257, AGY77166) или Escherichia coli (NP_415249, NP_415250, NP_415251, NP_415252, NP_418575, NP_418576, NP_418577, NP_418578). Указанная сукцинил-КоАсинтетаза может происходить, например, из Escherichia coli (NP_415256, NP_415257).
Этап 22 отражает преобразование ацетил-КоА и сукцинил-КоА в 3-оксоадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован Р-кетоадипил-КоА-тиолазой (EC 2.3.1.16). Указанная кетоизовалератоксидоредуктаза может представлять собой, например, PaaJ из Escherichia coli (WP_001206190.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 23 отражает преобразование 3-оксо-адипил-КоА в 3-гидроксиадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.1.1.157) или ацетоацетил-КоАгидратазой (EC 4.2.1.119). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегадрогеназа или ацетоацетил-КоАгидратаза может представлять собой, например,
Hbd из Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NPJ49314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl из Clostridium kluyveri (WP 011989027.1) (SEQ ID NO: 57) или PaaHl из Cupriavidus necator (WP 010814882.1).
Следует отметить, что PhaB является R-специфической и Hbd является S-специфической. Кроме то- 15 043734 го, Hbd1 из Clostridium kluyveri является НАДФЫ-зависимой, a Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и
Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 24 отражает преобразование 3-гидроксиадипил-КоА в 2,3-дегидроадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован эноил-КоА-гидратазой (ЕС: 4,2.1.17) или эноил-КоА-редуктазой (ЕС: 1,3.1.38). Указанная эноил-КоА-гидратаза или эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, CrtH3C. acetobutylicum (032472) (Seq. ID No. 52). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 25 отражает преобразование 2,3-дегидроадипил-КоА в адипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован транс-2-эноил-КоА-редуктазой (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Указанная транс-2-эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Bcd из С. acetobutylicum (NP_349317.1), которая образует комплекс с флавопротеинами электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr из Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr из Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter из Treponema denticola (NP_971211.1) или Ter из Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 26 отражает преобразование адипил-КоА в адипиновую кислоту. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 27 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в кротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кротонил-КоА-гидратазой (кротоназой) (EC 4.2.1.17) или кротонил-КоА-редуктазой (EC 1.3.1.38). Указанная кротонил-КоА-гидратаза (кротоназа) или кротонил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, клин' acetobutylicum (NP_349318.1) (SEQIDNO:52) или PhaJ из Aeromonas caviae (032472). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 28 отражает преобразование кротонил-КоА в кротонат. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 29 отражает преобразование кротоната в кротональдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СОдегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Curr Opin Bioteclmol 22: 320-325, 2011; Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Была продемонстрирована активность AOR Pyrococcus furiosus в отношении преобразования кротональдегида и кротоната (Loes, J Bacteriol, 187: 7056-7061, 2005). Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорга- 16 043734 низму продуцировать новые ненативные продукты.
Этап 30 отражает преобразование кротональдегида в 2-бутен-1-ол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID
NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или Clostridium ragsdalei, BdhB из
Clostridium acetobutylicum (NP 349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO:
71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium
Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из
Clostridium acetobutylicum (NP_149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ
ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназа или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 31 отражает преобразование кротонил-КоА в бутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован бутирил-КоА-дегидрогеназой или транс-2-эноил-КоА-редуктазой (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Указанная бутирил-КоА-дегидрогеназа или транс-2-эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Bcd из С. acetobutyiicum (NP_349317.1), которая образует комплекс с флавопротеинами электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr из Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr из Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter из Treponema denticola (NP_971211.1) или Ter из Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 32 отражает преобразование бутирил-КоА в ацетобутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован тиолазой или ацил-КоА-ацетилтрансферазой (EC 2.3.1.9). Указанная тиолаза может представлять собой, например,
ТЫА из Clostridium acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), ThlAl из Clostridium kluyveri (EDK35681), ТЫА2 из Clostridium kluyveri (EDK35682), ТЫАЗ из Clostridium, kluyveri (EDK35683), PhaA из Cupriavidus necator (WP 013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB из Cupriavidus necator (WPJH1615089.1) (SEQ ID NO: 3) или AtoB из Escherichia coli (NP 416728.1) (SEQ ID NO: 4).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 33 отражает преобразование ацетобутирил-КоА в ацетобутират. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 34 отражает преобразование ацетобутирата в ацетилацетон. Указанный этап может быть катализирован ацетоацетатдекарбоксилазой (EC 4.1.1.4). Указанная ацетоацетатдекарбоксилаза может представлять собой, например, Adc из Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). Указанный этап может также быть катализирован альфа-кетоизовалератдекарбоксилазой (EC 4.1.1.74). Указанная альфа-кетоизовалератдекарбоксилаза может представлять собой, например, KivD из Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Кроме того, Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. В редких случаях преобразование ацетоацетата в ацетон может происходить спонтанно. Однако спонтанное преобразование
- 17 043734 очень неэффективно; маловероятно, что оно может приводить к продуцированию выходных продуктов на желаемых уровнях.
Этап 35 отражает преобразование ацетилацетона в 3-метил-2-бутанол. Указанный этап может быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.2). Указанная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
SecAdh из
Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh из Clostridium Ijungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh из Clostridium ragsdalei (WP013239134.1) (SEQ ID NO: 18) или SecAdh из Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).
Указанный этап может также быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.80), такой как SecAdh из Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Однако Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Нокдаун или нокаут указанного фермента у Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei приводит к продуцированию и накоплению ацетилацетона, а не 3-метил-2-бутанола (WO 2015/085015).
Этап 36 отражает преобразование ацетобутирил-КоА в 3-гидроксигексаноил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидротеназой (EC 1.1.1.157) или ацетоацетил-КоАгидратазой (EC 4.2.1.119). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа или ацетоацетил-КоАгидратаза может представлять собой, например,
Hbd из Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NP 349314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl из Clostridium kluyveri (WP011989027.1) (SEQ ID NO: 57), Hbd2 из Clostridium kluyveri (EDK34807) или PaaHl из Cupriavidus necator (WP 010814882.1).
Следует отметить, что PhaB является R-специфической и Hbd является S-специфической. Кроме того, Hbd1 из Clostridium kluyveri является НАДФН-зависимой, a Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 37 отражает преобразование 3-гидроксигексаноил-КоА в 3-гидроксигексаноат. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+ бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 38 отражает преобразование 3-гидроксигексаноата в 1,3-гексальдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СОдегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Curr Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые ненативные продукты.
Этап 39 отражает преобразование 1,3-гексальдегида в 1,3-гександиол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
- 18 043734
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 40 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА. Указанный этап может быть катализирован гидроксиметилглутарил-КоА-синтазой (ГМГ-КоА-синтазой) (EC 2.3.3.10). ГМГ-КоА-синтазы распространены во многих родах и царствах жизни и включают, например, MvaS из Staphylococcus aureus (WP_053014863.1), ERG13 из Saccharomyces cerevisiae (NP_013580.1), HMGCS2 из Mus musculus (NP_032282.2) и многих других представителей группы ферментов ЕС 2.3.3.10. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 41 отражает преобразование 3-гидрокси-3-метилглютаноил-КоА в 3-метилглюконил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидратазой (EC 4.2.1.55). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, LiuC из Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). Указанный этап может также быть катализирован короткоцепочечной эноилКоА-гидратазой (EC 4.2.1.150) или эноил-КоА-гидратазой (EC 4.2.1.17). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 42 отражает преобразование 3-метилглюконил-КоА в 2-метилкротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован метилкротонил-КоА-декарбоксилазой (обладающей высоким структурным сходством с глютаконат-КоА-трансферазой (EC 2.8.3.12)), например, aibAB из Myxococcus xanthus (WP_011554267.1 и WP_011554268.1). Указанный этап может также быть катализирован метилкротоноил-КоА-карбоксилазой (EC 6,4.1.4), например, LiuDB из Pseudomonas aeruginosa (NP_250702.1 и NP_250704.1) или МССА и МССВ из Arabidopsis thaliana (NP_563674.1 и NP_567950.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 43 отражает преобразование метилкротонил-КоА в изовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован оксидоредуктазой, цинк-связывающей дегидрогеназой. Указанный оксидоредуктаза, цинк-связывающая дегидрогеназа может представлять собой, например, AibC из Myxococcus xanthus (WP_011554269.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 44 отражает преобразование изовалерил-КоА в изовалерат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9), и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетической тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацилКоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная
- 19 043734 тиоэстераза; SEQ ID NO: 12), и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.
Этап 45 отражает преобразование изовалерата в изовалеральдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза (AOR) может представлять собой, например, AOR из Clostridium. autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (последовательности SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно) или AOR из Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (последовательности SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно). Дополнительные примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые негативные продукты.
Этап 46 отражает преобразование изовалеральдегида в изоамиловый спирт. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,
Adh из Clostridium autoethanogenum (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или
Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP_023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Этап 47 отражает преобразование изовалерил-КоА в изовалеральдегид. Указанный этап может быть катализирован бутиральдегиддегидрогеназой (EC 1.2.1.57). Указанная бутиральдегиддегидрогеназа может представлять собой, например, Bld из Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei предположительно не обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.
Обзор Ptb-Buk
Согласно настоящему изобретению предложены новые пути, задействующие ферментную систему Ptb-Buk. В природе указанная ферментная система обнаруживается у ряда продуцирующих бутират микроорганизмов, такие как продуцирующие бутират Clostridia или Butyrivibrio. В частности, фосфатбутирилтрансфераза (Ptb) (EC 2.3.1.19) естественным образом катализирует реакцию бутаноила-КоА и фосфата с образованием КоА+бутаноилфосфата и бутираткиназы (Buk) (EC 2.7.2.7) естественным образом катализирует реакцию бутаноилфосфата и АДФ с образованием бутирата (бутаноата) и АТФ. Соответственно, указанные ферменты совместно (Ptb-Buk) естественным образом катализируют преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерируют одну молекулу АТФ посредством субстратного фосфорилирования (фиг. 2). Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной и
- 20 043734 способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, PtbBuk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ. Было описано, что Ptb активна в отношении диапазона ацил-КоА, в том числе ацетоацетил-КоА, in vitro (Thompson, Appl Environ Microbiol, 56: 607-613, 1990). Ранее не было показано, что ацетоацетил-фосфат может быть субстратом Buk. Хотя известно, что Buk воспринимает широкий диапазон субстратов (Liu, Appl Microbiol Biotechnol, 53: 545552, 2000), активность in vivo не была показана.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение экзогенной Ptb-Buk позволяет определенным микроорганизмам продуцировать подходящие продукты, в том числе ацетон, изопропанол, изобутилен, 3-гидроксибутират, 1,3-бутандиол и 2-гидроксиизобутират, а также другие продукты такие как пропионат, капроат и октонат.
Новые пути на основе Ptb-Buk обеспечивают ряд значимых преимуществ по сравнению с другими известными существующими маршрутами продуцирования продуктов, основанными на КоАтрансферазе - как в классическом клостридиалъном ферментативном пути ацетон-бутанол-этанол (ABE) или тиоэстеразе (Jones, Microbiol Rev, 50: 484-524, 1986; Matsumoto, Appl Microbiol Biotechnol, 97: 205210, 2013; May, Metabol Eng, 15: 218-225, 2013) (фиг. 3). В частности, указанные новые пути (1) не зависят от присутствия или продуцирования конкретных молекул, таких как органические кислоты, например, бутирата или ацетата, необходимых для КоА-трансферазной реакции, и (2) обеспечивают генерацию АТФ посредством субстратного фосфорилирования, не сохраняющуюся при тиоэстеразной или КоАтрансферазной реакции. Те же преимущества присутствуют при применении системы Ptb-Buk для других реакций, таких как преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. Соответственно, указанные новые пути отличаются потенциально значительно большими титрами продукции и скоростями за счет генерации дополнительной энергии и продуцирования целевых продуктов без ко-продукции нежелательных побочных продуктов, таких как ацетат.
Нежелательно, в частности, при промышленном масштабе, чтобы микроорганизмы продуцировали ацетат (или другие органические кислоты, необходимые для КоА-трансферазной реакции) в качестве побочного продукта, поскольку ацетат перенаправляет углерод от целевых продуктов и, соответственно, влияет на эффективность и выход целевых продуктов. Кроме того, ацетат может быть токсическим для микроорганизмов и/или может служить в качестве субстрата для роста загрязняющих микроорганизмов. Кроме того, присутствие ацетата усложняет выделение и разделение целевых продуктов и контроль за условиями ферментации, благоприятствующими получению целевых продуктов.
Генерация АТФ по механизму субстратного фосфорилирования может применяться в качестве движущей силы для синтеза продуктов, в частности, в ограниченных по АТФ системах. В частности, ацетогенные бактерии, как известно, живут на термодинамическом пределе существования (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014). Соответственно, продуцирование ацетата было описано у всех ацетогенных микроорганизмов, выделенных к настоящему времени (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, pages 354-420, New York, NY, Springer, 2006), поскольку продуцирование ацетата обеспечивает микроорганизму возможность прямо генерировать АТФ при субстратном фосфорилировании с помощью Pta (фосфотрансацетилазы) (EC 2.3.1.8) и Ack (ацетаткиназы) (EC 2.7.2.1). Несмотря на наличие механизмов сохранения АТФ в указанных микроорганизмах, такие как мембранные градиенты и электроразделительные ферменты, сопряженные с системами переноса ионов или протонов, например, Rnf-комплекс (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), прямая генерация АТФ остается критически важной для их выживания. В результате при введении гетерологичных путей, не позволяющих генерировать АТФ, происходит продуцирование ацетата в качестве побочного продукта (Schiel-Bengelsdorf, FEBS Lett, 586: 2191-2198, 2012). Однако пути Ptb-Buk, описанные в настоящем документе, обеспечивают альтернативный механизм генерации АТФ для микроорганизма по механизму субстратного фосфорилирования и, соответственно, позволяют избежать продуцирования ацетата. В частности, ацетат-образующие ферменты, такие как Pta-Ack, которые в ином случае имели бы существенное значение (Nagarajan, Microb Cell Factories, 12:118, 2013), могут быть заменены на Ptb-Buk в качестве альтернативного способа генерации АТФ. Поскольку после этого микроорганизм может генерировать АТФ за счет Ptb-Buk, указанная система предоставляет движущую силу, обеспечивающую максимальный поток через новые пути, задействующие Ptb-Buk. Генерация АТФ может также быть критически важным для нижерасположенных путей, требующих АТФ. Например, ферментативное продуцирование изобутилена из ацетона требует АТФ. Хотя полный путь от ацетил-КоА к изобутилену потребляет АТФ при использовании КоА-трансферазы или тиоэстеразы, при использовании Ptb-Buk указанный путь является энергетически нейтральным.
Приведены примеры источников Ptb и Buk. Однако следует понимать, что могут быть доступны другие подходящие источники Ptb и Buk. Кроме того, Ptb и Buk могут быть сконструированы для улучшения активности, и/или гены, кодирующие Ptb-Buk, могут быть кодон-оптимизированы для экспрессии, в частности, в микроорганизмах-хозяевах.
Фосфатбутирилтрансфераза может представлять собой любой источник или может происходить, например, из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:
- 21 043734
Описание Микроорганизм Номер доступа
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. EKQ52186
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 009167896
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium saccharoperbutylacetonicum WP_015390396
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium saccharobutylicum WP 022743598
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium beijerinckii WP 026886639
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium beijerinckii WP 041893500
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium butyricum WP_003410761
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. CDB14331
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium botulinum WP 049180512
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. CDB74819
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium paraputrificum WP 027098882
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 024615655
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium celatum WP 005211129
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium baratii WP 039312969
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium intestinale WP 021800215
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 042402499
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP_032117069
- 22 043734
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium perfringens ABG85761
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium botulinum WP_003374233
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium perfringens WP 004460499
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium perfringens WP 003454254
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium perfringens WP_041707926
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium perfringens BAB82054
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 008681116
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium chauvoei WP 021876993
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium colicanis WP 002598839
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium cadaveris WP_027637778
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium acetobutylicum WP__010966357
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium pasteurianum WP015617430
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium arbusti WP 010238988
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium pasteurianum WP 003445696
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium scatologenes WP 029160341
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 032120461
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium drakei WP 032078800
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP_021281241
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium argentinense WP 039635970
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium akagii WP 026883231
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 053242611
фосфатбутирилтрансфераза Clostridi um carb oxi div orans WP 007063154
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP„03 5292411
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sulfidigenes WP__035133394
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium tetanomorphum WP 035147564
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium hydrogeniformans WP 027633206
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 040212965
фосфатбутирилтрансфераза Candidatus Clostridium WP__040327613
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 040192242
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP__050606427
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium lundense WP 027625137
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium algidicarnis WP 029451333
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP035306567
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium acetobutylicum AAA75486
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium botulinum WP 025775938
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium botulinum WP 045541062
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium botulinum WP003357252
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium botulinum WP 030037192
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium bornimense WP 044039341
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium botulinum WP_041346554
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 053468896
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия порядка Clostridiales WP 034572261
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium tetani WP 023439553
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия порядка Clostridiales ERI95297
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium botulinum WPJ147403027
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium tetani WP_011100667
- 23 043734
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium tetani WP_035111554
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium senegalense WP_010295062
фосфатбутирилтрансфераза Caloramator sp. WP__027307587
фосфатбутирилтрансфераза Thermobrachium celere WP_018661036
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium cellulovorans WP_010073683
фосфатбутирилтрансфераза Coprococcus comes CDB84786
фосфатбутирилтрансфераза Coprococcus comes WP008371924
фосфатбутирилтрансфераза Eubacterium sp. CCZ03827
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. CCZ05442
фосфатбутирилтрансфераза Caloramator australicus WP008907395
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. CCY59505
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия семейства Lachnospiraceae WP_035626368
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия семейства Lachnospiraceae WP_027440767
фосфатбутирилтрансфераза Fervidicella metallireducens WP035381340
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. CCX89274
фосфатбутирилтрансфераза Eubacterium xylanophilum WP026834525
фосфатбутирилтрансфераза Roseburia sp. CDF44203
фосфатбутирилтрансфераза Butyrivibrio crossotus WP005600912
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия семейства Lachnospiraceae WP_027117626
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. CDA68345
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия семейства LJeptostreptococcaceae WP026899905
фосфатбутирилтрансфераза Butyrivibrio crossotus CCY77124
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. CDE44914
фосфатбутирилтрансфераза Coprococcus eutactus WP_004853197
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия Firmicutes CCY23248
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия семейства Lachnospiraceae WP027111007
фосфатбутирилтрансфераза Бактерия семейства Lachnospiraceae WP_016293387
фосфатбутирилтрансфераза Clostridium sp. WP 046822491
Согласно предпочтительному варианту реализации фосфатбутирилтрансфераза представляет собой Ptb из
Clostridium acetobutylicum (WP 010966357; SEQ ID NO: 87) или
Clostridium beijerinckii (WP026886639; SEQ ID NO: 88) (WP 041893500; SEQ ID NO: 89).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei естественным образом не содержат фосфатбутирилтрансферазу.
Указанная бутираткиназа может представлять собой любой источник или может происходить, например, из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:
Описание Микроорганизм Номер доступа
бутираткиназа Clostridium pasteurianum ALB48406
бутираткиназа Clostridium sp. CDB14330
бутираткиназа Clostridium sp. CDB74820
бутираткиназа Clostridium sp. EKQ52187
бутираткиназа Clostridium perfringens Q0SQK0
бутираткиназа Clostridium sp. WP002582660
-24043734
бутираткиназа Clostridium colicanis WP 002598838
бутираткиназа Clostridium botulinum WP003371719
бутираткиназа Clostridium perfringens WP__003454444
бутираткиназа Clostridium perfringens WP 004459180
бутираткиназа Clostridium celatum WP__005211128
бутираткиназа Clostridium sp. WP 008681112
бутираткиназа Clostridium sp. WP 008681114
бутираткиназа Clostridium sp. WP 009167897
бутираткиназа Clostridium perfringens WPjniO 10889
бутираткиназа Clostridium beijerinckii WP_011967556
бутираткиназа Clostridium botulinum WP__012422882
бутираткиназа Clostridium botulinum WP__012450845
бутираткиназа Clostridium saccharoperbutylacetonicum WP 015390397
бутираткиназа Clostridium beijerinckii WP_017209677
бутираткиназа Clostridium botulinum WP__017825911
бутираткиназа Clostridium chauvoei WP 021876994
бутираткиназа Clostridium saccharobutylicum WP 022743599
бутираткиназа Clostridium sp. WP 024615656
бутираткиназа Clostridium perfringens WP 025648345
бутираткиназа Clostridium beijerinckii WP026886638
бутираткиназа Clostridium paraputrificum WPJ127098883
бутираткиназа Clostridium sp. WP 032117070
бутираткиназа Clostridium botulinum WP 035786166
бутираткиназа Clostridium baratii WP-039312972
бутираткиназа Clostridium diolis WP03 9772701
бутираткиназа Clostridium botulinum WP_0410823 88
бутираткиназа Clostridium beijerinckii WP 041893502
бутираткиназа Clostridium sp. WP__042402497
бутираткиназа Clostridium baratii WP_045725505
бутираткиназа Clostridium perfringens WP 049039634
бутираткиназа Clostridium botulinum WP 049180514
бутираткиназа Clostridium botulinum WP 053341511
бутираткиназа Clostridium butyricum ABU40948
бутираткиназа Clostridium sp. CDE44915
бутираткиназа Clostridium senegalense WP_010295059
бутираткиназа Clostridium intestinale WP__021800216
бутираткиназа Eubacterium ventriosum WP 005363839
бутираткиназа Бактерия порядка Clostridiales WP 02165703 8
бутираткиназа Clostridium sp. WP 021281242
бутираткиназа Clostridium sporogenes WP 045520059
бутираткиназа Clostridium sp. WP 050606428
бутираткиназа Clostridium botulinum WP 012048334
бутираткиназа Clostridium botulinum WP-012343352
бутираткиназа Clostridium botulinum WP 003401518
бутираткиназа Clostridium argentinense WP 039635972
бутираткиназа Clostridium botulinum WP__003357547
- 25 043734
бутираткиназа Clostridium hydrogeniformans WP_027633205
бутираткиназа Clostridium botulinum WP 03 3066487
бутираткиназа Roseburia sp. CDF44202
бутираткиназа Бактерия семейства Lachnospiraceae WP027111008
бутираткиназа Clostridium sp. CDA68344
бутираткиназа Бактерия семейства Lachnospiraceae WP022782491
бутираткиназа Clostridium botulinum WP_012101111
бутираткиназа Clostridium carboxidivorans WP_007063155
бутираткиназа Clostridium botulinum WP 041346556
бутираткиназа Clostridium drakei WP_03 2078801
бутираткиназа Clostridium sp. WP__03 2120462
бутираткиназа Clostridium sp. WP 053468897
бутираткиназа Бактерия Firmicutes CCZ27888
бутираткиназа Clostridium sp. WP_03 53 06569
бутираткиназа Coprococcus comes CDB84787
бутираткиназа Clostridium sp. WP 035292410
бутираткиназа Clostridium sp. CCX89275
бутираткиназа Clostridium sp. WP040212963
бутираткиназа Clostridium pasteurianum WP 003445697
бутираткиназа Clostridium sp. WPJ153242610
бутираткиназа Бактерия семейства Lachnospiraceae WP_016299320
бутираткиназа Бактерия семейства Lachnospiraceae WP022785085
бутираткиназа Бактерия семейства Lachnospiraceae WP_016281561
бутираткиназа Eubacterium sp. CDA28786
бутираткиназа Clostridium scatologenes WP029160342
бутираткиназа Бактерия семейства Lachnospiraceae WP_016228168
бутираткиназа Clostridium pasteurianum WPJ) 15617429
бутираткиназа Clostridium algidicarnis WP029451332
бутираткиназа Бактерия семейства Lachnospiraceae WP_016293 388
бутираткиназа Clostridium sulfidigenes WP035133396
бутираткиназа Clostridium tetani WP__0 111 00666
бутираткиназа Clostridium tetanomorphum WP_03 5147567
бутираткиназа Subdoligranulum vanabile WP_007045828
бутираткиназа Eubacterium sp. CCZ03826
бутираткиназа Бактерия Firmicutes CDF07483
бутираткиназа Eubacterium sp. CDB13677
бутираткиназа Clostridium sp. WP 008400594
бутираткиназа Clostridium tetani WP_023439552
бутираткиназа Бактерия порядка Clostridiales WP022787536
бутираткиназа Бактерия семейства Lachnospiraceae WP027434709
бутираткиназа Бактерия Firmicutes CCY23249
бутираткиназа Clostridium acetobutylicum WP 010966356
Согласно предпочтительному варианту реализации указанная бутираткиназа представляет собой Buk из
Clostridium acetobutylicum (WP O10966356; SEQ ID NO: 90) или Clostridium beijerinckii (WP_011967556; SEQ ID NO: 91) (WP_017209677; SEQ ID NO: 92) (WP_026886638; SEQ ID NO: 93) (WP 041893502; SEQ ID NO: 94).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei естественным образом не содержат бутираткиназу.
Поскольку Ptb-Buk, как было показано, функционирует на широком диапазоне субстратов, разумно предположить, что в случае, когда Ptb-Buk не проявляет какой-либо активности в отношении требуемого субстрата, Ptb-Buk может быть сконструирована таким образом, чтобы добиться активности в отношении представляющего интерес субстрата. Может быть использована (однако без ограничений) стратегия рационального дизайна на основании доступных кристаллических структур Ptb и Buk, содержащих и не содержащих связанный субстрат, при этом связывающий карман может подвергаться изменениям для приведения в соответствие новому субстрату, или посредством насыщающего мутагенеза. После получе
- 26 043734 ния активности указанная активность может быть дополнительно усилена путем проведения многократных циклов ферментного конструирования. Указанные работы по конструированию могут быть скомбинированы с анализами для тестирования ферментной активности. Ранее была подтверждена эффективность указанных видов стратегий (см., например, Huang, Nature, 537: 320-327, 2016; Khoury, Trends Biotechnol, 32: 99-109, 2014; Packer, Nature Rev Genetics, 16: 379-394, 2015; Privett, PNAS USA, 109: 37903795, 2012).
Для улучшения субстратной специфичности Ptb-Buk в отношении специфического ацил-КоА субстрата может быть проведен скрининг вариантов Ptb-Buk из общедоступных баз данных или полученных мутантных Ptb-Buk (например, путем направленной эволюции) с применением высокопроизводительного анализа, а именно, избыточной экспрессии пары ферментов Ptb-Buk у E.coli, добавления экспериментального субстрата и скрининга на продуцирование АТФ с применением анализа биолюминесценции. В указанном анализе может быть использована устоявшаяся практика соотнесения концентрации АТФ с биолюминесценцией, обусловленной ферментом - люциферазой светлячков. Возможность проведения указанного анализа в формате многолуночного планшета облегчает эффективный скрининг на субстратную специфичность новых комбинаций Ptb-Buk (фиг. 33).
За счет проведения скрининга на продуцирование АТФ, а не на истощение субстрата или накопления продукта, указанный анализ позволяет избежать измерения спонтанного гидролиза КоА-группы. Однако альтернативный описанный в литературе подход заключается в использовании свободного КоА, который может быть измерен с помощью известного анализа с применением реактива Эллмана (5,5'дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) или DTNB) (Thompson, Appl Environ Microbiol, 56: 607-613, 1990.) для оценки эффективности сопряжения реакций Ptb-Buk (фиг. 33). Ацил-КоА и соответствующие им свободные кислоты и промежуточные фосфорсодержащие продукты могут также быть измерены в течение фазы валидации с применением ЖХ-МС/МС.
При применении способов высокопроизводительного скрининга кинетические данные собирать сложно ввиду трудоемкости количественного определения белков. Вместо этого для каждого состава лизата E.coli, содержащего ферменты Ptb-Buk, активность в отношении каждого представляющего интерес субстрата (измеряемая как люминесценция на единицу времени) может быть сравнена с активностью в отношении положительного контрольного субстрата (бутирил-КоА) и в отношении ацетил-КоА (физиологический субстрат, предположительно обеспечивающий максимальную конкуренцию для активных участков фермента, направленных против целевого ацил-КоА).
Для предотвращения смещения результатов анализа из-за активности нативной фосфотрансацетилазы (Pta) и/или ацетаткиназы (Ack) указанный анализ может также быть проведен на штамме E. coli с нокаутированными генами pta и/или ack.
Получение ацетона и изопропанола
Ацетон и изопропанол представляют собой имеющие важное значение промышленные растворители, совокупный объем рынка которых составляет 8 млн тонн, а стоимость мирового рынка составляет 8,5-11 млрд долларов. Кроме того, ацетон и изопропанол являются предшественниками ценных выходных продуктов, в том числе полиметилметакрилата (РММА), стоимость мирового рынка которого составляет 7 млрд долларов, изобутилена, стоимость мирового рынка которого составляет 25-29 млрд долларов, и пропилена, стоимость мирового рынка которого составляет 125 млрд долларов. Кроме того, недавно был описан маршрут для получения авиатоплива из ацетона. В настоящее время промышленное получение ацетона прямо связано с получением фенола нефтехимическим способом, поскольку он представляет собой побочный продукт процесса обработки кумола. Около 92% выхода ацетона по объему представляет собой сопутствующий продукт при получении фенола из кумола. Это связано с серьезными последствиями как для окружающей среды, так и для рынка. В процессе обработки кумола на каждый моль фенола приходится один моль образующегося сульфита натрия, что порождает серьезные проблемы, связанные с обработкой отходов, и создает угрозу для природной среды и здоровья человека. Ожидается, что мировой спрос на фенол ожидает стагнация или падение, тогда как спрос на ацетон, предположительно, будет возрастать. Разрабатываются и, согласно ожиданиям, скоро будут коммерциализированы альтернативные маршруты получения фенола путем прямого окисления бензена; это может привести к полной элиминации производства ацетона.
Ацетон получают в промышленных масштабах на протяжении почти 100 лет, в качестве побочного продукта бутанола в ходе ацетон-бутанол-спиртовой (ABE) ферментации. Хотя промышленная АВЕферментация сошла на нет во второй половине 20 века из-за низких цен на нефть и высокой стоимости сахара, недавно она была возобновлена, и на протяжении последних нескольких лет было построено несколько коммерческих заводов. Несколькими академическими группами было также продемонстрировано получение ацетона из сахара у гетерологичных хозяев, которые экспрессируют соответствующие ферменты АВЕ-ферментирующих организмов, в частности E.coli и дрожжей, путем метаболического конструирования и применения методов синтетической биологии. Однако незначительный выход и высокая стоимость, ассоциированные с предварительной обработкой, необходимой для высвобождения полисахаридного компонента биомассы, делает получение ацетона посредством стандартной ферментации экономически неоправданным, поскольку в современных технологиях биохимического преобразова- 27 043734 ния не используется лигниновый компонент биомассы, который может составлять до 40% от указанного материала.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать ацетон или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения ацетона или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования ацетона могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение ацетона путем осуществления этапов 1, 2 и 3: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2 и 3, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать ацетон или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2 и 3 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii или Clostridium ragsdalei), указанный микроорганизм может быть модифицирован для нокдауна или нокаута экспрессии первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы (например, путем разрушения гена, кодирующего указанную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу), таким образом, что указанный микроорганизм продуцирует ацетон без его преобразования в изопропанол (WO 2015/085015).
Получение ацетона путем осуществления этапов 1, 13, 14, 15 и 3: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий экзогенные ферменты для этапов 1, 13, 14, 15 и 3, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать ацетон или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 14 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 14, 15 и 3 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную: вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, или Clostridium ragsdalei), указанный микроорганизм может быть модифицирован для нокдауна или нокаута экспрессии первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы (например, путем разрушения гена, кодирующего указанную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу), таким образом, что указанный микроорганизм продуцирует ацетон без его преобразования в изопропанол (WO 2015/085015).
Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования ацетона.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать изопропанол или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения изопропанола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования изопропанола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение изопропанола путем осуществления этапов 1, 2, 3 и 4: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2, 3 и 4, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изопропанол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2, 3 и 4 описаны в различных разделах настоящей заявки. В том случае, когда микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium, ragsdalei), введение экзогенного фермента для этапа 4 не является необходимым для получения изопропанола. Однако модификация указанного микроорганизма, например, для сверхэкспрессии нативной первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы, может
- 28 043734 приводить к усиленному продуцированию изопропанола.
Получение изопропанола путем осуществления этапов 1, 13, 14, 15, 3 и 4: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 14, 15, 3 и 4, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изопропанол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 14 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 14, 15, 3 и 4 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei), введение экзогенного фермента для этапа 4 не является необходимым для продуцирования изопропанола. Однако модификация микроорганизма, например, для избыточной экспрессии нативной первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы может приводить к усиленному продуцированию изопропанола.
Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования изопропанола.
Получение изобутилена
Изобутилен относится к основным химическим строительным блокам с объемом рынка, превышающим 15 млн тонн, и стоимостью мирового рынка, составляющей 25-29 млрд долларов. Помимо применения в химии и в качестве топливной присадки (15 Мт/год), изобутилен может быть преобразован в изооктан, высокоэффективное альтернативное топливо для автомобилей с бензиновыми двигателями. Global Bioenergies были поданы патентные заявки, относящиеся к ферментативному продуцированию изобутена (т.е. изобутилена) из ацетона, однако ни в один из раскрытых маршрутов не входит Ptb-Buk (WO 2010/001078; EP 2295593; WO 2011/076691; van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012).
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать изобутилен или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения изобутилена или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования изобутилена могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
На фиг. 1 показаны два альтернативных маршрута продуцирования изобутилена. Первый включает получение изобутилена путем осуществления этапов 1, 2, 3, 5 и 6. Второй включает получение изобутилена путем осуществления этапов 1, 2, 3, 7, 8 и 6. Этапы 2 и 8 могут быть катализированы Ptb-Buk. Соответственно, каждый маршрут может включать Ptb-Buk.
Получение изобутилена путем осуществления этапов 1,2, 3, 5 и 6: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2, 3, 5 и 6, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изобутилен или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2, 3, 5 и 6 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei), указанный микроорганизм может быть модифицирован для нокдауна или нокаута экспрессии первичной: вторичной алкогольдегидрогеназы (например, путем разрушения гена, кодирующего указанную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу), для предотвращения преобразования ацетона в изопропанол и максимизации преобразования ацетона в изобутилен.
Получение изобутилена путем осуществления этапов 1, 2, 3, 7, 8 и 6: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2, 3, 7, 8 и 6, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изобутилен или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 и/или этап 8 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2, 3, 7, 8 и 6 описаны в различных разделах настоящей заявки. В тех случаях, когда указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, который естественным образом содержит первичную: вторичную алкогольдегидрогеназу, способную к преобразованию ацетона в изопропанол (этап 4) (например, Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, или Clostridium ragsdalei),
- 29 043734 указанный микроорганизм может быть модифицирован для нокдауна или нокаута экспрессии первичной:
вторичной алкогольдегидрогеназы (например, путем разрушения гена, кодирующего указанную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу) для предотвращения преобразования ацетона в изопропанол и максимизации преобразования ацетона в изобутилен.
Получение 3-гидроксибутирата
3-Гидроксибутират (3-ГБ) представляет собой четырехуглеродную карбоновую кислоту из семейства бета-гидроксикислот. 3-Гидроксибутират представляет собой косметический ингредиент для очищения кожи жирного типа, промежуточный продукт при приготовлении антивозрастных кремов, промежуточный продукт при получении полигидроксибутирата (РНВ), биоразлагаемой полимерной смолы и комономер для других полигидроксикислот при получении новых биопластиков. Кроме того, частные варианты применения 3-гидроксибутирата включают применение в составе биосовместимых и биоразлагаемых нанокомпозитов, в частности, медицинских имплантатов, применение в качестве промежуточного продукта химических С3/С4-продуктов, хиральных строительных блоков и продуктов тонкой химии. Несмотря на продуцирование (R)- и (S)-3-гидроксибутuрата рекомбинантной E. coli, растущей на глюкозе, продуцирование 3-гидроксибутирата микроорганизмами, растущими на газообразных субстратах, продемонстрировано не было (Tseng, Appl Environ Microbiol, 75: 3137-3145, 2009). Отметим, что указанная система, ранее продемонстрированная на E.coli, не могла быть прямо перенесена на ацетогены, в том числе С. autoethanogenum, ввиду присутствия в ацетогенах нативной тиоэстеразы. Хотя E.coli также содержит тиоэстеразу TesB, которая может действовать на 3-ГБ-КоА, Tseng показал, что фоновая активность минимальна (<0,1 г/л). При том, что сообщалось о продуцировании чистых стереоизомеров Е. coli, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что С. autoethanogenum продуцировал смесь изомеров. Без связи с конкретной теорией, это предположительно является результатом активности нативной изомеразы. Это позволяет сочетать комбинацию ^-специфической 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназы (Hbd) с ^-специфической Ptb-Buk для оптимизированного продуцирования. Для получения чистых стереоизомеров указанная активность может быть нокаутирована. В совокупности, настоящее изобретение обеспечивает получение нескольких г/л 3-ГБ, в отличие от низких уровней продукции в E.coli, с применением Ptb-Buk в любой комбинации с (R)- или ^-специфической 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой, и нативной тиоэстеразы Clostridium autoethanogenum.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 3гидроксибутират или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 3-гидроксибутирата или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 3-гидроксибутирата могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
На фиг. 1 показаны два альтернативных маршрута продуцирования 3-гидроксибутирата. Первый предусматривает продуцирование 3-гидроксибутирата путем осуществления этапов 1, 2 и 15. Второй предусматривает продуцирование 3-гидроксибутирата путем осуществления этапов 1, 13 и 14. Этапы 2 и 14 могут быть катализированы Ptb-Buk. Соответственно, каждый маршрут может задействовать Ptb-Buk. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования 3-гидроксибутирата, при этом Ptb-Buk может катализировать более чем один этап (например, этапы 2 и 14).
Получение 3-гидроксибутирата путем осуществления этапов 1, 2 и 15: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2 и 15, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 3-гидроксибутират или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2 и 15 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 3-гидроксибутирата путем осуществления этапов 1, 13 и 14: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13 и 14, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 3-гидроксибутират или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 14 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13 и 14 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 1,3-бутандиола
1,3-Бутандиол (1,3-BDO) часто применяют в качестве растворителя для пищевых вкусоароматических агентов; он представляет собой комономер для применения в некоторых полиуретановых и полиэфирных смолах. Что еще более важно, 1,3-бутандиол может быть каталитически преобразован в 1,3-
- 30 043734 бутадиен (Makshina, Chem Soc Rev, 43:7917-7953,2014). Бутадиен применяют для получения резины, пластиков, смазывающих веществ, латекса и других продуктов. Хотя большая часть получаемого в настоящее время бутадиена используется для изготовления резины для автомобильных шин, он может также быть использован для получения адипонитрила, который может применяться при изготовлении нейлона 6,6. Мировой спрос на бутадиен в настоящее время растет. В 2011 г. подсчитанный спрос составил 10,5 млн тонн, оцениваемых в 40 млрд долларов.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 1,3бутандиол или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 1,3-бутандиола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 1,3-бутандиола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм может продуцировать 1,3бутандиол без ко-продукции этанола (или продуцируя только незначительное количество этанола, например, менее чем 0,1-1,0 г/л этанола или менее чем 1-10 г/л этанола).
На фиг. 1 показаны три альтернативных маршрута продуцирования 1,3-бутандиола. Первый предусматривает продуцирование 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 2, 15, 16 и 17. Второй предусматривает продуцирование 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 13, 14, 16 и 17. Третий предусматривает продуцирование 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 13, 18 и 17. Этапы 2 и 14 могут быть катализированы Ptb-Buk. Соответственно, по меньшей мере первый и второй маршруты могут задействовать Ptb-Buk. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования 1,3-бутандиола. Согласно родственному варианту реализации Ptb-Buk может катализировать более чем один этап (например, этапы 2 и 14).
Получение 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 2, 15, 16 и 17: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 2, 15, 16 и 17, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 1,3-бутандиол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 2 катализирует Ptb-Buk.
Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 2, 15, 16 и 17 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 13, 14, 16 и 17: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 14, 16 и 17, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 1,3-бутандиол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 14 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 14, 16 и 17 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 1,3-бутандиола путем осуществления этапов 1, 13, 18 и 17: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 18 и 17, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 1,3-бутандиол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат (фиг. 11). Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 18 и 17 описаны в различных разделах настоящей заявки. Наличие аналогичного маршрута было продемонстрировано у E. coli, однако не в ацетогенах, таких как Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (Kataoka, J Biosci Bioeng, 115: 475480, 2013). Хотя применение Ptb-Buk приводит к продуцированию (R)-1,3-бутандиола, указанный маршрут, не требующий применения Ptb-Buk, может приводить к продуцированию (S)-1,3-бутандиола.
Получение 2-гидроксиизобутирата
2-Гидроксиизобутират (2-ГИБ) представляет собой четырехуглеродную карбоновую кислоту, которая может служить в качестве строительных блоков для многих типов полимеров. Сложный метиловый эфир метакриловой кислоты, который может быть синтезирован путем обезвоживания 2гидроксиизобутирата или применения соответствующего амида, полимеризуют с образованием полиметилметакрилата (РММА) для получения акрилового стекла, прочных покрытий и чернил. Объем мирового рынка одного только указанного соединения превышает 3 млн тонн. Другие разветвленные карбоновые С4-кислоты, например, хлоро- и аминопроизводные 2-гидроксиизобутирата, а также изобутиленгликоль и его оксид, также используют в полимерах и для многих других применений.
Стереоспецифичность системы Ptb-Buk, в частности, подходит для преодоления ограничений существующего уровня техники в отношении получения 2-гидроксиизобутирата. И Ptb-Buk, и тиоэстеразы
- 31 043734 являются неизбирательными, таким образом, побочная активность с 3-гидроксибутирил-КоА может отвлекать ресурсы из целевых путей продуцирования 2-гидроксиизобутирил-КоА (см., например, фиг. 1 и 8). Однако Ptb-Buk способна различать стереоизомеры и действует на (R)-3-гидроксибутирил-КоА, но не на (S)-3-гидроксибутирил-КоА. Напротив, тиоэстеразы неспособны различать стереоизомеры 3гидроксибутирил-КоА. Согласно предпочтительному варианту реализации выбирают ^-специфическую ацетоацетил-КоА-гидратазу (EC 4.2.1.119) (этап 13) в комбинации с Ptb-Buk (этап 20), чтобы избежать потерь с образованием 3-гидроксибутирата и максимизировать выход 2-гидроксиизобутирата (фиг. 8). Указанная ^-специфическая форма 3-гидроксибутирил-КоА также представляет собой предпочтительный субстрат 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазы (EC 5.4.99.) (этап 19) (Yaneva, J Biol Chem, 287: 1550215511, 2012).
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 2гидроксиизобутират или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 2-гидроксиизобутирата или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 2-гидроксиизобутирата могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение 2-гидроксиизобутирата путем осуществления этапов 1, 13, 19 и 20: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 19 и 20, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 2-гидроксиизобутират или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 20 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 19 и 20 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен также микроорганизм, способный продуцировать 2-гидроксибутират (2-ГБ) или его предшественники из субстрата. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 2-гидроксибутирата или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Без связи с конкретной теорией, авторы настоящего изобретения считают, что наблюдаемое продуцирование 2гидроксибутирата обусловлено неспецифической мутазной активностью у таких микроорганизмов, как Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei.
Получение адипиновой кислоты
Адипиновая кислота представляет собой наиболее важную дикарбоновую кислоту, рынок которой оценивается более чем в 4,5 млрд долларов США при ежегодном уровне производства, составляющем приблизительно 2,5 млрд кг. Более 60% полученной адипиновой кислоты используют в качестве мономерного предшественника для получения нейлона; стоимость мирового рынка адипиновой кислоты предположительно достигнет 7,5 млрд долларов США к 2019 г. В настоящее время практически всю адипиновую кислоту получают петрохимически, например, путем карбонилирования бутадиена.
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать адипиновую кислоту или ее предшественники из субстрата (фиг. 34). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения адипиновой кислоты или ее предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования адипиновой кислоты могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение адипиновой кислоты путем осуществления этапов 22, 23, 24, 25 и 26: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 22, 23, 24, 25 и 26, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать адипиновую кислоту или ее предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 26 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 22, 23, 24, 25 и 26 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение адипиновой кислоты путем осуществления этапов 21, 22, 23, 24, 25 и 26: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 21, 22, 23, 24, 25 и 26, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать адипиновую кислоту или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганиз- 32 043734 ма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 26 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 21, 22, 23, 24, 25 и 26 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования адипиновой кислоты.
Получение 1,3-гександиола
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 1,3гександиол или его предшественники из субстрата (фиг. 35). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 1,3-гександиола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 1,3-гександиола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Пути, представленные на фиг. 35, начинаются с 3-гидроксибутирил-КоА, который может быть получен путем осуществления этапов 1 и 13, как показано на фиг. 1.
Получение 1,3-гександиола путем осуществления этапов 1, 13, 27, 31, 32, 36, 37, 38 и 39: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 27, 31, 32, 36, 37, 38 и 39, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 1,3-гександиол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 37 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 27, 31, 32, 36, 37, 38 и 39 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 3-метил-2-бутанола
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 3-метил2-бутанол или его предшественники из субстрата (фиг. 35). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 3-метил-2-бутанола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 3-метил-2-бутанола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Пути, представленные на фиг. 35, начинаются с 3-гидроксибутирил-КоА, который может быть получен путем осуществления этапов 1 и 13, как показано на фиг. 1.
Получение 3-метил-2-бутанола путем осуществления этапов 1, 13, 27, 31, 32, 33, 34 и 35: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 27, 31, 32, 33, 34 и 35, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 3-метил-2-бутанол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 33 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 27, 31, 32, 33, 34 и 35 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение 2-бутен-1-ола
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать 2-бутен1-ол или его предшественники из субстрата (фиг. 35). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 2-бутен-1-ола или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования 2-бутен-1-ола могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Пути, представленные на фиг. 35, начинаются с 3-гидроксибутирил-КоА, который может быть получен путем осуществления этапов 1 и 13, как показано на фиг. 1.
Получение 2-бутен-1-ола путем осуществления этапов 1, 13, 27, 28, 29 и 30: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 13, 27, 28, 29 и 30, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать 2-бутен-1-ол или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочти- 33 043734 тельному варианту реализации этап 28 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 13, 27, 28, 29 и 30 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение изовалерата
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать изовалерат или его предшественники из субстрата (фиг. 36). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения изовалерата или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования изовалерата могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение изовалерата путем осуществления этапов 1, 40, 41, 42, 43 и 44: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 40, 41, 42, 43 и 44, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изовалерат или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 44 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 40, 41, 42, 43 и 44 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение изоамилового спирта
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, способный продуцировать изоамиловый спирт или его предшественники из субстрата (фиг. 36). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения изоамилового спирта или его предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии субстрата. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный микроорганизм происходит из исходного микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Однако указанный микроорганизм может также происходить из совершенно другого микроорганизма, например, Escherichia coli. Описанные ферментативные пути продуцирования изоамилового спирта могут включать эндогенные ферменты и, при отсутствующей или низкой активности эндогенных ферментов, экзогенные ферменты.
Получение изоамилового спирта путем осуществления этапов 1, 40, 41, 42, 43, 44, 45 и 46: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов I, 40, 41, 42, 43, 44, 45 и 46, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изоамиловый спирт или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Согласно предпочтительному варианту реализации этап 44 катализирует Ptb-Buk. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 40, 41, 42, 43, 44, 45 и 46 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Получение изоамилового спирта путем осуществления этапов 1, 40, 41, 42, 43, 47 и 46: согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий ферменты для этапов 1, 40, 41, 42, 43, 47 и 46, за счет чего указанный микроорганизм способен продуцировать изоамиловый спирт или его предшественники из субстрата, такого как газообразный субстрат. Обычно по меньшей мере один из ферментов в указанном пути является экзогенным для указанного микроорганизма. Примеры типов и источников ферментов для этапов 1, 40, 41, 42, 43, 47 и 46 описаны в различных разделах настоящей заявки.
Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм может содержать более чем один путь продуцирования изоамилового спирта.
Получение дополнительных продуктов
Согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, содержащий экзогенную Ptb-Buk и экзогенную или эндогенную альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу (AOR). Такой микроорганизм может продуцировать, например, 1-пропанол, 1-бутанол, 1-гексанол и 1-октанол или их предшественники из ацетил-КоА, генерированного, например, из газообразного субстрата (фиг. 32). Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения 1-пропанола, 1-бутанола, 1-гексанола и 1-октанола или их предшественников путем культивирования такого микроорганизма в присутствии газообразного субстрата. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei естественным образом содержат AOR. Однако AOR может быть избыточно экспрессирован в таких микроорганизмах в комбинации с экспрессией экзогенной Ptb-Buk. Как вариант, экзогенная AOR и экзогенная Ptb-Buk могут быть экспрессированы в микроорганизме, отличном от Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei, таком как Escherichia coli.
Получение предшественников и промежуточных продуктов
Пути, представленные на фиг. 1, 34, 35 и 36, могут быть модифицированы для получения предшественников или промежуточных продуктов вышеупомянутых продуктов. В частности, части любых фер- 34 043734 ментативных путей, описанных в настоящем документе, могут быть введены в микроорганизм-хозяина для продуцирования предшественников или промежуточных продуктов.
Определения и уровень техники
Термин генетическая модификация или генетическое конструирование в широком смысле относится к манипуляциям с геномом или нуклеиновыми кислотами микроорганизма. Аналогичным образом, термин генетически сконструированный относится к микроорганизму, содержащего подвергшиеся манипуляциям геном или нуклеиновые кислоты. Способы генетической модификации включают, например, гетерологичную генную экспрессию, инсерции или делеции генов или промоторов, мутации нуклеиновых кислот, измененную генную экспрессию или инактивацию генов, конструирование ферментов, направленную эволюцию, интеллектуальный дизайн, способы случайного мутагенеза, перестановку генов и кодон-оптимизацию.
Рекомбинантный указывает на то, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм представляет собой продукт генетической модификации, конструирования или рекомбинации. В общем случае, термин рекомбинантный относится к нуклеиновой кислоте, белку или микроорганизму, который содержит генетический материал или кодируемый генетическим материалом, происходящим из нескольких источников, таких как два или более разных штаммов или видов микроорганизмов. В настоящем документе термин рекомбинантный могут также применяться для описания микроорганизма, который содержит мутированную нуклеиновую кислоту или белок, в том числе мутированную форму эндогенной нуклеиновой кислоты или белка.
Эндогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, которая или который присутствует или экспрессируется в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Например, эндогенный ген представляет собой ген, естественным образом присутствующий в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации экспрессию эндогенного гена может контролировать экзогенный регуляторный элемент, такой как экзогенный промотор.
Экзогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, которая или который не присутствует в микроорганизме дикого типа или исходном микроорганизме, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации экзогенный ген или фермент может происходить из гетерологичного (т.е. другого) штамма или вида, и быть введен в микроорганизм или экспрессирован в микроорганизме согласно настоящему изобретению. Согласно другому варианту реализации экзогенный ген или фермент может быть получен искусственным или рекомбинантным способом, и введен в микроорганизм или экспрессирован в микроорганизме согласно настоящему изобретению. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут быть адаптированы для интеграции в геном микроорганизма согласно настоящему изобретению или для сохранения в экстрахромосомном состоянии в микроорганизме согласно настоящему изобретению, например, в плазмиде.
Ферментная активность или просто активность относится к ферментативной активности в широком смысле, в том числе, однако не ограничиваясь перечисленным, активности фермента, количеству фермента или доступности фермента для катализа реакции. Соответственно, увеличенная ферментная активность включает увеличение активности фермента, увеличение количества фермента или увеличение доступности фермента для катализа реакции. Аналогичным образом, уменьшенная ферментная активность включает уменьшение активности фермента, уменьшение количества фермента или уменьшение доступности фермента для катализа реакции.
В отношении ферментной активности субстрат представляет собой молекулу, на которую действует фермент, а продукт представляет собой молекулу, продуцируемую под действием фермента. Нативный субстрат, соответственно, представляет собой молекулу, на которую действует фермент естественным образом в микроорганизме дикого типа, а нативный продукт представляет собой молекулу, естественным образом продуцируемую под действием фермента в указанном микроорганизме дикого типа. Например, бутаноил-КоА представляет собой нативный субстрат Ptb, а бутаноилфосфат представляет собой нативный субстрат Buk. Кроме того, бутаноилфосфат представляет собой нативный продукт Ptb, а бутират (бутаноат) представляет собой нативный продукт Buk. Аналогичным образом, ненативный субстрат представляет собой молекулу, на которую фермент не действует естественным образом в микроорганизме дикого типа, а ненативный продукт представляет собой молекулу, не продуцируемую естественным образом под действием фермента в указанном микроорганизме дикого типа. Фермент, который способен действовать на несколько разных субстратов, нативный или ненативный, как правило, называют неизбирательным ферментом. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной и способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, Ptb-Buk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ. Соответственно, согласно предпочтительным вариантам реализации Ptb-Buk согласно настоящему изобретению действует на ненативные субстраты (т.е. субстраты, отличные от бутаноил-КоА и/или бутаноилфосфата), обеспечивая получение ненативных продуктов (т.е. продуктов, отличных от бутаноилфосфата и/или бутирата
- 35 043734 (бутаноата)).
Термин бутирил-КоА в настоящем документе может применяться взаимозаменяемо с термином бутаноил-КоА.
Термин энергогенерирующий или т.п. может применяться взаимозаменяемо в настоящем документе с термином сохраняющий энергию или т.п. Оба указанных термина часто используются в опубликованных источниках.
Мутированный относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые были модифицированы в микроорганизме согласно настоящему изобретению по сравнению с микроорганизмом дикого типа или исходным микроорганизмом, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации указанная мутация может представлять собой делецию, инсерцию или замену в гене, кодирующем фермент. Согласно другому варианту реализации указанная мутация может представлять собой делецию, инсерцию или замену одной или более аминокислот в ферменте.
В частности, разрушающая мутация представляет собой мутацию, которая уменьшает или элиминирует (т.е. разрушает) экспрессию или активность гена или фермента. Разрушающая мутация может частично инактивировать, полностью инактивировать или удалять указанный ген или фермент. Разрушающая мутация может представлять собой нокаутную (КО) мутацию. Разрушающая мутация может представлять собой любую мутацию, которая уменьшает, предотвращает или блокируют биосинтез продукта, продуцируемого ферментом. Разрушающая мутация может включать, например, мутацию в гене, кодирующем фермент, мутацию в генетическом регуляторном элементе, вовлеченном в экспрессию гена, кодирующего фермент, введение нуклеиновой кислоты, которая продуцирует белок, уменьшающий или ингибирующий активность фермента, или введение нуклеиновой кислоты (например, антисмысловой РНК, миРНК, CRJSPR) или белка, который ингибирует экспрессию фермента. Разрушающая мутация может быть введена с применением любого способа, известного в данной области техники.
Введение разрушающей мутации приводит к получению микроорганизма согласно настоящему изобретению, который не продуцирует целевого продукта, по существу не продуцирует целевого продукта или продуцирует пониженное количество целевого продукта по сравнению с исходным микроорганизмом, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может не продуцировать целевого продукта или продуцирует по меньшей мере приблизительно на 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% меньше целевого продукта, чем исходный микроорганизм. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может продуцировать менее чем приблизительно 0,001; 0,01; 0,10; 0,30; 0,50 или 1,0 г/л целевого продукта.
Кодон-оптимизация относится к мутации нуклеиновой кислоты, такой как ген, для оптимизированной или улучшенной трансляции указанной нуклеиновой кислоты у конкретного штамма или вида. Кодон-оптимизация может приводить к более высоким скоростям трансляции или большей точности трансляции. Согласно предпочтительному варианту реализации гены согласно настоящему изобретению кодон-оптимизированы для экспрессии у Clostridium, в частности, у Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно дополнительному предпочтительному варианту реализации гены согласно настоящему изобретению кодон-оптимизированы для экспрессии у Clostridium autoethanogenum LZ1561, внесенного в DSMZ под номером доступа DSM23693.
Избыточно экспрессируемый относится к увеличению экспрессии нуклеиновой кислоты или белка в микроорганизме согласно настоящему изобретению по сравнению с микроорганизмом дикого типа или исходным микроорганизмом, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению. Избыточная экспрессия может быть достигнута с применением любых способов, известных в данной области техники, в том числе модификации числа копий гена, скорости генной транскрипции, скорости генной трансляции или скорости ферментного разложения.
Термин варианты включает нуклеиновые кислоты и белки, последовательность которых варьирует относительно последовательности референсной нуклеиновой кислоты и референсного белка, например, последовательности референсной нуклеиновой кислоты и референсного белка, известной из уровня техники или описанной на примерах в настоящем документе. Практическая реализация настоящего изобретения может быть осуществлена с применением вариантов нуклеиновых кислот или белков, которые выполняют по существу ту же функцию, что и референсная нуклеиновая кислота или референсный белок. Например, вариант белка может выполнять по существу ту же функцию или катализируют по существу ту же реакцию, что и референсный белок. Вариант гена может кодировать тот же или по существу тот же белок, что и референсный ген. Вариант промотора может обладать по существу такой же способностью в отношении способствования экспрессии одного или более генов, что и референсный промотор.
Такие нуклеиновые кислоты или белки могут называться в настоящем документе функционально эквивалентными вариантами. Например, функционально эквивалентные варианты нуклеиновой кислоты могут включать аллельные варианты, фрагменты гена, мутированные гены, полиморфизмы и т.п. Гомологичные гены из других микроорганизмов также представляют собой примеры функционально эквивалентных вариантов. Они включают гомологичные гены таких видов, как Clostridium acetobutylicum, Clos- 36 043734 tridium, beijerinckii или Clostridium ljungdahlii, подробную информацию о которых можно найти в открытом доступе на таких Интернет-сайтах, как сайты Genbank или NCBI. Функционально эквивалентные варианты также включают нуклеиновые кислоты, последовательность которых варьирует в результате кодон-оптимизации для конкретного микроорганизма. Функционально эквивалентный вариант нуклеиновой кислоты предпочтительно отличается по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или большей идентичностью последовательности нуклеиновых кислот (процент гомологии) последовательности референсной нуклеиновой кислоты. Функционально эквивалентный вариант белка предпочтительно отличается по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или более идентичностью аминокислот (процент гомологии) последовательности референсного белка. Функциональная эквивалентность варианта нуклеиновой кислоты или белка может быть оценена с применением любого способа, известного в данной области техники.
Нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в микроорганизм согласно настоящему изобретению с применением любого способа, известного в данной области техники. Например, нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в виде депротеинизированных нуклеиновых кислот или в составе с одним или более агентами, например, в виде липосом. Указанные нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК, РНК, кДНК или их комбинации, согласно необходимости. Согласно определенным вариантам реализации могут применяться ингибиторы рестрикции. Дополнительные векторы могут включать плазмиды, вирусы, бактериофаги, космиды и искусственные хромосомы. Согласно предпочтительному варианту реализации нуклеиновые кислоты доставляют в микроорганизм согласно настоящему изобретению с применением плазмиды. Например, трансформация (в том числе трансдукция или трансфекция) может быть достигнута путем электропорации, обработки ультразвуком, полиэтиленгликоль-опосредованной трансформации, химической или природной компетентности, трансформации протопластов, индукции профага или конъюгации. Согласно определенным вариантам реализации, предусматривающим системы активных рестрикционных ферментов, может быть необходимо метилирование нуклеиновой кислоты до введения указанной нуклеиновой кислоты в микроорганизм.
Кроме того, могут быть разработаны нуклеиновые кислоты, содержащие регуляторный элемент, такой как промотор, для увеличения или контроля экспрессии конкретной нуклеиновой кислоты иным образом. Указанный промотор может представлять собой конститутивный промотор или индуцируемый промотор. В идеале, указанный промотор представляет собой промотор пути Вуда-Льюнгдаля, промотор ферредоксина, промотор пируват:ферредоксиноксидоредуктазы, промотор оперона Rnf-комплекса, промотор оперона АТФ-синтазы или промотор оперона фосфотрансацетилазы/ацетаткиназы.
Микроорганизм представляет собой микроскопический организм, в частности, бактерию, архею, вирус или гриб. Микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой, как правило, бактерию. Следует понимать, что в настоящем документе при упоминании микроорганизма подразумевается и бактерия.
Исходный микроорганизм представляет собой микроорганизм, применяемый для получения микроорганизм согласно настоящему изобретению. Указанный исходный микроорганизм может представлять собой встречающиеся в природе микроорганизм (т.е. микроорганизм дикого типа) или микроорганизм, который был модифицирован ранее (т.е. мутантный или рекомбинантный микроорганизм). Указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть модифицирован для экспрессии или избыточной экспрессии одного или более ферментов, которые не экспрессировались или не экспрессировались избыточно в исходном микроорганизме. Аналогичным образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть модифицирован так, что он содержит один или более генов, которые не содержались в исходном микроорганизме. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может также быть модифицирован таким образом, чтобы не экспрессировать один или более ферментов или экспрессировать их меньшие количества по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно одному варианту реализации указанный исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum LZ1561, внесенный в DSMZ под номером доступа DSM23693.
Термин происходящий из указывает на то, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм модифицирован или адаптирован из другой нуклеиновой кислоты, другого белка или микроорганизма (например, исходной нуклеиновой кислоты, исходного белка или микроорганизма; или нуклеиновой кислоты, белка или микроорганизма дикого типа), с получением новой нуклеиновой кислоты, нового белка или микроорганизма. Такие модификации или адаптации, как правило, включают инсерцию, делецию, мутацию или замену нуклеиновых кислот или генов. В общем случае, микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из исходного микроорганизма. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из Clostridium autoethano
- 37 043734 genum LZ1561, внесенного в DSMZ под номером доступа DSM23693.
Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть дополнительно классифицирован на основании функциональных характеристик. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может представлять собой С1-фиксирующий микроорганизм или может происходить из С1фиксирующего микроорганизма, анаэроба, ацетогена, этанологена, карбоксидотрофа и/или метанотрофа. В табл. 1 приведен репрезентативный перечень микроорганизмов и идентифицированы их функциональ ные характеристики.
Таблица 1
C1 -фиксируюгци! Анаэроб Ацетоген Этанологен Автотроф Карбоксидотроф Метанотроф
Acetobacterium woodii + + + +/-1 - - -
Alkalibaculum bacchii + + + + + + -
Blautia producta + + + - + + -
Butyribacterium methylotrophicum + + + + + + -
Clostridium aceticum + + + - + + -
Clostridium autoethanogenum + + + + + + -
Clostridium carboxidivorans + + + + + + -
Clostridium coskatii + + + + + + -
Clostridium, drakei + + + - + + -
Clostridium formicoaceticum + + + - + + -
Clostridium Ijungdahlii + + + + + + -
Clostridium magnum + + + - + +/-2 -
Clostridium ragsdalei + + + + + + -
Clostridium scatologenes + + + - + + -
Eubacterium limosum + + + - + + -
Moorella thermautotrophica + + + + + + -
Moorella thermoacetica (ранее Clostridium thermoaceticum) + + + з + +
Oxobacter pfennigii + + + - + + -
Sporomusa ovata + + + - + +/-4 -
Sporomusa silvacetica + + + + +/-5 »
Sporomusa sphaeroides + + + - + +/-6 -
Thermoanaerobacter kiuvi + + + - + - -
1Acetobacterium woodi может продуцировать этанол из фруктозы, однако не из газа.
2Не было исследовано, может ли Clostridium magnum расти на CO.
3Был описан один штамм Moorella thermoacetica, Moorella sp. HUC22-1, продуцирующий этанол из газа.
4Не было исследовано, может ли Sporomusa ovata расти на CO.
5Не было исследовано, может ли Sporomusa silvacetica расти на CO.
6Не было исследовано, может ли Sporomusa sphaeroides расти на CO.
С1 относится к содержащей один атом углерода молекуле, например, СО, CO2, CH4 или CH3OH. С1-оксигенат относится к содержащей один атом углерода молекуле, которая также содержит по меньшей мере один атом кислорода, например, СО, CO2 или CH3OH. С1-источник углерода относится к содержащей один атом углерода молекуле, которая служит в качестве частичного или единственного источника углерода для микроорганизма согласно настоящему изобретению. Например, С1-источник углерода может содержать что-либо одно или более из СО, CO2, CH4, CH3OH или СН2О2. Предпочтительно С1-источник углерода содержит что-либо одно из CO и CO2 или и первое, и второе. С1фиксирующий микроорганизм представляет собой микроорганизм, который обладает способностью продуцировать один или более продуктов из С1-источника углерода. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой С1-фиксирующую бактерию. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из С1фиксирующего микроорганизма, идентифицированного в табл. 1.
Анаэроб представляет собой микроорганизм, которому не требуется кислород для роста. Анаэроб может негативно реагировать или даже погибать при присутствии кислорода в количестве, превышающем определенный порог. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой анаэроба. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из анаэроба, идентифицированного в табл. 1.
Ацетоген представляет собой микроорганизм, который продуцирует или способен продуцировать ацетат (или уксусную кислоту) как продукт анаэробного дыхания. Обычно ацетогены являются облигатно анаэробными бактериями, использующими путь Вуда-Льюнгдаля в качестве основного механизма сохранения энергии и синтеза происходящих из ацетил-КоА и ацетил-КоА продуктов, таких как ацетат (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). Ацетогены используют путь ацетил-КоА в каче- 38 043734 стве (1) механизма восстановительного синтеза ацетил-КоА из CO2, (2) конечного электроноакцепторного сохраняющего энергию процесса, (3) механизма фиксации (ассимиляции) CO2 при синтезе клеточного углерода (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006). Все встречающиеся в природе ацетогены являются С1-фиксирующими, анаэробными, аутотрофными и неметанотрофными. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой ацетоген. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из ацетогена, идентифицированного в табл. 1.
Этанологен представляет собой микроорганизм, который продуцирует или способен продуцировать этанол. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой этанологен. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из этанологена, идентифицированного в табл. 1.
Автотроф представляет собой микроорганизм, способный к росту в отсутствие органического углерода. Вместо него автотрофы используют неорганические источники углерода, такие как CO и/или CO2. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой автотрофа. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из автотрофа, идентифицированного в табл. 1.
Карбоксидотроф представляет собой микроорганизм, способный к утилизации CO в качестве единственного источника углерода. Обычно микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой карбоксидотроф. Согласно предпочтительному варианту реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из карбоксидотрофа, идентифицированного в табл. 1.
Метанотроф представляет собой микроорганизм, способный к утилизации метана в качестве единственного источника углерода и энергии. Согласно некоторым вариантам реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из метанотрофа.
В более широком смысле микроорганизм согласно настоящему изобретению может происходить из любого рода или вида, идентифицированного в табл. 1.
Согласно предпочтительному варианту реализации указанный микроорганизм согласно настоящему изобретению происходит из кластера Clostridia, содержащего виды Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Указанные виды были впервые описаны и охарактеризованы в источниках: Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993 (Clostridium ljungdahlii) и Huhnke, WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).
Указанные три вида во многом аналогичны. В частности, все указанные виды являются С1фиксирующими анаэробными ацетогенными этанологенными и карбоксидотрофными представителями рода Clostridium. Указанные виды обладают аналогичными генотипами и фенотипами, способами сохранения энергии и ферментативным метаболизмом. Кроме того, указанные виды кластеризованы в клостридиальную группу гомологии рРНК I, с идентичной более чем на 99% 16S рРНК ДНК, имеют содержание G+С в ДНК, составляющее приблизительно 22-30 мол.%, являются грамположительными, имеют аналогичную морфологию и размер (клетки на стадии логарифмического роста имеют размер 0,5-0,7х3-5 мкм), являются мезофильными (оптимальный рост при 30-37°С), отличаются аналогичными диапазонами значений pH, приблизительно 4-7,5 (с оптимальным значением pH, составляющим приблизительно 5,5-6), не содержат цитохромов и сохраняют энергию с помощью Rnf-комплекса. Также у указанных видов было продемонстрировано восстановление карбоновых кислот до соответствующих спиртов (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Важно отметить, что все указанные виды также демонстрируют выраженный аутотрофный рост на СО-содержащие газах, продуцируют этанол и ацетат (или уксусную кислоту) в качестве основных продуктов ферментации, и продуцируют незначительные количества 2,3бутандиола и молочной кислоты в определенных условиях.
Однако указанные три вида также имеют ряд отличий. Указанные виды были выделены из разных источников: Clostridium autoethanogenum из ЖКТ кролика, Clostridium ljungdahlii из отходов курятников, и Clostridium ragsdalei из пресноводных отложений. Указанные виды различаются утилизацией различных Сахаров (например, рамнозы, арабинозы), кислот (например, глюконата, цитрата), аминокислот (например, аргинина, гистидина) и других субстратов (например, бетаина, бутанола). Кроме того, указанные виды различаются ауксотрофностью по определенным витаминам (например, тиамину, биотину). Указанные виды отличают различия в последовательностях нуклеиновых кислот и аминокислот генов и белков пути Вуда-Льюнгдаля, хотя общая организация и число указанных генов и белков, как было обнаружено, одинакова у всех видов (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).
Соответственно, в целом, многие из характеристик Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei не являются специфическими для данного вида, а представляют собой общие характеристики указанного кластера С1-фиксирующих, анаэробных, ацетогенных, этанологенных и карбоксидотрофных представителей рода Clostridium. Однако поскольку указанные виды фактически являются отдельными видами, генетическая модификация или манипуляции, произведенные с одним из указанных видов, могут не оказывать идентичного эффекта на другой вид из указанных видов. Например, могут наблюдаться различия в росте, производительности или продуцировании продукта.
Микроорганизм согласно настоящему изобретению может также происходить из изолята или му
- 39 043734 танта Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii или Clostridium ragsdalei.
Изоляты и мутанты Clostridium autoethanogenum включают JAI-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200) и LZ1561 (DSM23693). Изоляты и мутанты Clostridium ljungdahlii включают ATCC 49587 (Tanner, IntJSystBacterial, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (US 5593886), C-01 (ATCC 55988) (US 6368819), O52 (ATCC 55989) (US 6368819) и OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010). Изоляты и мутанты Clostridium ragsdalei включают PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO 2008/028055).
Однако согласно некоторым вариантам реализации микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм, отличный от Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei. Например, указанный микроорганизм может быть выбран из группы, состоящей из
Escherichia coll, Saccharomyces cerevisiae, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharbutyricum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium butyricum, Clostridium diolis, Clostridium kluyveri, Clostridium pasterianium, Clostridium novyi, Clostridium difficile, Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium cellulovorans, Clostridium phytofermentans, Lactococcus lacks, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Zymomonas mobilis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Corynebacterium glutamicum, Trichoderma reesei, Cupriavidus necator, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum nMethylobacterium extorquens.
Субстрат относится к источнику углерода и/или энергии для микроорганизма согласно настоящему изобретению. Обычно указанный субстрат является газообразным и содержит С1-источник углерода, например СО, CO2 и/или CH4. Предпочтительно указанный субстрат содержит С1-источник углерода в виде CO или CO+CO2. Указанный субстрат может дополнительно содержать другие неуглеродные компоненты, такие как H2, N2, или электроны.
Субстрат обычно содержит по меньшей мере некоторое количество СО, например, приблизительно 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мол.% CO. Субстрат может содержать различное количество СО, например, приблизительно 20-80, 30-70 или 40-60 мол.% CO. Предпочтительно, субстрат содержит приблизительно 40-70 мол.% CO (например, газ сталелитейного производства или доменный газ), приблизительно 20-30 мол.% CO (например, отходящий газ кислородно-конвертерного процесса) или приблизительно 15-45 мол.% CO (например, сингаз). Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат может содержать относительно небольшое количество СО, например, приблизительно 1-10 или 1-20 мол.% CO. Микроорганизм согласно настоящему изобретению, как правило, преобразует по меньшей мере часть CO в субстрате в продукт. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат не содержит или по существу не содержит CO.
Субстрат может содержать некоторое количество H2. Например, субстрат может содержать приблизительно 1, 2, 5, 10, 15, 20 или 30 мол.% H2. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат может содержать относительно большое количество Нг, например, приблизительно 60, 70, 80 или 90 мол.% H2. Согласно дополнительным вариантам реализации указанный субстрат не содержит или по существу не содержит H2.
Субстрат может содержать некоторое количество CO2. Например, субстрат может содержать приблизительно 1-80 или 1-30 мол.% CO2. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субстрат может содержать менее чем приблизительно 20, 15, 10 или 5 мол.% CO2. Согласно другому варианту реализации указанный субстрат не содержит или по существу не содержит CO2.
Хотя субстрат, как правило, является газообразным, он может также быть представлен альтернативными формами. Например, указанный субстрат может быть растворен в жидкости, насыщенной СОсодержащим газом с применением генератора микропузырьковых дисперсий. Согласно дополнительному примеру субстрат может быть адсорбирован на твердой подложке.
Субстрат и/или С1-источник углерода может представлять собой отработанный газ, получаемый в виде побочного продукта промышленного процесса или из некоторого другого источника, например, из выхлопных газов автомобилей или при газификации биомассы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный промышленный процесс выбран из группы, состоящей из производства продуктов из черных металлов, такого как сталелитейное производство, производства продуктов из цветных металлов, процессов переработки нефти, газификации угля, получения электроэнергии, получения сажистых веществ, получения аммиака, получения метанола и производства кокса. Согласно указанным вариантам реализации указанный субстрат и/или С1-источник углерода может быть захвачен из промышленного процесса до того, как он будет выброшен в атмосферу, с применением любого удобного способа.
- 40 043734
Указанный субстрат и/или С1-источник углерода может представлять собой сингаз, такой как сингаз, полученный путем газификации угля или остатков нефтепереработки, газификации биомассы или лигноцеллюлозного материал, или риформинга природного газа. Согласно другому варианту реализации указанный сингаз может быть получен при газификации твердых бытовых отходов или твердых промышленных отходов.
Состав субстрата может оказывать значимое влияние на эффективность и/или стоимость реакции. Например, присутствие кислорода (O2) может снижать эффективность процесса анаэробной ферментации. В зависимости от состава субстрата могут быть желательны обработка, очистка или фильтрация субстрата для удаления каких-либо нежелательных загрязняющих примесей, таких как токсины, нежелательные компоненты или пылевые частицы, и/или увеличения концентрации желательных компонентов.
Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть культивирован для продуцирования одного или более продуктов. Например, Clostridium autoethanogenum продуцирует или может быть сконструирован таким образом, чтобы продуцировать этанол (WO 2007/117I57), ацетат (WO 2007/117157), бутанол (WO 2008/115080 и WO 2012/053905), бутират (WO 2008/115080), 2,3-бутандиол (WO 2009/151342), лактат (WO 2011/112103), бутен (WO 2012/024522), бутадиен (WO 2012/024522), метилэтилкетон (2-бутанон) (WO 2012/024522 и WO 2013/185123), этилен (WO 2012/026833), ацетон (WO 2012/115527), изопропанол (WO 2012/115527), липиды (WO 2013/036147), 3-гидроксипропионат (3-НР) (WO 2013/180581), изопрен (WO 2013/180584), жирные кислоты (WO 2013/191567), 2-бутанол (WO 2013/185123), 1,2-пропандиол (WO 2014/0369152) и 1-пропанол (WO 2014/0369152). Помимо одного или более целевых продуктов микроорганизм согласно настоящему изобретению может также продуцировать этанол, ацетат и/или 2,3-бутандиол. Согласно некоторым вариантам реализации собственно биомасса микроорганизмов может считаться продуктом.
Нативный продукт представляет собой продукт, продуцируемый генетически немодифицированным микроорганизмом. Например, этанол, ацетат и 2,3-бутандиол представляют собой нативные продукты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Негативный продукт представляет собой продукт, продуцируемый генетически модифицированным микроорганизмом, однако не продуцируемый генетически немодифицированным микроорганизмом, из которого происходит указанный генетически модифицированный микроорганизм.
Термины промежуточный продукт и предшественник, которые могут называться взаимозаменяемо в настоящем документе, относятся к молекулярному объекту, расположенному выше по ходу ферментативного пути относительно наблюдаемого или целевого продукта.
Селективность относится к отношению продуцирования целевого продукта к продуцированию всех продуктов ферментации микроорганизма. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть сконструирован таким образом, чтобы продуцировать продукты с определенной селективностью или с минимальной селективностью. Согласно одному варианту реализации целевой продукт составляет по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% или 75% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации указанный целевой продукт составляет по меньшей мере 10% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению, таким образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению отличается селективностью в отношении целевого продукта, составляющей по меньшей мере 10%. Согласно другому варианту реализации указанный целевой продукт составляет по меньшей мере 30% от всех продуктов ферментации, продуцируемых микроорганизмом согласно настоящему изобретению, таким образом, микроорганизм согласно настоящему изобретению отличается селективностью в отношении целевого продукта, составляющей по меньшей мере 30%.
Увеличение эффективности, увеличенная эффективность и т.п. включает, не ограничиваясь перечисленными, увеличение скорости роста, скорости или объема продуцирования продукта, отношения объема продукта к объему потребленного субстрата или селективности продукта. Эффективность может быть измерена относительно производительности исходного микроорганизма, из которого происходит микроорганизм согласно настоящему изобретению.
Обычно культивирование осуществляют в биореакторе. Термин биореактор включает устройство для культивирования/ферментации, состоящее из одного или более сосудов, колонн или трубок, например, проточный реактор с мешалкой (CSTR), реактор с иммобилизованными клетками (ICR), реактор с орошаемым слоем (TBR), барботажную колонку, газлифтный ферментер, статический смеситель или другой сосуд или другое устройство, подходящее для газожидкостного контакта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный биореактор может содержать первый реактор для роста и второй реактор для культивирования/ферментации. Субстрат может быть добавлен в один или в оба указанных реактора. В настоящем документе термины культура, культивирование и ферментация используются взаимозаменяемо. Указанные термины охватывают как фазу роста, так и фазу биосинтеза продукта в процессе культивирования/ферментации.
Культуру обычно поддерживают на водной культуральной среде, которая содержит питательные вещества, витамины и/или минеральные вещества, достаточные для обеспечения роста указанного мик- 41 043734 роорганизма. Предпочтительно, указанная водная культуральная среда представляет собой ростовую среду для анаэробных микроорганизмов, такую как минимальная ростовая среда для анаэробных микроорганизмов. Подходящие среды хорошо известны в данной области техники.
Культивирование/ферментацию предпочтительно проводят в подходящих условиях для продуцирования целевого продукта. Обычно культивирование/ферментацию осуществляют в анаэробных условиях. Учитываемые реакционные условия включают давление (или парциальное давление), температура, скорость потока газа, скорость потока жидкости, pH среды, редокс-потенциал среды, скорость перемешивания (при использовании проточного реактора с мешалкой), уровень инокулята, максимальные концентрации газового субстрата для того, чтобы газ в жидкой фазе не становился ограничивающим фактором, и максимальные концентрации продукта, чтобы избежать ингибирования продуктом. В частности, можно контролировать скорость введения субстрата для того, чтобы концентрация газа в жидкой фазе не становилась ограничивающим фактором, поскольку культура может потреблять продукты в условиях ограниченной доступности газа.
Эксплуатация биореактора при повышенном давлении позволяет увеличить скорость массопереноса газа из газовой фазы в жидкую фазу. Соответственно, обычно предпочтительно проведение культивирования/ферментации при давлении, превышающем атмосферное давление. Также, поскольку определенная скорость преобразования газа является, отчасти, функцией от времени удерживания субстрата, а время удерживания определяет требуемый объем биореактора, применение систем под давлением может значительно снижать требуемый объем биореактора и, следовательно, капитальную стоимость оборудования для культивирования/ферментации. Это, в свою очередь, означает, что время удерживания, определяемое как результат деления объема жидкости в биореакторе на скорость входящего потока газа, может быть снижено при поддержании повышенного, а не атмосферного давления в биореакторах. Оптимальные реакционные условия отчасти зависят от конкретного используемого микроорганизма. Однако, в целом, предпочтительно осуществление ферментации при давлении, превышающем атмосферное давление. Также, поскольку определенная скорость преобразования газа является, отчасти, функцией от времени удерживания субстрата, а достижение требуемого времени удерживания, в свою очередь, определяет требуемый объем биореактора, применение систем под давлением может значительно снижать требуемый объем биореактора, и, следовательно, капитальную стоимость оборудования для ферментации.
Целевые продукты могут быть отделены или очищены из ферментативного бульона с применением любого способа или комбинации способов, известных в данной области техники, включая, например, фракционную дистилляцию, испарение, первапорацию, отдувку газом, фазовое разделение и экстрактивную ферментацию, в том числе например, жидкостно-жидкостную экстракцию. Согласно некоторым вариантам реализации целевые продукты выделяют из ферментативного бульона путем непрерывного удаления части бульона из биореактора, отделения клеток микроорганизма из бульона (которое удобно осуществлять путем фильтрации) и извлечения из бульона одного или более целевых продуктов. Спирты и/или ацетон можно выделить, например, путем дистилляции. Кислоты могут быть выделены, например, путем адсорбции на активированном угле. Отделенные клетки микроорганизма предпочтительно возвращают в биореактор. Бесклеточный пермеат, остающийся после извлечения целевых продуктов, также предпочтительно возвращают в биореактор. Дополнительные питательные вещества (такие как витамины В) могут быть добавлены в бесклеточный пермеат для восполнения среды перед ее возвращением в биореактор.
Примеры
Приведенные ниже примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, однако, разумеется, не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие его объем.
Пример 1.
В указанном примере продемонстрирована способность Ptb-Buk к преобразованию ацетоацетилКоА в ацетоацетат у E.coli in vivo и применение Ptb-Buk при получении ацетона, изопропанола, 3гидроксибутирата и изобутилена.
Разрабатывали и конструировали пути на основе системы Ptb-Buk для получения ацетоацетата из ацетоацетил-КоА. Это осуществляли модульным способом с применением векторной системы pDUET (Novagen). Один модуль содержал гены ptb-buk из С. beijerinckii NCIMB8052 (GenBank NC_009617, позиция 232027..234147; Cbei_0203-204; NCBI-GeneID 5291437-38) на плазмиде pACYC. Другой модуль содержал ген тиолазы thlA С. acetobutylicum (Genbank NC_001988, позиция 82040..83218; СА_Р0078; NCBI-GeneID 1116083) и ген ацетоацетатдекарбоксилазы adc С. beijerinckii NCIMB8052 (Genbank NC_009617, позиция 4401916..4402656; Cbei_3835; NCBI-GeneID 5294996) на плазмиде pCOLA. Гены Ptb и buk амплифицировали из геномной ДНК С. beijerinckii NCIMB8052, а гены thlA и adc из существующей плазмиды для ацетона pMTL85147-thlA-ctfAB-adc (WO 2012/115527) и клонировали под контролем промотора Т7, присутствующего в векторах pDUET, посредством независимого от рестрикции клонирования с применением метода кольцевого полимеразного удлинения (СРЕС) (Quan, PloS One, 4:е6441, 2009).
Олигонуклеотиды, используемые для амплификации генов ptb и buk:
- 42 043734
SEQ ID NO: Название Последовательность Направле ние
95 pACYCDuet-ptb-buk pACYC-ptb-Rl AAGTTTTTACTCATATGTATATC TCCTTCTTATACTTAAC обратный
96 pACYCDuet-ptb-buk - ptbpACYC-Fl AGAAGGAGATATACATATGAGT AAAAACTTTGATGAGTTA прямой
97 pACYCDuet-ptb-buk buk-pACYC-Rl ACCAGACTCGAGGGTACCTAGT AAACCTTAGCTTGTTC обратный
98 pACYCDuet-ptb-buk pACYC-buk-Fl TAAGGTTTACTAGGTACCCTCG AGTCTGGTAAAGAAAC прямой
Олигонуклеотиды, используемые для амплификации генов thlA и adc:
SEQ ID NO: Название Последовательность Направлен ие
99 pCOLADuet-thlA-adc - thlA-adc-Rl ACATATGTATATCTCCTTCTTACT AGCACTTTTCTAGCAATATTG обратный
100 pCOLADuet-thlA-adc - adc- ThlA-Fl AGTAAGAAGGAGATATACATAT GTTAGAAAGTGAAGTATCTAAAC прямой
101 pCOLADuet-thlA-adc - adcpCOLA-Rl CAGACTCGAGGGTACCTTATTTT ACTGAAAGATAATCATGTAC обратный
102 pCOLADuet-thlA-adc pCOLA-adc-Fl TCTTTCAGTAAAATAAGGTACCC TCGAGTCTGGTAAAGAAAC прямой
103 pCOLADuet-thlA-adc thlA-pCOLA-Fl GAAGGAGATATACATATGAAAG AAGTTGTAATAGCTAGTG прямой
104 pCOLADuet-thlA-adc pCOLA-thlA-Rl ACAACTTCTTTCATATGTATATCT CCTTCTTATACTTAAC обратный
После конструирования плазмид pACYC-ptb-buk (SEQ ID NO: 105) и pCOLA-thlA-adc (SEQ ID NO: 106), ими индивидуально и совместно трансформировали E. coli BL21 (DE3) (Novagen) и проводили эксперименты с ростом в 4 повторностях в 1,5 мл культур в 12-луночных планшетах при 28°С с орбитальным встряхиванием при 160 об/мин с применением минимальной среды М9 (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) с глюкозой (фиг. 4). Указанные культуры инокулировали с плотностью, соответствующей OD600 нм=0,1 и индуцировали разными концентрациями ИПТГ (0, 50, 100 мкМ) через 2 ч роста (фиг. 5). Указанные планшеты герметично закрывали с применением липкой пленки для планшетов и над каждой лункой иглой с зеленым концом делали прокол для обеспечения микроаэробных условий. Рост продолжался в течение дополнительных 64 ч индукции. Указанный эксперимент проводили в трех повторностях.
Концентрации ацетона, а также концентрации других метаболитов, таких как изобутилен, измеряли с применением газохроматографического (ГХ) анализа, используя систему для парофазной ГХ Agilent 6890N, оснащенную полиэтиленгликолевым (ПЭГ) волокном 60 мкм Supelco для твердофазной микроэкстракции, колонкой Restek Rtx-1 (30 мх0,32 мкмх5 мкм) и пламенно-ионизационным детектором (FID). Образцы (4 мл) переносили в 20 мл флакон для парофазного анализа, над которым инкубировали (экспонировали) волокно в течение 10 мин при 50°С. Образец десорбировали в инжекторе при 250°С в течение 9 мин. Хроматографию проводили с использованием программы термостата на 40°С (5-минутное удерживание) и от 10°С/мин до 200°С, с последующим 5-минутным удерживанием при 220°С. Скорость потока через колонку составляла 1 мл/мин, водород использовали в качестве газа-носителя. Температуру FID поддерживали на уровне 250°С; 40 мл/мин водорода, 450 мл/мин воздуха и 15 мл/мин азота использовали в качестве поддувочного газа.
Было совершенно очевидно, что штамм, несущий как плазмиду pACYC-ptb-buk, так и плазмиду pCOLA-thlA-adc (экспрессирующий тиолазу, Ptb-Buk и ацетоацетатдекарбоксилазу), продуцировал ацетон. Средний измеренный итоговый показатель продуцирования ацетона составил 0,19 г/л, при этом продуцирование ацетона отсутствовало в контроле без плазмид, в контрольной среде и в несущих одну плазмиду контролях с pACYC-ptb-buk (экспрессирующих Ptb-Buk) или pCOLA-thlA-adc (экспрессирующих тиолазу и ацетоацетатдекарбоксилазу) (ниже достоверного предела детекции). Неиндуцированная культура штамма, несущего как плазмиду pACYC-ptb-buk, так и плазмиду pCOLA-thlA-adc (экспрессирующего тиолазу, Ptb-Buk и ацетоацетатдекарбоксилазу), не продуцировала ацетон в поддающихся оценке количествах.
Средние показатели продуцирования ацетона у E.coli BL21 (DE3)
Штамм Ацетон (г/л)
Thl+Ptb-Buk+Adc [A coli BL21 (DE3) + pACYC-ptb-buk + pCOLA-thlA-adc] 0,19±0,04
Thl+Adc отдельно [Е. coli BL21 (DE3) + pCOLA-thlA-adc] 0,04±0,01
Ptb-Buk отдельно [E. coli BL21 (DE3) + pACYC-ptb-buk] 0,03±0,01
Без контрольной плазмиды {E. coli BL21 (DE3)] 0,04±0,01
Контрольная среда 0,03±0,01
Настоящий эксперимент ясно демонстрирует, что Ptb-Buk способна осуществлять преобразование ацетоацетил-КоА в ацетоацетат и может быть использован вместо КоА-трансферазы или тиоэстеразы для продуцирования ацетона, что показано на примере маршрута, включающего этапы 1, 2, и 3 согласно фиг. 1.
Хорошо известно, что изопропанол может быть продуцирован из ацетона путем добавления пер
- 43 043734 вичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014) (этап 4 на фиг. 1), и что изобутилен может быть продуцирован из ацетона путем добавления гидроксиизовалератсинтазы (этап 5 на фиг. 1) и декарбоксилазы (этап 6 на фиг. 1) (van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012). Можно сконструировать путь, включающий продемонстрированный выше маршрут продуцирования ацетона с помощью Ptb-Buk, используя гены thlA, ptb-buk и adc, а также ген первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (например, под номером доступа Genbank NC_022592, поз. 609711..610766; CAETHG_0553; NCBI-GeneID: 17333984), что обеспечит продуцирование изопропанола с помощью системы Ptb-Buk у E.coli, включающее этапы 1, 2, 3 и 4 согласно фиг. 1. Аналогичным образом, может быть сконструирован путь, который включает представленный выше маршрут продуцирования ацетона с помощью Ptb-Buk-преобразования ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, с использованием генов thlA, ptb-buk и adc и генов гидроксиизовалератсинтазы и декарбоксилазы, обеспечивающий продуцирование изобутилена с помощью системы Ptb-Buk у E.coli, содержащей этапы 1, 2, 3, 5 и 6 согласно фиг. 1. Ацетоацетат может также быть преобразован в 3-гидроксибутират с помощью 3гидроксибутиратдегидрогеназы Bdh. Указанное преобразование может быть скомбинировано с Ptb-Bukпреобразованием ацетоацетил-КоА в ацетоацетат для продуцирования 3-гидроксибутирата у штамма, экспрессирующего гены thlA, ptb-buk и bdh, с получением пути, содержащего этапы 1, 2 и 15 согласно фиг. 1.
Пример 2.
В указанном примере продемонстрирована способность Ptb-Buk к преобразованию ацетоацетилКоА в ацетоацетат у С. autoethanogenum in vivo, и применение Ptb-Buk при получении ацетона, изопропанола, 3-гидроксибутирата и изобутилена из газообразного субстрата.
Чтобы продемонстрировать, что система Ptb-Buk также позволяет синтезировать ацетон, изопропанол или изобутилен из газообразных субстратов, конструировали плазмиду, которая содержит те же гены, что и описанные в примере 1, thl+ptb-buk+adc, под контролем клостридиального промотора на челночном векторе, что обеспечивает экспрессию в ацетогенах, таких как С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei.
Плазмида pMTL представляет собой челночную плазмидную систему для введения кольцевой DNA в Clostridia посредством конъюгации E.coli (Heap, J Microbiol Methods, 78: 79-85, 2009). Представляющие интерес гены (т.е. hbd, phaB, thlA, ptb, buk и aorl) клонировали в область lacZ указанных плазмид с применением общих техник молекулярной биологии, в том числе рестрикционного расщепления ДНК с последующим лигированием, и технологии сборки ДНК Golden Gate, согласно которой в плазмиду клонируют одновременно более одной части фрагментов ДНК. Сконструированные плазмиды верифицируют посредством ДНК-секвенирования.
Продуцирование ацетона и изопропанола ранее было продемонстрировано у С. autoethanogenum с применением плазмиды pMTL85147-thlA-ctfAB-adc, кодирующей thl+ctfAB+ adc (WO 2012/115527) под контролем клостридиального промотора из генного кластера Вуда-Льюнгдаля. В указанной плазмиде гены ctfAB, кодирующие КоА-трансферазу, прямо заменяли генами ptb-buk, кодирующими систему PtbBuk. Это осуществляли согласно описанию в примере 1 с применением способа СРЕС. Итоговая плазмида: pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.
Олигонуклеотиды, использованные для амплификации ptb-buk и клонирования в pMTL8317-thl-ptbbuk-adc, опис аны ниже._____________________________________________________________
SEQ ID NO: Название Последовательность Направле ние
107 thlA-ptb-Rl ATTTCCTCCCTTTCTAGCACTTT TCTAGCAATATTG Обратный
108 adc-buk-Fl TAAGGTTTACTAAGGAGGTTGT TTTATGTTAGAAAG Прямой
109 thlA-ptb-Fl GCTAGAAAAGTGCTAGAAAGG GAGGAAATGAACATG Прямой
ПО Buk-adc-Rl AAAACAACCTCCTTAGTAAACC TTAGCTTGTTCTTC Обратный
С. autoethanogenum DSM10061 и DSM23693 (дериват DSM1G061) получали из DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Инхоффенштрассе 7 В, 38124 Брауншвейг, Германия).
Штаммы культивировали при 37°С на среде РЕТС при pH 5,6 с применением стандартных анаэробных техник (Hungate, Meth Microbiol, ЗВ: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microb Physiol, 6:107-146, 1971). Содержащий 30 фунтов/кв.дюйм CO газ сталелитейных производств (собранный на объекте New Zealand Steel в Гленбруке, Новая Зеландия) или синтетическую смесь газов с таким же составом, 44% СО, 32% N2, 22% CO2, 2% H2, использовали в качестве субстрата для аутотрофного роста. Для получения твердой среды добавляли 1,2 % бакто-агара (BD, Франклин Лейке, Нью-Джерси 07417, США).
Синтезировали конструкцию и затем трансформировали С. autoethanogenum посредством конъюгации. Для этого экспрессионный вектор сначала вводили в конъюгативный донорный штамм E. coli HB101+R702(CA434) (Williams, J Gen Microbiol, 1136: 819-826, 1990) (донор) с применением стандартной трансформации методом теплового шока. Донорные клетки восстанавливали в среде SOC (Sambrook,
- 44 043734
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) при 37°C в течение 1 ч до высевания на чашки со средой LB (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989), содержащей 100 мкг/мл спектиномицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола. Чашки с LB инкубировали при 37°С в течение ночи. На следующий день аликвоты объемом 5 мл, содержащие LB с 100 мкг/мл спектиномицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола, инокулировали несколькими донорными колониями и инкубировали при 37°С, встряхивали в течение приблизительно 4 ч, или до наблюдаемой видимой плотности культуры, но до наступления стационарной фазы. 1,5 мл донорной культуры собирали в микроцентрифужную пробирку при комнатной температуре путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 2 мин; супернатант утилизировали. Донорные клетки аккуратно ресуспендировали в 500 мкл стерильного буфера ФСБ (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol 3, Cold Spring Harbour Press, 1989) и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 2 мин; супернатант ФСБ утилизировали. Осадок вводили в анаэробную камеру и аккуратно ресуспендировали в 200 мкл культуры С. autoethanogenum (реципиента) во время поздней экспоненциальной фазы. Указанную смесь для конъюгации (смесь донорных и реципиентных клеток) наносили на чашки с PETC-MES +фруктозный агар и оставляли для высыхания. Когда пятна при визуальном осмотре переставали быть влажными, чашки помещали в сосуд для использования под давлением, нагнетали сингаз до 25-30 фунтов/кв. дюйм и инкубировали при 37°С в течение ~24 ч. Через 24 ч инкубирования смесь для конъюгации извлекали из чашек, аккуратно соскребая ее с применением инокуляционной петли на 10 мкл. Извлеченную смесь суспендировали в 200-300 мкл среды РЕТС. Аликвоты указанной смеси для конъюгации объемом 100 мкл высевали на чашки с агаровой средой РЕТС с добавлением 15 мкг/мл тиамфеникола для выбора трансформантов, несущих плазмиду, которая придает устойчивость к тиамфениколу за счет экспрессии хлорамфениколацетилтрансферазы.
Три отдельных колонии С. autoethanogenum, несущие плазмиду pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc, инокулировали в 2 мл среды PETC-MES с 15 мкг/мл тиамфеникола, и культивировали в автотрофных условиях при 37°С с орбитальным встряхиванием на 100 об/мин в течение трех дней. Культуры разводили до OD600 нм=0,05 с 10 мл среды PETC-MES с 15 мкг/мл тиамфеникола в бутылях для сыворотки и культивировали в автотрофных условиях при 37°С с орбитальным встряхиванием на 100 об/мин в течение пяти дней, ежедневно отбирая образцы для измерения биомассы и метаболитов. Параллельно изучали контрольный штамм, в котором экспрессионная плазмида кодировали только thl и adc под контролем промотора кластера Вуда-Льюнгдаля, без генов ctfAB или ptb-buk для катализа образования ацетоацетата из ацетоацетил-КоА (pMTL85147-thlA-adc). Образцы культур отбирали в течение пяти дней для мониторинга накопления метаболитов и биомассы.
Концентрации изопропанола, а также концентрации этанола, уксусной кислоты, 2,3-бутандиола и молочной кислоты измеряли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на Agilent LC с рефрактометрической (RI) детекцией при 35°С. Образцы получали путем разведения 400 мкл с 100 мкл раствора 5-сульфосалициловой кислоты (1 мас./об.% в 1М серной кислоте), с последующим 3-минутным центрифугированием при 14000 об/мин; супернатант переносили в стеклянный флакон для анализа. Разделение проводили, вводя пробу объемом 10 мкл на колонку Alltech IOA-2000 (150 ммх6,5 ммх8 мкм) со скоростью 0,7 мл/мин при 65°С в изократических условиях, с применением 5 мМ серной кислоты в качестве подвижной фазы.
В некоторых случаях использовали более длительный метод ВЭЖХ для улучшения разделения пиков. Согласно указанному способу концентрации изопропанола, этанола, ацетата, 2,3-бутандиола, а также 3-гидроксибутирата (который не подлежит разделению с применением более краткого метода) измеряли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на Agilent 1260 Infinity LC с рефрактометрической (RI) детекцией при 35°С. Образцы получали путем разведения 400 мкл с 100 мкл раствора 5-сульфосалициловой кислоты (1 мас./об.% в 1М серной кислоте), с последующим 3-минутным центрифугированием при 14000 об/мин; супернатант переносили в стеклянный флакон для анализа. Разделение проводили, вводя пробу объемом 10 мкл на колонку Aminex HPX-87H (300 ммх7,8 ммх9 мкм) со скоростью 0,6 мл/мин при 35°С в изократических условиях, с применением 5 мМ серной кислоты в качестве подвижной фазы. autoethanogenum, несущий pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc. продуцировал изопропанол в количестве до 0,804 г ИПА/г биомассы, тогда как контрольный штамм С- autoethanogenum с pMTL85147-thlA-adc, не содержащей Ptb-Buk, не продуцировал ИПА (фиг. 12).
Настоящий эксперимент ясно демонстрирует, что Ptb-Buk способна осуществлять преобразование ацетоацетил-КоА в ацетоацетат в пути изопропанола при использовании газообразного субстрата. PtbBuk может быть использована вместо КоА-трансферазы или тиоэстеразы ферментирующим газ ацетогеном, таким как С. autoethanogenum, что показано на примере использования маршрута, включающего этапы 1, 2, 3 и 4 согласно фиг. 1.
С. autoethanogenum содержит нативную первичную:вторичную алкогольдегидрогеназу которая преобразует ацетон в изопропанол (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Было продемонстрировано, что нокаут указанного гена элиминирует преобразование ацетона в изопропанол у С. autoethanogenum (WO 2015/085015). На фоне указанного нокаута становится возможным получение ацето-
- 45 043734 на (а не изопропанола) с помощью системы Ptb-Buk из газообразного сырья с применением тех же генов, включающее этапы 1, 2 и 3 согласно фиг. 1. Добавление генов гидроксиизовалератсинтазы и декарбоксилазы (van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93:1377-1387, 2012) в указанный штамм обеспечивает продуцирование изобутилена из газа у С. autoethanogenum или аналогичных бактерий, включающее этапы 1,
2, 3, 5 и 6 согласно фиг. 1.
Ацетоацетат может таюке быть преобразован в 3-гидроксибутират с помощью 3гидроксибутиратдегидрогеназы Bdh. 3-гидроксибутиратдегидрогеназа была идентифицирована в геноме С. autoethanogenum (AGY75962) и других ацетогенов, таких как С. ljungdahlii (ADK16920.1). Указанная активность может быть скомбинирована с Ptb-Buk- (или КоА-трансферазным) преобразованием ацетоацетил-КоА в ацетоацетат для продуцирования 3-гидроксибутирата штаммом, экспрессирующим гены thlA, ptb-buk (или ctfAB) и bdh, что дает путь, содержащий этапы 1, 2 и 15 согласно фиг. 1. Для С. autoethanogenum были продемонстрированы низкие уровни образования 3-гидроксибутирата (до 2 г/л) через указанный маршрут. Указанные уровни могут быть увеличены путем избыточной экспрессии гена Bdh, который естественным образом экспрессируется на незначительных уровнях.
В одном эксперименте С. autoethanogenum, трансформировали плазмидой pMTL82256-thlA-ctfAB согласно описанию в примере 2. Продуцирование отслеживали в течение 10 дней на шести биологических репликатах в аутотрофных условиях согласно описанию в примере 2. Средний показатель для 3-ГБ через 10 дней составил 1,86±0,14 г/л. На 10 день средний титр продуцируемого 1,3-бутандиола (из 3-ГБ) составил 0,38±0,05 г/л (фиг. 37). Не происходило образования ацетона или изопропанола. Это показывает, что 3-ГБ может быть эффективно продуцирован нативными ферментами через ацетоацетат.
Согласно некоторым вариантам реализации может быть желательным нокаут или нокдаун экспрессии 3-гидроксибутиратдегидрогеназ, таких как Bdh, для предотвращения утечки углерода в 3-ГБ и, соответственно, стимуляции продуцирования таких продуктов, как ацетон, изопропанол и изобутилен.
Пример 3.
В указанном примере продемонстрирована способность Ptb-Buk к преобразованию (R)-3гидроксибутирил-КоА в (R)-3-гидроксибутират в E.coli in vivo для продуцирования (R)гидроксибутирата, ацетона, изопропанола или изобутилена.
Разрабатывали и сконструировали пути, основанные на системе Ptb-Buk, для получения (R)-3гидроксибутирата из (R)-3-гидроксибутирил-КоА. Кроме того, использовали 3-гидроксибутиратдегидрогеназу (Bdh) для преобразования (R)-3-ГБ в ацетоацетат. Описано содержание у Ralstonia pickettii двух 3-гидроксибутиратдегидрогеназ, Bdh1 и Bdh2, способных к преобразованию 3гидроксибутират в ацетоацетат да vitro (Takanashi, J Biosci Bioeng, 101:501-507, 2006). Один разработанный путь включал применение указанного фермента для продуцирования ацетона (этапы 1, 13, 14, 15, 3 согласно фиг. 1), с повторным использованием восстанавливающих эквивалентов, полученных при продуцировании (R)-3-гидроксибутирил-КоА, и АТФ, генерированной Ptb-Buk (фиг. 6).
Указанные пути конструировали модульным способом с применением векторной системы pDUET (Novagen). Указанные два модуля, описанные в примере выше (pACYC-ptb-buk для экспрессии Ptb-Buk; и pCOLA-thlA-adc для экспрессии тиолазы и ацетоацетатдекарбоксилазы) использовали совместно с двумя дополнительными модулями, каждый из которых содержал (R)-специфическую 3гидроксибутиратдегидрогеназу phaB Cupravidus necator (WP_010810131.1) (pCDF-phaB), а один содержал также ген 3-гидроксибутиратдегидрогеназы bdh1 Rasltonia pickettii (BAE72684.1) (pCDF-phaB-bdh1) в векторе pCDF. Оба гена, phaB и bdh1, были синтезированы с помощью GeneArt и клонированы под контролем промотора Т7, присутствующего при независимом от рестрикции клонировании с применением метода кольцевого полимеразного удлинения (СРЕС) (Quan, PloS One, 4:e6441, 2009).
Олигонуклеотиды, используемые для амплификации гена bdh1:_______________________
SEQ ID NO: Название Последовательность Направлен ие
111 pDuet-insert2-Rl CATATGTATATCTCCTTCTTATAC TTAAC прямой
112 insert2-pDuet-Fl GTTAAGTATAAGAAGGAGATATA CATATG прямой
113 pDuet-insert2-Fl CCTCGAGTCTGGTAAAGAAAC прямой
114 insert2-pDuet-Rl GTTTCTTTACCAGACTCGAGG прямой
Олигонуклеотиды, используемые для амплификации гена phaB:
SEQ ID NO: Название Последовательность Направлен ие
115 pCDF-phaB -pACYC- phaB-Rl CTATTCTTTGTGTCATGGTATATC TCCTTATTAAAG прямой
116 pCDF-phaB - phaBpACYC-Fl ATAAGGAGATATACCATGACACA AAGAATAGCATAC прямой
- 46 043734
117 pCDF-phaB - pACYCphaB-Fl TGGTTTACACATGGGATAAGATC CGAATTCGAGCTC прямой
118 pCDF-phaB - phaBpACYC-Rl AGCTCGAATTCGGATCTTATCCC ATGTGTAAACCAC прямой
После конструирования плазмид pACYC-ptb-buk (SEQ ID NO: 105), pCOLA-thlA-adc (SEQ
ID NO: 106), pCDF-phaB (SEQ ID NO: 119) и pCDF-phaB-bdhl (SEQ ID NO: 120) ими трансформировали индивидуально и в комбинациях E.coli BL21 (DE3) (Novagen) и проводили эксперименты с ростом в 4 повторностях в культуре объемом 1,5 мл в 12-луночных планшетах при 28°С с орбитальным встряхиванием при 160 об/мин с применением минимальной среды М9 с глюкозой. Культуры инокулировали с плотностью, соответствующей OD600hm=0,1, и через 2 ч роста индуцировали разными концентрациями ИПТГ (0, 50, 100 мкМ). Указанные планшеты герметично закрывали с применением липкой пленки для планшетов BioRad и над каждой лункой иглой с зеленым концом делали прокол для обеспечения микроаэробных условий. Рост продолжался в течение дополнительных 64 ч индукции. Указанный эксперимент проводили в 3 повторностях. Метаболиты измеряли согласно описанию в предыдущих примерах.
Культуры, содержащие комбинацию плазмид pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc и pCDF-phaB, продуцировали 1,65-2,4 г/л (R)-3-гидроксибутирата (в зависимости от уровня индуктора) с очень незначительным количеством побочных продуктов (фиг. 13A-F), демонстрируя эффективность системы Ptb-Buk для преобразования (R)-3-гидроксибутирил-КоА в (R)-3-гидроксибутират и поддержания роста (фиг. 13A-F). В культуральной среде в культурах, которые также экспрессировали bdh1 (содержащих комбинацию плазмид pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc и pCDF-phaB-bdhl) были обнаружены только незначительные количества (К)-3-гидроксибутирата, тогда как ацетон был обнаружен в количестве от 0,89 до 1,16 г/л (в зависимости от уровня индуктора), что указывает на эффективность гена bdh1 для преобразования (R)-3гидроксибутирата в ацетоацетат, и далее в ацетон. Ни 3-гидроксибутират, ни ацетон не были обнаружены при любых комбинациях плазмид без Ptb-Buk (фиг. 13 A-F). В указанных культурах уровни ацетата уровни были значимо выше.
Настоящий эксперимент ясно демонстрирует, что Ptb-Buk способна осуществлять преобразование (К)-3-гидроксибутират-КоА в 3-гидроксибутират, а также что Bdh1 способен к преобразованию in vivo 3гидроксибутирата далее в ацетоацетат путем повторного использования восстанавливающих эквивалентов, полученных при продуцировании (К)-3-гидроксибутирил-КоА. Настоящий эксперимент также выявляет, что Ptb-Buk способна поддерживать рост и, соответственно, продуцирование ацетата перестает быть необходимостью. Продуцирование (R)-3-гидроксибутирата было показано на примере штамма, содержащего этапы 1, 13 и 14 согласно фиг. 1. Продуцирование ацетона было показано на примере маршрута, который содержит этапы 1, 13, 14, 15 и 3 согласно фиг. 1.
Хорошо известно, что изопропанол может быть продуцирован из ацетона путем добавления первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (этап 4 на фиг. 1) (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 33943403, 2014), и что изобутилен может быть продуцирован из ацетона путем добавления гидроксиизовалератсинтазы (этап 5 на фиг. 1) и декарбоксилазы (этап 6 на фиг. 1) (van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012). Можно сконструировать путь, который включает продемонстрированный выше маршрут продуцирования ацетона с помощью Ptb-Buk, используя гены thlA, ptb-buk и adc, а также ген первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (например, Genbank NC_022592, позиция 609711..610766; CAETHG_0553; NCBI-GeneID: 17333984), что обеспечит продуцирование изопропанола с помощью системы Ptb-Buk у E. coli (этапы 1, 13, 14, 15, 3 и 4 согласно фиг. 1). Аналогичным образом, можно сконструировать путь, который включает продемонстрированный выше маршрут продуцирования ацетона с помощью Ptb-Buk, используя гены thlA, ptb-buk и adc, а также гены гидроксиизовалератсинтазы и декарбоксилазы, что обеспечит продуцирование изобутилена с помощью системы Ptb-Buk у E. coli (этапы 1, 13, 14, 15, 3, 5 и 6 согласно фиг. 1).
Пример 4.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование (R)-3-гидроксибутирaтa и 1,3бутандиола у С. autoethanogenum. Также продемонстрировано продуцирование 1,3-бутандиола в отсутствие 2,3-бутандиола.
Конструировали штамм C.autoethanogenum, в котором нативный путь продуцирования 2,3бутандиола инактивировали и заменяли на гены, обеспечивающие образование (К)-3-гидроксибутирилКоА. Это было достигнуто путем замены гена ацетолактатдекарбоксилазы (budA) в геноме С. autoethanogenum на гены тиолазы (thlA С. acetobutylicum; GenBank NC_001988, позиция 82040..83218; СА_Р0078; NCBI-GeneID 1116083) и ^-специфической 3-гидроксибутиратдегидрогеназы (phaB Cupravidus necator, GenBank WP_010810131.1), с получением в результате штамма С. autoethanogenum budA::thlAphaB.
Для замены гена budA на гены thlA u phaB плазмиду pMTL8225-budA::thlA-phaB (фиг. 14) с геном токсина E.coli mazF под контролем тетрациклинового индуцируемого промотора tet3n0 (для контрселекции), плечо гомологии размером -1Кб в 3'-5' направлении от гена budA, thlA, phaB, кассету ermB, фланкированную сайтами loxP, и плечо гомологии размером -1Кб в 5'-3' направлении от гена budA собирали
- 47 043734 на плазмиде pMTL-tet3no.
Плечи гомологии размером -1Кб в 3'-5' и 5'-3' направлении от budA амплифицировали с помощью ПЦР из С. autoethanogenum с праймерами SN01/SN02 и SN07/SN08. Гены thlA и phaB гены амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК Cupriavidus necator с применением праймеров SN03/SN04mod. Кассету ermB, фланкированную сайтами loxP, амплифицировали с помощью ПЦР с применением праймеров SN05mod/SN06. Промотор tet3no, фланкированный FseI и PmeI, синтезировали, обрабатывали рестрикционными ферментами FseI и PmeI, и очищали. ПЦР-продукты и расщепленный вектор собирали с применением набора для клонирования GeneArt Seamless от Life Technologies; плазмиду pMTL8225budA::thlA-phaB (SEQ ID NO: 121) без мутаций во встроенных фрагментах применяли для трансформации С. autoethanogenum путем конъюгации согласно описанию в предыдущих примерах.
После конъюгации и выбора на триметоприме и кларитромицине, 9 колоний методом штриха в двух повторностях высевали на чашки с агаром PETC-MES с кларитромицином и ангидротетрациклином для индукции экспрессии генов mazF. В колониях в присутствии кларитромицина и ангидротетрациклина гены budA должны быть заменены на гены thlA и phaB и кассету ermB. Это верифицировали посредством ПЦР с применением праймеров Og31f/Og32r, фланкирующих плечи гомологии, и полимеразы КАРА (фиг. 15).
Полосу, соответствующую -3,3 Кб, амплифицируют из штамма дикого типа, тогда как полосу, соответствующую -5,7 Кб, амплифицировали из колоний 1, 4, 7 и 9, что указывает на замену гена budA на thlA, phaB и кассету ermB. Вышеуказанное событие дополнительно подтверждали путем секвенирования ПЦР-продуктов из всех 4 клонов. После итоговой модификации экспрессию генов thlA и phaB запускает промотор в 3'-5' направлении от гена budA.____________________________________________
SEQ ID NO: Описание Последовательность
122 SN01 ATTTACAAATTCGGCCGGCCTACCTCCTCGTATAAATAAGATG
123 SN02 CTAGCTATTACAACTTCTTTCATATTACATTCACCTCTATGTC
124 SN03 GACATAGAGGTGAATGTAATATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAG
125 SN04mod GTATAGCATACATTATACGAACGGTATTATCCCATGTGTAAACC ACCGT
126 SN05mod TTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTTAGAAGCAAACT TAAG
127 SN06 GTCTAGTGITTTTTTCTATCAATACTCTAGATACCGTTCGTATAG C
128 SN07 TGTATGCTATACGAACGGTAAGTATTGATAGAAAAAAACACTA GAC
129 SN08 CAAAAAGGAGTTTAAACAAAAAGTCATAAACCTGGATAAC
130 Og31f CCGTTTCTCACAACAACAATACCAG
131 Og32r AAACCACCTTGACGATGAAACCATA
Осуществляли ферментацию штамма С. autoethanogenum budA::thlA-phaB. Культуру выращивали при 37°С с синтетическим газом (50% СО, 18% CO2, 2 % H2 и 30% N2), который постоянно подавали в биореактор. Исходную скорость потока газа устанавливали на уровне 50 мл/мин, с последующим увеличением до 400 мл/мин в ходе эксперимента, а скорость перемешивания увеличивали от 200 об/мин до 500 об/мин. Ферментацию осуществляли на протяжении почти 5 дней. Метаболиты измеряли согласно описанию в примерах выше.
Концентрацию 1,3-бутандиола и других метаболитов, таких как 2-гидроксиизомасляная кислота, измеряли с применением газохроматографического (ГХ) анализа, используя систему для ГХ Agilent 6890N, оснащенную колонкой Agilent CP-SIL 5CB-MS (50 мх0,25 мкмх0,25 мкм), автоматическим пробозаборником и пламенно-ионизационным детектором (FID). Образцы получали путем разведения 400 мкл образца 400 мкл ацетонитрила с последующим 3-минутным центрифугированием при 14000 об/мин; супернатант переносили в стеклянный флакон и высушивали образец в Thermo SpeedVac. После высыхания образцы суспендировали в растворе, содержащем 400 мкл N,О-бис(трифторацетамида) (BSTFA) и пиридин (в соотношении 3:1) и нагревали в герметично закрытом стеклянном флаконе в течение 60 мин при 60°С. Образцы переносили в автоматический пробозаборник для анализа, вводя пробу объемом 1 мкл, с коэффициентом деления 30:1 и температурой на входе, составляющей 250°С. Хроматографию проводили с использованием программы термостата от 70°С (без удерживания) с нарастанием до 110°С со скоростью 3°С/мин, с нарастанием до 230°С со скоростью 15°С/мин, с последующим итоговым нарастанием со скоростью 40°С/мин до 310°С с 3-минутным удерживанием. Скорость потока через колонку составляла 1,8 мл/мин, гелий использовали в качестве газа-носителя. Температуру FID поддерживали на уровне 320°С; 40 мл/мин водорода, 400 мл/мин воздуха и 20 мл/мин гелия использовали в качестве поддувочного газа.
Неожиданным образом, штамм С. autoethanogenum budA::thlA-phaB, экспрессирующий thlA и phaB, продуцировал до 1,55 г/л 3-гидроксибутирата из газа (фиг. 16). Нативная тиоэстераза может конвертировать образующийся 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. В геномной последовательности были идентифицированы три гипотетических тиоэстеразы.
Что еще более неожиданно, было обнаружено, что помимо образования 3-гидроксибутирата, про
- 48 043734 исходило также образование до 150 мг/л 1,3-бутандиола (фиг. 16). Это может быть обусловлено активностью нативных альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы (AOR) и алкогольдегидрогеназы. В геноме С. autoethanogenum присутствуют два гена AOR и несколько генов алкогольдегидрогеназ (Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015). Указанное восстановление 3-гидроксибутирата приводит в действие восстановленный ферредоксин, и, соответственно, оно может быть прямо сопряжено с окислением СО, обеспечивающим образование восстановленного ферредоксина (СО+Fdox^CO2+Fdred) (фиг. 7).
Было также продемонстрировано продуцирование 1,3-BDO из газа через альтернативный маршрут с применением бутиральдегиддегидрогеназы Bld из Clostridium saccharoperbutylacetomcum (ААР42563.1) (SEQ ID NO: 80).
Ген bld синтезировали и клонировали совместно с той же тиолазой (thlA С. acetobutylicum) и (R)специфической 3-гидроксибутиратдегидрогеназой (phaB Cupravidus necator) в плазмиду pMTL8315-Pfdx-thlA-phaB-bld (SEQ ID NO: 132).
Гены Bld и phaB амплифицировали из вышеуказанной плазмиды с помощью праймеров, представленных в табл. ниже, и клонировали в существующую плазмиду pMTL85147-thlA (WO 2012/115527).
SEQ ID NO: Праймер Последовательность Направление
133 bld-phaB-Fl ACATGGGATAAGAAGGAGATATACATATGATAA AAG прямой
134 bld-pMTL-Rl CGTCGACTCTAGATTAACCTGCTAAAACACATCT TC прямой
135 pMTL-bld-Fl GTGTTTTAGCAGGTTAATCTAGAGTCGACGTCAC GC прямой
Итоговой конструкцией трансформировали С. autoethanogenum согласно описанию выше и проводили эксперимент с ростом в бутылях для сыворотки с 50 мл среды РЕТС, нагнетая до достижения давления 30 фунтов/кв. дюйм СО-содержащий газ сталелитейных производств (собранный на объекте New Zealand Steel в Гленбруке, Новая Зеландия) или синтетической смеси газов с таким же составом, 44% СО, 32% N2, 22% СО2, 2% Н2.
Было продемонстрировано продуцирование 1,3-BDO через указанный маршрут из газа (фиг. 17А), однако уровни продуцирования были ниже (до 67 мг/л 1,3-BDO), чем через маршрут с AOR и, в отличие от маршрута с AOR, наблюдалось влияние на рост при экспрессии гена bld относительно С. autoethanogenum дикого типа (фиг. 17В).
В другом эксперименте С. autoethanogenum, трансформированный плазмидой pMTL83159-phaBthlA согласно описанию в примере 2, продуцировал 0,33 и 0,46 г/л 3-ГБ и 1,3-BDO, соответственно, в эксперименте в бутылях в аутотрофных условиях согласно описанию в примере 2 (фиг. 40).
Пример 5.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование (S)-3-гидроксибутирата и 1,3бутандиола у С. autoethanogenum.
Конструировали плазмиду, которая экспрессирует тиолазу (thlA из С. acetobutylicum: SEQ ID NO: 136) и ^-специфическую 3-гидроксибутиратдегидрогеназу (hbd1 из С. kluyveri; SEQ ID NO: 137) под контролем либо промотора ферредоксина (Pfdx, выделенный из С. autoethanogenum; SEQ ID NO: 138), либо промотора пируват-ферредоксиноксидоредуктазы (Ppfor, выделенный из С. autoethanogenum: SEQ ID NO: 139). Указанную плазмида конструировали следующим образом: P-hbd1-rbs2-thlA собирали вместе и клонировали в вектор pMTL83151 (Heap, J Microbiol Meth, 78:79-85, 2009), используя рутинные способы молекулярного клонирования, в том числе расщепление рестрикционными ферментами с последующим лигированием, полимеразную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами, бесшовное клонирование (Thermo Fisher Scientific) и метод GeneArt Type IIs (Thermo Fisher Scientific). Оперон P-hbd1-rbs2thlA клонировали между сайтами рестрикции NotI и XhoI, обнаруживаемыми в области множественного клонирования плазмиды. Р является конститутивным промотором, который содержит интактный сайт связывания рибосомы (rbs). rbs2 (SEQ ID NO: 140) представляет собой сайт связывания рибосомы для экспрессии thlA. Осуществляли поэтапные процедуры амплификации Р, hbd1 и thlA с существующих матриц с праймерами, представленными ниже.
- 49 043734
SEQ ID NO: Название Последовательность Направление
141 Pfdx-Fl AAAGGTCTCCGGCCGCGCTCACTATCTGCG GAACC прямой
142 Pfdx-Rl TTTGGTCTCGAATTCTGTAACACCTCCTTAA TTTTTAG обратный
143 Ppfor-Fl AAAGGTCTCCGGCCGCAAAATAGTTGATAA TAATGCAGAG прямой
144 Ppfor-Rl TTTGGTCTCGAATTCCTCTCCTTTTCAAGCAT ATA обратный
145 hbdl-Fl AAAGGTCTCGAATTCAAAGATCTATGTCTAT TAAATCAGTTGCAG прямой
146 hbdl-Rl TTTGGTCTCCCTCCTTTCTATTTCTAATATGC GAAAAATCCTTTACC обратный
147 thlA-Fl AAAGGTCTCAGGAGGTGTTACATATGAAAG AAGTTGTAATAGCTAGTGC прямой
148 thlA-Rl TTTGGTCTCCTCGAGTATGGATCCCTAGCAC TTTTCTAGCAATATTGC обратный
Полимеразные цепные реакции проводили согласно описанию ниже с применением набора для ПЦР Кара Taq PCR Kit (Кара Biosystems). Температуру отжига устанавливали на уровне 56°С, удлинение в течение 1 мин. Проводили 30 циклов повторных ПЦР-реакций. После этого ПЦР-продукты обессоливали с применением набора DNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research Corporation).
Остов плазмиды pMTL83151 получали, проводя двойное расщепление NotI/XhoI с применением FastDigest NotI и FastDigest XhoI (Thermo Fisher Scientific), следуя предоставленному протоколу, с последующей обработкой щелочным фосфатом, с применением щелочной фосфатазы FastAP (Thermo Fisher Scientific) и следуя предоставленным протоколам. Затем расщепленный остов обессоливали с применением набора DNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research Corporation).
Сборку ПЦР-продуктов и остова плазмиды осуществляли с применением набора GeneArt Type IIs (Thermo Fisher Scientific). Затем итоговую плазмиду выделяли из экспрессирующего плазмиду хозяина E. coli с применением набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
Для введения собранных плазмид pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA и pMTL8315-Ppfor-hbdl-thlA, состоящих из оперонов, сначала плазмиду вводили в штамм E. coli CA434 посредством химической трансформации. После этого выполняли конъюгацию путем смешивания трансформированного штамма СА434 с хозяином-продуцентом С. autoethanogenum на твердой агаровой среде LB, и инкубации в анаэробной среде под давлением со смесью, состоящей из монооксида углерода и водорода, согласно описанию в примере 2. После конъюгации проводили отбор С. autoethanogenum на основании успешного роста на твердой среде, содержащей подходящий антибиотик и триметоприм для удаления оставшегося штамма E. coli CA434, в анаэробных условиях.
Штаммы С. autoethanogenum, несущие введенную плазмиду pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA или pMTL8315-Ppfor-hbdl-thlA, состоящую из оперона P-hbdl-rbs2-thlA, культивировали в 10 мл среды РЕТС в бутыли Schott объемом 250 мл, герметично закрывали резиновой пробкой и крышкой, и нагнетали до достижения давления 30 фунтов/кв. дюйм СО-содержащий газ сталелитейных производств (собранный на объекте New Zealand Steel в Гленбруке, Новая Зеландия) или синтетическую смесь газов с таким же составом, 44% СО, 32% N2, 22% CO2, 2% H2. Метаболиты измеряли согласно описанию в предыдущих примерах.
Неожиданным образом, в культурах С. autoethanogenum, экспрессирующих thlA и hbd1, присутствовал 3-гидроксибутират, продуцированный из газа (фиг. 18А). Нативная тиоэстераза может преобразовывать образующийся 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. В геномной последовательности были идентифицированы три гипотетических тиоэстеразы. В штамме, несущем pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA, обнаруживалось до 2,55 г/л 3-гидроксибутирата (фиг. 18А).
Что еще более неожиданно, было также обнаружено, что 3-гидроксибутират со временем преобразуется в 1,3-бутандиол; к окончанию роста штамм, несущий плазмиду pMTL8315-Pfdx-hbd1-thlA, продуцировал до 1,1 г/л 1,3-бутандиола (фиг. 18А). Это может быть обусловлено активностью нативных альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы (AOR) и алкогольдегидрогеназы. В геноме С. autoethanogenum присутствуют два гена AOR и несколько алкогольдегидрогеназ (Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015). Указанное восстановление 3-гидроксибутирата (и восстановление ацетата до этанола; фиг. 18В) приводит в действие восстановленный ферредоксин, и, соответственно, оно может быть прямо сопряжено с окислением СО, обеспечивающим образование восстановленного ферредоксина (СО+Fdox^CO2+Fdred) (фиг. 7).
Тот же самый штамм С. autoethanogenum, несущий плазмиду pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA, также тестировали в ходе непрерывной ферментации. Ферментацию осуществляли согласно описанию в предыдущем примере, однако культивирование переводили в непрерывный режим со скоростью разведения свежей средой, составляющей примерно 0,05, на 2 день и затем увеличивали до 1,0 на 3 день. Наблюдался высокий уровень продуцирования 3-гидроксибутирата, до 7 г/л, при продуцировании 1,3-BDO на уровне 0,5 г/л.
- 50 043734
Чтобы улучшить продуцирование (S)-3-rugpOKCu6yTupama и 1,3-бутандиола и избежать синтеза другой формы бутандиола (2,3-бутандиола), плазмиду pMTL-HBD-ThlA вводили в штамм с инактивированным путем продуцирования 2,3-бутандиола, у которого был удален ген ацетолактатдекарбоксилазы BudA (US9297026). Указанный нокаут budA элиминировал основной путь, ведущий к 2,3-BDO, увеличивая специфичность в отношении продуцирования 3-ГБ и 1,3-BDO. При экспрессии pMTL-HBD-ThlA штаммов с делецией budA достигалась специфичность, составляющая 15% (С-мол.%) как для 3-ГБ, так и для 1,3-BDO (фиг. 41).
Селективность (С-мол.%)
Ацетат14,7
Этанол64,9
2,3-BDO1,3
Биомасса3,7
3-ГБ10,4
1,3- BDO 5,0
Для сравнения, в штамме, экспрессирующем ту же плазмиду, pMTL83159-hbd-thlA, без нокаута budA, общая специфичность в отношении продуцирования 3-ГБ и 1,3-BDO в стационарном состоянии составляла только 6,9%
Селективность _________________________(С-мол.%)
Ацетат0,4
Этанол84,3
2,3-BDO6,2
Биомасса2,2
3-ГБ3,5
1,3-BDO3,4
Пример 6.
В указанном примере продемонстрировано, что система Ptb-Buk эффективна у С. autoethanogenum в отношении диапазона ацил-КоА, в том числе ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2гидроксиизобутирил-КоА
Систему Ptb-Buk экспрессировали из плазмиды в С. autoethanogenum и ее активность измеряли с применением анализа гидролиза КоА. Для этого гены ptb-buk из С. beijerinckii NCIMB8052 (GenBank NC_009617, позиция 232027..234147; Cbei_0203-204; NCBI-GeneID 5291437-38) амплифицировали из геномной ДНК С. beijerinckii NCIMB8052 и клонировали под контролем промотора пируватферредоксиноксидоредуктазы (Ppfor, выделенный из С. autoethanogenum; SEQ ID NO: 139) в вектор pMTL82251 (Heap, J Microbiol Meth, 78:79-85, 2009) с применением рутинных способов молекулярного клонирования, в том числе расщепления рестрикционными ферментами с последующим лигированием, полимеразной цепной реакции с перекрывающимися праймерами, бесшовного клонирования (Thermo Fisher Scientific) и GeneArt Type IIs (Thermo Fisher Scientific) согласно описанию в примере 5. Олигонуклеотиды описаны ниже.
SEQ ID NO: Название Последовательность Направление
149 Ppfor-F2 aaacagctatgaccgcGGCCGCAAAATAGT прямой
150 Ppfor-R2 ttactcatTGGATTCCTCTCCTTT обратный
151 Ptb-Buk-F2 ggaatccaATGAGTAAAAACTTTGATGAG прямой
152 Ptb-Buk-R2 caggcctcgagatctcCTAGTAAACCTTAGCTTGTTC обратный
Итоговую плазмиду pMTL82256-ptb-buk (SEQ ID NO: 153) вводили в С. Autoethanogenum согласно описанию в предыдущих примерах.
Анализы на гидролиз Ацил-КоА проводили следующим образом. Клетки С. autoethanogenum собирали при плотности OD 2 (поздняя экспоненциальная фаза) путем центрифугирования (14000 об/мин в течение 1 мин при 4°С). Клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера для лизиса (калий-фосфатный буфер, pH 8). Клетки лизировали с использованием циклов замораживания-размораживания (необязательно), обрабатывали ультразвуком 6x30 с амплитудой 20 на льду. Образцы центрифугировали в течение 10 мин при 14000 об/мин и 4°С и извлекали супернатант с растворимыми белками. Концентрацию белка измеряли, например, с помощью анализа методом Бредфорда.
Смесь для анализа содержала: 484 мкл калий-фосфатного буфера с pH 8,0, 1 мкл DTNB (конечная концентрация - 0,1 мМ), 10 мкл клеточного лизата и 5 мкл КоА (конечная концентрация - 500 мкМ). Все компоненты смешивали в кварцевой кювете (кювета объемом 1 мл с длиной считываемого пути 1 см), за исключением белка. Анализ начинали с добавления клеточного лизата с последующей реакцией в спектрофотометре при 405 нм, 30°С в течение 3 мин. Контроль без лизата анализировали для измерения автолиза ацил-КоА.
- 51 043734
Для определения активности рассчитывали наклон в линейной части кривой (обычно в течение первых 30 с). Количество белка нормировали и наклон делили на количество белка. Коэффициент экстинкции (14,150 М-1 см-1) использовали для расчета специфической активности в М/с/мг. Вычитали активность отрицательного контроля.
Анализ проводили с ацетоацетил-КоА, рацемической смесью 3-гидроксибутирил-КоА (3-ГБ-КоА) и 2-гидроксиизобутирил-КоА (2-ГИБ-КоА). Возможность искусственно низких скоростей гидролиза 3-ГБКоА и 2-ГИБ-КоА из-за потенциальных ограничений доступности субстрата изучали, повторяя анализы на гидролиз в лизатах С. autoethanogenum с использованием разных концентраций ацил-КоА, 500 и 200 мкМ.
Результаты анализа указывают на значимое увеличение гидролиза КоА в лизатах С. autoethanogenum, несущего плазмиду pMTL82256-ptb-buk, экспрессирующую систему Ptb-Buk, в отношении диапазона ацил-КоА, в том числе ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирил-КоА (фиг. 20А-В). Примечательно, что наблюдается также гидролиз КоА таких ацил-КоА, как 2гидроксиизобутирил-КоА, которые С. autoethanogenum дикого типа не гидролизует. Наблюдалась некоторая нативная активность гидролиза КоА в отношении ацетоацетил-КоА и 3-гидроксибутирил-КоА.
Пример 7.
В указанном примере продемонстрировано, что разрушение идентифицированных нативных генов тиоэстеразы повышает эффективность системы Ptb-Buk и КоА-трансферазы за счет увеличения популяции доступных ацил-КоА, таких как ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА или 2гидроксиизобутирил-КоА.
В отличие от системы Ptb-Buk, где энергия сохраняется в форме АТФ при преобразовании ацилКоА в соответствующие кислоты, при простом гидролизе КоА сохранения энергии не происходит.
В анализах на гидролазу было обнаружено, что у С. autoethanogenum присутствует нативная активность гидролиза в отношении ацетоацетил-КоА и 3-гидроксибутирил-КоА.
Анализы на гидролиз ацил-КоА проводили с ацетоацетил-КоА, рацемической смесью 3гидроксибутирил-КоА (3-ГБ-КоА) и 2-гидроксиизобутирил-КоА (2-ГИБ-КоА) согласно описанию в предыдущем примере. Результаты указанного анализа указывают на расщепление ацетоацетил-КоА и 3-ГБКоА, однако не 2-ГИБ-КоА, и подтверждают наличие нативной активности у С. autoethanogenum (фиг. 11).
Анализ генома С. autoethanogenum привел к идентификации трех гипотетических КоА-тиоэстераз (гидролаз сложных тиоэфиров), которые могут отвечать за расщепление тиоэфирной связи ацетоацетилКоА или 3-гидроксибутирил-КоА. Они также присутствуют у других ацетогенов, таких как С. ljungdahlii.
Описание Аннотация С. autoethanogenum SEQ ID NO: C. Ijungdahlii SEQ ID NO:
Тиоэстераза 1 (CAETHGJ)718) Пальмитоил-КоАгидролаза AGY74947.1 154 ADK 15695.1 157
Тиоэстераза 2 (CAETHGJ524) 4- Гидроксибензоил- КоА-тиоэстераза AGY75 747.1 155 ADK16655.1 158
Тиоэстераза 3 (CAETHGJ780) Г ипотетическая тиоэстераза AGY75 999.1 156 ADK16959.1 159
Инактивация указанных трех гипотетических КоА-тиоэстераз приводит к более высоким титрам продуктов, увеличивая эффективность системы Ptb-Buk. Указанные три гипотетических тиоэстеразы инактивировали с применением технологии ClosTron. Вкратце, нацеливающий домен Ltr типа II перепрограммировали, используя интернет-сайт ClosTron, и перенаправленные плазмиды ClosTron заказывали у DNA 2.0. Нокаутные векторы ClosTron pMTL007C-E2-Cau-2640-571s, нацеленный на тиоэстеразу 1 (CAETHG_0718), pMTL007C-E2-PBor3 782- 166s, нацеленный на тиоэстеразу 2 (CAETHG_1524), и pMTL007C-E2-PBor4039-199s, нацеленный на тиоэстеразу 3 (CAETHG_1780), вводили в С. autoethanogenum с применением конъюгации.
Выбор на основании интеграции проводили путем отбора на среде РЕТС с добавлением 5 мкг/мл кларитромицина; успешную инактивацию в результате интеграции интрона типа II подтверждали с помощью ПЦР для всего сайта встраивания.
Активность КоА-гидролазы в отношении ацетоацетил-КоА как С. autoethanogenum дикого типа, так и каждого из С. autoethanogenum с одним из гипотетических инактивированных генов измеряли с применением описанного выше анализа. Было показано, что все три штамма с инактивированными гипотетическими тиоэстеразами демонстрируют меньшую активность гидролиза в отношении ацетоацетил-КоА и 3-гидроксибутирил-КоА (фиг. 21А-В).
Чтобы продемонстрировать, что уменьшение активности КоА-гидролазы и, соответственно, увеличение популяции ацетоацетил-КоА, является благоприятным для продуцирования происходящих из ацетоацетил-КоА продуктов, плазмиду с изопропанолом pMTL85147-thlA-ctfAB-adc, кодирующую
- 52 043734 thl+ctfAB+adc (WO 2012/115527), вводили в штамм С. autoethanogenum дикого типа и штамм с инактивированной тиоэстеразой 1. Эксперимент с ростом проводили в 40 мл среды РЕТС в бутыли Schott объемом 1 л в технических трипликатах с газом Со при 37°С при встряхивании на 110 об/мин. Синтетический газ (50% СО, 18% CO2, 2% H2 и 30% N2) использовали в качестве единственного источника энергии и углерода. Паровую фазу заменяли один раз и заполняли синтетическим газом, доводя давление до 21 фунт/кв. дюйм (1,5 бар) при 37°С (50% СО, 18% CO2, 2% Н2 и 30% N2). Образцы для определения OD и аналитических данных собирали дважды в сутки.
Штамм с инактивированной тиоэстеразой 3 CAETHG_1780 продуцировал значимо более высокие уровни изопропанола по сравнению со штаммом дикого типа (фиг. 22 и 23A-D).
Аналогичным образом, нокаут тиоэстераз у С. autoethanogenum может увеличивать популяцию 3гидроксибутирил-КоА, обеспечивая более эффективную утилизацию 3-гидроксибутирил-КоА парой PtbBuk и приводя к более высоким уровням продуцируемых ацетона, изопропанола, изобутилена, (R)-3гидроксибутирата, 1,3-бутандиола и/или 2-гидроксиизомасляной кислоты. При введении плазмиды pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA из примера 5 в штамм С. autoethanogenum. с разрушенной тиоэстеразой 2 CAETHG_1524 синтез 3-гидроксибутирата прекращался (при этом при экспрессии указанной плазмиды в штамме С. autoethanogenum дикого типа наблюдали до 2,55 г/л 3-гидроксибутирата). В указанном штамме отсутствует конкурентная активность в отношении 3-гидроксибутирил-КоА.
Указанные результаты демонстрируют, что путем уменьшения активности тиоэстераз можно добиться более высоких уровней популяции КоА, доступного для системы Ptb-Buk и синтеза продуктов.
Кроме того, продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO может быть увеличено путем избыточной экспрессии ptb-buk. В контрольном эксперименте, когда С. autoethanogenum согласно описанию в примере 2 трансформировали плазмидами pMTL83159-phaB-thlA из примера 4, плюс pMTL82256 (Heap, J Microbiol Methods, 78: 79-85, 2009), последняя из которых представляет собой пустую плазмиду, используемую в качестве фонового контроля, ферментация такого штамма приводила к продуцированию 3-ГБ с максимальным титром 1,68 г/л на 10 день (фиг. 42А). Когда вместо пустой плазмиды pMTL82256 в С. autoethanogenum с pMTL83159-phaB-thlA коэкспрессировали плазмиду pMTL82256-buk-ptb, ферментация приводила к получению более высокого титра 3-ГБ, 4,76 г/л, в более ранний период, на 4 день (фиг. 42В).
Удаление нативных тиоэстераз повышает эффективность системы Ptb-Buk, которой свойственно предпочтение (R)-3-ГБ-KoA. Локус гена тиоэстеразы в геноме удаляли и заменяли на фрагмент ДНК bukptb посредством обычной молекулярно-биологической методики, известной как гомологичная рекомбинация. Замену гена тиоэстеразы на buk-ptb подтверждали с помощью ПЦР, с последующим электрофорезом в агарозном геле и секвенированием ДНК.
В эксперименте в бутылях, когда pMTL83156-phaB-thlA экспрессировали без ptb-buk у мутанта с делецией тиоэстеразы, описанного выше, средний максимальный титр продуцированного 3-ГБ составлял 0,50±0,05 г/л, аналогично титру, полученному с применением немодифицированного штамма С. autoethanogenum. При коэкспрессии pMTL82256-buk-ptb с плазмидой pMTL83156-phaB-thlA в штамме с нокаутированной тиоэстеразой продуцирование 3-ГБ увеличивалось до 1,29±0,10 г/л (фиг. 43).
Пример 8
В указанном примере продемонстрирована возможность элиминации системы продуцирования ацетата у ацетогена С. autoethanogenum системой Ptb-Buk.
Продуцирование ацетата описано у всех ацетогенных микроорганизмов (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes , 3rd edition, pages 354-420, New York, NY, Springer, 2006), поскольку продуцирование ацетата обеспечивает микроорганизму возможность прямо генерировать АТФ при субстратном фосфорилировании с помощью Pta (фосфотрансацетилазы) и Ack (фосфотрансацетилазыацетаткиназы). Нативные образующие ацетат ферменты, такие как Pta-Ack, соответственно, считаются имеющими существенное значение для ацетогенов (Nagarajan, Microb Cell Factories, 12: 118, 2013). Поскольку Ptb-Buk обеспечивает альтернативный способ генерирования энергии, становится возможной замена нативной системы Pta-Ack на Ptb-Buk.
Гены pta и ack у С. autoethanogenum находятся в одном опероне. Для замены генов pta и ack генами ptb и buk собирали плазмиду, pMTL8225-pta-ack::ptb-buk (фиг. 24), с контрселективным маркером mazF под контролем тетрациклинового индуцируемого промотора, плечом гомологии размером ~1Кб в 3'-5' направлении, ptb, buk, кассетой ermB, фланкированной сайтами loxP и плечом гомологии размером ~1Кб в 5'-3' направлении (SEQ ID NO: 160).
Плечи гомологии размером ~1Кб в 3'-5' и 5'-3' направлении амплифицировали с помощью ПЦР из С. autoethanogenum с праймерами SN22f/ SN23r и SN28f/ SN29r. Ptb и buk гены амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pIPA_16 с применением праймеров SN24f/SN25r. Кассету ermB с сайтами loxP амплифицировали с помощью ПЦР с применением праймеров SN26f/SN27r. Остов плазмиды амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами SN30f/SN31r. Полимеразу КАРА использовали для всех ПЦРамплификаций. ПЦР-продукты собирали с применением набора для клонирования GeneArt Seamless от Life Technologies; плазмиду без мутаций во встраиваемых фрагментах применяли для трансформации С. autoethanogenum путем конъюгации согласно описанию выше.
- 53 043734
После конъюгации и выбора на триметоприме и кларитромицине, 7 колоний методом штриха в двух повторностях высевали на чашки с агаром PETC-MES с кларитромицином и ангидротетрациклином для индукции экспрессии генов mazF. В колониях в присутствии кларитромицина и ангидротетрациклина гены pta и ack должны быть заменены на гены ptb и buk и кассету ermB. Это верифицировали посредством ПЦР с применением праймеров Og29f/Og30r, фланкирующих плечи гомологии, и полимеразы КАРА (фиг. 25). Полосу, соответствующую ~4,6 Кб амплифицировали из штамма дикого типа, а полосы, соответствующие ~5,7 Кб амплифицировали из колоний 1 и 4-7, что указывает на замену генов pta и ack генами ptb и buk и кассетой ermB. Вышеуказанное событие дополнительно подтверждали путем секвенирования ПЦР-продуктов из клонов 4-7.
После итоговой модификации экспрессию генов ptb и buk запускает промотор в 3'-5' направлении от гена pta. ___________________________________________________________________________________
SEQ ID NO: Название Последовательность
161 SN22f TTTACAAATTCGGCCGGCCAAAGATTGCTCTATGTTTAAGCT
162 SN23r CATCAAAGITTTTACTCATCAATTTCATGTTCATTTCCTCCCT
163 SN24f AGGGAGGAAATGAACATGAAATTGATGAGTAAAAACTTTGATGAGT
164 SN25r GTATAGCATACATTATACGAACGGTACTAGTAAACCTTAGCTTGTTCT TC
165 SN26f GAAGAACAAGCTAAGGTTTACTAGTACCGTTCGTATAATGTATGCTAT AC
166 SN27r AGAGATGAGCATTAAAAGTCAAGTCTACCGTTCGTATAGCATACA
167 SN28f TGTATGCTATACGAACGGTAGACTTGACTTTTAATGCTCATCTCT
168 SN29r CATGAGATTATCAAAAAGGAGTTTAAATATCTATTTTGTCCTTAGGA
169 SN30f TCCTAAGGACAAAATAGATATTTAAACTCCTTTTTGATAATCTCATG
170 SN31r AGCTTAAACATAGAGCAATCTTTGGCCGGCCGAATTTGTAAA
171 Og29f AGCCACATCCAGTAGATTGAACTTT
172 Og30r AATTCGCCCTACGATTAAAGTGGAA
Итоговый штамм С. autoethanogenum pta-ack::ptb-buk, в котором оперон pta-ack заменяли на оперон ptb-buk, трансформировали согласно описанию выше обеспечивающей продуцирование изопропанола плазмидой pMTL85147-thlA-adc из примера 2. Проводили исследование роста в аутотрофных условиях и анализировали конечные продукты метаболизма. Продуцирования ацетата не наблюдалась, тогда как изопропанол (до 0,355 г/л) и 3-ГБ (до 0,29 г/л) по-прежнему продуцировался наряду с этанолом и 2,3бутандиолом (фиг. 39А и 39В). Это демонстрирует, что возможно продуцирование изопропанола и 3-ГБ без продуцирования ацетата из газообразных субстратов, CO и/или CO2 и H2 с применением системы PtbBuk.
В том случае, если целевым продуктом является ацетон, а не изопропанол, ген первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (SEQ ID NO: 17) может быть дополнительно нокаутирован в указанном штамме С. autoethanogenum pta-ack::ptb-buk с применением способов, описанных выше и подробно описанных в WO 2015/085015. Введение плазмиды pMTL85147-thlA-adc в указанный штамм приводит к продуцированию ацетона на уровнях, аналогичных уровням, описанным выше для изопропанола, без ко-продукции ацетата. Этанол, 2,3-бутандиол и 3-ГБ могут представлять собой дополнительные продукты.
Дополнительные нокауты могут позволить элиминировать также и указанные продукты, например, нокаут гена ацетолактатдекарбоксилазы BudA приводит к получению штамма, неспособного продуцировать 2,3-бутандиол (US9297026). Продуцирование 3-ГБ может быть снижено или элиминировано путем удаления гена 3-гидроксибутиратдегидрогеназы Bdh (SEQ ID NO: 62).
Пример 9
В указанном примере продемонстрировано улучшение преобразования 3-гидроксибутирата в 1,3BDO путем избыточной экспрессии гена альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы aor1.
Остов плазмиды pMTL82251 использовали для избыточной экспрессии гена aorl С. autoethanogenum. Плазмида pMTL82251 была выбрана, поскольку она имеет другую точку начала репликации и маркерный антибиотик, однако может быть коэкспрессирована с плазмидой, используемой в примере 5, содержавшей hbd1 и thlA. Получение остова плазмиды и реакцию сборки осуществляли после проведения процедур, представленных выше, с получением сначала плазмиды pMTL82256 путем введения промотора ферредоксина С. autoethanogenum в плазмиду pMTL82251 с последующим добавлением генов aorl с образованием плазмиды pMTL82256-aor1. Использовали перечисленные ниже праймеры.
- 54 043734
SEQ ID NO: Название Последовательность Направление
173 Pfdx-Fl AAAGGTCTCCGGCCGCGCTCACTATCTGCGGAACC прямой
174 Pfdx-Rl TTTGGTCTCGAATTCTGTAACACCTCCTTAA1TTTT AG обратный
175 aorl-Fl AAAGGTCTCGAATTCAAAGATCTATGTATGGTTAT GATGGTAAAGTATTAAG прямой
176 aorl-RI TTTGGTCTCCTCGAGTATGGATCCCTAGAACTTACC TATATATTCATCTAATCC обратный
После трансформации штамма Е. coli CA434 итоговой плазмидой pMTL82256-aor1 выполняли конъюгацию с предыдущим хозяином-продуцентом С. autoethanogenum 1,3-BDO. Соответственно, итоговый штамм С. autoethanogenum был носителем двух плазмид, одна из которых избыточно экспрессировала hbd1 и thlA, а другая - aor1, с разными точками начала репликации и селективным маркером. Продуцирование 1,3-BDO характеризовали и количественно описывали согласно процедурам, представленным выше.
Результаты ясно показывают, что продуцирование 1,3-BDO может быть улучшено путем избыточной экспрессии aor1. Аналогичным образом, в С. autoethanogenum могут быть экспрессированы другие гены альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы для облегчения преобразования 3-гидроксибутирата в 1,3бутандиол.
Для улучшения продуцирования 1,3-BDO AOR избыточно экспрессировали для улучшения преобразования 3-ГБ в 3-ГБ-альдегид. С этой целью pMTL82256-hbd-thlA и pMTL83159-aor1 коэкспрессировали в С. autoethanogenum. По сравнению со штаммом, несущим отдельно pMTL82256-hbd-thlA, штамм с коэкспрессией aorl продуцировал больше этанола и 1,3-BDO (фиг. 44).
Пример 10
В указанном примере продемонстрирована стереоспецифичность Ptb-Buk, позволяющая получать 2-гидроксиизомасляную кислоту без получения нежелательных побочных продуктов.
2-гидроксиизомасляная кислота может быть продуцирована в E. coli и С. autoethanogenum путем введения тиолазы и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы для преобразования ацетил-КоА в 3гидроксибутирил-КоА, фермента 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазы для преобразования 3гидроксибутирил-КоА в 2-гидроксиизобутирил-КоА, и фермента, который может гидролизовать КоА с образованием 2-гидроксиизомасляной кислоты. 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа может быть либо (R)-, либо ^-специфической, и фермент, преобразующий 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксибутират в соответствии с этапом 1, 13, 19 и 20 согласно фиг. 1. Указанный последний этап может быть осуществлен с помощью тиоэстеразы или системы Ptb-Buk.
Три потенциальных кандидатных гена, тиоэстераза Е. coli типа II TesB, пару фосфатацетилтрансфераза/ацетаткиназа из С. autoethanogenum и пару бутирилтрансфераза/бутираткиназа из С. beijerinckii клонировали в экспрессионные векторы E. coli pDUET T7 с применением способов, описанных выше, и праймеров, приведенных ниже.
SEQ ID NO: Праймер Последовательность
177 pETDuet-pta-ack ack-DuetI2-Rl GGGTACCTTATTTATTTTCAACTATTTCTTTTGTATC
178 pETDuet-pta-ack DuetI2 -ack-Fl TTGAAAATAAATAAGGTACCCTCGAGTCTGGTAAAG
179 pETDuet-pta-ack DuetI2-pta-Rl TTTTTTCCATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAAC
180 pETDuet-pta-ack pta-DuetI2-Fl AGGAGATATACATATGGAAAAAATTTGGAGTAAGGC
181 pETDuet-tesB DuetI2-tesB-Fl GAAATCATAATTAAGGTACCCTCGAGTCTGGTAAAG
182 pETDuet-tesB - DuetI2-tesB-Rl CCTGACTCATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAAC
183 pETDuet-tesB - tesB- DuetI2-Fl AAGAAGGAGATATACATATGAGTCAGGCACTTAAAA
184 pETDuet-tesB testB-DuetI2-Rl AGGGTACCTTAATTATGATTTCTCATAACACCTTC
- 55 043734
Полученные плазмиды pDUET-pta-ack (SEQ IDNO: 185), pDUET-ptb-buk (SEQ ID NO: 186), pDUET-tesB (SEQ ID NO: 187) вводили в BL21(DE3) E. coli для экспрессии и затем анализировали активность в отношении ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирил-КоА. Результаты показаны на фиг. 27. BL21 E. coli обладает незначительной, но измеряемой активностью в отношении всех трех субстратов. Для Pta-Ack было показано отсутствие активности, превышающей фоновую, тогда как и тиоэстераза TesB, и Ptb-Buk показали высокую активность в отношении всех трех субстратов, в том числе 2-гидроксиизобутирил-КоА.
Активность и тиоэстеразы TesB, и Ptb-Buk была выше в отношении линейного ацетоацетил-КоА, 3гидроксибутирил-КоА, по сравнению с разветвленным 2-гадроксиизобутирил-КоА. Это создает проблему для указанного пути, поскольку приводит к ранней терминации пути на уровне 3-гидроксибутирилКоА, в частности, из-за активности, более высокой, чем активность в отношении фермента 2гидроксиизобутирил-КоА-мутазы.
Однако Ptb-Buk, в отличие от тиоэстераз, способна различать стереоизомеры и действует исключительно (или преимущественно) на (R)-3-гидроксибутирил-КоА, но не на (S)-3-гидроксибутирил-КоА. Это было продемонстрировано путем экспрессии системы Ptb-Buk либо с ThlA и ^-специфической Hbd (фиг. 28А) или ^-специфической phaB (фиг. 28В) в системе pDuet у Е. coli. Указанные конструкции конструировали согласно описанию в примерах 1 и 3. Исследования роста подтвердили, что образование поддающихся оценке количеств 3-гидроксибутирата происходило только при экспрессии Ptb-Buk в комбинации с ^специфической Hbd, но не с ^-специфической phaB.
Соответственно, маршрут через ^-специфическую 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу и PtbBuk обеспечивает значимые преимущества, поскольку система Ptb-Buk (в отличие от тиоэстеразы) не активна в отношении (S)-3-гидроксибутирил-КоА, но (S)-3-гидроксибутирил-КоА также является предпочтительным изомером для 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазы (Yaneva, J Biol Chem, 287:15502-15511, 2012). Продуцированная 2-гидроксиизобутирил-КоА может затем быть использована Ptb-Buk для продуцирования 2-гидроксиизомасляной кислоты, и (в отличие от тиоэстеразы) гидролиз 2гидроксиизобутирил-КоА обеспечивает дополнительную энергию (фиг. 8).
Разрабатывали модульные конструкции для сравнения производительности указанного пути. Генную кассету, содержащую промотор Вуда-Льюнгдаля перед генами meaB, hcmA и hcmB, кодоноптимизировали и синтезировали (SEQ ID NO: 188). HcmA и hcmB кодируют 2-гидроксиизобутирилКоА-мутазу, а meaB - шаперон из Aquincola tertiaricarbonis; в указанной конструкции гены hcmA и meaB сливали в один белок согласно описанию (SEQ ID NO: 189) (Yaneva, J Biol Chem, 287: 15502-15511, 2012). Генную кассету клонировали либо в плазмиду, содержащую тиолазу (thlA из С. acetobutylicum: SEQ ID NO: 136) и ^-специфическую 3-гидроксибутиратдегидрогеназу (hbd из С. acetobutylicum·, SEQ ID NO: 190) (pMTL83155-thLA-hbd), либо ^-специфическую 3гидроксибутиратдегидрогеназу (p^B^R- eutropha) (pMTL83155-thlA-phaB), с применением рестрикционных ферментов Kpnl и Ncol, с образованием плазмид pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB (SEQ ID NO: 191) и pMTL83155-thlA-phaB-PwlmeaBhcmA-hcmB (SEQ ID NO: 192), соответственно. Субклонирование кодон-оптимизированной 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазной кассеты в Е. coli Top-10 прошло успешно, однако после некоторых начальных сложностей; было обнаружено, что 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазная кассета может быть клонирована в плазмиду при более низкой температуре (28°С).
Для получения векторов pMTL83I55-thlA-hbd и PMTL83155-thlA-PhaB сначала амплифици ровали промоторную область фосфатацетилтрансферазы С. autoethanogenum (SEQ ID NO: 193) и клонировали в вектор pMTL83151 (FJ797647.1; Heap, J Microbiol Meth, 78:79-85, 2009) с применением сайтов рестрикции NotI и NdeI до введения генов thlA и hbd или, соответственно, phaB, с помощью NdeI и KpnI в реакции двойного лигирования.
Кроме того, собирали совместимые плазмидные модули для экспрессии ptb-buk или tesB.
Для этого соответствующие гены амплифицировали из геномной ДНК и вводили в плазмиду pMTL82256, описанную в примере 9, а затем вводили ptb-buk или phaB с применением NdeI и NcoI и набора для клонирования Seamless (Life Technologies) с образованием плазмид pMTL82256-ptb-buk (SEQ ID NO: 194) и pMTL82256-tesB (SEQ ID NO: 195).
Плазмиды pMTL83155 -thlA -hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB, pMTL83155-thlA-phaB-Pwl meaBhcmA-hcmB, pMTL82256-ptb-buk и pMTL82256-tesB вводили в E. coli Top-10 (все этапы проводили при 28°С) и С. autoethanogenum путем трансформации согласно описанию в предыдущих примерах, в следующих комбинациях:
- 56 043734 pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk, pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB, pMTL83155thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk и pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmAhcmB + pMTL82256-tesB.
Эксперименты с ростом проводили на E. coli в среде LB при 30°С в течение 4 дней, и с С autoethanogenum на среде РЕТС с содержащим 30 фунтов/кв. дюйм CO газом сталелитейных производств (собранным на объекте New Zealand Steel в Гленбруке, Новая Зеландия) при 30°С и 37°С в течение 6 дней. Метаболиты измеряли согласно описанию выше. Помимо измерения с помощью ГХ-МС, продуцирование 2-гидроксиизомасляной кислоты также подтверждали с применением жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) и 1Н ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии.
Данные жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) регистрировали с использованием системы жидкостной хроматографии Dionex UltiMate 3000 (Dionex, Калифорния, США), сопряженной с масс-спектрометром ABSciex 4000 QTRAP (ABSciex, Конкорд, Канада). Указанной системой жидкостной хроматографии управляли через программное обеспечение Chromeieon (Dionex), и хроматографическое разделение проводили, вводя пробу объемом 10 мкл на колонку Gemini-NX C18 150 ммх2 мм (внутр. диаметр), с гранулами 3 мкм и пористостью 110 A (Phenomenex, Ашаффенбург, Германия), оснащенную предколонкой-картриджем Security Guard Gemini-NX C18 4 ммх2 мм (внутр. диаметр). Температуру термостата колонки контролировали и поддерживали на уровне 55°С на всем протяжении сбора данных; использовали следующие подвижные фазы: 7,5 мМ водный трибутиламин со значением pH, доведенным до 4,95 (±0,05) с ледяной уксусной кислотой (элюент А) и ацетонитрил (элюент В). Скорость потока подвижных фаз поддерживали на уровне 300 мкл/мин для всего профиля градиента; и подвижные фазы вводили прямо в масс-спектрометр без деления потока. Масс-спектрометром управляли с использованием программного обеспечения Analyst 1.5.2 (ABSciex), он был оснащен источником электроспрея TurboV, эксплуатируемом в режиме отрицательной ионизации. Использовали следующие оптимизированные ранее (и, соответственно, общие) показатели для получения запланированных данных методом мониторинга множественных реакций (MRM): напряжение ионного распыления 4500В, распылитель (GS1), вспомогательный газ (GS2), газовая завеса (CUR) и газ для соударений (CAD) - 60, 60, 20 и Среднее (условные единицы), соответственно, получены с помощью генератора азота N300DR (Peak Scientific, Массачусетс, США). Температуру вспомогательного газа поддерживали на уровне 350°С. Входной потенциал (ЕР) составлял -10 Вольт. Указанный способ также позволяет детектировать и отделять 2-гидроксимасляную кислоту.
1Н ядерная магнитно-резонансная (ЯМР) спектроскопия при напряженности поля 400 МГц. Образцы получали путем разведения 400 мкл образца 400 мкл 20 мМ фосфатного буфера, приготовленного с D2O и содержащего триметилсилилпропионовую кислоту (TMSP) в качестве внутреннего стандарта (pH=7). Указанные образцы затем переносили в стеклянную пробирку для ЯМР (5 ммх8 дюймов) и анализировали посредством 1Н ЯМР с применением предварительного насыщения для подавления сигнала воды с импульсом возбуждения 30°, релаксационной задержкой 15 с и 64 сканированиями при температуре 27°С. После получения спектра его трансформировали, сглаживали и интегрировали с применением программного обеспечения Agilent VnmrJ. TMSP в известной концентрации использовали для количественного определения 2-гидроксиизобутирата с использованием резонанса в области 1,36 м.д. (синглет).
И в E. coli, растущей в гетеротрофных условиях, и в С. autoethanogenum, растущей в автотрофных условиях, 2-гидроксиизомасляная кислота может быть детектирована в конструкциях pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB (1,5 мг/л согласно способу ЖХ-МС/МС, и 8 мг/л при ГХ-МС в С. autoethanogenum; 0,5 мг/л согласно способу ЖХ-МС/МС и 2 мг/л согласно ГХ-МС у E. coli) и pMTL83155-thlA-phaB-Pwl-meaBhcmA-hcmB+ pMTL82256-ptb-buk (15 мг/л согласно способу ЖХ-МС/МС и 75 мг/л согласно ГХ-МС у С. autoethanogenum; 1,1 мг/л согласно способу ЖХ-МС/МС и 8,5 мг/л согласно ГХ-МС у E. coli), однако не в каких других конструкциях, в том числе контрольной. Безусловно, максимальное продуцирование происходило в штамме, несущем плазмиду pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82236-ptb-buk (в до раз выше, чем для всех других маршрутов), содержащем оптимальный путь с тиолазой, (S)-специфической ^-специфической 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой, 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазой и системой Ptb-Buk (фиг. 29A-D). Неожиданным образом, также обнаружено, что указанный штамм продуцирует 2гидроксибутират (2-ГБ) (до 64 мг/л согласно ЖХ-МС/МС и 50 мг/л согласно ГХ-МС у С. autoethanogenum.; 12 мг/л согласно ЖХ-МС/МС и 9,5 мг/л согласно ГХ-МС у E. coli), что указывает на неспецифическую мутазную активность (фиг. 30). То же самое было обнаружено в штамме tesB, однако в данном случае на значимо более низких уровнях (18 мг/л согласно ЖХ-МС/МС и 9 мг/л согласно ГХ-МС у С. autoethanogenum). Продуцирование 2-гидроксиизомасляной кислоты также подтверждали с помощью ЯМР.
Кроме того, проводили также количественную ПЦР в реальном времени (кРВ-ПЦР) для подтвер- 57 043734 ждения экспрессии генов thlA, hbd, meaBhcmA и hcmB (фиг. 31).
Графики РВ-ПЦР показывают, что продукт гена thlA экспрессируется на немного более высоких уровнях с промотором Ppta-ack, чем hbd (что ожидалось для второго гена в опероне), и что htncB демонстрирует немного более низкие уровни экспрессии, чем meaBhcmA. Также при 30°С в С. autoethanogenum, наблюдаются более низкие уровни экспрессии, чем при 37°С, и в E.coli при 30°С. Циклоспецифические значения приведены ниже.
Условия Мишень Среднее Cq Стандартное отклонение Cq
Е. coli / 30 °C thlA 18,26 0,243
hbd 20,6 0,603
meaBhcmA 16,20 0,108
hmcB 18,30 0,666
С. autoethanogenum / 30 °C thlA 26,10 0,169
Hbd 27,54 0,415
meaBhcmA 20,63 0,604
hmcB 22,64 0,697
С. autoethanogenum / 37 °C thlA 18,48 0,069
hbd 21,85 0,222
meaBhcmA 16,72 0,119
hmcB 19,62 0,173
Отношение (S)-3-гидроксимасляной кислоты к (R)-3-гидроксимасляной кислоте измеряли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на системе для ЖХ Agilent 1260 Infinity с УФ-детекцией на 210 нм. Образцы получали путем центрифугирования при 14000 об/мин в течение 3 минут, с последующим испарением 200 мкл супернатанта до сухого остатка. Затем осадок ресуспендировали в 100% изопропаноле и обрабатывали ультразвуком при нагревании в течение 1 ч. Центрифугирование повторяли и супернатант переносили во флакон для ВЭЖХ для анализа. Разделение осуществляли, вводя пробу объемом 5 мкл на колонку TCI Chiral MB-S (250 ммх4,6 ммх3 мкм) со скоростью 1,5 мл/мин и 40°С в изократических условиях, с применением в качестве подвижной фазы 955 гексан-изопропанола с 0,1% трифторуксусной кислоты.
Проводили стереоспепифический анализ продуцированной 3-ГБ. Неожиданным образом было обнаружено, что С. autoethanogenum продуцировал смесь изомеров. Согласно описаниям, ферменты Hbd и PhaB являются стереоспецифическими, PhaB является R-специфическим, Hbd - S-специфическим; при экспрессии указанных ферментов в E.coli наблюдали стереоизомерически чистый продукт (Tseng, Appl Environ Microbiol, 75:3137-3145, 2009).
Приведенная ниже таблица указывает на равновесное распределение (R)- и (S)-форм 3-ГБ, продуцированных посредством трех разных маршрутов у С. autoethanogenum. Эти данные указывают на присутствие изомеразы в С. autoethanogenum.
Маршрут % R-формы % S-формы
ThlA - PhaB 55 ±7 53 ±5
ThlA - HBD 12 ±3 88 ±3
ThlA - ctfAB 16 ±7 84 ±7
Нокаут нативных изомераз может предотвращать взаимопревращение (R)- и (S)-форм 3-ГБ. Как вариант, экспрессия или избыточная экспрессия изомераз может обеспечивать новые маршруты для ptbbuk. Например, Hbd может быть использована для получения (S)-3-ГБ, изомераза может преобразовывать (S)-3-ГБ в (R)-3-ГБ, и ptb-buk может действовать на (R)-3-ГБ с продуцированием представляющих интерес продуктов.
Пример 11.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование изобутилена с помощью Ptb-Bukпреобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерат.
Были описаны разные маршруты продуцирования изобутилена, например, преобразование ацетона в изобутилен с помощью гидроксиизовалератсинтазы и декарбоксилазы (van Leeuwen, Appl Microbiol Biotechnol, 93:1377-1387, 2012). Однако этап гидроксиизовалератдекарбоксилазы является этапом, требующим АТФ, и кинетика указанного фермента может быть неидеальной. Были идентифицированы два ведущих к изобутилену задействующих систему Ptb-Buk альтернативных маршрута через 3- 58 043734 гидроксиизовалерил-КоА, который, как было показано in vitro, представляет собой подходящий субстрат для системы Ptb-Buk (Liu, Appl Microbiol Biotechnol, 53:545-552, 2000).
Альтернативный путь 1 состоит из синтазы, которая преобразует ацетон в 3-гидроксиизовалерилКоА (фиг. 9).
Альтернативный путь 2 проходит через известный промежуточный продукт биосинтеза изолейцина 3-метил-2-оксопентаноат, общий для бактерий, таких как E. coli или С. autoethanogenum (фиг. 10).
Пример 12.
В указанном примере описаны способы определения характеристик вариантов Ptb-Buk.
Принимая во внимание субстратную неизбирательность Ptb-Buk, предполагают, что системы PtbBuk с варьирующими последовательностями аминокислот обладают варьирующими предпочтениями в отношении определенных субстратов. Для идентификации системы Ptb-Buk, отдающей предпочтение требуемому субстрату (например, ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА, 2-гидроксиизобутирилКоА, ацетил-КоА и/или бутирил-КоА), желательно проведение высокопроизводительного скрининга. Такой скрининг может осуществляться путем сопряжения люциферазы светлячков (Luc) с системой PtbBuk (фиг. 33). Luc вступает в реакцию с D-люциферином с генерацией оксилюциферина, диоксида углерода и света. Помимо магния и молекулярного кислорода, для развития реакции с Luc требуется АТФ. АТФ представляет собой продукт, генерируемый Ptb-Buk при наличии подходящего ацил-КоА- или эноил-КоА-субстрата. Соответственно, сравнение скоростей реакции и предпочтений Ptb-Buk для различных субстратов может быть осуществлено на основании количественного определения количества света, генерируемого в ходе реакции с Ptb-Buk, Luc, d-люциферином, магнием, молекулярным кислородом, фосфатом, АДФ, и ацил-КоА или эноил-КоА.
Пример 13.
В указанном примере используется моделирование на уровне генома, чтобы продемонстрировать возможность достижения высокой селективности в отношении ненативных продуктов при применении Ptb-Buk. Кроме того, на указанном примере продемонстрировано, что применение Ptb-Buk может обеспечивать сопряжение клеточного роста с продуцированием продукта, что позволяет конструировать стабильные высокопродуктивные штаммы для ферментации.
Использовали метаболическую модель на уровне генома С. autoethanogenum, аналогичную описанной в источнике: Marcellin, Green Chem, 18: 3020-3028, 2006. Были созданы варианты указанной модели, содержащие дополнительные метаболические реакции, каждая из которых представляет отличный генетически модифицированный микроорганизм для получения ненативных продуктов. Для каждого пути получения ненативного продукта создавали три версии модели, включающей либо тиоэстеразную, либо ацетат-КоА-трансферазную, либо Ptb-Buk-реакцию.
Показатели максимальной селективности вычисляли с помощью анализа баланса потоков (FBA) с применением скриптов COBRA Toolbox v2.0 из MATLAB R2014a (The Mathworks, Inc.) с Gurobi версии 6.0.4 в качестве решающей программы (Gurobi Optimization, Inc.). Обменные реакции ограничивали для представления химически заданной минимальной ростовой среды с CO в качестве источника углерода и энергии. Для поиска существующих вариантов дизайна штамма, включающих до 10 генных нокаутов и обеспечивающих сопряжение продуцирования целевого ненативного химического вещества с ростом, использовали эволюционный алгоритм.
Согласно прогнозу на основании FBA, пути, задействующие Ptb-Buk или КоА-трансферазу, обеспечивают самые высокие показатели селективности продуктов за счет образования АТФ при субстратном фосфорилировании. Результаты представлены в табл. 2. Однако следует отметить, что одним из ограничений моделей на уровне генома и FBA-анализа является то, что не учитывается кинетика ферментов. Для функциональной КоА-трансферазной реакции требуется определенный базовый уровень ацетата, соответственно, в реальности максимальная селективность при применении КоА-трансферазы будет составлять менее чем 100% ввиду необходимости присутствия некоторого базового уровня ацетата.
- 59 043734
Таблица 2. Анализ баланса потоков (FBA), отражающий максимальные возможные показатели селективности ненативных продуктов у С. autoethanogenum в отношении совокупности продуктов и ________________________кандидатных ферментов___________________
Ненативный продукт Максимальный % селективности (С в целевом продукте/С во всех продуктах ферментации)
Тиоэстераза КоА-трансфераза Ptb-Buk
Ацетон 82,0 100 100
Изопропанол 82,1 100 100
Изобутилен 55,9 80,2 80,2
3 -Г идроксибутират 86,0 100 100
1,3-Бутандиол 88,6 100 100
2-Г идроксиизобутират 86,0 100 100
Желательно конструировать штаммы, в которых продуцирование целевых ненативных химических веществ необходимо для роста клеток. Согласно прогнозу на основании FBA, в большинстве случаев при сопряжении продуцирования целевого химического вещества с ростом при использовании тиоэстеразы или КоА-трансферазы возникнут затруднения; вместо этого предпочтение будет отдано нативным продуктам, ацетату и этанолу. Однако существует множество вариантов дизайна штаммов, обеспечивающих сопряжение роста и продуцирования химических веществ при использовании Ptb-Buk, часто предусматривающих разрушение фосфотрансацетилазных-ацетаткиназных реакций. В табл. 3 обобщены данные относительно способности сопряжения с ростом для каждого штамма.
Таблица 3. Потенциал для сопряжения ненативного химического продуцирования с ростом у С. autoethanogenum при росте на СО, с реконфигурацией метаболической сети с нокаутом до 10 генов
Ненативный продукт Способность к сопряжению продуцирования ненативных химических веществ с ростом
Тиоэстераза КоА-трансфераза Ptb-Buk
Ацетон Нет Нет Есть
Изопропанол Нет Нет Есть
Изобутилен Нет Нет Нет
3-Гидроксибутират Нет Нет Есть
1,3-Бутандиол Нет Есть Есть
2-Г идроксиизобутират Нет Нет Есть
Хотя и Ptb-Buk, и КоА-трансфераза могут поддерживать высокую селективность, согласно прогнозу на основании анализа баланса потоков в большинстве случаев только Ptb-Buk может обеспечивать конструирование стабильных высокопродуктивных штаммов для ферментации, обеспечивающее сопряжение продуцирования ненативных химических веществ с ростом.
Пример 14.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование адипиновой кислоты с помощью PtbBuk из газообразного сырья.
Было описано продуцирование E.coli адипиновой кислоты из сахара через путь, задействующий Ptb-Buk (Yu, Biotechnol Bioeng, 111: 2580-2586, 2014). Однако уровень продуцирования был низким, в диапазоне мкг/л. Без связи с конкретной теорией, авторы настоящего изобретения считают, что это предположительно обусловлено отсутствием движущей силы в форме восстановительной способности и профицита АТФ. Применение восстановленного газообразного субстрата, такого как СО и Н2, и ацетогенной бактерии, такой как С. autoethanogenum, может обеспечивать преодоление указанного существующего ограничения. Окисление СО и Н2 обеспечивает достаточную движущую силу для восстановления 3-оксо-адипил-КоА до 3-гидроксиадипил-КоА 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой или ацетоацетил-КоА-гидратазой, и 2,3-дегидроадипил-КоА до адипил-КоА эноил-КоА-гидролазой или эноилКоА-редуктазой (фиг. 34, этапы 23 и 25), в отличие от E.coli, растущих в гетеротрофных условиях на более окисленных сахарах. Ацетогенные бактерии существуют на энергетическом пределе жизни и, соответственно, генерирующие АТФ реакции, такие как система Ptb-Buk, обладают выраженной движущей силой, что обеспечивает эффективное преобразование адипил-КоА в адипиновую кислоту (фиг. 34, этап
-60043734
26), в отличие от E.coli, растущей в гетеротрофных условиях на сахарах, с генерацией профицита АТФ за счет гликолиза.
Для продуцирования адипиновой кислоты из газа в С. autoethanogenum гены, кодирующие сукцинил-КоА-синтетазу, из E. coli (NP_415256, NP_415257), кетоизовалератоксидоредуктазу PaaJ из E. coli (WP_001206190.1), 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу Hbd из Clostridium beijerinckii (WP_011967675.1), транс-2-эноил-КоА-редуктазу Crt из С. acetobutylicum (NP_349318.1), транс-2-эноилКоА-редуктазу Bcd из С. acetobutylicum (NP_349317.1) и флавопротеины электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316) клонируют на экспрессионную плазмиду, а затем трансформируют согласно описанию выше штаммы С. autoethanogenum pta-ack::ptb-buk или CAETHG_1524::ptb-buk из приведенных выше примеров. Адипиновую кислоту получают в соответствии с этапами, представленными на фиг. 34.
Пример 15.
В указанном примере продемонстрировано продуцирование различных продуктов, в том числе 2бутен-1-ола, 3-метил-2-бутанола, 1,3-гександиола (HDO), с помощью Ptb-Buk и AOR.
Как продемонстрировано в примере 6, Ptb-Buk является в значительной степени неизбирательной и действует на широкий диапазон КоА в качестве субстратов, или может быть сконструирована таким образом, чтобы использовать диапазон не встречающихся в природе КоА в качестве субстратов. Аналогичным образом, фермент AOR, как было показано, действует на широкий диапазон субстратов. Вместе указанные два фермента могут преобразовывать широкий диапазон КоА через соответствующие кислоты в альдегиды, которые затем могут быть преобразованы в спирты, кетоны или енолы с помощью алкогольдегидрогеназ, широкий спектр которых существует в природе. Хотя в стандартных условиях восстановление кислот с ферредоксином в альдегиды с помощью AOR является эндотермическим (Thauer, Bacteriol Rev, 41: 100-180, 1977), и, соответственно, его реализация нецелесообразна, неожиданным образом, оно имеет место у карбоксидотрофных ацетогенов, таких как С. autoethanogenum, функционирующих при низких значениях pH, при CO или Н2 в качестве субстрата (Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015). Одно из общих ограничений при работе с ацетогенами заключается в том, что они ограничены по АТФ, существуя на термодинамическом пределе жизни (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), что может быть преодолено за счет сопряжения указанного восстановления кислот с АТФ-связанным образованием кислот из КоА с помощью системы Ptb-Buk.
Применение системы Ptb-Buk и системы AOR было продемонстрировано в приведенных выше примерах для нескольких разных продуктов, однако может быть расширено на дополнительные продукты, например, получение 2-бутен-1-ола, 3-метил-2-бутанола, 1,3-гександиола (HDO). 2-бутен-1-ол может быть продуцирован с помощью Ptb-Buk, AOR и алкогольдегидрогеназы из кротонил-КоА (фиг. 35). 1,3Гександиол может быть продуцирован с помощью Ptb-Buk, AOR и алкогольдегидрогеназы из 3гидроксигексаноил-КоА (фиг. 35). Путем комбинирования Ptb-Buk, Adc и алкогольдегидрогеназы (такой как нативная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа) может быть продуцирован 3-метил-2-бутанол из ацетобутирил-КоА.
Все указанные предшественники, кротонил-КоА, 3-гидроксигексаноил-КоА или ацетобутирил-КоА, могут быть получены путем восстановления и удлинения ацетил-КоА, ацетоацетил-КоА и 3-ГБ-КоА, согласно описанию в предыдущих примерах, посредством известных ферментативных путей, например, у Clostridium kluyveri (Barker, PNAS USA, 31:373-381, 1945; Seedorf, PNAS USA, 105: 2128-2133, 2008) и других Clostridia. Задействованные ферменты включают кротонил-КоА-гидратазу (кротоназу) или кротонил-КоА-редуктазу, бутирил-КоА-дегидрогеназу или транс-2-эноил-КоА-редуктазу, тиолазу или ацилКоА-ацетилтрансферазу, и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу или ацетоацетил-КоА-гидратазу (фиг. 35). Соответствующие гены из С. kluyveri или других Clostridia были клонированы в экспрессионную плазмиду (U.S. 2011/0236941) и затем согласно описанию выше трансформировали штаммы С. autoethanogenum pta-ack::ptb-buk или CAETHG_1524::ptb-buk из приведенных выше примеров для получения 2бутен-1-ола, 3-метил-2-бутанола, 1,3-гександиола (HDO). 2-бутен-1-ол, 3-метил-2-бутанол и 1,3гександиол (HDO) могут быть предшественниками для дальнейших выходных продуктов.
Хотя было представлено всего несколько примеров, следует понимать, что указанный путь может быть дополнительно расширен с применением тех же ферментов или их сконструированных вариантов, обладающих специфичностью в отношении более длинных цепей, для получения диапазона спиртов, кетонов, енолов или диолов С4, С6, С8, Сю, С12, С14 (фиг. 39). Молекулы другого типа могут быть получены также с применением праймеров или удлиняющих звеньев, отличных от ацетил-КоА, на тиолазном этапе, согласно существующим описаниям (Cheong, Nature Biotechnol, 34: 556-561, 2016).
Все источники, в том числе публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылок в той же степени, как если бы каждый источник был индивидуальным конкретным образом включен посредством ссылки и полностью приведен в настоящем документе. Ссылка на какой-либо предшествующий уровень техники в настоящем описании не предполагает, и не должна быть истолкована как признание того, что предшествующий уровень техники входит в известный уровень техники в рассматриваемой области в какой-либо стране.
Применение терминов в единственном числе, включая сопровождаемые определением указан-

Claims (15)

  1. ный(ая,ое) и аналогичных объектов в контексте описания настоящего изобретения (в частности, в контексте приведенной ниже формулы изобретения) должны рассматриваться как охватывающие термины как в единственном, так и во множественном числе, если в настоящем документе не указано иное или если это явным образом не противоречит контексту. Термины состоящий, имеющий, включающий и содержащий должны рассматриваться как неограничивающие (т.е. означающие в том числе, но не ограничиваясь перечисленным), если не указано иное. Подразумевается, что указание диапазонов значений в настоящем документе служит исключительно в качестве краткого способа индивидуального указания каждого отдельного значения, попадающего в указанный диапазон, если в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в настоящее описание в той же степени, как если бы оно было индивидуальным образом указано в настоящем документе. Все способы, описанные в настоящем документе, могут быть реализованы в любом подходящем порядке, если в настоящем документе не указано иное или если это иным образом явно не противоречит контексту. Применение всех и каждого примеров, или примеры выражений (например, такие как) в настоящем документе предназначено исключительно для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения, если не указано иное. Никакая формулировка в настоящем описании не должна быть истолкована как подразумевающая, что какой-либо не заявленный элемент имеет существенное значение для практической реализации настоящего изобретения.
    Предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения описаны в настоящем документе. Специалисты в данной области техники после прочтения приведенного выше описания смогут обнаружить очевидные варианты указанных предпочтительных вариантов реализации. Авторы настоящего изобретения ожидают, что специалисты в соответствующих случаях будут применять такие варианты, и предполагают, что практическая реализация настоящего изобретения может осуществляться иным образом, чем, в частности, это описано в настоящем документе. Соответственно, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета изобретения, описанного в формуле изобретения, прилагаемой к настоящему документу, в рамках, установленных применимым законодательством. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных вариантах охвачена настоящим изобретением, если в настоящем документе не указано иное или если это иным образом явно не противоречит контексту.
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Генетически сконструированная бактерия, содержащая экзогенную фосфатбутирилтрансферазу (Ptb) и экзогенную бутираткиназу (Buk) (Ptb-Buk), где Ptb-Buk действует на субстрат ацил-КоА или эноил-КоА, отличный от бутаноил-КоА, где указанная бактерия представляет собой С1-фиксирующую бактерию, которая содержит путь Вуда-Льюнгдаля, где указанная бактерия выбрана изAcetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, и Thermoanaerobacter kiuvi и где указанная бактерия продуцирует одно или более из ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата, 1,3бутандиола, 2-гидроксиизобутирата, адипиновой кислоты, 1,3-гександиола, 3-метил-2-бутанола, 2-бутен1-ола, этанола, иное чем бутират.
  2. 2. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия не продуцирует бутанол.
  3. 3. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная Ptb-Buk преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират.
  4. 4. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия дополнительно содержит экзогенную или эндогенную альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу (AOR).
  5. 5. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия дополнительно содержит разрушающую мутацию в фосфотрансацетилазе (Pta) и ацетаткиназе (Ack).
  6. 6. Бактерия по п.1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия дополнительно содержит разрушающую мутацию в тиоэстеразе.
  7. 7. Бактерия по п.1, содержащая:
    (а) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, и фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, фермент, который преобразует 3-гидроксибутират в ацетоацетат, и фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, при этом фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, представляет собой Ptb-Buk.
    - 62 043734
  8. 8. Бактерия по п.7, характеризующаяся тем, что указанная бактерия дополнительно содержит разрушающую мутацию в первичной:вторичной алкогольдегидрогеназе.
  9. 9. Бактерия по п.1, содержащая:
    (a) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, и фермент, который преобразует ацетон в изопропанол, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, фермент, который преобразует 3-гидроксибутират в ацетоацетат, фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, и фермент, который преобразует ацетон в изопропанол, при этом фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, представляет собой Ptb-Buk.
  10. 10. Бактерия по п.1, содержащая:
    (a) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, фермент, который преобразует ацетон в 3-гидроксиизовалерат, и фермент, который преобразует 3-гидроксиизовалерат в изобутилен, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, фермент, который преобразует ацетоацетат в ацетон, фермент, который преобразует ацетон в 3-гидроксиизовалерил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксиизовалерилКоА в 3-гидроксиизовалерат, и фермент, который преобразует 3-гидроксиизовалерат в изобутилен, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, и/или фермент, который преобразует 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3-гидроксиизовалерат, представляет собой Ptb-Buk.
  11. 11. Бактерия по п.1, содержащая:
    (a) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, и фермент, который преобразует ацетоацетат в 3-гидроксибутират, при этом фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, при этом фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, представляет собой Ptb-Buk.
  12. 12. Бактерия по п.1, содержащая:
    (a) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, и фермент, который преобразует ацетоацетат в 3-гидроксибутират, фермент, который преобразует 3-гидроксибутират в 3-гидроксибутиральдегид, и фермент, который преобразует 3-гидроксибутиральдегид в 1,3-бутандиол, при этом фермент, который преобразует ацетоацетилКоА в ацетоацетат, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3гидроксибутират, фермент, который преобразует 3-гидроксибутират в 3-гидроксибутиральдегид, и фермент, который преобразует 3-гидроксибутиральдегид в 1,3-бутандиол, при этом фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, представляет собой Ptb-Buk.
  13. 13. Бактерия по п.1, содержащая:
    (а) фермент, который преобразует ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, фермент, который преобразует ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксибутирил-КоА в 2гидроксиизобутирил-КоА, и фермент, который преобразует 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират, при этом фермент, который преобразует 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират, представляет собой Ptb-Buk.
  14. 14. Бактерия по п.1, содержащая:
    (a) ферменты, которые преобразуют ацетил-КоА в сукцинил-КоА, фермент, который преобразует сукцинил-КоА в 3-оксоадипил-КоА, фермент, который преобразует 3-оксоадипил-КоА в 3гидроксиадипил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксиадипил-КоА в 2,3-дегидроадипил-КоА, фермент, который преобразует 2,3-дегидроадипил-КоА в адипил-КоА, и фермент, который преобразует адипил-КоА в адипиновую кислоту, при этом фермент, преобразующий адипил-КоА в адипиновую кислоту, представляет собой Ptb-Buk, или (b) фермент, который преобразует ацетил-КоА в 3-оксоадипил-КоА, фермент, который преобразует 3-оксоадипил-КоА в 3-гидроксиадипил-КоА, фермент, который преобразует 3-гидроксиадипил-КоА в 2,3-дегидроадипил-КоА, фермент, который преобразует 2,3-дегидроадипил-КоА в адипил-КоА, и фермент, который преобразует адипил-КоА в адипиновую кислоту, при этом фермент, который преобразует адипил-КоА в адипиновую кислоту, представляет собой Ptb-Buk.
  15. 15. Бактерия по п.1, содержащая:
    -
EA201890952 2015-10-13 2016-10-13 Генетически сконструированная бактерия, содержащая энергогенерирующий ферментативный путь EA043734B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/240,850 2015-10-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA043734B1 true EA043734B1 (ru) 2023-06-19

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10316337B2 (en) Genetically engineered bacterium for the production of isobutylene
AU2012221176B2 (en) Recombinant microorganisms and uses therefor
US20090111154A1 (en) Butanol production by recombinant microorganisms
US20100221800A1 (en) Microorganism engineered to produce isopropanol
CA3079761A1 (en) Microorganisms and methods for the biological production of ethylene glycol
CA2899587C (en) Recombinant microorganisms comprising nadph dependent enzymes and methods of production thereof
US20160024532A1 (en) Atp driven direct photosynthetic production of fuels and chemicals
WO2012135731A2 (en) Alcohol production from recombinant microorganisms
WO2012099934A2 (en) Butanol production by microorganisms having nadh coupling
US9434963B2 (en) Process for butanol production
US20160138049A1 (en) OXYGEN-TOLERANT CoA-ACETYLATING ALDEHYDE DEHYDROGENASE CONTAINING PATHWAY FOR BIOFUEL PRODUCTION
TWI811184B (zh) 包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌
EA043734B1 (ru) Генетически сконструированная бактерия, содержащая энергогенерирующий ферментативный путь
TW202128984A (zh) 包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌
CA3228407A1 (en) Microbial fermentation for the production of isoprenoid alcohols and derivatives