EA043734B1 - GENETICALLY ENGINEERED BACTERIA CONTAINING AN ENERGY-GENERATING ENZYMATIVE PATHWAY - Google Patents

GENETICALLY ENGINEERED BACTERIA CONTAINING AN ENERGY-GENERATING ENZYMATIVE PATHWAY Download PDF

Info

Publication number
EA043734B1
EA043734B1 EA201890952 EA043734B1 EA 043734 B1 EA043734 B1 EA 043734B1 EA 201890952 EA201890952 EA 201890952 EA 043734 B1 EA043734 B1 EA 043734B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
coa
enzyme
converts
clostridium
aldehyde
Prior art date
Application number
EA201890952
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Михаэль Кёпке
Расмус Овергорд Енсен
Джеймс Брюс Ярнтон Хэйкок Берендорфф
Райан Эдвард Хилл
Дармави Джуминага
Александер Пол Мюллер
Original Assignee
ЛанцаТек НЗ, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ЛанцаТек НЗ, Инк. filed Critical ЛанцаТек НЗ, Инк.
Publication of EA043734B1 publication Critical patent/EA043734B1/en

Links

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявкиCross references to related applications

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/240850, поданной 13 октября 2015 г., полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.This application claims benefit from U.S. Provisional Patent Application No. 62/240,850, filed October 13, 2015, incorporated herein by reference in its entirety.

Уровень техникиState of the art

Благодаря недавним успехам в ферментативном и метаболическом конструировании (инженерии) были идентифицированы и разработаны ферментативные маршруты для получения различных продуктов (Clomburg, Appl Microbiol Biotechnol, 86: 419-434, 2010; Peralta-Yahya, Biotechnol J, 5: 147-162, 2010; Cho, Biotechnol Adv, pii: S0734-9750(14)00181-5, 2014. Однако все указанные ферментативные маршруты являются энерго(АТФ)-потребляющими или, в лучшем случае, энергетически (АТФ-) нейтральными, что ограничивает выход продукта в энергетически ограниченных системах и рассинхронизирует продуцирование продукта и рост микроорганизма. Согласно настоящему изобретению предложены энергогенерирующие (АТФ-генерирующие) пути, позволяющие преодолеть указанные ограничения, обеспечивая новые ферментативные маршруты и пути для получения различных продуктов, в том числе кислот, алкенов, альдегидов, спиртов и диолов. Указанные пути прямо сопряжены с ростом микроорганизма и обеспечивают высокий выход продуктов.With recent advances in enzyme and metabolic engineering, enzymatic routes have been identified and developed to produce various products (Clomburg, Appl Microbiol Biotechnol, 86: 419-434, 2010; Peralta-Yahya, Biotechnol J, 5: 147-162, 2010 ; Cho, Biotechnol Adv, pii: S0734-9750(14)00181-5, 2014. However, all of these enzymatic routes are energy (ATP)-consuming or, at best, energy (ATP-) neutral, which limits the product yield in energy-limited systems and desynchronizes product production and microorganism growth.According to the present invention, energy-generating (ATP-generating) pathways are proposed to overcome these limitations by providing new enzymatic routes and pathways for the production of various products, including acids, alkenes, aldehydes, alcohols and diols These pathways are directly related to the growth of the microorganism and provide a high yield of products.

В частности, настоящее изобретение относится к ферментативным путям, включающим Ptb-Buk. Фосфатбутирилтрансфераза (Ptb) (EC 2.3.1.19) в норме катализирует реакцию бутаноил-КоА и фосфата с образованием КоА и бутаноилфосфата. Бутираткиназа (Buk) (EC 2.7.2.7) в норме катализирует реакцию бутаноилфосфата и АДФ с образованием бутирата (бутаноата) и АТФ. Соответственно, указанные ферменты совместно (Ptb-Buk) в норме катализируют преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерируют одну молекулу АТФ по механизму субстратного фосфорилирования (SLP).In particular, the present invention relates to enzymatic pathways involving Ptb-Buk. Phosphate butyryl transferase (Ptb) (EC 2.3.1.19) normally catalyzes the reaction of butanoyl-CoA and phosphate to form CoA and butanoyl phosphate. Butyrate kinase (Buk) (EC 2.7.2.7) normally catalyzes the reaction of butanoyl phosphate and ADP to produce butyrate (butanoate) and ATP. Accordingly, these enzymes together (Ptb-Buk) normally catalyze the conversion of butanoyl-CoA to butyrate and generate one molecule of ATP via the substrate phosphorylation (SLP) mechanism.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной и способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, Ptb-Buk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ по механизму субстратного фосфорилирования.The inventors of the present invention have found that Ptb is non-selective and capable of accepting various acyl-CoAs and enoyl-CoAs as substrates, thus Ptb-Buk can be used to convert a number of acyl-CoAs and enoyl-CoAs into the corresponding acids or alkenates, respectively. with simultaneous generation of ATP through the mechanism of substrate phosphorylation.

Кроме того, в комбинации с альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (AOR) и алкогольдегидрогеназой, кислоты, образованные с помощью системы Ptb-Buk, могут быть далее преобразованы в соответствующие альдегиды, спирты или диолы. AOR (EC 1.2.7.5) катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина (который может, например, образовываться в результате окисления CO или водорода) с образованием альдегида и окисленного ферредоксина.Moreover, in combination with aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) and alcohol dehydrogenase, acids formed by the Ptb-Buk system can be further converted into the corresponding aldehydes, alcohols or diols. AOR (EC 1.2.7.5) catalyzes the reaction of an acid and reduced ferredoxin (which can, for example, form from the oxidation of CO or hydrogen) to form an aldehyde and oxidized ferredoxin.

Алкогольдегидрогеназа (EC 1.1.1.1 и EC 1.1.1.2) может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф).Alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1 and EC 1.1.1.2) can convert aldehyde and NAD(P)H to alcohol and NAD(P).

Введение Ptb-Buk и/или AOR в гетерологичный вид, соответственно, обеспечивает новый альтернативный способ получения нативных и ненативных продуктов, таких как кислоты, алкены, кетоны, альдегиды, спирты и диолы, с высоким выходом, таким образом преодолевая ограничения существующего уровня техники.The introduction of Ptb-Buk and/or AOR into a heterologous form accordingly provides a new alternative route for the preparation of native and non-native products such as acids, alkenes, ketones, aldehydes, alcohols and diols in high yield, thereby overcoming the limitations of the current state of the art.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Согласно настоящему изобретению предложена генетически сконструированная (т.е. генноинженерная) бактерия, содержащая экзогенную фосфатбутирилтрансферазу (Ptb) и экзогенную бутираткиназу (Buk) (Ptb-Buk). В общем случае, указанная Ptb-Buk действует на ненативный субстрат, например, субстрат, отличный от бутаноил-КоА и/или бутаноилфосфата, и продуцирует ненативный продукт, например, продукт, отличный от бутаноилфосфата или бутирата. Согласно некоторым вариантам реализации указанная Ptb-Buk преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3гидроксиизовалерат, 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, или 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират.The present invention provides a genetically engineered bacterium containing exogenous phosphate butyryl transferase (Ptb) and exogenous butyrate kinase (Buk) (Ptb-Buk). In general, said Ptb-Buk acts on a non-native substrate, eg, a substrate other than butanoyl-CoA and/or butanoyl phosphate, and produces a non-native product, eg, a product other than butanoyl phosphate or butyrate. In some embodiments, said Ptb-Buk converts acetoacetyl-CoA to acetoacetate, 3-hydroxyisovaleryl-CoA to 3hydroxyisovalerate, 3-hydroxybutyryl-CoA to 3-hydroxybutyrate, or 2-hydroxyisobutyryl-CoA to 2hydroxyisobutyrate.

Указанная бактерия может продуцировать что-либо одно или более из кислоты, алкена, кетона, альдегида, спирта или диола. Более конкретно, указанная бактерия может продуцировать что-либо одно или более из ацетона или его предшественника, изопропанола или его предшественника, изобутилена или его предшественника, 3-гидроксибутирата или его предшественника, 1,3-бутандиола или его предшественника, 2-гидроксиизобутирата или его предшественника, адипиновой кислоты или ее предшественника, 1,3-гександиола или его предшественника, 3-метил-2-бутанола или его предшественника, 2-бутен-1-ола или его предшественника, изовалерата или его предшественника, или изоамилового спирта или его предшественника. Указанная бактерия, как правило, не продуцирует бутанол.The bacterium may produce any one or more of an acid, an alkene, a ketone, an aldehyde, an alcohol, or a diol. More specifically, said bacterium may produce any one or more of acetone or its precursor, isopropanol or its precursor, isobutylene or its precursor, 3-hydroxybutyrate or its precursor, 1,3-butanediol or its precursor, 2-hydroxyisobutyrate or its precursor, adipic acid or its precursor, 1,3-hexanediol or its precursor, 3-methyl-2-butanol or its precursor, 2-buten-1-ol or its precursor, isovalerate or its precursor, or isoamyl alcohol or its precursor . This bacterium, as a rule, does not produce butanol.

Указанная бактерия может дополнительно содержать разрушающую мутацию в фосфотрансацетилазе (Pta) и ацетаткиназе (Ack). Указанная бактерия может дополнительно содержать разрушающую мутацию в тиоэстеразе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена генетически сконструированная бактерия, содержащая экзогенную Ptb-Buk и экзогенную или эндогенную альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу.The bacterium may additionally contain a disruptive mutation in phosphotransacetylase (Pta) and acetate kinase (Ack). The bacterium may further contain a disruptive mutation in the thioesterase. According to another embodiment of the present invention, a genetically engineered bacterium is provided that contains exogenous Ptb-Buk and exogenous or endogenous aldehyde:ferredoxin oxidoreductase.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения продукта, включающий культивирование бактерии согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации в присутствии субстрата. Указанный продукт может представлять собой, например, ацетон или его предшественник, изопропанол или его предшественник, изобутилен или его предшественник, 3-гидроксибутират или егоThe present invention also provides a method for producing a product, comprising cultivating a bacterium according to any of the above embodiments in the presence of a substrate. Said product may be, for example, acetone or its precursor, isopropanol or its precursor, isobutylene or its precursor, 3-hydroxybutyrate or its

- 1 043734 предшественник, 1,3-бутандиол или его предшественник, 2-гидроксиизобутират или его предшественник, адипиновую кислоту или ее предшественник, 1,3-гександиол или его предшественник, 3-метил-2бутанол или его предшественник, 2-бутен-1-ол или его предшественник, изовалерат или его предшественник, или изоамиловый спирт или его предшественник. Обычно указанный субстрат представляет собой газообразный субстрат, содержащий, например, что-либо одно или более из CO, CO2 и H2. Согласно одному варианту реализации указанный газообразный субстрат представляет собой сингаз. Согласно другому варианту реализации указанный газообразный субстрат представляет собой отходящий промышленный газ.- 1 043734 precursor, 1,3-butanediol or its precursor, 2-hydroxyisobutyrate or its precursor, adipic acid or its precursor, 1,3-hexanediol or its precursor, 3-methyl-2-butanol or its precursor, 2-butene-1 -ol or a precursor thereof, isovalerate or a precursor thereof, or isoamyl alcohol or a precursor thereof. Typically, said substrate is a gaseous substrate containing, for example, any one or more of CO, CO 2 and H 2 . In one embodiment, said gaseous substrate is syngas. According to another embodiment, said gaseous substrate is an industrial waste gas.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

Фиг. 1 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата, 1,3-бутандиола и 2гидроксиизобутирата из ацетил-КоА. Ацетил-КоА может быть получен из любого подходящего субстрата, такого как углеводный (например, сахарный) субстрат или газообразный субстрат. Согласно настоящему изобретению ацетил-КоА часто получают из газообразного субстрата. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.Fig. 1 is a diagram of the metabolic pathways for the production of various products, including acetone, isopropanol, isobutylene, 3-hydroxybutyrate, 1,3-butanediol, and 2hydroxyisobutyrate from acetyl-CoA. Acetyl-CoA can be obtained from any suitable substrate, such as a carbohydrate (eg, sugar) substrate or a gaseous substrate. According to the present invention, acetyl-CoA is often obtained from a gaseous substrate. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму, отражающую реакции, естественным образом катализируемые Ptb-Buk, а именно, преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерацию одной молекулы АТФ.Fig. 2 is a diagram showing the reactions naturally catalyzed by Ptb-Buk, namely the conversion of butanoyl-CoA to butyrate and the generation of one ATP molecule.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму сравнения активности КоА-трансферазы, тиоэстеразы и PtbBuk.Fig. 3 is a graph comparing the activities of CoA transferase, thioesterase and PtbBuk.

Фиг. 4 представляет собой график, отражающий средние показатели продуцирования ацетона в E. coli BL21 (D3), модифицированной плазмидами, содержащими экзогенные гены. Указанные данные демонстрируют способность Ptb-Buk к преобразованию ацетоацетил-КоА в ацетоацетат в E.coli in vivo.Fig. 4 is a graph showing the average acetone production in E. coli BL21 (D3) modified with plasmids containing exogenous genes. These data demonstrate the ability of Ptb-Buk to convert acetoacetyl-CoA to acetoacetate in E. coli in vivo.

Фиг. 5 представляет собой график, отражающий эффект индукции E. coli BL21 (DE3), несущей как плазмиду pACYC-ptb-buk, так и плазмиду pCOLA-thlA-adc (экспрессирующие тиолазу, Ptb-Buk и ацетоацетатдекарбоксилазу).Fig. 5 is a graph showing the effect of induction of E. coli BL21 (DE3) carrying both plasmid pACYC-ptb-buk and plasmid pCOLA-thlA-adc (expressing thiolase, Ptb-Buk and acetoacetate decarboxylase).

Фиг. 6 представляет собой диаграмму пути, разработанного для применения Ptb-Buk для получения ацетона, с повторным использованием восстанавливающих эквивалентов, получаемых при продуцировании (R)-3-гидроксибутирuл-КоА и АТФ, генерируемой Ptb-Buk.Fig. 6 is a diagram of the pathway developed for the use of Ptb-Buk to produce acetone, reusing the reducing equivalents obtained from the production of (R)-3-hydroxybutyryl-CoA and the ATP generated by Ptb-Buk.

Фиг. 7 представляет собой диаграмму, отражающую роль альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы (AOR), ферредоксина и Adh при продуцировании 1,3-бутандиола в С. autoethanogenum. Чаще всего AOR может применяться для катализа преобразование кислоты в альдегид, a Adh может применяться для катализа преобразования альдегида в спирт/диол.Fig. 7 is a diagram showing the role of aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR), ferredoxin and Adh in the production of 1,3-butanediol in C. autoethanogenum. Most commonly, AOR can be used to catalyze the conversion of an acid to an aldehyde, and Adh can be used to catalyze the conversion of an aldehyde to an alcohol/diol.

Фиг. 8 представляет собой диаграмму, отражающую стереоспецифичность Ptb-Buk при продуцировании (R)-3-гидроксибутирата и 2-гидроксиизобутирата. Термин нативный на фиг. 8 относится к нативной тиоэстеразе.Fig. 8 is a diagram showing the stereospecificity of Ptb-Buk in producing (R)-3-hydroxybutyrate and 2-hydroxyisobutyrate. The term native in Fig. 8 refers to native thioesterase.

Фиг. 9 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование изобутена с помощью PtbBuk-преобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерата с применением альтернативного пути 1.Fig. 9 is a diagram showing the production of isobutene by PtbBuk conversion of 3-hydroxyisovaleryl-CoA and 3-hydroxyisovalerate using alternative route 1.

Фиг. 10 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование изобутена с помощью PtbBuk-преобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерата с применением альтернативного пути 2.Fig. 10 is a diagram showing the production of isobutene by PtbBuk conversion of 3-hydroxyisovaleryl-CoA and 3-hydroxyisovalerate using alternative route 2.

Фиг. 11 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование 1,3-бутандиола с помощью 3 -бутиральдегиддегидрогеназы (Bld).Fig. 11 is a diagram showing the production of 1,3-butanediol by 3-butyraldehyde dehydrogenase (Bld).

Фиг. 12 представляет собой график, отражающий продуцирование изопропанола в С. autoethanogenum с применением системы Ptb-Buk относительно контроля oPMTL85i47-thlA-adc, • pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.Fig. 12 is a graph showing isopropanol production in C. autoethanogenum using the Ptb-Buk system relative to the control o P MTL85i47-thlA-adc, • pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.

Фиг. 13A-F представляют собой графики, отражающие продуцирование 3-гидроксибутирата, ацетата, этанола и ацетона с применением модульных плазмид у E. coli с разными концентрациями индуктора ИТПТ (0, 50, 100 мкМ). Фиг. 13А: pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB. Фиг. 13В:Fig. 13A-F are graphs showing the production of 3-hydroxybutyrate, acetate, ethanol and acetone using modular plasmids in E. coli with different concentrations of ITPT inducer (0, 50, 100 μM). Fig. 13A: pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB. Fig. 13V:

pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13С: pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13D: pCOLA-thlA-adc. Фиг. 13E: pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13F: pCDF-phaB.pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Fig. 13C: pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Fig. 13D: pCOLA-thlA-adc. Fig. 13E: pCDF-phaB-bdhl. Fig. 13F: pCDF-phaB.

Фиг. 14 представляет собой плазмидную карту плазмиды pMTL8225-budA::thlA-phaB.Fig. 14 is a plasmid map of plasmid pMTL8225-budA::thlA-phaB.

Фиг. 15 представляет собой снимок геля ПЦР-верификации замены генов ацетолактатсинтазы (budA) генами тиолазы (thlA) и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (phaB) у С. autoethanogenum для 4 клонов (1, 4, 7, 9) по сравнению с диким типом (W). Все клоны являются положительными, что видно по большему размеру ПЦР-фрагментов по сравнению с диким типом.Fig. 15 is a snapshot of a PCR verification gel of the replacement of acetolactate synthase (budA) genes with thiolase (thlA) and 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (phaB) genes in C. autoethanogenum for 4 clones (1, 4, 7, 9) compared to wild type (W). All clones are positive, as evidenced by the larger size of PCR fragments compared to the wild type.

Фиг. 16 представляет собой график, отражающий профиль ферментации для периодической ферментации штамма С. autoethanogenum budA::thlAphaB и демонстрирующий образование 3гидроксибутирата и 1,3-бутандиола из газа.Fig. 16 is a graph showing the fermentation profile for a batch fermentation of the C. autoethanogenum strain budA::thlAphaB and showing the formation of 3hydroxybutyrate and 1,3-butanediol from gas.

Фиг. 17А представляет собой график, отражающий продуцирование 1,3-BDO с помощью тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (Bld) и бутиральдегиддегидрогеназы. Фиг. 17В представляет собой график, отражающий влияние экспрессии bld на рост.Fig. 17A is a graph showing the production of 1,3-BDO by thiolase, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (Bld) and butyraldehyde dehydrogenase. Fig. 17B is a graph showing the effect of bld expression on growth.

- 2 043734- 2 043734

Фиг. 18А представляет собой график, отражающий образование 3-гидроксибутирата и 1,3бутандиола из газообразного субстрата в С autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA. Фиг. 18В представляет собой график, отражающий восстановление ацетата в этанол в той же культуре. Фиг. 19 представляет собой график, отражающий профиль ферментации штамма С. autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA, демонстрирующий образование 3-гидроксибутирата и 1,3-бутандиола из газообразного субстрата в непрерывной культуре (где это указано, среду непрерывно восполняли с заданной скоростью разведения D).Fig. 18A is a graph showing the formation of 3-hydroxybutyrate and 1,3butanediol from substrate gas in C autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA. Fig. 18B is a graph showing the reduction of acetate to ethanol in the same culture. Fig. 19 is a graph depicting the fermentation profile of C. autoethanogenum strain pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA demonstrating the production of 3-hydroxybutyrate and 1,3-butanediol from a gaseous substrate in continuous culture (where indicated, the medium was continuously replenished at a given dilution rate D ).

Фиг. 20А и 20В представляют собой графики, отражающие увеличенную активность гидролиза КоА в отношении диапазона ацил-КоА (ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирилКоА) у С. autoethanogenum, экспрессирующего систему Ptb-Buk из плазмиды pMTL82256-ptb-buk, по сравнению с диким типом (WT).Fig. 20A and 20B are graphs showing increased CoA hydrolysis activity across a range of acyl-CoAs (acetoacetyl-CoA, 3-hydroxybutyryl-CoA, and 2-hydroxyisobutyryl-CoA) in C. autoethanogenum expressing the Ptb-Buk system from plasmid pMTL82256-ptb-buk , compared to wild type (WT).

Фиг. 21А и 21В представляют собой графики, отражающие сниженную активность гидролиза ацилКоА у штаммов С. autoethanogenum с инактивированной тиоэстеразой (СТ2640 = тиоэстераза 1, СТ1524 = тиоэстераза 2, СТ1780 = тиоэстераза 3) по сравнению с активностью, обнаруживаемой у C. autoethanogenum LZ1560 или LZ1561.Fig. 21A and 21B are graphs showing the reduced acylCoA hydrolysis activity of C. autoethanogenum thioesterase-inactivated strains (CT2640 = thioesterase 1, CT1524 = thioesterase 2, CT1780 = thioesterase 3) compared to the activity found in C. autoethanogenum LZ1560 or L Z1561.

Фиг. 22 представляет собой график, отражающий увеличенное специфическое продуцирование изопропанола у штамма С. autoethanogenum с разрушенной тиоэстеразой 3 CAETHG_1780 по сравнению с С. autoethanogenum дикого типа.Fig. 22 is a graph showing the increased specific isopropanol production of the thioesterase 3 disrupted C. autoethanogenum strain CAETHG_1780 compared to wild type C. autoethanogenum.

Фиг. 23A-D представляют собой графики, отражающие рост (фиг. 23А) и профили продуцирования изопропанола (фиг. 23В), ацетата (фиг. 23С) и этанола (фиг. 23D) у С. autoethanogenum дикого типа и штамма с разрушенной тиоэстеразой 3 (CAETHG_1780), по сравнению с С. autoethanogenum дикого типа.Fig. 23A-D are graphs depicting the growth (FIG. 23A) and isopropanol (FIG. 23B), acetate (FIG. 23C), and ethanol (FIG. 23D) production profiles of C. autoethanogenum wild type and thioesterase 3 disrupted strain ( CAETHG_1780), compared to wild-type C. autoethanogenum.

Фиг. 24 представляет собой плазмидную карту pMTL8225-pta-ack::ptb-buk.Fig. 24 is a plasmid map of pMTL8225-pta-ack::ptb-buk.

Фиг. 25 представляет собой снимок геля, отражающий замену генов pta и ack на гены ptb и buk и кассету ermB.Fig. 25 is a gel image showing the replacement of the pta and ack genes with the ptb and buk genes and the ermB cassette.

Фиг. 26 представляет собой график, отражающий увеличенное преобразование 3-гидроксибутирата в 1,3-BDO за счет избыточной экспрессии гена альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы aor1.Fig. 26 is a graph showing increased conversion of 3-hydroxybutyrate to 1,3-BDO due to overexpression of the aldehyde:ferredoxin oxidoreductase gene aor1.

Фиг. 27 представляет собой график, отражающий активность тиоэстеразы TesB, Pta-Ack и системы Ptb-Buk на гидролиз КоА ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирил-КоА по сравнению с контролем (штамм BL21). Ptb-Buk демонстрирует максимальную активность, тогда как PtaAck демонстрирует отсутствие активности.Fig. 27 is a graph showing the activity of TesB thioesterase, Pta-Ack and the Ptb-Buk system on the hydrolysis of CoA acetoacetyl-CoA, 3-hydroxybutyryl-CoA and 2-hydroxyisobutyryl-CoA compared to the control (strain BL21). Ptb-Buk shows maximum activity, while PtaAck shows no activity.

Фиг. 28А и 28В представляют собой графики, отражающие продуцирование 3-гидроксибутирата с помощью Ptb-Buk в комбинации с ^-специфической (Hbd) (фиг. 28А) или ^-специфической 3гидроксибутиратдегидрогеназой (PhaB) (фиг. 28В).Fig. 28A and 28B are graphs showing the production of 3-hydroxybutyrate by Ptb-Buk in combination with ^-specific (Hbd) (Fig. 28A) or ^-specific 3hydroxybutyrate dehydrogenase (PhaB) (Fig. 28B).

Фиг. 29A-D представляют собой графики, отражающие ЖХ-МС/МС-детекцию 2гидроксиизомасляной кислоты (2-ГИБ) и 2-гидроксибутирата (2-ГБ). Фиг. 29А: 1 мМ стандарт 2-ГИБ. Фиг. 29В: 1 мМ стандарт 2-ГБ. Фиг. 29С: 0,5 мМ стандарт 2-ГБ и 2-ГИБ. Фиг. 29D: дупликат образца С. autoethanogenum, демонстрирующий продуцирование 2-ГИБ и 2-ГБ из газа.Fig. 29A-D are graphs showing LC-MS/MS detection of 2-hydroxyisobutyric acid (2-HIB) and 2-hydroxybutyrate (2-HB). Fig. 29A: 1 mM 2-GIB standard. Fig. 29V: 1mM 2-GB standard. Fig. 29C: 0.5 mM standard 2-GB and 2-GIB. Fig. 29D: duplicate sample of C. autoethanogenum showing production of 2-HIB and 2-HB from gas.

Фиг. 30 представляет собой группу графиков, отражающих ГХ-МС-подтверждение продуцирования 2-гидроксиизомасляной кислоты (8,91 мин).Fig. 30 is a group of graphs showing GC/MS confirmation of 2-hydroxyisobutyric acid production (8.91 min).

Первая панель: С. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Вторая панель: С. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk (спектр). Третья панель: Е. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Четвертая панель: Е. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk.First panel: C. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Second panel: C. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk (spectrum). Third panel: E. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Fourth panel: E. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk.

Фиг. 31 представляет собой группу графиков ПЦР в реальном времени, отражающих экспрессию генов пути 2-ШВА (thlA, hba, meaBhcmA, hcmB из промотора pta-ack и, соответственно, промотора оперона Вуда-Льюнгдаля) в E.coli, С. autoethanogenum LZ1561 при 30°С, и С. autoethanogenum LZ1561 при 37°С.Fig. 31 is a group of real-time PCR graphs reflecting the expression of 2-WBA pathway genes (thlA, hba, meaBhcmA, hcmB from the pta-ack promoter and, accordingly, the promoter of the Wood-Ljungdahl operon) in E. coli, C. autoethanogenum LZ1561 at 30°C, and C. autoethanogenum LZ1561 at 37°C.

Фиг. 32 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование различных продуктов в микроорганизме, содержащем Ptb-Buk, AOR и Adh.Fig. 32 is a diagram showing the production of various products in a microorganism containing Ptb-Buk, AOR and Adh.

Фиг. 33 представляет собой диаграмму, отражающую сопряжение люциферазы светлячков (Luc) с системой Ptb-Buk для характеризации вариантов Ptb-Buk.Fig. 33 is a diagram showing the coupling of firefly luciferase (Luc) to the Ptb-Buk system to characterize Ptb-Buk variants.

Фиг. 34 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе адипиновой кислоты. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.Fig. 34 is a diagram of the metabolic pathways for the production of various products, including adipic acid. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk.

Фиг. 35 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе 1,3-гександиола, 2-метил-2-бутанола и 2-бутен-1-ола. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.Fig. 35 is a diagram of the metabolic pathways for the production of various products, including 1,3-hexanediol, 2-methyl-2-butanol and 2-buten-1-ol. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk.

Фиг. 36 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе изовалерата и изоамилового спирта. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.Fig. 36 is a diagram of the metabolic pathways for the production of various products, including isovalerate and isoamyl alcohol. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk.

- 3 043734- 3 043734

Фиг. 37 представляет собой график продуцирования 3-ГБ в С. autoethanogenum, содержащем плазмиду pMTL82256-thlA-ctfAB, в различных точках роста.Fig. 37 is a graph of 3-HB production in C. autoethanogenum containing plasmid pMTL82256-thlA-ctfAB at various growth points.

Фиг. 38А представляет собой график, отражающий рост и профиль продуцирования этанола и 2,3бутандиола у штамма С. awtoetf?a«ogrnwwpta-ack::ptb-buk + pMTL85147^^ Фиг. 38В представляет собой график, отражающий профиль продуцирования изопропанола и 3-ГБ у штамма С. autoethanogenum pta-ack: :ptb-buk + pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.Fig. 38A is a graph showing the growth and ethanol and 2,3butanediol production profile of strain C. awtoetf?a'ogrnwwpta-ack::ptb-buk + pMTL85147^^ FIG. 38B is a graph showing the isopropanol and 3-HB production profile of the C. autoethanogenum pta-ack: :ptb-buk + pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc strain.

Фиг. 39 представляет собой диаграмму схемы пути продуцирования диапазона спиртов, кетонов, енолов или диолов С4, C6, C8, C10, С12, С14 посредством комбинирования известного пути удлинения цепи (Hbd, Crt, Bcd-EtfAB, ТЫ) с Ptb-Buk + AOR/Adc-Adh.Fig. 39 is a schematic diagram of a pathway for producing a range of C4 , C6 , C8 , C10 , C12 , C14 alcohols, ketones, enols or diols by combining a known chain extension pathway (Hbd, Crt, Bcd-EtfAB, THY) with Ptb-Buk + AOR/Adc-Adh.

Фиг. 40 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO С. autoethanogenum, трансформированным плазмидой pMTL83159-phaB-thlA, в различных точках роста.Fig. 40 is a graph showing the production of 3-HB and 1,3-BDO by C. autoethanogenum transformed with plasmid pMTL83159-phaB-thlA at various growth points.

Фиг. 41 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO С. autoethanogenum, содержащим нокаут budA и pMTL-HBD-ThlA, в различных точках роста.Fig. 41 is a graph showing the production of 3-HB and 1,3-BDO by C. autoethanogenum containing a budA and pMTL-HBD-ThlA knockout at various growth points.

Фиг. 42А представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ при ферментации С. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256. Фиг. 42В представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ при ферментации С. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256-buk-ptb.Fig. 42A is a graph showing the production of 3-HB by fermentation of C. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256. Fig. 42B is a graph showing the production of 3-HB by fermentation of C. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256-buk-ptb.

Фиг. 43 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ штаммом С. autoethanogenum, с нокаутом тиоэстеразы (ΔCAETHG_1524), экспрессирующим плазмиду pMTL83156-phaB-thlA, содержащим и не содержащим экспрессионную плазмиду Ptb-Buk pMTL82256-buk-ptb.Fig. 43 is a graph showing the production of 3-HB by a thioesterase knockout strain of C. autoethanogenum (ΔCAETHG_1524) expressing plasmid pMTL83156-phaB-thlA with and without the Ptb-Buk expression plasmid pMTL82256-buk-ptb.

Фиг. 44 представляет собой график, отражающий продуцирование этанола и 1,3-BDO у штамма С. autoethanogenum, экспрессирующего плазмиду pMTL82256-hbd-thlA (2pf) содержащего и не содержащего плазмиду для избыточной экспрессии AOR pMTL83159-aor1 (+aorl).Fig. 44 is a graph showing the production of ethanol and 1,3-BDO in a C. autoethanogenum strain expressing plasmid pMTL82256-hbd-thlA (2pf) containing and not containing the AOR overexpression plasmid pMTL83159-aor1 (+aorl).

Подробное описание изобретения Метаболические пути на фиг. 1 и 34-36Detailed Description of the Invention Metabolic Pathways in FIG. 1 and 34-36

Фиг. 1 и 34-36 представляют собой диаграммы метаболических путей продуцирования различных продуктов кислот, алкенов, кетонов, альдегидов, спиртов и диолов, в том числе ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата (R- и S-изомеров), 1,3-бутандиола, 2-гидроксиизобутирата, адипиновой кислоты, 1,3-гександиола, 2-метил-2-бутанола, 2-бутен-1-ола, изовалерата и изоамилового спирта из субстрата. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk. Примеры ферментов приведены для каждого из этапов и ферментативных путей, подробно представленных на фиг. 1 и 34-36. Однако специалисту в данной области техники могут быть известны дополнительные подходящие ферменты.Fig. 1 and 34-36 are diagrams of metabolic pathways for the production of various products of acids, alkenes, ketones, aldehydes, alcohols and diols, including acetone, isopropanol, isobutylene, 3-hydroxybutyrate (R- and S-isomers), 1,3- butanediol, 2-hydroxyisobutyrate, adipic acid, 1,3-hexanediol, 2-methyl-2-butanol, 2-buten-1-ol, isovalerate and isoamyl alcohol from the substrate. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk. Examples of enzymes are given for each of the steps and enzymatic pathways detailed in FIG. 1 and 34-36. However, additional suitable enzymes may be known to one skilled in the art.

Этап 1 отражает преобразование ацетил-Ко А в ацетоацетил-КоА. Указанный этап может быть катализирован тиолазой (т.е. ацетил-КоА-ацетилтрансферазой) (EC 2.3.1.9). Указанная тиолаза может представлять собой, например, ThlA из Clostridium, acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), PhaA из Cupriavidus necator (WP_013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB из Cupriavidus necator (WP_011615089.1) (SEQ ID NO: 3) или AtoB из Escherichia coli (NP_416728.1) (SEQ ID NO: 4). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 1 reflects the conversion of acetyl-Co A to acetoacetyl-CoA. This step can be catalyzed by a thiolase (ie acetyl-CoA acetyltransferase) (EC 2.3.1.9). Said thiolase may be, for example, ThlA from Clostridium, acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), PhaA from Cupriavidus necator (WP_013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB from Cupriavidus necator (WP_011615089. 1) (SEQ ID NO: 3) or AtoB from Escherichia coli (NP_416728.1) (SEQ ID NO: 4). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has native activity corresponding to this stage.

Этап 2 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в ацетоацетат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9), и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацилКоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12), и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрес- 4 043734 сия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 2 reflects the conversion of acetoacetyl-CoA to acetoacetate. This step can be catalyzed by CoA transferase (ie acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase) (EC 2.8.3.9). Said CoA transferase may be, for example, CtfAB, a heterodimer containing CtfA and CtfB subunits from Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6 ). This step can also be catalyzed by thioesterase (EC 3.1.2.20). Said thioesterase may be, for example, TesB from Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). This step may also be catalyzed by a hypothetical thioesterase, for example from Clostridium autoethanogenum or Clostridium ljungdahlii. Specifically, three hypothetical thioesterases have been identified in Clostridium autoethanogenum: (1) thioesterase 1 (AGY74947.1; annotated as palmitoyl-CoA hydrolase; SEQ ID NO: 8), (2) thioesterase 2 (AGY75747.1; annotated as 4hydroxybenzoyl -CoA thioesterase; SEQ ID NO: 9), and (3) thioesterase 3 (AGY75999.1; annotated as a hypothetical thioesterase; SEQ ID NO: 10). Three hypothetical thioesterases were also identified in Clostridium ljungdahlii: (1) thioesterase 1 (ADK15695.1; annotated as predicted acylCoA thioesterase 1; SEQ ID NO: 11), (2) thioesterase 2 (ADK16655.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 12), and (3) thioesterase 3 (ADK16959.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 13). This step can also be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.

Этап 3 отражает преобразование ацетоацетата в ацетон. Указанный этап может быть катализирован ацетоацетатдекарбоксилазой (EC 4.1.1.4). Указанная ацетоацетатдекарбоксилаза может представлять собой, например, Adc из Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). Указанный этап может также быть катализирован альфа-кетоизовалератдекарбоксилазой (EC 4.1.1.74). Указанная альфакетоизовалератдекарбоксилаза может представлять собой, например, KivD из Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Кроме того, Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. В редких случаях преобразование ацетоацетата в ацетон может происходить спонтанно. Однако спонтанное преобразование очень неэффективно; маловероятно, что оно может приводить к продуцированию выходных продуктов на желаемых уровнях.Step 3 reflects the conversion of acetoacetate to acetone. This step can be catalyzed by acetoacetate decarboxylase (EC 4.1.1.4). Said acetoacetate decarboxylase may be, for example, Adc from Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). This step can also be catalyzed by alpha-ketoisovalerate decarboxylase (EC 4.1.1.74). Said alpha-ketoisovalerate decarboxylase may be, for example, KivD from Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. In addition, Escherichia coli has no known native activity corresponding to this step. In rare cases, conversion of acetoacetate to acetone may occur spontaneously. However, spontaneous conversion is very inefficient; it is unlikely to produce output products at the desired levels.

Этап 4 отражает преобразование ацетона в изопропанол. Указанный этап может быть катализирован первичной: вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.2). Указанная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 4 reflects the conversion of acetone to isopropanol. This step can be catalyzed by primary: secondary alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.2). Said primary:secondary alcohol dehydrogenase may be, for example,

SecAdh изSecAdh from

Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh из Clostridium ljungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh из Clostridium ragsdalei (WPJH3239134.1) (SEQ ID NO: 18) или SecAdh из Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh from Clostridium ljungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh from Clostridium ragsdalei (WPJH3239134.1) (SEQ ID NO: 18) or SecAdh from Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).

Указанный этап может также быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.80), такой как SecAdh из Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Однако Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Нокдаун или нокаут указанного фермента у Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei приводит к продуцированию и накоплению ацетона, а не изопропанола (WO 2015/085015).This step can also be catalyzed by a primary:secondary alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.80), such as SecAdh from Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). However, Escherichia coli has no known native activity corresponding to this step. Knockdown or knockout of this enzyme in Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei leads to the production and accumulation of acetone rather than isopropanol (WO 2015/085015).

Этап 5 отражает преобразование ацетона в 3-гидроксиизовалерат. Указанный этап может быть катализирован гидроксиизовалератсинтазой, например, гидроксиметилглутарил-КоА-синтазой (ГМГ-КоАсинтазой) (EC 2.3.3.10) из Mus musculus (SEQ ID NO: 21) (US 2012/0110001).Step 5 reflects the conversion of acetone to 3-hydroxyisovalerate. This step can be catalyzed by hydroxyisovalerate synthase, for example, hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (HMG-CoA synthase) (EC 2.3.3.10) from Mus musculus (SEQ ID NO: 21) (US 2012/0110001).

Гидроксиметилглутарил-КоА-синтаза может быть сконструирована таким образом, чтобы ее активность увеличивалась. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase can be engineered to increase its activity. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 6 отражает преобразование 3-гидроксиизовалерата в изобутилен (изобутен). Указанный этап может быть катализирован гидроксиизовалератфосфорилазой/декарбоксилазой. Указанный этап может также быть катализирован мевалонатдифосфатдекарбоксилазой (гидроксиизовалератдекарбоксилазой) (EC 4.1.1.33). Указанная мевалонатдифосфатдекарбоксилаза может представлять собой, например,Step 6 reflects the conversion of 3-hydroxyisovalerate to isobutylene (isobutene). This step can be catalyzed by hydroxyisovalerate phosphorylase/decarboxylase. This step can also be catalyzed by mevalonate diphosphate decarboxylase (hydroxyisovalerate decarboxylase) (EC 4.1.1.33). Said mevalonate diphosphate decarboxylase may be, for example,

Mdd из Saccharomyces cerevisiae (САА96324.1) (SEQ ID NO:Mdd from Saccharomyces cerevisiae (CAA96324.1) (SEQ ID NO:

22) или Mdd из Picrophilus torridus (WP_011178157.1) (SEQ ID NO: 23) (US 2011/0165644; van Leeuwen, ApplMicrobiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012).22) or Mdd from Picrophilus torridus (WP_011178157.1) (SEQ ID NO: 23) (US 2011/0165644; van Leeuwen, ApplMicrobiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012).

Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 7 отражает преобразование ацетона в 3-гидроксиизовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксиизовалерил-КоА-синтазой. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 7 reflects the conversion of acetone to 3-hydroxyisovaleryl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxyisovaleryl-CoA synthase. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 8 отражает преобразование 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3-гидроксиизовалерат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетической тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium, autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9) и (3) тиоэстеразаStep 8 reflects the conversion of 3-hydroxyisovaleryl-CoA to 3-hydroxyisovalerate. This step can be catalyzed by CoA transferase (ie acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase) (EC 2.8.3.9). Said CoA transferase may be, for example, CtfAB, a heterodimer containing CtfA and CtfB subunits from Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6 ). This step can also be catalyzed by thioesterase (EC 3.1.2.20). Said thioesterase may be, for example, TesB from Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). This step may also be catalyzed by a hypothetical thioesterase, for example from Clostridium autoethanogenum or Clostridium ljungdahlii. Specifically, three hypothetical thioesterases have been identified in Clostridium, autoethanogenum: (1) thioesterase 1 (AGY74947.1; annotated as palmitoyl-CoA hydrolase; SEQ ID NO: 8), (2) thioesterase 2 (AGY75747.1; annotated as 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase; SEQ ID NO: 9) and (3) thioesterase

- 5 043734 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.- 5 043734 (AGY75999.1; annotated as a hypothetical thioesterase; SEQ ID NO: 10). Three hypothetical thioesterases have also been identified in Clostridium ljungdahlii: (1) thioesterase 1 (ADK15695.1; annotated as predicted acyl-CoA thioesterase 1; SEQ ID NO: 11), (2) thioesterase 2 (ADK16655.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 12) and (3) thioesterase 3 (ADK16959.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 13). This step can also be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.

Этап 9 отражает преобразование ацетил-КоА в 3-метил-2-оксопентаноат. Указанный этап охватывает ряд ферментативных реакций, вовлеченных в путь биосинтез изолейцина, который естественным образом присутствует у многих бактерий, в том числе Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (и Escherichia coli). Ферменты, вовлеченные в преобразование ацетил-КоА в 3-метил-2-оксопентаноат, могут включать цитрамалатсинтазу (EC 2.3.1.182), 3-изопропилмалатдегидратазу (EC 4.2.1.35), 3-изопропилмалатдегидрогеназу (EC 1.1.1.85), ацетолактатсинтазу (EC 2.2.1.6), кетол-кислотную редуктоизомеразу (EC 1.1.1.86) и/или дигидроксикислотную дегидратазу (EC 4.2.1.9). Указанная цитрамалатсинтаза может представлять собой, например, CimA из Clostridium autoethanogenum (AGY76958.1) (SEQ ID NO: 24) или CimA из Methanocaldococcus jannaschii (NP_248395.1) (SEQ ID NO: 25). Указанная 3-изопропилмалатдегидратаза может представлять собой, например, LeuCD из Clostridium autoethanogenum (WP_023162955.1, LeuC; AGY77204.1, LeuD) (последовательности SEQ ID NO: 26 и 27, соответственно) или LeuCD из Escherichia coli (NP_414614.1, LeuC; NP_414613.1, LeuD) (последовательности SEQ ID NO: 28 и 29, соответственно). Указанная 3изопропилмалатдегидрогеназа может представлять собой, например, LeuB из Clostridium autoethanogenum (WP_023162957.1) (SEQ ID NO: 30) или LeuB из Escherichia coli (NP_414615.4) (SEQ ID NO: 31). Указанная ацетолактатсинтаза может представлять собой, например, IlvBN из Clostridium autoethanogenum (AGY74359.1, IlvB; AGY74635.1, IlvB; AGY74360.1, IlvN) (последовательности SEQ ID NO: 32, 33 и 34, соответственно) или IlvBN из Escherichia coli (NP_418127.1, IlvB; NP_418126.1, IlvN) (последовательности SEQ ID NO: 35 и 36, соответственно). Указанная кетол-кислотная редуктоизомераза может представлять собой, например, IlvC из Clostridium autoethanogenum (WP_013238693.1) (SEQ ID NO: 37) или IlvC из Escherichia coli (NP_418222.1) (SEQ ID NO: 38). Указанная дигидроксикислотная дегидратаза может представлять собой, например, IlvD из Clostridium autoethanogenum (WP_013238694.1) (SEQ ID NO: 39) или IlvD из Escherichia coli (YP_026248.1) (SEQ ID NO: 40). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 9 reflects the conversion of acetyl-CoA to 3-methyl-2-oxopentanoate. This step involves a number of enzymatic reactions involved in the isoleucine biosynthesis pathway, which is naturally present in many bacteria, including Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (and Escherichia coli). Enzymes involved in the conversion of acetyl-CoA to 3-methyl-2-oxopentanoate may include citramalate synthase (EC 2.3.1.182), 3-isopropylmalate dehydratase (EC 4.2.1.35), 3-isopropylmalate dehydrogenase (EC 1.1.1.85), acetolactate synthase (EC 2.2.1.6), ketol acid reductoisomerase (EC 1.1.1.86) and/or dihydroxy acid dehydratase (EC 4.2.1.9). Said citramalate synthase may be, for example, CimA from Clostridium autoethanogenum (AGY76958.1) (SEQ ID NO: 24) or CimA from Methanocaldococcus jannaschii (NP_248395.1) (SEQ ID NO: 25). Said 3-isopropylmalate dehydratase may be, for example, LeuCD from Clostridium autoethanogenum (WP_023162955.1, LeuC; AGY77204.1, LeuD) (SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively) or LeuCD from Escherichia coli (NP_414614.1, LeuC ; NP_414613.1, LeuD) (sequences SEQ ID NO: 28 and 29, respectively). Said 3-isopropylmalate dehydrogenase may be, for example, LeuB from Clostridium autoethanogenum (WP_023162957.1) (SEQ ID NO: 30) or LeuB from Escherichia coli (NP_414615.4) (SEQ ID NO: 31). Said acetolactate synthase may be, for example, IlvBN from Clostridium autoethanogenum (AGY74359.1, IlvB; AGY74635.1, IlvB; AGY74360.1, IlvN) (SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively) or IlvBN from Escherichia coli (NP_418127.1, IlvB; NP_418126.1, IlvN) (SEQ ID NOs: 35 and 36, respectively). Said ketol acid reductoisomerase may be, for example, IlvC from Clostridium autoethanogenum (WP_013238693.1) (SEQ ID NO: 37) or IlvC from Escherichia coli (NP_418222.1) (SEQ ID NO: 38). Said dihydroxy acid dehydratase may be, for example, IlvD from Clostridium autoethanogenum (WP_013238694.1) (SEQ ID NO: 39) or IlvD from Escherichia coli (YP_026248.1) (SEQ ID NO: 40). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage.

Этап 10 отражает преобразование 3-метил-2-оксопентоаа в 2-метилбутаноил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кетоизовалератоксидоредуктазой (EC 1.2.7.7). Указанная кетоизовалератоксидоредуктаза может представлять собой, например, VorABCD из Methanothermobacter thermautotrophicus (WP_010876344.1, VorA; WP_010876343.1, VorB; WP_010876342.1, VorC; WP_010876341.1, VorD) (последовательности SEQ ID NO: 41-44, соответственно) или VorABCD из Pyrococcus furiosus (WP_011012106.1, VorA; WP_011012105.1, VorB; WP_011012108.1, VorC; WP_011012107.1, VorD) (последовательности SEQ ID NO: 45-48, соответственно). VorABCD представляет собой 4-субъединичный фермент. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 10 reflects the conversion of 3-methyl-2-oxopentoaa to 2-methylbutanoyl-CoA. This step can be catalyzed by ketoisovalerate oxidoreductase (EC 1.2.7.7). Said ketoisovalerate oxidoreductase may be, for example, VorABCD from Methanothermobacter thermautotrophicus (WP_010876344.1, VorA; WP_010876343.1, VorB; WP_010876342.1, VorC; WP_010876341.1, VorD) (sequences SEQ ID NO: 41-44, respectively) or VorABCD from Pyrococcus furiosus (WP_011012106.1, VorA; WP_011012105.1, VorB; WP_011012108.1, VorC; WP_011012107.1, VorD) (sequences SEQ ID NO: 45-48, respectively). VorABCD is a 4-subunit enzyme. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 11 отражает преобразование 2-метилбутаноил-КоА в 2-метилкротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 2-метилбутаноил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.3.99.12). Указанная 2метилбутаноил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой, например, AcdH из Streptomyces avermitilis (AAD44196.1 или ВАВ69160.1) (SEQ ID NO: 49) или AcdH из Streptomyces coelicolor (AAD44195.1) (SEQ ID NO: 50). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 11 reflects the conversion of 2-methylbutanoyl-CoA to 2-methylcrotonyl-CoA. This step can be catalyzed by 2-methylbutanoyl-CoA dehydrogenase (EC 1.3.99.12). Said 2methylbutanoyl-CoA dehydrogenase may be, for example, AcdH from Streptomyces avermitilis (AAD44196.1 or BAB69160.1) (SEQ ID NO: 49) or AcdH from Streptomyces coelicolor (AAD44195.1) (SEQ ID NO: 50). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 12 отражает преобразование 2-метилкротонил-КоА в 3-гидроксиизовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кротоназой/3-гидроксибутирил-КоА-дегидратазой (EC 4.2.1.55). Указанная кротоназа/3-гидроксибутирил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, Crt из Clostridium beijerinckii (ABR34202.1) (SEQ ID NO: 51), Crt из Clostridium acetobutylicum (Np_349318.1) (SEQ ID NO: 52) или LiuC из Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). Указанный этап может также быть катализирован кротонил-КоА-карбоксилазой-редуктазой (EC 1.3.1.86). Указанная кротонил-КоА-карбоксилазаStep 12 reflects the conversion of 2-methylcrotonyl-CoA to 3-hydroxyisovaleryl-CoA. This step can be catalyzed by crotonase/3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase (EC 4.2.1.55). Said crotonase/3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase may be, for example, Crt from Clostridium beijerinckii (ABR34202.1) (SEQ ID NO: 51), Crt from Clostridium acetobutylicum (Np_349318.1) (SEQ ID NO: 52) or LiuC from Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). This step can also be catalyzed by crotonyl-CoA carboxylase reductase (EC 1.3.1.86). Indicated crotonyl-CoA carboxylase

- 6 043734 редуктаза может представлять собой, например, Ccr из Treponema denticola (NP_971211.1) (SEQ ID NO: 53). Указанный этап может также быть катализирован кротонил-КоА-редуктазой (EC 1.3.1.44). Указанная кротонил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Ter из Euglena gracilis (AAW66853.1) (SEQ ID NO: 54). Указанный этап может также быть катализирован 3-гидроксипропионил-КоАдегидратазой (EC 4.2.1.116). Указанная 3-гидроксипропионил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, Msed_2001 из Metallosphaera sedula (WP_012021928.1). Указанный этап может также быть катализирован эноил-КоА-гидратазой. Указанная эноил-КоА-гидратаза (4.2.1.17) может представлять собой, например, YngF из Bacillus anthracis (WP_000787371.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.- 6 043734 the reductase may be, for example, Ccr from Treponema denticola (NP_971211.1) (SEQ ID NO: 53). This step can also be catalyzed by crotonyl-CoA reductase (EC 1.3.1.44). Said crotonyl-CoA reductase may be, for example, Ter from Euglena gracilis (AAW66853.1) (SEQ ID NO: 54). This step can also be catalyzed by 3-hydroxypropionyl-CoAdehydratase (EC 4.2.1.116). Said 3-hydroxypropionyl-CoA dehydratase may be, for example, Msed_2001 from Metallosphaera sedula (WP_012021928.1). This step can also be catalyzed by enoyl-CoA hydratase. Said enoyl-CoA hydratase (4.2.1.17) may be, for example, YngF from Bacillus anthracis (WP_000787371.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 13 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.1.1.157). Указанная 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой, например, Hbd из Clostridium beijerinckii (WP_011967675.1) (SeQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NP_349314.1) (SEQ ID NO: 56) или Hbd1 из Clostridium kluyveri (WP_011989027.1) (SEQ ID NO: 57). Указанный этап может также быть катализирован ацетоацетил-КоА-редуктазой (EC 4.2.1.36). Указанная ацетоацетил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, PhaB из Cupriavidus necator (WP_010810131.1) (SEQ ID NO: 58). Указанный этап может также быть катализирован ацетоацетил-КоА-гидратазой (EC 4.2.1.119). Следует отметить, что PhaB является R-специфической, a Hbd является S-специфической. Кроме того, Hbd1 из Clostridium, kluyveri является НАДФН-зависимой, а Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 13 reflects the conversion of acetoacetyl-CoA to 3-hydroxybutyryl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (EC 1.1.1.157). Said 3hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase may be, for example, Hbd from Clostridium beijerinckii (WP_011967675.1) (SeQ ID NO: 55), Hbd from Clostridium acetobutylicum (NP_349314.1) (SEQ ID NO: 56) or Hbd1 from Clostridium kluyveri (WP_011989027.1) (SEQ ID NO: 57). This step can also be catalyzed by acetoacetyl-CoA reductase (EC 4.2.1.36). Said acetoacetyl-CoA reductase may be, for example, PhaB from Cupriavidus necator (WP_010810131.1) (SEQ ID NO: 58). This step can also be catalyzed by acetoacetyl-CoA hydratase (EC 4.2.1.119). It should be noted that PhaB is R-specific and Hbd is S-specific. In addition, Hbd1 from Clostridium, kluyveri is NADPH-dependent, and Hbd from Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii are NADH-dependent. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 14 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. Указанный этап может быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9) и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 14 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to 3-hydroxybutyrate. This step can be catalyzed by thioesterase (EC 3.1.2.20). Said thioesterase may be, for example, TesB from Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). This step may also be catalyzed by a hypothetical thioesterase, for example from Clostridium autoethanogenum or Clostridium ljungdahlii. Specifically, three hypothetical thioesterases have been identified in Clostridium autoethanogenum: (1) thioesterase 1 (AGY74947.1; annotated as palmitoyl-CoA hydrolase; SEQ ID NO: 8), (2) thioesterase 2 (AGY75747.1; annotated as 4 -hydroxybenzoyl-CoA thioesterase; SEQ ID NO: 9) and (3) thioesterase 3 (AGY75999.1; annotated as a hypothetical thioesterase; SEQ ID NO: 10). Three hypothetical thioesterases have also been identified in Clostridium ljungdahlii: (1) thioesterase 1 (ADK15695.1; annotated as predicted acyl-CoA thioesterase 1; SEQ ID NO: 11), (2) thioesterase 2 (ADK16655.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 12) and (3) thioesterase 3 (ADK16959.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 13). This step can also be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.

Этап 15 отражает преобразование 3-гидроксибутирата в ацетоацетат. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутиратдегидрогеназой (EC 1.1.1.30). Указанная 3-гидроксибутиратдегидрогеназа может представлять собой, например, Bdh1 из Ralstonia pickettii (ВАЕ72684.1) (SEQ ID NO: 60) или Bdh2 из Ralstonia pickettii (BAE72685.1) (SEQ ID NO: 61). Указанная обратная реакция, преобразование ацетоацетата в 3-гидроксибутират, может быть катализирована другими 3гидроксибутиратдегидрогеназными (EC 1.1.1.30) ферментами. Например, преобразование ацетоацетата в 3-гидроксибутират может быть катализировано Bdh из Clostridium autoethanogenum (AGY75962) (SEQ ID NO: 62). Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei предположительно содержат ферменты с аналогичной активностью. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 15 reflects the conversion of 3-hydroxybutyrate to acetoacetate. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.30). Said 3-hydroxybutyrate dehydrogenase may be, for example, Bdh1 from Ralstonia pickettii (BAE72684.1) (SEQ ID NO: 60) or Bdh2 from Ralstonia pickettii (BAE72685.1) (SEQ ID NO: 61). This reverse reaction, the conversion of acetoacetate to 3-hydroxybutyrate, can be catalyzed by other 3hydroxybutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.30) enzymes. For example, the conversion of acetoacetate to 3-hydroxybutyrate can be catalyzed by Bdh from Clostridium autoethanogenum (AGY75962) (SEQ ID NO: 62). Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei are thought to contain enzymes with similar activities. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 16 отражает преобразование 3-гидроксибутирата в 3-гидроксибутирилальдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза (AOR) может представлять собой, например, AOR из Clostridium autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (последовательности SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно) или AOR из Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (последовательности SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно). Согласно дополнительным вариантам реализации указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза, например, может представлять собой любой источник или может проStep 16 reflects the conversion of 3-hydroxybutyrate to 3-hydroxybutyryl aldehyde. This step can be catalyzed by aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.5). Said aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) may be, for example, an AOR from Clostridium autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (SEQ ID NOs: 63 and 64, respectively) or an AOR from Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083. 1) (sequences SEQ ID NO: 65 and 66, respectively). In further embodiments, said aldehyde:ferredoxin oxidoreductase, for example, may be any source or may be

- 7 043734 исходить из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:- 7 043734 come from any of the following sources, the sequences of which are publicly available:

Описание Description Микроорганизм Microorganism Номер доступа Access number GenelD GenelD альдегид: ферредо ксино ксидоре дуктаза aldehyde: ferredo xino xidore ductase Acidilobus saccharovorans 345-15 Acidilobus saccharovorans 345-15 NC-014374.1 NC-014374.1 9498931 9498931 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Acidilobus saccharovorans 345-15 Acidilobus saccharovorans 345-15 NC__014374.1 NC__014374.1 9499504 9499504 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Acidilobus saccharovorans 345-15 Acidilobus saccharovorans 345-15 NC_014374.1 NC_014374.1 9499550 9499550 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Acidilobus saccharovorans 345-15 Acidilobus saccharovorans 345-15 NC_014374.1 NC_014374.1 9498997 9498997 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum boonei T469 Aciduliprofundum boonei T469 NC 013926.1 NC 013926.1 8828075 8828075 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum boonei T469 Aciduliprofundum boonei T469 NC 013926.1 NC 013926.1 8828511 8828511 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum boonei T469 Aciduliprofundum boonei T469 NC 013926.1 NC 013926.1 8828305 8828305 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum boonei T469 Aciduliprofundum boonei T469 NC 013926.1 NC 013926.1 8827762 8827762 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum boonei T469 Aciduliprofundum boonei T469 NC_013926.1 NC_013926.1 8827370 8827370 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum sp. A4AR08-339 Aciduliprofundum sp. A4AR08-339 NC 019942.1 NC 019942.1 14306579 14306579 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum sp. MAR08-339 Aciduliprofundum sp. MAR08-339 NC 019942.1 NC 019942.1 14306982 14306982 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum sp. MAR08-339 Aciduliprofundum sp. MAR08-339 NC 019942.1 NC 019942.1 14306639 14306639 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aciduliprofundum sp. MAR08-339 Aciduliprofundum sp. MAR08-339 NC019942.1 NC019942.1 14307339 14307339 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Aeropyrum pemix KI Aeropyrum pemix KI NC 000854.2 NC 000854.2 1444491 1444491 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 NC 000917.1 NC 000917.1 1483287 1483287 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 NC_000917.1 NC_000917.1 1483233 1483233 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 NC_000917.1 NC_000917.1 1483554 1483554 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 NC_000917.1 NC_000917.1 1485513 1485513 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus profundus DSM 5631 Archaeoglobus profundus DSM 5631 NCJH3741.1 NCJH3741.1 8738726 8738726 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus profundus DSM 5631 Archaeoglobus profundus DSM 5631 NC 013741.1 NC 013741.1 8740019 8740019 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC 021169.1 NC 021169.1 15392228 15392228 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC_021169.1 NC_021169.1 15393814 15393814 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC_021169.1 NC_021169.1 15391826 15391826 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC_021169.1 NC_021169.1 15393763 15393763 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 NC_021169.1 NC_021169.1 15393491 15393491 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus veneficus SNP6 Archaeoglobus veneficus SNP6 NC_015320.1 NC_015320.1 10393142 10393142 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Archaeoglobus veneficus SNP6 Archaeoglobus veneficus SNP6 NC 015320.1 NC 015320.1 10395048 10395048 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldisphaera lagunensis DSM 15908 Caldisphaera lagunensis DSM 15908 NC_019791.1 NC_019791.1 14212403 14212403 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldisphaera lagunensis DSM 15908 Caldisphaera lagunensis DSM 15908 NCO19791.1 NCO19791.1 14211524 14211524 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldisphaera lagunensis DSM 15908 Caldisphaera lagunensis DSM 15908 NC__019791.1 NC__019791.1 14212092 14212092 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldisphaera lagunensis DSM 15908 Caldisphaera lagunensis DSM 15908 NC_019791.1 NC_019791.1 14212561 14212561 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldivirga maquilingensis IC-167 Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 NC 009954.1 5710116 5710116 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldivirga maquilingensis IC-167 Caldivirga maquilingensis IC-167 NC_009954.1 NC_009954.1 5710117 5710117 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldivirga maquilingensis IC-167 Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 NC 009954.1 5709088 5709088 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldivirga maquilingensis IC-167 Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 NC 009954.1 5708891 5708891 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldivirga maquilingensis IC-167 Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 NC 009954.1 5710478 5710478 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldivirga maquilingensis IC-167 Caldivirga maquilingensis IC-167 NC009954.1 NC009954.1 5710457 5710457 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Caldivirga maquilingensis IC-167 Caldivirga maquilingensis IC-167 NC 009954.1 NC 009954.1 5709696 5709696 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Candidatus Caldiarchaeum Candidatus Caldiarchaeum NC 022786.1 NC 022786.1 17602865 17602865 subterraneum subterraneum шп>дегид:ферредоксиноксидоредуктаза sp>dehyde:ferredoxin oxidoreductase Candidatus Korarchaeum cryptofilum Candidatus Korarchaeum cryptofilum NC 010482.1 NC 010482.1 6094361 6094361 OPF8 OPF8 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Candidatus Korarchaeum cryptofilum Candidatus Korarchaeum cryptofilum NC 010482.1 NC 010482.1 6094198 6094198 OPF8 OPF8 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Candidatus Korarchaeum cryptofilum Candidatus Korarchaeum cryptofilum NC 010482.1 NC 010482.1 6093546 6093546 OPF8 OPF8 альдегид: ферредо ксино ксидоре ду ктаза aldehyde: ferredo xino xidore do ctaza Candidatus Korarchaeum cryptofilum Candidatus Korarchaeum cryptofilum NC010482.1 NC010482.1 6093319 6093319 OPF8 OPF8

- 8 043734- 8 043734

альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 NC_010482.1 NC_010482.1 6094057 6094057 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 ' ' Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 '' NC_010482.1 NC_010482.1 6093563 6093563 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Chloroflexus aurantiacus J-10-fl Chloroflexus aurantiacus J-10-fl NC_010175.1 NC_010175.1 5828639 5828639 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 NC_003030.1 NC_003030.1 1118201 1118201 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Clostridium botulinum А, штамм ATCC 3502 Clostridium botulinum A, strain ATCC 3502 NC_009495.1 NC_009495.1 5187636 5187636 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Clostridium botulinum А, шт. Hall Clostridium botulinum A, pcs. Hall NC_009698.1 NC_009698.1 5400593 5400593 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfovibrio vulgaris, шт. Hildenborough Desulfovibrio vulgaris, pcs. Hildenborough NC_002937.3 NC_002937.3 2796664 2796664 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfovibrio vulgaris, шт. Hildenborough Desulfovibrio vulgaris, pcs. Hildenborough NC_002937.3 NC_002937.3 2795337 2795337 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfurococcus fermentans DSM 16532 Desulfurococcus fermentans DSM 16532 NC-018001.1 NC-018001.1 13061477 13061477 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfurococcus fermentans DSM 16532 Desulfurococcus fermentans DSM 16532 NC_018001.1 NC_018001.1 13061068 13061068 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfurococcus fermentans DSM 16532 Desulfurococcus fermentans DSM 16532 NC_018001.1 NC_018001.1 13062247 13062247 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfurococcus kamchatkensis 1221η Desulfurococcus kamchatkensis 1221η NC_011766.1 NC_011766.1 7171099 7171099 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfurococcus kamchatkensis 1221η Desulfurococcus kamchatkensis 1221η NC_011766.1 NC_011766.1 7171759 7171759 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfurococcus kamchatkensis 1221η Desulfurococcus kamchatkensis 1221η NC_011766.1 NC_011766.1 7170725 7170725 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Desulfurococcus mucosus DSM 2162 Desulfurococcus mucosus DSM 2162 NCJ)14961.1 NCJ)14961.1 10152801 10152801 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ferroglobus placidus DSM 10642 Ferroglobus placidus DSM 10642 NC__013849.1 NC__013849.1 8778536 8778536 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ferroglobus placidus DSM 10642 Ferroglobus placidus DSM 10642 NC_013849.1 NC_013849.1 8779007 8779007 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ferroglobus placidus DSM 10642 Ferroglobus placidus DSM 10642 NC_013849.1 NC_013849.1 8778940 8778940 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ferroglobus placidus DSM 10642 Ferroglobus placidus DSM 10642 NC_013849.1 NC_013849.1 8779639 8779639 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ferroglobus placidus DSM 10642 Ferroglobus placidus DSM 10642 NC_013849.1 NC_013849.1 8778820 8778820 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ferroglobus placidus DSM 10642 Ferroglobus placidus DSM 10642 NC013849.1 NC013849.1 8778745 8778745 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ferroglobus placidus DSM 10642 Ferroglobus placidus DSM 10642 NC__013849.1 NC__013849.1 8779874 8779874 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Fervidicoccus fontis Kam940 Fervidicoccus fontis Kam940 NC_017461.1 NC_017461.1 12449263 12449263 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Fervidicoccus fontis Kam940 Fervidicoccus fontis Kam940 NC-017461.1 NC-017461.1 12449994 12449994 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Fervidicoccus fontis Kam940 Fervidicoccus fontis Kam940 NC-017461.1 NC-017461.1 12449294 12449294 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Fervidicoccus fontis Kam940 Fervidicoccus fontis Kam940 NC_017461.1 NC_017461.1 12449682 12449682 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Geobacter sulfurreducens PCA Geobacter sulfurreducens PCA NC_002939.5 NC_002939.5 2685730 2685730 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Geobacter sulfurreducens PCA Geobacter sulfurreducens PCA NC_002939.5 NC_002939.5 2687039 2687039 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halalkalicoccus jeotgali B3 Halalkalicoccus jeotgali B3 NC-014297.1 NC-014297.1 9418623 9418623 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halalkalicoccus jeotgali B3 Halalkalicoccus jeotgali B3 NC_P 14297.1 NC_P 14297.1 9418760 9418760 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halalkalicoccus jeotgali B3 Halalkalicoccus jeotgali B3 NC_014297,1 NC_014297,1 9420819 9420819 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halalkalicoccus jeotgali B3 Halalkalicoccus jeotgali B3 NC_014297.1 NC_014297.1 9418748 9418748 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloarcula hispanica ATCC 33960 Haloarcula hispanica ATCC 33960 NC_015948.1 NC_015948.1 11051410 11051410 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloarcula hispanica ATCC 33960 Haloarcula hispanica ATCC 33960 NCP15948.1 NCP15948.1 11050783 11050783 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloarcula hispanica ATCC 33960 Haloarcula hispanica ATCC 33960 NC_015948.1 NC_015948.1 11051433 11051433 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloarcula hispanica N601 Haloarcula hispanica N601 NC_023013.1 NC_023013.1 23805333 23805333 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloarcula hispanica N601 Haloarcula hispanica N601 NC-023013.1 NC-023013.1 23805138 23805138 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloarcula hispanica N601 Haloarcula hispanica N601 NC_023013.1 NC_023013.1 23804665 23804665 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloarcula marismortui ATCC 43049 Haloarcula marismortui ATCC 43049 NC__006396.1 NC__006396.1 3127969 3127969 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloarcula marismortui ATCC 43049 Haloarcula marismortui ATCC 43049 NC_006396.1 NC_006396.1 3129232 3129232 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloferax mediterranei ATCC 33500 Haloferax mediterranei ATCC 33500 NCP17941.2 NCP17941.2 13028168 13028168 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloferax mediterranei ATCC 33500 Haloferax mediterranei ATCC 33500 NC_017941.2 NC_017941.2 13028399 13028399 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloferax volcanii DS2 Haloferax volcanii DS2 NCP13964.1 NCP13964.1 8919329 8919329 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloferax volcanii DS2 Haloferax volcanii DS2 NC_013964.1 NC_013964.1 8919033 8919033 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloferax volcanii DS2 Haloferax volcanii DS2 NC_013967.1 NC_013967.1 8926544 8926544

- 9 043734- 9 043734

альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halogeometricum borinquense DSM 11551 Halogeometricum borinquense DSM 11551 NC_014735.1 NC_014735.1 9989054 9989054 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halogeometricum borinquense DSM 11551 Halogeometricum borinquense DSM 11551 NC_014729.1 NC_014729.1 9994424 9994424 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halogeometricum borinquense DSM 11551 Halogeometricum borinquense DSM 11551 NC_014729.1 NC_014729.1 9992444 9992444 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase галофильная архея DL31 halophilic archaea DL31 NC__015954.1 NC__015954.1 11095016 11095016 альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase галофильная архея DL31 halophilic archaea DL31 NC__015954.1 NC__015954.1 11095541 11095541 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase галофильная архея DL31 halophilic archaea DL31 NC_015954.1 NC_015954.1 11094595 11094595 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase галофильная архея DL31 halophilic archaea DL31 NC__015954.1 NC__015954.1 11096497 11096497 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase галофильная архея DL31 halophilic archaea DL31 NC_015954.1 NC_015954.1 11094563 11094563 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase галофильная архея DL31 halophilic archaea DL31 NC__015954.1 NC__015954.1 11095602 11095602 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halopiger xanaduensis SH-б Halopiger xanaduensis SH-b NC__015666.1 NC__015666.1 10799161 10799161 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halopiger xanaduensis SH-б Halopiger xanaduensis SH-b NC_015658.1 NC_015658.1 10795465 10795465 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halopiger xanaduensis SH-6 Halopiger xanaduensis SH-6 NC_015666.1 NC_015666.1 10798686 10798686 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Halopiger xanaduensis SH-6 Halopiger xanaduensis SH-6 NC_015666.1 NC_015666.1 10796679 10796679 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 NC_012029.1 NC_012029.1 7400122 7400122 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 NC__012029.1 NC__012029.1 7400291 7400291 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 Halorubrum lacusprofimdi ATCC 49239 NC__012029.1 NC__012029.1 7400689 7400689 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC_013744.1 NC_013744.1 8744461 8744461 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC__013744.1 NC__013744.1 8744695 8744695 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC__013743.1 NC__013743.1 8740954 8740954 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC__013745.1 NC__013745.1 8745418 8745418 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC_013743.1 NC_013743.1 8742968 8742968 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NQ013743.1 NQ013743.1 8741246 8741246 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC__013743.1 NC__013743.1 8741269 8741269 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 NC_013745.1 NC_013745.1 8745313 8745313 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Hyperthermus butilicus DSM 5456 Hyperthermus butilicus DSM 5456 NC_008818.1 NC_008818.1 4781896 4781896 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Hyperthermus butilicus DSM 5456 Hyperthermus butilicus DSM 5456 NC_008818.1 NC_008818.1 4782266 4782266 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Hyperthermus butilicus DSM 5456 Hyperthermus butilicus DSM 5456 NC-008818.1 NC-008818.1 4782804 4782804 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Hyperthermus butilicus DSM 5456 Hyperthermus butilicus DSM 5456 NC_008818.1 NC_008818.1 4781774 4781774 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ignicoccus hospitalis ΚΙΝ4/Ί Ignicoccus hospitalis ΚΙΝ4/Ί NC__009776.1 NC__009776.1 5562477 5562477 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ignicoccus hospitalis ΚΙΝ4/Ί Ignicoccus hospitalis ΚΙΝ4/Ί NC009776.1 NC009776.1 5562774 5562774 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Ignisphaera aggregans DSM 17230 Ignisphaera aggregans DSM 17230 NC__014471.1 NC__014471.1 9716798 9716798 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanocaldococcusjannaschii DSM 2661 Methanocaldococcusjannaschii DSM 2661 NC_000909.1 NC_000909.1 1452083 1452083 альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanocella arvoryzae MRE50 Methanocella arvoryzae MRE50 NC__009464.1 NC__009464.1 5142690 5142690 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanocella arvoryzae MRE50 Methanocella arvoryzae MRE50 NC-009464.1 NC-009464.1 5143773 5143773 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanocella conradii HZ254 Methanocella conradii HZ254 NC_017034.1 NC_017034.1 11972399 11972399 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanocella conradii HZ254 Methanocella conradii HZ254 NC__017034.1 NC__017034.1 11971349 11971349 альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanocella paludicola SANAE Methanocella paludicola SANAE NC__013665.1 NC__013665.1 8680711 8680711 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanocella paludicola SANAE Methanocella paludicola SANAE NC013665.1 NC013665.1 8680676 8680676 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanocorpusculum labreanum Z Methanocorpusculum labreanum Z NC_008942.1 NC_008942.1 4795790 4795790 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanoculleus marisnigri JR1 Methanoculleus marisnigri JR1 NC_009051.1 NC_009051.1 4847673 4847673 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanohalobium evestigatum Z-7303 Methanohalobium evestigatum Z-7303 NC_014253.1 NC_014253.1 9347460 9347460 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanohalobium evestigatum Z-7303 Methanohalobium evestigatum Z-7303 NC-014253.1 NC-014253.1 9347022 9347022 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanolobus psychrophilus RI 5 Methanolobus psychrophilus RI 5 NC-018876.1 NC-018876.1 13845119 13845119 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Methanomethylovorans hollandica DSM 15978 Methanomethylovorans hollandica DSM 15978 NC-019977.1 NC-019977.1 14408029 14408029 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Methanosaeta harundinacea 6Ac Methanosaeta harundinacea 6Ac NC-017527.1 NC-017527.1 12511443 12511443

- 10 043734 альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид: ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза- 10 043734 aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxin oxidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde :ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase ald egid:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxin oxidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxin oxidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde :ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreduct pelvis aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase

Methanosaeta thermophila PT Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina barkeri, шт. Fusaro Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOlMethanosaeta thermophila PT Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina barkeri, pcs. Fusaro Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl

Methanosphaerula palustris El-9c Methano spirillum hungatei JF-1 Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema sp. J7-2Methanosphaerula palustris El-9c Methano spirillum hungatei JF-1 Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba mag adii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema sp. J7-2

Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4

Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Pyrobaculum aerophilum, шт. IM2 Pyrobaculum aerophilum, шт. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, шт. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, шт. IM2 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Pyrobaculum aerophilum , pcs. IM2 Pyrobaculum aerophilum, pcs. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, pcs. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, pcs. IM2 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514

NC_008553.1NC_008553.1

NC_015676.1NC_015676.1

NC__003552.1NC__003552.1

NC_003552.1NC_003552.1

NC_003552.1NC_003552.1

NCJ)07355.1NCJ)07355.1

NC_003901.1NC_003901.1

NC-003901.1NC-003901.1

NC003901.1NC003901.1

NC_020389.1NC_020389.1

NC-020389.1NC-020389.1

NC__020389.1NC__020389.1

NC_011832.1NC_011832.1

NC__007796.1NC__007796.1

NC_016112.1NC_016112.1

NC_007644.1NC_007644.1

NC_007644.1NC_007644.1

NC_007644.1NC_007644.1

NC-013922.1NC-013922.1

NC-013922.1NC-013922.1

NC__013 923.1NC__013 923.1

NC__013922.1NC__013922.1

NC_019962.1NC_019962.1

NC_019962.1NC_019962.1

NC__019962.1NC__019962.1

NC-018224.1NC-018224.1

NC_019792.1NC_019792.1

NC_019792.1NC_019792.1

NC_019792.1NC_019792.1

NC_019792.1NC_019792.1

NC_019792.1NC_019792.1

NC_019792.1NC_019792.1

NCJH9974.1NCJH9974.1

NC019974.1NC019974.1

NCJH9974.1NCJH9974.1

NC__019974.1NC__019974.1

NC-020388.1NC-020388.1

NC-020388.1NC-020388.1

NC_020388.1NC_020388.1

NC__007427.1NC__007427.1

NC-007426.1NC-007426.1

NC__007426.1NC__007426.1

NC__007426.1NC__007426.1

NC__003364.1NC__003364.1

NC-003364.1NC-003364.1

NC_003364.1NC_003364.1

NC-003364.1NC-003364.1

NC-009376.1NC-009376.1

NC-009376.1NC-009376.1

NC_009376.1NC_009376.1

4462364 10822365 1475882 1474856 1473602 3625763 1479263 1481668 1480987 14656065 14656771 14654304 7271108 3924565 11361147 3831332 3830998 3831866 8824961 8823392 8826737 8825516 14335278 14333050 14333754 13349954 14210296 14207133 14209682 14207576 14206941 14206532 14403316 14405255 14403781 14402014 14651997 14652892 14651999 3694680 3702508 3702507 3702509 1464236 1464102 1465126 1465445 5055904 5055700 50548814462364 10822365 1475882 1474856 1473602 3625763 1479263 1481668 1480987 14656065 14656771 14654304 7271108 3924565 11361 147 3831332 3830998 3831866 8824961 8823392 8826737 8825516 14335278 14333050 14333754 13349954 14210296 14207133 14209682 14207576 14206941 14206532 14403316 14405255 14403781 14402014 14651997 14652892 14651999 3694680 3702508 3702507 3702509 1 464236 1464102 1465126 1465445 5055904 5055700 5054881

- 11 043734- 11 043734

альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum arsenaticum DSM13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM13514 NC_009376.1 NC_009376.1 5054644 5054644 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 NC 009376.1 NC 009376.1 5054547 5054547 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum calidifontis JCM11548 Pyrobaculum calidifontis JCM11548 NC_009073.1 NC_009073.1 4910224 4910224 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 NC_009073.1 NC_009073.1 4908822 4908822 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 NC_009073.1 NC_009073.1 4909927 4909927 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 NC_009073.1 NC_009073.1 4910099 4910099 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum islandicum DSM 4184 Pyrobaculum islandicum DSM 4184 NC 008701.1 NC 008701.1 4617364 4617364 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum islandicum DSM 4184 Pyrobaculum islandicum DSM 4184 NC_008701.1 NC_008701.1 4616724 4616724 альдегид :ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum islandicum DSM 4184 Pyrobaculum islandicum DSM 4184 NC 008701.1 NC 008701.1 4617494 4617494 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum neutrophilum V24Sta Pyrobaculum neutrophilum V24Sta NC_010525.1 NC_010525.1 6165427 6165427 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum neutrophilum V24Sta Pyrobaculum neutrophilum V24Sta NC_010525.1 NC_010525.1 6164958 6164958 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum neutrophilum V24Sta Pyrobaculum neutrophilum V24Sta NC_010525.1 NC_010525.1 6164976 6164976 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum oguniense TE7 Pyrobaculum oguniense TE7 NC__016885.1 NC__016885.1 11853778 11853778 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum oguniense TE7 Pyrobaculum oguniense TE7 NC_016885.1 NC_016885.1 11854024 11854024 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum oguniense TE7 Pyrobaculum oguniense TE7 NC_016885.1 NC_016885.1 11856490 11856490 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum oguniense TE7 Pyrobaculum oguniense TE7 NC_016885.1 NC_016885.1 11856176 11856176 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum oguniense ΊΈ7 Pyrobaculum oguniense ΊΈ7 NC_016885.1 NC_016885.1 11854908 11854908 альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum sp. 1860 Pyrobaculum sp. 1860 NC_016645.1 NC_016645.1 11594868 11594868 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum sp. 1860 Pyrobaculum sp. 1860 NC_016645.1 NC_016645.1 11596631 11596631 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrobaculum sp. 1860 Pyrobaculum sp. 1860 NC_016645.1 NC_016645.1 11594049 11594049 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus abyssi GE5 Pyrococcus abyssi GE5 NC_000868.1 NC_000868.1 1496313 1496313 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus abyssi GES Pyrococcus abyssi GES NC_000868.1 NC_000868.1 1495669 1495669 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus abyssi GE5 Pyrococcus abyssi GE5 NC_000868.1 NC_000868.1 1496580 1496580 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Pyrococcus abyssi GE5 Pyrococcus abyssi GE5 NC_000868.1 NC_000868.1 1495287 1495287 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus furiosus GOMI Pyrococcus furiosus GOMI NC_018092.1 NC_018092.1 13302148 13302148 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus furiosus GOMI Pyrococcus furiosus GOMI NC_018092.1 NC_018092.1 13301806 13301806 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Pyrococcus furiosus COM1 Pyrococcus furiosus COM1 NC_018092.1 NC_018092.1 13301219 13301219 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus furiosus GOMI Pyrococcus furiosus GOMI NC_018092.1 NC_018092.1 13300785 13300785 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus furiosus DSM 3638 Pyrococcus furiosus DSM 3638 NC-003413.1 NC-003413.1 1468181 1468181 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus furiosus DSM 3638 Pyrococcus furiosus DSM 3638 NC_003413.1 NC_003413.1 1469073 1469073 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Pyrococcus fiiriosus DSM 3638 Pyrococcus fiiriosus DSM 3638 NC_003413.1 NC_003413.1 1469843 1469843 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus horikoshii OT3 Pyrococcus horikoshii OT3 NC_000961.1 NC_000961.1 1443218 1443218 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus horikoshii OT3 Pyrococcus horikoshii OT3 NC_000961.1 NC_000961.1 1443341 1443341 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus horikoshii OT3 Pyrococcus horikoshii OT3 NC000961.1 NC000961.1 1443932 1443932 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus horikoshii OT3 Pyrococcus horikoshii OT3 NC_000961.1 NC_000961.1 1443598 1443598 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus sp. NA2 Pyrococcus sp. NA2 NC_015474.1 NC_015474.1 10555029 10555029 альдегвд:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus sp. NA2 Pyrococcus sp. NA2 NC__015474.1 NC__015474.1 10554020 10554020 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus sp. NA2 Pyrococcus sp. NA2 NCJ)15474.1 NCJ)15474.1 10555341 10555341 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus sp. ST04 Pyrococcus sp. ST04 NC_017946.1 NC_017946.1 13022107 13022107 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus sp. ST04 Pyrococcus sp. ST04 NC_017946.1 NC_017946.1 13022436 13022436 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus sp. ST04 Pyrococcus sp. ST04 NC-017946.1 NC-017946.1 13021314 13021314 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus yayanosii CH1 Pyrococcus yayanosii CH1 NC_015680.1 NC_015680.1 10837518 10837518 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus yayanosii CH1 Pyrococcus yayanosii CH1 NC_015680.1 NC_015680.1 10837112 10837112 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrococcus yayanosii CH1 Pyrococcus yayanosii CH1 NC_015680.1 NC_015680.1 10837264 10837264 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrolobus fumarii 1A Pyrolobus fumarii 1A NC_015931.1 NC_015931.1 11138144 11138144 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrolobus fumarii 1A Pyrolobus fumarii 1A NCJ115931.1 NCJ115931.1 11138776 11138776 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Pyrolobus fumarii 1A Pyrolobus fumarii 1A NC_pi5931.1 NC_pi5931.1 11139127 11139127 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 NC_007643.1 NC_007643.1 3833668 3833668 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Staphylothermus hellenicus DSM 12710 Staphylothermus hellenicus DSM 12710 NC_014205.1 NC_014205.1 9234557 9234557 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Staphylothermus hellenicus DSM 12710 Staphylothermus hellenicus DSM 12710 NC_014205.1 NC_014205.1 9233414 9233414

- 12 043734- 12 043734

альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Staphylothermus hellenicus DSM12710 Staphylothermus hellenicus DSM12710 NC 014205.1 NC 014205.1 9234134 9234134 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Staphylothermus hellenicus DSM 12710 Staphylothermus hellenicus DSM 12710 NC 014205.1 NC 014205.1 9234110 9234110 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Staphylothermus marinus Fl Staphylothermus marinus Fl NC 009033.1 NC 009033.1 4907444 4907444 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Staphylothermus marinus Fl Staphylothermus marinus Fl NC_009033.1 NC_009033.1 4907343 4907343 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 NC 013522.1 NC 013522.1 8630284 8630284 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 NC_013522.1 NC_013522.1 8630027 8630027 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 NC_013522.1 NC_013522.1 8630623 8630623 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.Bl Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.Bl NC 015958.1 NC 015958.1 11082596 11082596 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus barophilus MP Thermococcus barophilus MP NC__014804.1 NC__014804.1 10041639 10041639 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus barophilus MP Thermococcus barophilus MP NC__014804.1 NC__014804.1 10041106 10041106 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus barophilus MP Thermococcus barophilus MP NC_014804.1 NC_014804.1 10042460 10042460 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus cleftensis Thermococcus cleftensis NC_018015.1 NC_018015.1 13037745 13037745 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Thermococcus cleftensis Thermococcus cleftensis NC_018015.1 NC_018015.1 13038896 13038896 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus cleftensis Thermococcus cleftensis NC_018015.1 NC_018015.1 13037242 13037242 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Thermococcus gammatolerans EJ3 Thermococcus gammatolerans EJ3 NC__012804.1 NC__012804.1 7988317 7988317 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза. aldehyde:ferredoxin oxidoreductase. Thermococcus gammatolerans EJ3 Thermococcus gammatolerans EJ3 NC_012804.1 NC_012804.1 7987451 7987451 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus kodakarensis KOD1 Thermococcus kodakarensis KOD1 NC-006624.1 NC-006624.1 3233851 3233851 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus kodakarensis KOD1 Thermococcus kodakarensis KOD1 NC-006624.1 NC-006624.1 3233735 3233735 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus litoralis DSM 5473 Thermococcus litoralis DSM 5473 NC_022084.1 NC_022084.1 16550741 16550741 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus litoralis DSM 5473 Thermococcus litoralis DSM 5473 NC_022084.1 NC_022084.1 16548761 16548761 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus litoralis DSM 5473 Thermococcus litoralis DSM 5473 NC-022084.1 NC-022084.1 16550885 16550885 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus onnurineus NAI Thermococcus onnurineus NAI NC__011529.1 NC__011529.1 7018383 7018383 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus onnurineus NAI Thermococcus onnurineus NAI NC__011529.1 NC__011529.1 7016739 7016739 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus onnurineus NAI Thermococcus onnurineus NAI NC011529.1 NC011529.1 7017051 7017051 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus onnurineus NAI Thermococcus onnurineus NAI NC_011529.1 NC_011529.1 7017476 7017476 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sibiricus MM 739 Thermococcus sibiricus MM 739 NC_012883.1 NC_012883.1 8096638 8096638 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sibiricus MM 739 Thermococcus sibiricus MM 739 NC_012883.1 NC_012883.1 8096005 8096005 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sibiricus MM 739 Thermococcus sibiricus MM 739 NC_012883.1 NC_012883.1 8096629 8096629 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Thermococcus sibiricus MM 739 Thermococcus sibiricus MM 739 NC_012883.1 NC_012883.1 8095463 8095463 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sibiricus MM 739 Thermococcus sibiricus MM 739 NC__012883.1 NC__012883.1 8096131 8096131 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sibiricus MM 739 Thermococcus sibiricus MM 739 NC__012883.1 NC__012883.1 8096636 8096636 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sp. 4557 Thermococcus sp. 4557 NQ015865.1 NQ015865.1 11015504 11015504 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sp. 4557 Thermococcus sp. 4557 NC_015865.1 NC_015865.1 11015249 11015249 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sp. 4557 Thermococcus sp. 4557 NC_015865.1 NC_015865.1 11015571 11015571 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sp. AM4 Thermococcus sp. AM4 NC__016051.1 NC__016051.1 7419050 7419050 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sp. AM4 Thermococcus sp. AM4 NC__016051.1 NC__016051.1 7418514 7418514 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermococcus sp. AM4 Thermococcus sp. AM4 NC__016051.1 NC__016051.1 7420292 7420292 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 NC__011296.1 NC__011296.1 6941429 6941429 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 ' Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 ' NC_011296.1 NC_011296.1 6943174 6943174 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 ' Thermodesulfovibrio yellow stonii DSM 11347 ' NC_011296.1 NC_011296.1 6941905 6941905 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Thermofilum pendens Hrk 5 Thermofilum pendens Hrk 5 NC_008698.1 NC_008698.1 4602054 4602054 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermofilum pendens Hrk 5 Thermofilum pendens Hrk 5 NC_008698.1 NC_008698.1 4601386 4601386 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermofilum pendens Hrk 5 Thermofilum pendens Hrk 5 NCJ)08698.1 NCJ)08698.1 4600878 4600878 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Thermofilum pendens Hrk 5 Thermofilum pendens Hrk 5 NC_008698.1 NC_008698.1 4600730 4600730 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermofilum sp. 1910b Thermofilum sp. 1910b NC_022093.1 NC_022093.1 16572780 16572780 альдегвдферредоксиноксидоредуктаза aldegvdferredoxin oxidoreductase Thermofilum sp. 1910b Thermofilum sp. 1910b NC_022093.1 NC_022093.1 16572926 16572926 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermofilum sp. 1910b Thermofilum sp. 1910b NC_022093.1 NC_022093.1 16573009 16573009

- 13 043734- 13 043734

альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermofilum sp. 1910b Thermofilum sp. 1910b NC_022093.1 NC_022093.1 16574342 16574342 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermogladius cellulolyticus 1633 Thermogladus cellulolyticus 1633 NC_017954.1 NC_017954.1 13012904 13012904 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoplasma acidophilum DSM1728 Thermoplasma acidophilum DSM1728 NC__002578.1 NC__002578.1 1456355 1456355 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoplasma acidophilum DSM 1728 Thermoplasma acidophilum DSM 1728 NC__002578.1 NC__002578.1 1456646 1456646 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoplasma volcanium GSS1 Thermoplasma volcanium GSS1 NC 002689.2 NC 002689.2 1441901 1441901 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoplasma volcanium GSS1 Thermoplasma volcanium GSS1 NC_002689.2 NC_002689.2 1441379 1441379 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoproteus tenax Kra 1 Thermoproteus tenax Kra 1 NC_016070.1 NC_016070.1 11262174 11262174 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoproteus tenax Kra 1 Thermoproteus tenax Kra 1 NC__016070.1 NC__016070.1 11262275 11262275 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoproteus tenax Kra 1 Thermoproteus tenax Kra 1 NC 016070.1 NC 016070.1 11262652 11262652 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoproteus tenax Kra 1 Thermoproteus tenax Kra 1 NC 016070.1 NC 016070.1 11262926 11262926 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoproteus uzoniensis 768-20 Thermoproteus uzoniensis 768-20 NC 015315.1 NC 015315.1 10361668 10361668 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoproteus uzoniensis 768-20 Thermoproteus uzoniensis 768-20 NC_015315.1 NC_015315.1 10361250 10361250 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermoproteus uzoniensis 768-20 Thermoproteus uzoniensis 768-20 NC_pi5315.1 NC_pi5315.1 10360972 10360972 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermosphaera aggregans DSM 11486 Thermosphaera aggregans DSM 11486 NC_014160.1 NC_014160.1 9165115 9165115 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermosphaera aggregans DSM 11486 Thermosphaera aggregans DSM 11486 NC 014160.1 NC 014160.1 9165462 9165462 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermus thermophilus HB8 Thermus thermophilus HB8 NC 006461.1 NC 006461.1 3168554 3168554 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Thermus thermophilus HB8 Thermus thermophilus HB8 NC 006461.1 NC 006461.1 3168612 3168612 альдегид:ферредоксиноксидоред}гктазаaldehyde:ferredoxin oxidored} g ctase Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NC014537.1 NC014537.1 9753145 9753145 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NC_014537.1 NC_014537.1 9750947 9750947 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NC 014537.1 NC 014537.1 9750989 9750989 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NC_014537.1 NC_014537.1 9753486 9753486 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Vulcanisaeta distributa DSM 14429 NCJH4537.1 NCJH4537.1 9751414 9751414 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC 015151.1 NC 015151.1 10288238 10288238 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC_pi5151.1 NC_pi5151.1 10288894 10288894 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC_015151.1 NC_015151.1 10288574 10288574 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC_015151.1 NC_015151.1 10288827 10288827 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC 015151.1 NC 015151.1 10288607 10288607 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC_015151.1 NC_015151.1 10288523 10288523 альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза aldehyde:ferredoxin oxidoreductase Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 NC 015151.1 NC 015151.1 10288815 10288815

AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СО-дегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Сшт Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые негативные продукты.AOR catalyzes the reaction of an acid and reduced ferredoxin to form an aldehyde and oxidized ferredoxin. In acetogens, this reaction can be coupled to the oxidation of CO (by CO dehydrogenase, EC 1.2.7.4) or hydrogen (by ferredoxin-dependent hydrogenase, EC 1.12.7.2 or 1.12.1.4), which in both cases produces reduced ferredoxin ( Kopke, USA Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous AOR or introduction of exogenous AOR into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Alternatively, exogenous AOR can be introduced into a microorganism that does not naturally contain AOR, such as E. coli. In particular, coexpression of Ptb-Buk and AOR (and optionally Adh) may allow such a microorganism to produce new negative products.

Этап 17 отражает преобразование 3-гидроксибутирилальдегида в 1,3-бутандиол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 17 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl aldehyde to 1,3-butanediol. This step can be catalyzed by alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1. or 1.1.1.2.). Alcohol dehydrogenase can convert aldehyde and NAD(P)H into alcohol and NAD(P). Said alcohol dehydrogenase may be, for example,

Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) илиAdh from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) or

Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh изClostridium ragsdalei, BdhB from Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh from

Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum. (NP 149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl from Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 from Clostridium Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 from Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl from Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 from Clostridium acetobutylicum. (NP 149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE from Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhE from Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) or AdhE2 from Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).

Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous alcohol dehydrogenase or introduction of exogenous alcohol dehydrogenase into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Escherichia coli presumably does not have native activity corresponding to this stage.

- 14 043734- 14 043734

Этап 18 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутирилальдегид. Указанный этап может быть катализирован бутиральдегиддегидрогеназой (EC 1.2.1.57). Указанная бутиральдегиддегидрогеназа может представлять собой, например, Bld из Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 18 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to 3-hydroxybutyrylaldehyde. This step can be catalyzed by butyraldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.57). Said butyraldehyde dehydrogenase may be, for example, Bld from Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium, ragsdalei have no known native activity corresponding to this stage. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 19 отражает преобразование 3-гадроксибутирил-КоА в 2-гидроксиизобутирил-КоА.Step 19 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to 2-hydroxyisobutyryl-CoA.

Указанный этап может быть катализирован 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазой (EC 5,4.99.-). Указанная 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутаза может представлять собой, например, HcmAB из Aquincola tertiaricarbonis (AFK77668.1, большая субъединица; AFK77665.1, малая субъединица) (последовательности SEQ ID NO: 81 и 82, соответственно) или HcmAB из Kyrpidia tusciae (WP_013074530.1, большая субъединица; WP_013074531.1, малая субъединица) (последовательности SEQ ID NO: 83 и 84, соответственно). Было описано улучшение активности HcmAB шапероном MeaB (AFK77667.1, Aquincola tertiaricarbonis; WP_013074529.1, Kyrpidia tusciae) (последовательности SEQ ID NO: 85 и 86, соответственно) путем реактивации HcmAB, хотя MeaB не является необходимым для функции HcmAB, (Yaneva, J Biol Chem, 287: 15502-15511, 2012). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.This step can be catalyzed by 2-hydroxyisobutyryl-CoA mutase (EC 5.4.99.-). Said 2-hydroxyisobutyryl-CoA mutase may be, for example, HcmAB from Aquincola tertiaricarbonis (AFK77668.1, large subunit; AFK77665.1, small subunit) (SEQ ID NOs: 81 and 82, respectively) or HcmAB from Kyrpidia tusciae (WP_013074530.1, large subunit; WP_013074531.1, small subunit) (SEQ ID NOs: 83 and 84, respectively). Improvement of HcmAB activity by the chaperone MeaB (AFK77667.1, Aquincola tertiaricarbonis; WP_013074529.1, Kyrpidia tusciae) (SEQ ID NOs: 85 and 86, respectively) by reactivating HcmAB has been described, although MeaB is not required for HcmAB function, (Yaneva, J Biol Chem, 287: 15502–15511, 2012). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 20 отражает преобразование 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2-гидроксиизобутират. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+ бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 20 reflects the conversion of 2-hydroxyisobutyryl-CoA to 2-hydroxyisobutyrate. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 21 отражает преобразование ацетил-КоА в сукцинил-КоА. Указанный этап охватывает ряд ферментативных реакций, вовлеченных в восстановительный ЦТК-путь, который естественным образом присутствует во многих бактериях, в том числе Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (и Escherichia coli) (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014; патент США № 9297026). Ферменты, вовлеченные в преобразование ацетил-КоА в сукцинил-КоА, могут включать пируват:ферредоксиноксидоредуктазу (PFOR) (EC 1.2.7.1), пируваткарбоксилазу (PYC) (EC 6.4.1.1), маликфермент/малатдегидрогеназу (EC 1.1.1.38, ЕС 1.1.1.40), пируватфосфатдикиназу (PPDK) (ЕС:2.7.9.1), РЕР-карбоксикиназу (PCK) (EC 4.1.1.49), фумаратгидратазу/фумаразу (EC 4.2.1.2), фумаратредуктазу (EC 1.3.5.1)/сукцинатдегидрогеназу (EC 1.3.5.4) и сукцинил-КоА-синтетазу (EC 6.2.1.5). Указанная пируват:ферредоксиноксидоредуктаза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY75153, AGY77232) или Escherichia coli (NP_415896). Пируваткарбоксилаза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY75817). Указанная малик-фермент/малатдегидрогеназа может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76687) или Escherichia coli (NP_416714, NP_417703). Указанная пируватфосфатдикиназа (PPDK) может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76274, AGY77114). Указанная РЕР-карбоксикиназа (PCK) может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76928) или Escherichia coli (NP_417862). Указанная фумаратгидратаза/фумараза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76121, AGY76122) или Escherichia coli (NP_416128, NP_416129, NP_418546). Указанная фумаратредуктаза/сукцинатдегидрогеназа может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY74573, AGY74575, AGY75257, AGY77166) или Escherichia coli (NP_415249, NP_415250, NP_415251, NP_415252, NP_418575, NP_418576, NP_418577, NP_418578). Указанная сукцинил-КоАсинтетаза может происходить, например, из Escherichia coli (NP_415256, NP_415257).Step 21 reflects the conversion of acetyl-CoA to succinyl-CoA. This step involves a number of enzymatic reactions involved in the reductive TCA pathway, which is naturally present in many bacteria, including Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (and Escherichia coli) (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014; US Patent No. 9297026). Enzymes involved in the conversion of acetyl-CoA to succinyl-CoA may include pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (PFOR) (EC 1.2.7.1), pyruvate carboxylase (PYC) (EC 6.4.1.1), malic enzyme/malate dehydrogenase (EC 1.1.1.38, EC 1.1 .1.40), pyruvate phosphate dikinase (PPDK) (EC:2.7.9.1), PEP carboxykinase (PCK) (EC 4.1.1.49), fumarate hydratase/fumarase (EC 4.2.1.2), fumarate reductase (EC 1.3.5.1)/succinate dehydrogenase (EC 1.3.5.4) and succinyl-CoA synthetase (EC 6.2.1.5). Said pyruvate:ferredoxin oxidoreductase may come from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY75153, AGY77232) or Escherichia coli (NP_415896). Pyruvate carboxylase may be derived from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY75817). Said malic enzyme/malate dehydrogenase may come from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY76687) or Escherichia coli (NP_416714, NP_417703). Said pyruvate phosphate dikinase (PPDK) may be derived from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY76274, AGY77114). Said PEP carboxykinase (PCK) may be derived from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY76928) or Escherichia coli (NP_417862). Said fumarate hydratase/fumarase may be derived, for example, from Clostridium autoethanogenum (AGY76121, AGY76122) or Escherichia coli (NP_416128, NP_416129, NP_418546). Said fumarate reductase/succinate dehydrogenase may be derived, for example, from Clostridium autoethanogenum (AGY74573, AGY74575, AGY75257, AGY77166) or Escherichia coli (NP_415249, NP_415250, NP_415251, NP_415252, NP_41 8575, NP_418576, NP_418577, NP_418578). Said succinyl-CoA synthetase may come from, for example, Escherichia coli (NP_415256, NP_415257).

Этап 22 отражает преобразование ацетил-КоА и сукцинил-КоА в 3-оксоадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован Р-кетоадипил-КоА-тиолазой (EC 2.3.1.16). Указанная кетоизовалератоксидоредуктаза может представлять собой, например, PaaJ из Escherichia coli (WP_001206190.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 22 reflects the conversion of acetyl-CoA and succinyl-CoA to 3-oxoadipyl-CoA. This step can be catalyzed by P-ketoadipyl-CoA thiolase (EC 2.3.1.16). Said ketoisovalerate oxidoreductase may be, for example, PaaJ from Escherichia coli (WP_001206190.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 23 отражает преобразование 3-оксо-адипил-КоА в 3-гидроксиадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.1.1.157) или ацетоацетил-КоАгидратазой (EC 4.2.1.119). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегадрогеназа или ацетоацетил-КоАгидратаза может представлять собой, например,Step 23 reflects the conversion of 3-oxo-adipyl-CoA to 3-hydroxyadipyl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (EC 1.1.1.157) or acetoacetyl-CoAhydratase (EC 4.2.1.119). Said 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase or acetoacetyl-CoAhydratase may be, for example,

Hbd из Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NPJ49314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl из Clostridium kluyveri (WP 011989027.1) (SEQ ID NO: 57) или PaaHl из Cupriavidus necator (WP 010814882.1).Hbd from Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd from Clostridium acetobutylicum (NPJ49314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl from Clostridium kluyveri (WP 011989027.1) (SEQ ID NO: 57) or PaaHl from Cupriavidus necator (WP 010814882.1).

Следует отметить, что PhaB является R-специфической и Hbd является S-специфической. Кроме то- 15 043734 го, Hbd1 из Clostridium kluyveri является НАДФЫ-зависимой, a Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii иIt should be noted that PhaB is R-specific and Hbd is S-specific. In addition, Hbd1 from Clostridium kluyveri is NADPH-dependent, and Hbd from Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii are NADH-dependent. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and

Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium ragsdalei has no known native activity corresponding to this stage.

Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 24 отражает преобразование 3-гидроксиадипил-КоА в 2,3-дегидроадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован эноил-КоА-гидратазой (ЕС: 4,2.1.17) или эноил-КоА-редуктазой (ЕС: 1,3.1.38). Указанная эноил-КоА-гидратаза или эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, CrtH3C. acetobutylicum (032472) (Seq. ID No. 52). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 24 reflects the conversion of 3-hydroxyadipyl-CoA to 2,3-dehydroadipyl-CoA. This step can be catalyzed by enoyl-CoA hydratase (EC: 4.2.1.17) or enoyl-CoA reductase (EC: 1.3.1.38). Said enoyl-CoA hydratase or enoyl-CoA reductase may be, for example, CrtH3C. acetobutylicum (032472) (Seq. ID No. 52). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 25 отражает преобразование 2,3-дегидроадипил-КоА в адипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован транс-2-эноил-КоА-редуктазой (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Указанная транс-2-эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Bcd из С. acetobutylicum (NP_349317.1), которая образует комплекс с флавопротеинами электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr из Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr из Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter из Treponema denticola (NP_971211.1) или Ter из Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 25 reflects the conversion of 2,3-dehydroadipyl-CoA to adipyl-CoA. This step can be catalyzed by trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Said trans-2-enoyl-CoA reductase may be, for example, Bcd from C. acetobutylicum (NP_349317.1), which forms a complex with electron transport flavoproteins EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr from Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr from Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter from Treponema denticola (NP_971211.1) or Ter from Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii and Clostridium, ragsdalei have no known native activity corresponding to this stage. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 26 отражает преобразование адипил-КоА в адипиновую кислоту. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 26 reflects the conversion of adipyl-CoA to adipic acid. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.

Этап 27 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в кротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кротонил-КоА-гидратазой (кротоназой) (EC 4.2.1.17) или кротонил-КоА-редуктазой (EC 1.3.1.38). Указанная кротонил-КоА-гидратаза (кротоназа) или кротонил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, клин' acetobutylicum (NP_349318.1) (SEQIDNO:52) или PhaJ из Aeromonas caviae (032472). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 27 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to crotonyl-CoA. This step can be catalyzed by crotonyl-CoA hydratase (crotonase) (EC 4.2.1.17) or crotonyl-CoA reductase (EC 1.3.1.38). Said crotonyl-CoA hydratase (crotonase) or crotonyl-CoA reductase may be, for example, clin'acetobutylicum (NP_349318.1) (SEQIDNO:52) or PhaJ from Aeromonas caviae (032472). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 28 отражает преобразование кротонил-КоА в кротонат. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 28 reflects the conversion of crotonyl-CoA to crotonate. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.

Этап 29 отражает преобразование кротоната в кротональдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СОдегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Curr Opin Bioteclmol 22: 320-325, 2011; Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Была продемонстрирована активность AOR Pyrococcus furiosus в отношении преобразования кротональдегида и кротоната (Loes, J Bacteriol, 187: 7056-7061, 2005). Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорга- 16 043734 низму продуцировать новые ненативные продукты.Step 29 reflects the conversion of crotonate to crotonaldehyde. This step can be catalyzed by aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.5). Examples of sources of aldehyde:ferredoxin oxidoreductases are described in various sections of this application. AOR catalyzes the reaction of an acid and reduced ferredoxin to form an aldehyde and oxidized ferredoxin. In acetogens, this reaction can be coupled to the oxidation of CO (by CO dehydrogenase, EC 1.2.7.4) or hydrogen (by ferredoxin-dependent hydrogenase, EC 1.12.7.2 or 1.12.1.4), which in both cases produces reduced ferredoxin (Kopke, Curr Opin Bioteclmol 22: 320-325, 2011; Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous AOR or introduction of exogenous AOR into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. The AOR of Pyrococcus furiosus has been demonstrated to be active in converting crotonaldehyde and crotonate (Loes, J Bacteriol, 187: 7056-7061, 2005). Alternatively, exogenous AOR can be introduced into a microorganism that does not naturally contain AOR, such as E. coli. In particular, coexpression of Ptb-Buk and AOR (and optionally Adh) may allow such a microorganism to produce new non-native products.

Этап 30 отражает преобразование кротональдегида в 2-бутен-1-ол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 30 reflects the conversion of crotonaldehyde to 2-buten-1-ol. This step can be catalyzed by alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1. or 1.1.1.2.). Alcohol dehydrogenase can convert aldehyde and NAD(P)H into alcohol and NAD(P). Said alcohol dehydrogenase may be, for example,

Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ IDAdh from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID

NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или Clostridium ragsdalei, BdhB изNO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) or Clostridium ragsdalei, BdhB from

Clostridium acetobutylicum (NP 349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO:Clostridium acetobutylicum (NP 349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh from Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl from Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO:

71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium71), Bdhl from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 from Clostridium

Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 изIjungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 from Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl from Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 from

Clostridium acetobutylicum (NP_149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQClostridium acetobutylicum (NP_149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE from Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl from Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ

ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).ID NO: 78) or AdhE2 from Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).

Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназа или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous alcohol dehydrogenase or introduction of exogenous alcohol dehydrogenase into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Escherichia coli presumably does not have native activity corresponding to this stage.

Этап 31 отражает преобразование кротонил-КоА в бутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован бутирил-КоА-дегидрогеназой или транс-2-эноил-КоА-редуктазой (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Указанная бутирил-КоА-дегидрогеназа или транс-2-эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Bcd из С. acetobutyiicum (NP_349317.1), которая образует комплекс с флавопротеинами электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr из Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr из Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter из Treponema denticola (NP_971211.1) или Ter из Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 31 reflects the conversion of crotonyl-CoA to butyryl-CoA. This step can be catalyzed by butyryl-CoA dehydrogenase or trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Said butyryl-CoA dehydrogenase or trans-2-enoyl-CoA reductase can be, for example, Bcd from C. acetobutyiicum (NP_349317.1), which forms a complex with electron transport flavoproteins EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr from Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr from Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter from Treponema denticola (NP_971211.1) or Ter from Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 32 отражает преобразование бутирил-КоА в ацетобутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован тиолазой или ацил-КоА-ацетилтрансферазой (EC 2.3.1.9). Указанная тиолаза может представлять собой, например,Step 32 reflects the conversion of butyryl-CoA to acetobutyryl-CoA. This step can be catalyzed by a thiolase or an acyl-CoA acetyltransferase (EC 2.3.1.9). Said thiolase may be, for example,

ТЫА из Clostridium acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), ThlAl из Clostridium kluyveri (EDK35681), ТЫА2 из Clostridium kluyveri (EDK35682), ТЫАЗ из Clostridium, kluyveri (EDK35683), PhaA из Cupriavidus necator (WP 013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB из Cupriavidus necator (WPJH1615089.1) (SEQ ID NO: 3) или AtoB из Escherichia coli (NP 416728.1) (SEQ ID NO: 4).ThlAl from Clostridium acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), ThlAl from Clostridium kluyveri (EDK35681), ThlAl from Clostridium kluyveri (EDK35682), ThlAl from Clostridium, kluyveri (EDK35683), PhaA from Cupriavidus necator (WP 013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB from Cupriavidus necator (WPJH1615089.1) (SEQ ID NO: 3) or AtoB from Escherichia coli (NP 416728.1) (SEQ ID NO: 4).

Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has native activity corresponding to this stage.

Этап 33 отражает преобразование ацетобутирил-КоА в ацетобутират. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 33 reflects the conversion of acetobutyryl-CoA to acetobutyrate. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.

Этап 34 отражает преобразование ацетобутирата в ацетилацетон. Указанный этап может быть катализирован ацетоацетатдекарбоксилазой (EC 4.1.1.4). Указанная ацетоацетатдекарбоксилаза может представлять собой, например, Adc из Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). Указанный этап может также быть катализирован альфа-кетоизовалератдекарбоксилазой (EC 4.1.1.74). Указанная альфа-кетоизовалератдекарбоксилаза может представлять собой, например, KivD из Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Кроме того, Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. В редких случаях преобразование ацетоацетата в ацетон может происходить спонтанно. Однако спонтанное преобразованиеStep 34 reflects the conversion of acetobutyrate to acetylacetone. This step can be catalyzed by acetoacetate decarboxylase (EC 4.1.1.4). Said acetoacetate decarboxylase may be, for example, Adc from Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). This step can also be catalyzed by alpha-ketoisovalerate decarboxylase (EC 4.1.1.74). Said alpha-ketoisovalerate decarboxylase may be, for example, KivD from Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. In addition, Escherichia coli has no known native activity corresponding to this step. In rare cases, conversion of acetoacetate to acetone may occur spontaneously. However, spontaneous transformation

- 17 043734 очень неэффективно; маловероятно, что оно может приводить к продуцированию выходных продуктов на желаемых уровнях.- 17 043734 very ineffective; it is unlikely to produce output products at the desired levels.

Этап 35 отражает преобразование ацетилацетона в 3-метил-2-бутанол. Указанный этап может быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.2). Указанная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 35 reflects the conversion of acetylacetone to 3-methyl-2-butanol. This step can be catalyzed by primary:secondary alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.2). Said primary:secondary alcohol dehydrogenase may be, for example,

SecAdh изSecAdh from

Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh из Clostridium Ijungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh из Clostridium ragsdalei (WP013239134.1) (SEQ ID NO: 18) или SecAdh из Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh from Clostridium Ijungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh from Clostridium ragsdalei (WP013239134.1) (SEQ ID NO: 18) or SecAdh from Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).

Указанный этап может также быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.80), такой как SecAdh из Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Однако Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Нокдаун или нокаут указанного фермента у Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei приводит к продуцированию и накоплению ацетилацетона, а не 3-метил-2-бутанола (WO 2015/085015).This step can also be catalyzed by a primary:secondary alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.80), such as SecAdh from Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). However, Escherichia coli has no known native activity corresponding to this step. Knockdown or knockout of this enzyme in Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei leads to the production and accumulation of acetylacetone rather than 3-methyl-2-butanol (WO 2015/085015).

Этап 36 отражает преобразование ацетобутирил-КоА в 3-гидроксигексаноил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидротеназой (EC 1.1.1.157) или ацетоацетил-КоАгидратазой (EC 4.2.1.119). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа или ацетоацетил-КоАгидратаза может представлять собой, например,Step 36 reflects the conversion of acetobutyryl-CoA to 3-hydroxyhexanoyl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrotenase (EC 1.1.1.157) or acetoacetyl-CoAhydratase (EC 4.2.1.119). Said 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase or acetoacetyl-CoAhydratase may be, for example,

Hbd из Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NP 349314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl из Clostridium kluyveri (WP011989027.1) (SEQ ID NO: 57), Hbd2 из Clostridium kluyveri (EDK34807) или PaaHl из Cupriavidus necator (WP 010814882.1).Hbd from Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd from Clostridium acetobutylicum (NP 349314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl from Clostridium kluyveri (WP011989027.1) (SEQ ID NO: 57), Hbd2 from Clostridium kluyveri (EDK34807) or PaaHl from Cupriavidus necator (WP 010814882.1).

Следует отметить, что PhaB является R-специфической и Hbd является S-специфической. Кроме того, Hbd1 из Clostridium kluyveri является НАДФН-зависимой, a Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.It should be noted that PhaB is R-specific and Hbd is S-specific. In addition, Hbd1 from Clostridium kluyveri is NADPH-dependent, and Hbd from Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii are NADH-dependent. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 37 отражает преобразование 3-гидроксигексаноил-КоА в 3-гидроксигексаноат. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+ бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 37 reflects the conversion of 3-hydroxyhexanoyl-CoA to 3-hydroxyhexanoate. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.

Этап 38 отражает преобразование 3-гидроксигексаноата в 1,3-гексальдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СОдегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Curr Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые ненативные продукты.Step 38 reflects the conversion of 3-hydroxyhexanoate to 1,3-hexaldehyde. This step can be catalyzed by aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.5). Examples of sources of aldehyde:ferredoxin oxidoreductases are described in various sections of this application. AOR catalyzes the reaction of an acid and reduced ferredoxin to form an aldehyde and oxidized ferredoxin. In acetogens, this reaction can be coupled to the oxidation of CO (by CO dehydrogenase, EC 1.2.7.4) or hydrogen (by ferredoxin-dependent hydrogenase, EC 1.12.7.2 or 1.12.1.4), which in both cases produces reduced ferredoxin (Kopke, Curr Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous AOR or introduction of exogenous AOR into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Alternatively, exogenous AOR can be introduced into a microorganism that does not naturally contain AOR, such as E. coli. In particular, coexpression of Ptb-Buk and AOR (and optionally Adh) may allow such a microorganism to produce new non-native products.

Этап 39 отражает преобразование 1,3-гексальдегида в 1,3-гександиол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 39 reflects the conversion of 1,3-hexaldehyde to 1,3-hexanediol. This step can be catalyzed by alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1. or 1.1.1.2.). Alcohol dehydrogenase can convert aldehyde and NAD(P)H into alcohol and NAD(P). Said alcohol dehydrogenase may be, for example,

- 18 043734- 18 043734

Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).Adh from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) or Clostridium ragsdalei, BdhB from Clostridium acetobutylicum (NP349891.1) (SEQ ID NO: 69 ), Bdh from Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl from Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72) , Bdh2 from Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 from Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl from Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 from Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE from Clostridium beijerinckii (WP041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl from Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ ID NO: 78) or AdhE2 from Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).

Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous alcohol dehydrogenase or introduction of exogenous alcohol dehydrogenase into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Escherichia coli presumably does not have native activity corresponding to this stage.

Этап 40 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА. Указанный этап может быть катализирован гидроксиметилглутарил-КоА-синтазой (ГМГ-КоА-синтазой) (EC 2.3.3.10). ГМГ-КоА-синтазы распространены во многих родах и царствах жизни и включают, например, MvaS из Staphylococcus aureus (WP_053014863.1), ERG13 из Saccharomyces cerevisiae (NP_013580.1), HMGCS2 из Mus musculus (NP_032282.2) и многих других представителей группы ферментов ЕС 2.3.3.10. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 40 reflects the conversion of acetoacetyl-CoA to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA. This step can be catalyzed by hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (HMG-CoA synthase) (EC 2.3.3.10). HMG-CoA synthases are distributed in many genera and kingdoms of life and include, for example, MvaS from Staphylococcus aureus (WP_053014863.1), ERG13 from Saccharomyces cerevisiae (NP_013580.1), HMGCS2 from Mus musculus (NP_032282.2) and many other representatives EU enzyme groups 2.3.3.10. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 41 отражает преобразование 3-гидрокси-3-метилглютаноил-КоА в 3-метилглюконил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидратазой (EC 4.2.1.55). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, LiuC из Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). Указанный этап может также быть катализирован короткоцепочечной эноилКоА-гидратазой (EC 4.2.1.150) или эноил-КоА-гидратазой (EC 4.2.1.17). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 41 reflects the conversion of 3-hydroxy-3-methylglutanoyl-CoA to 3-methylgluconyl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase (EC 4.2.1.55). Said 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase may be, for example, LiuC from Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). This step can also be catalyzed by short-chain enoyl-CoA hydratase (EC 4.2.1.150) or enoyl-CoA hydratase (EC 4.2.1.17). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 42 отражает преобразование 3-метилглюконил-КоА в 2-метилкротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован метилкротонил-КоА-декарбоксилазой (обладающей высоким структурным сходством с глютаконат-КоА-трансферазой (EC 2.8.3.12)), например, aibAB из Myxococcus xanthus (WP_011554267.1 и WP_011554268.1). Указанный этап может также быть катализирован метилкротоноил-КоА-карбоксилазой (EC 6,4.1.4), например, LiuDB из Pseudomonas aeruginosa (NP_250702.1 и NP_250704.1) или МССА и МССВ из Arabidopsis thaliana (NP_563674.1 и NP_567950.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 42 reflects the conversion of 3-methylgluconyl-CoA to 2-methylcrotonyl-CoA. This step can be catalyzed by methylcrotonyl-CoA decarboxylase (with high structural similarity to glutaconate-CoA transferase (EC 2.8.3.12)), for example, aibAB from Myxococcus xanthus (WP_011554267.1 and WP_011554268.1). This step can also be catalyzed by methylcrotonoyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.4), for example, LiuDB from Pseudomonas aeruginosa (NP_250702.1 and NP_250704.1) or MSCA and MSCB from Arabidopsis thaliana (NP_563674.1 and NP_567950.1 ). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium, ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 43 отражает преобразование метилкротонил-КоА в изовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован оксидоредуктазой, цинк-связывающей дегидрогеназой. Указанный оксидоредуктаза, цинк-связывающая дегидрогеназа может представлять собой, например, AibC из Myxococcus xanthus (WP_011554269.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 43 reflects the conversion of methylcrotonyl-CoA to isovaleryl-CoA. This step can be catalyzed by oxidoreductase, zinc-binding dehydrogenase. Said oxidoreductase, zinc-binding dehydrogenase, may be, for example, AibC from Myxococcus xanthus (WP_011554269.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Этап 44 отражает преобразование изовалерил-КоА в изовалерат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9), и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетической тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацилКоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказаннаяStep 44 reflects the conversion of isovaleryl-CoA to isovalerate. This step can be catalyzed by CoA transferase (ie acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase) (EC 2.8.3.9). Said CoA transferase may be, for example, CtfAB, a heterodimer containing CtfA and CtfB subunits from Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6 ). This step can also be catalyzed by thioesterase (EC 3.1.2.20). Said thioesterase may be, for example, TesB from Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). This step may also be catalyzed by a hypothetical thioesterase, for example from Clostridium autoethanogenum or Clostridium ljungdahlii. Specifically, three hypothetical thioesterases have been identified in Clostridium autoethanogenum: (1) thioesterase 1 (AGY74947.1; annotated as palmitoyl-CoA hydrolase; SEQ ID NO: 8), (2) thioesterase 2 (AGY75747.1; annotated as 4hydroxybenzoyl -CoA thioesterase; SEQ ID NO: 9), and (3) thioesterase 3 (AGY75999.1; annotated as a hypothetical thioesterase; SEQ ID NO: 10). Three hypothetical thioesterases have also been identified in Clostridium ljungdahlii: (1) thioesterase 1 (ADK15695.1; annotated as predicted acylCoA thioesterase 1; SEQ ID NO: 11), (2) thioesterase 2 (ADK16655.1; annotated as predicted

- 19 043734 тиоэстераза; SEQ ID NO: 12), и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.- 19 043734 thioesterase; SEQ ID NO: 12), and (3) thioesterase 3 (ADK16959.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 13). This step can also be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.

Этап 45 отражает преобразование изовалерата в изовалеральдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза (AOR) может представлять собой, например, AOR из Clostridium. autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (последовательности SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно) или AOR из Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (последовательности SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно). Дополнительные примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые негативные продукты.Step 45 reflects the conversion of isovalerate to isovaleraldehyde. This step can be catalyzed by aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.5). Said aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) may be, for example, an AOR from Clostridium. autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (SEQ ID NOs: 63 and 64, respectively) or AOR from Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (SEQ ID NOs: 65 and 66, respectively). Additional examples of sources of aldehyde:ferredoxin oxidoreductases are described in various sections of this application. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous AOR or introduction of exogenous AOR into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Alternatively, exogenous AOR can be introduced into a microorganism that does not naturally contain AOR, such as E. coli. In particular, coexpression of Ptb-Buk and AOR (and optionally Adh) may allow such a microorganism to produce new negative products.

Этап 46 отражает преобразование изовалеральдегида в изоамиловый спирт. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 46 reflects the conversion of isovaleraldehyde to isoamyl alcohol. This step can be catalyzed by alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1. or 1.1.1.2.). Alcohol dehydrogenase can convert aldehyde and NAD(P)H into alcohol and NAD(P). Said alcohol dehydrogenase may be, for example,

Adh из Clostridium autoethanogenum (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) илиAdh from Clostridium autoethanogenum (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) or

Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP_023163373.1) (SEQ ID NO: 79).Clostridium ragsdalei, BdhB from Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh from Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl from Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71 ), Bdhl from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 from Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 from Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74 ), AdhEl from Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 from Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE from Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77) , AdhEl from Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) or AdhE2 from Clostridium autoethanogenum (WP_023163373.1) (SEQ ID NO: 79).

Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous alcohol dehydrogenase or introduction of exogenous alcohol dehydrogenase into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Escherichia coli presumably does not have native activity corresponding to this stage.

Этап 47 отражает преобразование изовалерил-КоА в изовалеральдегид. Указанный этап может быть катализирован бутиральдегиддегидрогеназой (EC 1.2.1.57). Указанная бутиральдегиддегидрогеназа может представлять собой, например, Bld из Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei предположительно не обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 47 reflects the conversion of isovaleryl-CoA to isovaleraldehyde. This step can be catalyzed by butyraldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.57). Said butyraldehyde dehydrogenase may be, for example, Bld from Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei do not appear to have native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.

Обзор Ptb-BukPtb-Buk review

Согласно настоящему изобретению предложены новые пути, задействующие ферментную систему Ptb-Buk. В природе указанная ферментная система обнаруживается у ряда продуцирующих бутират микроорганизмов, такие как продуцирующие бутират Clostridia или Butyrivibrio. В частности, фосфатбутирилтрансфераза (Ptb) (EC 2.3.1.19) естественным образом катализирует реакцию бутаноила-КоА и фосфата с образованием КоА+бутаноилфосфата и бутираткиназы (Buk) (EC 2.7.2.7) естественным образом катализирует реакцию бутаноилфосфата и АДФ с образованием бутирата (бутаноата) и АТФ. Соответственно, указанные ферменты совместно (Ptb-Buk) естественным образом катализируют преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерируют одну молекулу АТФ посредством субстратного фосфорилирования (фиг. 2). Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной иThe present invention provides new pathways involving the Ptb-Buk enzyme system. In nature, this enzyme system is found in a number of butyrate-producing microorganisms, such as butyrate-producing Clostridia or Butyrivibrio. Specifically, phosphate butyryl transferase (Ptb) (EC 2.3.1.19) naturally catalyzes the reaction of butanoyl-CoA and phosphate to form CoA+butanoyl phosphate, and butyrate kinase (Buk) (EC 2.7.2.7) naturally catalyzes the reaction of butanoyl phosphate and ADP to form butyrate (butanoate ) and ATP. Accordingly, these enzymes together (Ptb-Buk) naturally catalyze the conversion of butanoyl-CoA to butyrate and generate one molecule of ATP through substrate phosphorylation (Fig. 2). However, the inventors of the present invention have discovered that Ptb is non-selective and

- 20 043734 способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, PtbBuk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ. Было описано, что Ptb активна в отношении диапазона ацил-КоА, в том числе ацетоацетил-КоА, in vitro (Thompson, Appl Environ Microbiol, 56: 607-613, 1990). Ранее не было показано, что ацетоацетил-фосфат может быть субстратом Buk. Хотя известно, что Buk воспринимает широкий диапазон субстратов (Liu, Appl Microbiol Biotechnol, 53: 545552, 2000), активность in vivo не была показана.- 20 043734 is capable of accepting various acyl-CoAs and enoyl-CoAs as substrates, thus PtbBuk can be used to convert a number of acyl-CoAs and enoyl-CoAs into the corresponding acids or alkenates, respectively, while generating ATP. Ptb has been described to be active against a range of acyl-CoAs, including acetoacetyl-CoA, in vitro (Thompson, Appl Environ Microbiol, 56: 607-613, 1990). Acetoacetyl phosphate has not previously been shown to be a substrate of Buk. Although Buk is known to accept a wide range of substrates (Liu, Appl Microbiol Biotechnol, 53:545552, 2000), in vivo activity has not been demonstrated.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение экзогенной Ptb-Buk позволяет определенным микроорганизмам продуцировать подходящие продукты, в том числе ацетон, изопропанол, изобутилен, 3-гидроксибутират, 1,3-бутандиол и 2-гидроксиизобутират, а также другие продукты такие как пропионат, капроат и октонат.In addition, the present inventors have discovered that the administration of exogenous Ptb-Buk allows certain microorganisms to produce suitable products, including acetone, isopropanol, isobutylene, 3-hydroxybutyrate, 1,3-butanediol and 2-hydroxyisobutyrate, as well as other products such as propionate, caproate and octonate.

Новые пути на основе Ptb-Buk обеспечивают ряд значимых преимуществ по сравнению с другими известными существующими маршрутами продуцирования продуктов, основанными на КоАтрансферазе - как в классическом клостридиалъном ферментативном пути ацетон-бутанол-этанол (ABE) или тиоэстеразе (Jones, Microbiol Rev, 50: 484-524, 1986; Matsumoto, Appl Microbiol Biotechnol, 97: 205210, 2013; May, Metabol Eng, 15: 218-225, 2013) (фиг. 3). В частности, указанные новые пути (1) не зависят от присутствия или продуцирования конкретных молекул, таких как органические кислоты, например, бутирата или ацетата, необходимых для КоА-трансферазной реакции, и (2) обеспечивают генерацию АТФ посредством субстратного фосфорилирования, не сохраняющуюся при тиоэстеразной или КоАтрансферазной реакции. Те же преимущества присутствуют при применении системы Ptb-Buk для других реакций, таких как преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. Соответственно, указанные новые пути отличаются потенциально значительно большими титрами продукции и скоростями за счет генерации дополнительной энергии и продуцирования целевых продуктов без ко-продукции нежелательных побочных продуктов, таких как ацетат.The new Ptb-Buk-based pathways provide a number of significant advantages over other known existing CoAtransferase-based product production routes - such as the classical clostridial acetone-butanol-ethanol (ABE) or thioesterase enzymatic pathway (Jones, Microbiol Rev, 50: 484 -524, 1986; Matsumoto, Appl Microbiol Biotechnol, 97: 205210, 2013; May, Metabol Eng, 15: 218-225, 2013) (Fig. 3). In particular, these new pathways (1) do not depend on the presence or production of specific molecules, such as organic acids, such as butyrate or acetate, required for the CoA transferase reaction, and (2) provide ATP generation through substrate phosphorylation, which is not maintained during thioesterase or CoAtransferase reaction. The same advantages are present when using the Ptb-Buk system for other reactions, such as the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to 3-hydroxybutyrate. Accordingly, these new pathways feature potentially significantly higher product titers and rates by generating additional energy and producing target products without co-producing unwanted by-products such as acetate.

Нежелательно, в частности, при промышленном масштабе, чтобы микроорганизмы продуцировали ацетат (или другие органические кислоты, необходимые для КоА-трансферазной реакции) в качестве побочного продукта, поскольку ацетат перенаправляет углерод от целевых продуктов и, соответственно, влияет на эффективность и выход целевых продуктов. Кроме того, ацетат может быть токсическим для микроорганизмов и/или может служить в качестве субстрата для роста загрязняющих микроорганизмов. Кроме того, присутствие ацетата усложняет выделение и разделение целевых продуктов и контроль за условиями ферментации, благоприятствующими получению целевых продуктов.Particularly on an industrial scale, it is undesirable for microorganisms to produce acetate (or other organic acids required for the CoA transferase reaction) as a by-product, since acetate redirects carbon away from the target products and accordingly affects the efficiency and yield of the target products. In addition, acetate may be toxic to microorganisms and/or may serve as a substrate for the growth of contaminating microorganisms. In addition, the presence of acetate complicates the isolation and separation of the target products and the control of fermentation conditions favorable to obtaining the target products.

Генерация АТФ по механизму субстратного фосфорилирования может применяться в качестве движущей силы для синтеза продуктов, в частности, в ограниченных по АТФ системах. В частности, ацетогенные бактерии, как известно, живут на термодинамическом пределе существования (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014). Соответственно, продуцирование ацетата было описано у всех ацетогенных микроорганизмов, выделенных к настоящему времени (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, pages 354-420, New York, NY, Springer, 2006), поскольку продуцирование ацетата обеспечивает микроорганизму возможность прямо генерировать АТФ при субстратном фосфорилировании с помощью Pta (фосфотрансацетилазы) (EC 2.3.1.8) и Ack (ацетаткиназы) (EC 2.7.2.1). Несмотря на наличие механизмов сохранения АТФ в указанных микроорганизмах, такие как мембранные градиенты и электроразделительные ферменты, сопряженные с системами переноса ионов или протонов, например, Rnf-комплекс (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), прямая генерация АТФ остается критически важной для их выживания. В результате при введении гетерологичных путей, не позволяющих генерировать АТФ, происходит продуцирование ацетата в качестве побочного продукта (Schiel-Bengelsdorf, FEBS Lett, 586: 2191-2198, 2012). Однако пути Ptb-Buk, описанные в настоящем документе, обеспечивают альтернативный механизм генерации АТФ для микроорганизма по механизму субстратного фосфорилирования и, соответственно, позволяют избежать продуцирования ацетата. В частности, ацетат-образующие ферменты, такие как Pta-Ack, которые в ином случае имели бы существенное значение (Nagarajan, Microb Cell Factories, 12:118, 2013), могут быть заменены на Ptb-Buk в качестве альтернативного способа генерации АТФ. Поскольку после этого микроорганизм может генерировать АТФ за счет Ptb-Buk, указанная система предоставляет движущую силу, обеспечивающую максимальный поток через новые пути, задействующие Ptb-Buk. Генерация АТФ может также быть критически важным для нижерасположенных путей, требующих АТФ. Например, ферментативное продуцирование изобутилена из ацетона требует АТФ. Хотя полный путь от ацетил-КоА к изобутилену потребляет АТФ при использовании КоА-трансферазы или тиоэстеразы, при использовании Ptb-Buk указанный путь является энергетически нейтральным.The generation of ATP by the mechanism of substrate phosphorylation can be used as a driving force for the synthesis of products, in particular, in ATP-limited systems. In particular, acetogenic bacteria are known to live at the thermodynamic limit of existence (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014). Accordingly, acetate production has been described in all acetogenic microorganisms isolated to date (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, pages 354-420, New York, NY, Springer, 2006), since acetate production provides the microorganism with ability to directly generate ATP upon substrate phosphorylation by Pta (phosphotransacetylase) (EC 2.3.1.8) and Ack (acetate kinase) (EC 2.7.2.1). Despite the presence of mechanisms for storing ATP in these microorganisms, such as membrane gradients and electrical separation enzymes coupled to ion or proton transport systems, for example, the Rnf complex (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), direct generation of ATP remains critical to their survival. As a result, when heterologous pathways are introduced that do not allow ATP generation, acetate is produced as a by-product (Schiel-Bengelsdorf, FEBS Lett, 586: 2191-2198, 2012). However, the Ptb-Buk pathways described herein provide an alternative mechanism for generating ATP for the microorganism through substrate phosphorylation and therefore avoid acetate production. In particular, acetate-forming enzymes such as Pta-Ack, which would otherwise be essential (Nagarajan, Microb Cell Factories, 12:118, 2013), can be replaced by Ptb-Buk as an alternative way to generate ATP. Since the microorganism can then generate ATP at the expense of Ptb-Buk, this system provides the driving force to ensure maximum flux through new pathways involving Ptb-Buk. ATP generation may also be critical for downstream ATP-requiring pathways. For example, the enzymatic production of isobutylene from acetone requires ATP. Although the entire pathway from acetyl-CoA to isobutylene consumes ATP when using CoA transferase or thioesterase, when using Ptb-Buk the pathway is energy neutral.

Приведены примеры источников Ptb и Buk. Однако следует понимать, что могут быть доступны другие подходящие источники Ptb и Buk. Кроме того, Ptb и Buk могут быть сконструированы для улучшения активности, и/или гены, кодирующие Ptb-Buk, могут быть кодон-оптимизированы для экспрессии, в частности, в микроорганизмах-хозяевах.Examples of Ptb and Buk sources are given. However, it should be understood that other suitable sources of Ptb and Buk may be available. In addition, Ptb and Buk can be engineered to improve activity, and/or the genes encoding Ptb-Buk can be codon-optimized for expression, particularly in microbial hosts.

Фосфатбутирилтрансфераза может представлять собой любой источник или может происходить, например, из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:The phosphate butyryl transferase may be from any source or may be derived, for example, from any of the following sources, the sequences of which are publicly available:

- 21 043734- 21 043734

Описание Description Микроорганизм Microorganism Номер доступа Access number фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. EKQ52186 EKQ52186 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 009167896 WP 009167896 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium saccharoperbutylacetonicum Clostridium saccharoperbutylacetonicum WP_015390396 WP_015390396 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium saccharobutylicum Clostridium saccharobutylicum WP 022743598 WP 022743598 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium beijerinckii Clostridium beijerinckii WP 026886639 WP 026886639 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium beijerinckii Clostridium beijerinckii WP 041893500 WP 041893500 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium butyricum Clostridium butyricum WP_003410761 WP_003410761 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. CDB14331 CDB14331 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium botulinum Clostridium botulinum WP 049180512 WP 049180512 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. CDB74819 CDB74819 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium paraputrificum Clostridium paraputrificum WP 027098882 WP 027098882 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 024615655 WP 024615655 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium celatum Clostridium celatum WP 005211129 WP 005211129 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium baratii Clostridium baratii WP 039312969 WP 039312969 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium intestinale Clostridium intestinal WP 021800215 WP 021800215 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 042402499 WP 042402499 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP_032117069 WP_032117069

- 22 043734- 22 043734

фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium perfringens Clostridium perfringens ABG85761 ABG85761 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium botulinum Clostridium botulinum WP_003374233 WP_003374233 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium perfringens Clostridium perfringens WP 004460499 WP 004460499 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium perfringens Clostridium perfringens WP 003454254 WP 003454254 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium perfringens Clostridium perfringens WP_041707926 WP_041707926 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium perfringens Clostridium perfringens BAB82054 BAB82054 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 008681116 WP 008681116 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium chauvoei Clostridium chauvoei WP 021876993 WP 021876993 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium colicanis Clostridium colicanis WP 002598839 WP 002598839 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium cadaveris Clostridium cadaveris WP_027637778 WP_027637778 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium acetobutylicum Clostridium acetobutylicum WP__010966357 WP__010966357 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium pasteurianum Clostridium pasteurianum WP015617430 WP015617430 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium arbusti Clostridium arbusti WP 010238988 WP 010238988 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium pasteurianum Clostridium pasteurianum WP 003445696 WP 003445696 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium scatologenes Clostridium scatologenes WP 029160341 WP 029160341 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 032120461 WP 032120461 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium drakei Clostridium drakei WP 032078800 WP 032078800 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP_021281241 WP_021281241 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium argentinense Clostridium argentinense WP 039635970 WP 039635970 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium akagii Clostridium akagii WP 026883231 WP 026883231 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 053242611 WP 053242611 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridi um carb oxi div orans Clostridium carb oxi div orans WP 007063154 WP 007063154 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP„03 5292411 WP„03 5292411 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sulfidigenes Clostridium sulfidigenes WP__035133394 WP__035133394 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium tetanomorphum Clostridium tetanomorphum WP 035147564 WP 035147564 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium hydrogeniformans Clostridium hydrogeniformans WP 027633206 WP 027633206 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 040212965 WP 040212965 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Candidatus Clostridium Candidatus Clostridium WP__040327613 WP__040327613 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 040192242 WP 040192242 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP__050606427 WP__050606427 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium lundense Clostridium lundense WP 027625137 WP 027625137 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium algidicarnis Clostridium algidicarnis WP 029451333 WP 029451333 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP035306567 WP035306567 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium acetobutylicum Clostridium acetobutylicum AAA75486 AAA75486 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium botulinum Clostridium botulinum WP 025775938 WP 025775938 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium botulinum Clostridium botulinum WP 045541062 WP 045541062 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium botulinum Clostridium botulinum WP003357252 WP003357252 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium botulinum Clostridium botulinum WP 030037192 WP 030037192 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium bornimense Clostridium bornimense WP 044039341 WP 044039341 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium botulinum Clostridium botulinum WP_041346554 WP_041346554 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium sp. Clostridium sp. WP 053468896 WP 053468896 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Бактерия порядка Clostridiales Bacteria of the order Clostridiales WP 034572261 WP 034572261 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium tetani Clostridium tetani WP 023439553 WP 023439553 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Бактерия порядка Clostridiales Bacteria of the order Clostridiales ERI95297 ERI95297 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium botulinum Clostridium botulinum WPJ147403027 WPJ147403027 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium tetani Clostridium tetani WP_011100667 WP_011100667

- 23 043734- 23 043734

фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium tetani Clostridium tetani WP_035111554 WP_035111554 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium senegalense Clostridium senegalense WP_010295062 WP_010295062 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Caloramator sp. Caloramator sp. WP__027307587 WP__027307587 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Thermobrachium celere Thermobrachium celere WP_018661036 WP_018661036 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Clostridium cellulovorans Clostridium cellulovorans WP_010073683 WP_010073683 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Coprococcus comes Coprococcus comes CDB84786 CDB84786 фосфатбутирилтрансфераза phosphate butyryl transferase Coprococcus comes Coprococcus comes