EA043734B1 - GENETICALLY ENGINEERED BACTERIA CONTAINING AN ENERGY-GENERATING ENZYMATIVE PATHWAY - Google Patents
GENETICALLY ENGINEERED BACTERIA CONTAINING AN ENERGY-GENERATING ENZYMATIVE PATHWAY Download PDFInfo
- Publication number
- EA043734B1 EA043734B1 EA201890952 EA043734B1 EA 043734 B1 EA043734 B1 EA 043734B1 EA 201890952 EA201890952 EA 201890952 EA 043734 B1 EA043734 B1 EA 043734B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- coa
- enzyme
- converts
- clostridium
- aldehyde
- Prior art date
Links
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title claims description 70
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 66
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 325
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 286
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 273
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 273
- 241001656809 Clostridium autoethanogenum Species 0.000 claims description 259
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 claims description 256
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 255
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 255
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 169
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 138
- 108700024126 Butyrate kinases Proteins 0.000 claims description 131
- 108700024327 Phosphate butyryltransferases Proteins 0.000 claims description 127
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 111
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 109
- 241000186566 Clostridium ljungdahlii Species 0.000 claims description 108
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 claims description 104
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 claims description 101
- 241001611023 Clostridium ragsdalei Species 0.000 claims description 98
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 86
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 78
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 65
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 65
- 229920001791 ((R)-3-Hydroxybutanoyl)(n-2) Polymers 0.000 claims description 55
- QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 0.000 claims description 53
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical group CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 53
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-M acetoacetate Chemical compound CC(=O)CC([O-])=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 48
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- FFVUICCDNWZCRC-ZSJPKINUSA-N 2-hydroxyisobutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C)(C)O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 FFVUICCDNWZCRC-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 37
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 32
- 108010084715 isopropanol dehydrogenase (NADP) Proteins 0.000 claims description 29
- BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-M 2-hydroxyisobutyrate Chemical compound CC(C)(O)C([O-])=O BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 claims description 23
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 claims description 23
- MXLMTQWGSQIYOW-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-butanol Chemical compound CC(C)C(C)O MXLMTQWGSQIYOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N butyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 15
- WCASXYBKJHWFMY-NSCUHMNNSA-N 2-Buten-1-ol Chemical compound C\C=C\CO WCASXYBKJHWFMY-NSCUHMNNSA-N 0.000 claims description 12
- AXFYFNCPONWUHW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyisovaleric acid Chemical compound CC(C)(O)CC(O)=O AXFYFNCPONWUHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- PEVZKILCBDEOBT-CITAKDKDSA-N 3-hydroxyisovaleryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(C)(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 PEVZKILCBDEOBT-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 12
- AVIYEYCFMVPYST-UHFFFAOYSA-N hexane-1,3-diol Chemical compound CCCC(O)CCO AVIYEYCFMVPYST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- GTLLKMCVRPVGBK-UHFFFAOYSA-N 3-methylbutaneperoxoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)OO GTLLKMCVRPVGBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 10
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 claims description 8
- SPNAEHGLBRRCGL-BIEWRJSYSA-N adipoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 SPNAEHGLBRRCGL-BIEWRJSYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 7
- ZFXICKRXPZTFPB-FZHFFJAKSA-N (Z)-2,3-dehydroadipoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)\C=C/CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZFXICKRXPZTFPB-FZHFFJAKSA-N 0.000 claims description 6
- OTEACGAEDCIMBS-FOLKQPSDSA-N 3-hydroxyadipyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OTEACGAEDCIMBS-FOLKQPSDSA-N 0.000 claims description 6
- VKKKAAPGXHWXOO-BIEWRJSYSA-N 3-oxoadipyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VKKKAAPGXHWXOO-BIEWRJSYSA-N 0.000 claims description 6
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 claims description 5
- 241001611022 Clostridium carboxidivorans Species 0.000 claims description 4
- 241000186587 Clostridium scatologenes Species 0.000 claims description 4
- 241000193459 Moorella thermoacetica Species 0.000 claims description 4
- 241000186339 Thermoanaerobacter Species 0.000 claims description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000328950 Clostridium drakei Species 0.000 claims description 3
- 241001468167 Clostridium magnum Species 0.000 claims description 3
- 241000204376 Sporomusa ovata Species 0.000 claims description 3
- 241000217849 Sporomusa sphaeroides Species 0.000 claims description 3
- 241001468163 Acetobacterium woodii Species 0.000 claims description 2
- 241000037909 Alkalibaculum Species 0.000 claims description 2
- 241001464894 Blautia producta Species 0.000 claims description 2
- 241001656810 Clostridium aceticum Species 0.000 claims description 2
- 241001171821 Clostridium coskatii Species 0.000 claims description 2
- 241000193161 Clostridium formicaceticum Species 0.000 claims description 2
- 241000186398 Eubacterium limosum Species 0.000 claims description 2
- 241000178985 Moorella Species 0.000 claims description 2
- 241001509483 Oxobacter pfennigii Species 0.000 claims description 2
- 241000543642 Sporomusa silvacetica Species 0.000 claims description 2
- HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanal Chemical compound CC(O)CC=O HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 324
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 192
- 239000000047 product Substances 0.000 description 145
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 142
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 121
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 115
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 100
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 90
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 78
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 46
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 42
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 40
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 40
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 36
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 34
- 101150096860 thlA gene Proteins 0.000 description 34
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 description 32
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 31
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 30
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 28
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 27
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 24
- BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisobutyric acid Chemical compound CC(C)(O)C(O)=O BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 23
- 101150054092 buk gene Proteins 0.000 description 22
- 101150031417 buk1 gene Proteins 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N 3-benzyl-5-[(2-nitrophenoxy)methyl]oxolan-2-one Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1OCC1OC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)C1 AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 21
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 241000894007 species Species 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 20
- 108090000124 3-hydroxybutyrate dehydrogenases Proteins 0.000 description 19
- 101150110984 phaB gene Proteins 0.000 description 19
- 102000034279 3-hydroxybutyrate dehydrogenases Human genes 0.000 description 18
- 102000002932 Thiolase Human genes 0.000 description 18
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 description 18
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 18
- 101100297400 Rhizobium meliloti (strain 1021) phaAB gene Proteins 0.000 description 17
- 101100280476 Streptococcus pneumoniae (strain ATCC BAA-255 / R6) fabM gene Proteins 0.000 description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- 101150015366 budA gene Proteins 0.000 description 17
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 108010055682 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Proteins 0.000 description 16
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 16
- 101150006589 adc gene Proteins 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 101150056596 azin2 gene Proteins 0.000 description 16
- 101150031273 BDH1 gene Proteins 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 15
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 15
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 15
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 14
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 14
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 14
- 101001028272 Escherichia coli (strain K12) Long-chain acyl-CoA thioesterase FadM Proteins 0.000 description 13
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 description 13
- 241001112693 Lachnospiraceae Species 0.000 description 13
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 13
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical compound C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N Butyraldehyde Chemical compound CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 101000693728 Homo sapiens S-acyl fatty acid synthase thioesterase, medium chain Proteins 0.000 description 12
- 102100025541 S-acyl fatty acid synthase thioesterase, medium chain Human genes 0.000 description 12
- 108091022873 acetoacetate decarboxylase Proteins 0.000 description 12
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N (S)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 11
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 11
- 108010023922 Enoyl-CoA hydratase Proteins 0.000 description 11
- 102000011426 Enoyl-CoA hydratase Human genes 0.000 description 11
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- 101150108780 pta gene Proteins 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 101150101337 Bdh2 gene Proteins 0.000 description 10
- 241000186570 Clostridium kluyveri Species 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- JSHMCUNOMIZJDJ-UHFFFAOYSA-N butanoyl dihydrogen phosphate Chemical compound CCCC(=O)OP(O)(O)=O JSHMCUNOMIZJDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-M (R)-3-hydroxybutyrate Chemical compound C[C@@H](O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-M 0.000 description 9
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 9
- 101100119095 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) ermB gene Proteins 0.000 description 9
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 8
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 8
- 241000118652 Haloterrigena turkmenica DSM 5511 Species 0.000 description 8
- 108010000775 Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase Proteins 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000789 acetogenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N 0.000 description 7
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 7
- 241000928018 Caldivirga maquilingensis IC-167 Species 0.000 description 7
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 7
- 241001675829 Ferroglobus placidus DSM 10642 Species 0.000 description 7
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 7
- 241000461168 Vulcanisaeta moutnovskia 768-28 Species 0.000 description 7
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 7
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 description 7
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 3-hydroxybutyryl aldehyde Chemical class 0.000 description 6
- 108030005660 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratases Proteins 0.000 description 6
- YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 3-methylbutanal Chemical compound CC(C)CC=O YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100028889 Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial Human genes 0.000 description 6
- 241000205274 Methanosarcina mazei Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 241001467519 Pyrococcus sp. Species 0.000 description 6
- 241000047166 Thermococcus sibiricus MM 739 Species 0.000 description 6
- 241001495444 Thermococcus sp. Species 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010031234 carbon monoxide dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- RWGFKTVRMDUZSP-UHFFFAOYSA-N cumene Chemical compound CC(C)C1=CC=CC=C1 RWGFKTVRMDUZSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 6
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N valeric aldehyde Natural products CCCCC=O HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMWATMXOQQZNBX-DKBZLLMOSA-N 2-methylcrotonoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(/C)=C/C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 PMWATMXOQQZNBX-DKBZLLMOSA-N 0.000 description 5
- 101710090359 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase Proteins 0.000 description 5
- 241000114861 Aciduliprofundum boonei T469 Species 0.000 description 5
- 102100022714 Acyl-coenzyme A thioesterase 13 Human genes 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000543897 Archaeoglobus sulfaticallidus PM70-1 Species 0.000 description 5
- 241001110912 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 Species 0.000 description 5
- 241000193469 Clostridium pasteurianum Species 0.000 description 5
- 241001508458 Clostridium saccharoperbutylacetonicum Species 0.000 description 5
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 5
- 108010036781 Fumarate Hydratase Proteins 0.000 description 5
- 102100036160 Fumarate hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 5
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 108010035473 Palmitoyl-CoA Hydrolase Proteins 0.000 description 5
- 108090000472 Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) Proteins 0.000 description 5
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 5
- 241001203471 Vulcanisaeta distributa DSM 14429 Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N crotonoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)/C=C/C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002309 gasification Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 5
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N (S)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N 0.000 description 4
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 4
- 241000601487 Acidilobus saccharovorans 345-15 Species 0.000 description 4
- 241001329407 Aciduliprofundum sp. Species 0.000 description 4
- 102100025854 Acyl-coenzyme A thioesterase 1 Human genes 0.000 description 4
- 101710175445 Acyl-coenzyme A thioesterase 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000276439 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000070528 Caldisphaera lagunensis DSM 15908 Species 0.000 description 4
- 241000643379 Candidatus Korarchaeum cryptofilum Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108700040197 Enoyl-CoA Hydratase 2 Proteins 0.000 description 4
- 241001267419 Eubacterium sp. Species 0.000 description 4
- 241000085256 Fervidicoccus fontis Kam940 Species 0.000 description 4
- 241000164875 Firmicutes bacterium Species 0.000 description 4
- 241001398756 Halalkalicoccus jeotgali B3 Species 0.000 description 4
- 241000531259 Hyperthermus Species 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000863422 Myxococcus xanthus Species 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000736843 Pyrobaculum aerophilum Species 0.000 description 4
- 241000947431 Pyrobaculum calidifontis JCM 11548 Species 0.000 description 4
- 241000065785 Pyrobaculum oguniense TE7 Species 0.000 description 4
- 241001222730 Pyrococcus horikoshii OT3 Species 0.000 description 4
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 4
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 101710182361 Pyruvate:ferredoxin oxidoreductase Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 102100024639 Short-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 241000268867 Staphylothermus hellenicus DSM 12710 Species 0.000 description 4
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 241000696041 Thermococcus onnurineus Species 0.000 description 4
- 241000205174 Thermofilum Species 0.000 description 4
- 241001491085 Thermofilum pendens Hrk 5 Species 0.000 description 4
- 241000343917 Thermoproteus tenax Kra 1 Species 0.000 description 4
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 4
- 101710081312 Trans-2-enoyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 108010011384 acyl-CoA dehydrogenase (NADP+) Proteins 0.000 description 4
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 101150048352 mazF gene Proteins 0.000 description 4
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 4
- OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N thiamphenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CO)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N 0.000 description 4
- 229960003053 thiamphenicol Drugs 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 3
- 108010063585 (R)-citramalate synthase Proteins 0.000 description 3
- WHBMMWSBFZVSSR-VKHMYHEASA-N (S)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRQDDZWMEGEOOO-UHFFFAOYSA-N 2-trimethylsilylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)[Si](C)(C)C HRQDDZWMEGEOOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108030005924 3-hydroxypropionyl-CoA dehydratases Proteins 0.000 description 3
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxovaleric acid Chemical compound CCC(C)C(=O)C(O)=O JVQYSWDUAOAHFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DUJGMZAICVPCBJ-VDAHYXPESA-N 4-amino-1-[(1r,4r,5s)-4,5-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1 DUJGMZAICVPCBJ-VDAHYXPESA-N 0.000 description 3
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108700001448 Aldo-keto reductase family 1 member A1 Proteins 0.000 description 3
- 241000848220 Aquincola tertiaricarbonis Species 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 3
- 241000186542 Clostridium baratii Species 0.000 description 3
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 3
- 241000949098 Coprococcus comes Species 0.000 description 3
- 241000359383 Desulfurococcus amylolyticus Species 0.000 description 3
- 241000343919 Desulfurococcus amylolyticus DSM 16532 Species 0.000 description 3
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 description 3
- 102000057412 Diphosphomevalonate decarboxylases Human genes 0.000 description 3
- 108700035271 EC 1.1.1.2 Proteins 0.000 description 3
- 241001379910 Ephemera danica Species 0.000 description 3
- 241000195619 Euglena gracilis Species 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241001131718 Haloarcula hispanica ATCC 33960 Species 0.000 description 3
- 241000756428 Haloarcula hispanica N601 Species 0.000 description 3
- 241000981400 Haloferax volcanii DS2 Species 0.000 description 3
- 241001199007 Halogeometricum borinquense DSM 11551 Species 0.000 description 3
- 241000557006 Halorubrum Species 0.000 description 3
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000002284 Hydroxymethylglutaryl-CoA Synthase Human genes 0.000 description 3
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 241001019595 Natronomonas moolapensis Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 241000670334 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Species 0.000 description 3
- 241000514899 Pyrobaculum islandicum DSM 4184 Species 0.000 description 3
- 241000881945 Pyrobaculum sp. Species 0.000 description 3
- 241000432808 Pyrococcus abyssi GE5 Species 0.000 description 3
- 241001120653 Pyrococcus yayanosii CH1 Species 0.000 description 3
- 241000007219 Pyrolobus fumarii 1A Species 0.000 description 3
- 108010031852 Pyruvate Synthase Proteins 0.000 description 3
- 241000589625 Ralstonia pickettii Species 0.000 description 3
- 241001069493 Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589 Species 0.000 description 3
- 241000847591 Thermococcus barophilus MP Species 0.000 description 3
- 241000357036 Thermococcus cleftensis Species 0.000 description 3
- 241001054916 Thermococcus litoralis DSM 5473 Species 0.000 description 3
- 241000857763 Thermodesulfovibrio yellowstonii DSM 11347 Species 0.000 description 3
- 241000870821 Thermoproteus uzoniensis 768-20 Species 0.000 description 3
- 241000589892 Treponema denticola Species 0.000 description 3
- 108010084631 acetolactate decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PASOAYSIZAJOCT-UHFFFAOYSA-N butanoic acid Chemical compound CCCC(O)=O.CCCC(O)=O PASOAYSIZAJOCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 3
- MLUCVPSAIODCQM-NSCUHMNNSA-N crotonaldehyde Chemical compound C\C=C\C=O MLUCVPSAIODCQM-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 3
- MLUCVPSAIODCQM-UHFFFAOYSA-N crotonaldehyde Natural products CC=CC=O MLUCVPSAIODCQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N crotonic acid Chemical compound C\C=C\C(O)=O LDHQCZJRKDOVOX-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 3
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- UYVZIWWBJMYRCD-ZMHDXICWSA-N isovaleryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(C)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 UYVZIWWBJMYRCD-ZMHDXICWSA-N 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000009628 steelmaking Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 3
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LYNVNYDEQMMNMZ-XGXNYEOVSA-N 2-methylbutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LYNVNYDEQMMNMZ-XGXNYEOVSA-N 0.000 description 2
- MWMOPIVLTLEUJO-UHFFFAOYSA-N 2-oxopropanoic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.CC(=O)C(O)=O MWMOPIVLTLEUJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyhexanoic acid Chemical compound CCCC(O)CC(O)=O HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxypropionate Chemical compound OCCC([O-])=O ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010028984 3-isopropylmalate dehydratase Proteins 0.000 description 2
- 102100026105 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 5-sulfosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C1O YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 2
- 102000005345 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001203192 Archaeoglobus profundus DSM 5631 Species 0.000 description 2
- 241000006176 Archaeoglobus veneficus SNP6 Species 0.000 description 2
- 101100389345 Bacillus subtilis (strain 168) ndoA gene Proteins 0.000 description 2
- 101000782236 Bothrops leucurus Thrombin-like enzyme leucurobin Proteins 0.000 description 2
- 241000193174 Butyrivibrio crossotus Species 0.000 description 2
- 108010068197 Butyryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000156241 Candidatus Korarchaeum cryptofilum OPF8 Species 0.000 description 2
- 102100031668 Chromodomain Y-like protein Human genes 0.000 description 2
- 101710168556 Chromodomain Y-like protein Proteins 0.000 description 2
- 241000070918 Cima Species 0.000 description 2
- 241001522206 Clostridium algidicarnis Species 0.000 description 2
- 241001147768 Clostridium argentinense Species 0.000 description 2
- 241001509415 Clostridium botulinum A Species 0.000 description 2
- 241001509496 Clostridium celatum Species 0.000 description 2
- 241000193169 Clostridium cellulovorans Species 0.000 description 2
- 241000206044 Clostridium chauvoei Species 0.000 description 2
- 241000788977 Clostridium colicanis Species 0.000 description 2
- 241000272479 Clostridium diolis Species 0.000 description 2
- 241000779784 Clostridium hydrogeniformans Species 0.000 description 2
- 241001147791 Clostridium paraputrificum Species 0.000 description 2
- 241000429427 Clostridium saccharobutylicum Species 0.000 description 2
- 241000936120 Clostridium senegalense Species 0.000 description 2
- 241001318996 Clostridium sulfidigenes Species 0.000 description 2
- 241000186520 Clostridium tetanomorphum Species 0.000 description 2
- 101710188748 Crotonyl-CoA hydratase Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000605762 Desulfovibrio vulgaris Species 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700034992 EC 1.1.1.80 Proteins 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 2
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 description 2
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003983 Flavoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010057573 Flavoproteins Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- 241001003011 Geobacter sulfurreducens PCA Species 0.000 description 2
- 101150019065 HBD gene Proteins 0.000 description 2
- 241000423295 Haloarcula marismortui ATCC 43049 Species 0.000 description 2
- 241001054902 Haloferax mediterranei ATCC 33500 Species 0.000 description 2
- 241000546751 Halopiger xanaduensis Species 0.000 description 2
- 101000958922 Homo sapiens Diphosphomevalonate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000323143 Ignicoccus hospitalis Species 0.000 description 2
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical compound CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000102542 Kara Species 0.000 description 2
- 108010000200 Ketol-acid reductoisomerase Proteins 0.000 description 2
- 241001468178 Kyrpidia tusciae Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 241001042243 Methanocella arvoryzae MRE50 Species 0.000 description 2
- 241001276824 Methanocella conradii HZ254 Species 0.000 description 2
- 241000921850 Methanocella paludicola SANAE Species 0.000 description 2
- 241001507079 Methanohalobium evestigatum Z-7303 Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101000958925 Panax ginseng Diphosphomevalonate decarboxylase 1 Proteins 0.000 description 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 101710104378 Putative malate oxidoreductase [NAD] Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000439254 Pyrobaculum neutrophilum V24Sta Species 0.000 description 2
- 241001115170 Pyrococcus furiosus DSM 3638 Species 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 2
- 241000711837 Roseburia sp. Species 0.000 description 2
- 108030005950 Short-chain-enoyl-CoA hydratases Proteins 0.000 description 2
- 101000581497 Solanum tuberosum 2-methylacyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 241000205077 Staphylothermus marinus Species 0.000 description 2
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 241000145545 Streptomyces collinus Species 0.000 description 2
- 102000011929 Succinate-CoA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010075728 Succinate-CoA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000295829 Thermococcus gammatolerans EJ3 Species 0.000 description 2
- 241000981880 Thermococcus kodakarensis KOD1 Species 0.000 description 2
- 241000438192 Thermoplasma acidophilum DSM 1728 Species 0.000 description 2
- 241000435340 Thermoplasma volcanium GSS1 Species 0.000 description 2
- 241001119038 Thermosphaera aggregans DSM 11486 Species 0.000 description 2
- 241000868182 Thermus thermophilus HB8 Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108010087331 glutaconate CoA-transferase Proteins 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 108010072869 indolepyruvate decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 108010071806 methylcrotonoyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 2
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- VAAHKRMGOFIORX-SNIDVWGTSA-N s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 3-hydroxyhexanethioate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VAAHKRMGOFIORX-SNIDVWGTSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 101150026728 tesB gene Proteins 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 2
- AOFUBOWZWQFQJU-SNOJBQEQSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolane-2,3,4-triol;(2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AOFUBOWZWQFQJU-SNOJBQEQSA-N 0.000 description 1
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 1
- NEJDKFPXHQRVMV-UHFFFAOYSA-N (E)-2-Methyl-2-buten-1-ol Natural products CC=C(C)CO NEJDKFPXHQRVMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- AFENDNXGAFYKQO-GSVOUGTGSA-N (R)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108010062721 (R)-2-methylmalate dehydratase Proteins 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N (R)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- PUPZLCDOIYMWBV-SCSAIBSYSA-N (R)-butane-1,3-diol Chemical compound C[C@@H](O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N (R)-flurbiprofen Chemical compound FC1=CC([C@H](C(O)=O)C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- PUPZLCDOIYMWBV-BYPYZUCNSA-N (S)-butane-1,3-diol Chemical compound C[C@H](O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 1-Butene Chemical compound CCC=C VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSGWCUXYFMVTPH-MPVICIIESA-N 2-hydroxyisovaleryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(O)C(C)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OSGWCUXYFMVTPH-MPVICIIESA-N 0.000 description 1
- BTVWZWFKMIUSGS-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropane-1,2-diol Chemical compound CC(C)(O)CO BTVWZWFKMIUSGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108030002957 Acetate CoA-transferases Proteins 0.000 description 1
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 description 1
- 241000567147 Aeropyrum Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000605902 Butyrivibrio Species 0.000 description 1
- MGONSHHJTCSVHI-UHFFFAOYSA-N C(CC(=O)C)(=O)OP(=O)(O)O Chemical compound C(CC(=O)C)(=O)OP(=O)(O)O MGONSHHJTCSVHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000716167 Caloramator australicus Species 0.000 description 1
- 241000062075 Caloramator sp. Species 0.000 description 1
- 241001395745 Candidatus Caldiarchaeum Species 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001665089 Chloroflexus aurantiacus J-10-fl Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000423302 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Species 0.000 description 1
- 241000306276 Clostridium akagii Species 0.000 description 1
- 241000719667 Clostridium arbusti Species 0.000 description 1
- 241000445964 Clostridium autoethanogenum DSM 10061 Species 0.000 description 1
- 101100322572 Clostridium beijerinckii (strain ATCC 51743 / NCIMB 8052) adc gene Proteins 0.000 description 1
- 241001335108 Clostridium bornimense Species 0.000 description 1
- 241000193455 Clostridium cadaveris Species 0.000 description 1
- 241001331740 Clostridium lundense Species 0.000 description 1
- 241000186581 Clostridium novyi Species 0.000 description 1
- 241000193470 Clostridium sporogenes Species 0.000 description 1
- 241001464949 Coprococcus eutactus Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 241000301255 Desulfurococcus mucosus DSM 2162 Species 0.000 description 1
- 108700040484 Diphosphomevalonate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 108700033402 EC 1.1.1.38 Proteins 0.000 description 1
- 108700034993 EC 1.1.1.86 Proteins 0.000 description 1
- 108700034911 EC 3.1.2.- Proteins 0.000 description 1
- 101150014913 ERG13 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100021822 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241001531192 Eubacterium ventriosum Species 0.000 description 1
- 241001531182 Eubacterium xylanophilum Species 0.000 description 1
- 241000228882 Fervidicella metallireducens Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000546770 Halopiger Species 0.000 description 1
- 241001417305 Halopiger xanaduensis SH-6 Species 0.000 description 1
- 101000839020 Homo sapiens Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010063370 Homoaconitate hydratase Proteins 0.000 description 1
- 241001603562 Ignisphaera aggregans DSM 17230 Species 0.000 description 1
- NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N Isooctane Chemical compound CC(C)CC(C)(C)C NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000933069 Lachnoclostridium phytofermentans Species 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000157876 Metallosphaera sedula Species 0.000 description 1
- 101100395468 Metallosphaera sedula (strain ATCC 51363 / DSM 5348 / JCM 9185 / NBRC 15509 / TH2) Msed_2001 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 1
- 241001003007 Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 Species 0.000 description 1
- 241000947423 Methanocorpusculum labreanum Z Species 0.000 description 1
- 241001491087 Methanoculleus marisnigri JR1 Species 0.000 description 1
- 241001306965 Methanolobus psychrophilus Species 0.000 description 1
- 241000039716 Methanomethylovorans hollandica DSM 15978 Species 0.000 description 1
- 241001592722 Methanosaeta harundinacea 6Ac Species 0.000 description 1
- 241001013737 Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Species 0.000 description 1
- 241001139408 Methanosarcina acetivorans C2A Species 0.000 description 1
- 241000205275 Methanosarcina barkeri Species 0.000 description 1
- 241001538098 Methanosphaerula palustris Species 0.000 description 1
- 241001649418 Methanospirillum hungatei JF-1 Species 0.000 description 1
- 241001302042 Methanothermobacter thermautotrophicus Species 0.000 description 1
- 241000767818 Methanothrix thermoacetophila PT Species 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001472016 Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Species 0.000 description 1
- 241000078163 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Species 0.000 description 1
- 241000186544 Moorella thermoautotrophica Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide Chemical compound C[Si](C)(C)O\C(C(F)(F)F)=N\[Si](C)(C)C XCOBLONWWXQEBS-KPKJPENVSA-N 0.000 description 1
- 102100032457 NAD-dependent malic enzyme, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000172870 Natrialba magadii ATCC 43099 Species 0.000 description 1
- 241001417623 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Species 0.000 description 1
- 241000975077 Natrinema sp. Species 0.000 description 1
- 241001417618 Natronobacterium gregoryi SP2 Species 0.000 description 1
- 241000007221 Natronococcus occultus SP4 Species 0.000 description 1
- 241000765915 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150052992 PTBP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027506 Peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001632455 Picrophilus torridus Species 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 229920001273 Polyhydroxy acid Polymers 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000205226 Pyrobaculum Species 0.000 description 1
- 241000403986 Pyrobaculum oguniense Species 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 description 1
- 241000836453 Pyrococcus furiosus COM1 Species 0.000 description 1
- 241000134686 Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 Species 0.000 description 1
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 description 1
- 206010039792 Seborrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000204388 Sporomusa Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 101001125870 Streptomyces venezuelae Thioesterase PikA5 Proteins 0.000 description 1
- 241001136694 Subdoligranulum Species 0.000 description 1
- 102100035726 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000202694 Thermoanaerobacter wiegelii Species 0.000 description 1
- 241000520824 Thermobrachium celere Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 1
- 241000193453 [Clostridium] cellulolyticum Species 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N adiponitrile Chemical compound N#CCCCCC#N BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004099 anaerobic respiration Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 101150052778 bdh gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001277 beta hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- UVMPXOYNLLXNTR-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;ethanol;propan-2-one Chemical compound CCO.CC(C)=O.CCCCO UVMPXOYNLLXNTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFAZFSACZIVZDV-UHFFFAOYSA-N butan-2-one Chemical compound CCC(C)=O.CCC(C)=O RFAZFSACZIVZDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diol Chemical compound CCCC(O)O CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPLCYFWQZHLPFH-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diol;butane-2,3-diol Chemical compound CCCC(O)O.CC(O)C(C)O UPLCYFWQZHLPFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N butene Natural products CC=CC IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 description 1
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000571 coke Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- JVSWJIKNEAIKJW-UHFFFAOYSA-N dimethyl-hexane Natural products CCCCCC(C)C JVSWJIKNEAIKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000004508 fractional distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000002816 fuel additive Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000003988 headspace gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- QKGYJVXSKCDGOK-UHFFFAOYSA-N hexane;propan-2-ol Chemical compound CC(C)O.CCCCCC QKGYJVXSKCDGOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M hexanoate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004434 industrial solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001450 methanotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000037312 oily skin Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 238000005373 pervaporation Methods 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 238000005504 petroleum refining Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- DIIBXMIIOQXTHW-UHFFFAOYSA-N pirozadil Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)OCC=2N=C(COC(=O)C=3C=C(OC)C(OC)=C(OC)C=3)C=CC=2)=C1 DIIBXMIIOQXTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950008646 pirozadil Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001225 polyester resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004645 polyester resin Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920005749 polyurethane resin Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000010248 power generation Methods 0.000 description 1
- 238000000079 presaturation Methods 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 101150048333 ptb gene Proteins 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- OFTARKWRQHIGAM-BIKQFFATSA-N s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 3-hydroxybutanethioate;s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C)(C)O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OFTARKWRQHIGAM-BIKQFFATSA-N 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 108090000308 trans-2-enoyl-CoA reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 239000002912 waste gas Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявкиCross references to related applications
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/240850, поданной 13 октября 2015 г., полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.This application claims benefit from U.S. Provisional Patent Application No. 62/240,850, filed October 13, 2015, incorporated herein by reference in its entirety.
Уровень техникиState of the art
Благодаря недавним успехам в ферментативном и метаболическом конструировании (инженерии) были идентифицированы и разработаны ферментативные маршруты для получения различных продуктов (Clomburg, Appl Microbiol Biotechnol, 86: 419-434, 2010; Peralta-Yahya, Biotechnol J, 5: 147-162, 2010; Cho, Biotechnol Adv, pii: S0734-9750(14)00181-5, 2014. Однако все указанные ферментативные маршруты являются энерго(АТФ)-потребляющими или, в лучшем случае, энергетически (АТФ-) нейтральными, что ограничивает выход продукта в энергетически ограниченных системах и рассинхронизирует продуцирование продукта и рост микроорганизма. Согласно настоящему изобретению предложены энергогенерирующие (АТФ-генерирующие) пути, позволяющие преодолеть указанные ограничения, обеспечивая новые ферментативные маршруты и пути для получения различных продуктов, в том числе кислот, алкенов, альдегидов, спиртов и диолов. Указанные пути прямо сопряжены с ростом микроорганизма и обеспечивают высокий выход продуктов.With recent advances in enzyme and metabolic engineering, enzymatic routes have been identified and developed to produce various products (Clomburg, Appl Microbiol Biotechnol, 86: 419-434, 2010; Peralta-Yahya, Biotechnol J, 5: 147-162, 2010 ; Cho, Biotechnol Adv, pii: S0734-9750(14)00181-5, 2014. However, all of these enzymatic routes are energy (ATP)-consuming or, at best, energy (ATP-) neutral, which limits the product yield in energy-limited systems and desynchronizes product production and microorganism growth.According to the present invention, energy-generating (ATP-generating) pathways are proposed to overcome these limitations by providing new enzymatic routes and pathways for the production of various products, including acids, alkenes, aldehydes, alcohols and diols These pathways are directly related to the growth of the microorganism and provide a high yield of products.
В частности, настоящее изобретение относится к ферментативным путям, включающим Ptb-Buk. Фосфатбутирилтрансфераза (Ptb) (EC 2.3.1.19) в норме катализирует реакцию бутаноил-КоА и фосфата с образованием КоА и бутаноилфосфата. Бутираткиназа (Buk) (EC 2.7.2.7) в норме катализирует реакцию бутаноилфосфата и АДФ с образованием бутирата (бутаноата) и АТФ. Соответственно, указанные ферменты совместно (Ptb-Buk) в норме катализируют преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерируют одну молекулу АТФ по механизму субстратного фосфорилирования (SLP).In particular, the present invention relates to enzymatic pathways involving Ptb-Buk. Phosphate butyryl transferase (Ptb) (EC 2.3.1.19) normally catalyzes the reaction of butanoyl-CoA and phosphate to form CoA and butanoyl phosphate. Butyrate kinase (Buk) (EC 2.7.2.7) normally catalyzes the reaction of butanoyl phosphate and ADP to produce butyrate (butanoate) and ATP. Accordingly, these enzymes together (Ptb-Buk) normally catalyze the conversion of butanoyl-CoA to butyrate and generate one molecule of ATP via the substrate phosphorylation (SLP) mechanism.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной и способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, Ptb-Buk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ по механизму субстратного фосфорилирования.The inventors of the present invention have found that Ptb is non-selective and capable of accepting various acyl-CoAs and enoyl-CoAs as substrates, thus Ptb-Buk can be used to convert a number of acyl-CoAs and enoyl-CoAs into the corresponding acids or alkenates, respectively. with simultaneous generation of ATP through the mechanism of substrate phosphorylation.
Кроме того, в комбинации с альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (AOR) и алкогольдегидрогеназой, кислоты, образованные с помощью системы Ptb-Buk, могут быть далее преобразованы в соответствующие альдегиды, спирты или диолы. AOR (EC 1.2.7.5) катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина (который может, например, образовываться в результате окисления CO или водорода) с образованием альдегида и окисленного ферредоксина.Moreover, in combination with aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) and alcohol dehydrogenase, acids formed by the Ptb-Buk system can be further converted into the corresponding aldehydes, alcohols or diols. AOR (EC 1.2.7.5) catalyzes the reaction of an acid and reduced ferredoxin (which can, for example, form from the oxidation of CO or hydrogen) to form an aldehyde and oxidized ferredoxin.
Алкогольдегидрогеназа (EC 1.1.1.1 и EC 1.1.1.2) может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф).Alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1 and EC 1.1.1.2) can convert aldehyde and NAD(P)H to alcohol and NAD(P).
Введение Ptb-Buk и/или AOR в гетерологичный вид, соответственно, обеспечивает новый альтернативный способ получения нативных и ненативных продуктов, таких как кислоты, алкены, кетоны, альдегиды, спирты и диолы, с высоким выходом, таким образом преодолевая ограничения существующего уровня техники.The introduction of Ptb-Buk and/or AOR into a heterologous form accordingly provides a new alternative route for the preparation of native and non-native products such as acids, alkenes, ketones, aldehydes, alcohols and diols in high yield, thereby overcoming the limitations of the current state of the art.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Согласно настоящему изобретению предложена генетически сконструированная (т.е. генноинженерная) бактерия, содержащая экзогенную фосфатбутирилтрансферазу (Ptb) и экзогенную бутираткиназу (Buk) (Ptb-Buk). В общем случае, указанная Ptb-Buk действует на ненативный субстрат, например, субстрат, отличный от бутаноил-КоА и/или бутаноилфосфата, и продуцирует ненативный продукт, например, продукт, отличный от бутаноилфосфата или бутирата. Согласно некоторым вариантам реализации указанная Ptb-Buk преобразует ацетоацетил-КоА в ацетоацетат, 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3гидроксиизовалерат, 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират, или 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2гидроксиизобутират.The present invention provides a genetically engineered bacterium containing exogenous phosphate butyryl transferase (Ptb) and exogenous butyrate kinase (Buk) (Ptb-Buk). In general, said Ptb-Buk acts on a non-native substrate, eg, a substrate other than butanoyl-CoA and/or butanoyl phosphate, and produces a non-native product, eg, a product other than butanoyl phosphate or butyrate. In some embodiments, said Ptb-Buk converts acetoacetyl-CoA to acetoacetate, 3-hydroxyisovaleryl-CoA to 3hydroxyisovalerate, 3-hydroxybutyryl-CoA to 3-hydroxybutyrate, or 2-hydroxyisobutyryl-CoA to 2hydroxyisobutyrate.
Указанная бактерия может продуцировать что-либо одно или более из кислоты, алкена, кетона, альдегида, спирта или диола. Более конкретно, указанная бактерия может продуцировать что-либо одно или более из ацетона или его предшественника, изопропанола или его предшественника, изобутилена или его предшественника, 3-гидроксибутирата или его предшественника, 1,3-бутандиола или его предшественника, 2-гидроксиизобутирата или его предшественника, адипиновой кислоты или ее предшественника, 1,3-гександиола или его предшественника, 3-метил-2-бутанола или его предшественника, 2-бутен-1-ола или его предшественника, изовалерата или его предшественника, или изоамилового спирта или его предшественника. Указанная бактерия, как правило, не продуцирует бутанол.The bacterium may produce any one or more of an acid, an alkene, a ketone, an aldehyde, an alcohol, or a diol. More specifically, said bacterium may produce any one or more of acetone or its precursor, isopropanol or its precursor, isobutylene or its precursor, 3-hydroxybutyrate or its precursor, 1,3-butanediol or its precursor, 2-hydroxyisobutyrate or its precursor, adipic acid or its precursor, 1,3-hexanediol or its precursor, 3-methyl-2-butanol or its precursor, 2-buten-1-ol or its precursor, isovalerate or its precursor, or isoamyl alcohol or its precursor . This bacterium, as a rule, does not produce butanol.
Указанная бактерия может дополнительно содержать разрушающую мутацию в фосфотрансацетилазе (Pta) и ацетаткиназе (Ack). Указанная бактерия может дополнительно содержать разрушающую мутацию в тиоэстеразе. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложена генетически сконструированная бактерия, содержащая экзогенную Ptb-Buk и экзогенную или эндогенную альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу.The bacterium may additionally contain a disruptive mutation in phosphotransacetylase (Pta) and acetate kinase (Ack). The bacterium may further contain a disruptive mutation in the thioesterase. According to another embodiment of the present invention, a genetically engineered bacterium is provided that contains exogenous Ptb-Buk and exogenous or endogenous aldehyde:ferredoxin oxidoreductase.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения продукта, включающий культивирование бактерии согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации в присутствии субстрата. Указанный продукт может представлять собой, например, ацетон или его предшественник, изопропанол или его предшественник, изобутилен или его предшественник, 3-гидроксибутират или егоThe present invention also provides a method for producing a product, comprising cultivating a bacterium according to any of the above embodiments in the presence of a substrate. Said product may be, for example, acetone or its precursor, isopropanol or its precursor, isobutylene or its precursor, 3-hydroxybutyrate or its
- 1 043734 предшественник, 1,3-бутандиол или его предшественник, 2-гидроксиизобутират или его предшественник, адипиновую кислоту или ее предшественник, 1,3-гександиол или его предшественник, 3-метил-2бутанол или его предшественник, 2-бутен-1-ол или его предшественник, изовалерат или его предшественник, или изоамиловый спирт или его предшественник. Обычно указанный субстрат представляет собой газообразный субстрат, содержащий, например, что-либо одно или более из CO, CO2 и H2. Согласно одному варианту реализации указанный газообразный субстрат представляет собой сингаз. Согласно другому варианту реализации указанный газообразный субстрат представляет собой отходящий промышленный газ.- 1 043734 precursor, 1,3-butanediol or its precursor, 2-hydroxyisobutyrate or its precursor, adipic acid or its precursor, 1,3-hexanediol or its precursor, 3-methyl-2-butanol or its precursor, 2-butene-1 -ol or a precursor thereof, isovalerate or a precursor thereof, or isoamyl alcohol or a precursor thereof. Typically, said substrate is a gaseous substrate containing, for example, any one or more of CO, CO 2 and H 2 . In one embodiment, said gaseous substrate is syngas. According to another embodiment, said gaseous substrate is an industrial waste gas.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг. 1 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата, 1,3-бутандиола и 2гидроксиизобутирата из ацетил-КоА. Ацетил-КоА может быть получен из любого подходящего субстрата, такого как углеводный (например, сахарный) субстрат или газообразный субстрат. Согласно настоящему изобретению ацетил-КоА часто получают из газообразного субстрата. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.Fig. 1 is a diagram of the metabolic pathways for the production of various products, including acetone, isopropanol, isobutylene, 3-hydroxybutyrate, 1,3-butanediol, and 2hydroxyisobutyrate from acetyl-CoA. Acetyl-CoA can be obtained from any suitable substrate, such as a carbohydrate (eg, sugar) substrate or a gaseous substrate. According to the present invention, acetyl-CoA is often obtained from a gaseous substrate. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk.
Фиг. 2 представляет собой диаграмму, отражающую реакции, естественным образом катализируемые Ptb-Buk, а именно, преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерацию одной молекулы АТФ.Fig. 2 is a diagram showing the reactions naturally catalyzed by Ptb-Buk, namely the conversion of butanoyl-CoA to butyrate and the generation of one ATP molecule.
Фиг. 3 представляет собой диаграмму сравнения активности КоА-трансферазы, тиоэстеразы и PtbBuk.Fig. 3 is a graph comparing the activities of CoA transferase, thioesterase and PtbBuk.
Фиг. 4 представляет собой график, отражающий средние показатели продуцирования ацетона в E. coli BL21 (D3), модифицированной плазмидами, содержащими экзогенные гены. Указанные данные демонстрируют способность Ptb-Buk к преобразованию ацетоацетил-КоА в ацетоацетат в E.coli in vivo.Fig. 4 is a graph showing the average acetone production in E. coli BL21 (D3) modified with plasmids containing exogenous genes. These data demonstrate the ability of Ptb-Buk to convert acetoacetyl-CoA to acetoacetate in E. coli in vivo.
Фиг. 5 представляет собой график, отражающий эффект индукции E. coli BL21 (DE3), несущей как плазмиду pACYC-ptb-buk, так и плазмиду pCOLA-thlA-adc (экспрессирующие тиолазу, Ptb-Buk и ацетоацетатдекарбоксилазу).Fig. 5 is a graph showing the effect of induction of E. coli BL21 (DE3) carrying both plasmid pACYC-ptb-buk and plasmid pCOLA-thlA-adc (expressing thiolase, Ptb-Buk and acetoacetate decarboxylase).
Фиг. 6 представляет собой диаграмму пути, разработанного для применения Ptb-Buk для получения ацетона, с повторным использованием восстанавливающих эквивалентов, получаемых при продуцировании (R)-3-гидроксибутирuл-КоА и АТФ, генерируемой Ptb-Buk.Fig. 6 is a diagram of the pathway developed for the use of Ptb-Buk to produce acetone, reusing the reducing equivalents obtained from the production of (R)-3-hydroxybutyryl-CoA and the ATP generated by Ptb-Buk.
Фиг. 7 представляет собой диаграмму, отражающую роль альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы (AOR), ферредоксина и Adh при продуцировании 1,3-бутандиола в С. autoethanogenum. Чаще всего AOR может применяться для катализа преобразование кислоты в альдегид, a Adh может применяться для катализа преобразования альдегида в спирт/диол.Fig. 7 is a diagram showing the role of aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR), ferredoxin and Adh in the production of 1,3-butanediol in C. autoethanogenum. Most commonly, AOR can be used to catalyze the conversion of an acid to an aldehyde, and Adh can be used to catalyze the conversion of an aldehyde to an alcohol/diol.
Фиг. 8 представляет собой диаграмму, отражающую стереоспецифичность Ptb-Buk при продуцировании (R)-3-гидроксибутирата и 2-гидроксиизобутирата. Термин нативный на фиг. 8 относится к нативной тиоэстеразе.Fig. 8 is a diagram showing the stereospecificity of Ptb-Buk in producing (R)-3-hydroxybutyrate and 2-hydroxyisobutyrate. The term native in Fig. 8 refers to native thioesterase.
Фиг. 9 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование изобутена с помощью PtbBuk-преобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерата с применением альтернативного пути 1.Fig. 9 is a diagram showing the production of isobutene by PtbBuk conversion of 3-hydroxyisovaleryl-CoA and 3-hydroxyisovalerate using alternative route 1.
Фиг. 10 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование изобутена с помощью PtbBuk-преобразования 3-гидроксиизовалерил-КоА и 3-гидроксиизовалерата с применением альтернативного пути 2.Fig. 10 is a diagram showing the production of isobutene by PtbBuk conversion of 3-hydroxyisovaleryl-CoA and 3-hydroxyisovalerate using alternative route 2.
Фиг. 11 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование 1,3-бутандиола с помощью 3 -бутиральдегиддегидрогеназы (Bld).Fig. 11 is a diagram showing the production of 1,3-butanediol by 3-butyraldehyde dehydrogenase (Bld).
Фиг. 12 представляет собой график, отражающий продуцирование изопропанола в С. autoethanogenum с применением системы Ptb-Buk относительно контроля oPMTL85i47-thlA-adc, • pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.Fig. 12 is a graph showing isopropanol production in C. autoethanogenum using the Ptb-Buk system relative to the control o P MTL85i47-thlA-adc, • pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.
Фиг. 13A-F представляют собой графики, отражающие продуцирование 3-гидроксибутирата, ацетата, этанола и ацетона с применением модульных плазмид у E. coli с разными концентрациями индуктора ИТПТ (0, 50, 100 мкМ). Фиг. 13А: pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB. Фиг. 13В:Fig. 13A-F are graphs showing the production of 3-hydroxybutyrate, acetate, ethanol and acetone using modular plasmids in E. coli with different concentrations of ITPT inducer (0, 50, 100 μM). Fig. 13A: pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB. Fig. 13V:
pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13С: pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13D: pCOLA-thlA-adc. Фиг. 13E: pCDF-phaB-bdhl. Фиг. 13F: pCDF-phaB.pACYC-ptb-buk, pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Fig. 13C: pCOLA-thlA-adc, pCDF-phaB-bdhl. Fig. 13D: pCOLA-thlA-adc. Fig. 13E: pCDF-phaB-bdhl. Fig. 13F: pCDF-phaB.
Фиг. 14 представляет собой плазмидную карту плазмиды pMTL8225-budA::thlA-phaB.Fig. 14 is a plasmid map of plasmid pMTL8225-budA::thlA-phaB.
Фиг. 15 представляет собой снимок геля ПЦР-верификации замены генов ацетолактатсинтазы (budA) генами тиолазы (thlA) и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (phaB) у С. autoethanogenum для 4 клонов (1, 4, 7, 9) по сравнению с диким типом (W). Все клоны являются положительными, что видно по большему размеру ПЦР-фрагментов по сравнению с диким типом.Fig. 15 is a snapshot of a PCR verification gel of the replacement of acetolactate synthase (budA) genes with thiolase (thlA) and 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (phaB) genes in C. autoethanogenum for 4 clones (1, 4, 7, 9) compared to wild type (W). All clones are positive, as evidenced by the larger size of PCR fragments compared to the wild type.
Фиг. 16 представляет собой график, отражающий профиль ферментации для периодической ферментации штамма С. autoethanogenum budA::thlAphaB и демонстрирующий образование 3гидроксибутирата и 1,3-бутандиола из газа.Fig. 16 is a graph showing the fermentation profile for a batch fermentation of the C. autoethanogenum strain budA::thlAphaB and showing the formation of 3hydroxybutyrate and 1,3-butanediol from gas.
Фиг. 17А представляет собой график, отражающий продуцирование 1,3-BDO с помощью тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (Bld) и бутиральдегиддегидрогеназы. Фиг. 17В представляет собой график, отражающий влияние экспрессии bld на рост.Fig. 17A is a graph showing the production of 1,3-BDO by thiolase, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (Bld) and butyraldehyde dehydrogenase. Fig. 17B is a graph showing the effect of bld expression on growth.
- 2 043734- 2 043734
Фиг. 18А представляет собой график, отражающий образование 3-гидроксибутирата и 1,3бутандиола из газообразного субстрата в С autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA. Фиг. 18В представляет собой график, отражающий восстановление ацетата в этанол в той же культуре. Фиг. 19 представляет собой график, отражающий профиль ферментации штамма С. autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA, демонстрирующий образование 3-гидроксибутирата и 1,3-бутандиола из газообразного субстрата в непрерывной культуре (где это указано, среду непрерывно восполняли с заданной скоростью разведения D).Fig. 18A is a graph showing the formation of 3-hydroxybutyrate and 1,3butanediol from substrate gas in C autoethanogenum pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA. Fig. 18B is a graph showing the reduction of acetate to ethanol in the same culture. Fig. 19 is a graph depicting the fermentation profile of C. autoethanogenum strain pMTL8315-Pfdx-hbdl-thlA demonstrating the production of 3-hydroxybutyrate and 1,3-butanediol from a gaseous substrate in continuous culture (where indicated, the medium was continuously replenished at a given dilution rate D ).
Фиг. 20А и 20В представляют собой графики, отражающие увеличенную активность гидролиза КоА в отношении диапазона ацил-КоА (ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирилКоА) у С. autoethanogenum, экспрессирующего систему Ptb-Buk из плазмиды pMTL82256-ptb-buk, по сравнению с диким типом (WT).Fig. 20A and 20B are graphs showing increased CoA hydrolysis activity across a range of acyl-CoAs (acetoacetyl-CoA, 3-hydroxybutyryl-CoA, and 2-hydroxyisobutyryl-CoA) in C. autoethanogenum expressing the Ptb-Buk system from plasmid pMTL82256-ptb-buk , compared to wild type (WT).
Фиг. 21А и 21В представляют собой графики, отражающие сниженную активность гидролиза ацилКоА у штаммов С. autoethanogenum с инактивированной тиоэстеразой (СТ2640 = тиоэстераза 1, СТ1524 = тиоэстераза 2, СТ1780 = тиоэстераза 3) по сравнению с активностью, обнаруживаемой у C. autoethanogenum LZ1560 или LZ1561.Fig. 21A and 21B are graphs showing the reduced acylCoA hydrolysis activity of C. autoethanogenum thioesterase-inactivated strains (CT2640 = thioesterase 1, CT1524 = thioesterase 2, CT1780 = thioesterase 3) compared to the activity found in C. autoethanogenum LZ1560 or L Z1561.
Фиг. 22 представляет собой график, отражающий увеличенное специфическое продуцирование изопропанола у штамма С. autoethanogenum с разрушенной тиоэстеразой 3 CAETHG_1780 по сравнению с С. autoethanogenum дикого типа.Fig. 22 is a graph showing the increased specific isopropanol production of the thioesterase 3 disrupted C. autoethanogenum strain CAETHG_1780 compared to wild type C. autoethanogenum.
Фиг. 23A-D представляют собой графики, отражающие рост (фиг. 23А) и профили продуцирования изопропанола (фиг. 23В), ацетата (фиг. 23С) и этанола (фиг. 23D) у С. autoethanogenum дикого типа и штамма с разрушенной тиоэстеразой 3 (CAETHG_1780), по сравнению с С. autoethanogenum дикого типа.Fig. 23A-D are graphs depicting the growth (FIG. 23A) and isopropanol (FIG. 23B), acetate (FIG. 23C), and ethanol (FIG. 23D) production profiles of C. autoethanogenum wild type and thioesterase 3 disrupted strain ( CAETHG_1780), compared to wild-type C. autoethanogenum.
Фиг. 24 представляет собой плазмидную карту pMTL8225-pta-ack::ptb-buk.Fig. 24 is a plasmid map of pMTL8225-pta-ack::ptb-buk.
Фиг. 25 представляет собой снимок геля, отражающий замену генов pta и ack на гены ptb и buk и кассету ermB.Fig. 25 is a gel image showing the replacement of the pta and ack genes with the ptb and buk genes and the ermB cassette.
Фиг. 26 представляет собой график, отражающий увеличенное преобразование 3-гидроксибутирата в 1,3-BDO за счет избыточной экспрессии гена альдегид:ферредоксиноксидоредуктазы aor1.Fig. 26 is a graph showing increased conversion of 3-hydroxybutyrate to 1,3-BDO due to overexpression of the aldehyde:ferredoxin oxidoreductase gene aor1.
Фиг. 27 представляет собой график, отражающий активность тиоэстеразы TesB, Pta-Ack и системы Ptb-Buk на гидролиз КоА ацетоацетил-КоА, 3-гидроксибутирил-КоА и 2-гидроксиизобутирил-КоА по сравнению с контролем (штамм BL21). Ptb-Buk демонстрирует максимальную активность, тогда как PtaAck демонстрирует отсутствие активности.Fig. 27 is a graph showing the activity of TesB thioesterase, Pta-Ack and the Ptb-Buk system on the hydrolysis of CoA acetoacetyl-CoA, 3-hydroxybutyryl-CoA and 2-hydroxyisobutyryl-CoA compared to the control (strain BL21). Ptb-Buk shows maximum activity, while PtaAck shows no activity.
Фиг. 28А и 28В представляют собой графики, отражающие продуцирование 3-гидроксибутирата с помощью Ptb-Buk в комбинации с ^-специфической (Hbd) (фиг. 28А) или ^-специфической 3гидроксибутиратдегидрогеназой (PhaB) (фиг. 28В).Fig. 28A and 28B are graphs showing the production of 3-hydroxybutyrate by Ptb-Buk in combination with ^-specific (Hbd) (Fig. 28A) or ^-specific 3hydroxybutyrate dehydrogenase (PhaB) (Fig. 28B).
Фиг. 29A-D представляют собой графики, отражающие ЖХ-МС/МС-детекцию 2гидроксиизомасляной кислоты (2-ГИБ) и 2-гидроксибутирата (2-ГБ). Фиг. 29А: 1 мМ стандарт 2-ГИБ. Фиг. 29В: 1 мМ стандарт 2-ГБ. Фиг. 29С: 0,5 мМ стандарт 2-ГБ и 2-ГИБ. Фиг. 29D: дупликат образца С. autoethanogenum, демонстрирующий продуцирование 2-ГИБ и 2-ГБ из газа.Fig. 29A-D are graphs showing LC-MS/MS detection of 2-hydroxyisobutyric acid (2-HIB) and 2-hydroxybutyrate (2-HB). Fig. 29A: 1 mM 2-GIB standard. Fig. 29V: 1mM 2-GB standard. Fig. 29C: 0.5 mM standard 2-GB and 2-GIB. Fig. 29D: duplicate sample of C. autoethanogenum showing production of 2-HIB and 2-HB from gas.
Фиг. 30 представляет собой группу графиков, отражающих ГХ-МС-подтверждение продуцирования 2-гидроксиизомасляной кислоты (8,91 мин).Fig. 30 is a group of graphs showing GC/MS confirmation of 2-hydroxyisobutyric acid production (8.91 min).
Первая панель: С. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Вторая панель: С. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk (спектр). Третья панель: Е. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Четвертая панель: Е. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk.First panel: C. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Second panel: C. autoethanogenum + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk (spectrum). Third panel: E. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-tesB. Fourth panel: E. coli + pMTL83155-thlA-hbd-Pwl-meaBhcmA-hcmB + pMTL82256-ptb-buk.
Фиг. 31 представляет собой группу графиков ПЦР в реальном времени, отражающих экспрессию генов пути 2-ШВА (thlA, hba, meaBhcmA, hcmB из промотора pta-ack и, соответственно, промотора оперона Вуда-Льюнгдаля) в E.coli, С. autoethanogenum LZ1561 при 30°С, и С. autoethanogenum LZ1561 при 37°С.Fig. 31 is a group of real-time PCR graphs reflecting the expression of 2-WBA pathway genes (thlA, hba, meaBhcmA, hcmB from the pta-ack promoter and, accordingly, the promoter of the Wood-Ljungdahl operon) in E. coli, C. autoethanogenum LZ1561 at 30°C, and C. autoethanogenum LZ1561 at 37°C.
Фиг. 32 представляет собой диаграмму, отражающую продуцирование различных продуктов в микроорганизме, содержащем Ptb-Buk, AOR и Adh.Fig. 32 is a diagram showing the production of various products in a microorganism containing Ptb-Buk, AOR and Adh.
Фиг. 33 представляет собой диаграмму, отражающую сопряжение люциферазы светлячков (Luc) с системой Ptb-Buk для характеризации вариантов Ptb-Buk.Fig. 33 is a diagram showing the coupling of firefly luciferase (Luc) to the Ptb-Buk system to characterize Ptb-Buk variants.
Фиг. 34 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе адипиновой кислоты. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.Fig. 34 is a diagram of the metabolic pathways for the production of various products, including adipic acid. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk.
Фиг. 35 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе 1,3-гександиола, 2-метил-2-бутанола и 2-бутен-1-ола. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.Fig. 35 is a diagram of the metabolic pathways for the production of various products, including 1,3-hexanediol, 2-methyl-2-butanol and 2-buten-1-ol. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk.
Фиг. 36 представляет собой диаграмму метаболических путей продуцирования различных продуктов, в том числе изовалерата и изоамилового спирта. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk.Fig. 36 is a diagram of the metabolic pathways for the production of various products, including isovalerate and isoamyl alcohol. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk.
- 3 043734- 3 043734
Фиг. 37 представляет собой график продуцирования 3-ГБ в С. autoethanogenum, содержащем плазмиду pMTL82256-thlA-ctfAB, в различных точках роста.Fig. 37 is a graph of 3-HB production in C. autoethanogenum containing plasmid pMTL82256-thlA-ctfAB at various growth points.
Фиг. 38А представляет собой график, отражающий рост и профиль продуцирования этанола и 2,3бутандиола у штамма С. awtoetf?a«ogrnwwpta-ack::ptb-buk + pMTL85147^^ Фиг. 38В представляет собой график, отражающий профиль продуцирования изопропанола и 3-ГБ у штамма С. autoethanogenum pta-ack: :ptb-buk + pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc.Fig. 38A is a graph showing the growth and ethanol and 2,3butanediol production profile of strain C. awtoetf?a'ogrnwwpta-ack::ptb-buk + pMTL85147^^ FIG. 38B is a graph showing the isopropanol and 3-HB production profile of the C. autoethanogenum pta-ack: :ptb-buk + pMTL85147-thlA-ptb-buk-adc strain.
Фиг. 39 представляет собой диаграмму схемы пути продуцирования диапазона спиртов, кетонов, енолов или диолов С4, C6, C8, C10, С12, С14 посредством комбинирования известного пути удлинения цепи (Hbd, Crt, Bcd-EtfAB, ТЫ) с Ptb-Buk + AOR/Adc-Adh.Fig. 39 is a schematic diagram of a pathway for producing a range of C4 , C6 , C8 , C10 , C12 , C14 alcohols, ketones, enols or diols by combining a known chain extension pathway (Hbd, Crt, Bcd-EtfAB, THY) with Ptb-Buk + AOR/Adc-Adh.
Фиг. 40 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO С. autoethanogenum, трансформированным плазмидой pMTL83159-phaB-thlA, в различных точках роста.Fig. 40 is a graph showing the production of 3-HB and 1,3-BDO by C. autoethanogenum transformed with plasmid pMTL83159-phaB-thlA at various growth points.
Фиг. 41 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ и 1,3-BDO С. autoethanogenum, содержащим нокаут budA и pMTL-HBD-ThlA, в различных точках роста.Fig. 41 is a graph showing the production of 3-HB and 1,3-BDO by C. autoethanogenum containing a budA and pMTL-HBD-ThlA knockout at various growth points.
Фиг. 42А представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ при ферментации С. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256. Фиг. 42В представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ при ферментации С. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256-buk-ptb.Fig. 42A is a graph showing the production of 3-HB by fermentation of C. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256. Fig. 42B is a graph showing the production of 3-HB by fermentation of C. autoethanogenum pMTL83159-phaB-thlA + pMTL82256-buk-ptb.
Фиг. 43 представляет собой график, отражающий продуцирование 3-ГБ штаммом С. autoethanogenum, с нокаутом тиоэстеразы (ΔCAETHG_1524), экспрессирующим плазмиду pMTL83156-phaB-thlA, содержащим и не содержащим экспрессионную плазмиду Ptb-Buk pMTL82256-buk-ptb.Fig. 43 is a graph showing the production of 3-HB by a thioesterase knockout strain of C. autoethanogenum (ΔCAETHG_1524) expressing plasmid pMTL83156-phaB-thlA with and without the Ptb-Buk expression plasmid pMTL82256-buk-ptb.
Фиг. 44 представляет собой график, отражающий продуцирование этанола и 1,3-BDO у штамма С. autoethanogenum, экспрессирующего плазмиду pMTL82256-hbd-thlA (2pf) содержащего и не содержащего плазмиду для избыточной экспрессии AOR pMTL83159-aor1 (+aorl).Fig. 44 is a graph showing the production of ethanol and 1,3-BDO in a C. autoethanogenum strain expressing plasmid pMTL82256-hbd-thlA (2pf) containing and not containing the AOR overexpression plasmid pMTL83159-aor1 (+aorl).
Подробное описание изобретения Метаболические пути на фиг. 1 и 34-36Detailed Description of the Invention Metabolic Pathways in FIG. 1 and 34-36
Фиг. 1 и 34-36 представляют собой диаграммы метаболических путей продуцирования различных продуктов кислот, алкенов, кетонов, альдегидов, спиртов и диолов, в том числе ацетона, изопропанола, изобутилена, 3-гидроксибутирата (R- и S-изомеров), 1,3-бутандиола, 2-гидроксиизобутирата, адипиновой кислоты, 1,3-гександиола, 2-метил-2-бутанола, 2-бутен-1-ола, изовалерата и изоамилового спирта из субстрата. Жирными стрелками указаны этапы, которые могут быть катализированы Ptb-Buk. Примеры ферментов приведены для каждого из этапов и ферментативных путей, подробно представленных на фиг. 1 и 34-36. Однако специалисту в данной области техники могут быть известны дополнительные подходящие ферменты.Fig. 1 and 34-36 are diagrams of metabolic pathways for the production of various products of acids, alkenes, ketones, aldehydes, alcohols and diols, including acetone, isopropanol, isobutylene, 3-hydroxybutyrate (R- and S-isomers), 1,3- butanediol, 2-hydroxyisobutyrate, adipic acid, 1,3-hexanediol, 2-methyl-2-butanol, 2-buten-1-ol, isovalerate and isoamyl alcohol from the substrate. Bold arrows indicate steps that can be catalyzed by Ptb-Buk. Examples of enzymes are given for each of the steps and enzymatic pathways detailed in FIG. 1 and 34-36. However, additional suitable enzymes may be known to one skilled in the art.
Этап 1 отражает преобразование ацетил-Ко А в ацетоацетил-КоА. Указанный этап может быть катализирован тиолазой (т.е. ацетил-КоА-ацетилтрансферазой) (EC 2.3.1.9). Указанная тиолаза может представлять собой, например, ThlA из Clostridium, acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), PhaA из Cupriavidus necator (WP_013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB из Cupriavidus necator (WP_011615089.1) (SEQ ID NO: 3) или AtoB из Escherichia coli (NP_416728.1) (SEQ ID NO: 4). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 1 reflects the conversion of acetyl-Co A to acetoacetyl-CoA. This step can be catalyzed by a thiolase (ie acetyl-CoA acetyltransferase) (EC 2.3.1.9). Said thiolase may be, for example, ThlA from Clostridium, acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), PhaA from Cupriavidus necator (WP_013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB from Cupriavidus necator (WP_011615089. 1) (SEQ ID NO: 3) or AtoB from Escherichia coli (NP_416728.1) (SEQ ID NO: 4). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has native activity corresponding to this stage.
Этап 2 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в ацетоацетат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9), и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацилКоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12), и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрес- 4 043734 сия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 2 reflects the conversion of acetoacetyl-CoA to acetoacetate. This step can be catalyzed by CoA transferase (ie acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase) (EC 2.8.3.9). Said CoA transferase may be, for example, CtfAB, a heterodimer containing CtfA and CtfB subunits from Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6 ). This step can also be catalyzed by thioesterase (EC 3.1.2.20). Said thioesterase may be, for example, TesB from Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). This step may also be catalyzed by a hypothetical thioesterase, for example from Clostridium autoethanogenum or Clostridium ljungdahlii. Specifically, three hypothetical thioesterases have been identified in Clostridium autoethanogenum: (1) thioesterase 1 (AGY74947.1; annotated as palmitoyl-CoA hydrolase; SEQ ID NO: 8), (2) thioesterase 2 (AGY75747.1; annotated as 4hydroxybenzoyl -CoA thioesterase; SEQ ID NO: 9), and (3) thioesterase 3 (AGY75999.1; annotated as a hypothetical thioesterase; SEQ ID NO: 10). Three hypothetical thioesterases were also identified in Clostridium ljungdahlii: (1) thioesterase 1 (ADK15695.1; annotated as predicted acylCoA thioesterase 1; SEQ ID NO: 11), (2) thioesterase 2 (ADK16655.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 12), and (3) thioesterase 3 (ADK16959.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 13). This step can also be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.
Этап 3 отражает преобразование ацетоацетата в ацетон. Указанный этап может быть катализирован ацетоацетатдекарбоксилазой (EC 4.1.1.4). Указанная ацетоацетатдекарбоксилаза может представлять собой, например, Adc из Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). Указанный этап может также быть катализирован альфа-кетоизовалератдекарбоксилазой (EC 4.1.1.74). Указанная альфакетоизовалератдекарбоксилаза может представлять собой, например, KivD из Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Кроме того, Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. В редких случаях преобразование ацетоацетата в ацетон может происходить спонтанно. Однако спонтанное преобразование очень неэффективно; маловероятно, что оно может приводить к продуцированию выходных продуктов на желаемых уровнях.Step 3 reflects the conversion of acetoacetate to acetone. This step can be catalyzed by acetoacetate decarboxylase (EC 4.1.1.4). Said acetoacetate decarboxylase may be, for example, Adc from Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). This step can also be catalyzed by alpha-ketoisovalerate decarboxylase (EC 4.1.1.74). Said alpha-ketoisovalerate decarboxylase may be, for example, KivD from Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. In addition, Escherichia coli has no known native activity corresponding to this step. In rare cases, conversion of acetoacetate to acetone may occur spontaneously. However, spontaneous conversion is very inefficient; it is unlikely to produce output products at the desired levels.
Этап 4 отражает преобразование ацетона в изопропанол. Указанный этап может быть катализирован первичной: вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.2). Указанная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 4 reflects the conversion of acetone to isopropanol. This step can be catalyzed by primary: secondary alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.2). Said primary:secondary alcohol dehydrogenase may be, for example,
SecAdh изSecAdh from
Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh из Clostridium ljungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh из Clostridium ragsdalei (WPJH3239134.1) (SEQ ID NO: 18) или SecAdh из Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh from Clostridium ljungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh from Clostridium ragsdalei (WPJH3239134.1) (SEQ ID NO: 18) or SecAdh from Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).
Указанный этап может также быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.80), такой как SecAdh из Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Однако Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Нокдаун или нокаут указанного фермента у Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei приводит к продуцированию и накоплению ацетона, а не изопропанола (WO 2015/085015).This step can also be catalyzed by a primary:secondary alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.80), such as SecAdh from Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). However, Escherichia coli has no known native activity corresponding to this step. Knockdown or knockout of this enzyme in Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei leads to the production and accumulation of acetone rather than isopropanol (WO 2015/085015).
Этап 5 отражает преобразование ацетона в 3-гидроксиизовалерат. Указанный этап может быть катализирован гидроксиизовалератсинтазой, например, гидроксиметилглутарил-КоА-синтазой (ГМГ-КоАсинтазой) (EC 2.3.3.10) из Mus musculus (SEQ ID NO: 21) (US 2012/0110001).Step 5 reflects the conversion of acetone to 3-hydroxyisovalerate. This step can be catalyzed by hydroxyisovalerate synthase, for example, hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (HMG-CoA synthase) (EC 2.3.3.10) from Mus musculus (SEQ ID NO: 21) (US 2012/0110001).
Гидроксиметилглутарил-КоА-синтаза может быть сконструирована таким образом, чтобы ее активность увеличивалась. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase can be engineered to increase its activity. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 6 отражает преобразование 3-гидроксиизовалерата в изобутилен (изобутен). Указанный этап может быть катализирован гидроксиизовалератфосфорилазой/декарбоксилазой. Указанный этап может также быть катализирован мевалонатдифосфатдекарбоксилазой (гидроксиизовалератдекарбоксилазой) (EC 4.1.1.33). Указанная мевалонатдифосфатдекарбоксилаза может представлять собой, например,Step 6 reflects the conversion of 3-hydroxyisovalerate to isobutylene (isobutene). This step can be catalyzed by hydroxyisovalerate phosphorylase/decarboxylase. This step can also be catalyzed by mevalonate diphosphate decarboxylase (hydroxyisovalerate decarboxylase) (EC 4.1.1.33). Said mevalonate diphosphate decarboxylase may be, for example,
Mdd из Saccharomyces cerevisiae (САА96324.1) (SEQ ID NO:Mdd from Saccharomyces cerevisiae (CAA96324.1) (SEQ ID NO:
22) или Mdd из Picrophilus torridus (WP_011178157.1) (SEQ ID NO: 23) (US 2011/0165644; van Leeuwen, ApplMicrobiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012).22) or Mdd from Picrophilus torridus (WP_011178157.1) (SEQ ID NO: 23) (US 2011/0165644; van Leeuwen, ApplMicrobiol Biotechnol, 93: 1377-1387, 2012).
Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium, autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 7 отражает преобразование ацетона в 3-гидроксиизовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксиизовалерил-КоА-синтазой. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 7 reflects the conversion of acetone to 3-hydroxyisovaleryl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxyisovaleryl-CoA synthase. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 8 отражает преобразование 3-гидроксиизовалерил-КоА в 3-гидроксиизовалерат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетической тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium, autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9) и (3) тиоэстеразаStep 8 reflects the conversion of 3-hydroxyisovaleryl-CoA to 3-hydroxyisovalerate. This step can be catalyzed by CoA transferase (ie acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase) (EC 2.8.3.9). Said CoA transferase may be, for example, CtfAB, a heterodimer containing CtfA and CtfB subunits from Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6 ). This step can also be catalyzed by thioesterase (EC 3.1.2.20). Said thioesterase may be, for example, TesB from Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). This step may also be catalyzed by a hypothetical thioesterase, for example from Clostridium autoethanogenum or Clostridium ljungdahlii. Specifically, three hypothetical thioesterases have been identified in Clostridium, autoethanogenum: (1) thioesterase 1 (AGY74947.1; annotated as palmitoyl-CoA hydrolase; SEQ ID NO: 8), (2) thioesterase 2 (AGY75747.1; annotated as 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase; SEQ ID NO: 9) and (3) thioesterase
- 5 043734 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.- 5 043734 (AGY75999.1; annotated as a hypothetical thioesterase; SEQ ID NO: 10). Three hypothetical thioesterases have also been identified in Clostridium ljungdahlii: (1) thioesterase 1 (ADK15695.1; annotated as predicted acyl-CoA thioesterase 1; SEQ ID NO: 11), (2) thioesterase 2 (ADK16655.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 12) and (3) thioesterase 3 (ADK16959.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 13). This step can also be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.
Этап 9 отражает преобразование ацетил-КоА в 3-метил-2-оксопентаноат. Указанный этап охватывает ряд ферментативных реакций, вовлеченных в путь биосинтез изолейцина, который естественным образом присутствует у многих бактерий, в том числе Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (и Escherichia coli). Ферменты, вовлеченные в преобразование ацетил-КоА в 3-метил-2-оксопентаноат, могут включать цитрамалатсинтазу (EC 2.3.1.182), 3-изопропилмалатдегидратазу (EC 4.2.1.35), 3-изопропилмалатдегидрогеназу (EC 1.1.1.85), ацетолактатсинтазу (EC 2.2.1.6), кетол-кислотную редуктоизомеразу (EC 1.1.1.86) и/или дигидроксикислотную дегидратазу (EC 4.2.1.9). Указанная цитрамалатсинтаза может представлять собой, например, CimA из Clostridium autoethanogenum (AGY76958.1) (SEQ ID NO: 24) или CimA из Methanocaldococcus jannaschii (NP_248395.1) (SEQ ID NO: 25). Указанная 3-изопропилмалатдегидратаза может представлять собой, например, LeuCD из Clostridium autoethanogenum (WP_023162955.1, LeuC; AGY77204.1, LeuD) (последовательности SEQ ID NO: 26 и 27, соответственно) или LeuCD из Escherichia coli (NP_414614.1, LeuC; NP_414613.1, LeuD) (последовательности SEQ ID NO: 28 и 29, соответственно). Указанная 3изопропилмалатдегидрогеназа может представлять собой, например, LeuB из Clostridium autoethanogenum (WP_023162957.1) (SEQ ID NO: 30) или LeuB из Escherichia coli (NP_414615.4) (SEQ ID NO: 31). Указанная ацетолактатсинтаза может представлять собой, например, IlvBN из Clostridium autoethanogenum (AGY74359.1, IlvB; AGY74635.1, IlvB; AGY74360.1, IlvN) (последовательности SEQ ID NO: 32, 33 и 34, соответственно) или IlvBN из Escherichia coli (NP_418127.1, IlvB; NP_418126.1, IlvN) (последовательности SEQ ID NO: 35 и 36, соответственно). Указанная кетол-кислотная редуктоизомераза может представлять собой, например, IlvC из Clostridium autoethanogenum (WP_013238693.1) (SEQ ID NO: 37) или IlvC из Escherichia coli (NP_418222.1) (SEQ ID NO: 38). Указанная дигидроксикислотная дегидратаза может представлять собой, например, IlvD из Clostridium autoethanogenum (WP_013238694.1) (SEQ ID NO: 39) или IlvD из Escherichia coli (YP_026248.1) (SEQ ID NO: 40). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 9 reflects the conversion of acetyl-CoA to 3-methyl-2-oxopentanoate. This step involves a number of enzymatic reactions involved in the isoleucine biosynthesis pathway, which is naturally present in many bacteria, including Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (and Escherichia coli). Enzymes involved in the conversion of acetyl-CoA to 3-methyl-2-oxopentanoate may include citramalate synthase (EC 2.3.1.182), 3-isopropylmalate dehydratase (EC 4.2.1.35), 3-isopropylmalate dehydrogenase (EC 1.1.1.85), acetolactate synthase (EC 2.2.1.6), ketol acid reductoisomerase (EC 1.1.1.86) and/or dihydroxy acid dehydratase (EC 4.2.1.9). Said citramalate synthase may be, for example, CimA from Clostridium autoethanogenum (AGY76958.1) (SEQ ID NO: 24) or CimA from Methanocaldococcus jannaschii (NP_248395.1) (SEQ ID NO: 25). Said 3-isopropylmalate dehydratase may be, for example, LeuCD from Clostridium autoethanogenum (WP_023162955.1, LeuC; AGY77204.1, LeuD) (SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively) or LeuCD from Escherichia coli (NP_414614.1, LeuC ; NP_414613.1, LeuD) (sequences SEQ ID NO: 28 and 29, respectively). Said 3-isopropylmalate dehydrogenase may be, for example, LeuB from Clostridium autoethanogenum (WP_023162957.1) (SEQ ID NO: 30) or LeuB from Escherichia coli (NP_414615.4) (SEQ ID NO: 31). Said acetolactate synthase may be, for example, IlvBN from Clostridium autoethanogenum (AGY74359.1, IlvB; AGY74635.1, IlvB; AGY74360.1, IlvN) (SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively) or IlvBN from Escherichia coli (NP_418127.1, IlvB; NP_418126.1, IlvN) (SEQ ID NOs: 35 and 36, respectively). Said ketol acid reductoisomerase may be, for example, IlvC from Clostridium autoethanogenum (WP_013238693.1) (SEQ ID NO: 37) or IlvC from Escherichia coli (NP_418222.1) (SEQ ID NO: 38). Said dihydroxy acid dehydratase may be, for example, IlvD from Clostridium autoethanogenum (WP_013238694.1) (SEQ ID NO: 39) or IlvD from Escherichia coli (YP_026248.1) (SEQ ID NO: 40). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage.
Этап 10 отражает преобразование 3-метил-2-оксопентоаа в 2-метилбутаноил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кетоизовалератоксидоредуктазой (EC 1.2.7.7). Указанная кетоизовалератоксидоредуктаза может представлять собой, например, VorABCD из Methanothermobacter thermautotrophicus (WP_010876344.1, VorA; WP_010876343.1, VorB; WP_010876342.1, VorC; WP_010876341.1, VorD) (последовательности SEQ ID NO: 41-44, соответственно) или VorABCD из Pyrococcus furiosus (WP_011012106.1, VorA; WP_011012105.1, VorB; WP_011012108.1, VorC; WP_011012107.1, VorD) (последовательности SEQ ID NO: 45-48, соответственно). VorABCD представляет собой 4-субъединичный фермент. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 10 reflects the conversion of 3-methyl-2-oxopentoaa to 2-methylbutanoyl-CoA. This step can be catalyzed by ketoisovalerate oxidoreductase (EC 1.2.7.7). Said ketoisovalerate oxidoreductase may be, for example, VorABCD from Methanothermobacter thermautotrophicus (WP_010876344.1, VorA; WP_010876343.1, VorB; WP_010876342.1, VorC; WP_010876341.1, VorD) (sequences SEQ ID NO: 41-44, respectively) or VorABCD from Pyrococcus furiosus (WP_011012106.1, VorA; WP_011012105.1, VorB; WP_011012108.1, VorC; WP_011012107.1, VorD) (sequences SEQ ID NO: 45-48, respectively). VorABCD is a 4-subunit enzyme. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 11 отражает преобразование 2-метилбутаноил-КоА в 2-метилкротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 2-метилбутаноил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.3.99.12). Указанная 2метилбутаноил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой, например, AcdH из Streptomyces avermitilis (AAD44196.1 или ВАВ69160.1) (SEQ ID NO: 49) или AcdH из Streptomyces coelicolor (AAD44195.1) (SEQ ID NO: 50). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 11 reflects the conversion of 2-methylbutanoyl-CoA to 2-methylcrotonyl-CoA. This step can be catalyzed by 2-methylbutanoyl-CoA dehydrogenase (EC 1.3.99.12). Said 2methylbutanoyl-CoA dehydrogenase may be, for example, AcdH from Streptomyces avermitilis (AAD44196.1 or BAB69160.1) (SEQ ID NO: 49) or AcdH from Streptomyces coelicolor (AAD44195.1) (SEQ ID NO: 50). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 12 отражает преобразование 2-метилкротонил-КоА в 3-гидроксиизовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кротоназой/3-гидроксибутирил-КоА-дегидратазой (EC 4.2.1.55). Указанная кротоназа/3-гидроксибутирил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, Crt из Clostridium beijerinckii (ABR34202.1) (SEQ ID NO: 51), Crt из Clostridium acetobutylicum (Np_349318.1) (SEQ ID NO: 52) или LiuC из Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). Указанный этап может также быть катализирован кротонил-КоА-карбоксилазой-редуктазой (EC 1.3.1.86). Указанная кротонил-КоА-карбоксилазаStep 12 reflects the conversion of 2-methylcrotonyl-CoA to 3-hydroxyisovaleryl-CoA. This step can be catalyzed by crotonase/3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase (EC 4.2.1.55). Said crotonase/3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase may be, for example, Crt from Clostridium beijerinckii (ABR34202.1) (SEQ ID NO: 51), Crt from Clostridium acetobutylicum (Np_349318.1) (SEQ ID NO: 52) or LiuC from Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). This step can also be catalyzed by crotonyl-CoA carboxylase reductase (EC 1.3.1.86). Indicated crotonyl-CoA carboxylase
- 6 043734 редуктаза может представлять собой, например, Ccr из Treponema denticola (NP_971211.1) (SEQ ID NO: 53). Указанный этап может также быть катализирован кротонил-КоА-редуктазой (EC 1.3.1.44). Указанная кротонил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Ter из Euglena gracilis (AAW66853.1) (SEQ ID NO: 54). Указанный этап может также быть катализирован 3-гидроксипропионил-КоАдегидратазой (EC 4.2.1.116). Указанная 3-гидроксипропионил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, Msed_2001 из Metallosphaera sedula (WP_012021928.1). Указанный этап может также быть катализирован эноил-КоА-гидратазой. Указанная эноил-КоА-гидратаза (4.2.1.17) может представлять собой, например, YngF из Bacillus anthracis (WP_000787371.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.- 6 043734 the reductase may be, for example, Ccr from Treponema denticola (NP_971211.1) (SEQ ID NO: 53). This step can also be catalyzed by crotonyl-CoA reductase (EC 1.3.1.44). Said crotonyl-CoA reductase may be, for example, Ter from Euglena gracilis (AAW66853.1) (SEQ ID NO: 54). This step can also be catalyzed by 3-hydroxypropionyl-CoAdehydratase (EC 4.2.1.116). Said 3-hydroxypropionyl-CoA dehydratase may be, for example, Msed_2001 from Metallosphaera sedula (WP_012021928.1). This step can also be catalyzed by enoyl-CoA hydratase. Said enoyl-CoA hydratase (4.2.1.17) may be, for example, YngF from Bacillus anthracis (WP_000787371.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 13 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.1.1.157). Указанная 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа может представлять собой, например, Hbd из Clostridium beijerinckii (WP_011967675.1) (SeQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NP_349314.1) (SEQ ID NO: 56) или Hbd1 из Clostridium kluyveri (WP_011989027.1) (SEQ ID NO: 57). Указанный этап может также быть катализирован ацетоацетил-КоА-редуктазой (EC 4.2.1.36). Указанная ацетоацетил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, PhaB из Cupriavidus necator (WP_010810131.1) (SEQ ID NO: 58). Указанный этап может также быть катализирован ацетоацетил-КоА-гидратазой (EC 4.2.1.119). Следует отметить, что PhaB является R-специфической, a Hbd является S-специфической. Кроме того, Hbd1 из Clostridium, kluyveri является НАДФН-зависимой, а Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 13 reflects the conversion of acetoacetyl-CoA to 3-hydroxybutyryl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (EC 1.1.1.157). Said 3hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase may be, for example, Hbd from Clostridium beijerinckii (WP_011967675.1) (SeQ ID NO: 55), Hbd from Clostridium acetobutylicum (NP_349314.1) (SEQ ID NO: 56) or Hbd1 from Clostridium kluyveri (WP_011989027.1) (SEQ ID NO: 57). This step can also be catalyzed by acetoacetyl-CoA reductase (EC 4.2.1.36). Said acetoacetyl-CoA reductase may be, for example, PhaB from Cupriavidus necator (WP_010810131.1) (SEQ ID NO: 58). This step can also be catalyzed by acetoacetyl-CoA hydratase (EC 4.2.1.119). It should be noted that PhaB is R-specific and Hbd is S-specific. In addition, Hbd1 from Clostridium, kluyveri is NADPH-dependent, and Hbd from Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii are NADH-dependent. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 14 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. Указанный этап может быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4-гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9) и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетическая тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацил-КоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 12) и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 14 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to 3-hydroxybutyrate. This step can be catalyzed by thioesterase (EC 3.1.2.20). Said thioesterase may be, for example, TesB from Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). This step may also be catalyzed by a hypothetical thioesterase, for example from Clostridium autoethanogenum or Clostridium ljungdahlii. Specifically, three hypothetical thioesterases have been identified in Clostridium autoethanogenum: (1) thioesterase 1 (AGY74947.1; annotated as palmitoyl-CoA hydrolase; SEQ ID NO: 8), (2) thioesterase 2 (AGY75747.1; annotated as 4 -hydroxybenzoyl-CoA thioesterase; SEQ ID NO: 9) and (3) thioesterase 3 (AGY75999.1; annotated as a hypothetical thioesterase; SEQ ID NO: 10). Three hypothetical thioesterases have also been identified in Clostridium ljungdahlii: (1) thioesterase 1 (ADK15695.1; annotated as predicted acyl-CoA thioesterase 1; SEQ ID NO: 11), (2) thioesterase 2 (ADK16655.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 12) and (3) thioesterase 3 (ADK16959.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 13). This step can also be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.
Этап 15 отражает преобразование 3-гидроксибутирата в ацетоацетат. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутиратдегидрогеназой (EC 1.1.1.30). Указанная 3-гидроксибутиратдегидрогеназа может представлять собой, например, Bdh1 из Ralstonia pickettii (ВАЕ72684.1) (SEQ ID NO: 60) или Bdh2 из Ralstonia pickettii (BAE72685.1) (SEQ ID NO: 61). Указанная обратная реакция, преобразование ацетоацетата в 3-гидроксибутират, может быть катализирована другими 3гидроксибутиратдегидрогеназными (EC 1.1.1.30) ферментами. Например, преобразование ацетоацетата в 3-гидроксибутират может быть катализировано Bdh из Clostridium autoethanogenum (AGY75962) (SEQ ID NO: 62). Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei предположительно содержат ферменты с аналогичной активностью. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 15 reflects the conversion of 3-hydroxybutyrate to acetoacetate. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.30). Said 3-hydroxybutyrate dehydrogenase may be, for example, Bdh1 from Ralstonia pickettii (BAE72684.1) (SEQ ID NO: 60) or Bdh2 from Ralstonia pickettii (BAE72685.1) (SEQ ID NO: 61). This reverse reaction, the conversion of acetoacetate to 3-hydroxybutyrate, can be catalyzed by other 3hydroxybutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.30) enzymes. For example, the conversion of acetoacetate to 3-hydroxybutyrate can be catalyzed by Bdh from Clostridium autoethanogenum (AGY75962) (SEQ ID NO: 62). Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei are thought to contain enzymes with similar activities. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 16 отражает преобразование 3-гидроксибутирата в 3-гидроксибутирилальдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза (AOR) может представлять собой, например, AOR из Clostridium autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (последовательности SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно) или AOR из Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (последовательности SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно). Согласно дополнительным вариантам реализации указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза, например, может представлять собой любой источник или может проStep 16 reflects the conversion of 3-hydroxybutyrate to 3-hydroxybutyryl aldehyde. This step can be catalyzed by aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.5). Said aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) may be, for example, an AOR from Clostridium autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (SEQ ID NOs: 63 and 64, respectively) or an AOR from Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083. 1) (sequences SEQ ID NO: 65 and 66, respectively). In further embodiments, said aldehyde:ferredoxin oxidoreductase, for example, may be any source or may be
- 7 043734 исходить из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:- 7 043734 come from any of the following sources, the sequences of which are publicly available:
- 8 043734- 8 043734
- 9 043734- 9 043734
- 10 043734 альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза альдегид: ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза альдегид:ферредоксино ксидоредуктаза- 10 043734 aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxin oxidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde :ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase ald egid:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxin oxidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde: ferredoxin oxidoreductase aldehyde: ferredoxino xidoreductase aldehyde :ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxin oxidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreduct pelvis aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase aldehyde:ferredoxino xidoreductase
Methanosaeta thermophila PT Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina barkeri, шт. Fusaro Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOlMethanosaeta thermophila PT Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina barkeri, pcs. Fusaro Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei Gol Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl Methanosarcina mazei TucOl
Methanosphaerula palustris El-9c Methano spirillum hungatei JF-1 Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema sp. J7-2Methanosphaerula palustris El-9c Methano spirillum hungatei JF-1 Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Moorella thermoacetica ATCC 39073 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrialba mag adii ATCC 43099 Natrialba magadii ATCC 43099 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema pellirubrum DSM 15624 Natrinema sp. J7-2
Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronobacterium gregoryi SP2 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4 Natronococcus occultus SP4
Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Pyrobaculum aerophilum, шт. IM2 Pyrobaculum aerophilum, шт. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, шт. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, шт. IM2 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas moolapensis 8,8.11 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Natronomonas pharaonis DSM 2160 Pyrobaculum aerophilum , pcs. IM2 Pyrobaculum aerophilum, pcs. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, pcs. 1M2 Pyrobaculum aerophilum, pcs. IM2 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514 Pyrobaculum arsenaticum DSM 13514
NC_008553.1NC_008553.1
NC_015676.1NC_015676.1
NC__003552.1NC__003552.1
NC_003552.1NC_003552.1
NC_003552.1NC_003552.1
NCJ)07355.1NCJ)07355.1
NC_003901.1NC_003901.1
NC-003901.1NC-003901.1
NC003901.1NC003901.1
NC_020389.1NC_020389.1
NC-020389.1NC-020389.1
NC__020389.1NC__020389.1
NC_011832.1NC_011832.1
NC__007796.1NC__007796.1
NC_016112.1NC_016112.1
NC_007644.1NC_007644.1
NC_007644.1NC_007644.1
NC_007644.1NC_007644.1
NC-013922.1NC-013922.1
NC-013922.1NC-013922.1
NC__013 923.1NC__013 923.1
NC__013922.1NC__013922.1
NC_019962.1NC_019962.1
NC_019962.1NC_019962.1
NC__019962.1NC__019962.1
NC-018224.1NC-018224.1
NC_019792.1NC_019792.1
NC_019792.1NC_019792.1
NC_019792.1NC_019792.1
NC_019792.1NC_019792.1
NC_019792.1NC_019792.1
NC_019792.1NC_019792.1
NCJH9974.1NCJH9974.1
NC019974.1NC019974.1
NCJH9974.1NCJH9974.1
NC__019974.1NC__019974.1
NC-020388.1NC-020388.1
NC-020388.1NC-020388.1
NC_020388.1NC_020388.1
NC__007427.1NC__007427.1
NC-007426.1NC-007426.1
NC__007426.1NC__007426.1
NC__007426.1NC__007426.1
NC__003364.1NC__003364.1
NC-003364.1NC-003364.1
NC_003364.1NC_003364.1
NC-003364.1NC-003364.1
NC-009376.1NC-009376.1
NC-009376.1NC-009376.1
NC_009376.1NC_009376.1
4462364 10822365 1475882 1474856 1473602 3625763 1479263 1481668 1480987 14656065 14656771 14654304 7271108 3924565 11361147 3831332 3830998 3831866 8824961 8823392 8826737 8825516 14335278 14333050 14333754 13349954 14210296 14207133 14209682 14207576 14206941 14206532 14403316 14405255 14403781 14402014 14651997 14652892 14651999 3694680 3702508 3702507 3702509 1464236 1464102 1465126 1465445 5055904 5055700 50548814462364 10822365 1475882 1474856 1473602 3625763 1479263 1481668 1480987 14656065 14656771 14654304 7271108 3924565 11361 147 3831332 3830998 3831866 8824961 8823392 8826737 8825516 14335278 14333050 14333754 13349954 14210296 14207133 14209682 14207576 14206941 14206532 14403316 14405255 14403781 14402014 14651997 14652892 14651999 3694680 3702508 3702507 3702509 1 464236 1464102 1465126 1465445 5055904 5055700 5054881
- 11 043734- 11 043734
- 12 043734- 12 043734
- 13 043734- 13 043734
AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СО-дегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Сшт Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые негативные продукты.AOR catalyzes the reaction of an acid and reduced ferredoxin to form an aldehyde and oxidized ferredoxin. In acetogens, this reaction can be coupled to the oxidation of CO (by CO dehydrogenase, EC 1.2.7.4) or hydrogen (by ferredoxin-dependent hydrogenase, EC 1.12.7.2 or 1.12.1.4), which in both cases produces reduced ferredoxin ( Kopke, USA Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous AOR or introduction of exogenous AOR into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Alternatively, exogenous AOR can be introduced into a microorganism that does not naturally contain AOR, such as E. coli. In particular, coexpression of Ptb-Buk and AOR (and optionally Adh) may allow such a microorganism to produce new negative products.
Этап 17 отражает преобразование 3-гидроксибутирилальдегида в 1,3-бутандиол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 17 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl aldehyde to 1,3-butanediol. This step can be catalyzed by alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1. or 1.1.1.2.). Alcohol dehydrogenase can convert aldehyde and NAD(P)H into alcohol and NAD(P). Said alcohol dehydrogenase may be, for example,
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) илиAdh from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) or
Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh изClostridium ragsdalei, BdhB from Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh from
Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum. (NP 149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl from Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 from Clostridium Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 from Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl from Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 from Clostridium acetobutylicum. (NP 149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE from Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhE from Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) or AdhE2 from Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous alcohol dehydrogenase or introduction of exogenous alcohol dehydrogenase into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Escherichia coli presumably does not have native activity corresponding to this stage.
- 14 043734- 14 043734
Этап 18 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутирилальдегид. Указанный этап может быть катализирован бутиральдегиддегидрогеназой (EC 1.2.1.57). Указанная бутиральдегиддегидрогеназа может представлять собой, например, Bld из Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 18 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to 3-hydroxybutyrylaldehyde. This step can be catalyzed by butyraldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.57). Said butyraldehyde dehydrogenase may be, for example, Bld from Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium, ragsdalei have no known native activity corresponding to this stage. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 19 отражает преобразование 3-гадроксибутирил-КоА в 2-гидроксиизобутирил-КоА.Step 19 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to 2-hydroxyisobutyryl-CoA.
Указанный этап может быть катализирован 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутазой (EC 5,4.99.-). Указанная 2-гидроксиизобутирил-КоА-мутаза может представлять собой, например, HcmAB из Aquincola tertiaricarbonis (AFK77668.1, большая субъединица; AFK77665.1, малая субъединица) (последовательности SEQ ID NO: 81 и 82, соответственно) или HcmAB из Kyrpidia tusciae (WP_013074530.1, большая субъединица; WP_013074531.1, малая субъединица) (последовательности SEQ ID NO: 83 и 84, соответственно). Было описано улучшение активности HcmAB шапероном MeaB (AFK77667.1, Aquincola tertiaricarbonis; WP_013074529.1, Kyrpidia tusciae) (последовательности SEQ ID NO: 85 и 86, соответственно) путем реактивации HcmAB, хотя MeaB не является необходимым для функции HcmAB, (Yaneva, J Biol Chem, 287: 15502-15511, 2012). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.This step can be catalyzed by 2-hydroxyisobutyryl-CoA mutase (EC 5.4.99.-). Said 2-hydroxyisobutyryl-CoA mutase may be, for example, HcmAB from Aquincola tertiaricarbonis (AFK77668.1, large subunit; AFK77665.1, small subunit) (SEQ ID NOs: 81 and 82, respectively) or HcmAB from Kyrpidia tusciae (WP_013074530.1, large subunit; WP_013074531.1, small subunit) (SEQ ID NOs: 83 and 84, respectively). Improvement of HcmAB activity by the chaperone MeaB (AFK77667.1, Aquincola tertiaricarbonis; WP_013074529.1, Kyrpidia tusciae) (SEQ ID NOs: 85 and 86, respectively) by reactivating HcmAB has been described, although MeaB is not required for HcmAB function, (Yaneva, J Biol Chem, 287: 15502–15511, 2012). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 20 отражает преобразование 2-гидроксиизобутирил-КоА в 2-гидроксиизобутират. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+ бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 20 reflects the conversion of 2-hydroxyisobutyryl-CoA to 2-hydroxyisobutyrate. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 21 отражает преобразование ацетил-КоА в сукцинил-КоА. Указанный этап охватывает ряд ферментативных реакций, вовлеченных в восстановительный ЦТК-путь, который естественным образом присутствует во многих бактериях, в том числе Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (и Escherichia coli) (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014; патент США № 9297026). Ферменты, вовлеченные в преобразование ацетил-КоА в сукцинил-КоА, могут включать пируват:ферредоксиноксидоредуктазу (PFOR) (EC 1.2.7.1), пируваткарбоксилазу (PYC) (EC 6.4.1.1), маликфермент/малатдегидрогеназу (EC 1.1.1.38, ЕС 1.1.1.40), пируватфосфатдикиназу (PPDK) (ЕС:2.7.9.1), РЕР-карбоксикиназу (PCK) (EC 4.1.1.49), фумаратгидратазу/фумаразу (EC 4.2.1.2), фумаратредуктазу (EC 1.3.5.1)/сукцинатдегидрогеназу (EC 1.3.5.4) и сукцинил-КоА-синтетазу (EC 6.2.1.5). Указанная пируват:ферредоксиноксидоредуктаза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY75153, AGY77232) или Escherichia coli (NP_415896). Пируваткарбоксилаза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY75817). Указанная малик-фермент/малатдегидрогеназа может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76687) или Escherichia coli (NP_416714, NP_417703). Указанная пируватфосфатдикиназа (PPDK) может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76274, AGY77114). Указанная РЕР-карбоксикиназа (PCK) может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76928) или Escherichia coli (NP_417862). Указанная фумаратгидратаза/фумараза может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY76121, AGY76122) или Escherichia coli (NP_416128, NP_416129, NP_418546). Указанная фумаратредуктаза/сукцинатдегидрогеназа может происходить, например, из Clostridium autoethanogenum (AGY74573, AGY74575, AGY75257, AGY77166) или Escherichia coli (NP_415249, NP_415250, NP_415251, NP_415252, NP_418575, NP_418576, NP_418577, NP_418578). Указанная сукцинил-КоАсинтетаза может происходить, например, из Escherichia coli (NP_415256, NP_415257).Step 21 reflects the conversion of acetyl-CoA to succinyl-CoA. This step involves a number of enzymatic reactions involved in the reductive TCA pathway, which is naturally present in many bacteria, including Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (and Escherichia coli) (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014; US Patent No. 9297026). Enzymes involved in the conversion of acetyl-CoA to succinyl-CoA may include pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (PFOR) (EC 1.2.7.1), pyruvate carboxylase (PYC) (EC 6.4.1.1), malic enzyme/malate dehydrogenase (EC 1.1.1.38, EC 1.1 .1.40), pyruvate phosphate dikinase (PPDK) (EC:2.7.9.1), PEP carboxykinase (PCK) (EC 4.1.1.49), fumarate hydratase/fumarase (EC 4.2.1.2), fumarate reductase (EC 1.3.5.1)/succinate dehydrogenase (EC 1.3.5.4) and succinyl-CoA synthetase (EC 6.2.1.5). Said pyruvate:ferredoxin oxidoreductase may come from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY75153, AGY77232) or Escherichia coli (NP_415896). Pyruvate carboxylase may be derived from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY75817). Said malic enzyme/malate dehydrogenase may come from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY76687) or Escherichia coli (NP_416714, NP_417703). Said pyruvate phosphate dikinase (PPDK) may be derived from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY76274, AGY77114). Said PEP carboxykinase (PCK) may be derived from, for example, Clostridium autoethanogenum (AGY76928) or Escherichia coli (NP_417862). Said fumarate hydratase/fumarase may be derived, for example, from Clostridium autoethanogenum (AGY76121, AGY76122) or Escherichia coli (NP_416128, NP_416129, NP_418546). Said fumarate reductase/succinate dehydrogenase may be derived, for example, from Clostridium autoethanogenum (AGY74573, AGY74575, AGY75257, AGY77166) or Escherichia coli (NP_415249, NP_415250, NP_415251, NP_415252, NP_41 8575, NP_418576, NP_418577, NP_418578). Said succinyl-CoA synthetase may come from, for example, Escherichia coli (NP_415256, NP_415257).
Этап 22 отражает преобразование ацетил-КоА и сукцинил-КоА в 3-оксоадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован Р-кетоадипил-КоА-тиолазой (EC 2.3.1.16). Указанная кетоизовалератоксидоредуктаза может представлять собой, например, PaaJ из Escherichia coli (WP_001206190.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 22 reflects the conversion of acetyl-CoA and succinyl-CoA to 3-oxoadipyl-CoA. This step can be catalyzed by P-ketoadipyl-CoA thiolase (EC 2.3.1.16). Said ketoisovalerate oxidoreductase may be, for example, PaaJ from Escherichia coli (WP_001206190.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 23 отражает преобразование 3-оксо-адипил-КоА в 3-гидроксиадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой (EC 1.1.1.157) или ацетоацетил-КоАгидратазой (EC 4.2.1.119). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегадрогеназа или ацетоацетил-КоАгидратаза может представлять собой, например,Step 23 reflects the conversion of 3-oxo-adipyl-CoA to 3-hydroxyadipyl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (EC 1.1.1.157) or acetoacetyl-CoAhydratase (EC 4.2.1.119). Said 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase or acetoacetyl-CoAhydratase may be, for example,
Hbd из Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NPJ49314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl из Clostridium kluyveri (WP 011989027.1) (SEQ ID NO: 57) или PaaHl из Cupriavidus necator (WP 010814882.1).Hbd from Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd from Clostridium acetobutylicum (NPJ49314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl from Clostridium kluyveri (WP 011989027.1) (SEQ ID NO: 57) or PaaHl from Cupriavidus necator (WP 010814882.1).
Следует отметить, что PhaB является R-специфической и Hbd является S-специфической. Кроме то- 15 043734 го, Hbd1 из Clostridium kluyveri является НАДФЫ-зависимой, a Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii иIt should be noted that PhaB is R-specific and Hbd is S-specific. In addition, Hbd1 from Clostridium kluyveri is NADPH-dependent, and Hbd from Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii are NADH-dependent. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and
Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium ragsdalei has no known native activity corresponding to this stage.
Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 24 отражает преобразование 3-гидроксиадипил-КоА в 2,3-дегидроадипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован эноил-КоА-гидратазой (ЕС: 4,2.1.17) или эноил-КоА-редуктазой (ЕС: 1,3.1.38). Указанная эноил-КоА-гидратаза или эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, CrtH3C. acetobutylicum (032472) (Seq. ID No. 52). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 24 reflects the conversion of 3-hydroxyadipyl-CoA to 2,3-dehydroadipyl-CoA. This step can be catalyzed by enoyl-CoA hydratase (EC: 4.2.1.17) or enoyl-CoA reductase (EC: 1.3.1.38). Said enoyl-CoA hydratase or enoyl-CoA reductase may be, for example, CrtH3C. acetobutylicum (032472) (Seq. ID No. 52). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 25 отражает преобразование 2,3-дегидроадипил-КоА в адипил-КоА. Указанный этап может быть катализирован транс-2-эноил-КоА-редуктазой (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Указанная транс-2-эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Bcd из С. acetobutylicum (NP_349317.1), которая образует комплекс с флавопротеинами электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr из Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr из Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter из Treponema denticola (NP_971211.1) или Ter из Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 25 reflects the conversion of 2,3-dehydroadipyl-CoA to adipyl-CoA. This step can be catalyzed by trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Said trans-2-enoyl-CoA reductase may be, for example, Bcd from C. acetobutylicum (NP_349317.1), which forms a complex with electron transport flavoproteins EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr from Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr from Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter from Treponema denticola (NP_971211.1) or Ter from Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii and Clostridium, ragsdalei have no known native activity corresponding to this stage. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 26 отражает преобразование адипил-КоА в адипиновую кислоту. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 26 reflects the conversion of adipyl-CoA to adipic acid. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.
Этап 27 отражает преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в кротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован кротонил-КоА-гидратазой (кротоназой) (EC 4.2.1.17) или кротонил-КоА-редуктазой (EC 1.3.1.38). Указанная кротонил-КоА-гидратаза (кротоназа) или кротонил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, клин' acetobutylicum (NP_349318.1) (SEQIDNO:52) или PhaJ из Aeromonas caviae (032472). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 27 reflects the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to crotonyl-CoA. This step can be catalyzed by crotonyl-CoA hydratase (crotonase) (EC 4.2.1.17) or crotonyl-CoA reductase (EC 1.3.1.38). Said crotonyl-CoA hydratase (crotonase) or crotonyl-CoA reductase may be, for example, clin'acetobutylicum (NP_349318.1) (SEQIDNO:52) or PhaJ from Aeromonas caviae (032472). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 28 отражает преобразование кротонил-КоА в кротонат. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 28 reflects the conversion of crotonyl-CoA to crotonate. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.
Этап 29 отражает преобразование кротоната в кротональдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СОдегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Curr Opin Bioteclmol 22: 320-325, 2011; Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Была продемонстрирована активность AOR Pyrococcus furiosus в отношении преобразования кротональдегида и кротоната (Loes, J Bacteriol, 187: 7056-7061, 2005). Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорга- 16 043734 низму продуцировать новые ненативные продукты.Step 29 reflects the conversion of crotonate to crotonaldehyde. This step can be catalyzed by aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.5). Examples of sources of aldehyde:ferredoxin oxidoreductases are described in various sections of this application. AOR catalyzes the reaction of an acid and reduced ferredoxin to form an aldehyde and oxidized ferredoxin. In acetogens, this reaction can be coupled to the oxidation of CO (by CO dehydrogenase, EC 1.2.7.4) or hydrogen (by ferredoxin-dependent hydrogenase, EC 1.12.7.2 or 1.12.1.4), which in both cases produces reduced ferredoxin (Kopke, Curr Opin Bioteclmol 22: 320-325, 2011; Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous AOR or introduction of exogenous AOR into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. The AOR of Pyrococcus furiosus has been demonstrated to be active in converting crotonaldehyde and crotonate (Loes, J Bacteriol, 187: 7056-7061, 2005). Alternatively, exogenous AOR can be introduced into a microorganism that does not naturally contain AOR, such as E. coli. In particular, coexpression of Ptb-Buk and AOR (and optionally Adh) may allow such a microorganism to produce new non-native products.
Этап 30 отражает преобразование кротональдегида в 2-бутен-1-ол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 30 reflects the conversion of crotonaldehyde to 2-buten-1-ol. This step can be catalyzed by alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1. or 1.1.1.2.). Alcohol dehydrogenase can convert aldehyde and NAD(P)H into alcohol and NAD(P). Said alcohol dehydrogenase may be, for example,
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ IDAdh from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID
NO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или Clostridium ragsdalei, BdhB изNO: 67), Clostridium Ijungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) or Clostridium ragsdalei, BdhB from
Clostridium acetobutylicum (NP 349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO:Clostridium acetobutylicum (NP 349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh from Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl from Clostridium Ijungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO:
71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium71), Bdhl from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 from Clostridium
Ijungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 изIjungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 from Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl from Clostridium acetobutylicum (NP_149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 from
Clostridium acetobutylicum (NP_149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQClostridium acetobutylicum (NP_149199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE from Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl from Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ
ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).ID NO: 78) or AdhE2 from Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназа или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous alcohol dehydrogenase or introduction of exogenous alcohol dehydrogenase into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Escherichia coli presumably does not have native activity corresponding to this stage.
Этап 31 отражает преобразование кротонил-КоА в бутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован бутирил-КоА-дегидрогеназой или транс-2-эноил-КоА-редуктазой (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Указанная бутирил-КоА-дегидрогеназа или транс-2-эноил-КоА-редуктаза может представлять собой, например, Bcd из С. acetobutyiicum (NP_349317.1), которая образует комплекс с флавопротеинами электронного транспорта EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr из Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr из Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter из Treponema denticola (NP_971211.1) или Ter из Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 31 reflects the conversion of crotonyl-CoA to butyryl-CoA. This step can be catalyzed by butyryl-CoA dehydrogenase or trans-2-enoyl-CoA reductase (EC 1.3.8.1, EC 1.3.1.86, EC 1.3.1.85, EC 1.3.1.44). Said butyryl-CoA dehydrogenase or trans-2-enoyl-CoA reductase can be, for example, Bcd from C. acetobutyiicum (NP_349317.1), which forms a complex with electron transport flavoproteins EtfAB (NP_349315, NP_349316), Ccr from Streptomyces collinus (AAA92890), Ccr from Rhodobacter sphaeroides (YP_354044.1), Ter from Treponema denticola (NP_971211.1) or Ter from Euglena gracilis (AY741582.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 32 отражает преобразование бутирил-КоА в ацетобутирил-КоА. Указанный этап может быть катализирован тиолазой или ацил-КоА-ацетилтрансферазой (EC 2.3.1.9). Указанная тиолаза может представлять собой, например,Step 32 reflects the conversion of butyryl-CoA to acetobutyryl-CoA. This step can be catalyzed by a thiolase or an acyl-CoA acetyltransferase (EC 2.3.1.9). Said thiolase may be, for example,
ТЫА из Clostridium acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), ThlAl из Clostridium kluyveri (EDK35681), ТЫА2 из Clostridium kluyveri (EDK35682), ТЫАЗ из Clostridium, kluyveri (EDK35683), PhaA из Cupriavidus necator (WP 013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB из Cupriavidus necator (WPJH1615089.1) (SEQ ID NO: 3) или AtoB из Escherichia coli (NP 416728.1) (SEQ ID NO: 4).ThlAl from Clostridium acetobutylicum (WP_010966157.1) (SEQ ID NO: 1), ThlAl from Clostridium kluyveri (EDK35681), ThlAl from Clostridium kluyveri (EDK35682), ThlAl from Clostridium, kluyveri (EDK35683), PhaA from Cupriavidus necator (WP 013956452.1) (SEQ ID NO: 2), BktB from Cupriavidus necator (WPJH1615089.1) (SEQ ID NO: 3) or AtoB from Escherichia coli (NP 416728.1) (SEQ ID NO: 4).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has native activity corresponding to this stage.
Этап 33 отражает преобразование ацетобутирил-КоА в ацетобутират. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 33 reflects the conversion of acetobutyryl-CoA to acetobutyrate. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.
Этап 34 отражает преобразование ацетобутирата в ацетилацетон. Указанный этап может быть катализирован ацетоацетатдекарбоксилазой (EC 4.1.1.4). Указанная ацетоацетатдекарбоксилаза может представлять собой, например, Adc из Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). Указанный этап может также быть катализирован альфа-кетоизовалератдекарбоксилазой (EC 4.1.1.74). Указанная альфа-кетоизовалератдекарбоксилаза может представлять собой, например, KivD из Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Кроме того, Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. В редких случаях преобразование ацетоацетата в ацетон может происходить спонтанно. Однако спонтанное преобразованиеStep 34 reflects the conversion of acetobutyrate to acetylacetone. This step can be catalyzed by acetoacetate decarboxylase (EC 4.1.1.4). Said acetoacetate decarboxylase may be, for example, Adc from Clostridium beijerinckii (WP_012059998.1) (SEQ ID NO: 14). This step can also be catalyzed by alpha-ketoisovalerate decarboxylase (EC 4.1.1.74). Said alpha-ketoisovalerate decarboxylase may be, for example, KivD from Lactococcus lactis (SEQ ID NO: 15). Clostridium autoethanogenum, Clostridium, ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. In addition, Escherichia coli has no known native activity corresponding to this step. In rare cases, conversion of acetoacetate to acetone may occur spontaneously. However, spontaneous transformation
- 17 043734 очень неэффективно; маловероятно, что оно может приводить к продуцированию выходных продуктов на желаемых уровнях.- 17 043734 very ineffective; it is unlikely to produce output products at the desired levels.
Этап 35 отражает преобразование ацетилацетона в 3-метил-2-бутанол. Указанный этап может быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.2). Указанная первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 35 reflects the conversion of acetylacetone to 3-methyl-2-butanol. This step can be catalyzed by primary:secondary alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.2). Said primary:secondary alcohol dehydrogenase may be, for example,
SecAdh изSecAdh from
Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh из Clostridium Ijungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh из Clostridium ragsdalei (WP013239134.1) (SEQ ID NO: 18) или SecAdh из Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).Clostridium autoethanogenum (AGY74782.1) (SEQ ID NO: 16), SecAdh from Clostridium Ijungdahlii (ADK15544.1) (SEQ ID NO: 17), SecAdh from Clostridium ragsdalei (WP013239134.1) (SEQ ID NO: 18) or SecAdh from Clostridium beijerinckii (WP 026889046.1) (SEQ ID NO: 19).
Указанный этап может также быть катализирован первичной:вторичной алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.80), такой как SecAdh из Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). Однако Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Нокдаун или нокаут указанного фермента у Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei приводит к продуцированию и накоплению ацетилацетона, а не 3-метил-2-бутанола (WO 2015/085015).This step can also be catalyzed by a primary:secondary alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.80), such as SecAdh from Thermoanaerobacter brokii (3FSR_A) (SEQ ID NO: 20). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage (Kopke, Appl Environ Microbiol, 80: 3394-3403, 2014). However, Escherichia coli has no known native activity corresponding to this step. Knockdown or knockout of this enzyme in Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei leads to the production and accumulation of acetylacetone rather than 3-methyl-2-butanol (WO 2015/085015).
Этап 36 отражает преобразование ацетобутирил-КоА в 3-гидроксигексаноил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидротеназой (EC 1.1.1.157) или ацетоацетил-КоАгидратазой (EC 4.2.1.119). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа или ацетоацетил-КоАгидратаза может представлять собой, например,Step 36 reflects the conversion of acetobutyryl-CoA to 3-hydroxyhexanoyl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrotenase (EC 1.1.1.157) or acetoacetyl-CoAhydratase (EC 4.2.1.119). Said 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase or acetoacetyl-CoAhydratase may be, for example,
Hbd из Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd из Clostridium acetobutylicum (NP 349314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl из Clostridium kluyveri (WP011989027.1) (SEQ ID NO: 57), Hbd2 из Clostridium kluyveri (EDK34807) или PaaHl из Cupriavidus necator (WP 010814882.1).Hbd from Clostridium beijerinckii (WP 011967675.1) (SEQ ID NO: 55), Hbd from Clostridium acetobutylicum (NP 349314.1) (SEQ ID NO: 56), Hbdl from Clostridium kluyveri (WP011989027.1) (SEQ ID NO: 57), Hbd2 from Clostridium kluyveri (EDK34807) or PaaHl from Cupriavidus necator (WP 010814882.1).
Следует отметить, что PhaB является R-специфической и Hbd является S-специфической. Кроме того, Hbd1 из Clostridium kluyveri является НАДФН-зависимой, a Hbd из Clostridium acetobutylicum и Clostridium beijerinckii являются НАДН-зависимыми. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.It should be noted that PhaB is R-specific and Hbd is S-specific. In addition, Hbd1 from Clostridium kluyveri is NADPH-dependent, and Hbd from Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii are NADH-dependent. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 37 отражает преобразование 3-гидроксигексаноил-КоА в 3-гидроксигексаноат. Указанный этап может быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+ бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.Step 37 reflects the conversion of 3-hydroxyhexanoyl-CoA to 3-hydroxyhexanoate. This step can be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.
Этап 38 отражает преобразование 3-гидроксигексаноата в 1,3-гексальдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. AOR катализирует реакцию кислоты и восстановленного ферредоксина с образованием альдегида и окисленного ферредоксина. В ацетогенах указанная реакция может быть сопряжена с окислением CO (с помощью СОдегидрогеназы, EC 1.2.7.4) или водорода (с помощью ферредоксин-зависимой гидрогеназы, EC 1.12.7.2 или 1.12.1.4), что дает в обоих случаях восстановленный ферредоксин (Kopke, Curr Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые ненативные продукты.Step 38 reflects the conversion of 3-hydroxyhexanoate to 1,3-hexaldehyde. This step can be catalyzed by aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.5). Examples of sources of aldehyde:ferredoxin oxidoreductases are described in various sections of this application. AOR catalyzes the reaction of an acid and reduced ferredoxin to form an aldehyde and oxidized ferredoxin. In acetogens, this reaction can be coupled to the oxidation of CO (by CO dehydrogenase, EC 1.2.7.4) or hydrogen (by ferredoxin-dependent hydrogenase, EC 1.12.7.2 or 1.12.1.4), which in both cases produces reduced ferredoxin (Kopke, Curr Opin Biotechnol 22: 320-325, 2011; K''pke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous AOR or introduction of exogenous AOR into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Alternatively, exogenous AOR can be introduced into a microorganism that does not naturally contain AOR, such as E. coli. In particular, coexpression of Ptb-Buk and AOR (and optionally Adh) may allow such a microorganism to produce new non-native products.
Этап 39 отражает преобразование 1,3-гексальдегида в 1,3-гександиол. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 39 reflects the conversion of 1,3-hexaldehyde to 1,3-hexanediol. This step can be catalyzed by alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1. or 1.1.1.2.). Alcohol dehydrogenase can convert aldehyde and NAD(P)H into alcohol and NAD(P). Said alcohol dehydrogenase may be, for example,
- 18 043734- 18 043734
Adh из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) или Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).Adh from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) or Clostridium ragsdalei, BdhB from Clostridium acetobutylicum (NP349891.1) (SEQ ID NO: 69 ), Bdh from Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl from Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72) , Bdh2 from Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 from Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl from Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 from Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE from Clostridium beijerinckii (WP041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl from Clostridium autoethanogenum (WP023163372.1) (SEQ ID NO: 78) or AdhE2 from Clostridium autoethanogenum (WP 023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous alcohol dehydrogenase or introduction of exogenous alcohol dehydrogenase into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Escherichia coli presumably does not have native activity corresponding to this stage.
Этап 40 отражает преобразование ацетоацетил-КоА в 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА. Указанный этап может быть катализирован гидроксиметилглутарил-КоА-синтазой (ГМГ-КоА-синтазой) (EC 2.3.3.10). ГМГ-КоА-синтазы распространены во многих родах и царствах жизни и включают, например, MvaS из Staphylococcus aureus (WP_053014863.1), ERG13 из Saccharomyces cerevisiae (NP_013580.1), HMGCS2 из Mus musculus (NP_032282.2) и многих других представителей группы ферментов ЕС 2.3.3.10. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 40 reflects the conversion of acetoacetyl-CoA to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA. This step can be catalyzed by hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (HMG-CoA synthase) (EC 2.3.3.10). HMG-CoA synthases are distributed in many genera and kingdoms of life and include, for example, MvaS from Staphylococcus aureus (WP_053014863.1), ERG13 from Saccharomyces cerevisiae (NP_013580.1), HMGCS2 from Mus musculus (NP_032282.2) and many other representatives EU enzyme groups 2.3.3.10. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 41 отражает преобразование 3-гидрокси-3-метилглютаноил-КоА в 3-метилглюконил-КоА. Указанный этап может быть катализирован 3-гидроксибутирил-КоА-дегидратазой (EC 4.2.1.55). Указанная 3-гидроксибутирил-КоА-дегидратаза может представлять собой, например, LiuC из Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). Указанный этап может также быть катализирован короткоцепочечной эноилКоА-гидратазой (EC 4.2.1.150) или эноил-КоА-гидратазой (EC 4.2.1.17). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 41 reflects the conversion of 3-hydroxy-3-methylglutanoyl-CoA to 3-methylgluconyl-CoA. This step can be catalyzed by 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase (EC 4.2.1.55). Said 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase may be, for example, LiuC from Myxococcus xanthus (WP_011553770.1). This step can also be catalyzed by short-chain enoyl-CoA hydratase (EC 4.2.1.150) or enoyl-CoA hydratase (EC 4.2.1.17). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 42 отражает преобразование 3-метилглюконил-КоА в 2-метилкротонил-КоА. Указанный этап может быть катализирован метилкротонил-КоА-декарбоксилазой (обладающей высоким структурным сходством с глютаконат-КоА-трансферазой (EC 2.8.3.12)), например, aibAB из Myxococcus xanthus (WP_011554267.1 и WP_011554268.1). Указанный этап может также быть катализирован метилкротоноил-КоА-карбоксилазой (EC 6,4.1.4), например, LiuDB из Pseudomonas aeruginosa (NP_250702.1 и NP_250704.1) или МССА и МССВ из Arabidopsis thaliana (NP_563674.1 и NP_567950.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium, ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 42 reflects the conversion of 3-methylgluconyl-CoA to 2-methylcrotonyl-CoA. This step can be catalyzed by methylcrotonyl-CoA decarboxylase (with high structural similarity to glutaconate-CoA transferase (EC 2.8.3.12)), for example, aibAB from Myxococcus xanthus (WP_011554267.1 and WP_011554268.1). This step can also be catalyzed by methylcrotonoyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.4), for example, LiuDB from Pseudomonas aeruginosa (NP_250702.1 and NP_250704.1) or MSCA and MSCB from Arabidopsis thaliana (NP_563674.1 and NP_567950.1 ). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium, ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 43 отражает преобразование метилкротонил-КоА в изовалерил-КоА. Указанный этап может быть катализирован оксидоредуктазой, цинк-связывающей дегидрогеназой. Указанный оксидоредуктаза, цинк-связывающая дегидрогеназа может представлять собой, например, AibC из Myxococcus xanthus (WP_011554269.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei не обладают известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 43 reflects the conversion of methylcrotonyl-CoA to isovaleryl-CoA. This step can be catalyzed by oxidoreductase, zinc-binding dehydrogenase. Said oxidoreductase, zinc-binding dehydrogenase, may be, for example, AibC from Myxococcus xanthus (WP_011554269.1). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have no known native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Этап 44 отражает преобразование изовалерил-КоА в изовалерат. Указанный этап может быть катализирован КоА-трансферазой (т.е. ацетил-КоА:ацетоацетил-КоА-трансферазой) (EC 2.8.3.9). Указанная КоА-трансфераза может представлять собой, например, CtfAB, гетеродимер, содержащий субъединицы CtfA и CtfB, из Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6). Указанный этап может также быть катализирован тиоэстеразой (EC 3.1.2.20). Указанная тиоэстераза может представлять собой, например, TesB из Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). Указанный этап может также быть катализирован гипотетической тиоэстеразой, например, из Clostridium autoethanogenum или Clostridium ljungdahlii. В частности, три гипотетических тиоэстеразы были идентифицированы в Clostridium autoethanogenum: (1) тиоэстераза 1 (AGY74947.1; аннотирована как пальмитоил-КоА-гидролаза; SEQ ID NO: 8), (2) тиоэстераза 2 (AGY75747.1; аннотирована как 4гидроксибензоил-КоА-тиоэстераза; SEQ ID NO: 9), и (3) тиоэстераза 3 (AGY75999.1; аннотирована как гипотетической тиоэстераза; SEQ ID NO: 10). Три гипотетических тиоэстеразы были также идентифицированы в Clostridium ljungdahlii: (1) тиоэстераза 1 (ADK15695.1; аннотирована как предсказанная ацилКоА-тиоэстераза 1; SEQ ID NO: 11), (2) тиоэстераза 2 (ADK16655.1; аннотирована как предсказаннаяStep 44 reflects the conversion of isovaleryl-CoA to isovalerate. This step can be catalyzed by CoA transferase (ie acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase) (EC 2.8.3.9). Said CoA transferase may be, for example, CtfAB, a heterodimer containing CtfA and CtfB subunits from Clostridium beijerinckii (CtfA, WP_012059996.1) (SEQ ID NO: 5) (CtfB, WP_012059997.1) (SEQ ID NO: 6 ). This step can also be catalyzed by thioesterase (EC 3.1.2.20). Said thioesterase may be, for example, TesB from Escherichia coli (NP_414986.1) (SEQ ID NO: 7). This step may also be catalyzed by a hypothetical thioesterase, for example from Clostridium autoethanogenum or Clostridium ljungdahlii. Specifically, three hypothetical thioesterases have been identified in Clostridium autoethanogenum: (1) thioesterase 1 (AGY74947.1; annotated as palmitoyl-CoA hydrolase; SEQ ID NO: 8), (2) thioesterase 2 (AGY75747.1; annotated as 4hydroxybenzoyl -CoA thioesterase; SEQ ID NO: 9), and (3) thioesterase 3 (AGY75999.1; annotated as a hypothetical thioesterase; SEQ ID NO: 10). Three hypothetical thioesterases have also been identified in Clostridium ljungdahlii: (1) thioesterase 1 (ADK15695.1; annotated as predicted acylCoA thioesterase 1; SEQ ID NO: 11), (2) thioesterase 2 (ADK16655.1; annotated as predicted
- 19 043734 тиоэстераза; SEQ ID NO: 12), и (3) тиоэстераза 3 (ADK16959.1; аннотирована как предсказанная тиоэстераза; SEQ ID NO: 13). Указанный этап может также быть катализирован фосфатбутирилтрансферазой (EC 2.3.1.19)+бутираткиназой (EC 2.7.2.7). Примеры источников фосфатбутирилтрансферазы и бутираткиназы описаны в различных разделах настоящей заявки. Нативные ферменты Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei (или Escherichia coli), такие как тиоэстеразы из Clostridium autoethanogenum, могут катализировать указанный этап и приводить к продуцированию некоторого количества выходных продуктов. Однако введение экзогенного фермента или избыточная экспрессия эндогенного фермента могут быть необходимы для продуцирования выходных продуктов на желаемых уровнях. Кроме того, согласно определенным вариантам реализации разрушающая мутация может быть введена в эндогенный фермент, такой как эндогенная тиоэстераза, для снижения или элиминации конкуренции с введенной Ptb-Buk.- 19 043734 thioesterase; SEQ ID NO: 12), and (3) thioesterase 3 (ADK16959.1; annotated as predicted thioesterase; SEQ ID NO: 13). This step can also be catalyzed by phosphate butyryl transferase (EC 2.3.1.19) + butyrate kinase (EC 2.7.2.7). Examples of sources of phosphate butyryl transferase and butyrate kinase are described in various sections of this application. Native enzymes of Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei (or Escherichia coli), such as thioesterases from Clostridium autoethanogenum, can catalyze this step and lead to the production of some output products. However, administration of an exogenous enzyme or overexpression of an endogenous enzyme may be necessary to produce output products at desired levels. Additionally, in certain embodiments, a disruptive mutation may be introduced into an endogenous enzyme, such as an endogenous thioesterase, to reduce or eliminate competition with the introduced Ptb-Buk.
Этап 45 отражает преобразование изовалерата в изовалеральдегид. Указанный этап может быть катализирован альдегид:ферредоксиноксидоредуктазой (EC 1.2.7.5). Указанная альдегид:ферредоксиноксидоредуктаза (AOR) может представлять собой, например, AOR из Clostridium. autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (последовательности SEQ ID NO: 63 и 64, соответственно) или AOR из Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (последовательности SEQ ID NO: 65 и 66, соответственно). Дополнительные примеры источников альдегид:ферредоксиноксидоредуктаз описаны в различных разделах настоящей заявки. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной AOR или введение экзогенной AOR в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Как вариант, экзогенная AOR может быть введена в микроорганизм, который естественным образом не содержит AOR, например, E. coli. В частности, коэкспрессия Ptb-Buk и AOR (и, необязательно, Adh) может позволять такому микроорганизму продуцировать новые негативные продукты.Step 45 reflects the conversion of isovalerate to isovaleraldehyde. This step can be catalyzed by aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.5). Said aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) may be, for example, an AOR from Clostridium. autoethanogenum (WP_013238665.1; WP_013238675.1) (SEQ ID NOs: 63 and 64, respectively) or AOR from Clostridium ljungdahlii (ADK15073.1; ADK15083.1) (SEQ ID NOs: 65 and 66, respectively). Additional examples of sources of aldehyde:ferredoxin oxidoreductases are described in various sections of this application. Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous AOR or introduction of exogenous AOR into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Alternatively, exogenous AOR can be introduced into a microorganism that does not naturally contain AOR, such as E. coli. In particular, coexpression of Ptb-Buk and AOR (and optionally Adh) may allow such a microorganism to produce new negative products.
Этап 46 отражает преобразование изовалеральдегида в изоамиловый спирт. Указанный этап может быть катализирован алкогольдегидрогеназой (EC 1.1.1.1. или 1.1.1.2.). Алкогольдегидрогеназа может преобразовывать альдегид и НАД(Ф)Н в спирт и НАД(Ф). Указанная алкогольдегидрогеназа может представлять собой, например,Step 46 reflects the conversion of isovaleraldehyde to isoamyl alcohol. This step can be catalyzed by alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1. or 1.1.1.2.). Alcohol dehydrogenase can convert aldehyde and NAD(P)H into alcohol and NAD(P). Said alcohol dehydrogenase may be, for example,
Adh из Clostridium autoethanogenum (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) илиAdh from Clostridium autoethanogenum (SEQ ID NO: 67), Clostridium ljungdahlii (ADK17019.1) (SEQ ID NO: 68) or
Clostridium ragsdalei, BdhB из Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh из Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl из Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71), Bdhl из Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 из Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 из Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74), AdhEl из Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 из Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE из Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77), AdhEl из Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) или AdhE2 из Clostridium autoethanogenum (WP_023163373.1) (SEQ ID NO: 79).Clostridium ragsdalei, BdhB from Clostridium acetobutylicum (NP_349891.1) (SEQ ID NO: 69), Bdh from Clostridium beijerinckii (WP 041897187.1) (SEQ ID NO: 70), Bdhl from Clostridium ljungdahlii (YP 003780648.1) (SEQ ID NO: 71 ), Bdhl from Clostridium autoethanogenum (AGY76060.1) (SEQ ID NO: 72), Bdh2 from Clostridium ljungdahlii (YP 003782121.1) (SEQ ID NO: 73), Bdh2 from Clostridium autoethanogenum (AGY74784.1) (SEQ ID NO: 74 ), AdhEl from Clostridium acetobutylicum (NP 149325.1) (SEQ ID NO: 75), AdhE2 from Clostridium acetobutylicum (NPJ49199.1) (SEQ ID NO: 76), AdhE from Clostridium beijerinckii (WP 041893626.1) (SEQ ID NO: 77) , AdhEl from Clostridium autoethanogenum (WP 023163372.1) (SEQ ID NO: 78) or AdhE2 from Clostridium autoethanogenum (WP_023163373.1) (SEQ ID NO: 79).
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Однако избыточная экспрессия эндогенной алкогольдегидрогеназы или введение экзогенной алкогольдегидрогеназы в Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei могут быть желательны для увеличения выхода продукта. Escherichia coli предположительно не обладает нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei have native activity corresponding to this stage. However, overexpression of endogenous alcohol dehydrogenase or introduction of exogenous alcohol dehydrogenase into Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii or Clostridium ragsdalei may be desirable to increase product yield. Escherichia coli presumably does not have native activity corresponding to this stage.
Этап 47 отражает преобразование изовалерил-КоА в изовалеральдегид. Указанный этап может быть катализирован бутиральдегиддегидрогеназой (EC 1.2.1.57). Указанная бутиральдегиддегидрогеназа может представлять собой, например, Bld из Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei предположительно не обладают нативной активностью, соответствующей указанному этапу. Escherichia coli не обладает известной нативной активностью, соответствующей указанному этапу.Step 47 reflects the conversion of isovaleryl-CoA to isovaleraldehyde. This step can be catalyzed by butyraldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.57). Said butyraldehyde dehydrogenase may be, for example, Bld from Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AAP42563.1) (SEQ ID NO: 80). Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii and Clostridium ragsdalei do not appear to have native activity corresponding to this step. Escherichia coli has no known native activity corresponding to this stage.
Обзор Ptb-BukPtb-Buk review
Согласно настоящему изобретению предложены новые пути, задействующие ферментную систему Ptb-Buk. В природе указанная ферментная система обнаруживается у ряда продуцирующих бутират микроорганизмов, такие как продуцирующие бутират Clostridia или Butyrivibrio. В частности, фосфатбутирилтрансфераза (Ptb) (EC 2.3.1.19) естественным образом катализирует реакцию бутаноила-КоА и фосфата с образованием КоА+бутаноилфосфата и бутираткиназы (Buk) (EC 2.7.2.7) естественным образом катализирует реакцию бутаноилфосфата и АДФ с образованием бутирата (бутаноата) и АТФ. Соответственно, указанные ферменты совместно (Ptb-Buk) естественным образом катализируют преобразование бутаноил-КоА в бутират и генерируют одну молекулу АТФ посредством субстратного фосфорилирования (фиг. 2). Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ptb является неизбирательной иThe present invention provides new pathways involving the Ptb-Buk enzyme system. In nature, this enzyme system is found in a number of butyrate-producing microorganisms, such as butyrate-producing Clostridia or Butyrivibrio. Specifically, phosphate butyryl transferase (Ptb) (EC 2.3.1.19) naturally catalyzes the reaction of butanoyl-CoA and phosphate to form CoA+butanoyl phosphate, and butyrate kinase (Buk) (EC 2.7.2.7) naturally catalyzes the reaction of butanoyl phosphate and ADP to form butyrate (butanoate ) and ATP. Accordingly, these enzymes together (Ptb-Buk) naturally catalyze the conversion of butanoyl-CoA to butyrate and generate one molecule of ATP through substrate phosphorylation (Fig. 2). However, the inventors of the present invention have discovered that Ptb is non-selective and
- 20 043734 способна воспринимать различные ацил-КоА и эноил-КоА в качестве субстратов, таким образом, PtbBuk может применяться для преобразования ряда ацил-КоА и эноил-КоА в соответствующие кислоты или алкенаты, соответственно, с одновременной генерацией АТФ. Было описано, что Ptb активна в отношении диапазона ацил-КоА, в том числе ацетоацетил-КоА, in vitro (Thompson, Appl Environ Microbiol, 56: 607-613, 1990). Ранее не было показано, что ацетоацетил-фосфат может быть субстратом Buk. Хотя известно, что Buk воспринимает широкий диапазон субстратов (Liu, Appl Microbiol Biotechnol, 53: 545552, 2000), активность in vivo не была показана.- 20 043734 is capable of accepting various acyl-CoAs and enoyl-CoAs as substrates, thus PtbBuk can be used to convert a number of acyl-CoAs and enoyl-CoAs into the corresponding acids or alkenates, respectively, while generating ATP. Ptb has been described to be active against a range of acyl-CoAs, including acetoacetyl-CoA, in vitro (Thompson, Appl Environ Microbiol, 56: 607-613, 1990). Acetoacetyl phosphate has not previously been shown to be a substrate of Buk. Although Buk is known to accept a wide range of substrates (Liu, Appl Microbiol Biotechnol, 53:545552, 2000), in vivo activity has not been demonstrated.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение экзогенной Ptb-Buk позволяет определенным микроорганизмам продуцировать подходящие продукты, в том числе ацетон, изопропанол, изобутилен, 3-гидроксибутират, 1,3-бутандиол и 2-гидроксиизобутират, а также другие продукты такие как пропионат, капроат и октонат.In addition, the present inventors have discovered that the administration of exogenous Ptb-Buk allows certain microorganisms to produce suitable products, including acetone, isopropanol, isobutylene, 3-hydroxybutyrate, 1,3-butanediol and 2-hydroxyisobutyrate, as well as other products such as propionate, caproate and octonate.
Новые пути на основе Ptb-Buk обеспечивают ряд значимых преимуществ по сравнению с другими известными существующими маршрутами продуцирования продуктов, основанными на КоАтрансферазе - как в классическом клостридиалъном ферментативном пути ацетон-бутанол-этанол (ABE) или тиоэстеразе (Jones, Microbiol Rev, 50: 484-524, 1986; Matsumoto, Appl Microbiol Biotechnol, 97: 205210, 2013; May, Metabol Eng, 15: 218-225, 2013) (фиг. 3). В частности, указанные новые пути (1) не зависят от присутствия или продуцирования конкретных молекул, таких как органические кислоты, например, бутирата или ацетата, необходимых для КоА-трансферазной реакции, и (2) обеспечивают генерацию АТФ посредством субстратного фосфорилирования, не сохраняющуюся при тиоэстеразной или КоАтрансферазной реакции. Те же преимущества присутствуют при применении системы Ptb-Buk для других реакций, таких как преобразование 3-гидроксибутирил-КоА в 3-гидроксибутират. Соответственно, указанные новые пути отличаются потенциально значительно большими титрами продукции и скоростями за счет генерации дополнительной энергии и продуцирования целевых продуктов без ко-продукции нежелательных побочных продуктов, таких как ацетат.The new Ptb-Buk-based pathways provide a number of significant advantages over other known existing CoAtransferase-based product production routes - such as the classical clostridial acetone-butanol-ethanol (ABE) or thioesterase enzymatic pathway (Jones, Microbiol Rev, 50: 484 -524, 1986; Matsumoto, Appl Microbiol Biotechnol, 97: 205210, 2013; May, Metabol Eng, 15: 218-225, 2013) (Fig. 3). In particular, these new pathways (1) do not depend on the presence or production of specific molecules, such as organic acids, such as butyrate or acetate, required for the CoA transferase reaction, and (2) provide ATP generation through substrate phosphorylation, which is not maintained during thioesterase or CoAtransferase reaction. The same advantages are present when using the Ptb-Buk system for other reactions, such as the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to 3-hydroxybutyrate. Accordingly, these new pathways feature potentially significantly higher product titers and rates by generating additional energy and producing target products without co-producing unwanted by-products such as acetate.
Нежелательно, в частности, при промышленном масштабе, чтобы микроорганизмы продуцировали ацетат (или другие органические кислоты, необходимые для КоА-трансферазной реакции) в качестве побочного продукта, поскольку ацетат перенаправляет углерод от целевых продуктов и, соответственно, влияет на эффективность и выход целевых продуктов. Кроме того, ацетат может быть токсическим для микроорганизмов и/или может служить в качестве субстрата для роста загрязняющих микроорганизмов. Кроме того, присутствие ацетата усложняет выделение и разделение целевых продуктов и контроль за условиями ферментации, благоприятствующими получению целевых продуктов.Particularly on an industrial scale, it is undesirable for microorganisms to produce acetate (or other organic acids required for the CoA transferase reaction) as a by-product, since acetate redirects carbon away from the target products and accordingly affects the efficiency and yield of the target products. In addition, acetate may be toxic to microorganisms and/or may serve as a substrate for the growth of contaminating microorganisms. In addition, the presence of acetate complicates the isolation and separation of the target products and the control of fermentation conditions favorable to obtaining the target products.
Генерация АТФ по механизму субстратного фосфорилирования может применяться в качестве движущей силы для синтеза продуктов, в частности, в ограниченных по АТФ системах. В частности, ацетогенные бактерии, как известно, живут на термодинамическом пределе существования (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014). Соответственно, продуцирование ацетата было описано у всех ацетогенных микроорганизмов, выделенных к настоящему времени (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, pages 354-420, New York, NY, Springer, 2006), поскольку продуцирование ацетата обеспечивает микроорганизму возможность прямо генерировать АТФ при субстратном фосфорилировании с помощью Pta (фосфотрансацетилазы) (EC 2.3.1.8) и Ack (ацетаткиназы) (EC 2.7.2.1). Несмотря на наличие механизмов сохранения АТФ в указанных микроорганизмах, такие как мембранные градиенты и электроразделительные ферменты, сопряженные с системами переноса ионов или протонов, например, Rnf-комплекс (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), прямая генерация АТФ остается критически важной для их выживания. В результате при введении гетерологичных путей, не позволяющих генерировать АТФ, происходит продуцирование ацетата в качестве побочного продукта (Schiel-Bengelsdorf, FEBS Lett, 586: 2191-2198, 2012). Однако пути Ptb-Buk, описанные в настоящем документе, обеспечивают альтернативный механизм генерации АТФ для микроорганизма по механизму субстратного фосфорилирования и, соответственно, позволяют избежать продуцирования ацетата. В частности, ацетат-образующие ферменты, такие как Pta-Ack, которые в ином случае имели бы существенное значение (Nagarajan, Microb Cell Factories, 12:118, 2013), могут быть заменены на Ptb-Buk в качестве альтернативного способа генерации АТФ. Поскольку после этого микроорганизм может генерировать АТФ за счет Ptb-Buk, указанная система предоставляет движущую силу, обеспечивающую максимальный поток через новые пути, задействующие Ptb-Buk. Генерация АТФ может также быть критически важным для нижерасположенных путей, требующих АТФ. Например, ферментативное продуцирование изобутилена из ацетона требует АТФ. Хотя полный путь от ацетил-КоА к изобутилену потребляет АТФ при использовании КоА-трансферазы или тиоэстеразы, при использовании Ptb-Buk указанный путь является энергетически нейтральным.The generation of ATP by the mechanism of substrate phosphorylation can be used as a driving force for the synthesis of products, in particular, in ATP-limited systems. In particular, acetogenic bacteria are known to live at the thermodynamic limit of existence (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014). Accordingly, acetate production has been described in all acetogenic microorganisms isolated to date (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, pages 354-420, New York, NY, Springer, 2006), since acetate production provides the microorganism with ability to directly generate ATP upon substrate phosphorylation by Pta (phosphotransacetylase) (EC 2.3.1.8) and Ack (acetate kinase) (EC 2.7.2.1). Despite the presence of mechanisms for storing ATP in these microorganisms, such as membrane gradients and electrical separation enzymes coupled to ion or proton transport systems, for example, the Rnf complex (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014), direct generation of ATP remains critical to their survival. As a result, when heterologous pathways are introduced that do not allow ATP generation, acetate is produced as a by-product (Schiel-Bengelsdorf, FEBS Lett, 586: 2191-2198, 2012). However, the Ptb-Buk pathways described herein provide an alternative mechanism for generating ATP for the microorganism through substrate phosphorylation and therefore avoid acetate production. In particular, acetate-forming enzymes such as Pta-Ack, which would otherwise be essential (Nagarajan, Microb Cell Factories, 12:118, 2013), can be replaced by Ptb-Buk as an alternative way to generate ATP. Since the microorganism can then generate ATP at the expense of Ptb-Buk, this system provides the driving force to ensure maximum flux through new pathways involving Ptb-Buk. ATP generation may also be critical for downstream ATP-requiring pathways. For example, the enzymatic production of isobutylene from acetone requires ATP. Although the entire pathway from acetyl-CoA to isobutylene consumes ATP when using CoA transferase or thioesterase, when using Ptb-Buk the pathway is energy neutral.
Приведены примеры источников Ptb и Buk. Однако следует понимать, что могут быть доступны другие подходящие источники Ptb и Buk. Кроме того, Ptb и Buk могут быть сконструированы для улучшения активности, и/или гены, кодирующие Ptb-Buk, могут быть кодон-оптимизированы для экспрессии, в частности, в микроорганизмах-хозяевах.Examples of Ptb and Buk sources are given. However, it should be understood that other suitable sources of Ptb and Buk may be available. In addition, Ptb and Buk can be engineered to improve activity, and/or the genes encoding Ptb-Buk can be codon-optimized for expression, particularly in microbial hosts.
Фосфатбутирилтрансфераза может представлять собой любой источник или может происходить, например, из любого из следующих источников, последовательности которых общедоступны:The phosphate butyryl transferase may be from any source or may be derived, for example, from any of the following sources, the sequences of which are publicly available:
- 21 043734- 21 043734
- 22 043734- 22 043734
- 23 043734- 23 043734