KR20240051254A - 포르메이트 데하이드로게나제 변이체 및 이용 방법 - Google Patents

포르메이트 데하이드로게나제 변이체 및 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 폴리펩타이드 및 암호화 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 발현하는 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 발현하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 생물 유래 화합물의 생산 방법을 제공한다.

Description

포르메이트 데하이드로게나제 변이체 및 이용 방법
관련 출원에 대한 교차 -참조
본 출원은 2021년 8월 31일자 미국 가출원 번호 63/239,231에 대해 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
서열목록의 원용에 의한 병합
본 출원은 특허 센터를 통해 제출된 서열목록이 수록되어 있다. 2022년 8월 24일자에 생성된 82,608 바이트 크기의 서열목록명 199683-105001_PCT.xml은 그 전체가 원용에 의해 본원에 병합된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 포르메이트 데하이드로게나제 (FDH) 변이체 및 이러한 변이체의 이용 방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 NAHD 생산을 증가시켜 생물 유래 화합물 (예를 들어, 1,3-부탄다이올)의 생산을 높이기 위한 비-자연 생성 미생물 유기체에 도입된 재조합 핵산에 의해 암호화된 포르메이트 데하이드로게나제 변이체에 관한 것이다.
1,3-부탄다이올 (1,3-BDO; 1,3-부틸렌 글리콜, 1,3-BG, 부틸렌 글리콜, BG라고도 함)은 전통적으로 수화 반응을 통해 아세틸렌으로부터 제조되는 4 탄소 디올이다. 제조된 아세트알데하이드는 3-하이드록시부티르알데하이드로 변환된 후, 환원하여 1,3-BDO로 제조된다. 최근, 아세트알데하이드의 원료가 아세틸렌에서 더 저렴한 에틸렌으로 대체되고 있다. 1,3-BDO는 식품 향미제의 유기 용매로 통상적으로 사용된다. 또한, 이것은 폴리우레탄과 폴리에스테르 수지에 대한 공-단량체로서 이용되며, 저혈당 제제로 널리 사용되고 있다. 광학 활성의 1,3-BDO는 생물학적 활성 화합물과 액정 합성에 이용가능한 출발 물질이다. 1,3-BDO의 다른 용도는 이를 탈수시켜 1,3-부타다이엔을 제조하는 것으로 (Ichikawa et al. Journal of Molecular Catalysis A-Chemical 256:106-112 (2006); Ichikawa et al. Journal of Molecular Catalysis A-Chemical 231:181-189 (2005)), 이는 합성 고무 (예를 들어, 타이어), 라텍스 및 수지를 제조하는 데 유용하다. 석유계 공급원에 대한 아세틸렌 또는 에틸렌의 의존성으로, 재생가능한 공급원료에 기반하여 1,3-BDO 및 부타다이엔을 제조하는 경로의 개발이 필요해졌다.
1,4-부탄다이올 (1,4-BDO)은 고 성능 폴리머, 용매 및 정밀 화학물질을 생산하는데 유용한 화합물이다. 이는 테트라하이드로푸란 (THF) 및 감마-부티로락톤 (GBL) 등의 가치가 높은 다른 화학물질을 제조하는 데 기초가 된다. 가치 사슬은 (1) 폴리머, (2) THF 유도체, 및 (3) GBL 유도체 등의 주요 부문들로 구성된다. 폴리머의 경우, 1,4-BDO는 폴리부틸렌 테레프탈레이트 (PBT)를 제조하기 위한 코모노머이다. PBT는 자동차, 전기, 수도 시스템 및 소형 가전 제품에 사용되는 중간 성능의 엔지니어링 열가소성 물질이다. 이를 THF로 변환한 다음 폴리테트라메틸렌 에테르 글리콜 (PTMEG)로 변환하면, LYCRA® 섬유와 같은 스판덱스 제품을 제조하는 데 사용되는 중간산물이 제공된다. PTMEG는 특수 폴리에스테르 에테르 (COPE)의 제조에서 1,4-BDO와도 조합된다. COPE는 기계적 특성과 오일/환경 저항성이 우수한 고 탄성의 엘라스토머로, 따라서 극한의 고온 및 저온에서 작동 가능하다. PTMEG 및 1,4-BDO는 또한 표준 열가소성 압출, 압연성형 및 성형 장치에서 가공되는 열가소성 폴리우레탄을 제조하는데, 이것은 뛰어난 인성 및 내마모성을 특징으로 한다. 1,4-BDO로부터 제조되는 GBL은 피롤리돈 제조뿐 아니라 농약 시장에 공급하기 위한 공급원료를 제공한다. 피롤리돈은 예를 들어 전자 산업 및 의약품 생산을 비롯해 사용이 증가하는 추출 공정용 고 성능 용매로 사용되고 있다.
1,4-BDO는 주요 석유화학 경로 2종에 의해 제조되며, 일부 부가적인 경로들 역시 상업적으로 운영된다. 한가지 경로는 아세틸렌을 포름알데하이드와 반응시킨 후 수소화하는 것을 포함한다. 최근, 부탄 또는 부타다이엔을 말레 무수물로 산화한 다음 수소화하는 1,4-BDO 공정도 출시되었다. 1,4-BDO는 기타 화학제 및 폴리머를 합성하기 위한 중간물질로 거의 독점적으로 사용되고 있다.
부타다이엔 (1,3-부타다이엔, BD)은 연간 250억 파운드 이상으로 생산되고 있으며 합성 고무 및 ABS 수지와 같은 폴리머, 및 헥사메틸렌다이아민 및 1,4-부탄다이올과 같은 화학제를 제조하는데 활용되고 있다. 예를 들어, 부타다이엔은 기타 알켄 화합물 (예를 들어, 스티렌)과 같은 수많은 기타 화학물질과 반응시켜, 다수의 코폴리머 (예를 들어, 아크릴로니트릴 1,3-부타다이엔 스티렌 (ABS), 스티렌-1,3-부타다이엔 (SBR) 고무, 스티렌-1,3-부타다이엔 라텍스)를 제조할 수 있다. 이들 물질은 고무, 플라스틱, 단열재, 유리섬유, 파이프, 자동차 및 보트 부품, 식품 용기 및 카페트 후면에 사용된다. 부타다이엔은 전형적으로 나프타, 액화 석유 가스, 에탄 또는 천연 가스와 같은 석유 공급원료를 에틸렌 및 기타 올레핀으로 변환하는 증기 분해 공정에서 부산물로 만들어진다. 대안 및/또는 재생가능한 공급원료로부터 부타다이엔을 제조하는 능력이 보다 지속가능한 화학 생산 공정을 추구하는 데 상당한 진전을 가져다 줄 것이다.
크로틸알코올은 2-부텐-1-올이라고도 하며, 유용한 화학 중간산물이다. 이는 크로틸 할라이드, 에스테르 및 에테르에 대한 전구체로도 사용되고 있으며, 모노머, 정밀 화학, 농약 및 의약품 생산에서 화학적 중간산물이다. 정밀 화학 제품의 예로는 소르브산, 트리메틸하이드로퀴논, 크로톤산 및 3-메톡시부탄올 등이 있다. 크로틸알코올은 또한 1,3-부타다이엔의 전구체이다. 크로틸알코올은 현재 석유 공급원료로부터만 제조된다. 예를 들어, 일본 특허 47-013009 및 미국 특허 3,090,815, 3,090,816 및 3,542,883에는 1,2-에폭시부탄의 이성질화에 의한 크로틸알코올의 제조 방법이 언급되어 있다. 크로틸알코올을 대안 및/또는 재생가능한 공급원료로부터 제조하는 능력은 보다 지속가능한 화학 생산 공정을 추구하는 데 상당한 진전을 가져올 것이다.
3-부텐-2-올 (메틸 비닐 카르비놀 (MVC)이라고도 함)은 부탄다이엔 생산에 이용가능한 중간산물이다. 3-부텐-2-올을 사용하는 것이 1,3-BDO에 비해 상당히 유익한데, 그 이유는 분리 단계가 더 적고 탈수 단계가 단 한 단계이기 때문이다. 또한, 3-부텐-2-올은 용매로, 폴리머 생산용 모노머로 또는 정밀 화학물질의 전구체로도 이용할 수 있다. 따라서, 3-부텐-2-올을 대안적인 및/또는 재생가능한 공급원료로부터 제조하는 능력은 보다 지속가능한 화학 생산 공정에 상당한 이점을 제공해 줄 것이다.
아디프산, 다이카르복시산은 분자량이 146.14이다. 이는 아디프산을 헥사메틸렌다이아민과 축합하여 제조하는 선형 폴리아미드인 나일론 6,6을 생산하는 데 이용할 수 있다. 이는 다양한 종류의 섬유를 제조하는 데 사용된다. 아디프산의 다른 용도로는 가소제, 불포화 폴리에스테르 및 폴리에스테르 폴리올에서의 사용을 포함한다. 추가적인 용도로는 폴리우레탄 제조, 윤활제 성분, 및 향료 및 겔화 보조제와 같은 식품 성분 등이 있다.
역사적으로 아디프산은 다양한 지방으로부터 산화를 통해 제조된다. 현재 일부 아디프산 합성 공정은 KA 오일, 사이클로헥사논, 케톤 또는 K 성분과 사이클로헥사놀, 알코올 또는 A 성분의 혼합물, 또는 순수한 사이클로헥사놀을 과량의 강한 질산을 이용한 산화를 기반으로 한다. 이러한 전략에서 KA 또는 사이클로헥사놀의 제조 경로에 몇가지 다른 변주들이 존재한다. 예를 들어, KA 오일 생산에서 대체 원료는 페놀이고, 페놀로부터 아디프산을 합성하는 공정이 개시되어 있다. 이 공정에 대한 다른 버전들은 과산화수소, 공기 또는 산소와 같이 질소 이외의 다른 산화제를 이용하는 경향을 보인다.
전술한 바와 같이 헥사메틸렌다이아민 (HMDA)은 나일론-6,6 제조에 이용될 뿐 아니라, 폴리우레탄을 제조하는 데 사용되는 모노머 공급원료로서 헥사메틸렌 다이이소시아네이트의 제조에도 활용된다. 다이아민은 또한 에폭시 수지에 가교제로 작용한다. HMDA는 아디포니트릴의 수소화를 통해 제조된다.
카프로락탐은 유기 화합물로서, 6-아미노헥산산 (ε-아미노헥산산, 6-아미노카프로산)의 락탐이다. 이는 대안적으로 카프로산의 사이클릭 아미드로 고려될 수 있다. 카프로락탐의 한가지 용도는 나일론-6 생산에서의 모노머이다. 카프로락탐은 사이클로헥사논으로부터 하이드록실암모늄 설페이트를 이용한 옥심화 공정과 이후 Beckmann 재배열 공정 단계를 이용한 촉매적 재배열을 통해 합성할 수 있다.
메틸아크릴산 (MAA)은 화학적 중간산물인 메틸 메타크릴레이트 (MMA)의 핵심적인 전구체로서, 전 세계적인 수요가 연간 45억 파운드 이상이며, 대부분 폴리아크릴레이트로 변환된다. 통상적인 메틸 메타크릴레이트 합성 경로 (즉, 아세톤 시아노하이드린 경로)는 하이드로겐 시아니드 (HCN) 및 아세톤을 아세톤 시아노하이드린으로 변환한 다음 산을 이용한 가수분해 및 메탄올을 이용한 에스테르화를 거쳐 MAA를 제조하는 과정을 수반한다. 높은 부산물 폐기 비용 (MAA 1톤 당 암모늄 바이설페이트 1.2톤이 생성됨)과 더불어 잠재적으로 치명적인 HCN 취급 문제로 인해, 더 깨끗하고 더 경제적인 공정을 목표로 하는 다수의 연구들이 촉발되었다. MAA는 출발 물질로서 메탄올을 이용한 에스테르화를 통해 MMA로 쉽게 변환될 수 있다.
미생물 유기체는 1,3-BDO, 1,4-BDO, 부타다이엔, 크로틸알코올, MVC, 아디페이트, HMDA, 카프로락탐 및 MAA와 같은 생물 유래 화합물을 생산하는데 이용될 수 있다. 이러한 생산의 역가, 속도 및 수율이 보조 인자의 이용가능성으로 인해 제한적일 수 있다. 특히, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 환원된 (NADH) 또는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 환원된 (NADPH)와 같은 보조 인자의 제한성으로 인해 레독스 이용가능성이 제한적일 수 있다. 예를 들어, NADPH는 지질과 핵산 합성과 같은 생합성 반응 및, 반응성 산소 종 (ROS)의 독성으로부터 보호하는데 참여하는 산화-환원에 대한 환원 당량을 제공한다. NADPH는 콜레스테롤 합성 및 지방산 사슬 연장과 같은 동화 경로에도 이용된다. 레독스 수준의 불균형은 1,3-BDO, 1,4-BDO, 부타다이엔, 크로틸알코올, MVC, 아디페이트, HMDA, 카프로락탐 및 MAA와 같은 생물 유래 화합물을 생산하는데 좋지 않은 효과를 유발할 수 있다. 또한, NADH는 대사 및 에너지 생산뿐 아니라 레독스 반응에 분자 간 전자 이동을 통해 많은 중요한 분자들의 올바른 기능 수행을 가능케 하는데 필연적이다. NAD+/NADH 쌍은 미생물 이화작용과 세포 생장에 중요한 것으로 밝혀졌다. 아울러, NAD(P)+ 트랜스하이드로게나제 (EC 1.6.1.1 - Si-특이적; 및 EC 1.6.1.2 - Re/Si-특이적)는 가역적인 반응, 즉 NADPH + NAD+ ↔ NADP+ + NADH를 촉매할 수 있으며, 따라서 NADH 생산 증가는 NADPH 생산 증가로 해석할 수 있다. 이에, NADH와 같은 보조 인자의 이용가능성 증가는 생물 유래 화합물의 역가, 속도 및 수율 증가에 도움이 될 수 있다.
포르메이트 데하이드로게나제 (FDH; EC 1.2.1.2)는 포르메이트 (즉, 포르메이트 이온)에서 이산화탄소로의 산화를 촉매하면서 동시에 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드를 산화된 형태 (NAD+)에서 이의 환원된 형태 (NADH)로 환원하는, 자연계에서 발견되는 일반적인 효소이다. 대안적으로, FDH (EC 1.17.1.9)는 포르메이트의 산화를 촉매하는 데 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트 (NADP+)의 보조 인자로 이용될 수 있으며, 따라서 이산화탄소와 NADPH가 만들어진다. FDH는 비-제한적으로 대부분의 아미노산, 키랄 화합물 (예를 들어, 키랄 알코올) 및 하이드록시산 등의 광학 활성 화합물의 생산 및 생물전환 (bioconversion)을 위한 코엔자임 순환 시스템으로 이용될 수 있다. FDH는 원하는 생산물, 예를 들어 대상 약제학적 생산물을 생산하기 위한 유기산 합성에 촉매로서 중요한 역할을 담당한다.
따라서, NADH의 이용가능성을 높임으로써 개선 가능한, 1,3-BDO, 1,4-BDO, 부타다이엔, 크로틸알코올, MVC, 아디페이트, HMDA, 카프로락탐 및 MAA와 같은 생물 유래 화합물을 상업적인 양으로 효율적으로 생산하기 위한 방법에 대해 개발 요구가 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고, 관련한 이점을 물론 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 포르메이트 데하이드로게나제, 즉 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 이러한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 포함한다. 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는, 일부 구현예에서, (a) 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 촉매할 수 있거나; (b) NAD+에서 NADH로의 변환 또는 환원을 촉매할 수 있거나; 또는 (c) 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가진 포르메이트 데하이드로게나제와 같은 야생형 포르메이트 데하이드로게나제의 활성과 비교해, 적어도 0.5배, 적어도 1배, 적어도 1.5배 또는 적어도 2배 높은 활성을 가진다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환 등의 하나 이상의 아미노산 변이를 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 하나 이상의 보존적인 아미노산 치환을 포함한 하나 이상의 아미노산 변이를 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 하나 이상의 비-보존적인 아미노산 치환을 포함한 하나 이상의 아미노산 변이를 가진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는, 표 6 및/또는 표 7에 언급된 변이들 중 하나 이상 등의 서열번호 1 또는 2에서 그 위치에 대응하는 특정 위치에서 하나 이상의 잔기를 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 본원 (예를 들어, 표 6 및/또는 표 7)에 기술된 아미노산 변이를 적어도 하나, 2개, 3개 또는 4개 가진다. 이러한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는, 일부 구현예에서, 표 6 또는 표 7에 언급된 변이체에 해당하는 변이 하나 또는 변이들의 조합을 서열번호 1 또는 2에 가진다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖지 않는다.
본원에 제공된 추가적인 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 본원에서 식별된 서열번호 1 및 2의 상동체에 대한 변이체를 포함한다. 이에, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 3-24의 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열을 가진다. 이러한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는, 일부 구현예에서, 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 해당하는 위치에 하나 이상의 변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 재조합 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 본 발명은 또한 이러한 재조합 핵산을 가진 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 가진 비-자연 발생 미생물 유기체 (non-naturally occurring microbial organism)를 제공한다. 이러한 미생물 유기체는, 일부 구현예에서, 하나 이상의 경로 효소가 이의 효소 반응을 촉매하기 위한 보조인자로서 NADH 또는 NADPH를 이용하는, 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 하나 이상의 경로 효소는 외인성 핵산에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 미생물 유기체는 미생물 유기체에 이종적인 외인성 핵산을 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 미생물 유기체는 미생물 유기체에 상동성인 외인성 핵산을 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 미생물 유기체는 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로를 포함한다. 이러한 생물 유래 화합물은, 일부 구현예에서, 알코올, 글리콜, 유기산, 알켄, 다이엔, 유기 아민, 유기 알데하이드, 비타민, 뉴트라수티컬 또는 의약품이다. 알코올에 대한 예로는 다음을 포함한다: (a) 생물 연료 알코올, 여기서 생물 연료는 탄소수 1-10의 1차 알코올, 2차 알코올, 다이올 또는 트리올임; (b) n-프로판올 또는 이소프로판올; 및 (c) 지방 알코올, 여기서 지방 알코올은 C4 내지 C27 탄소 원자, C8 내지 C18 탄소 원자, C12 내지 C18 탄소 원자 또는 C12 내지 C14 탄소 원자를 포함함. 생물 연료 알코올에 대한 예로는 다음을 포함한다: 1-프로판올, 이소프로판올, 1-부탄올, 이소부탄올, 1-펜탄올, 이소펜테놀, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-헥사놀, 3-메틸-1-펜탄올, 1-헵타놀, 4-메틸-1-헥사놀 및 5-메틸-1-헥사놀. 일부 구현예에서, 다이올은 프로판다이올 또는 부탄다이올, 예를 들어 1,4 부탄다이올, 1,3-부탄다이올 또는 2,3-부탄다이올이다. 일부 구현예에서, 생물 유래 화합물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: (a) 1,4-부탄다이올 또는 이의 중간산물, 여기서 중간산물은 선택적으로 4-하이드록시부탄산 (4-HB)임; (b) 부타다이엔 (1,3-부타다이엔) 또는 이의 중간산물, 여기서 중간산물은 선택적으로 1,4-부탄다이올, 1,3-부탄다이올, 2,3-부탄다이올, 크로틸알코올, 3-부텐-2-올 (메틸 비닐 카르비놀) 또는 3-부텐-1-올임; (c) 1,3-부탄다이올 또는 이의 중간산물, 여기서 중간산물은 선택적으로 3-하이드록시부티레이트 (3-HB), 2,4-펜타다이에노에이트, 크로틸알코올 또는 3-부텐-1-올임; (d) 아디페이트, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌다이아민, 레불린산 또는 이의 중간산물, 여기서 중간산물은 선택적으로 아디필-CoA 또는 4-아미노부티릴-CoA임; (e) 메타크릴산 또는 이의 에스테르, 3-하이드록시이소부티레이트, 2-하이드록시이소부티레이트, 또는 이의 중간산물, 여기서 에스테르는 선택적으로 메틸 메타크릴레이트 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트)임; (f) 1,2-프로판다이올 (프로필렌 글리콜), 1,3-프로판다이올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 다이에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 비스페놀 A 또는 이의 중간산물; (g) 숙신산 또는 이의 중간산물; 및 (h) C4 내지 C27 탄소 원자, C8 내지 C18 탄소 원자, C12 내지 C18 탄소 원자 또는 C12 내지 C14 탄소 원자를 포함하는 지방 알코올, 지방 알데하이드 또는 지방산, 여기서 지방 알코올은 선택적으로 도데카놀 (C12; 라우릴 알코올), 트리데실 알코올 (C13; 1-트리데카놀, 트리데카놀, 이소트리데카놀), 미리스틸 알코올 (C14; 1-테트라데카놀), 펜타데실 알코올 (C15; 1-펜타데카놀, 펜타데카놀), 세틸 알코올 (C16; 1-헥사데카놀), 헵타데실 알코올 (C17; 1-n-헵타데카놀, 헵타데카놀) 및 스테아릴 알코올 (C18; 1-옥타데카놀) 또는 팔미트올레일 알코올 (C16 불포화; cis-9-헥사데센-1-올)임.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성 배양물 배지 (substantially anaerobic culture medium)에 존재한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 미생물 유기체는 박테리아, 호모 또는 진균 종이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 미생물 유기체는, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 함유하지 않는 대조군 미생물 유기체와 비교해, NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 10% 더 많이 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 생물 유래 화합물을 생산하기에 충분한 기간 동안 조건 하에 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함하는 본원에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 구현예에서, 배양물의 다른 성분으로부터 생물 유래 화합물을 분리하는 것을 더 포함한다. 이러한 분리를 수행하는 방법은 추출, 연속적인 액체-액체 추출, 투과증발, 막 여과, 막 분리, 역 삼투압, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 또는 한외여과를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 생물 유래 화합물을 함유한 배양물 배지를 제공하고, 이러한 생물 유래 화합물은 대기 이산화탄소 흡수원 (atmospheric carbon dioxide uptake source)을 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 동위원소 비율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 생물 유래 화합물을 제공한다. 이러한 생물 유래 화합물은, 일부 구현예에서, Fm 값이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 생물 유래 화합물 및 생물 유래 화합물 이외의 다른 화합물을 가진 조성물을 제공한다. 이러한 생물 유래 화합물 이외의 다른 화합물은, 일부 구현예에서, 생물 유래 화합물 경로를 가진 비-자연 발생 미생물 유기체의 미량의 세포 분획이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 이의 본원에 기술된 생물 유래 화합물, 세포 용해물 (cell lysate) 또는 이의 배양 상층액 (culture supernatant)을 함유한 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-자연 발생 미생물 유기체에서 NADH의 이용성을 높이는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 가진 비-자연 발생 미생물 유기체를, NADH의 이용가능성을 높이기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함한다. NADH의 이용가능성 증가는, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 증가를 달성한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-자연 발생 미생물 유기체에서 포르메이트 농도를 낮추는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 가진 비-자연 발생 미생물 유기체를 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 높이기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함한다. 비-자연 발생 미생물 유기체에서 포르메이트의 농도 감소는, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 방법에서 불순물로서 포르메이트의 저하를 달성한다.
도 1은 FDH 라이브러리 스크린에서 대조군 대 라이브러리의 성능을 도시한다.
도 2는 컨센서스 서열 (서열번호 49)을 함유한 서열번호 1과 서열번호 2의 정렬을 예시한 것이다.
본원에 기술된 주제는 원하는 생산물 (예를 들어, NADH 또는 생물 유래 화합물)을 생산하는데 유용하고 원하는 특성을 가진 효소 변이체에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 주제는 자연계에서 생성되는 야생형 포르메이트 데하이드로게나제와 비교해 상당히 다른 구조적 및/또는 기능적 특징을 가진 효소 변이체로서 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에 관한 것이다. 즉, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 자연 발생 효소가 아니다. 제공된 이러한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 원하는 생산물 (예를 들어, NADH 또는 생물 유래 화합물)을 생산하도록 조작된, 미생물 유기체와 같이, 조작된 세포에서 유용하다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 대사 경로를 가진 미생물 유기체와 같은 세포는 원하는 생산물 (예를 들어, NADH 또는 생물 유래 화합물)을 생산할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 원하는 특징을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는, 생물 유래 화합물의 생산에 포르메이트 데하이드로게나제 활성을 이용하는 대사 경로를 가진, 미생물 유기체와 같은 세포 안으로 도입될 수 있다. 이에, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 이러한 미생물 유기체와 같이 조작된 세포에 이용해 원하는 생산물을 생산할 수 있다.
관례 및 약어
약어 관례
Ala; A 알라닌
Arg; R 아르기닌
Asn; N 아스파라긴
Asp; D 아스파르트산
Cys; C 시스테인
Glu; E 글루탐산
Gln; Q 글루타민
Gly; G 글리신
His; H 히스티딘
Ile; I 이소루신
Leu; L 루신
Lys; K 라이신
Met; M 메티오닌
Phe; F 페닐알라닌
Pro; P 프롤린
Ser; S 세린
Thr; T 트레오닌
Trp; W 트립토판
Tyr; Y 티로신
Val; V 발린
FDH 포르메이트 데하이드로게나제
NAD+ 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드
NADH 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 환원됨
NADP+ 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트
NADPH 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 환원됨
Pi 포스페이트
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 언급된 값으로부터 ±10%를 의미한다. 용어 "약"은 최소 유효 자리수로 반올림하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 약 5%는 4.5% 내지 5.5%를 의미한다. 아울러, 특정 수치를 언급할 경우, 약은 또한 정확한 수치를 포함한다. 예를 들어, 약 5%는 또한 실제 5%를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이" 또는 이의 문법상 동의어는 본원에 기술된 임의의 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 사용할 경우, 출발 잔기 또는 염기 또는 참조 잔기 또는 염기를 기준으로 아미노산 잔기의 구조나 핵산 염기의 구조에서의 변화를 지칭한다. 아미노산 잔기의 변이는, 예를 들어, 하나의 아미노산이 구조적으로 다른 아미노산 잔기로의 치환, 삽입 또는 결손을 포함한다. 이러한 치환은 본원에 기술된 바와 같이 보존적인 치환, 비-보존적인 치환, 아미노산의 특정 하위-유형으로의 치환 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 염기의 변이는, 예를 들어, 하나의 자연 발생 염기를 다른 자연 발생 염기로의 변경, 예를 들어 아데닌에서 티민으로의 변경 또는 구아닌에서 사이토신으로의 변경 또는 아데닌에서 시토신으로의 변경 또는 구아닌에서 티민으로의 변경을 포함한다. 핵산 염기의 변이시, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 암호화된 아미노산 잔기 또는 기능이 달라지고, 그래서 암호화하는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 변이가 발생할 수 있다. 핵산 염기의 변이는 침묵 돌연변이라고도 알려진 바와 같이 암호화된 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 기능 또는 아미노산 서열에 변이가 생기지 않을 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물 유래"는 생물 유기체로부터 유래하거나 또는 이에 의해 합성되는 것을 의미하며, 생물 유기체에 의해 생산될 수 있으므로 재생가능한 자원으로 간주될 수 있다. 이러한 생물 유기체, 특히 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 원하는 생물 유래 화합물을 합성하기 위해 당 (예를 들어, 셀로비오스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스, 갈락토스 (예를 들어, 해양 식물 바이오메스로부터 유래한 갈락토스), 및 슈크로스), 농산물, 식물, 박테리아 또는 동물 소스로부터 수득되는 탄수화물, 및 글리세롤 (예를 들어, 바이오디젤 제조로부터 생기는 비정제 글리세롤 부산물) 등의 공급 원료 또는 바이오매스를 이용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적인 치환"은 측쇄가 비슷한 아미노산 계열 내에서 치환이 이루어지도록 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 지칭한다. 대안적으로, 용어 "비-보존적인 치환"은 치환되는 잔기가 아미노산의 한가지 계열에서 다른 계열의 잔기로 전이되도록 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것을 지칭한다. 유전자 암호화된 아미노산은 계열 4개로 나눌 수 있다: (1) 산성 (음으로 하전됨) = Asp (D), Glu (G); (2) 염기성 (양으로 하전됨) = Lys (K), Arg (R), His (H); (3) 비-극성 (소수성) = Cys (C), Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Met (M), Trp (W), Gly (G), Tyr (Y), 비-극성은 또한 다음과 같이 세분됨: (i) 강한 소수성 = Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Met (M), Phe (F); 및 (ii) 중간 수준의 소수성 = Gly (G), Pro (P), Cys (C), Tyr (Y), Trp (W); 및 (4) 비-하전된 극성 = Asn (N), Gln (Q), Ser (S), Thr (T). 대안적인 방식으로, 아미노산 레퍼토리는 다음과 같은 군으로 구분될 수있다: (1) 산성 (음으로 하전됨) = Asp (D), Glu (G); (2) 염기성 (양으로 하전됨) = Lys (K), Arg (R), His (H), (3) 지방족 = Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Ser (S), Thr (T), 여기서 Ser (S) 및 Thr (T)은 선택적으로 지방족-하이드록실로 별도로 분류됨; (4) 방향족 = Phe (F), Tyr (Y), Trp (W); (5) 아미드 = Asn (N), Glu (Q); 및 (6) 황-함유 = Cys (C) 및 Met (M) (예를 들어, Biochemistry, 4th ed., Ed. by L. Stryer, WH Freeman and Co., 1995를 참조하며, 그 전체가 원용에 의해 본원에 통합됨).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배양물 배지 (culture medium)", "배지", "증식 배지 (growth medium)" 또는 이의 문법상 동의어는 본원에 기술된 미생물 유기체와 같은 미생물을 포함한, 세포의 증식을 뒷받침하는 영양분이 함유된 액체 또는 고체 (예, 젤라틴성) 물질을 지칭한다. 증식을 뒷받침하는 영양분으로는 비-제한적으로 다음을 포함한다: 비-제한적으로, 셀로비오스, 갈락토스, 글루코스, 자일로스, 에탄올, 아세테이트, 아라비노스, 아라비톨, 소르비톨 및 글리세롤 등의 탄소를 공급하는 물질; 마그네슘, 질소, 인 및 황 등의 필수 원소를 제공하는 염; 펩톤 또는 트립톤 등의 아미노산원; 및 효모 추출물과 같은 비타민원. 배양 배지는 모든 구성성분들의 양이 알려져 있는 정의된 배지이거나, 또는 모든 구성성분들의 양이 알려져 있지 않은 비-정의된 배지일 수 있다. 배양 배지는 또한 일반적으로 선택 배지에서 발견되는, 선택 세포만 증식시킬 수 있는 물질 (예를 들어, 항생제 또는 항진균제), 또는 일반적으로 분화 또는 지표 배지에서 발견되는, 동일 배지에서 증식시 다른 것에 비해 하나의 미생물 유기체의 분화를 허용하는 물질과 같이, 증식에 필요한 영양분 이외의 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조작된" 또는 "변이체"는 본원에 언급된 임의의 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 사용될 경우, 이는 부모 서열과 비교해 아미노산 잔기 또는 핵산 염기에 하나 이상의 변이를 가진 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 아미노산 또는 핵산의 서열은 자연 발생된 것이 아니다. 아미노산 또는 핵산의 부모 서열은, 예를 들어, 야생형 서열 또는 이의 상동체, 또는 야생형 서열 또는 이의 상동체의 변형된 변이체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "외인성"은 언급된 분자 또는 언급된 활성이 숙주 미생물 유기체에 도입되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 분자는, 예를 들어, 숙주 염색체 또는 플라스미드와 같은 비-염색체성 유전 물질에의 삽입에 의해서와 같이, 암호화 핵산을 숙주 유전 물질에 도입함으로써, 도입할 수 있다. 따라서, 이 용어는, 암호화 핵산의 발현에 대해 이용된 바와 같이, 암호화 핵산을 발현가능한 형태로 미생물 유기체에 도입하는 것을 의미한다. 생합성 활성에 대해 사용될 경우, 이 용어는 숙주 참조 유기체에 도입되는 활성을 의미한다. 그 원천은, 예를 들어 숙주 미생물 유기체에 도입된 후 언급한 활성을 발현하는 상동적인 또는 이종적인 암호화 핵산일 수 있다. 이에, 용어 "내인성"은 숙주에 존재하는 참조 분자 또는 활성을 지칭한다. 마찬가지로, 이 용어는, 암호화 핵산의 발현에 대해 사용될 경우, 미생물 유기체에 내재된 암호화 핵산의 발현을 의미한다. 용어 "이종"은 참조 종 이외의 다른 소스로부터 유래하는 분자 또는 활성을 의미하고, "상동"은 숙주 미생물 유기체로부터 유래하는 분자 또는 활성을 지칭한다. 즉, 본원에 기술된 암호화 핵산의 외인성 발현은 이종적인 또는 상동적인 암호화 핵산 중 어느 하나 또는 둘다를 이용할 수 있다.
미생물 유기체가 재조합 핵산 및/또는 외인성 핵산 2종 이상을 함유할 경우, 2종 이상의 재조합 핵산 및/또는 외인성 핵산은 본원에 기술된 바와 같이 언급된 암호화 핵산 또는 생합성 활성을 지칭하는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 2종 이상의 재조합 핵산 또는 외인성 핵산은 숙주 미생물 유기체에 개별 핵산 분자로, 폴리시스트론 핵산 분자로 또는 이들의 조합으로 도입될 수 있으며, 여전히 재조합 핵산 및/또는 외인성 핵산 2종 이상으로 간주될 수 있는 것으로 또한 이해된다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 미생물 유기체는 원하는 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 2종 이상의 재조합 및/또는 외인성 핵산을 발현하도록 조작될 수 있다. 원하는 활성을 가진 효소 또는 단백질을 암호화하는 2종의 재조합 및/또는 외인성 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입할 경우, 이들 2종의 재조합 및/또는 외인성 핵산은 단일 핵산으로서, 예를 들어 단일 플라스미드 형태로 또는 분리된 플라스미드 형태로 도입될 수 있으며, 숙주 염색체에서 한곳 또는 여러 곳에 병합될 수 있으며, 여전히 외인성 핵산 2종으로 간주되는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 3종 이상의 재조합 및/또는 외인성 핵산을, 숙주 유기체에 임의의 원하는 조합으로, 예를 들어 하나의 플라스미드로, 각각의 개별 플라스미드로 도입할 수 있으며, 숙주 염색체에 한 곳 또는 여러 곳에 삽입할 수 있으며, 여전히 2 이상의 재조합 또는 외인성 핵산, 예를 들어 3종의 외인성 핵산으로 간주되는 것으로 이해된다. 즉, 언급된 재조합 또는 외인성 핵산 또는 생합성 활성의 개수는 숙주 유기체에 도입되는 개별 핵산의 개수를 지칭하는 것이 아니라, 암호화 핵산의 개수 또는 생합성 활성의 개수를 지칭한다.
용어 "Fm 값" 또는 "프렉션 모던 값 (Fraction Modern value)"은 화합물에 대해 사용될 경우 탄소-14 (14C) : 탄소-12 (12C)의 비율이다. 구체적으로, Fm 값은 식: Fm = (S-B)/(M-B)으로 계산하고, 여기서 B, S 및 M은 각각 블랭크, 샘플 및 모던 레퍼런스 (modern reference)의 14C/12C 비율이다. Fm 값은 "모던"으로부터 유래한 샘플의 14C/12C 비율의 편차 값이다. 모던은 mil 당 δ13CVPDB=-19에 대해 표준화한 NBS (National Bureau of Standard) 옥살산 I (즉, 표준 레퍼런스 물질 (SRM) 4990b)의 (AD 1950) 방사성 탄소 농도의 95%로서 정의한다 (Olsson, The use of Oxalic acid as a Standard. in, Radiocarbon Variations and Absolute Chronology, Nobel Symposium, 12th Proc., John Wiley & Sons, New York (1970)). 예를 들어, AMS로 측정한 질량 분광 측정 결과는 mil 당 δ13CVPDB=-19에 대해 표준화한 NBS 옥살산 I (SRM 4990b)의 비활성 * 0.95라는 국제적으로 합의된 정의를 이용하여 계산한다. 이는 절대 (AD 1950) 14C/12C 비율 1.176 ± 0.010 x 10-12와 등가이다 (Karlen et al., Arkiv Geofysik, 4:465-471 (1968)). 표준 계산에는 서로 간에 한가지 동위원소의 차별적인 흡수, 예를 들어, 생물 시스템의 C12 대비 C13 대비 C14의 선호적인 흡수성 (preferential uptake)이 고려되며, 이들 보정은 δ13에 대해 보정된 Fm으로서 반영된다. Fm = 0%는 물질에 탄소-14가 전혀 없으며, 즉 화석 (예, 석유계) 탄소원임을 의미하는 반면, Fm = 100%는 1950년대 이후 핵 폭발 실험으로 대기에 탄소-14가 방출된 것에 대해 보정한 이후의, 전부 모던 탄소원임을 나타낸다. 모던 탄소 (pMC)의 %는 1950년대 핵 실험 프로그램의 효력이 지속되고 있고 소멸되지 않았으므로 100% 보다 클 수 있으며, 그래서 대기에 탄소-14가 상당히 농화되어 있다. 모든 샘플의 탄소-14 활성은 "pre-bomb" 표준물질을 참조로 하고, 거의 모든 새로운 바이오베이스 생산물 (biobased product)들이 post-bomb 환경에서 만들어지므로, 모든 pMC 값들은 (동위원소 분획에 대해 보정한 후) 샘플의 진정한 바이오베이스 함량을 더 잘 반영하도록 0.95 (2010 현재)를 곱해야 한다. 바이오베이스의 함량이 103% 보다 높다는 것은 분석 에러가 발생하였거나 또는 바이오베이스의 탄소원이 수년 이상 오래되었다는 것을 의미한다. 탄소-14를 이용한 연대 측정 기법을 이용한 물질의 바이오베이스 정량법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Currie et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 172:281-287 (2000), and Colonna et al., Green Chemistry, 13:2543-2548 (2011) 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 단편"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 대해 사용된 경우, 단편의 기원이 되는 본래의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성 (예, 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및/또는 NAD+에서 NADH로의 변환 촉매) 일부 또는 전부 유지하는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 일부분을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 기능성 단편은 아미노산 약 200 내지 약 380, 약 200 내지 약 370, 약 200 내지 약 360, 약 200 내지 약 350, 약 200 내지 약 340, 약 200 내지 약 330, 약 200 내지 약 320, 약 200 내지 약 310, 약 200 내지 약 300, 약 300 내지 약 380, 약 300 내지 약 360, 약 300 내지 약 370, 약 300 내지 약 360, 약 300 내지 약 350, 약 300 내지 약 340, 약 300 내지 약 330, 약 300 내지 약 320, 약 350 내지 약 380, 약 350 내지 약 360개 길이의 아미노산 서열을 포함한다. 이들 기능성 단편은, 예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 말단 절단체 (truncation)(예를 들어, C-말단 또는 N-말단 절단체)일 수 있다. 또한, 기능성 단편은 본원에 기술된 조작된 펩타이드의 아미노산 변이와 같이 본원에 기술된 아미노산 변이를 하나 이상 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 분자 (예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 벡터) 또는 세포 (예를 들어, 효모 세포)에 대해 사용되는 경우, 참조 분자 또는 세포가 자연에서 함께 발견되는 하나 이상의 성분이 실질적으로 없는 분자 또는 세포를 지칭한다. 이 용어는 이의 천연 환경에서 함께 발견되는 성분들 중 일부 또는 전부 제거된 분자 또는 세포를 포함한다. 즉, 단리된 분자 또는 세포는, 자연에서 함께 발견되거나 또는 비-자연 발생 환경에서 함께 증식, 보관 또는 유지되는 다른 물질들로부터 부분적으로 또는 완전히 분리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미생물 (microbial)", "미생물 유기체" 또는 "미생물 (microorganism)"은 고세균, 박테리아 또는 진핵생물류 범주에 속하는 미시 세포로서 존재하는 모든 유기체를 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 이 용어는 미시 크기의 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 유기체를 망라하며, 모든 종의 박테리아, 고세균류 및 유박테리아 (eubacteria)뿐 아니라 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물을 포괄하는 것으로 의도된다. 또한, 이 용어는 생화학적으로 생산하기 위해 배양가능한 임의 종의 세포 배양물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비-자연 발생"은 본원에 기술된 미생물 유기체에 대해 사용되는 경우, 미생물 유기체가 언급된 종의 야생형 균주를 비롯해, 언급된 종의 자연 발생 균주에서 정상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변이를 가진 것을 의미하는 것으로 의도된다. 유전자 변이로는, 예를 들어, 대사 폴리펩타이드를 암호화하는 발현가능한 핵산을 도입하는 변형, 그외 핵산 부가, 핵산 결손 및/또는 미생물 유기체의 유전 물질의 기타 기능적인 파괴 등이 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 암호화 영역 및 이의 기능성 단편에서의 유전자 변이를 포함한다. 부가적인 변형으로는, 예를 들어, 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 바꾸는, 비-암호화 조절 영역을 포함한다. 대사 폴리펩타이드의 예로는 본원에 기술된 아세틸-CoA 또는 생물 유래 화합물 경로의 효소 또는 단백질 등이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산에 대해 사용되는 경우, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 다른 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 프로모터)과, 연결된 뉴클레오티드 서열이 기능 (예를 들어, 미생물 유기체에서 조작된 포르메이트 데하이드로게나제 발현)하도록 허용하는 방식으로 연결된 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "경로"는 요망하는 생산물 (예를 들어, 1,3-BDO 또는 생물 유래 화합물)의 생산에 대해 사용되는 경우, 기질 화합물이 생산물 화합물로 변환되는 것을 촉매하거나 및/또는 기질 화합물을 생산물 화합물로 변환하기 위한 공동-기질을 생산하는, 하나 이상의 폴리펩타이드 (예를 들어, 단백질 또는 효소)를 지칭한다. 이러한 생산물 화합물은 본원에 기술된 생물 유래 화합물들 중 하나이거나, 또는 대사 경로의 다른 단백질 또는 효소에 의한 추가로 변환시 생물 유래 화합물로 이어질 수 있는 중간산물 화합물일 수 있다. 즉, 대사 경로는 기질 화합물에 작용해 이를 일련의 중간산물 화합물을 통해 소정의 생산물 화합물로 변환하는 일련의 대사 폴리펩타이드들 (예를 들어, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종 또는 그 이상)로 구성될 수 있다. 대사 경로의 대사성 폴리펩타이드는 숙주 미생물 유기체에 의해 자연적으로 생산되거나 또는 본원에 기술된 바와 같이 외인성 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제)를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 등의 핵산에 대해 용어 "재조합"은, 생물 시스템에 인위적으로 공급된 핵산; 생물 시스템에서 변형된 핵산, 또는 생물 시스템에서 이의 발현 또는 조절이 조작된 핵산을 지칭한다. 재조합 핵산은 예를 들어 미생물 유기체 염색체에 또는 플라스미드와 같은 비-염색체 유전물질에 통합에 의해서와 같이 핵산을 미생물 유기체의 유전 물질에 도입함으로써, 생물 시스템에 제공될 수 있다. 미생물 유기체에 도입되거나 또는 미생물 유기체에서 발현되는 재조합 핵산은 미생물 유기체와는 다른 유기체 또는 종으로부터 유래하는 핵산일 수 있거나, 또는 합성 핵산, 또는 미생물 유기체와 동일한 유기체 또는 종에서 내인성으로 또한 발현되는 핵산일 수 있다. 미생물 유기체와 동일한 유기체 또는 종에서 내인성으로 또한 발현되는 재조합 핵산은, 만일 재조합 핵산의 서열이 내인성으로 발현되는 서열에 비해 변형되거나, 핵산의 발현을 통제하는 프로모터와 같은 조절 영역의 서열이 내인성으로 발현되는 서열의 조절 영역에 비해 변형되거나, 핵산이 내인성으로 발현되는 서열에 비해 미생물 유기체의 게놈에서 대안적인 위치에서 발현되거나, 핵산이 내인성으로 발현되는 서열에 비해 미생물 유기체에서 다른 카피 수로 발현되거나, 및/또는 핵산이 미생물 유기체에서 플라스미드와 같은 비-염색체 유전 물질로 발현된다면, 이종의 것으로 간주할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산에 대해 사용되는 경우, 연결된 오픈 리딩 프래임 (예를 들어, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)의 전사가 RNA 중합효소에 의해 개시되게 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터 서열은 전사 개시 부위의 5' 말단에 또는 바로 상류에 위치할 수 있다. RNA 중합효소 및 필수 전사 인자들이 프로모터 서열에 결합하여 전사를 개시시킨다. 프로모터 서열은 전사 방향을 정의하며, 전사할 DNA 가닥, 즉 센스 가닥을 가리킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 혐기성"은 배양 또는 증식 조건에 대해 사용되는 경우, 액체 매질의 용존 산소량이 포화도의 약 10% 미만임을 의미하는 것으로 의도된다. 또한, 이 용어는 산소가 약 1% 미만인 분위기로 유지되는 액체 또는 고체 배지가 든 밀폐된 챔버를 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 미생물 유기체를 형질전이, 형질전환 또는 감염시켜 미생물 유기체가 미생물 유기체에 천연적인 것 이외의 다른 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 유발하거나 또는 세포에 천연적이지 않은 방식으로 발현하도록 유발하는, 화합물 및/또는 조성물을 지칭한다. 벡터는 미생물 유기체에서 기능하는 ("발현 벡터") 발현 통제 서열 (예를 들어, 프로모터)과 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 본원에 기술된 조작된 FDH와 같이 하나 이상의 생합성 경로 효소 또는 단백질을 함유하도록 제작될 수 있다. 본원에 기술된 미생물 유기체에 이용하기 위해 활용가능한 발현 벡터로는, 예를 들어, 숙주 염색체로의 안정적인 통합에 작동가능한 선택 서열 또는 마커 및 벡터를 포함한, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체 등이 있다. 또한, 발현 벡터는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자와 적절한 발현 통제 서열을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대해 내성을 제공하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나 또는 배양 배지에 없는 중요한 영양분을 공급하는, 선별가능한 마커 유전자도 포함될 수 있다. 발현 조절 서열은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 구성적인 프로모터, 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결인자 등을 포함할 수 있다. 2 이상의 재조합 또는 외인성 암호화 핵산을 공동-발현할 경우, 이들 2종의 핵산은, 예를 들어, 단일한 발현 벡터에 또는 개별 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 하나의 벡터에서 발현하는 경우, 하나의 공통적인 발현 통제 서열을 암호화 핵산에 작동가능하게 연결하거나 또는 유도 프로모터 하나 및 구성적인 프로모터 하나 등의 서로 다른 발현 통제 서열에 작동가능하게 연결할 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 참여하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 재조합 또는 외인성 핵산 서열의 형질전환은 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 검증할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들어, mRNA의 노던 블롯 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭과 같은 핵산 분석, 또는 유전자 산물 발현에 대한 면역블롯팅, 또는 도입된 핵산 또는 이의 대응되는 유전자 산물 (예를 들어, 효소 또는 단백질)의 발현을 검사하기에 적합한 기타 분석 방법 등이 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 재조합 또는 외인성 핵산은 원하는 생산물을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 것으로 이해되며, 또한 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법 및 본원에 기술된 방법을 이용해 충분한 발현을 달성하도록 발현 수준을 최적화할 수 있음을 알 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 예시된 대사 변형을 포함한 유전자 변이가, E. coli와 같은 적절한 미생물 유기체 및 이의 대응되는 대사 반응 또는 원하는 대사 경로를 위한 유전자 등의 바람직한 유전 물질에 적합한 소스 유기체에 대해서 설명됨을, 이해할 것이다. 그러나, 매우 다양한 유기체들에서 전체 게놈 서열 분석 및 게놈학 분야의 높은 기술 수준을 감안하면, 당해 기술 분야의 당업자라면 본원에 기술된 교시 내용 및 지침을 기본적으로 다른 모든 유기체들에도 쉽게 적용할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 본원에 예시된 E. coli의 대사 변이는 언급된 종이 아닌 다른 종 유래의 동일한 또는 유사한 암호화 핵산을 통합함으로써, 다른 종에도 쉽게 적용할 수 있다. 이러한 유전자 변이로는, 예를 들어 일반적으로 종 상동체 (species homolog)의 유전자 변이 등이 있으며, 특히 오르소로그 (ortholog), 파라로그 (paralog) 또는 비-오르소로그 유전자 치환 (non-orthologous gene displacement)을 포함한다.
오르소로그는, 수직 직계 (vertical descent) 관계이면서 여러 유기체들에서 실질적으로 동일하거나 또는 상동한 기능을 담당하는, 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들어, 마우스 에폭사이드 하이드롤라제와 인간 에폭사이드 하이드롤라제는 에폭사이드의 가수분해라는 생물학적 기능 측면에서 오르소로그로 간주할 수 있다. 예를 들어, 유전자들이 상동적이거나 또는 공통 조상으로부터 진화적으로 관련있는 것으로 보기에 충분한 서열 유사성을 공유한 경우, 이들 유전자들은 수직 직계 관계이다. 또한, 유전자가, 3차 구조를 공유하지만, 1차 서열 유사성이 확인불가한 수준으로 공통 조상으로부터 진화된 것임을 의미하는 충분한 수준의 서열 유사성을 반드시 가지고 있지 않은 경우에도, 오르소로그로 간주할 수 있다. 오르소로그 유전자들은 아미노산 서열 동일성 약 25% 내지 100%의 서열 유사성을 가진 단백질을 암호화할 수 있다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유한 단백질을 암호화하는 유전자들 역시, 이들의 3차원 구조에 유사성이 있다면, 수직 직계에 의해 생겨난 것으로 간주할 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성인자 및 엘라스타제 등의 세린 프로테아제 계열 효소에 속하는 구성원들은 공통 조상으로부터 수직 직계에 의해 생겨난 것으로 간주한다.
오르소로그는, 예를 들어, 진화를 통해 구조적으로 또는 전체 활성 측면에서 분화된 유전자 또는 이에 의해 암호화된 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 어떤 종이 2가지 기능을 가진 유전자 산물을 암호화하고 있으며 이러한 기능이 제2의 종에서 별개의 유전자들로 분리되어 있다면, 이들 유전자 3종과 이의 대응되는 산물은 오르소로그로 간주한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 생화학적 생산물 생산시, 비-자연 발생 미생물 유기체를 구축하기 위해 도입 또는 파괴시킬 대사 활성을 가지고 있는 오르소로그 유전자를 선택해야 함을, 알 것이다. 분리가능한 활성들을 가진 오르소로그의 예는, 개개 활성이 2 이상의 종들에서 또는 단일한 종에서 별개의 유전자 산물들로 분리되어 있는 경우이다. 구체적인 예는, 세린 프로테아제 활성을 가진 2가지 타입, 즉 엘라스타제 단백질 분해 활성과 플라스미노겐 단백질 분해 활성이, 플라스미노겐 활성인자 및 엘라스타제로서 개별 분자로 분리된 경우이다. 두 번째 예는, 마이코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 드로소필라 DNA 중합효소 III 활성이 분리된 경우이다. 첫 번째 종 유래의 DNA 중합효소는, 2번째 종 유래의 엑소뉴클레아제 또는 중합효소 중 어느 하나 또는 이들 둘다에 대해 오르소로그인 것으로 간주할 수 있으며, 그 역도 성립될 수 있다.
이와는 반대로, 파라로그는, 예를 들어, 복제 및 이후 진화적 분화 관계에 있는 상동체이며, 기능이 유사하거나 또는 공통적이지만, 동일한 것은 아니다. 파라로그는, 예를 들어, 동일 종 또는 다른 종으로부터 기원하거나 또는 유래할 수 있다. 예를 들어, 마이크로솜 에폭사이드 하이드롤라제 (에폭사이드 하이드롤라제 I)와 용해성 에폭사이드 하이드롤라제 (에폭사이드 하이드롤라제 II)는, 이들이 별개의 반응을 촉매하고 동일 종에서 다른 기능을 가지고 있는, 공통 조상으로부터 함께 진화된 2종의 별개의 효소이므로, 파라로그로 간주할 수 있다. 파라로그는 서로 유의미한 수준의 서열 유사성을 가진 동일한 종으로부터 유래한 단백질들이므로, 이들은 상동적이거나 또는 공통 조상으로부터 함께 진화된 관계임을 의미한다. 파라로그 단백질 계열 그룹으로는 HipA 상동체, 루시퍼라제 유전자, 펩티다제 등이 있다.
비-오르소로그 유전자 치환 (nonorthologous gene displacement)은 어떤 종 유래의 비-오르소로그 유전자가 다른 종에서 언급된 유전자의 기능을 치환할 수 있는 것을 의미한다. 치환은, 예를 들어 여러가지 종들에서 언급된 기능과 비교해, 기원 종에서 동일하거나 또는 유사한 작용을 실질적으로 수행할 수 있는 것을 포함한다. 일반적으로, 비-오르소로그 유전자 치환은 언급된 기능을 코딩하는 공지된 유전자와 구조적으로 관련있는 것으로 구분할 수 있지만, 구조적으로 관련성이 낮지만 기능적으로 유사한 유전자 및 이의 유전자 산물도 그럼에도 불구하고 여전히 본 발명에 사용되는 용어의 의미에 포함될 것이다. 기능 유사성에는, 예를 들어 치환하고자 하는 기능을 암호화하는 유전자에 대해, 비-오르소로그 유전자 산물의 활성부 또는 결합부에서 어느 정도 이상의 구조 유사성이 요구된다. 따라서, 비-오르소로그 유전자는 예를 들어 파라로그 또는 비-관련 유전자 (unrelated gene)를 포괄한다.
이에, 원하는 산물에 대해 생합성 능력을 가진 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체를 동정하고 구축함에 있어, 당해 기술 분야의 당업자는, 본 발명에 제공된 교시 내용 및 지침을 특정 종에 적용하여, 대사 변형의 식별이 오르소로그의 동정 및 이의 함유 또는 불활성화를 망라할 수 있음을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 또한, 파라로그 및/또는 비-오르소로그 유전자 치환이, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 언급된 미생물 유기체에 존재하는 한, 진화 관계의 유전자들을 이용할 수 있다. 마찬가지로, 유전자 파괴의 경우, 진화 관계의 유전자들도 파괴 표적이 되는 효소 활성들의 기능적 중복 (functional redundancy)을 줄이거나 또는 없애기 위해 미생물 유기체에서 파괴 또는 제거될 수 있다.
오르소로그, 파라로그 및 비-오르소로그 유전자 치환은 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 2종의 폴리펩타이드에 대해 핵산 또는 아미노산 서열을 조사함으로써, 비교 서열들 간의 서열 동일성 및 유사성을 확인한다. 이러한 유사성을 토대로, 당해 기술 분야의 당업자는 이들 단백질들이 공통 조상으로부터 진화된 관계임을 의미할 만큼 유사성이 충분히 높은지 결정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자들에게 널리 공지된 알고리즘, 예를 들어 Align, BLAST, Clustal W 등으로 원 (raw) 서열의 유사성 또는 동일성을 비교 및 확인하고, 또한, 서열에서 갭의 존재나 유의 수준을 결정하여, 가중치 (weight) 또는 스코어를 할당할 수 있다. 이들 알고리즘은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 동일성 결정에 마찬가지로 적용가능하다. 관계 (relatedness)를 정할 만큼 충분한 유사성에 대한 매개변수들은, 널리 공지된 통계학적 유사성 계산법, 또는 랜덤 폴리펩타이드에서 유사한 매칭을 발견할 확률, 그리고 확인된 매칭의 유의 수준을 토대로 산출한다. 2 이상 서열들에 대한 전산적인 비교는, 또한, 필요한 경우, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 시각적으로 최적화될 수 있다. 관련 유전자 산물 또는 단백질은 높은 유사성, 예를 들어 25% 내지 100%의 서열 동일성을 가진 것으로 볼 수 있다. 비-관련 단백질은, 충분한 크기의 데이터베이스를 검색한다면, 우연히 발생할 것으로 예상되는 수준 (약 5%)과 기본적으로 동일한, 동일성을 가질 수 있다. 5% 내지 24% 사이의 서열은, 비교되는 서열들이 관련성이 있다고 판단할 만큼 충분한 상동성을 보이거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 데이터세트의 크기를 감안해 이러한 매칭의 유의 수준을 결정하기 위한 추가적인 통계학적 분석을 수행하여, 이들 서열들의 관련성을 결정할 수 있다.
BLAST 알고리즘을 이용해 2 이상의 서열들의 관계를 확인하기 위한 매개변수의 예는, 예를 들어 아래에 기술된 바와 같을 수 있다. 간략하게는, 아미노산 서열 정렬은 BLASTP 버전 2.0.8 (1999년 1월 5일) 및 하기의 매개변수들을 적용해 수행할 수 있다: 매트릭스: 0 BLOSUM62; 갭 오픈 (gap open): 11; 갭 연장 (gap extension): 1; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 문자 크기: 3; 필터: 온 (on). 뉴클레오티드 서열 정렬은 BLASTN 버전 2.0.6 (1998년 9월 16일) 및 하기의 매개변수들을 적용해 수행할 수 있다: 매치: 1; 미스매치: -2; 갭 오픈: 5; 갭 연장: 2; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 문자 크기: 11; 필터: 오프. 당해 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 비교시 엄격성을 높이거나 또는 낮추고, 2 이상의 서열의 관계를 정하기 위해, 상기한 매개변수에 어떤 변화를 가할 수 있음을 알 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 야생형 또는 부모 포르메이트 데하이드로게나제의 변이체로서 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 제공한다. 이러한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 본원에 기술된 하나 이상의 변이와 본원에 기술된 바와 같이 야생형 또는 부모 포르메이트 데하이드로게나제에 대해 더 높은 촉매 활성을 가진다. 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및/또는 NAD+에서 NAD로의 변환을 촉매할 수 있다. 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에 의해 촉매되는 예시적인 효소 반응은 다음과 같이 표시된다:
이에, 일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 깁시엘라 퀘르시네칸스 (Gibbsiella quercinecans)(UniprotID: A0A250B5N7; 서열번호 1)로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 칸디다 보이디니 (Candida boidinii)(UniprotID: O13437; 서열번호 2)로부터 유래한다. 이러한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는, 일부 구현예에서, 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유한다. 이러한 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 깁시엘라 퀘르시네칸스 (UniprotID: A0A250B5N7; 서열번호 1) 및/또는 칸디다 보이디니 (UniprotID: O13437; 서열번호 2)의 포르메이트 데하이드로게나제와 동일한 반응을 촉매하는 효소로 분류될 수 있다. 이에, 일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 탄소 다이옥사이드 및/또는 NADH의 생성을 촉매할 수 있다. 기타 구현예는 서열번호 3-24 중 어느 하나를 비롯하여, 표 1에 열거된 임의의 포르메이트 데하이드로게나제로부터 선택 또는 유래하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 제공한다. 이러한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는, 일부 구현예에서, 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 대응하는 위치에서 하나 이상의 변이를 포함한다. 이러한 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 1에 나열된 포르메이트 데하이드로게나제 중 하나 이상과 동일한 반응을 촉매하는 효소로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 변이체 또는 이의 기능성 단편을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 제공하며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에서 하나 이상의 변이를 가진다. 일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이러한 변이를 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는: (a) 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 촉매할 수 있거나; (b) NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있거나; 또는 (c) 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있다. 이에, 일부 구현예에서, 이러한 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있다.
본원에 기술된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 포르메이트 데하이드로게나제의 폴리펩타이드 변이체 등의 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 전술한 바와 같이 부모 포르메이트 데하이드로게나제와 유사한 효소 반응을 수행할 수 있는 것으로 이해된다. 포르메이트 데하이드로게나제 효소의 폴리펩타이드 변이체는, 비-제한적으로, 활성 증가 등의 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에 유익한 특징을 제공하는 변이체를 포함할 수 있는 것으로 추가로 이해된다 (예를 들어, 실시예 6 참조). 일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 야생형 또는 부모 포르메이트 데하이드로게나제와 적어도 동일하거나 또는 더 높은 활성을 발휘할 수 있으며, 즉 동일한 아미노산 위치(들)에 변이가 없는 포르메이트 데하이드로게나제보다 더 높은 활성을 가진다. 예를 들어, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 야생형 또는 부모 포르메이트 데하이드로게나제에 비해 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.8, 적어도 0.9, 적어도 1.0, 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.1, 적어도 2.2, 적어도 2.3, 적어도 2.4, 적어도 2.5, 적어도 2.6, 적어도 2.7, 적어도 2.8, 적어도 2.9, 적어도 3.0, 적어도 3.5, 적어도 4.0, 적어도 4.5, 적어도 5.0, 적어도 5.5, 적어도 6.0, 적어도 6.5, 적어도 7.0, 적어도 7.5, 적어도 8.0, 적어도 8.5, 적어도 9.0, 적어도 9.5, 적어도 10 또는 심지어 더 높은 활성을 가질 수 있다 (예를 들어, 실시예 6 참조). 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성된 포르메이트 데하이드로게나제의 활성보다 적어도 0.5, 적어도 1.0, 적어도 1.5 또는 적어도 2.0배 높은 활성을 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 적어도 0.5배 더 높은 활성을 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 적어도 1.0배 더 높은 활성을 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 적어도 1.5배 더 높은 활성을 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 적어도 2.0배 높은 활성을 가진다. 활성은 본원에 기술된 바와 같이 동일한 분석 조건 하에 야생형 또는 부모 포르메이트 데하이드로게나제를 기준으로, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 기질을 생산물로 변환하는 능력을 지칭하는 것으로 이해된다 (예를 들어, 실시예 6 참조).
일부 구현예에서, 본원에 기술된 포르메이트 데하이드로게나제의 활성은 촉매 상수 (kcat) 값 또는 턴오버수 (turnover number)로 측정한다. 일부 구현예에서, kcat는 적어도 0.1 s-1, 적어도 0.2 s-1, 적어도 0.3 s-1, 적어도 0.4 s-1, 적어도 0.5 s-1, 적어도 0.6 s-1, 적어도 0.7 s-1, 적어도 0.8 s-1, 적어도 0.9 s-1, 적어도 1 s-1, 적어도 2 s-1, 적어도 3 s-1, 적어도 4 s-1, 적어도 5 s-1, 적어도 6 s-1, 적어도 7 s-1, 적어도 8 s-1, 적어도 9 s-1, 적어도 10 s-1, 적어도 11 s-1, 적어도 12 s-1, 적어도 13 s-1, 적어도 14 s-1, 적어도 15 s-1, 적어도 16 s-1, 적어도 17 s-1, 적어도 18 s-1, 적어도 19 s-1, 적어도 20 s-1, 적어도 21 s-1, 적어도 22 s-1, 적어도 23 s-1, 적어도 24 s-1, 적어도 25 s-1, 적어도 26 s-1, 적어도 27 s-1, 적어도 28 s-1, 적어도 29 s-1, 적어도 30 s-1, 적어도 31 s-1, 적어도 32 s-1, 적어도 33 s-1, 적어도 34 s-1, 적어도 35 s-1, 적어도 36 s-1, 적어도 37 s-1, 적어도 38 s-1, 적어도 39 s-1, 적어도 40 s-1, 적어도 41 s-1, 적어도 42 s-1, 적어도 43 s-1, 적어도 44 s-1, 적어도 45 s-1, 적어도 46 s-1, 적어도 47 s-1, 적어도 48 s-1, 적어도 49 s-1, 적어도 50 s-1, 적어도 51 s-1, 적어도 52 s-1, 적어도 53 s-1, 적어도 54 s-1, 적어도 55 s-1, 적어도 56 s-1, 적어도 57 s-1, 적어도 58 s-1, 적어도 59 s-1, 적어도 60 s-1, 적어도 61 s-1, 적어도 62 s-1, 적어도 63 s-1, 적어도 64 s-1, 적어도 65 s-1, 적어도 66 s-1, 적어도 67 s-1, 적어도 68 s-1, 적어도 69 s-1, 적어도 70 s-1, 적어도 71 s-1, 적어도 72 s-1, 적어도 73 s-1, 적어도 74 s-1, 적어도 75 s-1, 적어도 76 s-1, 적어도 77 s-1, 적어도 78 s-1, 적어도 79 s-1, 적어도 80 s-1, 적어도 81 s-1, 적어도 82 s-1, 적어도 83 s-1, 적어도 84 s-1, 적어도 85 s-1, 적어도 86 s-1, 적어도 87 s-1, 적어도 88 s-1, 적어도 89 s-1, 적어도 90 s-1, 적어도 91 s-1, 적어도 92 s-1, 적어도 93 s-1, 적어도 94 s-1, 적어도 95 s-1, 적어도 96 s-1, 적어도 97 s-1, 적어도 98 s-1, 적어도 99 s-1, 적어도 100 s-1, 적어도 500 s-1, 적어도 1000 s-1, 적어도 2000 s-1, 적어도 3000 s-1, 적어도 4000 s-1, 적어도 5000 s-1, 적어도 6000 s-1, 적어도 7000 s-1, 적어도 8000 s-1, 적어도 9000 s-1, 적어도 10,000 s-1이고, 일부 구현예에서, Kcat는 1 s-1 내지 100 s-1, 5 s-1 내지 50 s-1 또는 10 s-1 내지 50 s-1이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 포르메이트 데하이드로게나제의 활성은 미하엘리스 상수 (Km)로 측정한다. 일부 구현예에서, Km은 0.005 mM 미만, 0.006 mM 미만, 0.007 mM 미만, 0.008 mM 미만, 0.009 mM 미만, 0.01 mM 미만, 0.02 mM 미만, 0.03 mM 미만, 0.04 mM 미만, 0.05 mM 미만, 0.06 mM 미만, 0.07 mM 미만, 0.08 mM 미만, 0.09 mM 미만, 0.1 mM 미만, 0.2 mM 미만, 0.3 mM 미만, 0.4 mM 미만, 0.5 mM 미만, 0.6 mM 미만, 0.7 mM 미만, 0.8 mM 미만, 0.9 mM 미만, 1 mM 미만, 2 mM 미만, 3 mM 미만, 4 mM 미만, 5 mM 미만, 6 mM 미만, 7 mM 미만, 8 mM 미만, 9 mM 미만, 10 mM 미만, 11 mM 미만, 12 mM 미만, 13 mM 미만, 14 mM 미만, 15 mM 미만, 16 mM 미만, 17 mM 미만, 18 mM 미만, 19 mM 미만, 20 mM 미만, 21 mM 미만, 22 mM 미만, 23 mM 미만, 24 mM 미만, 25 mM 미만, 26 mM 미만, 27 mM 미만, 28 mM 미만, 29 mM 미만, 30 mM 미만, 31 mM 미만, 32 mM 미만, 33 mM 미만, 34 mM 미만, 35 mM 미만, 36 mM 미만, 37 mM 미만, 38 mM 미만, 39 mM 미만, 40 mM 미만, 41 mM 미만, 42 mM 미만, 43 mM 미만, 44 mM 미만, 45 mM 미만, 46 mM 미만, 47 mM 미만, 48 mM 미만, 49 mM 미만, 50 mM 미만, 51 mM 미만, 52 mM 미만, 53 mM 미만, 54 mM 미만, 55 mM 미만, 56 mM 미만, 57 mM 미만, 58 mM 미만, 59 mM 미만, 60 mM 미만, 61 mM 미만, 62 mM 미만, 63 mM 미만, 64 mM 미만, 65 mM 미만, 66 mM 미만, 67 mM 미만, 68 mM 미만, 69 mM 미만, 70 mM 미만, 71 mM 미만, 72 mM 미만, 73 mM 미만, 74 mM 미만, 75 mM 미만, 76 mM 미만, 77 mM 미만, 78 mM 미만, 79 mM 미만, 80 mM 미만, 81 mM 미만, 82 mM 미만, 83 mM 미만, 84 mM 미만, 85 mM 미만, 86 mM 미만, 87 mM 미만, 88 mM 미만, 89 mM 미만, 90 mM 미만, 91 mM 미만, 92 mM 미만, 93 mM 미만, 94 mM 미만, 95 mM 미만, 96 mM 미만, 97 mM 미만, 98 mM 미만, 99 mM 미만, 100 mM 미만, 500 mM 미만 또는 1000 mM 미만이며, 일부 구현예에서, Km은 0.005 mM 내지 0.010 mM, 0.5 mM 내지 10 mM, 1 mM 내지 10 mM, 2 mM 내지 10 mM, 3 mM 내지 10 mM, 4 mM 내지 10 mM, 5 mM 내지 10 mM, 6 mM 내지 10 mM, 7 mM 내지 10 mM, 8 mM 내지 10 mM 또는 9 mM 내지 10 mM이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 포르메이트 데하이드로게나제의 활성은 촉매 효율 (kcat/km)로서 측정한다. 일부 구현예에서, 촉매 효율은 ℓ/(밀리몰*초) 단위로 측정한다. 일부 구현예에서, 촉매 효율은 0.1 초과, 0.2 초과, 0.3 초과, 0.4 초과, 0.5 초과, 0.6 초과, 0.7 초과, 0.8 초과, 0.9 초과, 1 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과, 6 초과, 7 초과, 8 초과, 9 초과, 10 초과, 11 초과, 12 초과, 13 초과, 14 초과, 15 초과, 16 초과, 17 초과, 18 초과, 19 초과, 20 초과, 21 초과, 22 초과, 23 초과, 24 초과, 25 초과, 26 초과, 27 초과, 28 초과, 29 초과, 30 초과, 31 초과, 32 초과, 33 초과, 34 초과, 35 초과, 36 초과, 37 초과, 38 초과, 39 초과, 40 초과, 41 초과, 42 초과, 43 초과, 44 초과, 45 초과, 46 초과, 47 초과, 48 초과, 49 초과, 50 초과, 51 초과, 52 초과, 53 초과, 54 초과, 55 초과, 56 초과, 57 초과, 58 초과, 59 초과, 60 초과, 61 초과, 62 초과, 63 초과, 64 초과, 65 초과, 66 초과, 67 초과, 68 초과, 69 초과, 70 초과, 71 초과, 72 초과, 73 초과, 74 초과, 75 초과, 76 초과, 77 초과, 78 초과, 79 초과, 80 초과, 81 초과, 82 초과, 83 초과, 84 초과, 85 초과, 86 초과, 87 초과, 88 초과, 89 초과, 90 초과, 91 초과, 92 초과, 93 초과, 94 초과, 95 초과, 96 초과, 97 초과, 98 초과, 99 초과, 100 초과, 500 초과, 1000 초과이다. 일부 구현예에서, 촉매 효율 (kcat/km)은 1 내지 30 ℓ/(밀리몰*초), 5 내지 30 ℓ/(밀리몰*초), 1 내지 10 ℓ/(밀리몰*초), 10 내지 30 ℓ/(밀리몰*초) 또는 20 내지 30 ℓ/(밀리몰*초)이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 참조 폴리펩타이드의 변이체이고, 여기서 참조 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며; 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1 또는 서열번호 2를 기준으로 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 가진다. 이에, 일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1의 변이체이고, 서열번호 1을 기준으로 표 6에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 가진다. 일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 2의 변이체이고, 서열번호 2를 기준으로 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 가진다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 가진 서열번호 1 또는 서열번호 2의 변이체로서 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 표 6 및/또는 표 7에 기술된 하나 이상의 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 참조되는 아미노산 서열에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지거나 또는 동일하다. 이에, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 1, 3 및/또는 4에 기술된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 65% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 70% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 75% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 85% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 65% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 70% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 75% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 85% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가지며, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 99% 동일하다.
서열 동일성, 상동성 또는 유사성은 폴리펩타이드 2종 또는 핵산 분자 2종 간의 서열 유사성을 지칭한다. 동일성은 비교 목적으로 정렬할 수 있는 각 서열에서 위치를 비교함으로써 결정할 수 있다. 비교 서열들에서 한 위치에 동일한 염기 또는 아미노산이 존재할 경우, 그 분자는 그 위치에서 동일한 것이다. 서열들 간의 상동성 정도는 서열들에 공유된 매칭되거나 또는 상동적인 위치의 개수에 대한 함수이다. 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역 (또는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역)이 다른 서열에 대해 특정 % (예를 들어, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 가진다는 것은, 정렬하였을 때 아미노산 (또는 뉴클레오티드 염기)의 %가 서열 2종의 비교에서 동일한 것을 의미한다. 이들 서열 동일성 %를 결정하기 위한 서열 2종의 정렬은 예를 들어 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램을 이용해 수행할 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 매개변수가 정렬시 적용된다. 사용될 수 있는 당해 기술 분야에 잘 알려진 정렬 프로그램 하나는 디폴트 매개변수로 설정된 BLAST이다. 특히, 프로그램은 다음과 같은 디폴트 매개변수를 이용한 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기술 = 서열 50종; 분류 = 고 점수; 데이터베이스 = 비-중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램에 대한 상세 내용은 National Center for Biotechnology Information에서 확인할 수 있다 (Altschul et al., " J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) 참조).
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1에서 위치 2, 9, 16, 19, 27, 29, 30, 41, 53, 73, 97, 98, 100, 101, 120, 121, 122, 123, 124, 128, 138, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 155, 175, 176, 191, 196, 198, 199, 203, 204, 206, 217, 218, 224, 231, 238, 256, 262, 264, 265, 266, 267, 269, 271, 284, 285, 287, 290, 291, 297, 301, 303, 313, 315, 319, 325, 329, 335, 336, 338, 339, 342, 343, 346, 350, 355, 365, 374, 381, 382 또는 384, 또는 이들의 조합에 대해 대응하는 위치에 아미노산 치환 하나 이상을 가진다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1에서 위치 2, 9, 16, 19, 27, 29, 30, 41, 53, 73, 97, 98, 100, 101, 120, 121, 122, 123, 124, 128, 138, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 155, 175, 176, 191, 196, 198, 199, 203, 204, 206, 217, 218, 224, 231, 238, 256, 262, 264, 265, 266, 267, 269, 271, 284, 285, 287, 290, 291, 297, 301, 303, 313, 315, 319, 325, 329, 335, 336, 338, 339, 342, 343, 346, 350, 355, 365, 374, 381, 382 또는 384, 또는 이들의 조합에 대해 대응하는 위치에 아미노산 치환 하나 이상을 가진다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1에서 위치 2, 9, 16, 19, 27, 29, 30, 41, 53, 73, 97, 98, 101, 120, 122, 124, 138, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 155, 175, 176, 191, 198, 199, 204, 206, 217, 218, 231, 238, 256, 262, 264, 265, 266, 267, 269, 271, 284, 285, 287, 290, 291, 297, 301, 303, 313, 319, 325, 329, 335, 336, 338, 339, 342, 346, 350, 355, 365, 374, 381, 382 또는 384, 또는 이들의 조합에 대해 대응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환 하나 이상을 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1에서 위치 2, 98, 199, 206, 231, 266 또는 381, 또는 이들의 조합에 대해 대응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환 하나 이상을 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1에서 위치 9, 16, 19, 27, 29, 30, 41, 53, 73, 97, 98, 101, 120, 122, 124, 138, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 155, 175, 176, 191, 198, 199, 204, 217, 218, 231, 238, 256, 262, 264, 265, 266, 267, 269, 271, 284, 285, 287, 290, 291, 297, 301, 303, 313, 319, 325, 329, 335, 336, 338, 339, 342, 346, 350, 355, 365, 374, 381, 382 또는 384, 또는 이들의 조합에 대해 대응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환 하나 이상을 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 2에서 위치 36, 64, 80, 91, 97, 111, 120, 162, 164, 187, 188, 214, 229, 256, 257, 260, 312, 313, 315, 320, 323, 361 또는 362, 또는 이들의 조합에 대해 대응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환 하나 이상을 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 2에서 위치 36, 64, 80, 111, 120, 162, 214, 229, 260, 315, 320 또는 361, 또는 이들의 조합에 대해 대응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환 하나 이상을 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유하며, 여기서 하나 이상의 아미노산 변이는 보존적인 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이에 대해 하나 이상의 보존적인 아미노산 치환을 함유한다. 비-제한적인 예로, 서열번호 1에서 C231A 치환에 대한 보존적인 아미노산 치환으로는 다른 비-극성 (소수성) 아미노산 (예를 들어, Cys (C), Ala (A), Val (V), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Met (M), Trp (W), Gly (G) 또는 Tyr (Y))의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유하며, 여기서 하나 이상의 아미노산 변이는 비-보존적인 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 열거된 바와 같이 아미노산 1-10곳에서 보존적인 아미노산 치환 및/또는 비-보존적인 아미노산 치환을 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 1-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 2-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 3-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 4-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 5-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 6-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 7-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 8-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 9-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 10-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 15-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 20-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 30-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 40-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 45-50곳, 또는 이들 범위에 망라되는 임의 개수의 위치들에 보존적인 아미노산 치환을 추가로 함유할 수 있으며, 이들 위치는 표 6 및/또는 표 7에 열거된 변이체 아미노산 위치 이외의 다른 곳이다. 일부 측면에서, 이러한 보존적인 아미노산 서열은 화학적으로 보존적인 또는 진화적으로 보존적인 아미노산 치환이다. 보존적인 아미노산을 식별하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이중 임의의 방법을 이용해 본원에 기술된 단리된 폴리펩타이드를 구축할 수 있다.
본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 야생형 또는 부모 포르메이트 데하이드로게나제에 대해 변이를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249 또는 250개 포함할 수 있다. 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 야생형 또는 부모 포르메이트 데하이드로게나제에 대해 변이를 최대 1, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 최대 14, 최대 15, 최대 16, 최대 17, 최대 18, 최대 19, 최대 20, 최대 21, 최대 22, 최대 23, 최대 24, 최대 25, 최대 26, 최대 27, 최대 28, 최대 29, 최대 30, 최대 31, 최대 32, 최대 33, 최대 34, 최대 35, 최대 36, 최대 37, 최대 38, 최대 39, 최대 40, 최대 41, 최대 42, 최대 43, 최대 44, 최대 45, 최대 46, 최대 47, 최대 48, 최대 49, 최대 50, 최대 51, 최대 52, 최대 53, 최대 54, 최대 55, 최대 56, 최대 57, 최대 58, 최대 59, 최대 60, 최대 61, 최대 62, 최대 63, 최대 64, 최대 65, 최대 66, 최대 67, 최대 68, 최대 69, 최대 70, 최대 71, 최대 72, 최대 73, 최대 74, 최대 75, 최대 76, 최대 77, 최대 78, 최대 79, 최대 80, 최대 81, 최대 82, 최대 83, 최대 84, 최대 85, 최대 86, 최대 87, 최대 88, 최대 89, 최대 90, 최대 91, 최대 92, 최대 93, 최대 94, 최대 95, 최대 96, 최대 97, 최대 98, 최대 99, 최대 100, 최대 101, 최대 102, 최대 103, 최대 104, 최대 105, 최대 106, 최대 107, 최대 108, 최대 109, 최대 110, 최대 111, 최대 112, 최대 113, 최대 114, 최대 115, 최대 116, 최대 117, 최대 118, 최대 119, 최대 120, 최대 121, 최대 122, 최대 123, 최대 124, 최대 125, 최대 126, 최대 127, 최대 128, 최대 129, 최대 130, 최대 131, 최대 132, 최대 133, 최대 134, 최대 135, 최대 136, 최대 137, 최대 138, 최대 139, 최대 140, 최대 141, 최대 142, 최대 143, 최대 144, 최대 145, 최대 146, 최대 147, 최대 148, 최대 149, 최대 150, 최대 151, 최대 152, 최대 153, 최대 154, 최대 155, 최대 156, 최대 157, 최대 158, 최대 159, 최대 160, 최대 161, 최대 162, 최대 163, 최대 164, 최대 165, 최대 166, 최대 167, 최대 168, 최대 169, 최대 170, 최대 171, 최대 172, 최대 173, 최대 174, 최대 175, 최대 176, 최대 177, 최대 178, 최대 179, 최대 180, 최대 181, 최대 182, 최대 183, 최대 184, 최대 185, 최대 186, 최대 187, 최대 188, 최대 189, 최대 190, 최대 191, 최대 192, 최대 193, 최대 194, 최대 195, 최대 196, 최대 197, 최대 198, 최대 199, 최대 200, 최대 201, 최대 202, 최대 203, 최대 204, 최대 205, 최대 206, 최대 207, 최대 208, 최대 209, 최대 210, 최대 211, 최대 212, 최대 213, 최대 214, 최대 215, 최대 216, 최대 217, 최대 218, 최대 219, 최대 220, 최대 221, 최대 222, 최대 223, 최대 224, 최대 225, 최대 226, 최대 227, 최대 228, 최대 229, 최대 230, 최대 231, 최대 232, 최대 233, 최대 234, 최대 235, 최대 236, 최대 237, 최대 238, 최대 239, 최대 240, 최대 241, 최대 242, 최대 243, 최대 244, 최대 245, 최대 246, 최대 247, 최대 248, 최대 249 또는 최대 250개 포함할 수 있다. 하나 이상의 변이는 표 6 및/또는 표 7에 열거된 하나 이상의 위치에 해당하는 하나 이상의 위치에 위치할 수 있다. 하나 이상의 변이는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 하나 이상의 위치에 해당하는 하나 이상의 위치에 위치할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "서열번호 Y의 X 위치에 해당하는 잔기"는 서열 2종을 정렬한 후 대응하는 위치에 있는 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 서열번호 2의 잔기는 서열번호 2의 203 위치에 있는 A (Ala)이다 (예를 들어, 도 2). 일부 구현예에서, 참조 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2가 아닌 포르메이트 데하이드로게나제이다.
본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 열거된 변이들의 임의 조합을 함유할 수 있다. 하나의 변이 단독 또는 변이들의 조합은 참조 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 (천연) 포르메이트 데하이드로게나제에 대해 본원에 기술된 활성을 유지 또는 개선하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 기재된 바와 같은 변이를, 표 1 및/또는 2에서 식별된 위치들 전부에서의 변이를 비롯하여, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 열거된 바와 같은 변이를 적어도 2개 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 열거된 바와 같은 변이를 적어도 3개 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 열거된 바와 같은 변이를 적어도 4개 함유한다.
일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 하나 이상의 변이는 표 6에 기재된 변이이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A; b) 서열번호 1의 9번 위치에 해당하는 잔기에 F; c) 서열번호 1의 16번 위치에 해당하는 잔기에 Y; d) 서열번호 1의 19번 위치에 해당하는 잔기에 K 또는 S; e) 서열번호 1의 27번 위치에 해당하는 잔기에 K, E, N, A, T 또는 V; f) 서열번호 1의 29번 위치에 해당하는 잔기에 G, E, K, N, D, A, T 또는 S; g) 서열번호 1의 30번 위치에 해당하는 잔기에 G, S, A, R 또는 H; h) 서열번호 1의 41번 위치에 해당하는 잔기에 K; i) 서열번호 1의 53번 위치에 해당하는 잔기에 A; j) 서열번호 1의 73번 위치에 해당하는 잔기에 V; k) 서열번호 1의 97번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 T; l) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 W, S, T 또는 R; m) 서열번호 1의 100번 위치에 해당하는 잔기에 A; n) 서열번호 1의 101번 위치에 해당하는 잔기에 F; o) 서열번호 1의 120번 위치에 해당하는 잔기에 C, G, A, V, H, I, S, F 또는 Q; p) 서열번호 1의 121번 위치에 해당하는 잔기에 R; q) 서열번호 1의 122번 위치에 해당하는 잔기에 S; r) 서열번호 1의 123번 위치에 해당하는 잔기에 A; s) 서열번호 1의 124번 위치에 해당하는 잔기에 T, A, V; t) 서열번호 1의 128번 위치에 해당하는 잔기에 N, M 또는 S; u) 서열번호 1의 138번 위치에 해당하는 잔기에 D; v) 서열번호 1의 143번 위치에 해당하는 잔기에 W 또는 Y; w) 서열번호 1의 144번 위치에 해당하는 잔기에 I, C, S, A, N 또는 T; x) 서열번호 1의 145번 위치에 해당하는 잔기에 P 또는 S; y) 서열번호 1의 146번 위치에 해당하는 잔기에 Q, N, G, P, Y, A, T, D, S, H 또는 V; z) 서열번호 1의 147번 위치에 해당하는 잔기에 A, L, V 또는 C; aa) 서열번호 1의 149번 위치에 해당하는 잔기에 G, A, T 또는 V; bb) 서열번호 1의 150번 위치에 해당하는 잔기에 T, G, R, D, N, S, Q, E, V 또는 L; cc) 서열번호 1의 151번 위치에 해당하는 잔기에 A, C 또는 T; dd) 서열번호 1의 152번 위치에 해당하는 잔기에 A; ee) 서열번호 1의 153번 위치에 해당하는 잔기에 T; ff) 서열번호 1의 155번 위치에 해당하는 잔기에 F; gg) 서열번호 1의 175번 위치에 해당하는 잔기에 R, I, V, A, T 또는 E; hh) 서열번호 1의 176번 위치에 해당하는 잔기에 S; ii) 서열번호 1의 191번 위치에 해당하는 잔기에 L; jj) 서열번호 1의 196번 위치에 해당하는 잔기에 V; kk) 서열번호 1의 198번 위치에 해당하는 잔기에 I; ll) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V; mm) 서열번호 1의 203번 위치에 해당하는 잔기에 H; nn) 서열번호 1의 204번 위치에 해당하는 잔기에 V; oo) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q; pp) 서열번호 1의 217번 위치에 해당하는 잔기에 V; qq) 서열번호 1의 218번 위치에 해당하는 잔기에 T, N, R, A, E, K, G, H, R, D, S 또는 Q; rr) 서열번호 1의 224번 위치에 해당하는 잔기에 R; ss) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 D, A, K, R, V, I, L, T, Y 또는 E; tt) 서열번호 1의 238번 위치에 해당하는 잔기에 T, R, V, Q 또는 E; uu) 서열번호 1의 256번 위치에 해당하는 잔기에 I, C, L, A, S, H, T, V 또는 E; vv) 서열번호 1의 262번 위치에 해당하는 잔기에 E 또는 S; ww) 서열번호 1의 264번 위치에 해당하는 잔기에 E; xx) 서열번호 1의 265번 위치에 해당하는 잔기에 N 또는 H; yy) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L; zz) 서열번호 1의 267번 위치에 해당하는 잔기에 F; aaa) 서열번호 1의 269번 위치에 해당하는 잔기에 D 또는 E; bbb) 서열번호 1의 271번 위치에 해당하는 잔기에 L 또는 M; ccc) 서열번호 1의 284번 위치에 해당하는 잔기에 S, C, M, L, I, V 또는 A; ddd) 서열번호 1의 285번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 G; eee) 서열번호 1의 287번 위치에 해당하는 잔기에 A; fff) 서열번호 1의 290번 위치에 해당하는 잔기에 I; ggg) 서열번호 1의 291번 위치에 해당하는 잔기에 D; hhh) 서열번호 1의 297번 위치에 해당하는 잔기에 R, V, G, N, D, K, E, A 또는 Q; iii) 서열번호 1의 301번 위치에 해당하는 잔기에 S, A, D, E 또는 N; jjj) 서열번호 1의 303번 위치에 해당하는 잔기에 K; kkk) 서열번호 1의 313번 위치에 해당하는 잔기에 Y; lll) 서열번호 1의 315번 위치에 해당하는 잔기에 E 또는 Y; mmm) 서열번호 1의 319번 위치에 해당하는 잔기에 R, P, E, V, A 또는 K; nnn) 서열번호 1의 325번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S; ooo) 서열번호 1의 329번 위치에 해당하는 잔기에 H 또는 N; ppp) 서열번호 1의 335번 위치에 해당하는 잔기에 A, M, R, V, N, T, L, S 또는 Y; qqq) 서열번호 1의 336번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 G; rrr) 서열번호 1의 338번 위치에 해당하는 잔기에 Y, F, W, S, D, V, A, L 또는 N; sss) 서열번호 1의 339번 위치에 해당하는 잔기에 T, L, G, 또는 A; ttt) 서열번호 1의 342번 위치에 해당하는 잔기에 K, L, A, V, I, N, Y, T, E, S, M, R, C 또는 D; uuu) 서열번호 1의 343번 위치에 해당하는 잔기에 A; vvv) 서열번호 1의 346번 위치에 해당하는 잔기에 A, M, I, L 또는 F; www) 서열번호 1의 350번 위치에 해당하는 잔기에 A; xxx) 서열번호 1의 355번 위치에 해당하는 잔기에 E; yyy) 서열번호 1의 365번 위치에 해당하는 잔기에 D, E 또는 P; zzz) 서열번호 1의 374번 위치에 해당하는 잔기에 E, G, A, R, H, Q 또는 K; aaaa) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 H, K, L, P 또는 R; bbbb) 서열번호 1의 382번 위치에 해당하는 잔기에 S; 및/또는 cccc) 서열번호 1의 384번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 T.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A; b) 서열번호 1의 9번 위치에 해당하는 잔기에 F; c) 서열번호 1의 16번 위치에 해당하는 잔기에 Y; d) 서열번호 1의 19번 위치에 해당하는 잔기에 K 또는 S; e) 서열번호 1의 27번 위치에 해당하는 잔기에 K, E, N, A, T 또는 V; f) 서열번호 1의 29번 위치에 해당하는 잔기에 G, E, K, N, D, A, T 또는 S; g) 서열번호 1의 30번 위치에 해당하는 잔기에 G, S, A, R 또는 H; h) 서열번호 1의 41번 위치에 해당하는 잔기에 K; i) 서열번호 1의 53번 위치에 해당하는 잔기에 A; j) 서열번호 1의 73번 위치에 해당하는 잔기에 V; k) 서열번호 1의 97번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 T; l) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 W, R 또는 T; m) 서열번호 1의 101번 위치에 해당하는 잔기에 F; n) 서열번호 1의 120번 위치에 해당하는 잔기에 G, A, H, S, F, Q, C, V 또는 I; o) 서열번호 1의 122번 위치에 해당하는 잔기에 S; p) 서열번호 1의 124번 위치에 해당하는 잔기에 T, A, V; q) 서열번호 1의 138번 위치에 해당하는 잔기에 D; r) 서열번호 1의 144번 위치에 해당하는 잔기에 N, I, C, S, A 또는 T; s) 서열번호 1의 145번 위치에 해당하는 잔기에 P 또는 S; t) 서열번호 1의 146번 위치에 해당하는 잔기에 P, D, V, Q, N, G, Y, A, T, S 또는 H; u) 서열번호 1의 147번 위치에 해당하는 잔기에 V, L, C, A; v) 서열번호 1의 150번 위치에 해당하는 잔기에 G, R, D, N, S, Q, E, L, T 또는 V; w) 서열번호 1의 151번 위치에 해당하는 잔기에 T, A 또는 C; x) 서열번호 1의 155번 위치에 해당하는 잔기에 F; y) 서열번호 1의 175번 위치에 해당하는 잔기에 R, I, V, A, T 또는 E; z) 서열번호 1의 176번 위치에 해당하는 잔기에 S; aa) 서열번호 1의 191번 위치에 해당하는 잔기에 L; bb) 서열번호 1의 198번 위치에 해당하는 잔기에 I; cc) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V; dd) 서열번호 1의 204번 위치에 해당하는 잔기에 V; ee) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q; ff) 서열번호 1의 217번 위치에 해당하는 잔기에 V; gg) 서열번호 1의 218번 위치에 해당하는 잔기에 T, N, R, A, E, K, G, H, D, S 또는 Q; hh) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 D, A, K, R, V, I, L, T, Y 또는 E; ii) 서열번호 1의 238번 위치에 해당하는 잔기에 T, R, V, Q 또는 E; jj) 서열번호 1의 256번 위치에 해당하는 잔기에 I, C, L, H, T, V, E, A 또는 S; kk) 서열번호 1의 262번 위치에 해당하는 잔기에 E 또는 S; ll) 서열번호 1의 264번 위치에 해당하는 잔기에 E; mm) 서열번호 1의 265번 위치에 해당하는 잔기에 N 또는 H; nn) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L; oo) 서열번호 1의 267번 위치에 해당하는 잔기에 F; pp) 서열번호 1의 269번 위치에 해당하는 잔기에 D 또는 E; qq) 서열번호 1의 271번 위치에 해당하는 잔기에 L 또는 M; rr) 서열번호 1의 284번 위치에 해당하는 잔기에 L, I, V, S, C, M 또는 A; ss) 서열번호 1의 285번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 G; tt) 서열번호 1의 287번 위치에 해당하는 잔기에 A; uu) 서열번호 1의 290번 위치에 해당하는 잔기에 I; vv) 서열번호 1의 291번 위치에 해당하는 잔기에 D; ww) 서열번호 1의 297번 위치에 해당하는 잔기에 R, V, G, N, D, K, E, A 또는 Q; xx) 서열번호 1의 301번 위치에 해당하는 잔기에 S, A, D, E 또는 N; yy) 서열번호 1의 303번 위치에 해당하는 잔기에 K; zz) 서열번호 1의 313번 위치에 해당하는 잔기에 Y; aaa) 서열번호 1의 319번 위치에 해당하는 잔기에 R, P, E, V, A 또는 K; bbb) 서열번호 1의 325번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S; ccc) 서열번호 1의 329번 위치에 해당하는 잔기에 H 또는 N; ddd) 서열번호 1의 335번 위치에 해당하는 잔기에 R, S, A, M, V, N, T, L 또는 Y; eee) 서열번호 1의 336번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 G; fff) 서열번호 1의 338번 위치에 해당하는 잔기에 Y, F, W, L, S, D, V, A 또는 N; ggg) 서열번호 1의 339번 위치에 해당하는 잔기에 L, G, A, T; hhh) 서열번호 1의 342번 위치에 해당하는 잔기에 K, L, V, I, N, Y, T, E, M, R, D, A, S 또는 C; iii) 서열번호 1의 346번 위치에 해당하는 잔기에 M, A, I, L 또는 F; jjj) 서열번호 1의 350번 위치에 해당하는 잔기에 A; kkk) 서열번호 1의 355번 위치에 해당하는 잔기에 E; lll) 서열번호 1의 365번 위치에 해당하는 잔기에 D, E 또는 P; mmm) 서열번호 1의 374번 위치에 해당하는 잔기에 E, G, A, R, H, Q 또는 K; nnn) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 P, H, K, L 또는 R; ooo) 서열번호 1의 382번 위치에 해당하는 잔기에 S; 및/또는 ppp) 서열번호 1의 384번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 T.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A; b) 서열번호 1의 9번 위치에 해당하는 잔기에 F; c) 서열번호 1의 16번 위치에 해당하는 잔기에 Y; d) 서열번호 1의 19번 위치에 해당하는 잔기에 K 또는 S; e) 서열번호 1의 27번 위치에 해당하는 잔기에 K, E, N, A, T 또는 V; f) 서열번호 1의 29번 위치에 해당하는 잔기에 G, E, K, N, D, A, T 또는 S; g) 서열번호 1의 30번 위치에 해당하는 잔기에 G, S, A, R 또는 H; h) 서열번호 1의 41번 위치에 해당하는 잔기에 K; i) 서열번호 1의 53번 위치에 해당하는 잔기에 A; j) 서열번호 1의 73번 위치에 해당하는 잔기에 V; k) 서열번호 1의 97번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 T; l) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 T; m) 서열번호 1의 101번 위치에 해당하는 잔기에 F; n) 서열번호 1의 120번 위치에 해당하는 잔기에 C, V 또는 I; o) 서열번호 1의 122번 위치에 해당하는 잔기에 S; p) 서열번호 1의 124번 위치에 해당하는 잔기에 V; q) 서열번호 1의 138번 위치에 해당하는 잔기에 D; r) 서열번호 1의 144번 위치에 해당하는 잔기에 I, C, S, A 또는 T; s) 서열번호 1의 145번 위치에 해당하는 잔기에 S; t) 서열번호 1의 146번 위치에 해당하는 잔기에 Q, N, G, Y, A, T, S 또는 H; u) 서열번호 1의 147번 위치에 해당하는 잔기에 A; v) 서열번호 1의 150번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 V; w) 서열번호 1의 151번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 C; x) 서열번호 1의 155번 위치에 해당하는 잔기에 F; y) 서열번호 1의 175번 위치에 해당하는 잔기에 R, I, V, A, T 또는 E; z) 서열번호 1의 176번 위치에 해당하는 잔기에 S; aa) 서열번호 1의 191번 위치에 해당하는 잔기에 L; bb) 서열번호 1의 198번 위치에 해당하는 잔기에 I; cc) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V; dd) 서열번호 1의 204번 위치에 해당하는 잔기에 V; ee) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q; ff) 서열번호 1의 217번 위치에 해당하는 잔기에 V; gg) 서열번호 1의 218번 위치에 해당하는 잔기에 T, N, R, A, E, K, G, H, D, S 또는 Q; hh) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 D, A, K, R, V, I, L, T, Y 또는 E; ii) 서열번호 1의 238번 위치에 해당하는 잔기에 T, R, V, Q, 또는 E; jj) 서열번호 1의 256번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 S; kk) 서열번호 1의 262번 위치에 해당하는 잔기에 E 또는 S; ll) 서열번호 1의 264번 위치에 해당하는 잔기에 E; mm) 서열번호 1의 265번 위치에 해당하는 잔기에 N 또는 H; nn) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L; oo) 서열번호 1의 267번 위치에 해당하는 잔기에 F; pp) 서열번호 1의 269번 위치에 해당하는 잔기에 D 또는 E; qq) 서열번호 1의 271번 위치에 해당하는 잔기에 L 또는 M; rr) 서열번호 1의 284번 위치에 해당하는 잔기에 S, C, M, 또는 A; ss) 서열번호 1의 285번 위치에 해당하는 잔기에 G; tt) 서열번호 1의 287번 위치에 해당하는 잔기에 A; uu) 서열번호 1의 290번 위치에 해당하는 잔기에 I; vv) 서열번호 1의 291번 위치에 해당하는 잔기에 D; ww) 서열번호 1의 297번 위치에 해당하는 잔기에 R, V, G, N, D, K, E, A 또는 Q; xx) 서열번호 1의 301번 위치에 해당하는 잔기에 S, A, D, E, 또는 N; yy) 서열번호 1의 303번 위치에 해당하는 잔기에 K; zz) 서열번호 1의 313번 위치에 해당하는 잔기에 Y; aaa) 서열번호 1의 319번 위치에 해당하는 잔기에 R, P, E, V, A 또는 K; bbb) 서열번호 1의 325번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S; ccc) 서열번호 1의 329번 위치에 해당하는 잔기에 H 또는 N; ddd) 서열번호 1의 335번 위치에 해당하는 잔기에 S, A, M, V, N, T, L 또는 Y; eee) 서열번호 1의 336번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 G; fff) 서열번호 1의 338번 위치에 해당하는 잔기에 S, D, V, A 또는 N; ggg) 서열번호 1의 339번 위치에 해당하는 잔기에 T; hhh) 서열번호 1의 342번 위치에 해당하는 잔기에 A, S 또는 C; iii) 서열번호 1의 346번 위치에 해당하는 잔기에 I, L, 또는 F; jjj) 서열번호 1의 350번 위치에 해당하는 잔기에 A; kkk) 서열번호 1의 355번 위치에 해당하는 잔기에 E; lll) 서열번호 1의 365번 위치에 해당하는 잔기에 D, E 또는 P; mmm) 서열번호 1의 374번 위치에 해당하는 잔기에 E, G, A, R, H, Q, 또는 K; nnn) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 H, K, L 또는 R; ooo) 서열번호 1의 382번 위치에 해당하는 잔기에 S; 및/또는 ppp) 서열번호 1의 384번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 T.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A; b) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 T; c) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V; d) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q; e) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 A, K, R, T, E, Y, V, I 또는 L; f) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L; 및/또는 g) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 P, K, L, R 또는 H.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A; b) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 T; c) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V; d) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q; e) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 V, I 또는 L; f) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L; 및/또는 g) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 H.
일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 하나 이상의 변이는 표 7에 기재된 변이이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K; b) 서열번호 2의 64번 위치에 해당하는 잔기에 V; c) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E; d) 서열번호 2의 91번 위치에 해당하는 잔기에 S; e) 서열번호 2의 97번 위치에 해당하는 잔기에 N; f) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T; g) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I; h) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L; i) 서열번호 2의 164번 위치에 해당하는 잔기에 V; j) 서열번호 2의 187번 위치에 해당하는 잔기에 G; k) 서열번호 2의 188번 위치에 해당하는 잔기에 C; l) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T; m) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 V, T 또는 C; n) 서열번호 2의 256번 위치에 해당하는 잔기에 C; o) 서열번호 2의 257번 위치에 해당하는 잔기에 G 또는 S; p) 서열번호 2의 260번 위치에 해당하는 잔기에 G; q) 서열번호 2의 312번 위치에 해당하는 잔기에 V, F, 또는 T; r) 서열번호 2의 313번 위치에 해당하는 잔기에 G 또는 A; s) 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C 또는 S; t) 서열번호 2의 320번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S; u) 서열번호 2의 323번 위치에 해당하는 잔기에 M; v) 서열번호 2의 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; 및/또는 w) 서열번호 2의 362번 위치에 해당하는 잔기에 K.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K; b) 서열번호 2의 64번 위치에 해당하는 잔기에 V; c) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E; d) 서열번호 2의 91번 위치에 해당하는 잔기에 S; e) 서열번호 2의 97번 위치에 해당하는 잔기에 N; f) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T; g) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I; h) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L; i) 서열번호 2의 164번 위치에 해당하는 잔기에 V; j) 서열번호 2의 187번 위치에 해당하는 잔기에 G; k) 서열번호 2의 188번 위치에 해당하는 잔기에 C; l) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T; m) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 C; n) 서열번호 2의 256번 위치에 해당하는 잔기에 C; o) 서열번호 2의 257번 위치에 해당하는 잔기에 G 또는 S; p) 서열번호 2의 260번 위치에 해당하는 잔기에 G; q) 서열번호 2의 312번 위치에 해당하는 잔기에 V, F, 또는 T; r) 서열번호 2의 313번 위치에 해당하는 잔기에 G 또는 A; s) 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C; t) 서열번호 2의 320번 위치에 해당하는 잔기에 S; u) 서열번호 2의 323번 위치에 해당하는 잔기에 M; v) 서열번호 2의 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; 및/또는 w) 서열번호 2의 362번 위치에 해당하는 잔기에 K.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K; b) 서열번호 2의 64번 위치에 해당하는 잔기에 V; c) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E; d) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T; e) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I; f) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L; g) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T; h) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 V, T 또는 C; i) 서열번호 2의 260번 위치에 해당하는 잔기에 G; j) 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C 또는 S; k) 서열번호 2의 320번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S; 및/또는 l) 서열번호 2의 361번 위치에 해당하는 잔기에 R.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K; b) 서열번호 2의 64번 위치에 해당하는 잔기에 V; c) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E; d) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T; e) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I; f) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L; g) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T; h) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 C; i) 서열번호 2의 260번 위치에 해당하는 잔기에 G; j) 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C; k) 서열번호 2의 320번 위치에 해당하는 잔기에 S; 및/또는 l) 서열번호 2의 361번 위치에 해당하는 잔기에 R.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변이는 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성한다: a) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 H; b) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q 및 231번 위치에 해당하는 잔기에 I; c) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I; d) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q 및 231번 위치에 해당하는 잔기에 V; e) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 및 266번 위치에 해당하는 잔기에 L; f) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q 및 231번 위치에 해당하는 잔기에 L; g) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A; h) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 T; i) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 V 및 266번 위치에 해당하는 잔기에 M; j) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; k) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; l) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 T 및 260번 위치에 해당하는 잔기에 G; m) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; n) 서열번호 2의 36, 162, 214 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 각각 K, L, T 및 R; o) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; p) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I 및 320번 위치에 해당하는 잔기에 S; q) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; r) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T 및 162번 위치에 해당하는 잔기에 L; s) 서열번호 2의 111, 162 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 각각 T, L 및 R; t) 서열번호 2의 64, 162, 214 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 각각 V, L, T 및 R; 또는 u) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 C 및 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C.
일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 하나 이상의 변이는 서열번호 24와 동일한 아미노산 서열을 생성하지 않는다. 이에, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 아미노산 서열은 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성되지 않는다. 그러나, 일부 구현예에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 3-24를 비롯하여, 표 1에 기술된 바와 같이 서열번호 1 및 2의 상동체의 변이체이다. 이러한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 해당하는 위치에 하나 이상의 변이를 함유한다.
본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 구축 및 분석하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법에 대한 예는 실시예 1 - 8에 기술되어 있다. 본원에 개시된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 구축하기 위해 다양한 임의의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법으로는 비-제한적으로 부위-특이적인 돌연변이 유발, 랜덤 돌연변이 유발, 조합 라이브러리 (combinatorial libraries) 및 기타 본원에 기술된 돌연변이 유발 방법 등이 있다 (예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999); Gillman et al., Directed Evolution Library Creation: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Springer, 2nd ed (2014) 참조). 비-제한적인 예로, 당해 기술 분야의 당업자라면, 표적 서열을 본원에 기술된 정렬을 이용해 서열 정렬을 수행하고; QuikChange (Agilent, Santa Clara, CA), Q5® 부위-특이적인 돌연변이 유발 키트 (New England BioLabs, Ipswich, MA) 또는 QuikChange HT 단백질 조작 시스템 (Agilent, Santa Clara, CA) 등의 부위-특이적인 돌연변이 유발 키트를 이용해 요망하는 변이를 구축하고; DNA 서열분석으로 새로운 돌연변이를 검증한 다음 실시예 1 - 8에 기술된 바와 같이 요망하는 생물 유래 화합물 경로를 가진 새로운 변이체를 세포용해물 또는 생체내 생산 분석으로 분석함으로써, 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 해당하는 위치에 하나 이상의 변이를 가진 서열번호 3-24 등의 서열번호 1 및 2의 상동체를 이용해 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 구축할 수 있을 것이다. 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 제조하는 방법에 대한 비-제한적인 일 예는 박테리아 세포, 효모 세포 또는 기타 적절한 세포 등의 적절한 미생물 유기체에서 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용해 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 발현시키는 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 단리된 포르메이트 데하이드로게나제이다. 본원에 제공된 단리된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 당해 기술 분야에 잘 알려진 다양한 방법에 의해, 예를 들어 재조합 발현 시스템, 석출, 겔 여과, 이온-교환, 역상 및 친화성 크로마토그래피 등에 의해 단리할 수 있다. 그외 잘 알려진 방법들이 Deutscher et al., Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology, Vol. 182, (Academic Press, (1990))에 기술되어 있다. 대안적으로, 본 발명의 단리된 폴리펩타이드는 잘 알려진 재조합 방법을 이용해 수득할 수 있다 (예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) 참조). 본원에 기술된 폴리펩타이드를 생화학적으로 정제하는 방법 및 조건은 당해 기술 분야의 당업자들이 선택할 수 있으며, 예를 들어 기능성 분석으로 정제를 모니터링할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진 재조합 핵산을 제공한다. 이에, 일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산 분자로서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 표 1 및/또는 표 2에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 포함하는 것인, 핵산 분자; (b) (a)의 단리된 핵산에 고 엄격 혼성화 조건 하에 혼성하는 재조합 핵산; 및 (c) (a) 또는 (b)에 상보적인 재조합 핵산로부터 선택되는 재조합 핵산을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산으로서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 가진, 재조합 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 단리된 핵산에 대해 고 엄격 혼성화 조건 하에 혼성하는 재조합 핵산을 제공한다. 이에, 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산에 고 엄격 혼성화 조건 하에 혼성하는 단리된 핵산이다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산에 고 엄격 혼성화 조건 하에 혼성하는 단리된 핵산이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 서열번호 1 또는 2의 변이체로서 아미노산 서열을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 참조되는 아미노산 서열에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지거나 또는 동일하다. 이에, 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 65% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 70% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 75% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 85% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 6에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 1에 대해 적어도 99% 동일하다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 65% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 70% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 75% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 85% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 98% 동일하다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변이를 함유한 아미노산 서열을 가진 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하고, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에서 표 7에 기재된 변이 이외의 다른 부분은 서열번호 2에 대해 적어도 99% 동일하다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하되, 여기서 하나 이상의 아미노산 변이는 보존적인 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하되, 여기서 하나 이상의 아미노산 변이는 비-보존적인 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 바와 같이 아미노산 위치 1-10곳에 보존적인 아미노산 치환 및/또는 비-보존적인 아미노산 치환을 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 아미노산 위치 1-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 2-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 3-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 4-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 5-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 6-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 7-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 8-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 9-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 10-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 15-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 20-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 30-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 40-50곳, 또는 대안적으로 아미노산 위치 45-50곳 또는 이들 범위에 속하는 임의 개수의 위치들에 보존적인 아미노산 치환을 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하되, 여기서 이들 위치는 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이체 아미노산 위치 이외의 다른 위치이다. 일부 측면에서, 이러한 보존적인 아미노산 서열은 화학적으로 보존적인 또는 진화적으로 보존적인 아미노산 치환이다. 보존적인 아미노산을 식별하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이중 임의의 방법을 이용해 본원에 기술된 단리된 폴리펩타이드를 구축할 수 있다.
본원에 제공된 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이들의 임의 조합을 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화할 수 있다. 하나의 변이 단독 또는 변이들의 조합은 참조 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 (천연) 포르메이트 데하이드로게나제에 대해 본원에 기술된 활성을 유지 또는 개선하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 만들 수 있다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에서 식별되는 최대 모든 위치들에서의 변이를 비롯하여, 표 1, 2, 3, 및/또는 4에 열거된 바와 같이 변이를 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 2개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 3개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 4개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 5개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 6개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 7개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 8개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 9개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 표 6 및/또는 표 7에 기재된 변이를 적어도 10개 함유한 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한 재조합 핵산을 제공한다. 이러한 프로모터는 본원에 기술된 바와 같이 미생물 유기체에서 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 재조합 핵산을 함유한 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 2중 가닥 DNA를 포함한다.
본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산은 또한 개시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 혼성하는 핵산 또는 본원에 개시된 핵산에 혼성하는 핵산을 함유한다. 혼성화 조건은 본원에 기술된 조건과 같이 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 고 엄격, 중간 엄격 또는 전 엄격 혼성화 조건을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본원에 기술된 조성물 및 방법에 이용될 수 있는 재조합 핵산은 본원에 개시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 혼성하는 핵산 또는 본원에 개시된 핵산에 특정한 서열 동일성 %를 가진 것으로 기술될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 본원에 기술된 뉴클레오티드에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지거나 또는 동일할 수 있다.
엄격한 혼성화는 혼성된 폴리뉴클레오티드들이 안정적인 조건을 의미한다. 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 바와 같이, 혼성된 폴리뉴클레오티드의 안정성은 하이브리드의 용융 온도 (Tm)로 반영된다. 일반적으로, 혼성된 폴리뉴클레오티드의 안정성은 염 농도, 예를 들어 소듐 이온 농도 및 온도에 따라 달라진다. 혼성화 반응은 저 엄격성 조건에서 수행한 다음 조건을 달리하여, 그러나 엄격성이 더 높은 조건에서 세척하여 수행할 수 있다. 혼성화의 엄격성에 대한 언급은 세척 조건에 관한 것이다. 고 엄격성 혼성화는 65℃ 및 0.018M NaCl 중에서 안정적으로 혼성된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 핵산 서열만 혼성화되게 하는 조건을 포함하며, 예를 들어, 하이브리드가 65℃, 0.018M NaCl 중에 안정적이지 않다면, 본원에서 간주되는 바와 같이 고 엄격성 조건에서 안정적이지 않을 것이다. 고 엄격성 조건은, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5X 덴하르트 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS 및 42℃에서 혼성한 다음 0.1X SSPE 및 0.1% SDS에서 65℃ 하에 세척함으로써, 제공될 수 있다. 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열을 기술하는데 있어 고 엄격 혼성화 조건 이외의 다른 혼성화 조건도 이용될 수 있다. 예를 들어, 중간 엄격성 혼성화 (moderately stringent hybridization)라는 표현은 50% 포름아미드, 5X 덴하르트 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS 및 42℃에서 혼성한 다음 0.2X SSPE 및 0.2% SDS에서 42℃ 하에 세척하는 조건과 균등한 조건을 의미한다. 낮은 엄격 혼성화라는 표현은 10% 포름아미드, 5X 덴하르트 용액, 6X SSPE, 0.2% SDS 및 22℃에서 혼성한 다음 1X SSPE 및 0.2% SDS에서 37℃ 하에 세척하는 조건과 균등한 조건을 의미한다. 덴하르트 용액은 1% Ficoll, 1% 폴리비닐피롤리돈 및 1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함한다. 20X SSPE (소듐 클로라이드, 소듐 포스페이트, 에틸렌 다이아민 테트라아세트산 (EDTA))는 3M 소듐 클로라이드, 0.2M 소듐 포스페이트 및 0.025 M (EDTA)를 포함한다. 그외 적합한, 저, 중간 및 고 엄격성 혼성화 완충제 및 조건들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)에 기술되어 있다.
본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산은 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 특정한 서열 동일성을 가질 수 있다. 이에, 본원에 기술된 일부 측면에서, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산은 본원에 개시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 혼성하는 핵산 또는 본원에 개시된 핵산에 대해, 동일하거나 또는 적어도 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한, 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본원에 기술된 재조합 핵산 또는 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에는 야생형 부모 서열에서, 예를 들어 서열번호 1 또는 2 등의 부모 서열이 배제될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 자연계에서 발견되는 아미노산 서열을 배제할 수 있다. 이에, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 핵산 또는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는, 암호화된 아미노산 서열이 야생형 부모 서열 또는 자연 발생 아미노산 서열이 아니거나 및/또는 뉴클레오티드 서열이 야생형 또는 자연 발생 뉴클레오티드 서열이 아닌 한, 본원에 기술된 바와 같다. 당해 기술 분야의 당업자는 자연 발생 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 자연계에서 발견되는 바와 같이 자연 발생 유기체에서 발견되는 서열에 대한 것으로 이해할 것이다. 이에, 동일한 상태로 발견되지 않거나 또는 자연 발생 유기체에서와 동일한 뉴클레오티드 또는 암호화된 아미노산 서열을 가진 것으로 발견되지 않은 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은, 본원에 기술된 재조합 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열의 의미에 포함된다. 예를 들어, 본원에 기술된 변이체를 비롯하여, 부모 서열과 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치에서 변이된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은, 자연 발생이 아닌 본원에 기술된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 의미에 포함된다. 본원에 기술된 재조합 핵산은 뉴클레오티드 서열을 함유한 자연 발생 염색체를 배제하고, DNA 결합 단백질과 같은 자연 발생 세포에서 발견되는 바와 같은 다른 분자, 예를 들어 진핵생물 세포 내 염색체에 결합하는 히스톤 등의 단백질을 또한 배제할 수 있다.
이에, 본원에 기술된 재조합 핵산은 자연 발생 핵산과 비교되는 물질적 및 화학적 차이를 가진다. 본원에 기술된 재조합 또는 비-자연 발생 핵산은 자연에서 발견되는 자연 발생 핵산의 공유 결합 또는 비-공유 결합과 같은 화학 결합들 중 일부 또는 전부 함유하지 않거나 또는 본질적으로 가지지 않는다. 본원에 기술된 재조합 핵산은, 따라서, 예를 들어, 염색체에서 발견되는 자연 발생 핵산과는 다른 화학적 구조를 가짐으로써 자연 발생 핵산과 차이를 가진다. 예를 들어, 자연 발생 염색체로부터 재조합 핵산을 해리하는 포스포다이에스테르 결합을 절단함으로써, 상이한 화학적 구조가 생길 수 있다. 본원에 기술된 재조합 핵산은 또한 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 염색체 DNA에 결합하는 단백질로부터 핵산을 단리 또는 분리함으로써 자연 발생 핵산과 달라질 수 있으며, 따라서 서로 다른 비-공유 결합으로 인해 자연 발생 핵산과 상이할 수 있다. 원핵생물 기원의 핵산과 관련하여, 본원에 기술된 비-자연 발생 핵산은 염색체의 자연 발생 화학 결합들 중 일부 또는 전부, 예를 들어 중합효소 또는 염색체 구조 단백질과 같은 DNA 결합 단백질에의 결합을 반드시 가지지 않거나, 또는 슈퍼코일드형과 같은 고차 구조가 아니다. 진핵생물 기원의 핵산과 관련하여, 본원에 기술된 비-자연 발생 핵산은 또한 동일한 내부 핵산 화학 결합 또는 염색질에서 발견되는 구조 단백질과의 화학 결합을 포함하지 않는다. 예를 들어, 본원에 기술된 비-자연 발생 핵산은 히스톤 또는 스캐폴드 단백질이 화학적으로 결합되어 있지 않으며, 센트로미어 또는 텔로미어 내에 함유되지 않는다. 즉, 본원에 기술된 비-자연 발생 핵산은, 자연계에서 발견되는 핵산 서열과는 다른 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 이온 결합 또는 정전기적 결합 및/또는 공유 결합을 포함하거나 또는 결여되어 있으므로, 자연 발생 핵산과 화학적으로 구분된다. 이러한 결합에서의 차이는 핵산의 개별 영역에 내부적으로 생길 수 있거나 (즉, cis), 또는 이러한 결합에서의 차이는 트랜스로, 예를 들어, 염색체 단백질과의 상호작용에서 생길 수 있다. 진핵생물 기원의 핵산의 경우, cDNA의 화학 결합은 염색체 DNA 상의 유전자의, 서열로서, 공유 결합과 상이하므로, cDNA는 재조합 또는 비-자연 발생 핵산인 것으로 간주된다. 이에, 당해 기술 분야의 당업자라면, 재조합 또는 비-자연 발생 핵산이 자연 발생 핵산과 구별됨을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다른 단계들 중에서도 본원에 개시된 벡터를 미생물, 예를 들어, 벡터에 의해 암호화된 아미노산 서열을 발현할 수 있거나 및/또는 발효 가능한 미생물 유기체에 도입하는 단계를 포함할 수 있는, 숙주 균주의 구축 방법을 제공한다. 본원에 기술된 벡터는, 비-제한적인 예로, 접합, 전기천공, 화학적 형질전환, 형질도입, 형질감염 및 초음파 형질전환 등의 당해 기술 분야에 잘 알려진 기술을 이용해, 미생물 유기체에 안정적으로 또는 일시적으로 도입할 수 있다. 본원에 부가적인 방법들이 기술되어 있으며, 이중 임의의 한가지 방법을 본원에 기술된 방법에 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 폴리펩타이드, 즉 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 포함하는 미생물 유기체, 특히 비-자연 발생 미생물 유기체를 제공한다. 이에, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 가진 비-자연 발생 미생물 유기체를 제공한다. 이에, 일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 유기체 (예를 들어, 숙주 미생물 유기체)를 제공하며, 여기서 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 1에서 위치 2, 9, 16, 19, 27, 29, 30, 41, 53, 73, 97, 98, 100, 101, 120, 121, 122, 123, 124, 128, 138, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 155, 175, 176, 191, 196, 198, 199, 203, 204, 206, 217, 218, 224, 231, 238, 256, 262, 264, 265, 266, 267, 269, 271, 284, 285, 287, 290, 291, 297, 301, 303, 313, 315, 319, 325, 329, 335, 336, 338, 339, 342, 343, 346, 350, 355, 365, 374, 381, 382 또는 384, 또는 이들의 조합 위치에 해당하는 위치에 하나 이상의 아미노산 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 유기체 (예를 들어, 숙주 미생물 유기체)를 제공하며, 여기서 조작된 포르메이트 데하이드로게나제는 서열번호 2에서 위치 36, 64, 80, 91, 97, 111, 120, 162, 164, 187, 188, 214, 229, 256, 257, 260, 312, 313, 315, 320, 323, 361 또는 362, 또는 이들의 조합 위치에 해당하는 위치에 하나 이상의 아미노산 변이를 포함한다.
선택적으로, 비-자연 발생 미생물 유기체는 NADH를 NADPH로 변환하기 위한 하나 이상의 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 함유할 수 있다. 이에, 일부 구현예에서, 비-자연 발생 미생물 유기체는 NADH에서 NADPH로의 변환을 촉매할 수 있는 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 외인성 핵산을 함유할 수 있다. 이러한 트랜스하이드로게나제는 NAD(P)+ 트랜스하이드로게나제 (EC 1.6.1.1 - Si-특이적; 및 EC 1.6.1.2 - Re/Si-특이적)를 포함한다. 비-제한적인 예시적인 트랜스하이드로게나제는 pntB_2 유전자 (UniProtKB A0A377CI53)에 의해 암호화된 에세케리키아 콜라이 (Escherichia coli)의 NAD(P) 트랜스하이드로게나제 서브유닛 베타, pntAb 유전자 (UniProtKB P96833)에 의해 암호화된 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)(균주 ATCC 25618 / H37Rv)의 프로톤-전위 NAD(P)(+) 트랜스하이드로게나제, pntAB 유전자 (UniProtKB P0C187)에 의해 암호화된 로도스피릴룸 루브럼 (Rhodospirillum rubrum)의 NAD(P) 트랜스하이드로게나제 서브유닛 알파 파트 2, pntAA 유전자 (UniProtKB Q83AE6)에 의해 암호화된 콕시엘라 부르네티 (Coxiella burnetii)(균주 RSA 493 / Nine Mile phase I)의 NAD(P) 트랜스하이드로게나제 알파 서브유닛, sthA 유전자 (UniProtKB P27306)에 의해 암호화된 에세케리키아 콜라이 (Escherichia coli)(균주 K12)의 용해성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제, sthA 유전자 (UniProtKB O05139)에 의해 암호화된 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens)의 용해성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제 등이 있다. 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산의 함유는, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에 의해 NADH를 NADPH로 변환하게 되므로, 본원에 기술된 생물 유래 화합물을 생산하기 위한 보조인자로 이용할 수 있다. 대안적으로 또는 아울러, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에 의해 구현된 증가된 양의 NADH를 증가된 양의 NADPH로 변환하는 데에는, 비-자연 발생 미생물 유기체에 존재하는 내인성 트랜스하이드로게나제에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 이종의 것이다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 상동의 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로를 더 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 비-자연 발생 미생물 유기체를 제공한다. 이러한 경로에는, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제에 의해 생산된 NADH 등의 보조인자의 생산이 직접적으로 또는 간접적으로 유익할 것이다. 보조인자의 생산이 직접적으로 유익할 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로로는, 예를 들어, 효소 반응을 촉매하는 보조인자로서 NADH에 의존하는 하나 이상의 효소를 가진 경로를 포함한다. 보조인자의 생산이 간접적으로 유익할 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로로는, 예를 들어 효소 반응을 촉매하는 보조인자로서 NADPH에 의존하는 하나 이상의 효소를 가진 경로를 포함하며, 여기서 NADPH는 본원에 기술된 바와 같은 트랜스하이드로게나제에 의한 NADH에서 NADPH로의 변환을 통해 생성된다. 아울러, NADH는 일반적으로 미생물 이화작용 및 세포 증식에 중요할 수 있으므로, 보조인자로서 NADH 또는 NADPH에 의존하는 효소를 포함하지 않는 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로를 가진 비-자연 발생 미생물 유기체도 미생물 이화작용 및 세포 증식의 개선이 간접적으로 여전히 유익할 수 있다. 일부 구현예에서, 생물 유래 화합물은 알코올, 글리콜, 유기산, 알켄, 다이엔, 유기 아민, 유기 알데하이드, 비타민, 뉴트라수티컬 또는 의약품이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 본원에 기술된 바와 같이 알코올 생산 경로를 포함한다. 이에, 일부 구현예에서, 알코올은 다음으로부터 선택된다: (i) C3 내지 C10 탄소 원자를 포함하는 1차 알코올, 2차 알코올, 다이올 또는 트리올로서, 생물 연료 알코올; (ii) n-프로판올 또는 이소프로판올; 및 (iii) C4 내지 C27 탄소 원자, C8 내지 C18 탄소 원자, C12 내지 C18 탄소 원자 또는 C12 내지 C14 탄소 원자를 포함하는 지방 알코올. 일부 측면에서, 생물 연료 알코올은 1-프로판올, 이소프로판올, 1-부탄올, 이소부탄올, 1-펜탄올, 이소펜테놀, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-헥사놀, 3-메틸-1-펜탄올, 1-헵타놀, 4-메틸-1-헥사놀 및 5-메틸-1-헥사놀로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 다이올 생산 경로를 포함한다. 이에, 일부 구현예에서, 다이올은 프로판다이올 또는 부탄다이올이다. 일부 측면에서, 부탄다이올은 1,4 부탄다이올, 1,3-부탄다이올 또는 2,3-부탄다이올이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 다음으로부터 선택되는 생물 유래 화합물의 생산 경로를 포함한다: (i) 1,4-부탄다이올 또는 이의 중간산물, 여기서 중간산물은 선택적으로 4-하이드록시부탄산 (4-HB); (ii) 부타다이엔 (1,3-부타다이엔) 또는 이의 중간산물이고, 중간산물은 선택적으로 1,4-부탄다이올, 1,3-부탄다이올, 2,3-부탄다이올, 크로틸알코올, 3-부텐-2-올 (메틸 비닐 카르비놀) 또는 3-부텐-1-올임; (iii) 1,3-부탄다이올 또는 이의 중간산물, 여기서 중간산물은 선택적으로 3-하이드록시부티레이트 (3-HB), 2,4-펜타다이에노에이트, 크로틸알코올 또는 3-부텐-1-올; (iv) 아디페이트, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌다이아민, 레불린산 또는 이의 중간산물, 여기서 중간산물은 선택적으로 아디필-CoA 또는 4-아미노부티릴-CoA임; (v) 메타크릴산 또는 이의 에스테르, 3-하이드록시이소부티레이트, 2-하이드록시이소부티레이트 또는 이의 중간산물, 여기서 에스테르는 선택적으로 메틸 메타크릴레이트 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트)임; (vi) 1,2-프로판다이올 (프로필렌 글리콜), 1,3-프로판다이올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 다이에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 비스페놀 A 또는 이의 중간산물; (vii) 숙신산 또는 이의 중간산물; 및 (viii) C4 내지 C27 탄소 원자, C8 내지 C18 탄소 원자, C12 내지 C18 탄소 원자 또는 C12 내지 C14 탄소 원자를 포함하는 지방 알코올, 지방 알데하이드 또는 지방산, 여기서 지방 알코올은 선택적으로 도데카놀 (C12; 라우릴 알코올), 트리데실 알코올 (C13; 1-트리데카놀, 트리데카놀, 이소트리데카놀), 미리스틸 알코올 (C14; 1-테트라데카놀), 펜타데실 알코올 (C15; 1-펜타데카놀, 펜타데카놀), 세틸 알코올 (C16; 1-헥사데카놀), 헵타데실 알코올 (C17; 1-n-헵타데카놀, 헵타데카놀) 및 스테아릴 알코올 (C18; 1-옥타데카놀) 또는 팔미트올레일 알코올 (C16 불포화; cis-9-헥사데센-1-올)임. 이에, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 1,4-부탄다이올 또는 이의 중간산물 생산 경로를 포함하며, 여기서 중간산물은 선택적으로 4-하이드록시부탄산 (4-HB)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 부타다이엔 (1,3-부타다이엔) 또는 이의 중간산물 생산 경로를 포함하며, 여기서 중간산물은 선택적으로 1,4-부탄다이올, 1,3-부탄다이올, 2,3-부탄다이올, 크로틸알코올, 3-부텐-2-올 (메틸 비닐 카르비놀) 또는 3-부텐-1-올이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 1,3-부탄다이올 또는 이의 중간산물의 생산 경로를 포함하며, 여기서 중간산물은 선택적으로 3-하이드록시부티레이트 (3-HB), 2,4-펜타다이에노에이트, 크로틸알코올 또는 3-부텐-1-올이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 아디페이트, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌다이아민, 레불린산 또는 이의 중간산물의 생산 경로를 포함하며, 여기서 중간산물은 선택적으로 아디필-CoA 또는 4-아미노부티릴-CoA이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 메타크릴산 또는 이의 에스테르, 3-하이드록시이소부티레이트, 2-하이드록시이소부티레이트 또는 이의 중간산물의 생산 경로를 포함하며, 여기서 에스테르는 선택적으로 메틸 메타크릴레이트 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 1,2-프로판다이올 (프로필렌 글리콜), 1,3-프로판다이올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 다이에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 비스페놀 A 또는 이의 중간산물의 생산 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 숙신산 또는 이의 중간산물의 생산 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 C4 내지 C27 탄소 원자, C8 내지 C18 탄소 원자, C12 내지 C18 탄소 원자 또는 C12 내지 C14 탄소 원자를 포함하는 지방 알코올, 지방 알데하이드 또는 지방산 생산 경로를 포함하고, 여기서 지방 알코올은 선택적으로 도데카놀 (C12; 라우릴 알코올), 트리데실 알코올 (C13; 1-트리데카놀, 트리데카놀, 이소트리데카놀), 미리스틸 알코올 (C14; 1-테트라데카놀), 펜타데실 알코올 (C15; 1-펜타데카놀, 펜타데카놀), 세틸 알코올 (C16; 1-헥사데카놀), 헵타데실 알코올 (C17; 1-n-헵타데카놀, 헵타데카놀) 및 스테아릴 알코올 (C18; 1-옥타데카놀) 또는 팔미트올레일 알코올 (C16 불포화; cis-9-헥사데센-1-올)이다.
1,4-부탄다이올 및 이의 중간산물, 예를 들어 4-하이드록시부탄산 (4-하이드록시부타노에이트, 4-하이드록시부티레이트, 4-HB는 본원 및 하기 간행물에 기술된 효소 경로를 통해 제조될 수 있는 생물 유래 화합물이다. 적합한 생물 유래 화합물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 다음 문헌에서 확인된다: 2008년 9월 25일에 공개된 "1,4-부탄다이올 및 이의 전구체를 생합성하기 위한 조성물 및 방법" 표제의 WO2008115840A2; 2010년 12월 9일에 발표된 "발효 브로스의 구성성분 분리 공정" 표제의 WO2010141780A1; 2010년 12월 9일에 발표된 "1,4-부탄다이올을 생산하기 위한 미생물 및 관련 방법" 표제의 WO2010141920A2; 2010년 3월 18일에 공개된 "1,4-부탄다이올을 생산하기 위한 미생물" 표제의 WO2010030711A2; 2010년 6월 24일에 공개된 "합성가스 및 기타 탄소원을 유용한 생산물로 변환하기 위한 미생물 및 방법" 표제의 WO2010071697A1; 2009년 7월 30일에 공개된 "합성 가스 또는 기타 기체성 탄소원 및 메탄올을 활용하기 위한 방법 및 유기체" 표제의 WO2009094485A1; 2009년 2월 19일에 공개된 "1,4-부탄다이올을 증식-연계되어 생산하기 위한 방법 및 유기체" 표제의 WO2009023493A1; 및 2008년 9월 25일에 공개된 "1,4-부탄다이올 및 이의 전구체를 생합성하기 위한 조성물 및 방법" 표제의 WO2008115840A2, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본원에 통합됨.
부타다이엔 및 이의 중간산물, 예를 들어 1,4-부탄다이올, 2,3-부탄다이올, 1,3-부탄다이올, 크로틸알코올, 3-부텐-2-올 (메틸 비닐 카르비놀) 및 3-부텐-1-올은 본원 및 하기 간행물에 기술된 효소 경로를 통해 제조할 수 있는 생물 유래 화합물이다. 부타다이엔을 생산하기 위한 직접 발효와 더불어, 1,3-부탄다이올, 1,4-부탄다이올, 크로틸알코올, 3-부텐-2-올 (메틸 비닐 카르비놀) 또는 3-부텐-1-올은 분리, (임의의 용도로) 정제한 다음 금속계 촉맨에 의해 부타다이엔으로 화학적으로 탈수 처리할 수 있다. 적절한 생물 유래 화합물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 다음 문헌들에서 확인된다: 2011년 11월 10일에 공개된 "부타다이엔을 생합성하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2011140171A2; 2012년 2월 9일에 공개된 "방향족, 2,4-펜타다이에노에이트 및 1,3-부타다이엔을 생합성하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2012018624A2; 2011년 11월 10일에 공개된 "부타다이엔을 생합성하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2011140171A2; 2013년 3월 21일에 공개된 "알켄을 생산하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2013040383A1; 2012년 12월 27일에 공개된 "부타다이엔을 생산하기 위한 미생물 및 이와 관련한 방법"으로 표제로 한 WO2012177710A1; 2012년 8월 9일에 공개된 "부타다이엔을 생합성하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2012106516A1; 및 2013년 2월 28일에 공개된 "2,4-펜타다이에노에이트, 부타다이엔, 프로필렌, 1,3-부탄다이올 및 관련 알코올을 생산하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2013028519A1, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본원에 통합됨.
1,3-부탄다이올 및 이의 중간산물, 예를 들어 2,4-펜타다이에노에이트, 크로틸알코올 또는 3-부텐-1-올은 본원 및 하기 간행물에 기술된 효소 경로를 통해 제조할 수 있는 생물 유래 화합물이다. 적절한 생물 유래 화합물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 다음 문헌에서 확인된다: 2011년 6월 16일에 공개된 "합성 가스 또는 기타 기체성 탄소원 및 메탄올을 1,3-부탄다이올로 변환하기 위한 방법 및 유기체"를 표제로 한 WO2011071682A1; 2011년 3월 17일에 공개된 "이소프로판올을 1차 알코올, 다이올 및 산과 공동-생산하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2011031897A; 2010년 11월 4일에 공개된 "1,3-부탄다이올을 생산하기 위한 유기체"를 표제로 한 WO2010127319A2; 2013년 5월 16일에 공개된 "세포질 아세틸-CoA의 이용가능성을 높이고 1,3-부탄다이올을 생산하기 위한 진핵 유기체 및 방법"을 표제로 한 WO2013071226A1; 2013년 2월 28일에 공개된 "2,4-펜타다이에노에이트, 부타다이엔, 프로필렌, 1,3-부탄다이올 및 관련 알코올을 생산하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2013028519A1; 2013년 3월 14일에 공개된 "1,3-부탄다이올을 생산하기 위한 진핵 유기체 및 방법"을 표제로 한 WO2013036764A1; 2013년 1월 24일에 공개된 "생산물 수율을 높이는 방법"을 표제로 한 WO2013012975A1; 2012년 12월 27일에 공개된 "1,3-부탄다이올을 생산하기 위한 미생물 및 이와 관련한 방법"을 표제로 한 WO2012177619A2; 2018년 10월 4일에 공개된 "알데하이드 데하이드로게나제 변이체 및 이용 방법"을 표제로 한 WO2018/183664A1; 2018년 10월 4일에 공개된 "3-하이드록시부트릴-CoA 데하이드로게나제 변이체 및 이용 방법"을 표제로 한 WO 2018/183640A1; 2019년 11월 14일에 공개된 "알코올 데하이드로게나제 돌연변이 및 다이아릴 키랄 알코올 합성에서의 이의 용도"를 표제로 한 US 2019/0345455; 및 2019년 11월 14일에 공개된 "알코올 데하이드로게나제 돌연변이 및 다이아릴 키랄 알코올 합성에서의 이의 용도"를 표제로 한 US 2019/0345455, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본원에 통합됨.
아디페이트, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌다이아민 및 레불린산 및 이들의 중간산물, 예를 들어 4-아미노부티릴-CoA는 본원 및 하기 간행물에 기술된 효소 경로를 통해 제조될 수 있는 생물 유래 화합물이다. 적절한 생물 유래 화합물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 다음 문헌에서 확인된다: 2010년 11월 11일에 공개된 "아디페이트, 헥사메틸렌다이아민 및 6-아미노카프로산을 생합성하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2010129936A1; 2013년 1월 24일에 공개된 "생산물 수율을 높이는 방법"을 표제로 한 WO2013012975A1; 2012년 12월 27일에 공개된 "6-아미노카프로산을 생산하기 위한 미생물"을 표제로 한 WO2012177721A1; 2012년 7월 26에 공개된 "생산물 수율을 높이는 방법"을 표제로 한 WO2012099621A1; 및 2009년 12월 17일에 공개된 "아디프산 및 기타 화합물을 생산하기 위한 미생물"을 표제로 한 WO2009151728, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본원에 통합됨.
메타크릴산 (2-메틸-2-프로페노산)은 총괄적으로 메타크릴레이트 (예를 들어, 폴리머 제조에 가장 현저하게 이용되는 메틸 메타크릴레이트)로 공지된 이의 에스테르 제조에 이용된다. 메타크릴레이트 에스테르, 예를 들어 메틸 메타크릴레이트, 3-하이드록시이소부티레이트 및/또는 2-하이드록시이소부티레이트 및 이들의 중간산물은 본원 및 하기 간행물에 기술된 효소 경로를 통해 제조할 수 있는 생물 유래 화합물이다. 적절한 생물 유래 화합물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 다음 문헌에서 확인된다: 2012년 10월 4일에 공개된 "메타크릴산 및 메타크릴레이트 에스테르 생산용 미생물 및 이와 관련한 방법"을 표제로 한 WO2012135789A2; 및 2009년 11월 5일에 공개된 "메타크릴산을 생산하기 위한 미생물"을 표제로 한 WO2009135074A2, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본원에 통합됨.
1,2-프로판다이올 (프로필렌 글리콜), n-프로판올, 1,3-프로판다이올 및 글리세롤, 및 이들의 중간산물은 본원 및 하기 간행물에 기술된 효소 경로를 통해 제조할 수 있는 생물 유래 화합물이다. 적절한 생물 유래 화합물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 다음 문헌에서 확인된다: 2009년 11월 9일에 공개된 "1차 알코올 생산 유기체"를 표제로 한 WO2009111672A1; 2011년 3월 17일에 공개된 "이소프로판올을 1차 알코올, 다이올 및 산과 함께 공동 생산하기 위한 미생물 및 방법"을 표제로 한 WO2011031897A1; 2012년 12월 27일에 공개된 N-프로판올 1,3-프로판다이올, 1,2-프로판다이올 또는 글리세롤을 생산하기 위한 미생물 및 이와 관련한 방법"을 표제로 한 WO2012177599A2, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본원에 통합됨.
폴리머 (예를 들어, PBS), 1,4-부탄다이올, 테트라하이드로푸란, 피롤리돈, 용매, 페인트, 방빙제 (deicer), 플라스틱, 연료 첨가제, 패브릭, 카페트, 안료 및 세정제 등의 제품 제조에 유용한, 숙신산 및 이의 중간산물은, 본원에 기술되고 하기 간행물에 기술된 효소 경로를 통해 제조할 수 있는 생물 유래 화합물이다. 적절한 생물 유래 화합물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 다음 문헌에서 확인된다: 2008년 7월 2일에 공개된 "숙시네이트를 증식-연계하여 생산하기 위한 방법 및 유기체"를 표제로 한 EP1937821A2, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
1차 알코올 및 지방산 및 이의 지방 알데하이드 등의 지방 알코올 (장쇄 알코올이라고도 함), 및 이의 중간산물은 하기 간행물에서 효소 경로를 통해 제조할 수 있는 생물 유래 화합물이다. 적절한 생물 유래 화합물 경로 및 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 다음 문헌에서 확인된다: 2009년 9월 11일에 공개된 "1차 알코올 생산 유기체"를 표제로 한 WO2009111672; 2012년 12월 27일에 공개된 "1차 알코올 및 관련 화합물을 생산하기 위한 미생물 및 이와 관련한 방법"을 표제로 한 WO2012177726, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본원에 통합됨.
본원에 기술된 미생물 유기체를 이용하여, 아세틸-CoA를 통해, 선택적으로 아세토아세틸-CoA 및/또는 숙시닐-CoA를 추가로 경유해 생산할 수 있는 추가적인 적절한 생물 유래 화합물은 본 발명의 일부로 포함된다. 예시적인 잘 알려진 생물 유래 화합물, 이를 생산하기 위한 경로 및 생산용 효소, 스크리닝 방법 및 단리 방법은 하기 특허 및 간행물에서 확인된다: 숙시네이트 (미국 특허 공개공보 2007/0111294, WO 2007/030830, WO 2013/003432), 3-하이드록시프로피온산 (3-하이드록시프로피오네이트)(미국 특허 공개공보 2008/0199926, WO 2008/091627, 미국 특허 공개공보 2010/0021978), 1,4-부탄다이올 (미국 특허 8067214, WO 2008/115840, 미국 특허 7947483, WO 2009/023493, 미국 특허 7858350, WO 2010/030711, 미국 특허 공개공보 2011/0003355, WO 2010/141780, 미국 특허 8129169, WO 2010/141920, 미국 특허 공개공보 2011/0201068, WO 2011/031897, 미국 특허 8377666, WO 2011/047101, 미국 특허 공개공보 2011/0217742, WO 2011/066076, 미국 특허 공개공보 2013/0034884, WO 2012/177943), 4-하이드록시부탄산 (4-하이드록시부타노에이트, 4-하이드록시부티레이트, 4-하이드록시부티레이트)(미국 특허 8067214, WO 2008/115840, 미국 특허 7947483, WO 2009/023493, 미국 특허 7858350, WO 2010/030711, 미국 특허 공개공보 2011/0003355, WO 2010/141780, 미국 특허 8129155, WO 2010/071697), 감마-부티로락톤 (미국 특허 8067214, WO 2008/115840, 미국 특허 7947483, WO 2009/023493, 미국 특허 7858350, WO 2010/030711, 미국 특허 공개공보 2011/0003355, WO 2010/141780, 미국 특허 공개공보 2011/0217742, WO 2011/066076), 4-하이드록시부티릴-CoA (미국 특허 공개공보 2011/0003355, WO 2010/141780, 미국 특허 공개공보 2013/0034884, WO 2012/177943), 4-하이드록시부타날 (미국 특허 공개공보 2011/0003355, WO 2010/141780, 미국 특허 공개공보 2013/0034884, WO 2012/177943), 푸트레신 (putrescine)(미국 특허 공개공보 2011/0003355, WO 2010/141780, 미국 특허 공개공보 2013/0034884, WO 2012/177943), 올레핀 (예, 아크릴산 및 아크릴레이트 에스테르)(미국 특허 8026386, WO 2009/045637), 아세틸-CoA (미국 특허 8323950, WO 2009/094485), 메틸 테트라하이드로폴레이트 (미국 특허 8323950, WO 2009/094485), 에탄올 (미국 특허 8129155, WO 2010/071697), 이소프로판올 (미국 특허 8129155, WO 2010/071697, 미국 특허 공개공보 2010/0323418, WO 2010/127303, 미국 특허 공개공보 2011/0201068, WO 2011/031897), n-부탄올 (미국 특허 8129155, WO 2010/071697), 이소부탄올 (미국 특허 8129155, WO 2010/071697), n-프로판올 (미국 특허 공개공보 2011/0201068, WO 2011/031897), 메틸아크릴산 (메틸아크릴레이트)(미국 특허 공개공보 2011/0201068, WO 2011/031897), 1차 알코올 (미국 특허 7977084, WO 2009/111672, WO 2012/177726), 장쇄 알코올 (미국 특허 7977084, WO 2009/111672, WO 2012/177726), 아디페이트 (아디프산)(미국 특허 8062871, WO 2009/151728, 미국 특허 8377680, WO 2010/129936, WO 2012/177721), 6-아미노카프로에이트 (6-아미노카프로산)(미국 특허 8062871, WO 2009/151728, 미국 특허 8377680, WO 2010/129936, WO 2012/177721), 카프로락탐 (미국 특허 8062871, WO 2009/151728, 미국 특허 8377680, WO 2010/129936, WO 2012/177721), 헥사메틸렌다이아민 (미국 특허 8377680, WO 2010/129936, WO 2012/177721), 레불린산 (미국 특허 8377680, WO 2010/129936), 2-하이드록시이소부티르산 (2-하이드록시이소부티레이트)(미국 특허 8241877, WO 2009/135074, 미국 특허 공개공보 2013/0065279, WO 2012/135789), 3-하이드록시이소부티르산 (3-하이드록시이소부티레이트)(미국 특허 8241877, WO 2009/135074, 미국 특허 공개공보 2013/0065279, WO 2012/135789), 메타크릴산 (메타크릴레이트)(미국 특허 8241877, WO 2009/135074, 미국 특허 공개공보 2013/0065279, WO 2012/135789), 메타크릴레이트 에스테르 (미국 특허 공개공보 2013/0065279, WO 2012/135789), 푸마레이트 (푸마르산)(미국 특허 8129154, WO 2009/155382), 말레이트 (말산)(미국 특허 8129154, WO 2009/155382), 아크릴레이트 (카르복시산)(미국 특허 8129154, WO 2009/155382), 메틸 에틸 케톤 (미국 특허 공개공보 2010/0184173, WO 2010/057022, 미국 특허 8420375, WO 2010/144746), 2-부탄올 (미국 특허 공개공보 2010/0184173, WO 2010/057022, 미국 특허 8420375, WO 2010/144746), 1,3-부탄다이올 (미국 특허 공개공보 2010/0330635, WO 2010/127319, 미국 특허 공개공보 2011/0201068, WO 2011/031897, 미국 특허 8268607, WO 2011/071682, 미국 특허 공개공보 2013/0109064, WO 2013/028519, 미국 특허 공개공보 2013/0066035, WO 2013/036764), 사이클로헥사논 (미국 특허 공개공보 2011/0014668, WO 2010/132845), 테레프탈레이트 (테레프탈산)(미국 특허 공개공보 2011/0124911, WO 2011/017560, 미국 특허 공개공보 2011/0207185, WO 2011/094131, 미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624), 무코네이트 (무코닉산)(미국 특허 공개공보 2011/0124911, WO 2011/017560), 아닐린 (미국 특허 공개공보 2011/0097767, WO 2011/050326), p-톨루에이트 (p-톨루산)(미국 특허 공개공보 2011/0207185, WO 2011/094131, 미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624), (2-하이드록시-3-메틸-4-옥소부톡시)포스포네이트 (미국 특허 공개공보 2011/0207185, WO 2011/094131, 미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624), 에틸렌 글리콜 (미국 특허 공개공보 2011/0312049, WO 2011/130378, WO 2012/177983), 프로필렌 (미국 특허 공개공보 2011/0269204, WO 2011/137198, 미국 특허 공개공보 2012/0329119, 미국 특허 공개공보 2013/0109064, WO 2013/028519), 부타다이엔 (1,3-부타다이엔)(미국 특허 공개공보 2011/0300597, WO 2011/140171, 미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624, 미국 특허 공개공보 2012/0225466, WO 2012/106516, 미국 특허 공개공보 2013/0011891, WO 2012/177710, 미국 특허 공개공보 2013/0109064, WO 2013/028519), 톨루엔 (미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624), 벤젠 (미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624), (2-하이드록시-4-옥소부톡시)포스포네이트 (미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624), 벤조에이트 (벤조산)(미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624), 스티렌 (미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624), 2,4-펜타다이에노에이트 (미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624, 미국 특허 공개공보 2013/0109064, WO 2013/028519), 3-부텐-1-올 (미국 특허 공개공보 2012/0021478, WO 2012/018624, 미국 특허 공개공보 2013/0109064, WO 2013/028519), 3-부텐-2-올 (미국 특허 공개공보 2013/0109064, WO 2013/028519), 1,4-사이클로헥산다이메탄올 (미국 특허 공개공보 2012/0156740, WO 2012/082978), 크로틸알코올 (미국 특허 공개공보 2013/0011891, WO 2012/177710, 미국 특허 공개공보 2013/0109064, WO 2013/028519), 알켄 (미국 특허 공개공보 2013/0122563, WO 2013/040383, US 2011/0196180), 하이드록시산 (WO 2012/109176), 케토산 (WO 2012/109176), 왁스 에스테르 (WO 2007/136762) 또는 카프로락톤 (미국 특허 공개공보 2013/0144029, WO 2013/067432) 경로. 생물 유래 화합물 경로를 개시한 상기 열거된 특허 및 특허 출원 공개공보들은 본원에 원용에 의해 통합된다.
당해 기술 분야의 당업자는, 이것이 단지 예에 불과하고, 원하는 생산물을 생산하기에 적합하며 적절한 활성이 기질에서 생산물로의 변환에 이용가능한 본원에 개시된 기질-생산물 쌍들 중 임의 쌍들을, 본원에 교시된 내용을 토대로 당해 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정할 수 있는 것으로 이해할 것이다. 이에, 일부 구현예에서, 본 발명은, 포르메이트 데하이드로게나제가 생물 유래 화합물을 생산하기 위한 경로에서 기능하는, 하나 이상의 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 함유한, 비-자연 발생 미생물 유기체를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 핵산을 포함하는 본원에 기술된 벡터를 가진 비-자연 발생 미생물 유기체를 제공한다. 또한, 본원에 기술된 핵산을 가진 비-자연 발생 미생물 유기체를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 유기체의 염색체에 통합된다. 일부 구현예에서, 통합은 부위-특이적이다. 본원에 기술된 일 구현예에서, 핵산을 발현한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 폴리펩타이드를 가진 비-자연 발생 미생물 유기체를 제공한다.
일부 구현예에서, 미생물 유기체는 박테리아, 효모 또는 진균 종이다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 박테리아, 효모 또는 진균 종이다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 효모 종이다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 진균 종이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 갖지 않은 대조군 미생물 유기체와 비교해, NADH 또는 생물 유래 화합물을 더 많이 생산할 수 있는 비-자연 발생 미생물 유기체를 제공한다. 이러한 미생물 유기체는, 일부 구현예에서, 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 10% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 20% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 30% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 40% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 50% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 60% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 70% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 80% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 90% 더 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.1배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.2배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.3배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.4배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.5배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.6배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.7배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.8배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 1.9배 더 많이 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물 유기체는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 2배 더 많이 생산할 수 있다.
본원에 기술된 주제는 대사 반응, 반응제 또는 이의 생산물을 일반적으로 참조하거나, 또는 참조한 대사 반응, 반응제 또는 생산물과 관련 있거나 또는 이를 촉매하는 효소 또는 이와 연관된 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자를 구체적으로 참조하여 본원에서 설명한다. 본원에 명확하게 달리 언급되지 않은 한, 당해 기술 분야의 당업자는, 반응에 대한 언급 역시 반응의 반응제 및 생산물에 대한 언급임을 이해할 것이다. 마찬가지로, 본원에 명확하게 달리 언급되지 않은 한, 반응제 또는 생산물에 대한 언급 역시 반응을 언급하는 것이며, 이들 임의의 대사 구성성분에 대한 언급 또한 참조 반응, 반응제 또는 생산물을 촉진하는 효소 또는 이에 참여하는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 언급하는 것이다. 마찬가지로, 잘 알려진 대사적 생화학, 효소학 및 게놈 분야를 감안해보면, 유전자 또는 암호화 핵산에 대한 언급은 대응하는 암호화된 효소 및 이것이 촉매하는 반응 또는 반응과 관련된 단백질뿐 아니라 반응의 반응제 및 생산물에 대한 언급으로 간주된다.
본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 하나 이상의 생물 유래 화합물 생합성 경로에 참여하는 효소 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 발현가능한 핵산을 도입함으로써 구축할 수 있다. 생합성을 위해 선택된 숙주 미생물 유기체에 따라, 특정 생물 유래 화합물 생합성 경로의 일부 또는 전체에 대한 핵산들을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 선택 숙주에 요망하는 생합성 경로에 대한 효소 또는 단백질 하나 이상이 결핍되어 있다면, 생물 유래 화합물의 생합성을 달성하기 위해 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)에 대한 암호화 핵산이 필요하다. 따라서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 요망하는 생합성 경로를 달성하기 위해 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 구축하거나, 또는 하나 이상의 내인성 효소 또는 단백질과 함께 생물 유래 화합물과 같은 요망하는 생산물을 생산하는 하나 이상의 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 요망하는 생합성 경로를 달성할 수 있다.
숙주 미생물 유기체는, 예를 들어, 박테리아, 효모, 진균 또는 발효 공정에 적용가능하거나 또는 적합한 다양한 임의의 다른 미생물에서 구축된, 비-자연 발생 미생물 유기체로부터 선택할 수 있다. 박테리아의 예는 장내세균목 (Enterobacteriales) 장내세균과 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 속 에스케리키아 (Escherichia) 및 클렙시엘라 (Klebsiella) 등; 목 에어로모나데일스 (Aeromonadales), 과 숙시니비브리오나시이 (Succinivibrionaceae), 예를 들어 속 안에어로바이오스피릴륨 (Anaerobiospirillum) 등; 목 파스퇴렐레일스 (Pasteurellales), 과 파스퇴렐라시이 (Pasteurellaceae), 예를 들어 속 액티노바실러스 (Actinobacillus) 및 만하이미아 (Mannheimia) 등; 목 리조비에일스 (Rhizobiales), 과 브라디리조비아시이 (Bradyrhizobiaceae), 예를 들어 속 리조비움 (Rhizobium) 등; 목 바실에일스 (Bacillales), 과 바실라시이 (Bacillaceae), 예를 들어 속 바실러스 (Bacillus) 등; 목 액티노바이세테일스 (Actinomycetales), 과 코리네박테리아시이 (Corynebacteriaceae) 및 스트렙토마이세타시이 (Streptomycetaceae), 예를 들어 각각 속 코리네박테리움 (Corynebacterium) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 등; 목 로도스피릴레일스 (Rhodospirillales), 과 아세토박테라시이 (Acetobacteraceae), 예를 들어 속 글루코노박터 (Gluconobacter) 등; 목 스핑고모나데일스 (Sphingomonadales), 과 스핑고모나다시이 (Sphingomonadaceae), 예를 들어 속 지모모나스 (Zymomonas) 등; 목 락토바실레일스 (Lactobacillales), 과 락토바실라시이 (Lactobacillaceae) 및 스트렙토코카시이 (Streptococcaceae), 예를 들어 각각 속 락토바실러스 (Lactobacillus) 및 락토코커스 (Lactococcus) 등; 목 클로스트리디에일스 (Clostridiales), 과 클로스트리디아시이 (Clostridiaceae), 예를 들어 속 클로스트리듐 (Clostridium); 과 슈도모나다시이 (Pseudomonadaceae), 목 슈도모나데일스 (Pseudomonadales), 예를 들어 속 슈도모나스 (Pseudomonas)로부터 선택되는 임의의 종을 포함한다. 숙주 박테리아에 대한 비-제한적인 예로는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 안에어로비오스피릴룸 숙시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens), 액티노바실러스 숙시노게네스 (Actinobacillus succinogenes), 만하이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens), 리조비움 에틸리 (Rhizobium etli), 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 클루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리툼 (Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 등이 있다. 예시적인 박테리아 메틸영양균으로는 예를 들어 바실러스 (Bacillus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 메틸로베르사틸리스 (Methyloversatilis), 메틸로코커스 (Methylococcus), 메틸로시스티스 (Methylocystis) 및 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium) 등이 있다.
마찬가지로, 효모 또는 진균 종에 대한 예시적인 종으로는, 목 사카로마이세테일스 (Saccharomycetales)의 과 사카로마이세타시이 (Saccaromycetaceae), 예를 들어 속 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 및 피키아 (Pichia); 목 사카로마이세테일스 (Saccharomycetales)의 과 디포다스카시이 (Dipodascaceae), 예를 들어 속 야로이와 (Yarrowia); 목 시조사카로마이세일스 (Schizosaccharomycetales), 과 시조사카로마이세타시이 (Schizosaccaromycetaceae), 예를 들어, 속 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces); 목 유로티에일스 (Eurotiales), 과 트리코코마시이 (Trichocomaceae), 예를 들어 속 아스퍼질러스 (Aspergillus); 및 목 뮤코레일스 (Mucorales), 과 뮤코라시이 (Mucoraceae), 예를 들어 속 리조푸스 (Rhizopus)로부터 선택되는 임의의 종을 포함한다. 숙주 효모 또는 진균에 대한 비-제한적인 종으로는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리제 (Rhizobus oryzae), 야로이와 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 등이 있다. E. coli는 유전자 조작에 적합한 잘 규명된 미생물 유기체이므로, 이 균주가 특히 유용한 숙주 유기체이다. 특히 유용한 숙주 유기체는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효소, 및 속 사카로마이세스 (Saccharomyces), 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 시조키트리움 (Schizochytrium), 로도토룰라 (Rhodotorula), 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 클루베로마이세스 (Kluyveromyces), 이사첸키아 (Issatchenkia), 야로이와 (Yarrowia), 칸디다 (Candida), 피키아 (Pichia), 오가타에아 (Ogataea), 쿠라이시아 (Kuraishia), 한세뉼라 (Hansenula) 및 코마가타엘라 (Komagataella)로부터 선택되는 효모 또는 진균을 포함한다. 유용한 숙주 유기체로는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 한세뉼라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 피키아 메타놀리카 (Pichia methanolica), 칸디다 보이디니 (Candida boidinii), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루베로마이세스 막시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리제 (Rhizobus oryzae,), 야로이와 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 이사첸키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis) 등을 포함한다. 임의의 적절한 미생물 숙주 유기체를 이용해 요망하는 생산물을 생산하기 위해 대사 및/또는 유전자 변형을 도입할 수 있다.
선택한 숙주 미생물 유기체의 생물 유래 화합물 생합성 경로의 구성요소에 따라, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 하나 이상의 외인성으로 발현되는 생물 유래 화합물 경로를 암호화하는 핵산 및 생물 유래 화합물 생합성 경로에 대한 암호화 핵산들을 최대 전부 함유할 수 있다. 예를 들어, 대응하는 암호화 핵산의 외인성 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질에서 결핍된 숙주에서 생물 유래 화합물 생합성을 확립할 수 있다. 생물 유래 화합물 경로의 모든 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주의 경우, 경로의 모든 효소 또는 단백질이 숙주가 경로 효소 또는 단백질 중 적어도 하나를 함유하더라도 발현될 수 있는 것으로 이해됨에도 불구하고, 경로의 모든 효소 또는 단백질의 외인성 발현을 포함시킬 수 있다.
본원에 제공된 교시내용 및 지침을 감안해, 당해 기술 분야의 당업자라면, 발현가능한 형태로 도입할 암호화 핵산의 수가 선택한 숙주 미생물 유기체의 생물 유래 화합물 경로의 결핍성과 적어도 상응할 것임을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 본원에 개시된 생물 유래 화합물의 생합성 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산을 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종, 11종 또는 12종, 최대한으로는 전부 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 미생물 유기체는 또한 숙주 미생물 유기체에 다른 유용한 기능을 부여하거나 또는 생물 유래 화합물 생합성을 촉진 또는 최적화하는 다른 유전자 변형도 함유할 수 있다. 이러한 다른 기능성의 일 예로는 생물 유래 화합물 경로의 전구체 중 하나 이상의 합성 강화가 있을 수 있다.
일반적으로, 숙주 미생물 유기체는 생물 유래 화합물 경로의 전구체가 자연적으로 만들어지는 분자로서 또는 숙주 미생물 유기체에 의해 자연적으로 만들어지는 전구체의 생산 증가나 또는 원하는 전구체의 드 노보 생산을 제공하는 조작된 생산물로서 생산되도록 선택한다. 예를 들어, 말로닐-CoA, 아세토아세틸-CoA 및 피루베이트는 E. coli와 같은 숙주 유기체에서 천연적으로 생산된다. 숙주 유기체는 본원에 기술된 바와 같이 전구체의 생산을 높이도록 조작될 수 있다. 아울러, 요망하는 전구체를 생산하도록 조작된 미생물 유기체를 숙주 유기체로 이용할 수 있으며, 생물 유래 화합물 경로의 효소 또는 단백질을 발현하도록 추가로 조작될 수도 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 생물 유래 화합물을 합성하는 효소적 능력을 가진 숙주로부터 구축된다. 이러한 특정한 구현예에서, NADH 합성 또는 축적을 증가시켜, 예를 들어 생물 유래 화합물의 경로 반응을 생물 유래 화합물을 생산하는 방향으로 향하게 하는 것이 유용할 수 있다. 합성 또는 축적의 증가는 예를 들어 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산의 발현 (예, 과다 발현), 그리고 생물 유래 화합물 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 발현 (예, 과다 발현)을 통해 달성할 수 있다. 생물 유래 화합물 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 발현은, 예를 들어, 이종의 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해 또는 내인성 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해 이루어질 수 있다. 즉, 자연 발생 유기체는 생물 유래 화합물 생합성 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 0종10종, 11종, 12종, 즉 이들 모두 과다발현함으로써 예를 들어 생물 유래 화합물을 생산하는, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체로 쉽게 구축할 수 있다. 아울러, 비-자연 발생 유기체는 생물 유래 화합물 생합성 경로에서 효소의 활성 증가를 야기하는 내인성 유전자의 돌연변이 유발을 통해 구축할 수도 있다.
특히 유용한 구현예에서, 암호화 핵산의 외인성 발현이 채택된다. 외인성 발현은 발현 및/또는 조절 요소를 맞춤 조절하는 능력을 숙주 및 어플리케이션에 부여함으로서 사용자에 의해 조절되는 원하는 발현 수준을 달성하게 된다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자의 발현은, 유도성 프로모터 또는 다른 조절 인자와 연계되었을 경우, 유전자의 프로모터의 유도나 또는 네거티브 조절 작동인자의 제거에 의해서와 같이 조작한다. 따라서, 자연 발생 유도성 프로모터를 가진 내인성 유전자는 적절한 유도성 물질을 제공함으로써 상향-조절하거나, 또는 유도성 조절 인자가 병합되도록 내인성 유전자의 조절 영역을 조작하여, 원하는 시점에 내인성 유전자의 발현이 증가하도록 조절할 수 있다. 마찬가지로, 유도성 프로모터는 비-자연 발생 미생물 유기체에 도입되는 외인성 유전자에 대한 조절 인자로 포함될 수도 있다.
하나 이상의 임의의 재조합 및/또는 외인성 핵산을 미생물 유기체 도입해 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체를 구축할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어 NADH 및/또는 NADPH와 같은 보조인자의 생산을 부여하도록 또는 생물 유래 화합물 생합성 경로를 미생물 유기체에 투여하도록, 핵산을 도입할 수 있다. 대안적으로, 암호화 핵산을 도입해, 보조인자 생산을 제공하는 데 필요한 반응들 중 일부를 촉매할 수 있는 생합성 능력 또는 생물 유래 화합물의 생합성 능력을 가진, 중간 미생물 유기체를 제조할 수 있다. 예를 들어, NADH 및 생물 유래 화합물의 생합성 경로를 가진 비-자연 발생 미생물은, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제와 1,3-BDO 경로 효소의 조합, 대안적으로 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제와 HMDA 경로 효소, 또는 대안적으로 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제와 MAA 경로 효소 등, 원하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 2 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 이에, 생합성 경로의 효소 또는 단백질 2종 이상으로 구성된 임의 조합이 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 원하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합으로 상응하는 원하는 생산물의 생산이 달성하는 한, 필요에 따라, 생합성 경로의 효소 또는 단백질 3종 이상으로 구성된 임의 조합이, 예를 들어, 본원에 제공된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제, 트랜스하이드로게나제 및 1,3-BDO가 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 원하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합으로 상응하는 원하는 생산물의 생산이 달성되는 한, 필요에 따라, 본원에 기술된 생합성 경로의 효소 또는 단백질 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종, 11종, 12종 또는 더 많은 종으로 구성된 임의 조합이 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체 및 방법은, NADH 또는 본원에 기술된 바와 같은 생물 유래 화합물의 생합성과 더불어, 또한 다른 경로를 통해 생산물의 생합성을 달성하기 위해, 미생물 유기체 서로 및/또는 다른 미생물 유기체 및 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법과의 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 생물 유래 화합물 생산체를 이용하는 것 이외의 생물 유래 화합물을 생산하기 위한 한가지 대안은 생물 유래 화합물 경로 중간산물을 생물 유래 화합물로 변환할 수 있는 다른 미생물 유기체를 추가함으로써 이루어진다. 이러한 생산으로는 예를 들어, 생물 유래 화합물 경로의 중간산물을 생산하는 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 생물 유래 화합물 경로의 중간산물은 이후 생물 유래 화합물 경로의 중간산물을 생물 유래 화합물로 변환하는 제2 미생물 유기체에 대해 기질로 이용할 수 있다. 생물 유래 화합물 경로의 중간산물은 제2 유기체의 다른 배양물에 직접 첨가하거나, 또는 중간산물 생산체의 오리지널 배양물을, 예를 들어, 세포 분리에 의해 이들 미생물 유기체를 제거한 다음, 발효 브로스에 제2 유기체를 후속적으로 첨가함으로써 중간산물의 정제 단계없이 최종 생산물을 제조할 수 있다.
본원에 제공된 교시 내용 및 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 생물 유래 화합물을 생산하기 위해, 다른 미생물 유기체, 서브-경로를 구비한 다른 비-자연 발생 미생물 유기체들의 공동-배양 및 당해 기술 분야에 잘 알려진 다른 화학적 및/또는 생화학적 공정들의 조합과 함께, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체 및 방법에 대해 매우 다양한 조합 및 치환들이 존재한다는 것을, 이해할 것이다.
마찬가지로, 당해 기술 분야의 당업자라면, NADH 또는 생물 유래 화합물의 합성 또는 생산을 높이기 위해 하나 이상의 유전자 파괴를 도입하고자 하는 요망하는 특성을 토대로 숙주 유기체를 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 이에, 만일 유전자를 파괴하기 위해 숙주 유기체에 유전자 변형을 도입하고자 한다면, 비슷하지만 동일한 것은 아닌 대사 반응을 촉매하는 임의의 상동체, 오르소로그 또는 파라로그를 원하는 대사 반응이 충분히 파괴되도록 파괴할 수 있는 것으로 이해된다. 여러가지 유기체들 간의 대사 네크워크들에는 일부 차이가 존재하므로, 당해 기술 분야의 당업자는 소정의 유기체에서 파괴할 실제 유전자에는 유기체들 간에 다를 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 본원에 제공된 교시 내용 및 지침을 감안해, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 기술된 방법을 임의의 적절한 숙주 미생물에 적용해 NADH 또는 생물 유래 화합물의 생합성을 높이게 될 대상 종의 유기체를 구축하는데 필요한 동계 대사 변이를 식별할 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 생산 증가는 NADH 또는 생물 유래 화합물의 생합성을 유기체의 증식과 연계되므로, 필요에 따라 본원에 기술된 바와 같이 NADH 또는 생물 유래 화합물의 생산을 유기체의 증식과 필연적으로 연계시킬 수 있다.
생물 유래 화합물 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산의 원천으로는 예를 들어 암호화된 유전자 산물이 참조 반응을 촉매할 수 있는 임의 종을 포함할 수 있다. 이러한 종은 원핵생물 및 진핵생물 유기체 둘다를 포함하며, 비-제한적인 예로는 고세균 및 유박테리아 등의 박테리아, 및 효모, 식물, 곤충, 동물 및 포유류, 예로 인간 등의 진핵생물 등이 있다. 이러한 원천에 대한 예시적인 종으로는, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 아비에스 그란디스 (Abies grandis), 아세토박터 아세티 (Acetobacter aceti), 아세토박터 파스테리안스 (Acetobacter pasteurians), 아크로모박터 데니트리피칸스 (Achromobacter denitrificans), 액시드아미노코커스 퍼멘탄스 (Acidaminococcus fermentans), 아시네토박터 바우마니이 (Acinetobacter baumannii) Naval-82, 아시네토박터 바일리이 (Acinetobacter baylyi), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 sp. ADP1, 아시네토박터 sp. 균주 M-1, 액티노바실러스 숙시노게네스 (Actinobacillus succinogenes), 액티노바실러스 숙시노게네스 130Z, 에어로피룸 퍼닉스 (Aeropyrum pernix), 아그로박테리움 투메팍시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 알칼리필러스 메탈리레디게네스 (Alkaliphilus metalliredigenes) QYF, 알로크로마튬 비노숨 (Allochromatium vinosum) DSM 180, 아미노모나스 아미노보러스 (Aminomonas aminovorus), 아미콜리시코커스 섭플라부스 (Amycolicicoccus subflavus) DQS3-9A1, 안에어로비오스피릴륨 숙시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens), 안에어로트룬쿠스 콜리호미니스 (Anaerotruncus colihominis), 아퀴펙스 에어롤리쿠스 (Aquifex aeolicus) VF5, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 아라비돕시스 탈리아나 col, 아르카에글루부스 풀기두스 (Archaeglubus fulgidus), 아르카에오글로부스 풀기두스 (Archaeoglobus fulgidus), 아르카에오글로부스 풀리두스 DSM 4304, 아르트로박터 글로비포르미스 (Arthrobacter globiformis), 아스카리스 숨 (Ascaris suum), 아스퍼질러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 나이거 CBS 513.88, 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus) NIH2624, 아토포비움 파르불럼 (Atopobium parvulum) DSM 20469), 아조토박터 비넬란디이 (Azotobacter vinelandii) DJ, 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alcalophilus) ATCC 27647, 바실러스 아조토포르만스 (Bacillus azotoformans) LMG 9581, 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 세레우스 ATCC 14579, 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans) 36D1, 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 메타놀리쿠스 (Bacillus methanolicus) MGA3, 바실러스 메타놀리쿠스 PB1, 바실러스 메타놀리쿠스 PB-1, 바실러스 셀레니티레두센스 (Bacillus selenitireducens) MLS10, 바실러스 스미티이 (Bacillus smithii), 바실러스 스파에리쿠스 (Bacillus sphaericus), 바실러스 섭틸러스 (Bacillus subtilis), 박테로이데스 카필로수스 (Bacteroides capillosus), 비피도박테리움 아니말리스 락티스 (Bifidobacterium animalis lactis), 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 덴티움 (Bifidobacterium dentium) ATCC 27678, 비피도박테리움 슈도롱검 아종 글로보숨 (Bifidobacterium pseudolongum subsp . globosum), 보스 타우러스 (Bos taurus), 버크홀데리아 세노세팍시아 (Burkholderia cenocepacia), 버크폴데리아 멀티보란스 (Burkholderia multivorans), 버크홀데리아 피로시니아 (Burkholderia pyrrocinia), 버크홀데리아 스타빌리스 (Burkholderia stabilis), 버크홀데리아 타일란덴시스 (Burkholderia thailandensis) E264, 버크홀데리아 제노보란스 (Burkholderia xenovorans), 부티레이트-생산 박테리아 L2-50, 카에노르하브디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans), 캄필로박터 쿠르부스 (Campylobacter curvus) 525.92, 캄필로막터 제주니 (Campylobacter jejuni), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 보이디니이 (Candida boidinii), 칸디다 메틸리카 (Candida methylica), 칸디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 칸디다 트로피칼리스 MYA-3404, 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스 Z-2901, 카스텔라니엘라 데프라그란스 (Castellaniella defragrans), 카울로박터 sp. (Caulobacter sp.) AP07, 클라미도모나스 레인하르드티이 (Chlamydomonas reinhardtii), 클로로비움 파에오박테로이데스 (Chlorobium phaeobacteroides) DSM 266, 클로로비움 리미콜라 (Chlorobium limicola), 클로로비움 테피둠 (Chlorobium tepidum), 클로로플렉수스 아그레간스 (Chloroflexus aggregans) DSM 9485, 클로로플렉스 아우란티아쿠스 (Chloroflexus aurantiacus), 클로로플렉수스 아우란티아쿠스 (Chloroflexus aurantiacus) J-10-fl, 시트로박터 코세리 (Citrobacter koseri) ATCC BAA-895, 시트로박터 용개 (Citrobacter youngae), 시트로박터 용개 ATCC 29220, 클로스트리듐 아세토부틸리컴 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 아세토부틸리컴 ATCC 824, 클로스트리듐 아시두리시 (Clostridium acidurici), 클로스트리듐 아미노부티리컴 (Clostridium aminobutyricum), 클로스트리듐 아스파라기포름 (Clostridium asparagiforme) DSM 15981, 클로스트리듐 베이에린키이 (Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 베이에린키이 NCIMB 8052, 클로스트리듐 베이에린키이 NRRL B593, 클로스트리듐 베이에린키이 (Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 보테아에 (Clostridium bolteae) ATCC BAA-613, 클로스트리듐 보툴리눔 C str. 에크런드 (Clostridium botulinum C str. Eklund), 클로스트리듐 카르복시디보란스 P7 (Clostridium carboxidivorans P7), 클로스트리듐 셀룰로리티컴 H10 (Clostridium cellulolyticum H10), 클로스트리듐 셀룰로보란스 743B (Clostridium cellulovorans 743B), 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile), 클로스트리듐 디피실 630 (Clostridium difficile 630), 클로스트리듐 히라노니스 (Clostridium hiranonis) DSM 13275, 클로스트리듐 힐레모나 (Clostridium hylemonae) DSM 15053, 클로스트리듐 글루베리 (Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 클루베리 DSM 555, 클로스트리듐 융달리 (Clostridium ljungdahli), 클로스트리듐 융달리 DSM, 클로스트리듐 융달리 DSM 13528, 클로스트리듐 메틸펜토숨 (Clostridium methylpentosum) DSM 5476, 클로스트리듐 노비이 (Clostridium novyi) NT, 클로스트리듐 파스테우리아눔 (Clostridium pasteurianum), 클로스트리듐 파스테우리아눔 DSM 525, 클로스트리듐 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 퍼프린겐스 ATCC 13124, 클로스트리듐 퍼프린겐스 str. 13, 클로스트리듐 피토퍼멘탄스 ISDg (Clostridium phytofermentans ISDg), 클로스트리듐 프로피오니컴 (Clostridium propionicum), 클로스트리듐 사카로부틸리컴 (Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니컴 N1-4, 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 코마모나스 sp. CNB-1 (Comamonas sp. CNB-1), 코마모나스 sp. CNB-1, 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032, 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 14067, 코리네박테리움 글루타미컴 R, 코리네박테리움 sp., 코리네박테리움 sp. U-96, 코리네박테리움 베리어빌 (Corynebacterium variabile), 크립토스포리듐 파르붐 아이오와 II (Cryptosporidium parvum Iowa II), 쿠쿠미스 사티부스 (Cucumis sativus), 쿠프리아비두스 네카토르 N-1 (Cupriavidus necator N-1), 시아노비움 PCC7001 (Cyanobium PCC7001), 데이노코커스 라디오두란스 R1 (Deinococcus radiodurans R1), 데설파티바실럼 알케니보란스 (Desulfatibacillum alkenivorans) AK-01, 데설피토박테리움 하프니엔스 (Desulfitobacterium hafniense), 데설피토박테리움 메탈리두센스 (Desulfitobacterium metallireducens) DSM 15288, 데설포토마쿨럼 레두센스 (Desulfotomaculum reducens) MI-1, 데설포비브리오 아프리카누스 (Desulfovibrio africanus), 데설포비브리오 아프리카누스 str. 발비스 베이 (esulfovibrio africanus str. Walvis Bay), 데설포비브리오 데설푸리칸스 G20, 데설포비브리오 데설푸리칸스 아종 데설푸리칸스 str. (Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str .) ATCC 27774, 데설포비브리오 프럭토소보란스 (Desulfovibrio fructosovorans) JJ, 데설포비브리오 불가리스 str. 힐덴보로우그흐 (Desulfovibrio vulgaris str. Hildenborough), 딕티오스텔리움 디스코이데움 AX4 (Dictyostelium discoideum AX4), 엘리자베스킹기아 메닝고셉티카 (Elizabethkingia meningoseptica), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 에리트로박터 sp. NAP1 (Erythrobacter sp . NAP1), 에세케리키아 콜라이 C (Escherichia coli C), 에세케리키아 콜라이 K12, 에세케리키아 콜라이 K-12 MG1655, 에세케리키아 콜라이 W, 유박테리움 바케리 (Eubacterium barkeri), 유박테리움 할리 (Eubacterium hallii) DSM 3353, 유박테리움 렉탈 (Eubacterium rectale) ATCC 33656, 유글레나 그라실리스 (Euglena gracilis), 플라보박테리움 프리고리스 (Flavobacterium frigoris), 푸소박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 푸소박테리움 뉴클레아툼 아종 폴리모르품 (Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum) ATCC 10953, 지오바실러스 sp. GHH01 (Geobacillus sp. GHH01), 지오바실러스 sp. M10EXG (Geobacillus sp. M10EXG), 지오바실러스 sp. Y4.1MC1 (Geobacillus sp. Y4.1MC1), 지오바실러스 스테아로서모필러스 (Geobacillus stearothermophilus), 지오바실러스 테모데니트리피칸스 NG80-2 (Geobacillus themodenitrificans NG80-2), 지오바실러스 서모글루코시다시우스 (Geobacillus thermoglucosidasius), 지오박터 베미드지엔시스 Bem (Geobacter bemidjiensis Bem), 지오박터 메탈리레두센스 GS-15 (Geobacter metallireducens GS-15), 지오박터 설퍼레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 지오박터 설퍼레두센스 PCA (Geobacter sulfurreducens PCA), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 할로아루쿨라 마리스모르투이 (Haloarcula marismortui), 할로아르쿨라 마리스모르투이 ATCC 43049, 할로박테리움 살리나룸 (Halobacterium salinarum), 한세뉼라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) DL-1, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 헬리코박터 필로리 26695, 헬리오박터 필로리 (Heliobacter pylori), 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 인간 장 메타게놈 (human gut metagenome), 하이드로게노박터 서모필러스 (Hydrogenobacter thermophilus), 하이드로게노박터 서모필러스 TK-6, 히포마이크로비움 데니트리피칸스 (Hyphomicrobium denitrificans) ATCC 51888, 히포마이크로비움 자바르지니이 (Hyphomicrobium zavarzinii), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니애 아종 뉴모니애 MGH 78578 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클로이베로마이세스 락티스 NRRL Y-1140, 락토바실러스 액시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) ATCC 367, 락토바실러스 파라플란타룸 (Lactobacillus paraplantarum), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 루코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides), 리시니바실러스 푸시포르미스 (Lysinibacillus fusiformis), 리시니바실러스 스페어리쿠스 (Lysinibacillus sphaericus), 말루스 x 도메스티카 (Malus x domestica), 만하이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens), 마린 감마 프로테오박테리움 (marine gamma proteobacterium) HTCC2080, 마린 메타게놈 JCVI_SCAF_1096627185304, 메소리조비움 로티 (Mesorhizobium loti) MAFF303099, 메탈로스페라 세둘러 (Metallosphaera sedula), 메타리지움 아크리둠 (Metarhizium acridum) CQMa 102, 메타노칼도코커스 야나스키 (Methanocaldococcus janaschii), 메타노칼도코커스 야나스키 (Methanocaldococcus jannaschii), 메타노사르시나 아세티보란스 (Methanosarcina acetivorans), 메타노사르시나 아세티보란스 C2A, 메타노사르시나 바케리 (Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 마제이 (Methanosarcina mazei), 메타노사르시나 마제이 Tuc01, 메타노사르시나 서모필라 (Methanosarcina thermophila), 메타노서모박터 서마유토트로피쿠스 (Methanothermobacter thermautotrophicus), 메틸리비움 페트롤레이필럼 PM1 (Methylibium petroleiphilum PM1), 메틸로바실러스 플라게라투스 (Methylobacillus flagellatus), 메틸로바실러스 플라게라투스 KT, 메틸로박터 마리누스 (Methylobacter marinus), 메틸로박테리움 엑스토르??스 (Methylobacterium extorquens), 메틸로박테리움 엑스토르??스 AM1, 메틸로코커스 캡슐라타스 (Methylococcus capsulatas), 메틸로마이크로비움 알붐 BG8 (Methylomicrobium album BG8), 메틸로모나스 아미노팩시엔스 (Methylomonas aminofaciens), 메틸로보러스 글루코세트로푸스 SIP3-4 (Methylovorus glucosetrophus SIP3-4), 메틸로보러스 sp. MP688, 무렐라 서모아세티카 (Moorella thermoacetica), 무스 무스쿨러스 (Mus musculus), 마이코박테리아 sp. 균주 JC1 DSM 3803 (Mycobacter sp. strain JC1 DSM 3803), 미코박테리움 아비움 아중 파라투베르쿨로시스 K-10 (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10), 마이코박테리움 보비스 BCG (Mycobacterium bovis BCG), 마이코박테리움 가스트리 (Mycobacterium gastri), 마이코박테리움 마리눔 M (Mycobacterium marinum M), 미코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis), 미코박테리움 스메그마티스 MC2 155 (Mycobacterium smegmatis MC2 155), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라스마 뉴모니애 M129 (Mycoplasma pneumoniae M129), 나트란에어로비우스 서모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 넥트리아 헤마토코카 mpVI 77-13-4 (Nectria haematococca mpVI 77-13-4), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 니트로소스페라 가르겐시스 Ga9.2 (Nitrososphaera gargensis Ga9.2), 노카르디아 브라실렌시스 (Nocardia brasiliensis), 노카르디아 파르시니카 IFM 10152 (Nocardia farcinica IFM 10152), 노카르디아 아이오웬시스 (Nocardia iowensis), 노카르디아 아이오웬시스 (sp. NRRL 5646), 노스톡 sp. PCC 7120 (Nostoc sp. PCC 7120), 오가타에아 파라폴리모르파 DL-1 (Ogataea parapolymorpha DL-1)(한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) DL-1), 유기체, 오릭톨라구스 쿠니쿨러스 (Oryctolagus cuniculus), 옥살로박터 포르미게네스 (Oxalobacter formigenes), 파에니바실러스 페오리애 (Paenibacillus peoriae) KCTC 3763, 파라코커스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans), 펠로박터 카르비놀리쿠스 (Pelobacter carbinolicus) DSM 2380, 펠로토마쿨럼 서모프로피오니컴 (Pelotomaculum thermopropionicum), 페니실리움 크리소게눔 (Penicillium chrysogenum), 퍼킨수스 마리누스 (Perkinsus marinus) ATCC 50983, 포토박테리움 프로푼둠 3TCK (Photobacterium profundum 3TCK), 피세아 아비에스 (Picea abies), 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris), 피크로필러스 토리두스 (Picrophilus torridus) DSM9790, 피누스 사비니아나 (Pinus sabiniana), 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 포풀러스 알바 (Populus alba), 포풀러스 트레물라 (Populus tremula) x 포풀러스 알바 (Populus alba), 포르피로모나스 깅기발리스 (Porphyromonas gingivalis), 포르피로모나스 깅기발리스 W83, 프로피오니박테리움 아크네 (Propionibacterium acnes), 프로피오니박테리움 프레덴라이치이 sp. 세르마니 (Propionibacterium fredenreichii sp. shermanii), 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 에어루지노사 PA01, 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 크낙크무시 (Pseudomonas knackmussii), 슈도모나스 크낙크무시 (B13), 슈도모나스 멘도시나 (Pseudomonas mendocina), 슈도모나스 푸티타 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 sp (Pseudomonas sp), 슈도모나스 시링게 pv. 시링게 B728a (Pseudomonas syringae pv. syringae B728a), 사이크로플렉수스 토르퀴스 (Psychroflexus torquis) ATCC 700755, 푸에르아리아 몬타나 (Pueraria montana), 피로바쿨럼 에어로필룸 str. IM2 (Pyrobaculum aerophilum str. IM2), 피로바쿨룸 이슬란디쿰 (Pyrobaculum islandicum) DSM 4184, 피로코커스 아비시 (Pyrococcus abyssi), 피로코커스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코시 OT3 (Pyrococcus horikoshii OT3), 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha), 랄스토니아 유트로파 H16 (Ralstonia eutropha H16), 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus), 리조비움 레구미노사룸 (Rhizobium leguminosarum), 로도박터 캡슐라투스 (Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스페어로이데스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도박터 스페어로이데스 ATCC 17025, 로도코커스 오파쿠스 B4 (Rhodococcus opacus B4), 로도코커스 루버 (Rhodococcus ruber), 로도수도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 로도수도모나스 팔루스트리스 CGA009 (Rhodopseudomonas palustris CGA009), 로도스피릴룸 루브럼 (Rhodospirillum rubrum), 로도스피릴룸 루브럼 (Rhodospirillum rubrum) ATCC 11170, 로제부리아 인테스티날리스 L1-82 (Roseburia intestinalis L1-82), 로제부리아 이뉼리니보란스 (Roseburia inulinivorans), 로제부리아 sp. A2-183, 로세이플렉수스 카스텐홀지이 (Roseiflexus castenholzii), 루브리비박스 젤라티노수스 (Rubrivivax gelatinosus), 루미노코커스 오베움 (Ruminococcus obeum) ATCC 29174, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 세레비지애 s288c, 사카로마이세스 클루이베리 (Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces serevisiae), 사카로마이세스 세레비지애 (Sachharomyces cerevisiae), 살모넬라 엔테릭 (Salmonella enteric), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 엔테리카 아종 아리조나 세로바 (Salmonella enterica subsp. arizonae serovar), 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 세로바 티피무리움 str. LT2 (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2), 살모넬라 엔테리카 티피무리움 (Salmonella enterica Typhimurium), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피무리움 LT2, 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 세발델라 터미티디스 (Sebaldella termitidis) ATCC 33386, 세라티아 프로테아마쿨란스 (Serratia proteamaculans), 슈와넬라 오네이덴시스 MR-1 (hewanella oneidensis MR-1), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시노리조비움 멜릴로티 1021 (Sinorhizobium meliloti 1021), 솔라눔 라이코페르시컴 (Solanum lycopersicum), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스테레움 히르수텀 FP-91666 SS1 (Stereum hirsutum FP-91666 SS1), 스트렙토코커스 무탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia), 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) ATCC 10782, 스트렙토마이세스 아눌라투스 (Streptomyces anulatus), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 (Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 신나모넨시스 (Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 클라불리게루스 (Streptomyces clavuligerus), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2) (Streptomyces coelicolor A3(2)), 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 그리세우스 아종 그리세우스 (Streptomyces griseus subsp. griseus) NBRC 13350, 스트렙토마이세스 sp CL190, 스트렙토마이세스 sp. 2065, 스트렙토마이세스 sp. ACT-1, 스트렙토마이세스 sp. KO-3988, 설폴로부스 액시도칼라리우스 (Sulfolobus acidocalarius), 설폴로부스 액시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius), 설폴로부스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus), 설폴로부스 솔파타리쿠스 P-2, 설폴로부스 sp. 균주 7 (Sulfolobus sp. strain 7), 설폴로부스 토코다이 (Sulfolobus tokodaii), 설푸리모나스 데니트리피칸스 (Sulfurimonas denitrificans), 수스 스크로파 (Sus scrofa), 시네코코쿠스 엘롱가투스 PCC 7942 (Synechococcus elongatus PCC 7942), 시네코코쿠스 sp. PCC 7002 (Synechococcus sp. PCC 7002), 시네코시스티스 str. PCC 6803, 신트로포박터 푸마록시단스 (Syntrophobacter fumaroxidans), 타우에라 아로마티카 (Thauera aromatica), 서모안에어로박터 브로키이 HTD4 (Thermoanaerobacter brockii HTD4), 서모안에어로박터 sp. X514, 서모안에어로박터 텡콩엔시스 MB4 (Thermoanaerobacter sp. X514, Thermoanaerobacter tengcongensis MB4), 서모코커스 코다카라엔시스 (Thermococcus kodakaraensis), 서모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 써모플라스마 액시도필룸 (Thermoplasma acidophilum), 서모프로테우스 뉴크로필러스 (Thermoproteus neutrophilus), 서모토가 마리티마 (Thermotoga maritima), 서모토가 마리팀 (Thermotoga maritime), 서모토가 마리팀 MSB8, 서무스 서모필러스 (hermus thermophilus), 티오캅사 로제오페르시시나 (Thiocapsa roseopersicina), 톨루모나스 아우렌시스 (Tolumonas auensis) DSM 9187, 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 트리코모나스 바기날리스 G3 (Trichomonas vaginalis G3), 트리티컴 아에스티붐 (Triticum aestivum,), 트립파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 츠카무렐라 파우로메타볼라 (Tsukamurella paurometabola) DSM 20162, 미배양 박테리움 (Uncultured bacterium), 미배양 유기체, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 비브리오 하르베이 (Vibrio harveyi) ATCC BAA-1116, 크산토박터 아우토트로피쿠스 Py2 (Xanthobacter autotrophicus Py2), 야로이와 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 예르시니아 프레데릭세니 (Yersinia frederiksenii), 예르시니아 인터메디아 (Yersinia intermedia), 예르시니아 인터메디아 (Yersinia intermedia) ATCC 29909, 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 지 메이스 (Zea mays), 주글로에아 라미게라 (Zoogloea ramigera), 자이모모나스 모빌러스 (Zymomonas mobilus)뿐 아니라 본원에 기술되거나 또는 해당 유전자에 대한 원천 유기체로서 이용가능한 다른 예시 종들 등이 있다. 그러나, 미생물 게놈 395종과 다양한 효모, 진균, 식물 및 포유류 게놈을 비롯해, 현재 550종 이상에서 이용가능한 전체 게놈 서열을 이용해 (NCBI와 같은 공공의 데이터베이스에서 이용가능한 데이터의 절반 이상을 이용해), 공지 유전자의 상동체, 오르소로그, 파라로그 및 비-오르소로거스 유전자 치환 등의, 관련 또는 동떨어진 종들에서 하나 이상의 유전자에 대해 필요한 생물 유래 화합물 생합성 활성을 코딩하는 유전자의 동정, 및 유기체들 간의 유전자 변이의 상호 교환은 일반적이며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이에, E. coli와 같은 특정 유기체를 참조하여 본원에 기술된 생물 유래 화합물의 생합성을 허용하는 대사 변이를, 비슷한 원핵생물 및 진핵생물 유기체 등의 미생물에 쉽게 적용할 수 있다. 본원에 제공된 교시 내용 및 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자라면 하나의 유기체에서 예시된 대사 변이가 다른 유기체에도 동일하게 적용될 수 있음을 알 것이다.
대안적인 생물 유래 화합물의 생합성 경로가 비-관련 종에 존재하는 경우와 같이 일부 경우에, 생물 유래 화합물의 생합성은, 예를 들어, 참조 반응을 대체하기 위해 비슷하지만 동일하진 않은 대사 반응을 촉매하는 비-관련 종들로부터 유래한 파라로그 또는 파라로그들의 외인성 발현을 통해, 숙주 종에 부여할 수 있다. 여러가지 유기체들 간에 대사 네트워크에 일부 차이가 존재하므로, 당해 기술 분야의 당업자라면 서로 다른 유기체들 간의 실제 유전자 용법 (gene usage)이 다를 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 본원에 제공된 교시 내용 및 지침을 감안해, 당해 기술 분야의 당업자라면, 또한 생물 유래 화합물을 합성할 미생물 유기체를 대상 종에서 구축하기 위해 본원에 예시된 내용에 대한 동계 (cognate) 대사 변형을 이용함으로써 모든 미생물 유기체들에 본원에 기술된 교시 내용 및 방법을 적용할 수 있음을, 이해할 것이다.
비-자연 발생 생물 유래 화합을 생산하는 숙주를 구축하고 발현 수준을 검사하는 방법은, 예를 들어, 당해 기술 분야에 잘 알려진 재조합 및 검출 방법에 의해 수행할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)에서 확인할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 조작된 프로메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 NADH 또는 생물 유래 화합물의 생산 경로에 참여하는 하나 이상의 효소 또는 단백질을 암호화하는 외인성 핵산은, 비-제한적인 예로, 접합, 전기천공, 화학적 형질전환, 형질도입, 형질감염 및 초음파 형질전환 등의 당해 기술 분야에 잘 알려진 기법을 이용해 미생물 유기체에 안정적으로 또는 일시적으로 도입할 수 있다. E. coli 또는 기타 원핵생물 세포에서 외인성 발현을 달성하기 위해, 진핵생물 핵산의 유전자 또는 cDNA의 일부 뉴클레오티드 서열은 N-말단 미토콘드리아 또는 기타 표적화 신호와 같은 표적화 신호를 암호화할 수 있으며, 이는 필요에 따라 원핵생물 미생물 유기체에 형질전환하기 전에 제거될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 리더 서열의 제거는 E. coli에서 발현 증가로 이어진다 (Hoffmeister et al., J. Biol . Chem. 280:4329-4338 (2005)). 효모 또는 기타 진핵생물 세포에서 외인성 발현을 위해, 유전자는 리더 서열의 부가 없이 세포질에서 발현시키거나, 또는 미생물 유기체에 적합한 미토콘드리아 표적화 또는 방출 신호와 같은 적절한 표적화 서열을 부가함으로써, 미토콘드리아 또는 그외 소기관으로 표적화하거나 또는 분비하도록 표적화할 수 있다. 따라서, 표적화 서열을 제거 또는 포함하기 위한 핵산 서열에의 적절한 변형은 원하는 특성을 부여하기 위해 외인성 핵산 서열에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 유전자는 단백질의 최적화된 발현을 달성하기 위해 당해 기술 분야에 잘 알려진 기법으로 코돈 최적화를 이행할 수 있도다.
발현 벡터 또는 벡터는, 본원에 기술된 바와 같이, 숙주 유기체에서 기능하는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 본원에 기술된 생물 유래 화합물 생합성 경로의 하나 이상의 효소 또는 단백질을 암호화하는 외인성 핵산 서열을, 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산 서열을, 함유하도록 구축될 수 있다. 본원에 기술된 숙주 유기체에서 이용하기에 적합한 발현 벡터로는, 예를 들어, 벡터 및 숙주 염색체에 안정적으로 삽입하기 위해 작동가능한 선별 서열 또는 마커를 포함한, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체 등이 있다. 또한, 발현 벡터는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자 및 적절한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대해 내성을 제공하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나 또는 배양 배지에 없는 중요한 영양분을 공급하는, 선별가능한 마커 유전자가 포함될 수 있다. 발현 조절 서열은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있는 구성적인 (constitutive) 프로모터, 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결인자 등을 포함할 수 있다. 2 이상의 재조합 및/또는 외인성 암호화 핵산을 공동-발현시킬 경우, 이들 2종의 핵산은, 예를 들어, 단일한 발현 벡터에 또는 개별 발현 벡터들에 삽입시킬 수 있다. 단일한 벡터 발현의 경우, 암호화 핵산에 하나의 공통적인 발현 조절 서열을 작동가능하게 연결하거나 또는 유도 프로모터 1개 및 구성적 프로모터 1개 등의 서로 다른 발현 조절 서열을 작동가능하게 연결할 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 참여하는 재조합 또는 외인성 핵산의 형질전환은 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 검증할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들어, mRNA 노던 블롯 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭과 같은 핵산 분석, 또는 유전자 산물 발현에 대한 면역블롯팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 이의 대응되는 유전자 산물의 발현을 검사하기 위한 그외 적절한 분석 방법 등이 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 재조합 및/또는 외인성 핵산이 원하는 생산물을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 것으로 이해할 것이며, 또한 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법 및 본원에 기술된 방법을 이용해 충분한 발현을 수득하도록 발현 수준을 최적화할 수 있는 것으로 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본원에 기술된 바와 같은 비-자연 발생 미생물 유기체를 생물 유래 화합물을 생산하기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함할 수 있다. 이에, 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 숙주 세포를 생물 유래 화합물을 생산하기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함하는 본원에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물을 배양물의 다른 성분으로 분리하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 측면에서, 분리로는 추출, 연속적인 액체-액체 추출, 투과증발 (pervaporation), 막 여과, 막 분리, 역 삼투압, 전기 투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과 (extractive filtration), 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 또는 한외여과 등이 있다.
일부 구현예에서, 생물 유래 화합물에 따라, 본원에 기술된 방법은 생물 유래 화합물을 지정된 최종 화합물로 화학적으로 변환하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물 유래 화합물이 부타다이엔일 경우, 본원에 기술된 방법은 1,3-부탄다이올, 크로틸알코올 또는 3-부텐-2-올을 화학적으로 탈수하여 부타다이엔을 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
적절한 정제 및/또는 NADH 또는 생물 유래 화합물의 생산을 검사하기 위한 분석은 잘 알려진 방법을 이용해 수행할 수 있다. 검사할 각 조작된 균주를 트리플리케이트 (triplicate) 배양과 같은 적절한 레플리케이트로 배양할 수 있다. 예를 들어, 조작된 생산 숙주에서 생산물 및 부산물의 생산을 모니터링할 수 있다. 최종 생산물 및 중간산물, 및 기타 유기 화합물은 HPLC (고 성능 액체 크로마토그래피), GC-MS (가스 크로마토그래피-질량 분광분석) 및 LC-MS (액체 크로마토그래피-질량 분광분석) 또는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 통상적인 공정을 이용한 그외 적합한 분석 방법 등의 방법으로 분석할 수 있다. 발효 브로스로의 생산물의 방출을 또한 배양 상층액을 이용해 검사할 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코스는, 예를 들어, 글루코스 및 알코올에 대한 굴절율 검출기, 및 유기산에 대한 UV 검출기를 이용해, HPLC에 의해 또는 당해 기술 분야에 잘 알려진 그외 적합한 분석 및 검출 방법으로 정량할 수 있다 (Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)). 또한, 재조합 및/또는 외인성 핵산으로부터 유래하는 개별 효소 또는 단백질의 활성도 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용해 분석할 수 있다.
생물 유래 화합물은 당해 기술 분야에 잘 알려진 다양한 방법을 이용해 배양물의 다른 성분들로부터 분리할 수 있다. 이러한 분리 방법으로는, 예를 들어, 추출 공정뿐 아니라 연속적인 액체-액체 추출, 투과증발, 막 여과, 막 분리, 역 삼투압, 전기 투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 및 한외여과를 포함하는 방법 등이 있다. 전술한 방법들 모두 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.
본원에 기술된 임의의 비-자연 발생 미생물 유기체를 배양하여 본원에 기술된 생합성 생산물을 생산 및/또는 분비시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 생물 유래 화합물을 생합성을 통해 생산하기 위해 생물 유래 화합물 생산체를 배양할 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 본 발명은 생물 유래 화합물 또는 본원에 기술된 생물 유래 화합물 경로 중간산물을 함유한 배양물 배지를 제공한다. 일부 측면에서, 배양물 배지는 또한 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물을 생산하는 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체로부터 분리될 수 있다. 배양물 배지로부터 미생물 유기체를 분리하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예시적인 방법으로는 여과, 응집 (flocculation), 석출, 원심분리, 침강 등이 있다.
NADH 또는 생물 유래 화합물을 생산하는 경우, 재조합 균주를 탄소원 및 기타 필수 영양분이 첨가된 배지에서 배양한다. 전체 공정의 비용을 줄이기 위해 발효 장치를 혐기성 상태로 유지시키는 것이 종종 바람직하며, 매우 바람직할 수 있다. 이러한 조건은, 예를 들어, 배지를 질소로 퍼징한 다음 격막 (septum) 및 크림프-캡 (crimp-cap)으로 플라스크를 밀봉함으로써, 달성할 수 있다. 혐기성 상태에서는 증식이 관찰되지 않는 균주의 경우, 제한적인 호기를 위해 격막에 작은 구멍을 뚫어 미세호기 (microaerobic) 또는 실질적으로 혐기 조건을 적용할 수 있다. 예시적인 혐기 조건들은 기존에 언급되어 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 호기 및 혐기 조건들은 2007년 8월 10일에 출원된 미국 특허 공개공보 2009/0047719에 기술되어 있다. 발효는 본원에 기술된 바와 같이 배치, 피드-배치 또는 연속적인 방식으로 수행할 수 있다. 또한, 발효는 필요에 따른 2 단계로 수행할 수 있다. 제1 단계는 높은 증식, 즉 높은 생산성을 허용하기 위한 호기성 단계일 수 있으며, 그 후 생물 유래 화합물을 고 수율로 수득하기 위한 혐기성 단계가 후속될 수 있다.
배지의 pH는, 필요에 따라 배양 배지를 원하는 pH에서 유지하기 위해, 필요에 따라 NaOH 또는 기타 염기와 같은 염기 또는 산을 첨가함으로써, 원하는 pH, 특히 pH7과 같은 중성 pH로 유지시킬 수 있다. 증식율은 분광광도계 (600 nm)를 사용해 광학 밀도를 측정함으로써 확인할 수 있으며, 글루코스 흡수율 (glucose uptake rate)은 시간 경과에 따른 탄소원 고갈을 모니터링함으로써 결정할 수 있다.
증식 배지는 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체에 탄소원을 공급할 수 있는 임의의 탄수화물 소스를 포함할 수 있다. 이러한 소스로는, 예를 들어, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 슈크로스 및 전분과 같은 당; 또는 글리세롤 등이 있으며, 탄소원은 유일한 탄소원으로서 단독으로 또는 본원에 기술되거나 당해 기술 분야에 공지된 다른 탄소원과 조합하여 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 탄소원은 당이다. 일 구현예에서, 탄소원은 당-함유 바이오매스 (biomass)이다. 일부 구현예에서, 당은 글루코스이다. 일 구현예에서, 당은 자일로스이다. 다른 구현예에서, 당은 아라비노스이다. 일 구현예에서, 당은 갈락토스이다. 다른 구현예에서, 당은 프럭토스이다. 다른 구현예에서, 당은 슈크로스이다. 일 구현예에서, 당은 전분이다. 특정 구현예에서, 탄소원은 글리세롤이다. 일부 구현예에서, 탄소원은 비정제 글리세롤이다. 일 구현예에서, 탄소원은 가공되지 않은 비정제 글리세롤이다. 다른 구현예에서, 탄소원은 글리세롤 및 글루코스이다. 다른 구현예에서, 탄소원은 메탄올 및 글리세롤이다. 일 구현예에서, 탄소원은 이산화탄소이다. 일 구현예에서, 탄소원은 포르메이트이다. 일 구현예에서, 탄소원은 메탄이다. 일 구현예에서, 탄소원은 메탄올이다. 특정 구현예에서, 메탄올은 유일한 탄소원으로 단독으로 사용되거나 또는 본원에 공지되거나 또는 당해 기술 분야에 공지된 다른 탄소원과 조합하여 사용된다. 구체적인 구현예에서, 메탄올이 유일한 (단독) 탄소원이다. 일 구현예에서, 탄소원은 화학전자-생성 탄소이다 (예를 들어, Liao et al. (2012) Science 335:1596). 일 구현예에서, 화학전자-생성 탄소는 메탄올이다. 일 구현예에서, 화학전자-생성 탄소는 포르메이트이다. 일 구현예에서, 화학전자-생성 탄소는 포르메이트 및 메탄올이다. 일 구현예에서, 탄소원은 탄수화물 및 메탄올이다. 일 구현예에서, 탄소원은 당 및 메탄올이다. 다른 구현예에서, 탄소원은 당 및 글리세롤이다. 다른 구현예에서, 탄소원은 당 및 비정제 글리세롤이다. 또 다른 구현예에서, 탄소원은 당 및 가공되지 않은 비정제 글리세롤이다. 일 구현예에서, 탄소원은 당-함유 바이오매스 및 메탄올이다. 다른 구현예에서, 탄소원은 당-함유 바이오매스 및 글리세롤이다. 다른 구현예에서, 탄소원은 당-함유 바이오매스 및 비정제 글리세롤이다. 또 다른 구현예에서, 탄소원은 당-함유 바이오매스 및 가공되지 않은 비정제 글리세롤이다. 일부 구현예에서, 탄소원은 당-함유 바이오매스, 메탄올 및 탄수화물이다. 그외 탄수화물 소스로는 예를 들어 재생가능한 공급원료 (renewable feedstock) 및 바이오매스 (biomass) 등이 있다. 본원에 제공된 방법에서 공급원료로서 사용할 수 있는 바이오매스 타입에 대한 예로는 셀룰로스 바이오매스, 헤미셀룰로스 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 일부 등이 있다. 이러한 바이오매스 공급원료는, 예를 들어, 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 및 전분과 같은 탄소원으로서 유용한 탄수화물 물질을 포함한다. 본원에 제공된 교시 내용 및 지침을 고려하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 상기에 예시된 것 이외의 재생가능한 공급원료 및 바이오매스 역시 숙시네이트 및 기타 경로 중간산물을 생산하기 위해 본원에 제공된 미생물 유기체를 배양하는데 이용할 수 있음을, 알 것이다.
본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는, 본원에 예시된 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여, NADH 또는 생물 유래 화합물을 생산하기 위해 조작된 포르메이트 데하이드로게나제 또는 생물 유래 화합물 경로의 효소 또는 단백질을 충분한 양으로 발현하도록, 구축된다. 본원에 기술된 미생물 유기체는 NADH 또는 생물 유래 화합물을 생산하기 위한 충분한 조건에서 배양되는 것으로 이해된다. 본원에 제시된 교시 내용 및 지침에 따라, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 NADH 또는 생물 유래 화합물의 생합성을 달성하여, 세포내 농도 약 0.1-200 mM 또는 그 이상을 달성할 수 있다. 일반적으로, NADH 또는 생물 유래 화합물의 세포내 농도는 약 3 내지 150 mM, 특히 약 5 내지 125 mM, 보다 구체적으로 약 8 내지 100 mM이며, 예를 들어 약 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM 또는 그 이상을 포함한다. 또한, 이들 예시 범위 사이와 그 보다 높은 세포 내 농도 역시 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체에서 달성될 수도 있다.
일부 구현예에서, 배양 조건은 혐기성 또는 실질적인 혐기성 배양 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기성 조건은 종래에 개시되어 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 발효 공정에 대한 예시적인 혐기성 조건은 본원에 기술되어 있으며, 예를 들어 2007년 8월 10일자 미국 공개공보 제2009/0047719호에 기술되어 있다. 이러한 조건들 중 임의의 조건을 비-자연 발생 미생물 유기체와 함께 이용할 수 있으며, 아울러 당해 분야에 잘 알려진 다른 혐기성 조건도 적용할 수 있다. NADH 또는 생물 유래 화합물 생산체는, 상기한 혐기성 또는 실질적인 혐기성 조건에서, NADH 또는 생물 유래 화합물을 세포 내 농도 5-10 mM 또는 그 이상으로, 아울러 본원에 예시된 다른 모든 농도로 합성할 수 있다. 전술한 내용에 세포 내 농도가 언급되어 있지만, 생물 유래 화합물을 생산하는 미생물 유기체가 생물 유래 화합물을 세포내에서 생산하거나, 및/또는 배양 배지로 생산물을 분비할 수 있는 것으로 이해된다.
발효 공정의 예로는, 비-제한적으로, 피드-배치 발효 및 배치 분리; 피드-배치 발효 및 연속 분리; 및 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다. 예시적인 배치 발효 프로토콜의 경우, 적정 기체가 퍼징되는 적절한 크기의 생물반응조에서 생산 유기체를 배양한다. 혐기성 조건에서, 배양물에 불활성 기체 또는 기체들의 조합, 예를 들어, 질소, N2/CO2 혼합물, 아르곤, 헬륨 등을 퍼징 처리한다. 세포가 증식하면서 탄소원을 이용함에 따라, 생물반응조에 탄소원 및/또는 영양분의 소모와 대략 균형을 이루는 속도로 추가적인 탄소원(들) 및/또는 기타 영양분을 투입한다. 생물반응조의 온도는 요망하는 온도, 일반적으로 22-37℃ 범위에서 유지되지만, 온도는 생산 유기체의 증식 특징 및 발효 공정의 요망하는 조건에 따라 더 높거나 또는 낮은 온도에서 유지될 수 있다. 발효 장치에서 배양물의 요망하는 특징, 예를 들어, 세포 밀도, 생산물 농도 등을 달성하기 위한 요망하는 시간 동안 증식을 계속 진행한다. 배치 발효 공정의 경우서, 발효 시간은, 요망하는 배양 조건에 따라, 일반적으로 수 시간에서 수일, 예를 들어 8시간 내지 24시간, 또는 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일, 또는 최대 1주일의 범위이다. pH는 필요에 따라 제어하거나 또는 제어하지 않을 수 있으며, pH를 제어하지 않는 배양의 경우, 운영 종료 시점까지 pH가 전형적으로 pH3-6으로 떨어질 것이다. 배양 기간이 끝나면, 발효 장치의 내용물을 세포 분리 유닛, 예를 들어 원심분리, 여과 유닛 등으로 통과시켜 세포 및 세포 파편을 취할 수 있다. 원하는 생산물이 세포 안에서 발현된 경우, 필요에 따라, 발효 브로스로부터 세포를 분리하기 전 또는 분리한 후, 부가적인 생산물을 방출시키기 위해, 세포를 효소적으로 또는 화학적으로 파괴하거나 또는 세포용해를 실시할 수 있다. 발효 브로스는 생산물 분리 유닛으로 이동시킬 수 있다. 생산물의 단리는 희석 수용액으로부터 원하는 생산물을 분리하는 당해 기술 분야에서 사용되는 표준 분리 공정에 의해 이루어진다. 이러한 방법으로는, 비-제한적으로, 발효 공정의 생산물의 화학적 특징에 따라, 생산물의 유기 용액을 제공하기 위한 수 비-혼화성 유기 용매 (예, 톨루엔 또는 그외 적절한 용매, 비-제한적인 예로, 다이에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로푸란 (THF), 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 벤젠, 펜탄, 헥산, 헵탄, 페트롤륨 에테르, 메틸 터셔리 부틸 에테르 (MTBE), 다이옥산, 다이메틸포름아미드 (DMF), 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 등)를 이용한 액체-액체 추출, 적절한 경우, 표준 증류 방법 등을 포함한다.
예시적인 완전 연속 발효 프로토콜 (fully continuous fermentation protocol)의 경우, 일반적으로 원하는 세포 밀도에 도달하기 위해 생산 유기체를 배치 방식으로 먼저 증식시킨다. 탄소원 및/또는 기타 영양분이 고갈되면, 동일 조성의 공급 배지를 원하는 속도로 연속적으로 공급하고, 발효액을 동일한 속도로 배출시킨다. 이러한 조건에서, 생물반응조 내 생산물 농도뿐 아니라 세포 밀도가 일반적으로 일정하게 유지된다. 발효 장치의 온도는 전술한 바와 같이 요망하는 온도에서 유지된다. 연속 발효 단계 동안에 일반적으로 생산을 최적화하는 데 적합한 pH 범위로 유지시키는 것이 바람직하다. pH는, 원하는 pH 범위에서 유지하기 위해 적정 산 또는 염기를 첨가하는 등의 일상적인 방법으로 유지 및 모니터링할 수 있다. 생물 반응조는 장기간 동안, 일반적으로 1주일 이상에서 수주, 최대 1달 또는 심지어 적절한 요망한 경우에는 이보다 더 긴 기간 동안 연속적으로 운영된다. 발효액 및/또는 발효 배양물은, 생산물 농도 및/또는 세포 밀도의 컨시스턴시를 확보하기 위해, 요망되는 바와 같이, 최대 매일 샘플을 취하는 등의 주기적인 모니터링을 실시한다. 연속 모드에서는, 새로운 신선한 배지를 공급하면서 발효 장치의 내용물을 일정하게 배출시킨다. 세포, 배지 및 생산물이 함유된 배출 스트림은, 일반적으로, 세포 및 세포 파편을 필요에 따라 취하면서 또는 취하지 않으면서, 생산물의 연속적인 분리 공정을 거치게 된다. 비-제한적인 예로, 수 비-혼화성 유기 용매를 이용한 연속적인 액체-액체 추출 (예, 톨루엔 또는 기타 적절한 용매, 비-제한적인 예로, 다이에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로푸란 (THF), 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 벤젠, 펜탄, 헥산, 헵탄, 페트롤륨 에테르, 메틸 터셔리 부틸 에테르 (MTBE), 다이옥산, 다이메틸포름아미드 (DMF), 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 등), 표준적인 연속 증류 방법 등 또는 그외 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법 등의, 당해 기술 분야에서 채택되는 연속적인 분리 방법을 이용해, 희석 수용액 (dilute aqueous solution)으로부터 생산물을 분리할 수 있다.
배양 조건은, 예를 들어 액체 배양 공정뿐 아니라 발효 및 기타 대규모 배양 공정을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 생합성 생산물의 특히 유익한 수율은 혐기성 또는 실질적인 혐기성 배양 조건 하에 달성될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, NADH 또는 생물 유래 화합물의 생합성을 달성하기 위한 하나의 예시적인 배양 조건은 혐기성 배양 및 발효 조건을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체는 혐기 또는 실질적인 혐기 조건 하에 유지, 배양 또는 발효시킬 수 있다. 간략하게는, 혐기성 조건은 산소가 결여된 환경을 의미한다. 실질적인 혐기성 조건은, 예를 들어, 배지의 용존 산소가 포화도 0-10%로 유지되는, 배양, 배치 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적인 혐기성 조건은 또한 산소 1% 미만의 대기로 유지되는 밀폐된 챔버 안에서 액체 배지 또는 고체 아가에서 세포를 증식시키거나 또는 세포를 휴지시키는 것을 포함한다. 산소 %는, 예를 들어 배양물에 N2/CO2 혼합물 또는 기타 적절한 비-산소성 기체 또는 기체들을 퍼징함으로써 유지할 수 있다.
본원에 기술된 배양 조건은 NADH 또는 생물 유래 화합물을 생산하기 위한 규모 확대 및 연속 배양일 수 있다. 배양 공정의 예로는, 피드-배치 발효 (fed-batch fermentation) 및 배치 분리 (batch separation); 피드-배치 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리가 있다. 이들 공정들 모두 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 생물 유래 화합물을 공업적인 양으로 생합성에 의해 생산하는데에는 발효 공정이 특히 유용하다. 일반적으로, 그리고 비-연속적인 배양 공정을 이용하는 경우에서와 같이, NADH 또는 생물 유래 화합물의 연속 생산 및/또는 거의 연속적인 생산은, 본원에 기술된 NADH 또는 생물 유래 화합물을 생산하는 유기체를 지수기 (exponential phase) 상태로 증식을 유지시키거나 및/또는 거의 유지시키기에 충분한 영양분 및 배지에서 배양하는 것을 포함할 것이다. 이러한 조건에서의 연속 배양은, 예를 들어 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 이상의 기간 동안의 증식 또는 배양을 포함할 수 있다. 추가적으로, 연속 배양은 1주일, 2주일, 3주일, 4주일 또는 5주일 이상에서 최대 수 개월까지의 장기간을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 유기체는 특정 용도에 적합하다면 수시간 동안 배양할 수 있다. 연속적인 및/또는 거의 연속적인 배양 조건은 이러한 예시적인 기간들 사이의 모든 시간 간격을 망라하는 것으로 이해하여야 한다. 아울러, 본원에 기술된 미생물 유기체를 배양하는 시간은 원하는 목적을 위해 생산물을 충분한 양으로 생산하기에 충분한 기간인 것으로 이해된다.
발효 공정은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 간략하게는, NADH 또는 생물 유래 화합물을 생합성하기 위한 발효는, 예를 들어, 피드-배치 발효 및 배치 분리; 피드-배치 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리로 수행될 수 있다. 배치 및 연속 발효 공정의 예는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.
상당량의 생물 유래 화합물을 연속적으로 생산하기 위해, 본원에 기술된 NADH 또는 생물 유래 화합물 생산체를 이용한 전술한 발효 공정 외에도, NADH 또는 생물 유래 화합물 생산체에 대해, 또한, 예를 들어, 생산물을 다른 화합물로 변환하기 위한 화학적 합성 및/또는 효소 공정을 동시에 실시하거나, 또는 생산물을 발효 배양물로부터 분리한 다음 순차적으로 이를 필요에 따라 생산물을 다른 화합물로 변환하는 화학적 및/또는 효소적 변환 공정을 수행할 수 있다.
일부 구현예들에서, 생물 유래 화합물 또는 임의의 생물 유래 화합물 경로의 중간산물에 존재하는 원자의 동위원소 분포 (isotopic distribution)를 변경하기 위해, 탄소 공급원료 및 기타 세포 흡수원 (cellular uptake source), 예를 들어 포스페이트, 암모니아, 설페이트, 클로라이드 및 기타 할로겐 화합물을 선택할 수 있다. 상기에 열거된 다양한 탄소 공급원료 및 기타 흡수원들은 총체적으로 "흡수원"으로서 본원에서 지칭될 것이다. 흡수원은 생물 유래 화합물 또는 경로 중간산물에 존재하는 임의의 원자, 또는 생물 유래 화합물 경로로부터 갈라진 반응들에서 만들어지는 부산물에 대해 동위원소 농화 (isotopic enrichment)를 제공할 수 있다. 동위원소 농화는, 예를 들어, 탄소, 수소, 산소, 질소, 황, 인, 염소 또는 기타 할로겐 화합물을 비롯한 임의의 표적 원소에서 달성될 수 있다.
일부 구현예들에서, 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14의 비율을 변경하기 위해 흡수원을 선택할 수 있다. 일부 구현예들에서, 산소-16, 산소-17 및 산소-18의 비율을 변경하기 위해 흡수원을 선택할 수 있다. 일부 구현예들에서, 수소, 중수소 및 삼중수소의 비율을 변경하기 위해 흡수원을 선택할 수 있다. 일부 구현예들에서, 질소-14 및 질소-15의 비율을 변경하기 위해 흡수원을 선택할 수 있다. 일부 구현예들에서, 황-32, 황-33, 황-34 및 황-35의 비율을 변경하기 위해 흡수원을 선택할 수 있다. 일부 구현예들에서, 인-31, 인-32 및 인-33의 비율을 변경하기 위해 흡수원을 선택할 수 있다. 일부 구현예들에서, 염소-35, 염소-36 및 염소-37의 비율을 변경하기 위해 흡수원을 선택할 수 있다.
일부 구현예들에서, 표적 원소의 동위원소 비율은 하나 이상의 흡수원을 선택함으로써 원하는 비율로 변경할 수 있다. 흡수원은 자연에서 발견되는 천연 소스로부터 유래하거나 또는 인간이 만든 소스로부터 유래할 수 있으며, 당해 기술 분야의 당업자는, 표적 원소의 원하는 동위원소 비율을 달성하기 위해 천연 소스, 인간이 만든 소스 또는 이들의 조합을 선택할 수 있다. 인간이 만든 소스에 대한 예로는, 예를 들어, 화학 합성 반응으로부터 적어도 부분적으로 유래되는 흡수원을 포함한다. 이러한 동위원소 농화된 흡수원은 상업적으로 구입하거나 또는 실험실에서 제조하거나, 및/또는 선택적으로 흡수원의 천연 소스를 혼합하여 원하는 동위원소 비율을 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 흡수원의 타겟 동위원소 비율은 자연에서 발견되는 바람직한 흡수원 오리진을 선택함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 천연 소스는 생물 유기체로부터 유래하거나 또는 이에 의해 합성되는 생물 기재 (biobase)이거나, 또는 석유계 생산물 또는 대기 등의 소스일 수 있다. 이러한 일부 구현예들에서, 탄소원은, 예를 들어, 탄소-14가 상대적으로 고갈되어 있을 수 있는 화석 연료-유래 탄소원, 또는 석유 유래 카운터파트 보다 탄소-14를 더 많이 포함할 수 있는 이산화탄소 등의 환경 또는 대기 탄소원으로부터 선택될 수 있다.
불안정한 탄소 동위원소인 탄소-14 또는 방사성 탄소 (radiocarbon)는 지구 대기 중에 탄소 원자 1012개 당 거의 1개이며, 반감기는 약 5700년이다. 탄소 스톡 (stock)은 우주선 (cosmic ray)과 일반 질소 (14N)가 참여하는 핵 반응으로 인해 대기 상층부에 풍부하다. 화석 연료에는 오래전에 붕괴되어 탄소-14가 없다. 화석 연료의 연소는 대기 중의 탄소-14의 비율 (fraction)을 낮추게 되며, 이를 '수스 효과 (Suess effect)'라 한다.
화합물에서 원소의 동위원소 비율을 확인하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 동위원소의 농화는 가속 질량 분광 측정 (AMS), SIRMS (Stable Isotope Ratio Mass Spectrometry) 및 SNIF-NMR (Site-Specific Natural Isotopic Fractionation by Nuclear Magnetic Resonance) 등의 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용한 질량 분광 측정으로 쉽게 분석한다. 이러한 질량 분광 기법들은 액체 크로마토그래피 (LC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및/또는 기체 크로마토그래피 등의 분리 기법과 통합될 수 있다.
이에, 일부 구현예에서, 본 발명은, 환경 탄소, 흡수원으로도 지칭되는, 대기 탄소 (atmospheric carbon)를 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비율을 가진, 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물을 제공한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물은 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 높게는 100%의 Fm 값을 가질 수 있다. 이러한 일부 구현예들에서, 흡수원은 CO2이다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 석유계 탄소 흡수원 (petroleum-based carbon uptake source)을 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비율을 가진, 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물을 제공한다. 이러한 측면에서, 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물은 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 Fm 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대기 탄소 흡수원과 석유계 탄소 흡수원의 조합에 의해 수득되는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비율을 가진, 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물을 제공한다. 이러한 흡수원들의 조합을 이용하는 것 역시 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비율을 다양하게 할 수 있는 한가지 방법이며, 각각의 비율이 흡수원의 비율을 반영할 것이다.
나아가, 본 발명은, 본원에 기술된 생물학적으로 생산된 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물, 및 이로부터 유래하는 생산물에 관한 것으로서, 여기서 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물은 환경에서 생성된 CO2에서와 대략 동일한 수치로 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 동위원소 비율을 가진다. 예를 들어, 일부 측면들에서, 본 발명은, 환경에서 발생하는 CO2에서와 대략 동일한 수치로, 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비율을 가진, 또는 본원에 개시된 다른 임의의 비율을 가진, 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물의 중간산물을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 생산물은 환경에서 발생하는 CO2에서와 대략 동일한 수치의 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비율, 또는 본원에 개시된 임의의 비율을 가질 수 있는 것으로 이해되며, 여기서 생산물은, 본원에 기술된 바와 같이, 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간산물로부터 제조되며, 생물 유래 생산물은 화학적으로 변형되어 최종 생산물로 제조된다. 원하는 생산물을 제조하기 위해, 생물 유래 화합물 또는 이의 중간산물을 화학적으로 변형하는 방법은, 본원에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명은, 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비율이 환경에서 발생한 CO2에서와 대략 동일한 수치인 생물기재 생산물을 추가로 제공하며, 여기서 생물기재 생산물은 본원에 기술된 바와 같이 생물 유래 화합물 또는 생물 유래 화합물 경로의 중간 산물들을 조합하여 또는 이로부터 직접 만들어진다.
본 발명은 본원에 기술된 생물 유래 화합물 및 생물 유래 화합물 이외의 다른 화합물을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 생물 유래 생산물 이외의 다른 화합물은 발효 브로스 또는 배양 배지의 세포성 분획, 예를 들어 미량의 세포성 분획일 수 있거나 또는 발효 브로스 또는 배양 배지일 수 있거나, 또는 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체의 존재 하에 이로부터 만들어진 정제된 또는 일부 정제된 분획일 수 있다. 조성물은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 부산물 생성이 저하된 유기체에 의해 생산된 경우 부산물의 수준 감소를 포함할 수 있다. 조성물은 예를 들어 생물 유래 화합물, 또는 본원에 기술된 미생물 유기체의 세포 용해물 또는 배양 상층액을 포함할 수 있다.
본 발명은 비-자연 발생 미생물 유기체에서 NADH의 이용가능성을 높이는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법은, 일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 가진) 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체를 NADH의 이용가능성을 높이기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법 또는 본원에 기술된 방법을 이용해 비-자연 발생 미생물 유기체에서 NADH의 이용가능성을 높이는 데 필요한 기간 및 배양 조건을 쉽게 결정할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 또한 비-자연 발생 미생물 유기체에 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 도입 (예를 들어, 미생물 유기체의 게놈에 통합 또는 형질전이)하는 것을 포함한다.
비-자연 발생 미생물 유기체에서 NADH의 이용성을 높이는 이러한 방법은, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH가 적어도 10% 더 많이 달성된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 20% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 30% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 40% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 50% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 60% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 70% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 80% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 90% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.1배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.2배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.3배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.4배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.5배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.6배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.7배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.8배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 1.9배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양하는 경우와 비교해 NADH를 적어도 2배 이상으로 더 많이 생산한다.
일부 구현예에서, 비-자연 발생 미생물 유기체에서 NADH의 이용가능성을 높이는 방법은 본원에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 증가를 달성하며, 여기서 비-자연 발생 미생물 유기체는 본원에 기술된 바와 같은 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로를 가진다. 이러한 경로는, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 보조인자의 생산이 직접 또는 간접적으로 유익할 것이다. 이러한 방법은, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 10% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 20% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 30% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 40% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 50% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 60% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 70% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 80% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 90% 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.1배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.2배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.3배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.4배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.5배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.6배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.7배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.8배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 1.9배 이상의 증가를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 생물 유래 화합물 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 생물 유래 화합물의 적어도 2배 이상의 증가를 달성한다.
본 발명은 비-자연 발생 미생물 유기체에서 포르메이트 농도를 낮추는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법은, 일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 가진) 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체를 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 높이기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함하며, 이로써 미생물 유기체에 의해 생산되는 이산화탄소는 증가하고 미생물 유기체에서 포르메이트의 농도는 감소한다. 당해 기술 분야의 당업자는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법 또는 본원에 기술된 방법을 이용해 비-자연 발생 미생물 유기체에서 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 높이는 데 필요한 기간 및 배양 조건을 쉽게 결정할 수 있을 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 또한 비-자연 발생 미생물 유기체에 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 도입 (예를 들어, 미생물 유기체의 게놈에 통합 또는 형질전이)하는 것을 포함한다.
이러한 비-자연 발생 미생물 유기체에서 포르메이트 농도를 낮추기 위한 방법은, 일부 구현예에서, 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 10% 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 20% 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 30% 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 40% 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 50% 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 60% 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 70% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 80% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 90% 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.1배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.2배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.3배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.4배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.5배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.6배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.7배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.8배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 1.9배 이상으로 더 많이 생산한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이산화탄소를 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 적어도 2배 이상으로 더 많이 생산한다.
일부 구현예에서, 비-자연 발생 미생물 유기체에서 포르메이트 농도를 낮추기 위한 방법은 본원에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 방법에서 불순물로서 포르메이트의 감소를 달성하며, 여기서 생물 유래 화합물의 생산 방법은 본원에 기술된 바와 같은 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로를 가진 비-자연 발생 미생물 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 이러한 방법은, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 10%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 20%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 30%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 40%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 50%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 60%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 70%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 80%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 90%의 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.1배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.2배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.3배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.4배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.5배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.6배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.7배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.8배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 1.9배 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산이 없는 동일한 미생물 유기체를 배양한 경우와 비교해 불순물로서 포르메이트의 적어도 2배 감소를 달성한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체를 배양함으로써 생산되는 본원에 제공된 생물 유래 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 상기한 생물 유래 화합물 이외의 다른 화합물을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 생물 유래 화합물 이외의 다른 화합물은 본원에 기술된 비-자연 발생 미생물 유기체의 미량의 세포성 분획이다.
서열
하기 표 1에서 서열은 FDH 서열, 및/또는 조성물을 구축하고 본원에 기술된 방법을 수행하기 위해 이용할 수 있는 아미노산 서열들을 예시한다. 필요에 따라서는 DNA 서열로부터 RNA 서열을 쉽게 유추할 수 있다.
표 1: 서열
서열번호 효소/유전자 유기체 UniProt ID / ENA 등재번호 서열
1 포르메이트 데하이드로게나제 지브시엘라 퀘르시네칸스 A0A250B5N7 MSKILCVLYPDPVTGFPPVYARDSIPDIRCYPNGQTAPTPAGELGFTPGELVGSVSGELGLRRYLESQGHELIVTSDKEGADSVFERHLPDADVVISQPFWPAYLTAERIAKAKRLKLALTAGIGSDHVDLKAAAERGITVAEVTFSNSISVAEHVVMTVLALVRNYLPAHQIANNGGWNIADCVARSYDVEGMHFGTLGAGRIGLAVLRRLKPFDMPLHYYDPHRLSAECEKELGLIYHDTPESLVSVCDVVNLQTPLYPATQGFVNAAFLAKFKRGAYLINTARGALCERDAIVHALETGQLAGYGGDVWFPQPAPIDHPWRRMPHQGMTPHISGTSLSGQARYAAGTLEILQNFLEGKPIRQEYLIVDGGNLAGAGANAYKLA
2 포르메이트 데하이드로게나제 칸디다 보이디니　 O13437 MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYDYQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK
3 포르메이트 데하이드로게나제 칸디다 보이디니 A0A0A1EQY0 MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGGNSVLDQHIPDADIIITTPFHPAYITKERIDKAKKLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVLMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLVPFNPKELLYYDYQALPKDAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTINAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYITKAYGKHDKK
4 포르메이트 데하이드로게나제 클로헤시노마이세스 아쿠아티쿠스 A0A1Y1ZA31 MVFLRSISRVARPASSMLSARAAPKASFGASFFRKPNAYRTLTATSTQQGKVLLVLYDGGVHAEQEPQLLGTTENELGIRKWLEDAGHTLITTSDKEGENSKFDQELVDAEVIITTPYVEATPHYSSSVPRNRTALSPHHLATLALPFHPGYLTAERLAKAKKLKLAVTAGIGSDHIDLDAANKTNGGITVAEVTGSNVVSVAEHVVMTILTLVRNFVPAHEQIAAGEWDVAAVAKNEYDLENKVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYFDYQPLTAEKEKEIGCRRVENLEEMLAQCDVVTINCPLHEKTRGLFNKDLISKMKKGSWLINTARGAIVVKEDVADALKSGHLRGYGGDVWFPQPAPKEHPLRYATNPWGGGNAMVPHMSGTSIDAQKRYAAGTKAILDSYFSGREDYKPEDLIVHQGDYATKAYGQREGKKHANA
5 포르메이트 데하이드로게나제 클라비스포라 루시타니애 C4Y770 MSKPKVLLVLYEGKHHAKDEPKLYGCLENELGIRGFVESHGYELVSISEKDPIGDSEFDYHLADAEIVITTPFFPAYLTRERIAEAPKLKLCITAGVGSDHVDLNAANERKITVAEVTGSNVVSVAEHAVMTMLNLVRNFVPGHEQAMSGGWDIAAIAKDEYDLEDKVIATVGAGRIGYRILERLVAFNPKKLLYFDYQDLPKEAVDKLNAASKLFNGHDDIVERVEKLEDMLSRSDVVTINCPLHEGSKGLFNKETISHMKDGAWLVNTARGAICVEKDVADAVESGKLRGYGGDVWYPQPAPDHHPWRTFRNKYGGGNAMTPHVSGTSLDAQERYAAGTQAILKSYFEKSFDYRPQDVIVVDGEYATKAYGQRK
6 포르메이트 데하이드로게나제 카발레로니아 소르디디콜라 A0A7H9UPL5 MAKVLCVLYDDPVDGMPKKYARDDIPAISKYHDGQSTPTPKAIDFKPGELLGSVSGELGLRKFLESRGHTLVVTSDKDGPNSTFERELEDAEVVISQPFWPAYLTAERIARAPKLKLALTAGIGSDHVDLQAAIDRGITVAEVTFCNSISVAEHVVMMILSQVRNYLPSHEWVKKGGWNIADCVSRAYDLEGMNVGTVAAGRIGAAVLRRLKPFDVKLHYTDRHRLPEQVERELGATWHPTAESMARVCDIVTINCPLHPETEHLFDETMISKMKRGAYIINTARGKIVDRDAVARALESGQLAGYAGDVWFPQPAPSDHPWRTMPNQGMTPHTSGTTLSAQARYAAGTREILECWFAKQPIREEYLIVDGGRLAGVGAHSYSAGNATSGSEEAARFKKA
7 포르메이트 데하이드로게나제 코시디오이데스 포사다시 RMSCC 3488 A0A0J6ETL5 MGKVLMVMYDGGEHAKQQPGLLGTTENELGLRKWLEERGHTLVTTSDKEGSNSTFERELVDAEIIITTPFHPGYLTAERLAKAKNLKLAITAGVGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGCNVVSVAEHVVMTILVLVRNFVPAHQQVASGEWDVAAVAKNEYDLEGKVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLSPEVEKEIGCRRVENLEEMLAQCDVVTINCPLHEKTRGLFNKELISKMKKGSWLVNTARGAIVVKEDVAEAIKSGHLRGYGGDVWFPQPAPKDHPLRYVQGPWGGGNAMVPHMSGTSIDAQIRYAQGTKNILESYFSGKFDYKQEDLIVHQGDYVTKAYGQRKKIQEEQRN
8 포르메이트 데하이드로게나제 보트리오티니아 퍽켈리아나 M7TQ78 MVFFTRSLSRLATRPSPCARSIFTASAVARTTPTWTTRSTAFRSQKLNNIFGNVRMLTGNHREKVKVLLVLYDGKKHAEEVPELLGTTENELGIRKWLEDQGHELITTSDKEGENSEFDKHLVDAEIIITTPFHPGYLTAERLAKAKNLKIAITAGIGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGSNVVSVAEHVVMTILVLVRNFVPAHEQIQAGEWDVAAAAKNEFDLEGKVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYFDYQPLKPEVEQEIGCRRVTDLEEMLAQCDVVTINCPLHEKTRGLFNKELISKMKKGSWLVNTARGAIVVKEDVADALASGHLRGYGGDVWFPQPAPKDHPLRYAKNPFGGGNAMVPHMSGTSLDAQKRYADGTKAILESYLSGKHDYRPEDLIVIGGDYATKAYGERAKNSGSAGANKA
9 포르메이트 데하이드로게나제 야로이와 리폴리티카 Q6CDN8 MKILLILYDAGSHAADEPKLLGCTENELGIRSWLESQGHTLVTTSSKEGADSVLDKEIVDADVVITTPFHPGYITRERIAKAKNLKICVTAGVGSDHVDLAAANERNIAVLEVTGSNVTSVAEHVVMTMLVLVRNFVPANEQVRGGGWDVAGVAKDSYDIEGKVIGTVGVGRIGKRVLQRLKPFDPKELLYYDYQPLSAADEKEIGARRVEKLEDMLAQCDVVTINCPLHESTKGLFNKELLSHMKKGAWLVNTARGAICVKEDVAAALKSGQLRGYGGDVWFPQPAPADHPWRKMVNKYGAGNAMTPHMSGTSLDAQARYAAGVKQILDEFFSGREQYRPQDIICYGGNYGTKAYGDDKKVVDKK
10 포르메이트 데하이드로게나제 쿠시네리아 아비세니애 A0A1I1JVK8 MAKILCVLYPDPVTGYPPRYARDDIPEITGYPNGQTAPSPEGDPGFSPGELIGCVSGELGLRSWAQANGHELIVTSDKEGVDSVFERHLPDADVVISQPFWPAYLSAERIARAPKLKLALTAGIGSDHVDLKAAAEHGITVAEVTFSNSISVAEHVVMTALTLVRNFVPSHQIAINGGWNIADCVSRSYDIEGMQFGTLGAGRIGLAVLRRMKPFDTPLHYYDPHRLSEDIECELGLTYHDSPESLVSVCDIVNVQTPLYPSTEGFINDALLSKFKRGAYLVNTARGGLCDREAVVRALESGQLAGYGGDVWYPQPAPVDHPWRRMPNHAMTPHISGTSLSAQTRYAAGTLEILQNFLAGKSLREEYLIVDAGNLAGAGANAYQL
11 포르메이트 데하이드로게나제 1, 미토콘드리아 지 메이스 A0A3L6EKZ5 MVESTPLLVCLLDTNTKLEKHIEDMHVLITTPFHPAYVTAERIKKAKNLELLLTAGIGSDHIDLPAAAAAGLTVAEVTGSNTVSVAEDELLRILILLRNFLPGYQQVVQGEWNVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNCNLLYHDRLQIDPELEKEIGAKFEEDLDAMLPKFDVIVINTPLTEKTRGMFNKERIAKMKKGVIVVNNARGAIMDARAVVDACSSGHIAGYGGDVWFPQPAPKDHPWRYMPNHAMTPHISRTTIDAQVRYADGVRDMLDRYFKGEDFPVQNYIVKEGQLASQYK
12 포르메이트 데하이드로게나제 닥틸렐리나 하프토틸라 S8BZ87 MVLRATSTLARCLAKPTLQASTLGARVVRPAYRQPLTAIQTRKLTTTFQPQVKVLAVLYDGGKHAQDVPALLGTTENELGIRKWLEDQGHTLVTTSDKEGENSKFDQELVDAEVIITTPFRPGYLTAERLAKAKKLKLAITAGIGSDHVDLNAANKTNGGVTVAEVTGSNVVSVAEHVVMTILILVRNFVPAHDQIRNGDWEVAAVAKDEYDLEDKIVGTVGVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYFDYQPLNAAVEKEIGCRRVESLEEMVAQCDVVTINCPLHESTHGLFNKNLISKMKKGSWLVNTARGAIVVKEDVAEAVKSGHLRGYGGDVWFPQPAPKDHPLRYAVNPFGGGNAMVPHMSGTSLDAQKRYADGTKKILESYLSGRHDYQPHDLIVHKGDYATKAYGQRK
13 포르메이트 데하이드로게나제 세그닐리파루스 루고수스 E5XSQ8 MAKIVAVLYPDPVDGYPTTYARDDIPVIASYPGGQSAPTPSAIDFVPGQLLGSVTGELGLRKFLEAQGHTLVVTSDKEGPDSALDRELADADVVISQPFWPAYLTAERIAAAPNLKLAITAGIGSDHVDLNAAIARGITVAEVTFSNSISVAEHAVMQILALVRNYLPSHAWVAEKRGWNIADSVERAYDLEGMTVGVIAAGRIGLAVLRRLKPFDVKLAYTDKHRLSAEVEEELGLTFYPDIPSLVRAVDIVDVHAPLVPETHHLFDDALIGTMKRGSYIVNTARGAIMDTGAVVRALESGQLAGYAGDVWYPQPPAPDHPWRTMPWSGMTPHVSGTTLSAQARYAAGTREILESWLAGAPIRDEYLIVDGGKLAGTGARSYSTSGSGSSPGSSGK
14 포르메이트 데하이드로게나제 아스퍼질러스 인돌로게누스 CBS 114.80 A0A2V5IND1 MVFMRSFSRQLRRPATSLLSSRGPLASAGSSPLRTSPLANSI아가TLTASANLQGKILMVLYDGGEHAKQQPGLLGTTENELGLRKWLEDQGHTLVTTSDKEGENSTFDKELVDAEVIITTPFHPGYLTAERLAKAKNLKIAVTAGVGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGCNVVSVAEHVVMTILTLVRNFVPAHEQIRNGEWDVAAVAKNEYDLENKVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLSPEVEKEIGCRRVDDLEEMLAQCDVVTINCPLHEKTRGLFNKDLISKMKKGSWLINTARGAIVVKEDVAEAVKSGHLRGYGGDVWFPQPAPKDHPLRYVQGPWGGGNAMVPHMSGTSIDAQIRYANGTKAILESYFSGRHDYRNEDLIVHNGDYVTRAYGQRNKA
15 포르메이트 데하이드로게나제 프라이드만니오마이세스 엔돌리티쿠스 A0A4V5N8V4 MVFARSALRLARPASSLFSQRAAPAFAQRGVPVAKRALSATASQQGKVLLVLYDGHQHAQDEPRLLGTTENELGIRKWIEDQGHTLVTTSDKDGENSKFDQELVDAEVIITTPFHPGYLTKERLAKAKKLKIAVTAGIGSDHVDLDAANTTNGGITVAEVTGSNVVSVAEHVIMTMLVLVRNFVPAHEMIAAGNWDVAAVAKNEYDLENKVVGTVAVGRIGERVLRRLKAFDCKELLYFDYQGLTPEKEKEIGCRRVENLEDMLAQCDVVTINCPLHEKTRGMFNKELLSKMKKGSWLVNTARGAIVVKEDVAEALKSGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPLRYASYSTWGGGNAMVPHMSGTSIDAQERYAAGTKAILEEYFSGRENYKPEDLIVHKGDYATKAYGQREGKKHANA
16 포르메이트 데하이드로게나제, 미토콘드리아 액티니디아 치넨시스 var. 치넨시스 A0A2R6RYX7 MAMKRAAASAVRALASSGNSNSSILTRELHTSPGSKKIVGVFYKANEYAAMNPNFLGCVERALGIGDWLKSQGHQYIVTDDKEGPDCELEKHISDMHVLITTPFHPAYVTAERIKKAKNLQLLLTAGIGSDHVDLKAAAAAGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRVLILTRNFLPGYHQVIKGDWNVAAIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNCHLLYHDRIKMDLELENQIGAKFEEDLDVMLPKCDIIVINMPLTEKTKGMFNKERIAKLKKGVLIVNNARGAIMDTQAVVDACSSGHIAGYSGDVWNPQPAPKDHPWRYMPNQAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGEEFPPQHYIVKEGPTRCGGNAIGWGQCEKVKMGLLENHLGESVRVVTKCSTSPGSKKIVGVFYKANEYAAMNPNFLGCVERALGIGDWLKSQGHQYIVTDDKEGPDCELEKHISDMHVLITTPFHPAYVTAERIKKAKNLQLLLTAGIGSDHVDLKAAAAAGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRVLILTRNFLPGYHQVIKGDWNVAAIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNCHLLYHDRIKMDLELENQIGAKFEEDLDVMLPKCDIIVINMPLTEKTKGMFNKERIAKLKKGVLIVNNARGAIMDTQAVVDACSSGHIAGYSGDVWNPQPAPKDHPWRYMPNQAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGEEFPPQHYIVKEGELASQYR
17 포르메이트 데하이드로게나제 아스퍼질러스 가와치 G7XZ66 MVFMRSFSRQLRRPATSLLSKGAFAPAASSPFRAAPLANSI아가TLTASANLQGKVLMVLYDGGEHAKQQPGLLGTTENELGLRKWLEEQGHTLVTTSDKEGENSTFDKELVDAEVIITTPFHPGYLTAERLAKAKNLKIAVTAGVGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGCNVVSVAEHVVMTILTLVRNFVPAHEQIRRGEWDVAAVAKNEFDLEGKVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLSPEVEKEIGCRRVDDLEEMLAQCDVVTINCPLHEKTRGLFNKELISKMKKGSWLVNTARGAIVVKEDVAEAVKSGHLRGYGGDVWFPQPAPADHPLRTVQGPWGGGNAMVPHMSGTSIDAQIRYANGTKAILESYFSGRHDYRPQDLIVHGGDYVTKAYGQRNKA
18 포르메이트 데하이드로게나제 칸디다투스 니트로소코스미쿠스 올레오필러스 A0A654LUU9 MKIVAVLYPGGEIAKRTPAILGSAENALGLTNFLKDKGHEFIVLTDKEEELDKHISTTDILITTPFWPAYVTKERISKASNLKLILTAGVGSDHIDLAAAASSKITVAEITGSNVVSVAEQVVMHILALVRNYIPAYKQVIEGRWDIAEIASNAHDLEDKVVGIIGMGRIGQRVCERLKAFDVKMLYHDQIPLRTAEEFVLGVRYTPRDQIVEQADVITINTPLTPETDGMFNRDLLFKMKKGAYLVNTARGKIVDTHALVESLEEGHLAGYAGDVWYPQPATGDHPWRHMPNHAMVPHYSGTTLEAQNRYANGIKDCLMRFLENRPLEQQYLIVDKGGVVSPSYSYAFKK
19 포르메이트 데하이드로게나제 블라스토마이세스 글리크리스티 A0A179UWZ8 MGKVLLVLYDGGQHAKDQPGLLGTTENELGLRKWLEEKGHTLVTTSDKEGANSKFDQELVDAEVIITTPFHPGYLTAERLAKAKNLKLAVTAGVGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGCNVVSVAEHVVMTILVLVRNFVPSHEQVASGDWNVAAVAKNEYDLEGKVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLTPEVEKEIGCRRVENLEEMLAQCDVVTINCPLHEKTRGLFNKDLISKMKKRLLAHQHRPRRHRRQRRRRRRHQIRPSARLRRRRVVPAARAQGPSAALRPGALGRRKRDGAAHVRQLHRCAGALRGGHEGDSRVVFLRQA
20 포르메이트 데하이드로게나제 파라버크홀데리아 카리벤시스 MBA4 A0A0P0RDP0 MYHVDMSIERRHENALDQTGARRMAKVLCVLYDDPVKGMPKQYARDGVPEITRYHDGQTAPTPKGIDFTPGELLGSVSGELGLRKYLESLGHTLVVTSDKDGPNSRFERELADAEVVISQPFWPAYLTAERIAKAPKLKLALTAGIGSDHVDLQAAIERGVTVAEVTYCNSISVAEHVVMMILGLVRNYLPSHEWVKKGGWNIADCVERAYDLEAMHVGTVAAGRIGAAVLRRLKPFDVKLHYTDRHRLPLDVEKELGATWHPDVESMVKACDVVTINCPLHPETENLFNEKLIAKMKRGAYIVNTARGKIVDRDAIVRALESGQLAGYAGDVWFPQPAPRDHPWRTMPHNGMTPHISGTTLSAQARYAAGTREILECWFEKRPIRDEYLIVDGGKLAGVGAHSYSAGNATSGSEEAARFKTA
21 포르메이트 데하이드로게나제 메소리조비움 sp. A0A440NN77 MKMAKVVCVLYDDPVDGYPSNYARDGLPKLDRYPGGQTLPTPKAIDFEPGVLLGSVTGELGLRPFLESAGHSLVVTSDKDGPDSVFERELADAEIVISQPFWPAYLTNERIAKADQLKLAITAGIGSDHVDLQAAMDRGITVAEVTYCNSISVSEHVVMMILALVRNYIPSYQWVIDGGWNIADCVARSYDVEGMQIGTVGAGRIGSAVLHRLQPFDVKLHYTDRHRLSEAVEKHLGVTFHPDAASMVGICDVVTINAPLHPETENLFDEAMIARMKRGAYLVNTARGKICNRDAVARALESGQLAGYAGDVWFPQPAPKDHPWRSMPHHGMTPHISGSSLSAQARYAAGTREILECWFEGRPIREEYLIVDGGKLAGAGAHSYSAGDATSGSEEAARFKAKA
22 포르메이트 데하이드로게나제 헬리코카르푸스 그리세우스 UAMH5409 A0A2B7Y0K3 MVFLRSTSRLLSRPISSLLAGRALPRASAALPLYNTQLCGPTSRLPFTGVRTLTASPKLQGKVLLVLYDGEEHAKQQPGLLGTTENELGLRKWLEDQGHTLVTTSDKEGENSKFDQELVDAEVIITTPFHPGYLTAERLAKAKNLKLAITAGVGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGCNVVSVAEHVVMTILVLVRNFVPAHEQVASGDWNVAAVAKNEFDLEGKVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLKPEVEKEIGCRRVENLEEMLAQCDVVTINCPLHEKTRGLFNKELISKMKKGSWLVNTARGAIVVKEDVAEAVKSGHLRGYGGDVWFPQPAPKDHPLRYAQGPWGGGNAMVPHMSGTSIDAQVRYAEGTKRILDSYFSGRHDYRPEDLILFGGDYATKAYGQRTKA
23 포르메이트 데하이드로게나제 스트렙토마이세스 알비도플라부스 A0A7H9W684 MAKIVCVLYPDPVTGFPPQYARTSLPALDGYPGGQTLPTPEGLDFTPGELVGSVSGELGLREFLESRGHTLVVTSDKEGPDSELDRELADADVVISQPFWPAYLTAERIARAPKLKLALTAGIGSDHVDLDAAIARGITVAEVTYSNSISVAEHAVMQILALVRNYLPSHKIAAEGGWNIADCVSHAYDLEGMDVGVIAAGRIGQAVLRRLKPFGVRLHYTDKRRLPREVEEELGLTFHASAQELARNIDVVSIHAPLHPETQNLFDEKLLATMRPGSYIVNTARAQIVDRDAIVRALESGQLAGYAGDVWYPQPAPADHPWRTMPHNGMTPHISGTTLTAQARYAAGTREILEDWLQGTPIREEYLIVDGGRLAGTGAASYTAGEKTAEKS
24 포르메이트 데하이드로게나제 (미국 공개공보 2019-0161741의 돌연변이) 인공 N/A MKIVLVLYDCGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGGNSVLDQHIPDADIIITTPFHPAYITKERIDKAKKLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLVPFNPKELLYYDYQALPKDAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAQGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK
25 fdh 지브시엘라 퀘르시네칸스 A0A250B5N7 / ATA21550 atgtccaagattttgtgcgtattgtatcccgatcctgttaccggttttccgccggtttatgcccgcgacagcatccctgatatccgttgctatccgaatggccagacggcgccgacgccggctggcgaattgggctttacccccggcgagctggtcggcagcgtatctggggaactgggattacgtcgctatctggaaagtcagggccatgagttgattgtgaccagtgacaaagaaggcgcggattcggtatttgaacgccatttgccggatgccgatgtggtcatttcccagccgttttggccggcttacttgaccgctgaacgcattgccaaagcgaagaggcttaaactggcgctgaccgccggtattggttccgaccatgtcgatctcaaggccgccgccgaacgcggcatcaccgtggccgaggtgacgttctccaactccatcagcgtggcggagcatgtggtgatgacggtactggccctggtgcgcaactacctgccggcgcatcaaatcgccaacaacggcggttggaacattgcggactgcgtggcgcgcagctatgacgtggaagggatgcatttcggcacgctgggcgccgggcgcattgggttggcggtgctgcgacgtttaaaaccctttgatatgccactgcattattacgatccgcaccgtttgtcggcggagtgcgagaaggagctgggtttaatttaccacgatacgccggagtcgctggtcagcgtctgcgatgtggttaacctgcagacgccgctttacccggcaacccaggggttcgtcaatgcggccttcctggcgaagttcaagcgtggcgcctacctgatcaataccgcccgcggcgcgctgtgtgagcgcgatgcgatcgtccacgcactggaaaccgggcagttggcgggctatggcggcgacgtgtggtttcctcaaccggcgccgatcgaccatccatggcggcgcatgccgcatcagggcatgacgccgcacatttccggcacgtcactgtcggggcaggcgcgctatgcggccgggacgctggaaattctgcagaacttcctggaaggcaagccgatccgccaagaatacctgattgttgatggcggcaatttggcgggtgccggcgccaacgcctataaattggcctga
26 fdh 칸디다 보이디니　 O13437 / CAA57036 atgaagatcgttttagtcttatatgatgctggtaagcacgctgctgatgaagaaaaattatatggttgtactgaaaataaattaggtattgctaattggttaaaagatcaaggtcatgaactaattactacttctgataaagaaggtgaaacaagtgaattggataaacatatcccagatgctgatattatcatcaccactcctttccatcctgcttatatcactaaggaaagacttgacaaggctaagaacttaaaatcagtcgttgtcgctggtgttggttctgatcacattgatttagattatattaatcaaacaggtaagaaaatctcagtcctggaagttacaggttctaatgttgtctctgttgctgaacacgttgtcatgaccatgcttgtcttggttagaaatttcgttccagcacatgaacaaattattaaccacgattgggaggttgctgctatcgctaaggatgcttacgatatcgaaggtaaaactatcgctaccattggtgctggtagaattggttacagagtcttggaaagattactcccatttaatccaaaagaattattatactacgattatcaagctttaccaaaagaagctgaagaaaaagttggtgctagaagagttgaaaatattgaagaattagttgctcaagctgatatcgttacagttaatgctccattacacgcaggtacaaaaggtttaattaataaggaattattatctaaatttaaaaaaggtgcttggttagtcaataccgcaagaggtgctatttgtgttgctgaagatgttgcagcagctttagaatctggtcaattaagaggttacggtggtgatgtttggttcccacaaccagctccaaaggatcacccatggagagatatgagaaataaatatggtgctggtaatgccatgactcctcactactctggtactactttagacgctcaaacaagatacgctgaaggtactaaaaatattttggaatcattctttaccggtaaatttgattacagaccacaagatattatcttattaaatggtgaatacgttactaaagcttacggtaaacacgataagaaataa
27 fdh 칸디다 보이디니 A0A0A1EQY0 / AIY34662 atgaagatcgttttagtcttatacgatgctggtaaacacgccgccgatgaagaaaaattatacggttgtactgaaaacaaattaggtattgccaattggttaaaagatcaaggccatgaattaatcaccacttctgataaagaaggcggaaacagtgtgttggatcaacatatcccagatgctgatattatcattacaactcctttccatcctgcttatatcaccaaggaaagaatcgacaaagctaaaaaattgaaattagttgtcgtcgctggtgtcggttctgatcatattgatttggattacatcaaccaaaccggtaagaaaatctccgttttggaagttaccggttctaatgttgtctctgttgcagaacacgttctcatgaccatgcttgtcttggttagaaattttgttccagctcacgaacaaatcattaaccacgattgggaagttgctgctatcgctaaggatgcttacgatatcgaaggtaaaactatcgccaccattggtgccggtagaattggttacagagtcttggaaagattagtcccatttaatccaaaagaattattatactacgattatcaagctttaccaaaagatgccgaagaaaaagttggtgctagaagggttgaaaatattgaagaattagttgcccaagctgatatagttacaattaatgctccattacacgctggtacaaaaggtttaattaacaaggaattattgtctaaattcaagaaaggtgcttggttagtcaatactgcaagaggtgccatttgtgttgccgaagatgttgctgcagctttagaatctggtcaattaagaggttacggtggtgatgtttggttcccacaacctgctccaaaagatcacccatggagagatatgagaaacaaatatggtgctggtaacgccatgactcctcattactctggtactactttagatgctcaaactagatacgctgaaggtactaaaaatattttagagtcattctttaccggtaagtttgactacagaccacaagatatcatcttattaaatggtgaatacattaccaaagcttatggtaagcacgataagaaataa
28 fdh 클로헤시노마이세스 아쿠아티쿠스 A0A1Y1ZA31 / ORY07153.1 atggtatttctccgctcaatttctcgagtcgcccgcccggcctcctcgatgctctcagcacgcgccgctcccaaagcttcctttggagcttcgttcttccgtaagccgaatgcctacagaacgctaacggcgacctcaacacaacagggcaaggtccttctcgtactctacgatggcggcgtccacgcggagcaggagccgcagctcctcggtactactgagaacgaactgggcatccgaaaatggctcgaagatgccggccacacgctcatcacgacttcagacaaggagggcgagaactccaaattcgaccaggaactggtggatgcggaggtgatcattaccacgccgtatgttgaagctaccccgcactactcgagctctgtgccccgcaaccgcaccgcgctctcgccccaccatcttgccactctcgcgctacccttccaccccggttatctgaccgcagagcgtctggccaaggcgaagaagctcaagctcgctgtcactgccggtatcggatctgatcacattgacctcgatgcagccaacaagacgaatggcggcatcaccgttgccgaagtcacgggctcgaatgtcgtgtccgtagccgagcacgtggttatgaccatcctcaccctcgtgcgcaacttcgttcccgcccatgagcagattgccgctggcgagtgggacgtcgctgccgtcgccaagaacgagtatgatttggagaacaaggtcgtcggcaccgttgccgtcggtcgcattggcgagcgtgtgctgcgccgtctcaagcccttcgactgcaaggagctgttgtacttcgactaccagccattgaccgctgaaaaggagaaggagattggctgccgaagggtggagaacctcgaggagatgctggcacagtgcgacgtcgtcactatcaactgcccgctacacgaaaagacacgggggctgttcaacaaggacctcatctccaagatgaagaagggctcatggctcatcaacactgcccgaggtgccattgtcgtgaaggaggatgttgctgatgcgctcaagagtggccacctccgtggatacggtggtgatgtctggttcccgcagccggcgcccaaggagcacccgctccgatatgccaccaacccatggggtggaggcaacgccatggtcccccacatgtccggtacctcgatcgatgcccagaagcgatatgctgctggtacgaaggccattctcgactcttacttctccggtcgtgaagactacaagcccgaggatctcatcgtgcatcaaggcgactacgccaccaaggcgtacggtcagcgcgagggaaagaagcatgctaatgcataa
29 fdh 클라비스포라 루시타니애 C4Y770 / EEQ39876.1 atgtctaaaccaaaagtgttactcgttttgtacgaaggcaagcaccatgccaaagatgagcctaagctttacggatgcctcgagaacgaattgggtatcagaggtttcgtggagtctcacggttacgaattggtgagcatctctgaaaaggatccaattggagactctgagtttgactatcatttggcagacgctgagattgtcattaccacgccatttttccccgcgtacctcactcgtgagagaattgcagaggcacccaagttgaagctctgcatcaccgcaggagtcggatcggaccatgttgacttgaatgctgccaatgaaagaaagatcactgttgcagaggttactggatccaacgttgtttctgttgctgaacacgcagtaatgacaatgttaaacttggttagaaactttgtcccaggacatgagcaggccatgtctggaggatgggatattgcagccattgccaaggatgaatatgacttggaggacaaggttatcgccacagttggcgctggcaggattggttaccgtatcttggagcgccttgtggcattcaatccgaagaagctcttgtactttgactaccaggatttgcccaaggaagccgtggacaagttgaacgctgcctctaaacttttcaatggtcacgacgacattgttgaacgcgtggaaaagttagaggatatgttatcccgttccgatgttgtgactatcaattgtcctttacacgagggaagcaaaggtttgttcaataaggaaaccattagtcacatgaaggatggcgcttggttggtgaacacagcccgtggtgccatttgtgttgaaaaggatgtagctgatgctgtcgaatcgggcaagctccgtggatacggtggagacgtatggtatccacagccagccccagaccatcatccttggagaactttccgcaacaagtatggcggtggaaatgctatgaccccccacgttagtggaacatcattggacgcccaagagagatatgctgctggtacacaagcaattttgaaatcgtactttgaaaagtcctttgattatcggccacaggatgtgattgttgttgatggcgaatacgccaccaaagcctatggccagcgtaagta
30 fdh 카발레로니아 소르디디콜라 A0A7H9UPL5
/ RSL21651.1		 atggccaaggttttatgcgttttatatgacgaccctgtcgacggtatgcccaagaagtacgcccgggacgacattcccgccatctcgaagtatcacgacggacaaagcaccccgacacccaaggcaatcgacttcaagccgggcgagttgctgggcagcgtgtccggcgagttgggattgcgcaagttcctcgaatcacgggggcacaccctggtcgttacatccgacaaggacggccccaactccacgttcgagcgcgagctggaggatgccgaggttgtcatttcccagccattctggcccgcctatctgacggctgaacgcatcgcccgggcgccgaagctcaagcttgcgctcacggctggcatcggctcggatcacgtcgatttgcaggccgcgatcgatcgcggcatcacggttgccgaagtgaccttctgcaatagcatcagcgtggccgagcacgtcgtcatgatgatcctgtcccaggtccggaactatttgccgtcgcatgaatgggtcaagaagggcggctggaatatcgcggattgcgtctcgcgtgcgtacgatctcgaggggatgaacgtagggaccgtggcggccggacgcatcggtgcggcggtgctgagacggctcaaaccctttgacgtcaagctgcactacacggaccggcatcgtctgccggaacaggtcgagcgcgagcttggcgcaacctggcatcccactgctgaatccatggcgcgtgtgtgcgatatcgtgaccatcaactgtccgttgcacccggaaacggaacatctcttcgacgagacgatgatcagcaagatgaagcgcggcgcttacatcatcaacacggcgcgcgggaagattgtcgatcgcgatgctgtcgcgcgtgcgctggaatcgggccaactggcgggttatgcaggcgacgtctggttcccgcagcctgcaccgagcgatcacccgtggcggaccatgccgaatcagggcatgacgccgcacacgtcgggcactacgctttcggcacaggcgcgttacgccgctggcacgcgtgaaattctcgaatgctggtttgccaaacaaccgattcgtgaggagtatctgatcgtcgacggcggacgtcttgccggtgtgggtgcgcactcgtacagcgcaggcaatgcgacgtcgggctcggaagaggcggcccgcttcaagaaggcataa
31 fdh 코시디오이데스 포사다시 RMSCC 3488 A0A0J6ETL5 / KMM63856.1 atgggtaaagttcttatggttatgtatgacggtggggagcatgcgaagcagcagcctggtttattgggaacaacagaaaatgagcttggattaagaaaatggcttgaggagagaggccacaccttggtaaccacatctgacaaggagggatcgaactctacctttgagcgcgagcttgttgatgcggagatcatcatcactacaccgttccatcccggttatctcaccgcagagcgtctggccaaggccaagaacctcaaacttgccatcacagcgggtgttggttccgaccatgttgacctgaatgccgccaataagaccaacggaggtatcactgtcgctgaagtcactggctgcaatgtcgtgtctgttgccgaacatgtcgttatgaccatcttagtcctcgtccgcaatttcgtcccggcccatcaacaagttgccagcggtgaatgggacgttgctgccgttgctaaaaacgagtatgaccttgagggtaaggtcgtcggaactgtagctgttggccgcattggtgagcgtgtacttcgccgtcttaagcccttcgactgcaaggagcttctttattatgactaccagcccctcagccctgaggtcgagaaggaaattggatgccgtcgtgttgagaacttggaggagatgttggcacagtgtgatgttgtcactatcaactgccctctccacgagaagacacgtggcttgttcaacaaggaactcatttctaagatgaagaaaggctcatggcttgtaaacaccgcccgtggggctatcgtcgtcaaggaggacgtcgcagaagctataaaatcaggccatctccgtggatatggcggtgacgtctggttcccacaacctgctcccaaagaccacccactacgctatgtccagggcccatggggcggcggaaatgccatggtccctcacatgtctggaacttccattgatgcacaaatccgctatgcacagggcacgaagaacatccttgaatcgtacttctccggcaagttcgattacaaacaagaagatttgattgttcatcagggc
32 fdh 보트리오티니아 퍽켈리아나 M7TQ78 / EMR85706.1 atggtatttttcactcgctccctctctcgtttggcaacaagaccgtctccctgtgctcggtcaatcttcacagcttctgctgttgcgagaactacacctacatggacgacgcgatcgactgctttccgctcgcagaagctgaataacatatttgggaatgtcagaatgctaacgggtaatcatcgtgaaaaggtcaaggtacttcttgtattgtacgacggaaagaagcacgccgaagaggtcccagagcttctcggcacaaccgagaacgagctcggtatccgcaaatggctcgaggatcaaggacatgagctcatcaccacctccgacaaggagggagagaactccgagttcgacaagcacttggtagacgcagagatcatcattaccactcctttccaccctggttacctcactgccgaacgtcttgccaaggccaagaacctcaagatcgccatcactgccggtattggatctgatcacgtcgatctcaatgctgccaacaagaccaacggtggtatcaccgttgctgaagttactggatccaacgtcgtctccgtcgctgagcacgtcgttatgaccatcttggttctcgtccgtaactttgtcccagcacacgagcaaatccaagccggagaatgggacgttgccgctgccgccaagaacgagttcgatcttgagggtaaggtcgtcggtaccgttgctgtcggaagaattggtgagcgtgtcttgagaagattgaagccattcgactgcaaggaattgttgtacttcgattaccaacctcttaagccagaggttgagcaagagattggttgcagacgtgttaccgatttggaggagatgttggctcaatgtgatgttgtcaccattaactgccctctccacgagaagacccgtggccttttcaacaaggagttgatctccaagatgaagaagggatcctggttggtcaacaccgcccgtggtgccattgttgtcaaggaagatgttgccgatgccctcgcatccggtcacctccgcggttacggaggagatgtttggttccctcaaccagcaccaaaggaccacccactccgctacgcaaagaacccattcggtggtggaaacgccatggttcctcacatgtctggtacctctctggatgctcaaaagagatatgccgatggtaccaaggctattctcgagagctacttgtctggaaagcatgactacagaccagaggatttgattgttattggtggtgactatgctaccaaggcttatggtgagagagcgaagaacagtggttctgccggtgccaacaaggcataa
33 fdh 야로이와 리폴리티카 Q6CDN8 / CAG83477.1 atgaagattctccttatcctttacgacgccggctcccacgctgctgacgaacccaagctgctaggttgcaccgagaacgagctcggcatccgatcctggctcgagtcccagggccataccctggtcaccacctcttccaaggagggtgctgactctgttctcgacaaggagattgttgatgccgatgttgtcatcaccactcccttccaccccggctacatcacccgagagcgaattgccaaggccaagaacctcaagatctgtgtcactgccggtgttggctctgaccacgttgatcttgctgccgccaacgagagaaacattgccgtgctcgaggtcactggttccaacgtgacttctgttgctgagcacgttgtcatgaccatgcttgttcttgtccgaaacttcgtgcctgccaacgagcaggttcgaggcggcggctgggacgttgccggtgttgccaaggattcctacgatattgagggtaaggtcattggtaccgtcggagtcggccgaatcggcaagcgagtgctccagcgactcaagcccttcgaccccaaggagctgctctactacgactatcagcctctgtctgctgccgacgagaaggagattggcgcccgacgagttgagaagctcgaggacatgcttgcccagtgtgatgttgtcaccatcaactgccccctgcacgaatccaccaagggtctctttaacaaggagctgctgtcccacatgaagaagggcgcctggctcgtcaacaccgctcgaggagccatctgtgtaaaggaggacgttgccgccgctctcaagtctggtcagctccgaggctacggcggagatgtctggttcccccagcctgcccctgctgaccacccctggagaaagatggtcaacaagtacggtgccggtaacgccatgaccccccacatgtctggaacctctctggacgcccaggcccgatacgctgctggtgtcaagcagattctcgacgagttcttctccggccgagaacagtaccgaccccaggacattatctgctacggtggtaactacggcaccaaggcctacggagacgacaagaaggtcgtcgacaagaagtaa
34 fdh 쿠시네리아 아비세니애 A0A1I1JVK8 / SFC52556 atggccaagattctctgtgttctttatcccgatccggtgaccggctatccaccgcgttatgcgcgtgacgatatccccgaaatcacgggctatcccaacggccagacagcgccttctccggagggagatccggggttttcccccggcgaattgatcggctgcgtctccggtgagctggggctgcgttcgtgggcgcaggccaacggtcatgagcttatcgtgaccagtgacaaggagggcgtcgattcggtcttcgagcgccatctgccggacgctgatgtcgtgatttctcagccgttctggccggcctacctcagcgcggaacgcattgcccgggcaccgaagctcaagctggcgctgacggccggtatcggctcggatcacgtcgatctcaaggcggcggccgagcacggtatcacggtggccgaggtgaccttctccaactcgatcagtgtggccgagcacgtggtcatgaccgcgctgacgctggtccgcaatttcgtgccgtcgcaccagattgccatcaacggcggctggaacatcgctgactgcgtatcacgcagctacgacatcgaagggatgcagtttggtaccctcggtgccggtcgtatcggccttgcggtcctgcgtcgcatgaagcccttcgatacaccgctgcattactacgatccgcaccgtctgtccgaggatatcgagtgcgagctcggtctgacctatcacgactcgccggaatcgctggtgagcgtctgcgacatcgtcaacgttcagacgccgctttacccctcgaccgaagggttcatcaacgacgcgctgctgtcgaaattcaagcgtggcgcctatctggtcaacaccgcgcgcggcgggctttgcgaccgtgaggcagtggtcagggcgctggagtccgggcagctggcaggttacgggggcgatgtgtggtacccgcagcccgcgccggtggatcatccgtggcggcgcatgcccaatcatgcgatgacgccacatatctccggcacctcgctgtcggcccagacccgctatgccgccggaacgctggaaatcctgcagaatttcctcgccggcaagtcgctgcgtgaagagtatctcatcgtcgatgccgggaacctggccggcgccggggccaatgcctatcagctttga
35 fdh 지 메이스 A0A3L6EKZ5 / PWZ21308 atggtagagtccacaccattgctggtttgcttgctagacacaaacactaaactggagaagcacattgaagacatgcatgtcctgattaccaccccattccacccagcttatgtcactgcagagaggataaagaaggcgaagaatcttgagcttcttctcacggcaggaatcggctccgatcatattgatcttccagcagctgctgctgcgggcttaactgtggctgaggtcactggaagcaacactgtctctgtggcagaagatgagctcttgcgcattctgattctgctcaggaacttcttgcctgggtaccaacaggtagttcaaggcgaatggaacgtagcaggcattgcccacagagcttatgatcttgaaggaaaaactgttgggactgttggagctggtcgtattggcaggctcttgcttcagcgtcttaagccctttaactgcaacctactttaccatgacagacttcagattgacccagagcttgagaaagaaattggggccaaatttgaggaggacctggatgctatgcttccaaagtttgatgtgattgtgatcaacacacctcttacggagaaaacaagaggcatgtttaacaaagagaggattgcaaagatgaagaaaggtgtaattgttgtgaataatgctcgaggagcaatcatggatgctcgagcagtcgtagatgcatgttctagcggtcacattgctggatatggtggtgatgtgtggttcccacagccagcaccaaaggatcacccctggcgctacatgcctaaccatgccatgacccctcacatctctaggactacaattgatgcgcaggtgcggtatgcggatggtgtgagggacatgctggataggtatttcaagggcgaggacttcccggtgcagaactacatcgtcaaggaaggccagctcgccagtcagtacaagtga
36 fdh 닥틸렐리나 하프토틸라 S8BZ87 / EPS40692 atggtacttcgagccacatctacccttgcgcgttgcctcgccaaaccaaccctccaggcctccacactgggtgctcgtgttgttcggccagcgtatcgccagccattgaccgcaattcaaaccagaaaactgacaactactttccaacctcaggtcaaagttcttgctgtcttgtatgatggtggcaagcacgcccaggatgttccagctctgctaggaaccacagagaacgagctcggtattagaaaatggcttgaggatcaaggacacactttggtcaccacctctgacaaggaaggcgagaactcaaaattcgaccaagagttggttgatgctgaagttatcatcacaactcccttccgccctggatatttgactgctgagcgtcttgcaaaagccaagaaattgaagcttgctatcactgccggaattggatctgaccatgtggacctcaatgctgccaataagacgaatggtggagtcactgttgctgaagtcactggatcgaatgtcgtcagtgtagctgaacatgttgttatgacgatcttgatcttggtcaggaattttgtcccagctcatgaccaaatcagaaatggtgactgggaagttgccgctgttgccaaggatgaatatgacctcgaagataagattgttggaactgttggtgttggtagaatcggcgagcgtgtcctgcgaagattgaagccattcgactgcaaggaactgctttacttcgactaccaaccactcaatgcagcagttgaaaaagaaatcggctgccgccgtgtcgagagtttagaggagatggttgcacagtgcgatgttgtaacgatcaactgtccactccacgagtccacccacggattattcaacaagaatttgatctccaagatgaagaagggttcttggttggttaatactgctcgtggcgccatcgttgtcaaggaagacgttgccgaagccgtcaaatctggccaccttcgaggctatggtggcgatgtttggttcccacaaccggcccctaaagatcacccactgcgatacgccgtaaacccattcggtggcggtaatgccatggtcccgcatatgtcaggaacttctcttgatgctcagaaacgatacgccgatggcaccaagaaaatcctcgaaagctacctttctggtcgccacgactatcagccacatgacctcattgtccacaagggagattacgcgaccaaggcatacggtcagcgcaaatga
37 fdh 세그닐리파루스 루고수스 E5XSQ8 / EFV12585.1 atggcgaaaatcgttgccgtcctttacccggacccggtggacgggtatcccacgacgtacgcccgcgacgacatcccggtcatcgcgagctaccccggagggcagagcgcgccgaccccgtccgcgatcgacttcgtccccggccagctgctgggcagcgtgaccggcgagctgggcttgcggaagttcctcgaagcccagggccacacgctcgtggtcacctcggacaaggaggggccggattccgcgctcgaccgcgagctggccgacgcggacgtggtgatctcgcagccgttctggcccgcctacctcaccgccgagcggatcgcggcggctccgaacctcaagctcgcgatcacggcgggcatcggctcggaccacgtggacctcaacgccgccatcgcgcgcggcatcaccgtcgccgaggtcaccttcagcaactcgatcagcgtcgccgaacacgcggtcatgcagatccttgctttggtgcgcaactacctgccgtcgcacgcgtgggtcgccgagaagcggggctggaacatcgccgactcggtggagcgcgcctacgacctcgaaggcatgaccgtcggcgtgatcgcggcgggccggatcggcctcgccgtcttgcgcaggctcaagcccttcgacgtgaagctggcgtacaccgacaagcaccgcctgtccgccgaagtcgaggaggagctgggcctcacgttctacccggacatcccctcgctggtgcgcgcggtggacatcgtggacgtccacgcgccgctcgtgcccgagacccaccacctcttcgacgacgcgctcatcggcacgatgaagcgcggctcgtacatcgtgaacaccgccagaggcgcgatcatggacaccggcgcggtggtccgcgcgctcgagtccggccagctcgccgggtacgcgggcgacgtctggtacccgcagccgcccgcacccgaccacccgtggcgcacgatgccgtggagcgggatgaccccgcacgtctcgggcacgacgctctcggcgcaggcccggtacgccgcagggactcgggagatcctcgagtcctggctcgcgggcgcgccgatccgcgacgagtacctcatcgtggacggcggcaagctcgcgggcaccggagcccgttcctacagcaccagtggcagcgggtcgagcccaggatcgagcgggaagtag
38 fdh 아스퍼질러스 인돌로게누스 CBS 114.80 A0A2V5IND1 / PYI25397.1 atggtatttatgcgctctttctcccgtcaacttcgacggcctgcgacttctcttctttcaagcagaggccctctcgcatcggctggcagcagtcccttgcggacctcgcctctggccaactccattgctggtgcacgtacgctaaccgcctcggccaatctacagggcaagattcttatggttctttatgacggcggtgagcacgccaagcagcagcccggtcttctgggtaccaccgagaacgagcttggtttgagaaagtggctggaggaccagggccacactttggttaccacctctgacaaggagggtgagaactccactttcgacaaggagctcgttgatgccgaagtcatcatcaccacccccttccaccccggttaccttactgcggagcgtttggccaaggccaagaaccttaagatcgccgtcactgccggtgttggttccgaccacgtcgacctcaacgccgccaacaagaccaatggcggtatcactgtggccgaagtcactggctgcaatgttgtctccgttgcggagcacgttgtcatgacgatcctgaccctggtccgcaacttcgttcccgcccacgagcagatccgtaacggcgagtgggacgttgctgctgtcgccaagaacgagtacgatttggagaacaaggttgtcggcactgtcgctgtcggccgcatcggtgagcgtgtcctgcgccgtctcaagcctttcgactgcaaggagctgctctactacgactaccagcctctctcccctgaggtcgagaaggagatcggctgccgccgtgttgacgacctcgaggagatgctcgctcagtgtgatgtcgttaccatcaactgccctctacacgagaagactcgtggtctgttcaacaaggacctcatctccaagatgaagaagggctcgtggctcatcaacaccgctcgcggtgccatcgttgtcaaggaggacgtcgccgaggccgtcaagtctggtcacttgagaggctacggaggtgatgtctggttccctcagcccgcccccaaggatcaccctctgcgctacgtccagggcccctggggcggcggcaacgccatggttccccacatgtccggtacctcgatcgacgcccagatccgttacgccaacggcaccaaggctatcctcgagagctacttctccggtcgccacgactacagaaacgaggacctcatcgtccacaacggtgactatgtcactcgcgcctacggtcagcgcaacaaggcttaa
39 fdh 프라이드만니오마이세스 엔돌리티쿠스 A0A4V5N8V4 / TKA45179.1 atggtattcgctcgctccgcactccgcctcgcacgcccggcgagctcgctgttctcgcagcgggcggcgccagccttcgcccagcgcggggttccagtcgccaagagggccctgtcagcgactgcgtcgcaacagggaaaagtcctcttggtgctctacgatggccaccaacacgcccaggacgagcctcgattgctcgggacgaccgagaacgagctcgggatccggaagtggattgaggaccagggccacactcttgtgacgacctccgacaaagacggcgagaacagcaagttcgaccaagagcttgttgacgccgaggtcatcatcaccacacccttccaccccggctacctcaccaaggagcgcctcgccaaggcgaagaagctcaagatcgccgtgacggccggtattggttccgaccacgtcgacctcgacgccgccaacacgaccaacggcggtatcaccgtcgccgaagtcaccggctccaacgtggtgtccgtcgccgagcacgtcatcatgaccatgctcgtcctggtccgcaacttcgtccccgcccacgagatgatcgccgccggcaactgggacgtcgcggccgtcgccaagaacgagtacgacttggagaacaaggtcgtcggtaccgtggctgtcggccggatcggcgagcgtgtcctccgcagactgaaggccttcgactgcaaggagctgctgtactttgactaccagggtctgactcccgagaaggagaaggagattggctgcaggcgggtggagaacctcgaggacatgctggcgcagtgcgatgtcgtcaccatcaactgcccgctgcacgagaagacgcgcggcatgttcaacaaggagctgctgagcaagatgaagaagggctcctggctcgtcaacacggcccgcggcgccatcgtcgtcaaggaagacgtggccgaggccctcaagagcggccagctccgcggctacggcggcgacgtctggttcccccagccagcccccaaggaccacccgctccgctacgcctcctactccacctggggcggcggcaacgccatggtgccccacatgtccggcacctccatcgacgcgcaggagcgctacgccgccggcaccaaggcgattttggaggagtacttcagcgggcgcgagaactacaagcccgaggatttgattgtgcataagggggattacgccactaaggcgtatgggcagcgggaggggaagaagcatgctaatgcttag
40 fdh 액티니디아 치넨시스 var. 치넨시스 A0A2R6RYX7 / PSS35217.1 atggcgatgaagcgtgctgctgcctctgcagtccgtgctcttgcttcgtcggggaattcgaattcgtcgattttgaccagagagctccatacttctcctgggagcaaaaagatagttggagtgttctataaggcaaatgaatatgctgcaatgaatcccaattttttgggctgtgtggaaagagcattgggcataggtgactggttgaaatcacaagggcaccaatacatcgtcacagatgacaaagagggacctgattgtgaactcgagaaacacatttctgatatgcacgtcctcataactaccccatttcatccggcctatgttactgcggaaaggatcaagaaggctaaaaatctgcaactattgctcacagctggaattggctctgaccatgtcgatctgaaggctgcagctgctgccgggttaacagttgctgaggtcactggaagcaatgtggtttcggtagcagaggacgagctcatgagagttctcattctcactcgaaatttcttacctggataccatcaggttattaaaggggactggaatgttgcagctattgctcacagggcctacgatctggaaggaaagactgttggaactgtcggtgctgggcgtattggcaggctgttactccaaagactgaagcctttcaactgtcatctcctctatcatgaccggatcaagatggacctggagttggagaatcaaatcggtgcaaagtttgaggaggatcttgatgtgatgcttccaaaatgtgacattattgtcatcaacatgcctcttactgagaaaacaaaaggtatgtttaacaaggagaggatcgctaagttgaagaagggagttctcattgttaacaatgctagaggagctataatggatacacaagcagttgttgatgcctgttccagtggacatattgcaggctacagtggggatgtttggaatccacaaccagctccaaaggaccacccatggcgatacatgccaaaccaagccatgacccctcatatttctgggactacaatcgatgcacagttgcgatatgcagcaggagttaaggacatgttggataggtatttcaagggagaagagtttcctccacagcattacattgtcaaggaggggcccacccgttgtggaggaaatgcgattgggtgggggcagtgcgagaaagtaaaaatgggactactggagaatcacttgggagaaagtgtcagagttgtcacaaagtgctctacttctcctgggagcaaaaagatagttggagtgttctataaggcaaatgaatatgctgcaatgaatcccaattttttgggctgtgtggaaagagcattgggcataggtgactggttgaaatcacaagggcaccaatacatcgtcacagatgacaaagagggacctgattgtgaactcgagaaacacatttctgatatgcacgtcctcataactaccccatttcatccggcctatgttactgcggaaaggatcaagaaggctaaaaatctgcaactattgctcacagctggaattggctctgaccatgtcgatctgaaggctgcagctgctgctgggttaacagttgctgaggtcactggaagcaatgtggtttcggtagcagaggacgagctcatgagagttctcattctcactcgaaatttcttacctggataccatcaggttattaaaggggactggaatgttgcagctattgctcacagggcctacgatctggaaggaaagactgttggaactgtcggtgctgggcgtattggcaggctgttactccaaagactgaagcctttcaactgtcatctcctctatcatgaccggatcaagatggacctggagttggagaatcaaatcggtgcaaagtttgaggaggatcttgatgtgatgcttccaaaatgtgacattattgtcatcaacatgcctcttactgagaaaacaaaaggtatgtttaacaaggagaggatcgctaagttgaagaagggagttctcattgttaacaatgctagaggagctataatggatacacaagcagttgttgatgcctgttccagtggacatattgcaggctacagtggggatgtttggaatccacaaccagctccaaaggaccacccatggcgatacatgccaaaccaagccatgacccctcatatttctgggactacaatcgatgcacagttgcgatatgcagcaggagttaaggacatgttggataggtatttcaagggagaagagtttcctccacagcattacattgtcaaggagggtgaactcgctagccaataccgttaa
41 fdh 아스퍼질러스 가와치 G7XZ66 / GAA92225.1 atggtatttatgcgctctttctcccgccaacttcggcgacctgccacctctcttctctccaagggagccttcgcgcccgcggccagcagcccattccgggctgctcctctggctaactcgatcgctggtgcacgtacgctaaccgcctccgcgaatctgcagggcaaggttcttatggtcctctatgacggcggtgagcacgccaagcagcagcccggtcttctgggtaccaccgagaacgagctcggcttgaggaagtggctcgaggagcagggtcacactctggtcaccacctccgacaaggagggcgagaactcgaccttcgacaaggagctcgtcgacgctgaagtcatcatcaccactcccttccaccccggttacctcactgctgagcgtctggccaaggccaagaacctcaagatcgccgtcactgctggtgtcggttccgaccacgttgacctgaacgctgccaacaagaccaatggcggtatcaccgtcgccgaggtcaccggctgcaacgtcgtctccgtcgctgagcacgttgtcatgaccatcctgaccctggtccgcaacttcgttcccgcccacgagcagatccgccgcggcgagtgggacgttgccgctgtcgctaagaacgagttcgacctcgagggtaaggtcgtcggtaccgttgccgttggccgtatcggagagcgtgtcctccgccgtctcaagcccttcgactgcaaggagctcctctactacgactaccagcccctttcccccgaggttgagaaggagatcggctgccgccgcgtcgacgacctcgaggagatgctcgctcagtgcgatgttgtcaccatcaactgccccctgcacgagaagacccgcggtctgttcaacaaggagctcatctccaagatgaagaagggctcttggctcgtcaacaccgctcgtggtgccatcgttgtcaaggaggatgtcgccgaggccgtcaagtctggccacctccgcggatacggtggtgacgtctggttcccccagcccgcccccgccgaccaccctctgcgcaccgtccagggcccctggggcggcggcaacgccatggttcctcacatgtccggtacctccatcgatgcccagatccgttacgccaacggtaccaaggccatcctcgagagctacttctccggccgccacgactaccgcccccaggacctcattgtccacggcggtgactacgttaccaaggcctacggccagcgcaacaaggcctaa
42 fdh 칸디다투스 니트로소코스미쿠스 올레오필러스 A0A654LUU9 / ALI34306.1 atgaaaattgttgcagtgttatatcctggaggagaaatagcaaaaaggacaccggcgattcttggttcggcagagaatgctcttggcttgacaaattttctgaaagataaaggacatgaatttattgtattaacagataaagaggaggaacttgataaacacatttctactactgatattctgatcactacccccttttggccggcctatgttaccaaagaaagaatttccaaagcttctaacctcaagctcatcttaactgcaggcgtaggatcagatcacatagatttggctgcagcagcaagtagtaaaataactgttgcagaaattacaggtagtaatgtggtaagtgtagctgaacaggttgtgatgcatatcttggctttagtgcgaaactacataccagcttataaacaggttatagaaggtagatgggatatagcagagatagcatcaaacgcgcatgatctagaagacaaggttgttggaattatcggaatgggaagaattggacaaagggtttgtgaaaggttgaaagcatttgatgttaaaatgctttatcatgatcaaattcctctacggactgcagaagaatttgtgttgggtgtcagatacacccctagagatcagatcgtagaacaggctgatgtgattacaataaatacgcctttaacgccagagaccgatggtatgtttaatcgagatctactttttaaaatgaaaaaaggtgcatatcttgttaatacagctcgaggaaagatcgtagatactcatgctcttgtagaatctttggaggaaggtcatttagcaggatatgctggcgatgtttggtatccacaaccggccacaggagatcatccttggagacatatgcctaatcatgcgatggtccctcattattctggaacaaccctcgaagcacaaaacagatatgcgaatggaataaaggattgtcttatgcggtttctagaaaaccgtcctcttgaacaacaataccttattgtcgataaaggtggcgtggtaagcccgagttacagctacgctttcaagaaataa
43 fdh 블라스토마이세스 글리크리스티 A0A179UWZ8 / OAT12333.1 atgggtaaagtactcttggttttgtatgatggaggacaacatgcgaaggaccagcctggtttgctcggaacgactgagaacgagctgggcctgaggaagtggttggaagagaagggccatacccttgtaaccacctctgacaaagaaggtgccaactctaaattcgaccaggagcttgtcgatgctgaggttatcatcactaccccattccacccaggatatctgaccgcagaacgcctggctaaagccaagaacctgaaactggccgtcacggccggtgtgggatccgaccacgtcgacctgaacgccgccaacaagacgaatggcggcatcaccgttgccgaagtgacgggctgcaatgtcgtctccgtcgccgagcacgtcgtcatgaccattctcgtcctggtccgcaactttgtcccttcacacgagcaggttgccagcggcgattggaacgttgccgccgtggcgaagaacgagtatgacctcgagggaaaagtcgtcggcaccgttgccgtgggccgtattggcgagcgtgtcctgcgacgactgaagccgtttgactgcaaggagctgctgtactatgattaccagccgctgacgccagaggtcgagaaggagatcggatgccgccgcgtggagaatctggaggaaatgctcgcgcagtgtgatgttgtcaccatcaactgccccctgcacgagaagactcgcggcttgtttaacaaagacctcatctcgaagatgaagaagaggctcctggctcatcaacaccgcccgcggcgccatcgtcgtcaaagaagacgtcgccgacgccatcaaatccggccatctgcgcggctacggcggcgacgtgtggttcccgcagcccgcgcccaaggaccatccgctgcgctacgtccaggggccctggggcggcggaaacgcgatggtgccgcacatgtccggcagctccatcgatgcgcaggtgcgctacgcggagggcacgaaggcgattctcgagtcgtatttctccggcaggcatga
44 fdh 파라버크홀데리아 카리벤시스 MBA4 A0A0P0RDP0 / ALL66463.1 atgtatcacgtcgatatgtcgatagagcgccggcatgaaaatgcgctcgaccagactggagcgagacgaatggctaaggttctttgtgtgctgtatgacgaccccgtcaagggaatgccgaaacagtacgcccgcgacggcgtacccgaaatcacgcgttatcacgacggtcaaacggccccgacgccgaagggcatcgacttcacgccgggcgaattgctgggcagcgtatcgggcgaactggggctgcggaaatacctcgaatcgctagggcatacgctcgtcgtgacatccgacaaggatggtccgaactcgcggttcgagcgcgagcttgccgacgccgaagtcgtgatttcccaaccgttctggcccgcgtacctgacggcggaacgcatcgcgaaagcgccgaagctcaagctcgcgttgacggcgggcatcggctcggatcacgtcgatttgcaggcggccatcgagcgcggcgtgacggtggccgaagtgacgtattgcaacagcatcagcgtcgccgaacacgtcgtgatgatgattctcgggctggtgcgcaattacctgccgtcgcatgaatgggtgaagaagggcggctggaacatcgccgactgcgtcgagcgtgcttacgatctcgaagccatgcacgtaggcacggttgcggcgggccggatcggcgcggccgtgttgcgcagactgaagccgttcgacgtgaagctgcactatacggatcgtcatcgcctgccgctcgatgtcgagaaagaactcggcgcgacgtggcacccggacgtcgagtcgatggtgaaagcgtgcgacgtggtgacgatcaactgtccgctgcacccggaaacggaaaatctcttcaatgaaaagctgatcgcgaaaatgaagcgcggcgcgtatatcgtgaacacggcgcgcggcaagatcgtcgatcgcgatgcgattgtgcgggcgctcgaatcgggacaactggcgggctatgcgggcgacgtgtggttcccgcagccggcgccgcgcgatcatccgtggcgcacgatgccgcacaacggcatgacgccgcatatttcgggcactacgctgtcggcacaggcgcgttatgcggctggcacgcgcgagatcctcgaatgctggttcgagaagcggcctatccgcgacgagtatctgatcgtcgacggcggcaagctggcgggcgtcggcgcgcactcgtatagcgcgggcaatgcgacgtcgggatcggaagaggcggcgcgattcaagactgcgtaa
45 fdh 메소리조비움 sp. A0A440NN77 / RWF04819.1 atcaaaatggcaaaggtcgtttgcgtcctctatgacgatccggttgacggttatccgtcaaattatgcacgggatgggctgccgaagctcgaccgctatcccggcggccagacgcttcccacgccgaaggccatcgacttcgaaccgggggttctgctcggcagcgtgacgggcgagctcggcctgcggccatttctcgaaagcgccgggcacagtctggtcgtgacctcggacaaggacggtcccgacagcgttttcgaacgcgaactcgctgacgccgaaatcgtcatctcgcagccgttctggccggcctatctgaccaacgaacggatcgccaaggcagaccaacttaagcttgcgatcaccgccggcatcggatccgaccatgtcgatctgcaggccgcgatggaccgcggcatcaccgtcgccgaggtgacctactgcaactcgatcagcgtgtccgagcatgttgtgatgatgatcctggcgctggtgcgaaactacatcccctcttaccagtgggtcatcgacggtggctggaatatcgccgactgtgtcgcgcgctcctacgatgtcgaggggatgcagatcggaaccgtcggcgccggccggatcggtagcgcggtgctgcaccggctgcagccgttcgacgtcaaattgcattacaccgaccgccaccgcctgtccgaggcagtcgagaaacaccttggcgtcaccttccacccagacgccgcgtccatggtcggcatctgcgatgtggtgacgatcaatgcacctctgcatccggagacggagaacctgttcgacgaggcgatgatcgccaggatgaaacggggcgcctatctggtgaacacggcgcgcggcaagatctgcaatcgcgacgccgtcgcccgtgcgctggagagcggccagctcgccggctatgccggcgatgtgtggttcccgcagccggcccccaaggaccatccctggcgttcgatgccgcatcacggcatgacgccgcatatttcaggatcttcgctctcggcccaggcgcgctacgccgccggcacccgcgaaatcctggagtgctggttcgaaggccggccgatccgggaggaatacctgatcgtcgatggcggcaagctggccggcgccggcgcgcattcctatagcgcaggcgacgccacaagcggttcggaggaggcggcgcgcttcaaggccaaggcgtga
46 fdh 헬리코카르푸스 그리세우스 UAMH5409 A0A2B7Y0K3 / PGH14392.1 atggtatttctgcgctctacatcccgtctcctctcccggccaatctcctctctgttggctggtcgagcccttccccgcgcctcagctgccttgcccctatacaacacgcagctctgcgggccaacgtcccgtttgcctttcactggagtcagaacactaacagcgagtcctaaactccagggtaaagttctgcttgtcttgtacgatggagaagagcatgcgaagcagcagcccggcctgcttggaaccactgagaacgagctcggattgagaaaatggctcgaagatcagggacataccctggttaccacctccgataaagagggagagaactcaaaattcgaccaggagctcgtcgacgctgaagttatcatcactactcctttccaccccggttacctcactgcggagcgtctcgccaaagctaagaacctcaagcttgccatcacagctggtgttggctccgaccacgtcgatctgaacgccgccaacaagactaacggcggtatcaccgtcgctgaagtcactggctgcaatgtcgtctctgtcgctgagcacgtcgtcatgactatccttgttttggtccgcaacttcgtccccgcacacgagcaggttgccagtggagactggaacgttgctgccgtggccaagaatgagttcgacttggagggcaaggtcgttggtaccgtcgctgttggccgcattggcgagcgtgttctccgacgactcaagccattcgactgcaaggagctgctctactacgactaccagcccttgaagcctgaggttgagaaggagattggatgccgtcgcgtcgagaacctcgaggagatgctggctcagtgtgacgttgtcaccatcaactgccctctccacgagaagacccgtggtctgttcaacaaggagctcatctcgaagatgaagaaaggctcctggctcgtcaacactgcccgtggcgccatcgtcgtcaaggaggacgttgccgaggccgttaagagcggccacctccgcggctacggaggcgacgtctggttcccccagcccgcgcccaaggaccacccactccgctacgcccagggcccatggggcggcggaaacgccatggttcctcacatgtccggtacctccatcgacgcccaggtccgctatgctgagggcaccaagaggatcttggactcgtacttctctggcagacacgactataggcctgaggatttgatcctgttcggtggtgattatgctaccaaggcatatggacagcggactaaggcttag
47 fdh 스트렙토마이세스 알비도플라부스 A0A7H9W684 / RZF05900.1 atggcgaagatcgtctgcgttctctacccggacccggtcaccggcttcccgccccagtacgcgcgcacctccctccctgcgctcgacggctaccccggcggccagaccctgccgactcccgagggcctcgacttcacccccggcgaactggtgggcagcgtctccggggagctggggttgcgggaattcctggagtcccggggccacaccctggtcgtcacctccgacaaggagggccccgactccgagctggaccgtgaattggccgacgccgacgtggtgatatcccagccgttctggcccgcctacctcaccgccgaacgcatcgcccgcgccccgaagctgaagctggcgctgaccgccggcatcggctccgaccacgtcgacctggacgccgccatcgcccgcggcatcaccgtcgccgaggtcacgtacagcaacagcatcagcgtcgccgagcacgctgtgatgcagatcctggccctggtccgcaactacctgccctcccacaagatcgcggccgagggtggctggaacatcgccgactgcgtctcgcacgcctacgacctggagggcatggacgtcggagtcatcgccgccggccgcatcggccaggccgtgctgcgccgcctcaagcccttcggtgtccgcctccactacaccgacaagcgccggctgccgcgcgaggtcgaggaggagctgggcctgaccttccacgcgagtgcccaggaactcgcccgcaacatcgacgtggtctccatccacgccccgctccaccccgagacgcagaacctcttcgacgagaagctgctggcgaccatgcggccgggctcctacatcgtcaacaccgcccgcgcccagatcgtcgaccgcgacgcgatcgtccgcgccctggagtcgggacagctcgccggttacgcgggcgacgtctggtacccccagcccgcccccgccgaccacccctggcgcaccatgccccacaacggcatgaccccccacatctccggcaccaccctcaccgcccaggcccgctacgcggccggcacccgcgagatcctggaggactggctgcagggcacgccgatccgcgaggaatacctcatcgtcgacggcggccgcctcgccggaacgggcgccgcgtcgtacacggcgggagaaaagacggcagaaaagagctga
48 fdh (미국 공개공보 2019-0161741의 돌연변이) 인공 N/A atgaagatcgttttagtcttatacgattgtggtaagcacgctgccgatgaagaaaaattatacggttgtactgaaaacaaattaggtattgccaattggttgaaagatcaaggacatgaattaatcaccacgtctgataaagaaggcggaaacagtgtgttggatcaacatataccagatgccgatattatcattacaactcctttccatcctgcttatatcactaaggaaagaatcgacaaggctaaaaaattgaaattagttgttgtcgctggtgtcggttctgatcatattgatttggattatatcaaccaaaccggtaagaaaatctccgttttggaagttaccggttctaatgttgtctctgttgcagaacacgttgtcatgaccatgcttgtcttggttagaaattttgttccagctcacgaacaaatcattaaccacgattgggaggttgctgctatcgctaaggatgcttacgatatcgaaggtaaaactatcgccaccattggtgccggtagaattggttacagagtcttggaaagattagtcccattcaatcctaaagaattattatactacgattatcaagctttaccaaaagatgctgaagaaaaagttggtgctagaagggttgaaaatattgaagaattggttgcccaagctgatatagttacagttaatgctccattacacgctggtacaaaaggtttaattaacaaggaattattgtctaaattcaagaaaggtgcttggttagtcaatactgcaagaggtgccatttgtgttgccgaagatgttgctgcagctttagaatctggtcaattaagaggttatggtggtgatgtttggttcccacaaccagctccaaaagatcacccatggagagatatgagaaacaaatatggtgctggtaacgccatgactcctcattactctggtactactttagatgctcaaactagatacgctcaaggtactaaaaatatcttggagtcattctttactggtaagtttgattacagaccacaagatatcatcttattaaacggtgaatacgttaccaaagcttacggtaagcacgataagaaataa
본 발명에 대한 다양한 구현예들의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형들이 본원에 제공된 본원에 기술된 정의 내에서 제공되는 것으로 이해된다. 따라서, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
합성 메타게놈 및 단백질 조작 FDH 라이브러리 (일차 FDH 라이브러리)
합성 메타게놈 FDH 라이브러리의 소싱 및 설계
서열 데이터베이스에서 칸디다 보이디니의 FDH (UniprotID: O13437; 서열번호 2)에 대해 대략적으로 상응하는 시드 아미노산 서열을 이용해 FDH 후보체 약 2500개에 대한 정보를 입수하였다. 이들 FDH 후보체 2500종으로부터 서열 품질, 구조 및 유사성에 기반하여 추가로 평가하기 위해 서열 300개 (+ 시드 서열 2개)를 선택하였으며, 예를 들어, 유사성이 50% 미만이거나 또는 동일성이 95%를 초과하는 서열들은 제외하였다.
이들 단백질은 이후 tinker 및 표준 E. coli 코돈 표를 이용해 DNA로 다시 코딩한 다음 pSC101ampR 벡터에 클로닝하였다. 프로모터/RBS 서열은 대조군 플라스미드에서 확인되는 것과 동일하였다.
주형 서열에 기반한 FDH 라이브러리의 소싱 및 설계
단백질 조작 FDH 라이브러리를 선택한 주형 서열로부터 전산적으로 설계함으로써 구축하였다. 라이브러리는 Ranomics, Inc. 사에서 주문하였다. 이 라이브러리의 돌연변이 복합도 (mutational complexity)는 변이체 당 치환 7개 미만을 목표로 하였다.
실시예 2
효소 라이브러리 스크리닝
FDH 분석 검증
실시예 1에 기술된 FDH 라이브러리의 설계 및 합성 이후에, Hopner and Knappe, Methods of Enzymatic Analysis, Volume III, 1551-1555 (1974)에 언급된 분석에 기반한 FDH 활성 스크리닝 분석을 공지된 대조군을 이용해 최적화하고, 384웰 플레이트에서 활용하도록 규모를 축소시켰다. 최적화된 분석에 대한 간단한 설명을 아래에 제공한다.
FDH 라이브러리 형질전환체의 해동한 글리세롤 원액 (5 ㎕)을 1/2 높이의 딥-웰 플레이트에서 100 ㎍/mL 카르베니실린이 첨가된 1X LB 배지 500 ㎕/웰에 투입한 다음 AeraSeals로 밀봉하였다. 플레이트는 35℃에서 인큐베이션하고, 80% 가습 하에 16-20시간 동안 1,000 RPM (revolutions per minute)으로 교반하였다. 수득한 배양물을 웰당 50 ㎕씩, 1/2 높이의 딥-웰 플레이트에 든 100 ㎍/mL 카르베니실린이 첨가된 1X LB 배지 450 ㎕/웰에 투입한 다음 AeraSeals로 밀봉하였다. 플레이트는 35℃에서 인큐베이션하고, 80% 가습 하에 16-20시간 동안 1,000 RPM으로 교반하였다. 수득한 배양물을 웰당 10 ㎕씩, 96웰 평평 바닥형 플레이트에 수용된 포스페이트 완충화된 염수 (PBS) 190 ㎕/웰에 첨가하였다. 플레이트 리더에서 광학 측정을 수행하였으며, 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생산 배양물 125 ㎕/웰을 다른 1/2 높이의 딥웰 플레이트 세트에 투입하고, 밀봉한 다음 4000xg에서 15분간 원심분리하였다. 플레이트를 열고, 디캔팅에 의해 상층액을 제거하였다. 수득한 펠릿은 분석 개시시까지 -80℃에서 보관하였다.
분석 당일 냉동한 펠릿 샘플 플레이트를 실온에서 1시간 이상 해동하였다. 세포용해 완충제 (1X Bugbuster 세포용해 시악, 2.5 mM 1,4-다이티오트레이톨 (DTT), 0.2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), 3U/㎕ rLysozyme, 0.0025 U/㎕ 벤조나제 뉴클레아제)를 125 ㎕/웰로 펠릿 플레이트에 분배하였다. 완충제와 펠릿을 Hamilton STARlet 액체 핸들러에 설정된 반복적인 파이펫팅을 이용해 25회 혼합하여 세포용해된 세포 현탁물을 수득하였다. 세포용해된 세포 현탁물 5 ㎕/웰을 96웰 평평 바닥형 1/2 영역 블랙 플레이트에서 분석 완충제 (최종 농도: 2.5 mM 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 (NAD), 10 mM 소듐 포르메이트, 50 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드 (Tris-HCl) pH 7.4) 45 ㎕/웰에 넣어 혼합하였다. 연속적인 카이네틱 흡광도 측정을 플레이트 리더에서 수행하였으며, 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 플레이트를 느린 오르비탈 이동으로 계속 교반하면서 10분 간격으로 실시하였으며, 온도는 28℃로 고정하였다. 플레이트 리더에서 입수한 카이네틱 데이터는 이후 Python에서 선형 피트 및 데이터 처리 패키지를 사용해 처리하였다.
합성 메타게놈 및 단백질 조잘 FDH 라이브러리의 1차 스크린
실시예 1에서 구축한 변이체들에 대한 1차 스크린에 대해 전술한 최적화된 FDH 분석을 수행하였다. 1차 스크리닝 실험에서 수득한 결과는 다음과 같이 처리하였다:
1. 각 균주 레플리케이트에 대한 카이네틱 데이터를 도표로 작성하였다;
2. 데이터의 첫 5분 구획의 선형 피트 (즉, 선형 영역)에 기반하여 반응 속도를 계산하고, 단위를 Abs/sec에서 mAbs/min으로 바꾸었다;
3. OD600 데이터에 따른 비율을 표준화하여 "표준화된 속도 (normalized rate)"를 구하였다;
4. "표준화된 속도"는 각 용기의 표준화된 속도를 해당 용기에서의 높은 대조군 속도 평균으로 나누어 구하였다;
5. 전체 샘플들에서 표준화된 속도를 각 용기에서 표준화된 속도와 높은 대조군 평균의 비율을 토대로 순위를 매겼다;
6. 표준화된 속도와 높은 대조군 평균 간의 비율에 대해 특정 임계값 (높은 대조군 대비 1.0x 활성)을 설정해, 히트를 식별하였다.
스크리닝한 균주 1,386종에서 1.0x 활성을 컷-오프로 설정하였으며, 균주 270종이 "히트"로 식별되었다. 스크린에서 대조군의 성능은 도 1에서 확인된다. 대조군 및 히트의 표준화된 속도 도표에서, 샘플 타입은 좌측에서 우측 방향으로 다음과 같다: 음성 대조군 (t679853); 양성 대조군 (t594738); 및 라이브러리.
상기 기준에 따라 정의한 라이브러리 히트들을 다음과 같이 표로 작성하였다:
50% 컷오프에서 히트 수는 527개였다. 컷오프 60%에서 히트 수는 464개였다. 컷오프 70%에서 히트 수는 415개였다. 컷오프 80%에서 히트 수는 371개였다. 컷오프 90%에서 히트 수는 328개였다. 컷오프 100%에서 히트 수는 270개였다. 컷오프 110%에서 히트 수는 225개였다. 컷오프 120%에서 히트 수는 183개였다. 컷오프 130%에서 히트 수는 145개였다.
실시예 3
2차 단백질 조작 라이브러리 (2차 FDH 라이브러리) 설계 및 합성
2세대 (gen2) 단백질 조작 라이브러리의 구축은 실시예 1 및 2 (gen 1)에서 언급한 이전의 메타게놈 및 단백질 조작 FDH 라이브러리의 결과를 활용 및 학습하여 수행하였다. 이전 스크리닝 시도에서 칸디다 보이디니의 FDH 유전자 기록 (UniprotID: O13437; 서열번호 2)이 식별되었으며, 측정한 활성에 2배 개선이 달성되었다. 메타게놈 발굴 라이브러리에서 시드 (즉, 칸디다 보이디니의 FDH) 활성의 2배인 FDH (UniprotID: A0A250B5N7; 서열번호 1)가 지브시엘라 퀘르시네칸스 (Gibbsiella quercinecans)에서 식별되었다. 단백질 조작 라이브러리에서, 변이체 1176개 중 84개가 칸디다 보이디니의 야생형 FDH보다 활성이 더 높았다. 야생형 활성의 1.5X로 정의한 유익한 점-돌연변이는 30개 이상이었으며, 상위 8개가 칸디다 보이디니의 야생형 FDH에 비해 >2X 더 높았다.
gen2 단백질 조작 라이브러리에는 초기 라이브러리에서 식별한 칸디다 보이디니 유전자 기록으로부터 나온 FDH를 이용하였으며, 지브시엘라 퀘르시네칸스에서 서열 주형으로서 FDH를 발굴하였다. 칸디다 보이디니 유래 FDH에 대해 몇가지 설계 전략을 적용해 변이체 라이브러리를 구축하였다. 1차 단백질 조작 라이브러리에서 순위가 높은 유익한 점-돌연변이들을 조합해, 점-돌연변이가 2-4개인 변이체를 제작하였다. 칸디다 보이디니의 야생형 FDH에 대한 상동성 모델 및 표 2에 요약한 gen1 단백질 조작 라이브러리에서 수득한 점-돌연변이 통합 모델에 대해 전산학적 도킹 및 설계를 수행하였다.
표 2: gen1 단백질 조작 라이브러리에서 입수한 점-돌연변이 통합
잔기 위치 변이
A 91 S
H 97 N
A 257 S
T 256 C
Y 312 V
히트-재조합 및 전산적인 도킹 및 설계 전략으로 각각 작제물 386개 및 321개가 제작되었다.
주형 서열로서 지브시엘라 퀘르시네칸스의 FDH를 이용해 하기를 포함하는 몇가지 단백질 조작 설계 전략을 구현하였다: (1) FDH 상동체에 대한 다중 서열 분석; (2) FDH 활성 부위로부터 10 Å 이내에 공통 발생 점-돌연변이 고려; (3) 칸디다 보이디니 FDH에서 식별된 유익한 돌연변이 고려, 및 (4) 지브시엘라 퀘르시네칸스 FDH 상동성 모델을 이용한 전산학적 도킹 및 설계. 이들 서열 생물정보, 활성-부위 돌연변이 유발, 히트-트랜스퍼 및 도킹 & 설계 단백질 조작 전략으로 작제물이 각각 150, 140, 117 및 63개 제작되었다.
변이체 단백질 서열에서 중복을 제거하고, pG_10499 플라스미드에 넣어 합성하기 위해 1121-멤버 라이브러리에 제공하였으며, 이로써 작제물 개수가 1,061개인 라이브러리가 구축되었다.
실시예 4
1차 FDH 라이브러리 형질전환
실시예 3에 언급된 작제물 1,061개로 구성된 초기 라이브러리에 대해 고 처리 형질전환 프로토콜을 실시하였다. 작제물의 약 91% (즉, 작제물 968개)가 3회 선별 (pick)로 회수되었고, 작제물의 2.7% (즉, 29개)는 0회 선별로 회수되었는데, 이는 아마도 복구 시간 연장 및 DNA 양 증가가 원인일 수 있다 (표 3).
표 3: 선별 성공 (Picking Success). 클론의 선별 횟수에 따른 샘플 수 및 %
선별 횟수 작제물 라이브러리 %
0 29.0 2.7%
1 34.0 3.2%
2 31.0 2.9%
3+ 968.0 91.1%
총 1,062.0 100.0%
형질전환된 작제물의 증식을 추가로 조사하였으며, 수득한 OD 값에 따르면 선별 후 작제물 20개 (즉, 1.9%)가 추가로 제거되었다. 그 결과, 작제물 49개 (즉, 4.6%)는 OD를 통과한 최종 냉동 원액에 존재하지 않았으며, 918개 (즉, 86.4%)는 OD를 통과한 최종 냉동 원액에서 각각 클론 3종에서 나타났다 (표 4).
표 4: 최종 형질전환 데이터 및 증식 성공, 구체적으로, 양성 대조군을 비롯해 OD가 성공에 해당하는 (즉, 증식된 샘플) 선별한 샘플의 수 및 %를 나타낸다.
선별 횟수 작제물 라이브러리 %
0 49.0 4.6%
1 34.0 3.2%
2 61.0 5.7%
3+ 918.0 86.4%
총 1,062.0 100.0%
실시예 5
2차 FDH 라이브러리에 대한 1차 스크린
여러가지 속도 명명법에 대한 정의 및 계산법
하기에 제공된 여러가지 속도 명명법에 대한 정의 및 계산법은 데이터 수집에 대한 참조로 이용한다. 용어 "원속도 (raw rate)"는 반응의 처음 5분간 카이네틱 데이터의 선형 회귀 기울기로 정의된다. 용어 "OD 표준화된 속도"는 각 샘플의 원속도를 특정 샘플의 OD로 나눈 것으로 정의하였다. "표준화된 속도"는 OD 표준화된 속도를 샘플이 있는 특정 플레이트에서 선택 양성 대조군의 OD 표준화된 속도 평균으로 나눈 것으로 정의하였다. 각 표준화 속도에 이용한 양성 대조군은 데이터 수집에서 설명하였다.
1차 스크린: 원속도, OD-표준화 속도 및 표준화 속도
실시예 2에 언급한 최적화된 FDH 분석을 이용해 1차 스크리닝을 수행하였다. 다음과 같은 음성 대조군과 3가지 양성 대조군을 분석에 포함하였다: (1) 음성 대조군 t679853; 및 (2) 1세대 라이브러리 스크린에서 유래한, 즉 균주가 야생형 FDH인, 양성 대조군 Positive 1 (t594738); 2세대 라이브러리 주형 2종 중 하나인 gen1 라이브러리에서 기록된 야생형 히트로서 Positive 2 (t729843); 및 gen1 라이브러리에서 메타게놈 히트로서 Positive 3 (t730034). 피어슨 상관 계수 (R) = 0.297 역시 약간의 양의 상관관계를 나타내었다. 전체적으로 낮은 R 값은 플롯 우측의 높은 OD 이상값이 원인일 가능성이 높다. 데이터를 OD로 표준화하여, OD 의존적인 효과를 완화시켰으며, OD 표준화된 속도 (Y 축)를 이용해 양성 대조군보다 성과가 우수한 히트들을 관찰하였다. Positive 2 균주 (t729843)가 원속도들 간, OD-표준화된 속도들 간에, 그리고 각 플레이트 상의 평균 속도들 간에 더 양호한 상관 관계를 나타내었으므로, Positive 2 균주 (t729843) 대조군을 OD 표준화된 데이터를 추가로 표준화하는데 이용해 플레이트-플레이트 편차가 거의 없는 "표준화된 속도"를 구하였다.
1차 스크린: 히트 선별
다음으로, 다음과 같은 절차를 이용해 2차 스크리닝을 위한 균주 200종을 선별하였다: 1) 균주들은 표준화된 속도 평균에 대해서만 순위를 매겼다 (Positive 2 균주 (t728943) 표준화 및 OD 표준화); 2) A 및 B 작업셀의 데이터를 이러한 순위 프로세스에서 하나로 결합시켰다; 3) Positive 3 균주 (t730034)(메타게놈 FDH 히트) 주형으로부터 수득한 상위 150종 균주 및 Positive 2 균주 (t729843)(E. coli 기록된, 코돈-최적화된FDH) 주형으로부터 입수한 상위 50종 균주들을 선택하였다.
선택한 히트 200종에서, 레플리케이트 수 대 평균 표준화 속도로 도표를 작성하였다. 히트는 1회-선별 균주 6종, 2회-선별 균주 10종 및 3회-선별된 히트 균주 184종을 포함하였다.
실시예 6
2차 FDH 라이브러리에 대한 2차 스크린
2차 스크린: 원속도, OD-표준화 속도 및 표준화 속도
실시예 2에 언급된 최적화된 FDH 분석을 이용해 2차 스크리닝을 수행하였다. 2차 스크리닝의 예비 분석 결과, 라이브러리 샘플의 최소 속도는 약 10 속도 단위였으며, 이는 1차 히트 성분들 모두 상당한 효소 활성을 가지고 있음을 의미한다. 속도 (Y 축) 대 OD600 (X 축)의 점 도표는 1차 스크린과 마찬가지로 OD와 원속도 간의 양의 상관 관계를 나타내었다. 아울러, OD 표준화된 라이브러리 데이터가 Positive 3 균주 (t730034)보다 높았다.
용기별 데이터 (per container data)의 경우, 데이터 분포가 매우 균일한 것으로 관찰되었다. 1차 스크린과의 일관성을 유지하고 여러가지 양성 대조군에 대해 반응 속도를 벤치마킹하기 위해, 2차 스크린에서 속도를 양성 대조군 3종 모두 (t594738; t729843; t730034)에 대해 각각 표준화하였다.
1차 스크린과 2차 스크린 간의 상관 관계
1차 스크린과 2차 스크린 간의 상관 관계를 조사하였으며, 표 5의 결과에서 대부분의 속도 타입들이 2가지 스크린 간에 만족스러운 상관 관계를 보였으며, 피어슨 상관 계수 >0.7, R-제곱근 >0.5 및 스피어만 상관성 >0.65이었다. Positive 1 균주 (t594738)에 대한 표준화된 속도 수치를 제외한, 2종의 스크린 결과는 밀접한 상관 관계를 나타내었으며, 이는 2종의 스크린에서 입수한 히트들이 아마도 진정한 히트임을 의미한다. 특정 양성 대조군보다 성능이 더 우수한 히트의 경우, 표준화된 (t729843) 속도 또는 표준화된 (t730034) 속도가 관찰하기 위한 우수한 지표였다. 양호한 양의 상관 관계를 보인 데이터 대부분이 데이터에서 강한 양의 기울기로 클러스터링 되었으며, 이는 상관성 수치를 뒷받침해준다.
표 5: 다양한 반응 속도들에 기반한 1차 스크린과 2차 스크린 간의 상관관계
상관 계수 원속도 OD 표준화된 속도 표준화된 (t729843) 속도 표준화된 (t594738) 속도 표준화된 (t730034) 속도
피어슨 (r) 0.765 0.747 0.746 0.425 0.783
r-제곱 0.585 0.558 0.557 0.181 0.613
스피어만 (ρ) 0.667 0.659 0.71 0.442 0.7
실시예 7
추가적인 FDH 활성 분석
선별한 변이체에 대해 추가적인 FDH 활성 스크린을 후술한 바와 같이 수행하여, 추가로 평가하였다.
구성적 프로모터 하에 FDH 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진 플라스미드 함유 E.coli 균주를 구축하였다. 이 균주를 LB + 카르베니실린 (100 ㎍/mL)에 접종해, 교반 인큐베이터에서 밤새 35℃에서 배양하였다. 밤새 배양물을 신선한 LB + 카르베니실린으로 희석한 다음 교반 인큐베이터에서 밤새 35℃에서 배양하였다. 이를 원심분리해 세포를 수집하고, 시험관내 세포용해물 분석을 수행하는 날까지 -20℃에서 냉동하였다.
시험관내 세포용해물 분석을 위해, 세포 펠릿을 해동한 다음 0.1 M Tris-HCl, pH 7.0 완충제에 재현탁하였다. 세포 현탁물의 OD600을 측정하고, 각 후보체를 OD4에 대해 표준화하였다. 원심분리해 펠릿화한 다음 펠릿을 뉴클레아제 및 리소자임이 함유된 화학적 세포용해 시약을 첨가해 실온에서 30분간 세포용해 처리하였다. 세포용해물을 이용해 다음과 같이 35℃에서 FDH 활성을 측정하였다. FDH 세포용해물 조산물의 분획, 요망하는 농도의 포르메이트 (0-100 mM) 및 0.5 mM NAD를 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4 완충제 0.04 mL에서 혼합하였다. 생산물 NADH를 10 μM PMS (1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸 설페이트 및 2 mM XTT (2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카르복스아닐라이드)와 560 nm에서 흡광도를 이용해 연관시켜, 반응물의 카이네틱을 모니터링하였다. 대조군 (예를 들어, 표 6, 표 7 및 표 8에 지정된 바와 같이 서열번호 1 또는 2)에 대한 상대적인 활성을 결정하였다.
선택 변이체의 활성 동정을 비롯한 이들 스크린 결과를 표 6 및 표 7에 나타낸다.
표 6: 지브시엘라 퀘르시네칸스 야생형 대조군의 FDH와 비교한, 지브시엘라 퀘르시네칸스 FDH를 주형으로 이용하여 조작한 FDH 예들의 상대적인 활성
변이체 # 잔기 위치 변이 활성
1 I 335 S +
2 C 231 A +
3 Y 346 A -
4 F 146 Q +
5 I 150 T +
6 A 122 S -
T 284 S
7 F 313 Y -
H 128 N
8 T 198 I -
T 284 C
9 Q 98 W -
S 147 V
10 F 100 A -
S 147 A
V 152 A
11 A 122 S -
A 285 S
12 N 175 R +
13 Q 343 A -
14 A 122 S -
Y 346 M
15 A 269 D +
H 297 R
16 C 290 I +
F 313 Y
17 Q 303 K +
T 350 A
18 H 128 N -
Q 303 K
19 I 335 A +
20 C 290 I +
Q 303 K
21 G 342 K -
22 V 152 A -
Y 346 I
23 G 342 L -
24 Y 346 L +
25 G 342 A +
26 N 381 P -
27 C 30 G +
28 N 176 S +
29 P 218 T +
I 238 T
30 S 147 L -
31 V 144 I +
32 A 122 S -
G 138 D
33 K 384 T +
34 T 338 Y -
35 Q 303 K +
T 284 C
36 I 335 M +
37 H 297 V +
T 301 S
38 H 128 N -
Y 346 I
39 S 147 A -
V 152 A
Y 346 L
40 A 122 S +
F 313 Y
41 G 342 V -
Q 98 W
S 147 L
42 V 19 S +
43 Q 315 E -
44 H 128 N -
T 284 S
45 D 27 K +
46 I 319 R +
47 Q 98 W -
S 147 L
48 A 262 E +
49 S 339 T +
50 S 151 A +
51 I 150 G -
52 A 285 G +
T 284 M
53 Q 303 K +
54 H 128 M -
55 G 342 I -
56 L 199 I +
F 266 M
57 P 218 N +
I 238 T
58 Q 256 I -
59 C 231 K +
60 R 325 T +
61 Q 256 C -
62 Q 256 L -
63 T 338 F -
64 V 191 L +
65 G 138 D -
H 128 N
66 C 231 R +
67 H 297 G +
T 301 S
68 C 231 V +
69 F 100 A -
V 152 A
Y 346 I
70 N 374 E +
71 H 128 S -
72 L 120 C +
73 I 124 T -
74 P 218 R +
74 I 238 R
75 H 297 R +
T 301 A
76 F 146 N +
77 T 301 S +
78 H 128 M -
Y 346 I
79 F 146 N +
80 H 297 R +
T 301 D
81 L 120 G -
82 A 285 S -
T 284 M
83 C 290 I -
T 284 C
84 L 120 A -
85 C 231 I +
86 N 374 G +
87 I 150 R -
88 I 319 P +
89 S 147 A +
90 L 120 V +
91 H 128 N -
T 350 A
92 C 290 I +
T 350 A
93 H 297 R +
T 301 E
94 Q 303 K +
T 198 I
95 Y 9 F +
96 A 269 E +
H 297 R
97 D 27 E +
98 A 285 S -
T 198 I
99 I 319 E +
100 T 338 W -
101 G 342 A +
Y 346 I
102 A 285 S -
H 128 S
103 A 122 S -
H 128 N
104 F 313 Y +
Q 303 K
105 T 145 P -
106 G 138 D +
107 N 175 I +
108 P 218 R +
109 N 374 A +
110 S 147 A -
Y 346 L
111 V 144 C +
112 G 342 A -
S 147 A
Y 346 L
113 N 381 H ++
114 V 152 A -
Y 346 A
115 L 206 Q ++
C 231 I
116 P 224 R -
117 G 342 V -
Q 98 W
S 147 V
Y 346 I
118 Q 365 D +
119 A 122 S +
A 285 G
120 R 325 S +
121 I 150 D -
122 L 120 H -
123 A 285 S -
T 350 A
124 T 338 S +
125 T 338 D +
126 Q 315 Y -
127 C 231 L +
128 F 146 G +
129 D 27 N +
130 T 284 S -
Y 346 F
131 A 122 S +
Q 303 K
132 R 29 G +
133 S 336 A +
134 I 150 N -
135 A 122 S -
T 284 C
136 G 342 V -
S 147 V
137 I 335 R -
138 L 199 I ++
139 T 284 M -
Y 346 I -
140 H 297 N +
T 301 S
141 G 342 V -
Q 98 W
S 147 V
142 H 128 N -
T 198 I
143 T 284 L -
144 I 319 V +
145 G 138 D +
T 350 A
146 F 266 M +
147 A 41 K +
148 Q 329 H +
149 G 342 N -
150 P 218 A +
I 238 T
151 A 285 S -
C 290 I
152 I 73 V +
153 P 218 E +
I 238 T
154 P 218 K +
I 238 V
155 N 381 K +
156 F 146 P -
157 P 218 G +
158 A 285 S -
T 284 C
159 N 381 L +
160 F 100 A -
G 342 A
V 152 A
Y 346 I
161 F 100 A -
V 152 A
162 A 285 G +
Y 346 I
163 G 138 D +
164 G 287 A +
165 F 100 A -
S 147 A
166 C 30 S +
167 H 297 D +
168 F 146 Y +
169 G 138 D +
T 198 I
170 H 297 R +
171 N 175 V +
172 S 151 C +
173 G 123 A -
174 F 100 A -
V 152 A
Y 346 A
175 F 313 Y +
176 A 285 S -
T 284 S
177 T 284 I -
178 A 285 S -
Y 346 M
179 G 342 A -
V 152 A
180 V 267 F +
F 271 L
181 I 335 V +
182 S 147 C -
183 S 97 I +
184 P 218 H +
I 238 Q
185 F 100 A -
186 C 231 T +
187 T 338 V +
188 N 374 R +
189 Q 256 A +
190 P 218 K +
I 238 R
191 M 217 V +
192 P 218 R +
I 238 T
193 I 238 T +
194 T 121 R -
195 P 218 K +
196 Q 256 S +
197 G 342 Y -
198 F 100 A -
Y 346 A
199 A 122 S -
H 128 S
200 G 265 N +
E 291 D
201 H 128 S -
Y 346 F
202 S 147 A -
V 152 A
203 R 203 H -
204 F 313 Y +
G 138 D
205 R 29 E +
206 S 149 G -
207 F 146 A +
208 I 319 A +
209 P 218 K +
I 238 E
210 Q 98 S +
211 Q 256 H -
212 Q 98 W -
S 147 V
Y 346 I
213 T 284 S +
Y 346 I
214 G 342 T -
215 P 218 T +
216 L 206 Q ++
C 231 V
217 A 285 G -
H 128 S
218 C 231 E +
219 H 297 K +
T 301 S
220 A 122 S +
C 290 I
221 T 338 A +
222 C 290 I -
H 128 N
223 E 143 W -
S 147 L
224 P 218 H +
I 238 R
225 A 285 G +
Y 346 F
226 C 30 A +
227 Q 355 E +
228 I 319 K +
229 T 284 S +
230 C 30 R +
231 E 143 W -
Q 98 W
Y 346 I
232 H 297 R +
T 301 N
233 T 284 C +
Y 346 F
234 S 97 T +
235 G 342 V -
S 147 V
Y 346 I
236 I 124 A -
237 A 122 S -
H 128 M
238 C 290 I +
T 198 I
239 F 146 T +
240 E 143 W -
Y 346 I
241 G 342 A -
V 152 A
Y 346 I
242 T 284 V -
243 G 342 E -
244 I 124 V +
245 F 271 L +
246 V 144 S +
247 R 29 K +
248 C 290 I +
249 I 335 N +
250 V 19 K +
251 T 284 M -
Y 346 F
252 Q 98 W -
Y 346 I
253 F 146 D -
254 I 150 S -
255 V 152 A -
Y 346 L
256 C 30 H +
257 A 285 G -
H 128 N
258 F 16 Y +
259 L 120 I +
260 V 144 A +
261 G 53 A +
262 H 155 F +
263 S 339 L -
264 L 199 I ++
F 266 L
265 Q 256 T -
266 N 175 A +
267 F 313 Y +
T 350 A
268 L 206 Q ++
C 231 L
269 P 218 G +
269 I 238 T
270 S 336 G +
271 F 100 A -
V 152 A
Y 346 L
272 S 2 A ++
273 Y 346 I +
274 P 218 D +
I 238 T +
275 L 120 S -
276 V 152 A -
277 H 128 M -
T 284 M
278 Y 346 F +
279 F 146 S +
280 T 284 C +
Y 346 I
281 Q 256 V -
282 A 122 S -
T 350 A
283 H 128 S -
T 284 S
284 H 297 R +
T 301 S
285 G 342 V -
Y 346 I
286 G 342 S +
287 Q 264 E +
G 265 H
288 G 342 A -
V 152 A
Y 346 L
289 A 122 S -
T 284 M
290 Q 98 T ++
291 P 218 H +
I 238 V
292 V 267 F +
F 271 M
293 I 150 Q -
294 F 100 A -
Y 346 L
295 G 138 D +
Q 303 K
296 F 313 Y +
T 198 I
297 I 204 V +
298 R 29 N +
299 H 128 N -
300 R 29 D +
301 H 128 M -
T 284 S
302 I 335 T +
303 P 218 N +
304 A 262 S +
305 E 143 W -
306 E 143 Y -
306 Q 98 W
307 T 284 A +
308 R 29 A +
309 H 297 K +
310 P 218 S +
I 238 T
311 A 285 S -
312 Q 365 E +
313 E 143 W -
Q 98 W
314 S 151 T -
329 C 231 Y +
330 I 335 L +
331 I 150 E -
332 A 122 S +
333 G 342 V -
Q 98 W
Y 346 I
334 A 122 S -
Y 346 I
335 G 342 V -
336 L 199 V ++
F 266 M
337 E 143 W -
G 342 V
Q 98 W
338 H 297 D +
T 301 S
339 H 297 E +
T 301 S
340 F 196 V -
M 217 V
341 S 149 A -
342 F 146 H +
343 A 285 S -
Y 346 I
344 I 335 Y +
345 G 342 M -
346 S 339 G -
347 G 342 A -
S 147 A
V 152 A
348 H 128 M -
Y 346 F
349 D 27 A +
350 N 374 H +
351 G 342 R -
352 H 128 S -
T 284 M
353 Q 365 P +
354 A 285 S -
Y 346 F
355 E 143 W -
G 342 V
356 H 297 A +
T 301 S
357 T 284 S -
Y 346 M
358 P 218 K +
I 238 T
359 T 145 S +
360 H 128 N -
T 284 M
361 D 27 T +
362 L 120 F -
363 H 128 S -
Y 346 I
364 N 374 Q +
365 A 285 G -
Y 346 M
366 H 128 M -
T 284 C
367 Q 264 E +
G 265 N
368 H 128 M -
Y 346 M
369 Q 329 N +
370 A 382 S +
371 F 100 A -
G 342 A
Y 346 I
372 H 297 A +
373 Q 256 E -
374 I 150 V +
375 S 339 A -
376 H 128 S -
T 284 C
377 P 218 H +
I 238 E
378 E 143 Y -
379 T 198 I +
T 350 A
380 C 231 D +
381 F 146 V -
382 K 384 S +
383 G 342 V -
Q 98 W -
384 V 144 N -
385 N 175 T +
386 T 284 C -
T 350 A
387 Q 98 R -
388 Q 264 E +
389 V 144 T +
390 H 297 Q +
T 301 S
391 H 128 N -
Y 346 F
392 C 290 I +
G 138 D
393 W 101 F +
394 A 122 S -
Y 346 F
395 G 342 V -
S 147 L
396 P 218 Q +
397 L 199 V +
398 T 338 L -
399 G 265 H +
E 291 D
400 T 338 N +
402 L 120 Q -
403 G 342 A +
Y 346 L
404 G 342 C +
405 S 149 T -
406 G 342 D -
407 A 285 G +
T 284 S
408 P 218 H +
409 N 381 R +
410 F 271 M +
411 H 128 N -
Y 346 M
412 S 149 V -
413 R 29 T +
414 S 147 V -
Y 346 I -
415 N 374 K +
416 T 350 A +
417 A 122 S -
T 198 I
418 E 143 W -
Q 98 W
S 147 L
419 P 218 H +
I 238 T
420 A 285 G +
421 N 175 E +
422 F 100 A -
Y 346 I
423 I 150 L -
424 R 29 S +
425 A 153 T -
426 D 27 V +
"+" = 대조군 대비 활성 증가 배수 > 0.5 내지 1.5배
"++" = 대조군 대비 활성 증가 배수 >1.5배.
표 7: 칸디다 보이디니 야생형 대조군의 FDH와 비교한, 칸디다 보이디니 FDH (서열번호 2)를 주형으로 이용하여 조작한 FDH 예들의 상대적인 활성
변이체 # 잔기 위치 변이 활성
1 T 315 C +
Y 323 M
2 A 260 G +
A 91 S
3 Q 320 T +
T 315 S
4 H 361 R +
H 97 N
N 214 T
5 D 36 K +
H 361 R
I 162 L
S 111 T
6 A 257 G +
Y 312 V
7 A 257 G +
S 313 G
8 H 361 R ++
S 111 T
9 D 362 K +
N 214 T
10 A 260 G +
S 313 A
11 S 313 G +
T 315 S
12 A 91 S +
Y 312 F
13 H 361 R ++
I 162 L
14 D 362 K +
N 214 T
P 188 C
15 D 36 K +
I 162 L
S 111 T
16 A 229 T ++
A 260 G
17 H 361 R ++
N 214 T
18 T 256 C +
Y 312 T
19 I 162 L +
N 214 T
S 111 T
20 H 361 R +
H 97 N
21 D 362 K +
P 188 C
22 D 80 E +
I 162 L
23 A 229 T +
V 120 I
24 T 256 C +
Y 312 V
25 D 36 K ++
H 361 R
I 162 L
N 214 T
26 N 187 G +
S 111 T
27 D 80 E ++
H 361 R
28 I 64 V +
N 214 T
29 Q 320 S ++
V 120 I
30 I 64 V +
N 187 G
31 D 362 K +
I 162 L
S 111 T
32 D 36 K ++
H 361 R
33 I 162 L ++
S 111 T
34 D 36 K +
I 162 L
I 164 V
N 214 T
49 A 257 G +
A 260 G
50 A 257 S +
A 260 G
51 D 36 K +
I 162 L
I 64 V
52 D 362 K +
I 162 L
53 D 362 K +
I 162 L
I 64 V
54 D 36 K +
D 80 E
I 162 L
55 H 361 R ++
I 162 L
S 111 T
56 A 229 V +
A 91 S
57 D 362 K +
I 64 V
58 H 361 R ++
I 162 L
I 64 V
N 214 T
59 I 162 L +
I 64 V
60 D 36 K +
D 80 E
H 361 R
61 N 214 T +
S 111 T
62 A 229 C ++
T 315 C
63 D 362 K +
D 80 E
64 A 229 V +
Y 312 F
"+" = 대조군 대비 FDH 활성 증가 배수 > 0.5 내지 1.5배
"++" = 대조군 대비 FDH 활성 증가 배수 >1.5.
이들 결과를 토대로, 지브시엘라 퀘르시네칸스의 FDH (서열번호 1)에 기반한 변이체 113, 115, 138, 216, 264, 268, 272, 290 및 336, 그리고 칸디다 보이디니의 FDH (서열번호 2)에 기반한 변이체 8, 13, 16, 17, 25, 27, 29, 32, 33, 55, 58 및 62는 대응하는 대조군 FDH의 활성을 기준으로 활성 증가 수준이 가장 높은 것으로 식별 (예를 들어, 1.5배 초과 증가)된 반면, 다른 다수의 변이체들은 대조군에 비해 FDH 활성 증가가 경미하였다 (예를 들어, 0.5배 초과 내지 1.5배 증가).
상기에서 동정된 변이체들에 대해 추가적인 스크리닝을 수행하였으며, 지브시엘라 퀘르시네칸스의 FDH (서열번호 1) 및 칸디다 보이디니의 FDH (서열번호 2)의 상동체를 다양한 다른 유기체들에서 동정하고, 실시예 2 및 본 실시예에 언급된 동일한 분석으로 활성을 스크리닝하였다. 스크리닝 결과를 표 8에 나타낸다.
표 8: 포르메이트 데하이드로게나제 상동체
서열번호 유기체 활성 (서열번호 2 대비)
1 지브시엘라 퀘르시네칸스 ++
2 칸디다 보이디니 대조군 수준
3 칸디다 보이디니 ++
4 클로헤시노마이세스 아쿠아티쿠스 ++
5 클라비스포라 루시타니애 +
6 카발레로니아 우데이스 +
7 코시디오이데스 포사다시 RMSCC 3488 +
8 보트리오티니아 퍽켈리아나 +
9 야로이와 리폴리티카 +
10 쿠시네리아 아비세니애 +
11 지 메이스 +
12 닥틸렐리나 하프토틸라 +
13 세그닐리파루스 루고수스 +
14 아스퍼질러스 인돌로게누스 CBS 114.80 +
15 아스퍼질러스 인돌로게누스 +
16 액티니디아 치넨시스 var. 치넨시스 +
17 아스퍼질러스 가와치 +
18 칸디다투스 니트로소코스미쿠스 올레오필러스 +
19 블라스토마이세스 글리크리스티 -
20 파라버크홀데리아 카리벤시스 MBA4 -
21 메소리조비움 sp. -
22 헬리코카르푸스 그리세우스 UAMH5409 -
23 스트렙토마이세스 알비도플라부스 -
"-" = 활성이 거의 또는 전혀 없음
"+" = 대조군 대비 활성 증가 배수 > 0.5 내지 1.5배
"++" = 대조군 대비 활성 증가 배수 >1.5배.
이들 결과를 토대로, 지브시엘라 퀘르시네칸스의 FDH (서열번호 1), 칸디다 보이디니 FDH (서열번호 3) 및 클로헤시오마이세스 아쿠아티쿠스 FDH (서열번호 4)를 비롯하여, 다양한 FDH 상동체들이 칸디다 보이디니 FDH (서열번호 2)에 비해 활성이 1.5배 높은 것으로 동정되었다.
실시예 8
FDH 변이체를 발현하는 E. Coli 에서 1,3- BDO 생산 증가
생물 유래 생산물의 생산에 있어 실시예 1 - 7에서 구축 및 분석한 변이체 FDH들의 영향을 조사하기 위해, 선택 FDH를 암호화하는 유전자를, 다음과 같은 1,3-BOD 경로 효소들을 암호화하는 도입된 유전자를 또한 가진 E. coli 균주에, 형질전환하였다: 1) 티올라제 (Thl), 2) 3-하이드록시부트릴-CoA 데하이드로게나제 (Hbd), 3) 알데하이드 데하이드로게나제 (Ald), 및 4) 알코올 데하이드로게나제 (Adh). 3-하이드록시부트릴-CoA 데하이드로게나제는 NADH를 보조인자로 이용한다. 알데하이드 데하이드로게나제는 NADH 또는 NADPH를, 바람직하게는 NADH를 보조인자로 이용한다. 알코올 데하이드로게나제는 NADPH를 보조인자로 이용한다. 도입된 FDH로는 지브시엘라 퀘르시네칸스 FDH (서열번호 1), 칸디다 보이디니 FDH　(서열번호 2) 또는 실시예 6에서 야생형 FDH와 비교해 (즉, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 FDH에 비해) 활성이 1,5배보다 높은 것으로 동정된 FDH 변이체를 포함하였다.
변이체 FDH 유전자를 발현하기 위한 벡터를 Thl/Hbd/Ald/Adh E. coli 균주에 형질전환하고, 형질전환체를 1,3-BDO 생산에 대해 검사하였다. 조작된 E. coli 세포에 2% 글루코스를 최소 배지 중에 공급하고, 35℃에서 18시간 배양한 후 세포를 회수한 다음 상층액을 분석용 HPLC 또는 표준 LC/MS 분석 방법으로 1,3-BOC 생산을 평가하였다.
변이체를 이용한 경우 그 결과를 표 9에 나타낸다.
표 9: 주형으로 지브시엘라 퀘르시네칸스 FDH (서열번호 1)를 기반으로 조작한 예시적인 FDH를 이용한 1,3-BDO 생산.
변이체 # 잔기 위치 변이 생체내 1,3-BDO 생산
113 N 381 H +
115 L 206 Q +
C 231 I
138 L 199 I +
216 L 206 Q +
C 231 V
264 L 199 I +
F 266 L
268 L 206 Q +
C 231 L
272 S 2 A +
290 Q 98 T +
336 L 199 V +
F 266 M
"+" = 1,3-BDO 생산 검출.
지브시엘라 퀘르시네칸스 FDH (서열번호 1) 및 칸디다 보이디니 FDH (서열번호 2) 둘다 1,3-BDO를 생산하는 것으로 나타났다. 또한, 검사한 변이체들 모두 1,3-BDO를 생산하는 것을 나타났다. 이들 결과는, 조작된 FDH의 활성을 통한 이산화탄소에의 변환으로 NADH 생산 및/또는 포르메이트 제거가 1,3-BDO와 같은 생물 유래 생산물을 생산하는 데 이용할 수 있음을 보여준다.
본 출원 전체에 다양한 간행물들이 언급되어 있다. 이들 간행물의 내용은 그 전체가 본 발명이 속하는 기술 상태를 보다 충분히 기술하기 위해 본 출원에 원용에 의해 포함된다. 본 발명이 상기 제공된 예를 들어 기술되었지만, 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형들이 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
전술한 주제에서 본 발명의 범위 및 사상으로부터 이탈하지 않으면서 다양한 변화들이 행해질 수 있으므로, 전술한 설명에 포함되거나 또는 첨부된 청구범위에서 정의된 모든 주제는 본 발명에 대한 설명 및 예시로서 해석되는 것으로 의도된다. 본 발명에 대한 다수의 수정 및 변형이 전술한 교시 내용에 비추어 가능하다. 이에, 본 발명의 내용은 첨부된 청구범위에 속하는 모든 이러한 대안, 수정 및 변동을 망라하는 것으로 의도된다.

Claims (58)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 변이체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제로서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 표 6 및/또는 표 7에 언급된 위치에 하나 이상의 변이를 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가
    a) 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 촉매할 수 있거나;
    b) NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있거나; 또는
    c) 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환 및 NAD+에서 NADH로의 변환을 촉매할 수 있는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 포르메이트 데하이드로게나제의 활성에 비해 적어도 0.5, 적어도 1, 적어도 1.5 또는 적어도 2배 더 높은 활성을 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 서열번호 1의 위치 2, 9, 16, 19, 27, 29, 30, 41, 53, 73, 97, 98, 100, 101, 120, 121, 122, 123, 124, 128, 138, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 155, 175, 176, 191, 196, 198, 199, 203, 204, 206, 217, 218, 224, 231, 238, 256, 262, 264, 265, 266, 267, 269, 271, 284, 285, 287, 290, 291, 297, 301, 303, 313, 315, 319, 325, 329, 335, 336, 338, 339, 342, 343, 346, 350, 355, 365, 374, 381, 382 또는 384, 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 서열번호 1의 위치 2, 9, 16, 19, 27, 29, 30, 41, 53, 73, 97, 98, 101, 120, 122, 124, 138, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 155, 175, 176, 191, 198, 199, 204, 206, 217, 218, 231, 238, 256, 262, 264, 265, 266, 267, 269, 271, 284, 285, 287, 290, 291, 297, 301, 303, 313, 319, 325, 329, 335, 336, 338, 339, 342, 346, 350, 355, 365, 374, 381, 382 또는 384, 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 서열번호 1의 위치 2, 98, 199, 206, 231, 266 또는 381, 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 서열번호 1의 위치 9, 16, 19, 27, 29, 30, 41, 53, 73, 97, 98, 101, 120, 122, 124, 138, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 155, 175, 176, 191, 198, 199, 204, 217, 218, 231, 238, 256, 262, 264, 265, 266, 267, 269, 271, 284, 285, 287, 290, 291, 297, 301, 303, 313, 319, 325, 329, 335, 336, 338, 339, 342, 346, 350, 355, 365, 374, 381, 382 또는 384, 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 서열번호 2의 위치 36, 64, 80, 91, 97, 111, 120, 162, 164, 187, 188, 214, 229, 256, 257, 260, 312, 313, 315, 320, 323, 361 또는 362, 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 서열번호 2의 위치 36, 64, 80, 111, 120, 162, 214, 229, 260, 315, 320 또는 361, 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 보존적인 아미노산 치환인, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 비-보존적인 아미노산 치환인, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 하나 이상의 변이가 표 6에 언급된 변이인, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    b) 서열번호 1의 9번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    c) 서열번호 1의 16번 위치에 해당하는 잔기에 Y;
    d) 서열번호 1의 19번 위치에 해당하는 잔기에 K 또는 S;
    e) 서열번호 1의 27번 위치에 해당하는 잔기에 K, E, N, A, T 또는 V;
    f) 서열번호 1의 29번 위치에 해당하는 잔기에 G, E, K, N, D, A, T 또는 S;
    g) 서열번호 1의 30번 위치에 해당하는 잔기에 G, S, A, R 또는 H;
    h) 서열번호 1의 41번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    i) 서열번호 1의 53번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    j) 서열번호 1의 73번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    k) 서열번호 1의 97번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 T;
    l) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 W, S, T 또는 R;
    m) 서열번호 1의 100번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    n) 서열번호 1의 101번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    o) 서열번호 1의 120번 위치에 해당하는 잔기에 C, G, A, V, H, I, S, F 또는 Q;
    p) 서열번호 1의 121번 위치에 해당하는 잔기에 R;
    q) 서열번호 1의 122번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    r) 서열번호 1의 123번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    s) 서열번호 1의 124번 위치에 해당하는 잔기에 T, A, V;
    t) 서열번호 1의 128번 위치에 해당하는 잔기에 N, M 또는 S;
    u) 서열번호 1의 138번 위치에 해당하는 잔기에 D;
    v) 서열번호 1의 143번 위치에 해당하는 잔기에 W 또는 Y;
    w) 서열번호 1의 144번 위치에 해당하는 잔기에 I, C, S, A, N 또는 T;
    x) 서열번호 1의 145번 위치에 해당하는 잔기에 P 또는 S;
    y) 서열번호 1의 146번 위치에 해당하는 잔기에 Q, N, G, P, Y, A, T, D, S, H 또는 V;
    z) 서열번호 1의 147번 위치에 해당하는 잔기에 A, L, V 또는 C;
    aa) 서열번호 1의 149번 위치에 해당하는 잔기에 G, A, T 또는 V;
    bb) 서열번호 1의 150번 위치에 해당하는 잔기에 T, G, R, D, N, S, Q, E, V 또는 L;
    cc) 서열번호 1의 151번 위치에 해당하는 잔기에 A, C 또는 T;
    dd) 서열번호 1의 152번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    ee) 서열번호 1의 153번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    ff) 서열번호 1의 155번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    gg) 서열번호 1의 175번 위치에 해당하는 잔기에 R, I, V, A, T 또는 E;
    hh) 서열번호 1의 176번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    ii) 서열번호 1의 191번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    jj) 서열번호 1의 196번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    kk) 서열번호 1의 198번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    ll) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V;
    mm) 서열번호 1의 203번 위치에 해당하는 잔기에 H;
    nn) 서열번호 1의 204번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    oo) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q;
    pp) 서열번호 1의 217번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    qq) 서열번호 1의 218번 위치에 해당하는 잔기에 T, N, R, A, E, K, G, H, R, D, S 또는 Q;
    rr) 서열번호 1의 224번 위치에 해당하는 잔기에 R;
    ss) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 D, A, K, R, V, I, L, T, Y 또는 E;
    tt) 서열번호 1의 238번 위치에 해당하는 잔기에 T, R, V, Q 또는 E;
    uu) 서열번호 1의 256번 위치에 해당하는 잔기에 I, C, L, A, S, H, T, V 또는 E;
    vv) 서열번호 1의 262번 위치에 해당하는 잔기에 E 또는 S;
    ww) 서열번호 1의 264번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    xx) 서열번호 1의 265번 위치에 해당하는 잔기에 N 또는 H;
    yy) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L;
    zz) 서열번호 1의 267번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    aaa) 서열번호 1의 269번 위치에 해당하는 잔기에 D 또는 E;
    bbb) 서열번호 1의 271번 위치에 해당하는 잔기에 L 또는 M;
    ccc) 서열번호 1의 284번 위치에 해당하는 잔기에 S, C, M, L, I, V 또는 A;
    ddd) 서열번호 1의 285번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 G;
    eee) 서열번호 1의 287번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    fff) 서열번호 1의 290번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    ggg) 서열번호 1의 291번 위치에 해당하는 잔기에 D;
    hhh) 서열번호 1의 297번 위치에 해당하는 잔기에 R, V, G, N, D, K, E, A 또는 Q;
    iii) 서열번호 1의 301번 위치에 해당하는 잔기에 S, A, D, E 또는 N;
    jjj) 서열번호 1의 303번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    kkk) 서열번호 1의 313번 위치에 해당하는 잔기에 Y;
    lll) 서열번호 1의 315번 위치에 해당하는 잔기에 E 또는 Y;
    mmm) 서열번호 1의 319번 위치에 해당하는 잔기에 R, P, E, V, A 또는 K;
    nnn) 서열번호 1의 325번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S;
    ooo) 서열번호 1의 329번 위치에 해당하는 잔기에 H 또는 N;
    ppp) 서열번호 1의 335번 위치에 해당하는 잔기에 M, R, V, N, T, L, S 또는 Y;
    qqq) 서열번호 1의 336번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 G;
    rrr) 서열번호 1의 338번 위치에 해당하는 잔기에 Y, F, W, S, D, V, A, L 또는 N;
    sss) 서열번호 1의 339번 위치에 해당하는 잔기에 T, L, G, 또는 A;
    ttt) 서열번호 1의 342번 위치에 해당하는 잔기에 K, L, A, V, I, N, Y, T, E, S, M, R, C 또는 D;
    uuu) 서열번호 1의 343번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    vvv) 서열번호 1의 346번 위치에 해당하는 잔기에 A, M, I, L 또는 F;
    www) 서열번호 1의 350번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    xxx) 서열번호 1의 355번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    yyy) 서열번호 1의 365번 위치에 해당하는 잔기에 D, E 또는 P;
    zzz) 서열번호 1의 374번 위치에 해당하는 잔기에 E, G, A, R, H, Q 또는 K;
    aaaa) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 H, K, L, P 또는 R;
    bbbb) 서열번호 1의 382번 위치에 해당하는 잔기에 S; 및/또는
    cccc) 서열번호 1의 384번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 T.
  15. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    b) 서열번호 1의 9번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    c) 서열번호 1의 16번 위치에 해당하는 잔기에 Y;
    d) 서열번호 1의 19번 위치에 해당하는 잔기에 K 또는 S;
    e) 서열번호 1의 27번 위치에 해당하는 잔기에 K, E, N, A, T 또는 V;
    f) 서열번호 1의 29번 위치에 해당하는 잔기에 G, E, K, N, D, A, T 또는 S;
    g) 서열번호 1의 30번 위치에 해당하는 잔기에 G, S, A, R 또는 H;
    h) 서열번호 1의 41번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    i) 서열번호 1의 53번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    j) 서열번호 1의 73번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    k) 서열번호 1의 97번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 T;
    l) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 W, R 또는 T;
    m) 서열번호 1의 101번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    n) 서열번호 1의 120번 위치에 해당하는 잔기에 G, A, H, S, F, Q, C, V 또는 I;
    o) 서열번호 1의 122번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    p) 서열번호 1의 124번 위치에 해당하는 잔기에 T, A 또는 V;
    q) 서열번호 1의 138번 위치에 해당하는 잔기에 D;
    r) 서열번호 1의 144번 위치에 해당하는 잔기에 N, I, C, S, A 또는 T;
    s) 서열번호 1의 145번 위치에 해당하는 잔기에 P 또는 S;
    t) 서열번호 1의 146번 위치에 해당하는 잔기에 P, D, V, Q, N, G, Y, A, T, S 또는 H;
    u) 서열번호 1의 147번 위치에 해당하는 잔기에 V, L, C 또는 A;
    v) 서열번호 1의 150번 위치에 해당하는 잔기에 G, R, D, N, S, Q, E, L, T 또는 V;
    w) 서열번호 1의 151번 위치에 해당하는 잔기에 T, A 또는 C;
    x) 서열번호 1의 155번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    y) 서열번호 1의 175번 위치에 해당하는 잔기에 R, I, V, A, T 또는 E;
    z) 서열번호 1의 176번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    aa) 서열번호 1의 191번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    bb) 서열번호 1의 198번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    cc) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V;
    dd) 서열번호 1의 204번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    ee) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q;
    ff) 서열번호 1의 217번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    gg) 서열번호 1의 218번 위치에 해당하는 잔기에 T, N, R, A, E, K, G, H, D, S 또는 Q;
    hh) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 D, A, K, R, V, I, L, T, Y 또는 E;
    ii) 서열번호 1의 238번 위치에 해당하는 잔기에 T, R, V, Q 또는 E;
    jj) 서열번호 1의 256번 위치에 해당하는 잔기에 I, C, L, H, T, V, E, A 또는 S;
    kk) 서열번호 1의 262번 위치에 해당하는 잔기에 E 또는 S;
    ll) 서열번호 1의 264번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    mm) 서열번호 1의 265번 위치에 해당하는 잔기에 N 또는 H;
    nn) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L;
    oo) 서열번호 1의 267번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    pp) 서열번호 1의 269번 위치에 해당하는 잔기에 D 또는 E;
    qq) 서열번호 1의 271번 위치에 해당하는 잔기에 L 또는 M;
    rr) 서열번호 1의 284번 위치에 해당하는 잔기에 L, I, V, S, C, M 또는 A;
    ss) 서열번호 1의 285번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 G;
    tt) 서열번호 1의 287번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    uu) 서열번호 1의 290번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    vv) 서열번호 1의 291번 위치에 해당하는 잔기에 D;
    ww) 서열번호 1의 297번 위치에 해당하는 잔기에 R, V, G, N, D, K, E, A 또는 Q;
    xx) 서열번호 1의 301번 위치에 해당하는 잔기에 S, A, D, E 또는 N;
    yy) 서열번호 1의 303번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    zz) 서열번호 1의 313번 위치에 해당하는 잔기에 Y;
    aaa) 서열번호 1의 319번 위치에 해당하는 잔기에 R, P, E, V, A 또는 K;
    bbb) 서열번호 1의 325번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S;
    ccc) 서열번호 1의 329번 위치에 해당하는 잔기에 H 또는 N;
    ddd) 서열번호 1의 335번 위치에 해당하는 잔기에 R, S, A, M, V, N, T, L 또는 Y;
    eee) 서열번호 1의 336번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 G;
    fff) 서열번호 1의 338번 위치에 해당하는 잔기에 Y, F, W, L, S, D, V, A 또는 N;
    ggg) 서열번호 1의 339번 위치에 해당하는 잔기에 L, G, A, T;
    hhh) 서열번호 1의 342번 위치에 해당하는 잔기에 K, L, V, I, N, Y, T, E, M, R, D, A, S 또는 C;
    iii) 서열번호 1의 346번 위치에 해당하는 잔기에 M, A, I, L 또는 F;
    jjj) 서열번호 1의 350번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    kkk) 서열번호 1의 355번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    lll) 서열번호 1의 365번 위치에 해당하는 잔기에 D, E 또는 P;
    mmm) 서열번호 1의 374번 위치에 해당하는 잔기에 E, G, A, R, H, Q 또는 K;
    nnn) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 P, H, K, L 또는 R;
    ooo) 서열번호 1의 382번 위치에 해당하는 잔기에 S; 및/또는
    ppp) 서열번호 1의 384번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 T.
  16. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    b) 서열번호 1의 9번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    c) 서열번호 1의 16번 위치에 해당하는 잔기에 Y;
    d) 서열번호 1의 19번 위치에 해당하는 잔기에 K 또는 S;
    e) 서열번호 1의 27번 위치에 해당하는 잔기에 K, E, N, A, T 또는 V;
    f) 서열번호 1의 29번 위치에 해당하는 잔기에 G, E, K, N, D, A, T 또는 S;
    g) 서열번호 1의 30번 위치에 해당하는 잔기에 G, S, A, R 또는 H;
    h) 서열번호 1의 41번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    i) 서열번호 1의 53번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    j) 서열번호 1의 73번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    k) 서열번호 1의 97번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 T;
    l) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 T;
    m) 서열번호 1의 101번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    n) 서열번호 1의 120번 위치에 해당하는 잔기에 C, V 또는 I;
    o) 서열번호 1의 122번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    p) 서열번호 1의 124번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    q) 서열번호 1의 138번 위치에 해당하는 잔기에 D;
    r) 서열번호 1의 144번 위치에 해당하는 잔기에 I, C, S, A 또는 T;
    s) 서열번호 1의 145번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    t) 서열번호 1의 146번 위치에 해당하는 잔기에 Q, N, G, Y, A, T, S 또는 H;
    u) 서열번호 1의 147번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    v) 서열번호 1의 150번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 V;
    w) 서열번호 1의 151번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 C;
    x) 서열번호 1의 155번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    y) 서열번호 1의 175번 위치에 해당하는 잔기에 R, I, V, A, T 또는 E;
    z) 서열번호 1의 176번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    aa) 서열번호 1의 191번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    bb) 서열번호 1의 198번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    cc) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V;
    dd) 서열번호 1의 204번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    ee) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q;
    ff) 서열번호 1의 217번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    gg) 서열번호 1의 218번 위치에 해당하는 잔기에 T, N, R, A, E, K, G, H, D, S 또는 Q;
    hh) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 D, A, K, R, V, I, L, T, Y 또는 E;
    ii) 서열번호 1의 238번 위치에 해당하는 잔기에 T, R, V, Q, 또는 E;
    jj) 서열번호 1의 256번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 S;
    kk) 서열번호 1의 262번 위치에 해당하는 잔기에 E 또는 S;
    ll) 서열번호 1의 264번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    mm) 서열번호 1의 265번 위치에 해당하는 잔기에 N 또는 H;
    nn) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L;
    oo) 서열번호 1의 267번 위치에 해당하는 잔기에 F;
    pp) 서열번호 1의 269번 위치에 해당하는 잔기에 D 또는 E;
    qq) 서열번호 1의 271번 위치에 해당하는 잔기에 L 또는 M;
    rr) 서열번호 1의 284번 위치에 해당하는 잔기에 S, C, M, 또는 A;
    ss) 서열번호 1의 285번 위치에 해당하는 잔기에 G;
    tt) 서열번호 1의 287번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    uu) 서열번호 1의 290번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    vv) 서열번호 1의 291번 위치에 해당하는 잔기에 D;
    ww) 서열번호 1의 297번 위치에 해당하는 잔기에 R, V, G, N, D, K, E, A 또는 Q;
    xx) 서열번호 1의 301번 위치에 해당하는 잔기에 S, A, D, E, 또는 N;
    yy) 서열번호 1의 303번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    zz) 서열번호 1의 313번 위치에 해당하는 잔기에 Y;
    aaa) 서열번호 1의 319번 위치에 해당하는 잔기에 R, P, E, V, A 또는 K;
    bbb) 서열번호 1의 325번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S;
    ccc) 서열번호 1의 329번 위치에 해당하는 잔기에 H 또는 N;
    ddd) 서열번호 1의 335번 위치에 해당하는 잔기에 S, A, M, V, N, T, L 또는 Y;
    eee) 서열번호 1의 336번 위치에 해당하는 잔기에 A 또는 G;
    fff) 서열번호 1의 338번 위치에 해당하는 잔기에 S, D, V, A 또는 N;
    ggg) 서열번호 1의 339번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    hhh) 서열번호 1의 342번 위치에 해당하는 잔기에 A, S 또는 C;
    iii) 서열번호 1의 346번 위치에 해당하는 잔기에 I, L, 또는 F;
    jjj) 서열번호 1의 350번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    kkk) 서열번호 1의 355번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    lll) 서열번호 1의 365번 위치에 해당하는 잔기에 D, E 또는 P;
    mmm) 서열번호 1의 374번 위치에 해당하는 잔기에 E, G, A, R, H, Q 또는 K;
    nnn) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 H, K, L 또는 R;
    ooo) 서열번호 1의 382번 위치에 해당하는 잔기에 S; 및/또는
    ppp) 서열번호 1의 384번 위치에 해당하는 잔기에 S 또는 T.
  17. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    b) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    c) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V;
    d) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q;
    e) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 A, K, R, T, E, Y, V, I 또는 L;
    f) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L; 및/또는
    g) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 P, K, L, R 또는 H.
  18. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    b) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    c) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 또는 V;
    d) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q;
    e) 서열번호 1의 231번 위치에 해당하는 잔기에 V, I 또는 L;
    f) 서열번호 1의 266번 위치에 해당하는 잔기에 M 또는 L; 및/또는
    g) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 H.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 하나 이상의 변이가 표 7에 언급된 변이인, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  20. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    b) 서열번호 2의 64번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    c) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    d) 서열번호 2의 91번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    e) 서열번호 2의 97번 위치에 해당하는 잔기에 N;
    f) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    g) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    h) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    i) 서열번호 2의 164번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    j) 서열번호 2의 187번 위치에 해당하는 잔기에 G;
    k) 서열번호 2의 188번 위치에 해당하는 잔기에 C;
    l) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    m) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 V, T 또는 C;
    n) 서열번호 2의 256번 위치에 해당하는 잔기에 C;
    o) 서열번호 2의 257번 위치에 해당하는 잔기에 G 또는 S;
    p) 서열번호 2의 260번 위치에 해당하는 잔기에 G;
    q) 서열번호 2의 312번 위치에 해당하는 잔기에 V, F, 또는 T;
    r) 서열번호 2의 313번 위치에 해당하는 잔기에 G 또는 A;
    s) 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C 또는 S;
    t) 서열번호 2의 320번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S;
    u) 서열번호 2의 323번 위치에 해당하는 잔기에 M;
    v) 서열번호 2의 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; 및/또는
    w) 서열번호 2의 362번 위치에 해당하는 잔기에 K.
  21. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    b) 서열번호 2의 64번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    c) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    d) 서열번호 2의 91번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    e) 서열번호 2의 97번 위치에 해당하는 잔기에 N;
    f) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    g) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    h) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    i) 서열번호 2의 164번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    j) 서열번호 2의 187번 위치에 해당하는 잔기에 G;
    k) 서열번호 2의 188번 위치에 해당하는 잔기에 C;
    l) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    m) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 C;
    n) 서열번호 2의 256번 위치에 해당하는 잔기에 C;
    o) 서열번호 2의 257번 위치에 해당하는 잔기에 G 또는 S;
    p) 서열번호 2의 260번 위치에 해당하는 잔기에 G;
    q) 서열번호 2의 312번 위치에 해당하는 잔기에 V, F, 또는 T;
    r) 서열번호 2의 313번 위치에 해당하는 잔기에 G 또는 A;
    s) 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C;
    t) 서열번호 2의 320번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    u) 서열번호 2의 323번 위치에 해당하는 잔기에 M;
    v) 서열번호 2의 361번 위치에 해당하는 잔기에 R; 및/또는
    w) 서열번호 2의 362번 위치에 해당하는 잔기에 K.
  22. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    b) 서열번호 2의 64번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    c) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    d) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    e) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    f) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    g) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    h) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 V, T 또는 C;
    i) 서열번호 2의 260번 위치에 해당하는 잔기에 G;
    j) 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C 또는 S;
    k) 서열번호 2의 320번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 S; 및/또는
    l) 서열번호 2의 361번 위치에 해당하는 잔기에 R.
  23. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K;
    b) 서열번호 2의 64번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    c) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E;
    d) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    e) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    f) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    g) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    h) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 T 또는 C;
    i) 서열번호 2의 260번 위치에 해당하는 잔기에 G;
    j) 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C;
    k) 서열번호 2의 320번 위치에 해당하는 잔기에 S; 및/또는
    l) 서열번호 2의 361번 위치에 해당하는 잔기에 R.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 변이를 적어도 1, 2, 3 또는 4개 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  25. 제24항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 변이가 다음을 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 생성하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제:
    a) 서열번호 1의 381번 위치에 해당하는 잔기에 H;
    b) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q 및 231번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    c) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I;
    d) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q 및 231번 위치에 해당하는 잔기에 V;
    e) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 I 및 266번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    f) 서열번호 1의 206번 위치에 해당하는 잔기에 Q 및 231번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    g) 서열번호 1의 2번 위치에 해당하는 잔기에 A;
    h) 서열번호 1의 98번 위치에 해당하는 잔기에 T;
    i) 서열번호 1의 199번 위치에 해당하는 잔기에 V 및 266번 위치에 해당하는 잔기에 M;
    j) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R;
    k) 서열번호 2의 162번 위치에 해당하는 잔기에 L 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R;
    l) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 T 및 260번 위치에 해당하는 잔기에 G;
    m) 서열번호 2의 214번 위치에 해당하는 잔기에 T 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R;
    n) 서열번호 2의 36, 162, 214 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 각각 K, L, T 및 R;
    o) 서열번호 2의 80번 위치에 해당하는 잔기에 E 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R;
    p) 서열번호 2의 120번 위치에 해당하는 잔기에 I 및 320번 위치에 해당하는 잔기에 S;
    q) 서열번호 2의 36번 위치에 해당하는 잔기에 K 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 R;
    r) 서열번호 2의 111번 위치에 해당하는 잔기에 T 및 162번 위치에 해당하는 잔기에 L;
    s) 서열번호 2의 111, 162 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 각각 T, L 및 R;
    t) 서열번호 2의 64, 162, 214 및 361번 위치에 해당하는 잔기에 각각 V, L, T 및 R; 또는
    u) 서열번호 2의 229번 위치에 해당하는 잔기에 C 및 서열번호 2의 315번 위치에 해당하는 잔기에 C.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제의 아미노산 서열이 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성되지 않는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  27. 서열번호 3-24 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제로서, 상기 조작된 포르메이트 데하이드로게나제가 표 6 및/또는 표 7에 에 언급된 위치에 해당하는 위치에 하나 이상의 변이를 포함하는, 조작된 포르메이트 데하이드로게나제.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산.
  29. 제28항에 있어서, 상기 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결된 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
  30. 제28항 또는 제29항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  31. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항으로부터 선택되는 조작된 포르메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 재조합 핵산을 포함하는 비-자연 발생 미생물 유기체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 비-자연 발생 미생물 유기체가 생물 유래 화합물을 생산할 수 있는 경로를 더 포함하고, 상기 경로의 효소 하나 이상이 이의 효소 반응을 촉매하는 데 NADH 또는 NADPH를 보조인자로 이용하는, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 경로의 하나 이상의 효소가 외인성 핵산에 의해 암호화된, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 외인성 핵산이 이종적인, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 외인성 핵산이 상동적인, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 유래 화합물이 알코올, 글리콜, 유기 산, 알켄, 다이엔, 유기 아민, 유기 알데하이드, 비타민, 뉴트라수티컬 또는 의약제인, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  37. 제36항에 있어서, 상기 알코올이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-자연 발생 미생물 유기체:
    a) C3 내지 C10 탄소 원자를 포함하는 1차 알코올, 2차 알코올, 다이올 또는 트리올인, 생물 연료 알코올;
    b) n-프로판올 또는 이소프로판올; 및
    c) C4 내지 C27 탄소 원자, C8 내지 C18 탄소 원자, C12 내지 C18 탄소 원자 또는 C12 내지 C14 탄소 원자를 포함하는, 지방 알코올.
  38. 제37항에 있어서, 상기 생물 연료 알코올이 1-프로판올, 이소프로판올, 1-부탄올, 이소부탄올, 1-펜탄올, 이소펜테놀, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-헥사놀, 3-메틸-1-펜탄올, 1-헵타놀, 4-메틸-1-헥사놀 및 5-메틸-1-헥사놀인, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  39. 제37항에 있어서, 상기 다이올이 프로판다이올 또는 부탄다이올인, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  40. 제39항에 있어서, 상기 부탄다이올이 1,4-부탄다이올, 1,3-부탄다이올 또는 2,3-부탄다이올인, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  41. 제39항에 있어서, 상기 부탄다이올이 1,3-부탄다이올인, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  42. 제32항에 있어서, 상기 생물 유래 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-자연 발생 미생물 유기체:
    a) 1,4-부탄다이올 또는 이의 중간산물, 상기 중간산물은 선택적으로 4-하이드록시부탄산 (4-HB)임;
    b) 부타다이엔 (1,3-부타다이엔) 또는 이의 중간산물, 상기 중간산물은 선택적으로 1,4-부탄다이올, 1,3-부탄다이올, 2,3-부탄다이올, 크로틸알코올, 3-부텐-2-올 (메틸 비닐 카르비놀) 또는 3-부텐-1-올임;
    c) 1,3-부탄다이올 또는 이의 중간산물, 상기 중간산물은 선택적으로 3-하이드록시부티레이트 (3-HB), 2,4-펜타다이에노에이트, 크로틸알코올 또는 3-부텐-1-올임;
    d) 아디페이트, 6-아미노카프로산, 카프로락탐, 헥사메틸렌다이아민, 레불린산 또는 이의 중간산물, 상기 중간산물은 선택적으로 아디필-CoA 또는 4-아미노부티릴-CoA임;
    e) 메타크릴산 또는 이의 에스테르, 3-하이드록시이소부티레이트, 2-하이드록시이소부티레이트, 또는 이의 중간산물, 상기 에스테르는 선택적으로 메틸 메타크릴레이트 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트)임;
    f) 1,2-프로판다이올 (프로필렌 글리콜), 1,3-프로판다이올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 다이에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 비스페놀 A 또는 이의 중간산물;
    g) 숙신산 또는 이의 중간산물; 및
    h) C4 내지 C27 탄소 원자, C8 내지 C18 탄소 원자, C12 내지 C18 탄소 원자 또는 C12 내지 C14 탄소 원자를 포함하는 지방 알코올, 지방 알데하이드 또는 지방산, 상기 지방 알코올은 선택적으로 도데카놀 (C12; 라우릴 알코올), 트리데실 알코올 (C13; 1-트리데카놀, 트리데카놀, 이소트리데카놀), 미리스틸 알코올 (C14; 1-테트라데카놀), 펜타데실 알코올 (C15; 1-펜타데카놀, 펜타데카놀), 세틸 알코올 (C16; 1-헥사데카놀), 헵타데실 알코올 (C17; 1-n-헵타데카놀, 헵타데카놀) 및 스테아릴 알코올 (C18; 1-옥타데카놀) 또는 팔미트올레일 알코올 (C16 불포화; cis-9-헥사데센-1-올)임.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-자연 발생 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성 배양 배지에 존재하는, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 유기체가 박테리아, 효모 또는 진균 종인, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-자연 발생 미생물 유기체가 제25항 또는 제26항의 핵산을 포함하지 않는 대조군 미생물 유기체와 비교해 NADH 또는 생물 유래 화합물을 적어도 10% 더 많이 생산할 수 있는, 비-자연 발생 미생물 유기체.
  46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 미생물 유기체를 생물 유래 화합물을 생산하기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함하는, 생물 유래 화합물의 생산 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 방법이 배양물의 다른 성분으로부터 상기 생물 유래 화합물을 분리하는 것을 더 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 분리가 추출, 연속적인 액체-액체 추출, 투과증발, 막 여과, 막 분리, 역 삼투압, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 또는 한외여과를 포함하는, 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 생물 유래 화합물을 포함하는 배양물 배지로서, 상기 생물 유래 화합물이 대기 이산화탄소 흡수원 (atmospheric carbon dioxide uptake source)임을 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 동위원소 비율을 가진, 방법.
  50. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 생물 유래 화합물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 생물 유래 화합물이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 Fm 값을 가진, 생물 유래 화합물.
  52. 제50항 또는 제51항의 생물 유래 화합물 및 상기 생물 유래 화합물 이외의 다른 화합물을 포함하는 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 생물 유래 화합물 이외의 다른 화합물이 생물 유래 화합물 경로를 가진 비-자연 발생 미생물 유기체의 미량의 세포성 분획인, 조성물.
  54. 제50항 또는 제51항의 생물 유래 화합물 또는 이의 세포용해물 또는 배양물 상층액을 포함하는 조성물.
  55. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 비-자연 발생 미생물 유기체를 NADH의 이용가능성을 높이기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함하는, 비-자연 발생 미생물 유기체에서 NADH 이용가능성을 높이는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 NADH 이용가능성의 증가가 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 증가를 달성하는, 방법.
  57. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 비-자연 발생 미생물 유기체를 포르메이트에서 이산화탄소로의 변환을 높이기 위한 조건 하에 충분한 기간 동안 배양하는 것을 포함하는, 비-자연 발생 미생물 유기체에서 포르메이트 농도를 감소시키는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 비-자연 발생 미생물 유기체에서 포르메이트의 농도 감소는 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 기술된 생물 유래 화합물의 생산 방법에서 불순물로서 포르메이트의 감소를 달성하는, 방법.
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