CN117980472A - 甲酸脱氢酶变体和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了工程化甲酸脱氢酶的多肽和编码核酸。本公开还提供了表达工程化甲酸脱氢酶的细胞。本公开还提供了生产生物衍生化合物的方法,其包括培养表达工程化甲酸脱氢酶的细胞,其中所述工程化甲酸脱氢酶能够催化转化。
Description
相关申请的交叉引用
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技术领域
本公开大体上涉及甲酸脱氢酶(FDH)变体和使用此类变体的方法,更具体地涉及由重组核酸编码的甲酸脱氢酶变体,所述重组核酸已被引入非天然存在的微生物生物体中以增强NADH的生产,从而增加生物衍生化合物(例如1,3-丁二醇)的生产。
背景技术
1,3-丁二醇(1,3-BDO;也称为1,3-丁二醇、1,3-BG、丁二醇、BG)是传统上由乙炔通过其水合产生的四个碳的二醇。所得乙醛而后被转化为3-羟基丁醛,其随后被还原以形成1,3-BDO。最近,乙炔已被更便宜的乙烯取代,以作为乙醛的来源。1,3-BDO通常用作食品调味剂的有机溶剂。它还用作聚氨酯和聚酯树脂的共聚单体,并被广泛用作降血糖剂。光学活性1,3-BDO是可用于合成生物活性化合物和液晶的起始材料。1,3-BDO的另一个用途是其经脱水提供1,3-丁二烯(Ichikawa等人,Journal of Molecular Catalysis A-Chemical256:106-112(2006);Ichikawa等人,Journal of Molecular Catalysis A-Chemical 231:181-189(2005)),其可用于制造合成橡胶(例如轮胎)、乳胶和树脂。乙炔或乙烯对石油基原料的依赖保证了对基于可再生原料生产1,3-BDO和丁二烯的路线的开发。
1,4-丁二醇(1,4-BDO)是生产高性能聚合物、溶剂和精细化学品的有价值的化学品。它是生产其他高价值化学品如四氢呋喃(THF)和γ-丁内酯(GBL)的基础。价值链由三个主要部分构成,包括:(1)聚合物,(2)THF衍生物,和(3)GBL衍生物。就聚合物而言,1,4-BDO是用于生产聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)的共聚单体。PBT是一种中等性能的工程热塑性塑料,用于汽车、电气、水系统和小家电应用。通过转化为THF随后转化为聚四亚甲基醚二醇(PTMEG),提供了一种用于制造氨纶产品如纤维的中间体。PTMEG还与1,4-BDO结合用于生产特种聚酯醚(COPE)。COPE是高模量弹性体,具有优异的机械性能和耐油性/耐环境性,允许它们在极端高温和低温下工作。PTMEG和1,4-BDO还生产在标准热塑性挤出、压延和成型设备上加工的热塑性聚氨酯,其特点是具有出色的韧性和耐磨性。由1,4-BDO生产的GBL为吡咯烷酮的制造以及农用化学品市场提供了原料。吡咯烷酮被用作越来越多使用的提取工艺的高性能溶剂,包括例如在电子工业和药物生产中。
1,4-BDO由两条主要的石化路线生产,还有几条额外路线也在商业运营中。一条路线包括使乙炔与甲醛反应,然后进行氢化。最近,引入了1,4-BDO工艺,其包括丁烷或丁二烯氧化成马来酸酐,然后进行氢化。1,4-BDO几乎完全用作合成其他化学品和聚合物的中间体。
每年生产超过250亿磅丁二烯(1,3-丁二烯,BD),用于制造聚合物,如合成橡胶和ABS树脂,以及化学品,如己二胺和1,4-丁二醇。例如,丁二烯可以与许多其他化学品如其他烯烃(例如苯乙烯)反应以制造多种共聚物(例如丙烯腈1,3-丁二烯苯乙烯(ABS)、苯乙烯-1,3-丁二烯(SBR)橡胶、苯乙烯-1,3-丁二烯乳胶)。这些材料用于橡胶、塑料、绝缘材料、玻璃纤维、管道、汽车和船舶零件、食品容器和地毯背衬。丁二烯通常作为蒸汽裂化过程的副产品生产,用于将石油原料如石脑油、液化石油气、乙烷或天然气转化为乙烯和其他烯烃。从替代和/或可再生原料制造丁二烯的能力将代表寻求更可持续的化学生产工艺的重大进步。
巴豆醇,也称为2-丁烯-1-醇,是一种有价值的化学中间体。它是巴豆基卤化物、酯和醚的前体,而这些物质又是单体、精细化学品、农用化学品和药品生产中的化学中间体。示例性精细化学品包括山梨酸、三甲基氢醌、巴豆酸和3-甲氧基丁醇。巴豆醇也是1,3-丁二烯的前体。巴豆醇目前完全由石油原料生产。例如,日本专利47-013009和美国专利第3,090,815、3,090,816和3,542,883号描述了一种通过1,2-环氧丁烷的异构化生产巴豆醇的方法。从替代和/或可再生原料制造巴豆醇的能力将代表寻求更可持续的化学生产工艺的重大进步。
3-丁烯-2-醇(也称为甲基乙烯基甲醇(MVC))是一种可用于生产丁二烯的中间体。与1,3-BDO相比,使用3-丁烯-2-醇具有显著优势,因为分离步骤更少,并且只有一个脱水步骤。3-丁烯-2-醇还可用作溶剂、用于聚合物生产的单体、或精细化学品的前体。因此,从替代和/或可再生原料制造3-丁烯-2-醇的能力将再次为可持续化学生产工艺带来显著优势。
己二酸是一种二羧酸,分子量为146.14。它可用于生产尼龙6,6,一种由己二酸与己二胺缩合而成的线性聚酰胺。这用于制造不同种类的纤维。己二酸的其他用途包括用于增塑剂、不饱和聚酯和聚酯多元醇。其他用途包括生产聚氨酯、润滑剂成分,以及作为调味剂和胶凝助剂以用作食品成分。
历史上,己二酸是通过氧化由多种脂肪制备的。目前的一些己二酸合成工艺依赖于使用过量的强硝酸对KA油(环己酮(酮或K组分)和环己醇(醇或A组分)的混合物)或纯环己醇进行氧化。该主题有数种变化,它们在KA或环己醇的生产路线上有所不同。例如,苯酚是KA油生产中的替代原料,并且已经描述了由苯酚合成己二酸的工艺。该工艺的其他版本倾向于使用硝酸以外的氧化剂,例如过氧化氢、空气或氧气。
除了如上所述的己二胺(HMDA)用于生产尼龙-6,6外,它还用于制备六亚甲基二异氰酸酯,这是一种用于生产聚氨酯的单体原料。二胺还用作环氧树脂中的交联剂。HMDA目前通过己二腈的氢化产生。
己内酰胺是一种有机化合物,是6-氨基己酸(ε-氨基己酸、6-氨基己酸)的内酰胺。它也可以被认为是己酸的环酰胺。己内酰胺的一个用途是作为生产尼龙-6的单体。己内酰胺可以通过使用硫酸羟铵的肟化工艺,然后使用贝克曼重排工艺步骤进行催化重排从环己酮合成。
甲基丙烯酸(MAA)是甲基丙烯酸甲酯(MMA)的关键前体,甲基丙烯酸甲酯是一种化学中间体,全球需求量每年超过45亿磅,其中大部分被转化为聚丙烯酸酯。合成甲基丙烯酸甲酯的常规工艺(即丙酮氰醇路线)包括将氰化氢(HCN)和丙酮转化为丙酮氰醇,然后进行酸辅助水解和与甲醇的酯化以得到MAA。处理潜在致命的HCN的困难以及副产品处理的高成本(每吨MAA形成1.2吨硫酸氢铵)引发了大量旨在实现更清洁和更经济的工艺的研究。作为起始材料,MAA可以容易地通过与甲醇酯化转化为MMA。
微生物生物体可用于生产生物衍生化合物,如1,3-BDO、1,4-BDO、丁二烯、巴豆醇、MVC、己二酸酯/盐、HMDA、己内酰胺和MAA。此种生产的滴度、速率和产率可受辅因子可用性限制。特别是,有限的辅因子,例如还原剂还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),可导致受限的氧化还原可用性。例如,NADPH为生物合成反应提供了还原当量,如脂质和核酸合成,以及涉及防止活性氧类(ROS)毒性的氧化还原。NADPH还用于合成代谢途径,如胆固醇合成和脂肪酸链延伸。氧化还原水平的不平衡可对生物衍生化合物如1,3-BDO、1,4-BDO、丁二烯、巴豆醇、MVC、己二酸酯/盐、HMDA、己内酰胺和MAA的生产产生有害影响。此外,NADH对于新陈代谢和能量产生至关重要,并且能够通过在氧化还原反应中在分子之间转移电子来实现许多重要分子的正确功能。已发现NAD+/NADH对在微生物分解代谢和细胞生长中起重要作用。此外,NAD(P)+转氢酶(EC 1.6.1.1-Si特异性;和EC 1.6.1.2-Re/Si特异性)可以催化的可逆反应,因此NADH的产量增加可以转化为NADPH的增加产量。因此,增加辅因子如NADH的可用性可有助于提高生物衍生化合物的滴度、速率和产率。
甲酸脱氢酶(FDH;EC 1.2.1.2)是自然界中发现的一种常见酶,它催化甲酸(即甲酸离子)氧化为二氧化碳,同时将氧化形式(NAD+)的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原为还原形式(NADH)。或者,FDH(EC 1.17.1.9)可以使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)的辅因子来催化甲酸的氧化,从而产生二氧化碳和NADPH。FDH可用作辅酶循环系统,用于光学活性化合物的生物转化和生产,包括但不限于大多数氨基酸、手性化合物(例如,手性醇)和羟基酸。FDH作为催化剂在有机酸合成中发挥重要作用,用于生产期望的产品,例如目的药物产品。
因此,需要开发有效生产商业数量的生物衍生化合物的方法,例如1,3-BDO、1,4-BDO、丁二烯、巴豆醇、MVC、己二酸酯/盐、HMDA、己内酰胺和MAA,这可以通过增加NADH的可用性来改善。本公开满足了这一需求,并且还提供了相关优点。
发明内容
在一些实施方案中,本文提供了一种工程化甲酸脱氢酶,其为氨基酸序列SEQ IDNO:1或2的变体或其功能片段。这种工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述位置处的一个或更多个改变。在一些实施方案中,本文所述的工程化甲酸脱氢酶能够:(a)催化甲酸转化为二氧化碳;(b)催化NAD+转化或还原为NADH;或(c)催化甲酸转化为二氧化碳和催化NAD+转化为NADH。在一些实施方案中,本文所述的工程化甲酸脱氢酶能够催化甲酸转化为二氧化碳和催化NAD+转化为NADH。
在一些实施方案中,本文所述的工程化甲酸脱氢酶具有比野生型甲酸脱氢酶(例如具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的甲酸脱氢酶)的活性高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍或至少2倍的活性。
在一些实施方案中,本文所述的工程化甲酸脱氢酶具有如表6和/或表7所述的一个或更多个氨基酸改变,例如一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中,本文所述的工程化甲酸脱氢酶具有一个或更多个氨基酸改变,所述氨基酸改变包括一个或更多个保守性氨基酸取代。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有一个或更多个氨基酸改变,所述氨基酸改变包括一个或更多个非保守性氨基酸取代。在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生在与SEQ ID NO:1或2中的位置对应的特定位置处具有一个或更多个残基的工程化甲酸脱氢酶,包括表6和/或表7中所述的那些改变中的一者或多者。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有本文所述的氨基酸改变(例如,表6和/或表7)中的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个。在一些实施方案中,此类工程化甲酸脱氢酶在SEQ ID NO:1或2中具有对应于表6或表7中描述的变体的一个改变或改变的组合。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶不具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
本文提供的了另外的工程化甲酸脱氢酶包括如本文所鉴定的SEQ ID NO:1和2的同系物的变体。因此,在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有作为氨基酸序列SEQ ID NO:3-24的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中,此类工程化甲酸脱氢酶包含在对应于表6和/或表7中所述位置的位置处的一个或更多个改变。
在一些实施方案中,本文提供了一种编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸。在一些实施方案中,这种重组核酸具有与启动子可操作地连接的编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的核苷酸序列。在一些实施方案中,本文还提供一种具有这种重组核酸的载体。
在一些实施方案中,本文提供一种具有编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的非天然存在的微生物生物体。在一些实施方案中,这种微生物生物体还包括能够生产生物衍生化合物的途径,其中所述途径中的一种或更多种酶使用NADH或NADPH作为辅因子来催化其酶促反应。在一些实施方案中,这种途径中的一种或更多种酶由外源核酸编码。
在一些实施方案中,本文所述的微生物生物体包含与微生物生物体异源的外源核酸。在一些实施方案中,本文所述的微生物生物体包含与微生物生物体同源的外源核酸。
在一些实施方案中,本文所述的微生物生物体包含能够生产生物衍生化合物的途径。在一些实施方案中,这种生物衍生化合物是醇、二元醇(glycol)、有机酸、烯烃、二烯烃、有机胺、有机醛、维生素、保健品或药物。醇的实例包括:(a)生物燃料醇,其中所述生物燃料是包含C3至C10碳原子的伯醇、仲醇、二醇(diol)或三醇;(b)正丙醇或异丙醇;和(c)脂肪醇,其中所述脂肪醇包含C4至C27碳原子、C8至C18碳原子、C12至C18碳原子或C12至C14碳原子。生物燃料醇的实例包括:1-丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、1-戊醇、异戊烯醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、1-庚醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-己醇。在一些实施方案中,二醇是丙二醇或丁二醇,例如1,4-丁二醇、1,3-丁二醇或2,3-丁二醇。在一些实施方案中,生物衍生化合物选自由以下组成的组:(a)1,4-丁二醇或其中间体,其中所述中间体任选地为4-羟基丁酸(4-HB);(b)丁二烯(1,3-丁二烯)或其中间体,其中所述中间体任选地为1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)或3-丁烯-1-醇;(c)1,3-丁二醇或其中间体,其中所述中间体任选地为3-羟基丁酸酯/盐(3-HB)、2,4-戊二烯酸酯/盐(2,4-pentadienoate)、巴豆醇或3-丁烯-1-醇;(d)己二酸酯/盐、6-氨基己酸、己内酰胺、己二胺、乙酰丙酸或其中间体,其中所述中间体任选地为己二酰辅酶A或4-氨基丁酰辅酶A;(e)甲基丙烯酸或其酯、3-羟基异丁酸酯/盐、2-羟基异丁酸酯/盐或其中间体,其中所述酯任选地为甲基丙烯酸甲酯或聚(甲基丙烯酸甲酯);(f)1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、二丙二醇、三丙二醇、新戊二醇、双酚A或其中间体;(g)琥珀酸或其中间体;和(h)包含C4至C27碳原子、C8至C18碳原子、C12至C18碳原子或C12至C14碳原子的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸,其中所述脂肪醇任选地为十二烷醇(C12;月桂醇)、十三烷醇(C13;1-十三醇、十三醇、异十三醇)、肉豆蔻醇(C14;1-十四醇)、十五烷醇(C15;1-十五醇、十五醇)、鲸蜡醇(C16;1-十六醇)、十七烷醇(C17;1-正十七醇、十七醇)和硬脂醇(C18;1-十八醇)或棕榈油醇(palmitoleyl alcohol)(C16不饱和;顺式-9-十六碳烯-1-醇(cis-9-hexadecen-1-ol))。
在一些实施方案中,本文所述的微生物生物体是在基本上厌氧的培养基中。
在一些实施方案中,本文所述的微生物生物体是细菌、酵母或真菌物种。
在一些实施方案中,与不包含编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的对照微生物生物体相比,本文所述的微生物生物体能够生产多至少10%的NADH或生物衍生化合物。
在一些实施方案中,本文提供一种生产本文所述的生物衍生化合物的方法,其包括在用于生产所述生物衍生化合物的条件下培养本文所述的非天然存在的微生物生物体,持续足以生产所述生物衍生化合物的时间段。在一些实施方案中,这种方法还包括将生物衍生化合物与培养物中的其他组分分离。用于进行这种分离的方法包括萃取、连续液-液萃取、渗透蒸发(pervaporation)、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、吸附色谱或超滤。
在一些实施方案中,本文提供具有通过本文提供的方法生产的生物衍生化合物的培养基,其中所述生物衍生化合物具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。
在一些实施方案中,本文提供一种根据本文所述方法生产的生物衍生化合物。在一些实施方案中,这种生物衍生化合物具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值。
在一些实施方案中,本文提供具有本文所述的生物衍生化合物和除所述生物衍生化合物以外的化合物的组合物。在一些实施方案中,除所述生物衍生化合物之外的该种化合物是具有生物衍生化合物途径的非天然存在的微生物生物体的痕量细胞部分。
在一些实施方案中,本文提供具有本文所述的生物衍生化合物或其细胞裂解物或培养上清液的组合物。
在一些实施方案中,本文提供一种用于增加非天然存在的微生物生物体中NADH的可用性的方法。在一些实施方案中,这种方法包括在用于增加NADH可用性的条件下培养具有编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的非天然存在的微生物生物体,持续足以增加NADH可用性的时间段。在一些实施方案中,NADH可用性的增加导致如本文所述的生物衍生化合物的产量增加。
在一些实施方案中,本文提供一种降低非天然存在的微生物生物体中的甲酸浓度的方法。在一些实施方案中,这种方法包括在用于增加甲酸向二氧化碳转化的条件下培养具有编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的非天然存在的微生物生物体,持续足以增加甲酸向二氧化碳转化的时间段。在一些实施方案中,非天然存在的微生物生物体中的甲酸浓度的降低导致用于生产本文所述的生物衍生化合物的方法中作为杂质的甲酸减少。
附图说明
图1示出了FDH文库筛选中对照vs文库的性能。
图2示出了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2之间的示例性比对,包括共有序列(SEQ IDNO:49)。
具体实施方式
本文所述的主题涉及具有期望特性并且可用于生产期望产物(例如,NADH或生物衍生化合物)的酶变体。在一些实施方案中,本文所述的主题涉及工程化甲酸脱氢酶,其为与自然界中存在的野生型甲酸脱氢酶相比具有明显不同的结构和/或功能特征的酶变体。因此,本文提供的工程化甲酸脱氢酶不是天然存在的酶。所提供的此类工程化甲酸脱氢酶可用于已被工程化以生产期望产物(例如,NADH或生物衍生化合物)的工程化细胞中,例如微生物生物体。例如,如本文所公开的,具有代谢途径的细胞,例如微生物生物体,可以生产期望产物(例如,NADH或生物衍生的化合物)。可将具有本文所述的期望特征的工程化甲酸脱氢酶引入具有代谢途径的细胞,例如微生物生物体,所述代谢途径使用甲酸脱氢酶活性来生产生物衍生化合物。因此,本文提供的工程化甲酸脱氢酶可用于工程化细胞,例如微生物生物体,以生产期望产物。
惯例和缩写
如本文所用,术语“约”是指所述值的±10%。术语“约”可以表示四舍五入到最接近的有效位。因此,约5%意指4.5%至5.5%。另外,提及特定数字的约也包括该精确数字。例如,约5%也包括精确的5%。
如本文所用,当提及本文所述的任何肽、多肽、蛋白质、核酸或多核苷酸使用时,术语“改变”或其语法等价物是指相对于起始或参考残基或碱基的氨基酸残基或核酸碱基的结构变化。氨基酸残基的改变包括例如缺失、插入和用一个氨基酸残基取代结构不同的氨基酸残基。此类取代可以是如本文所述的保守性取代、非保守性取代、对特定亚类氨基酸的取代,或其组合。核酸碱基的改变包括例如将一种天然存在的碱基改为不同的天然存在的碱基,例如将腺嘌呤改为胸腺嘧啶或将鸟嘌呤改为胞嘧啶或将腺嘌呤改为胞嘧啶或将鸟嘌呤改为胸腺嘧啶。核酸碱基的改变可通过改变肽、多肽或蛋白质的经过编码的氨基酸残基或功能而导致编码肽、多肽或蛋白质的改变。核酸碱基的改变可能不会导致经过编码的肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列或功能发烧改变,这也称为沉默突变。
如本文所用,术语“生物衍生(的)”是指从生物生物体衍生或由生物生物体合成的,并且可以被认为是可再生资源,因为它可以由生物生物体产生。这种生物生物体,特别是本文公开的非天然存在的微生物生物体,可以利用例如糖(例如,纤维二糖、葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖(例如,来自海洋植物生物质的半乳糖)和蔗糖);从农业、植物、细菌或动物来源获得的碳水化合物以及甘油(例如,来自生物柴油制造的粗甘油副产物)的原料或生物质来合成期望的生物衍生化合物。
如本文所用,术语“保守性取代”是指用一种氨基酸替换另一种氨基酸,使得该替换发生在氨基酸的侧链相关的氨基酸家族内。可替选地,术语“非保守性取代”是指用一种氨基酸残基替换另一种氨基酸残基,使得被替换的残基从一个氨基酸家族转移到不同的残基家族。基因编码的氨基酸可分为四个家族:(1)酸性的(带负电荷)=Asp(D)、Glu(G);(2)碱性的(带正电荷)=Lys(K)、Arg(R)、His(H);(3)非极性的(疏水性)=Cys(C)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Met(M)、Trp(W)、Gly(G)、Tyr(Y),其中非极性家族还细分为:(i)强疏水的=Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Met(M)、Phe(F);和(ii)中度疏水的=Gly(G)、Pro(P)、Cys(C)、Tyr(Y)、Trp(W);和(4)不带电荷的极性的=Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、Thr(T)。在替选方式中,氨基酸库可分组为(1)酸性的(带负电荷)=Asp(D)、Glu(G);(2)碱性的(带正电荷)=Lys(K)、Arg(R)、His(H)和(3)脂肪族的=Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T),其中Ser(S)和Thr(T)任选地被分组为脂肪族-羟基类;(4)芳香族的=Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W);(5)酰胺类=Asn(N)、Glu(Q);和(6)含硫的=Cys(C)和Met(M)(参见例如,Biochemistry,第4版,L.Stryer编辑,WH Freeman and Co.,1995,其通过引用整体并入本文)。
如本文所用,术语“培养基”、“介质”、“生长培养基”或其语法等价物是指含有支持细胞(包括微生物生物体,如本文所述的微生物生物体)生长的营养物的液体或固体(例如,凝胶状)物质。支持生长的营养物包括但不限于以下:提供碳的底物,例如但不限于纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、乙醇、乙酸盐、阿拉伯糖、阿糖醇、山梨糖醇和甘油;提供包括镁、氮、磷和硫的必需元素的盐;氨基酸的来源,例如蛋白胨或胰蛋白胨;以及维生素含量的来源,例如酵母提取物。培养基可以是确定的培养基,其中所有成分的量都是已知的,也可以是不明确的培养基,其中所有成分的量都是未知的。培养基还可以包含生长所需营养物以外的物质,例如通常在选择性培养基中可见的仅允许选定细胞生长的物质(例如,抗生素或抗真菌剂),或者通常在差异化培养基或指示剂培养基中可见的在同一培养基上生长时允许将一种微生物生物体与另一种微生物生物体区分开的物质。此类物质是本领域技术人员熟知的。
如本文所用,当提及本文所述的任何肽、多肽、蛋白质、核酸或多核苷酸使用时,术语“工程化”或“变体”是指与亲本序列相比在氨基酸残基或核酸碱基上具有至少一个改变的氨基酸或核酸序列。这种氨基酸或核酸序列不是天然存在的。氨基酸或核酸的亲本序列可以是例如野生型序列或其同源物,或者野生型序列或其同源物的修饰变体。
如本文所用的“外源”旨在意味着所提及的分子或所提及的活性被引入到宿主微生物生物体中。可例如通过将编码核酸引入到宿主遗传物质中来引入分子,例如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质(例如质粒)引入。因此,在提及编码核酸的表达使用时,该术语是指将编码核酸以可表达形式引入到微生物生物体中。当提及生物合成活性使用时,该术语是指活性被引入到宿主参考生物体中。来源可为例如同源或异源编码核酸,其在引入到宿主微生物生物体中之后表达所提及的活性。因此,术语“内源”是指所提及的分子或活性存在于宿主中。类似地,当提及编码核酸的表达使用时,所述术语是指微生物生物体内所含的编码核酸的表达。术语“异源”是指分子或活性是来源于除所提及的物种以外的来源,而“同源”是指分子或活性是来源于宿主微生物生物体。因此,本文所述的编码核酸的外源表达可利用异源编码核酸或同源编码核酸或两者。
应当理解,当多于一个重组核酸和/或外源核酸被包含在微生物生物体中时,所述多于一个重组核酸和/或外源核酸是指如本文所讨论的所提及编码核酸或生物合成活性。应当进一步理解,如本文所公开的,这类多于一个重组核酸或外源核酸可被引入宿主微生物生物体中的单独的核酸分子上、多顺反子核酸分子上或其组合上,并且仍然被认为是多于一个重组核酸和/或外源核酸。例如,如本文所公开的,微生物生物体可以被工程化以表达两个或更多个编码期望的途径酶或蛋白质的重组和/或外源核酸。在将编码具有期望活性的酶或蛋白质的两个重组和/或外源核酸引入宿主微生物生物体的情况下,应当理解,这两个重组和/或外源核酸可以作为单个核酸引入,例如,在单个质粒上,在单独的质粒上,可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中,并且仍然被认为是两个外源核酸。类似地,应当理解,可以将多于两个重组和/或外源核酸以任何期望的组合引入宿主生物体,例如,在单个质粒上,在单独的质粒上,可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中,并且仍然被认为是两个或更多个重组或外源核酸,例如三个外源核酸。因此,所提及的重组或外源核酸或生物合成活性的数目是指编码核酸的数目或生物合成活性的数目,而不是引入宿主生物体的单独核酸的数目。
当提及化合物使用时,术语“Fm值”或“现代分数值(Fraction Modern value)”是碳-14(14C)与碳-12(12C)的比率。具体地,Fm值由表达式Fm=(S-B)/(M-B)计算,其中B、S和M分别表示空白、样品和现代参考的14C/12C比率。Fm值是样品的14C/12C比率与“现代(Modern)”的偏差的测量值。现代被定义为相对于δ13CVPDB=-19/mil归一化的国家标准局(NBS)草酸I(即标准参考物质(SRM)4990b)的放射性碳浓度(公元1950年)的95%(Olsson,The use ofOxalic acid as a Standard.,Radiocarbon Variations and Absolute Chronology,Nobel专题研讨会,12th Proc.,John Wiley&Sons,New York(1970))。例如,通过ASM测量的质谱结果是使用国际商定的定义来计算的,该定义是0.95乘以相对于δ13CVPDB=-19/mil归一化的NBS草酸I(SRM 4990b)的比活性。这相当于14C/12C比率的绝对值(公元1950年)为1.176±0.010×10-12(Karlen等人,Arkiv Geofysik,4:465-471(1968))。标准计算考虑了一种同位素相对于另一种同位素的差异摄取,例如,在生物系统中的优先摄取:C12大于C13大于C14,并且这些校正反映为针对δ13校正的Fm。Fm=0%表示材料中完全缺乏碳-14原子,因此指示化石(例如,石油基)碳源,在校正了1950年后由核弹试验注入大气的碳-14后的Fm=100%指示了完全现代的碳源。由于导致大气中碳-14的大量富集的20世纪50年代核试验计划的持续但逐渐减少的影响,现代碳的百分比(pMC)可大于100%。由于所有样品的碳-14活性都参考了“炸弹前”标准,并且几乎所有新的生物基产品都是在炸弹后环境中生产的,因此所有pMC值(校正同位素分数后)必须乘以0.95(截至2010年)才能更好地反映样品的真实生物基含量。大于103%的生物基含量表明要不发生了分析错误,要不生物基碳的来源已有数年历史。碳-14测年技术用于量化材料生物基含量的应用在本领域是公知的(参见例如,Currie等人,Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B,172:281-287(2000),和Colonna等人,Green Chemistry,13:2543-2548(2011))。
如本文所用,当提及肽、多肽或蛋白质使用时,术语“功能片段”旨在指保留了衍生该片段的原始肽、多肽或蛋白质的部分或全部活性(例如,催化甲酸转化为二氧化碳和/或NAD+转化为NADH)的肽、多肽或蛋白质的一部分。此类功能片段包括长度为约200至约380、约200至约370、约200至约360、约200至约350、约200至约340、约200至约330、约200至约320、约200至约310、约200至约300、约300至约380、约300至约360、约300至约370、约300至约360、约300至约350、约300至约340、约300至约330、约300至约320、约350至约380、约350至约360个氨基酸的氨基酸序列。这些功能片段可以例如是肽、多肽或蛋白质的截短物(例如,C-末端或N-末端截短物)。功能片段还可包含本文所述的一个或更多个氨基酸改变,例如本文所述的工程化肽的氨基酸改变。
如本文所用,当提及分子(例如,肽、多肽、蛋白质、核酸、多核苷酸、载体)或细胞(例如,酵母细胞)使用时,术语“分离(的)”是指基本上不含在自然界中发现所提及的分子或细胞时存在的至少一种成分的分子或细胞。该术语包括自其天然环境中与其一起被发现的一些或所有组分移出的分子或细胞。因此,分离的分子或细胞可以部分地或完全地与自然界中与其一起发现的或在非自然存在的环境中与其一起生长、储存或存活的其他物质分离。
如本文所用,术语“微生物(的)”、“微生物生物体”或“微生物”旨在意指以古菌域、细菌域或真核生物域内所包括的显微细胞形式存在的任何生物体。因此,该术语旨在涵盖具有显微尺寸的原核或真核细胞或生物体,且包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌,以及真核微生物,例如酵母和真菌。该术语还包括可经培养以用于生产生化物质的任何物种的细胞培养物。
如本文所用,术语“非天然存在”当提及本文所述的微生物生物体使用时旨在意指微生物生物体具有至少一个在所提及物种的天然存在的菌株(包括所提及物种的野生型菌株)中通常未发现的遗传改变。遗传改变包括例如引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其他核酸添加、核酸缺失和/或微生物生物体遗传物质的其他功能性破坏。此类修饰包括例如编码区及其功能片段内的遗传改变。另外的修饰包括例如非编码调控区,其中修饰会改变基因或操纵子的表达。示例性代谢多肽包括本文所述的乙酰辅酶A或生物衍生化合物途径内的酶或蛋白质。
如本文所用,当提及编码工程化甲酸脱氢酶的核酸使用时,术语“可操作地连接”是指编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的核苷酸序列与另一个核苷酸序列(例如,启动子)以允许连接的核苷酸序列起作用(例如,在微生物生物体中表达工程化甲酸脱氢酶)的方式连接。
如本文所用,当提及期望产物(例如,1,3-BDO或生物衍生化合物)的生产使用时,术语“途径”是指催化底物化合物转化为产物化合物和/或生产用于将底物化合物转化为产物化合物的共底物的一种或更多种多肽(例如,蛋白质或酶)。这种产物化合物可以是本文所述的生物衍生化合物之一,或者是可在通过代谢途径中的其他蛋白质或酶进一步转化时得到生物衍生化合物的中间化合物。因此,代谢途径可以由一系列代谢多肽(例如,两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种)构成,这些代谢多肽作用于底物化合物,以将其通过一系列中间化合物转化为给定的产物化合物。代谢途径的代谢多肽可以由本文所述的外源核酸编码或由宿主微生物生物体自然生产。
如本文所用,提及核酸(诸如包含编码蛋白质或多肽(例如,本文所述的工程化甲酸脱氢酶)的基因的核酸)的术语“重组”是指:已被人工供应至生物系统的核酸;已在生物系统内修饰的核酸,或其表达或调控已在生物系统内被操纵的核酸。可以例如通过将核酸引入微生物生物体的遗传物质(例如通过整合到微生物生物体染色体中)或作为非染色体遗传物质(例如质粒)来将重组核酸提供给生物系统。引入微生物生物体中或在微生物生物体中表达的重组核酸可以是来自与微生物生物体不同的生物体或物种的核酸,或者可以是合成核酸,或者可以是也在与微生物生物体相同的生物体或物种中内源性表达的核酸。在以下情况下,也在与微生物生物体相同的生物体或物种中内源性表达的重组核酸可被认为是异源的:重组核酸的序列相对于内源表达的序列被修饰,调控区的序列(诸如控制核酸表达的启动子)相对于内源表达序列的调控区被修饰,核酸相对于内源表达序列在微生物生物体基因组中的替选位置表达,核酸相对于内源表达的序列在微生物生物体中以不同的拷贝数表达,和/或核酸作为非染色体遗传物质如质粒在微生物生物体中表达。
如本文所用,当提及编码工程化甲酸脱氢酶的核酸使用时,术语“启动子”是指在该处RNA聚合酶开始对所连接的开放阅读框进行转录的核苷酸序列(例如,编码工程化甲酸脱氢酶的核苷酸序列)。启动子序列可直接位于转录起始位点的上游或5'端。RNA聚合酶和必要的转录因子结合至启动子序列并启动转录。启动子序列定义了转录方向并指示哪条DNA链将被转录,即有义链。
如本文所用,当提及培养物或生长条件使用时,术语“基本上厌氧”旨在表示液体介质中的溶解氧量低于约10%饱和度。该术语还旨在包括在低于约1%氧气的气氛中保持的包括液体或固体介质的密封室。
如本文所用,术语“载体”是指转导、转化或感染微生物生物体的化合物和/或组合物,从而使微生物生物体表达除微生物生物体原有的核酸和/或蛋白质以外的核酸和/或蛋白质,或以非细胞原有的方式表达核酸和/或蛋白质。载体可以构建为包含一种或更多种生物合成途径酶或蛋白质,例如本文所述的工程化FDH,其由与在微生物生物体中起作用的表达控制序列(例如,启动子)可操作地连接的核苷酸序列(“表达载体”)编码。适用于本文所述的微生物生物体中的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体(episome)和人工染色体,包括可用于稳定整合到宿主染色体中的可操作载体和选择序列或标记物。另外,表达载体可包括一个或更多个可选择标记基因和适当的表达控制序列。也可包括可选择标记基因,其例如提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或供应培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共表达两种或更多种重组或外源编码核酸时,可以将两种核酸插入到例如单一表达载体中或分别的表达载体中。对于单一载体表达,编码核酸可与一个共同的表达控制序列或不同的表达控制序列可操作地连接,例如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。编码参与代谢或合成途径的酶或蛋白质的重组或外源核酸的转化可以使用本领域熟知的方法来确认。此类方法包括例如核酸分析,诸如mRNA的Northern印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增,或用于基因产物表达的免疫印迹法,或用于测试引入的核酸或其对应基因产物(例如,酶或蛋白质)的表达的其他合适分析方法。本领域技术人员应理解,重组或外源核酸以足够的量表达以产生期望产物,并且还应理解,可使用本领域熟知的和本文公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。
本领域技术人员将理解,参考合适的微生物生物体(例如大肠杆菌)及其对应的代谢反应,或针对期望遗传物质(例如针对期望代谢途径的基因)的合适来源生物体来对遗传改变(包括本文举例说明的代谢修饰)进行描述。然而,鉴于多种生物体的完整基因组测序和基因组学领域中的高技术水平,本领域技术人员将能够容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有其他生物体。举例来说,通过并入来自除所提及物种以外的物种的相同或类似的编码核酸,本文举例说明的大肠杆菌代谢改变可容易地应用于其他物种。此类基因改变一般包括例如种间同源物的基因改变,特别包括,直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置换。
直系同源物是通过垂直家系产生关联且在不同生物体中负责基本上相同或一致的功能的一或多个基因。举例来说,小鼠环氧化物水解酶和人类环氧化物水解酶可被视为用于环氧化物水解生物功能的直系同源物。例如,当基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的,或通过从共同祖先进化而产生关联时,所述基因通过垂直家系产生关联。如果基因共有足够的三维结构相似性但不必然具有足量的序列相似性,从而在无法鉴定到一级序列相似性的程度表明其进化自共同祖先,那么这些基因也可被视为直系同源物。直系同源的基因可编码序列相似性为约25%至100%氨基酸序列同一性的蛋白质。如果编码氨基酸相似性小于25%的蛋白质的基因的三维结构也显示出相似性,那么其也可被视为是由垂直家系产生的。丝氨酸蛋白酶家族的成员(包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶)被视为是通过垂直家系从共同祖先产生的。
直系同源物包括经由例如进化而在结构或总体活性上趋异的基因或其编码的基因产物。举例来说,在一种物种编码展现两种功能的基因产物的情况下,以及在此类功能分离成第二物种中的不同基因的情况下,这三种基因及其对应产物被视为直系同源物。为了产生生物化学产物,本领域技术人员将理解可对具有待引入或破坏的代谢活性的直系同源基因进行选择,以便构建非天然存在的微生物生物体。展现可分离活性的直系同源物的一个实例是不同活性已在两种或更多种物种之间或在单一物种内被分离成不同的基因产物。一特定实例是弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)被分离成作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶的不同分子。第二个实例是支原体5’-3’核酸外切酶和果蝇(Drosophila)DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可被视为来自第二物种的核酸外切酶和聚合酶中一者或两者的直系同源物,且反之亦然。
相反,旁系同源物是通过例如复制和随后的进化趋异而产生关联且具有相似或共同、但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可来源于或衍生自例如相同物种或不同物种。举例来说,微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可被视为旁系同源物,因为其代表两种共同进化自共同祖先的不同酶,催化不同反应且在相同物种中具有不同功能。旁系同源物是来自相同物种的彼此具有显著序列相似性的蛋白质,表明其是同源的或通过共同进化自共同祖先而产生关联。旁系同源蛋白质家族的分组包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶等。
非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因可取代不同物种中的所提及的基因功能。取代包括例如能够在起源物种中执行与不同物种中的所提及功能相比基本上相同或类似的功能。虽然一般来说,非直系同源基因置换可被鉴定为在结构上与编码所提及功能的已知基因相关,但是结构相关性较小但功能类似的基因及其对应的基因产物在本文中使用时仍然落于所述术语的含义内。功能相似性需要例如非直系同源基因产物的活性位点或结合区域与编码设法取代的功能的基因相比具有至少一些结构相似性。因此,非直系同源基因包括例如旁系同源物或无关基因。
因此,在鉴丁和构建具有期望产物的生物合成能力的本文所述的非天然存在的微生物生物体的过程中,所属领域技术人员将了解,通过对特定物种应用本文提供的教导和指导,代谢修饰的鉴定可包括直系同源物的鉴定和纳入或失活。只要所提及的微生物生物体中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置换以用于编码催化类似或基本上类似的代谢反应的酶,那么本领域技术人员也可利用这些进化上相关的基因。同样,对于基因破坏,进化相关的基因也可以在微生物生物体中被破坏或缺失,以减少或消除针对破坏的酶活性的功能冗余。
直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换可通过本领域技术人员熟知的方法来确定。举例来说,检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将会揭示所比较序列之间的序列同一性和相似性。基于此类相似性,如果相似性足够高,那么本领域技术人员可确定蛋白质是通过自共同祖先进化而产生关联。本领域技术人员熟知的算法(例如Align、BLAST、Clustal W等)比较和确定原始序列相似性或同一性,并且确定序列中可被指派权重或分数的空位的存在或意义。此类算法在本领域中也是已知的,且类似地可用于确定核苷酸序列相似性或同一性。足以确定关联性的相似性参数基于用于计算统计学相似性的熟知方法,或在随机多肽中发现类似匹配的概率和所确定匹配的意义计算得出。两种或更多种序列的计算机比较在需要时也可由本领域技术人员目测优化。相关的基因产物或蛋白质可被预期具有高相似性,例如25%到100%的序列同一性。如果扫描的时足够大小的数据库,那么无关的蛋白质可具有与预期偶然发生的概率基本上相同的同一性(约5%)。5%至24%的序列可能代表或可能不代表足以推断所比较的序列相关的同源性。可执行根据数据集的大小确定此类匹配的意义的其他统计学分析,以便确定这些序列的相关性。
使用BLAST算法确定两个或更多个序列的关联性的示例性参数可例如列举如下。简而言之,氨基酸序列比对可以使用BLASTP版本2.0.8(1999年1月5日)和以下参数进行:矩阵:0BLOSUM62;空位开放:11;空位延伸:1;x_dropoff:50;预期:10.0;字长:3;过滤器:开。核苷酸序列比对可以使用BLASTN版本2.0.6(1998年9月16日)和以下参数进行:匹配:1;错配:-2;空位开放:5;空位延伸:2;x_dropoff:50;预期:10.0;字长:11;过滤器:关。本领域技术人员将知晓,例如为了提高或降低比较的严格度并确定两个或更多个序列的关联性,可对上述参数作哪些修改。
在一些实施方案中,本文提供一种工程化甲酸脱氢酶,其为野生型或亲本甲酸脱氢酶的变体。此类工程化甲酸脱氢酶相对于本文所述的野生型或亲本甲酸脱氢酶包括本文所述的一个或更多个改变和更高的催化活性。本文提供的工程化甲酸脱氢酶能够催化甲酸转化为二氧化碳和/或催化NAD+转化为NADH。由本文所述的工程化甲酸脱氢酶催化的示例性酶促反应由以下表示:
因此,在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶能够催化甲酸转化为二氧化碳。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶能够催化NAD+转化为NADH。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶能够催化甲酸转化为二氧化碳并且催化NAD+转化为NADH。
在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶来源于槲寄生吉布氏菌(Gibbsiellaquercinecans)(UniprotID:A0A250B5N7;SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)(UniprotID:O13437;SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中,此类工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变。本文提供的此类工程化甲酸脱氢酶可归类为与槲寄生吉布氏菌(UniprotID:A0A250B5N7;SEQ ID NO:1)和/或博伊丁假丝酵母(UniprotID:O13437;SEQ ID NO:2)的甲酸脱氢酶催化相同反应的酶。因此,在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶能够形成二氧化碳和/或NADH。另一些实施方案提供一种选自或衍生自表1中描述的任何甲酸脱氢酶的工程化甲酸脱氢酶,包括SEQ ID NO:3-24中的任一者。在一些实施方案中,此类工程化甲酸脱氢酶包含在对应于表6和/或表7中所述位置的位置处的一个或更多个改变。本文提供的此类工程化甲酸脱氢酶可归类为与表1中描述的一种或更多种甲酸脱氢酶催化相同反应的酶。
在一些实施方案中,本文提供一种工程化甲酸脱氢酶,其具有氨基酸序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的变体或其功能片段,其中所述工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变。在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶包含在表6中所述的位置处的一个或更多个改变。在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶包含在表7中所述的位置处的一个或更多个改变。在一些实施方案中,具有本文所述的这种改变的工程化甲酸脱氢酶能够:(a)催化甲酸转化为二氧化碳;(b)催化NAD+转化为NADH;或(c)催化甲酸转化为二氧化碳和催化NAD+转化为NADH。因此,在一些实施方案中,本文提供的此类工程化甲酸脱氢酶催化甲酸转化为二氧化碳。在一些实施方案中,本文提供的此类工程化甲酸脱氢酶催化NAD+转化为NADH。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶催化甲酸转化为二氧化碳和催化NAD+转化为NADH。
应理解,工程化甲酸脱氢酶,例如具有如本文所述的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的甲酸脱氢酶的多肽变体,可进行与如上所述的亲本甲酸脱氢酶类似的酶促反应。还应理解,甲酸脱氢酶的多肽变体可以包括为工程化甲酸脱氢酶提供有益特征的变体,包括但不限于增加的活性(参见例如实施例6)。在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶可表现出至少与野生型或亲本甲酸脱氢酶相同或比其更高的活性,即其活性高于在相同的一个或多个氨基酸位置处无变体的甲酸脱氢酶。例如,本文提供的工程化甲酸脱氢酶可具有与野生型或亲本甲酸脱氢酶相比高至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少5.5倍、至少6.0倍、至少6.5倍、至少7.0倍、至少7.5倍、至少8.0倍、至少8.5倍、至少9.0倍、至少9.5倍、至少10倍或甚至更高倍数的活性(参见例如实施例6)。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有比由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的甲酸脱氢酶的活性高至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.5倍或至少2.0倍的活性。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有高至少0.5倍的活性。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有高至少1.0倍的活性。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有高至少1.5倍的活性。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有高至少2.0倍的活性。应当理解,活性是指本文所述的工程化甲酸脱氢酶在相同的测定条件下,如本文所述的条件下,相对于野生型或亲本甲酸脱氢酶将底物转化为产物的能力(参见例如实施例6)。
在一些实施方案中,本文所述的甲酸脱氢酶的活性被测量为催化常数(kcat)值或转换数(turnover number)。在一些实施方案中,kcat为至少0.1s-1、至少0.2s-1、至少0.3s-1、至少0.4s-1、至少0.5s-1、至少0.6s-1、至少0.7s-1、至少0.8s-1、至少0.9s-1、至少1s-1、至少2s-1、至少3s-1、至少4s-1、至少5s-1、至少6s-1、至少7s-1、至少8s-1、至少9s-1、至少10s-1、至少11s-1、至少12s-1、至少13s-1、至少14s-1、至少15s-1、至少16s-1、至少17s-1、至少18s-1、至少19s-1、至少20s-1、至少21s-1、至少22s-1、至少23s-1、至少24s-1、至少25s-1、至少26s-1、至少27s-1、至少28s-1、至少29s-1、至少30s-1、至少31s-1、至少32s-1、至少33s-1、至少34s-1、至少35s-1、至少36s-1、至少37s-1、至少38s-1、至少39s-1、至少40s-1、至少41s-1、至少42s-1、至少43s-1、至少44s-1、至少45s-1、至少46s-1、至少47s-1、至少48s-1、至少49s-1、至少50s-1、至少51s-1、至少52s-1、至少53s-1、至少54s-1、至少55s-1、至少56s-1、至少57s-1、至少58s-1、至少59s-1、至少60s-1、至少61s-1、至少62s-1、至少63s-1、至少64s-1、至少65s-1、至少66s-1、至少67s-1、至少68s-1、至少69s-1、至少70s-1、至少71s-1、至少72s-1、至少73s-1、至少74s-1、至少75s-1、至少76s-1、至少77s-1、至少78s-1、至少79s-1、至少80s-1、至少81s-1、至少82s-1、至少83s-1、至少84s-1、至少85s-1、至少86s-1、至少87s-1、至少88s-1、至少89s-1、至少90s-1、至少91s-1、至少92s-1、至少93s-1、至少94s-1、至少95s-1、至少96s-1、至少97s-1、至少98s-1、至少99s-1、至少100s-1、至少500s-1、至少1000s-1、至少2000s-1、至少3000s-1、至少4000s-1、至少5000s-1、至少6000s-1、至少7000s-1、至少8000s-1、至少9000s-1、至少10,000s-1。在一些实施方案中,Kcat在1s-1和100s-1之间、在5s-1和50s-1之间或在10s-1和50s-1之间。
在一些实施方案中,本文所述的甲酸脱氢酶的活性被测量为米氏常数(Michaelisconstant)(Km)。在一些实施方案中,Km为小于0.005mM、0.006mM、0.007mM、0.008mM、0.009mM、0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、小于0.2mM、小于0.3mM、小于0.4mM、小于0.5mM、小于0.6mM、小于0.7mM、小于0.8mM、小于0.9mM、小于1mM、小于2mM、小于3mM、小于4mM、小于5mM、小于6mM、小于7mM、小于8mM、小于9mM、小于10mM、小于11mM、小于12mM、小于13mM、小于14mM、小于15mM、小于16mM、小于17mM、小于18mM、小于19mM、小于20mM、小于21mM、小于22mM、小于23mM、小于24mM、小于25mM、小于26mM、小于27mM、小于28mM、小于29mM、小于30mM、小于31mM、小于32mM、小于33mM、小于34mM、小于35mM、小于36mM、小于37mM、小于38mM、小于39mM、小于40mM、小于41mM、小于42mM、小于43mM、小于44mM、小于45mM、小于46mM、小于47mM、小于48mM、小于49mM、小于50mM、小于51mM、小于52mM、小于53mM、小于54mM、小于55mM、小于56mM、小于57mM、小于58mM、小于59mM、小于60mM、小于61mM、小于62mM、小于63mM、小于64mM、小于65mM、小于66mM、小于67mM、小于68mM、小于69mM、小于70mM、小于71mM、小于72mM、小于73mM、小于74mM、小于75mM、小于76mM、小于77mM、小于78mM、小于79mM、小于80mM、小于81mM、小于82mM、小于83mM、小于84mM、小于85mM、小于86mM、小于87mM、小于88mM、小于89mM、小于90mM、小于91mM、小于92mM、小于93mM、小于94mM、小于95mM、小于96mM、小于97mM、小于98mM、小于99mM、小于100mM、小于500mM或小于1000mM。在一些实施方案中,Km在0.005mM和0.010mM之间、在0.5mM和10mM之间、在1mM和10mM之间、在2mM和10mM之间、在3mM和10mM之间、在4mM和10mM之间、在5mM和10mM之间、在6mM和10mM之间、在7mM和10mM之间、在8mM和10mM之间或在9mM和10mM。
在一些实施方案中,本文所述的甲酸脱氢酶的活性被测量为催化效率(kcat/km)。在一些实施方案中,催化效率以升/(毫摩尔*秒)为单位测量。在一些实施方案中,催化效率大于0.1、大于0.2、大于0.3、大于0.4、大于0.5、大于0.6、大于0.7、大于0.8、大于0.9、大于1、大于2、大于3、大于4、大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于11、大于12、大于13、大于14、大于15、大于16、大于17、大于18、大于19、大于20、大于21、大于22、大于23、大于24、大于25、大于26、大于27、大于28、大于29、大于30、大于31、大于32、大于33、大于34、大于35、大于36、大于37、大于38、大于39、大于40、大于41、大于42、大于43、大于44、大于45、大于46、大于47、大于48、大于49、大于50、大于51、大于52、大于53、大于54、大于55、大于56、大于57、大于58、大于59、大于60、大于61、大于62、大于63、大于64、大于65、大于66、大于67、大于68、大于69、大于70、大于71、大于72、大于73、大于74、大于75、大于76、大于77、大于78、大于79、大于80、大于81、大于82、大于83、大于84、大于85、大于86、大于87、大于88、大于89、大于90、大于91、大于92、大于93、大于94、大于95、大于96、大于97、大于98、大于99、大于100、大于500、大于1000。在一些实施方案中,催化效率(kcat/km)在1和30升/(毫摩尔*秒)之间、在5和30升/(毫摩尔*秒)之间、在1和10升/(毫摩尔*秒)之间、在10和30升/(毫摩尔*秒)之间或在20和30升/(毫摩尔*秒)之间。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶是参考多肽的变体,其中所述参考多肽具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列,并且所述工程化甲酸脱氢酶相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在表6和/或表7所述的位置处具有一个或更多个改变。因此,在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶是SEQ ID NO:1的变体,并且相对于SEQID NO:1在表6所述的位置处具有一个或更多个改变。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶是SEQ ID NO:2的变体,并且相对于SEQ ID NO:2在表7所述的位置处具有一个或更多个改变。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有作为SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的变体的氨基酸序列,所述氨基酸序列包含如表6和/或表7所述的一个或更多个改变,其中工程化甲酸脱氢酶中除表6和/或表7所述的一个或更多个改变之外的部分与如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性,或者是相同的。因此,在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表1、3和/或4中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少65%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少70%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少75%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少80%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少85%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少90%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少95%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少98%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1至少99%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少65%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少70%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少75%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少80%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少85%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少90%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少95%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少98%相同。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2至少99%相同。
序列同一性、同源性或相似性是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同一性可以通过比较每个序列中的位置来确定,所述位置可以为了比较的目的而被比对。当所比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时,则分子在该位置上是相同的。序列之间的同源性程度由序列共有的匹配或同源位置的数量确定。多肽或多肽区域(或多核苷酸或多核苷酸区域)与另一个序列具有一定百分比(例如,65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的“序列同一性”意味着,当比对时,所比较的两个序列中有该百分比的氨基酸(或核苷酸碱基)是相同的。比对两个序列以确定它们的百分比序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来完成,例如在Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)中描述的那些软件程序。优选地,比对时使用默认参数。本领域公知的一个可以使用的比对程序是设置为默认参数的BLAST。特别是,程序是BLASTN和BLASTP,使用以下默认参数:遗传密码=标准;过滤器=无;链=双;截止值=60;期望=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50个序列;排序依据=高分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心找到(另见Altschul等人,"J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、100、101、120、121、122、123、124、128、138、143、144、145、146、147、149、150、151、152、153、155、175、176、191、196、198、199、203、204、206、217、218、224、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、315、319、325、329、335、336、338、339、342、343、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、100、101、120、121、122、123、124、128、138、143、144、145、146、147、149、150、151、152、153、155、175、176、191、196、198、199、203、204、206、217、218、224、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、315、319、325、329、335、336、338、339、342、343、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶在SEQ ID NO:1中对应于位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、101、120、122、124、138、144、145、146、147、150、151、155、175、176、191、198、199、204、206、217、218、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、319、325、329、335、336、338、339、342、346、350、355、365、374、381、382或384的位置或其组合处包含一个或更多个氨基酸取代。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、98、199、206、231、266或381或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶在SEQ ID NO:1中对应于位置9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、101、120、122、124、138、144、145、146、147、150、151、155、175、176、191、198、199、204、217、218、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、319、325、329、335、336、338、339、342、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:2中位置36、64、80、91、97、111、120、162、164、187、188、214、229、256、257、260、312、313、315、320、323、361或362或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:2中位置36、64、80、111、120、162、214、229、260、315、320或361或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变,其中所述一个或更多个氨基酸改变是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含相对于表6和/或表7中描述的改变的一个或更多个保守性氨基酸取代。作为非限制性实例,相对于SEQ ID NO:1中的C231A取代保守的氨基酸取代可包括C231取代为另一个非极性(疏水性)氨基酸(例如,Cys(C)、Ala(A)、Val(V)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Met(M)、Trp(W)、Gly(G)或Tyr(Y))。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变,其中所述一个或更多个氨基酸改变是非保守性氨基酸取代。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含在表6中所述的位置处的一个或更多个改变。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含在表7中所述的位置处的一个或更多个改变。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶在表6和/或表7中所示的1至10个氨基酸位置处包含保守性氨基酸取代和/或非保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶还可以在1至50个氨基酸位置、或替选地2至50个氨基酸位置、或替选地3至50个氨基酸位置、或替选地4至50个氨基酸位置、或替选地5至50个氨基酸位置、或替选地6至50个氨基酸位置、或替选地7至50个氨基酸位置、或替选地8至50个氨基酸位置、或替选地9至50个氨基酸位置、或替选地10至50个氨基酸位置、或替选地15至50个氨基酸位置、或替选地20至50个氨基酸位置、或替选地30至50个氨基酸位置、或替选地40至50个氨基酸位置、或替选地45至50个氨基酸位置、或其中的任何整数的氨基酸位置处包含保守性氨基酸取代,其中这些位置不是表6和/或表7中所示的变体氨基酸位置。在某些方面,这种保守性氨基酸序列是化学上保守的或进化上保守的氨基酸取代。鉴定保守氨基酸的方法是本领域技术人员熟知的,其中任何一种都可用于产生本文所述的分离的多肽。
本文提供的工程化甲酸脱氢酶相对于野生型或亲本甲酸脱氢酶可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个改变。本文提供的工程化甲酸脱氢酶相对于野生型或亲本甲酸脱氢酶可包含至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29、至多30、至多31、至多32、至多33、至多34、至多35、至多36、至多37、至多38、至多39、至多40、至多41、至多42、至多43、至多44、至多45、至多46、至多47、至多48、至多49、至多50、至多51、至多52、至多53、至多54、至多55、至多56、至多57、至多58、至多59、至多60、至多61、至多62、至多63、至多64、至多65、至多66、至多67、至多68、至多69、至多70、至多71、至多72、至多73、至多74、至多75、至多76、至多77、至多78、至多79、至多80、至多81、至多82、至多83、至多84、至多85、至多86、至多87、至多88、至多89、至多90、至多91、至多92、至多93、至多94、至多95、至多96、至多97、至多98、至多99、至多100、至多101、至多102、至多103、至多104、至多105、至多106、至多107、至多108、至多109、至多110、至多111、至多112、至多113、至多114、至多115、至多116、至多117、至多118、至多119、至多120、至多121、至多122、至多123、至多124、至多125、至多126、至多127、至多128、至多129、至多130、至多131、至多132、至多133、至多134、至多135、至多136、至多137、至多138、至多139、至多140、至多141、至多142、至多143、至多144、至多145、至多146、至多147、至多148、至多149、至多150、至多151、至多152、至多153、至多154、至多155、至多156、至多157、至多158、至多159、至多160、至多161、至多162、至多163、至多164、至多165、至多166、至多167、至多168、至多169、至多170、至多171、至多172、至多173、至多174、至多175、至多176、至多177、至多178、至多179、至多180、至多181、至多182、至多183、至多184、至多185、至多186、至多187、至多188、至多189、至多190、至多191、至多192、至多193、至多194、至多195、至多196、至多197、至多198、至多199、至多200、至多201、至多202、至多203、至多204、至多205、至多206、至多207、至多208、至多209、至多210、至多211、至多212、至多213、至多214、至多215、至多216、至多217、至多218、至多219、至多220、至多221、至多222、至多223、至多224、至多225、至多226、至多227、至多228、至多229、至多230、至多231、至多232、至多233、至多234、至多235、至多236、至多237、至多238、至多239、至多240、至多241、至多242、至多243、至多244、至多245、至多246、至多247、至多248、至多249或至多250个改变。所述一个或更多个改变可以位于对应于表6和/或表7中描述的一个或更多个位置的一个或更多个位置处。所述一个或更多个改变可以位于对应于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2中的一个或更多个位置的一个或更多个位置处。如本文所用,短语“对应于SEQ ID NO:Y中位置X的残基”是指在两个序列比对之后的对应位置处的残基。例如,SEQ ID NO:2中对应于SEQ ID NO:1中位置231处的C(Cys)的残基是位置203处的A(Ala)(参见例如图2)。在一些实施方案中,参考序列为不是SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的甲酸脱氢酶。
本文提供的工程化甲酸脱氢酶可包含表6和/或表7中所示的改变的任何组合。单独的一种改变或改变的组合可产生工程化甲酸脱氢酶,其相对于参考多肽例如野生型(天然)甲酸脱氢酶保留或改善本文所述的活性。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含表6和/或表7中所示的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个改变,包括多至在表1和/或2中鉴定的所有位置处的改变。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含如表6和/或表7中所示的至少2个改变。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含如表6和/或表7中所示的至少3个改变。在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶包含如表6和/或表7中所示的至少4个改变。
在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶的一个或更多个氨基酸改变是表6中描述的改变。例如,在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,其包含:a)对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;b)对应于SEQ ID NO:1中位置9的残基处的F;c)对应于SEQ ID NO:1中位置16的残基处的Y;d)对应于SEQ ID NO:1中位置19的残基处的K或S;e)对应于SEQ ID NO:1中位置27的残基处的K、E、N、A、T或V;f)对应于SEQ IDNO:1中位置29的残基处的G、E、K、N、D、A、T或S;g)对应于SEQ ID NO:1中位置30的残基处的G、S、A、R或H;h)对应于SEQ ID NO:1中位置41的残基处的K;i)对应于SEQ ID NO:1中位置53的残基处的A;j)对应于SEQ ID NO:1中位置73的残基处的V;k)对应于SEQ ID NO:1中位置97的残基处的I或T;l)对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的W、S、T或R;m)对应于SEQ IDNO:1中位置100的残基处的A;n)对应于SEQ ID NO:1中位置101的残基处的F;o)对应于SEQID NO:1中位置120的残基处的C、G、A、V、H、I、S、F或Q;p)对应于SEQ ID NO:1中位置121的残基处的R;q)对应于SEQ ID NO:1中位置122的残基处的S;r)对应于SEQ ID NO:1中位置123的残基处的A;s)对应于SEQ ID NO:1中位置124的残基处的T、A、V;t)对应于SEQ ID NO:1中位置128的残基处的N、M或S;u)对应于SEQ ID NO:1中位置138的残基处的D;v)对应于SEQID NO:1中位置143的残基处的W或Y;w)对应于SEQ ID NO:1中位置144的残基处的I、C、S、A、N或T;x)对应于SEQ ID NO:1中位置145的残基处的P或S;y)对应于SEQ ID NO:1中位置146的残基处的Q、N、G、P、Y、A、T、D、S、H或V;z)对应于SEQ ID NO:1中位置147的残基处的A、L、V或C;aa)对应于SEQ ID NO:1中位置149的残基处的G、A、T或V;bb)对应于SEQ ID NO:1中位置150的残基处的T、G、R、D、N、S、Q、E、V或L;cc)对应于SEQ ID NO:1中位置151的残基处的A、C或T;dd)对应于SEQ ID NO:1中位置152的残基处的A;ee)对应于SEQ ID NO:1中位置153的残基处的T;ff)对应于SEQ ID NO:1中位置155的残基处的F;gg)对应于SEQ ID NO:1中位置175的残基处的R、I、V、A、T或E;hh)对应于SEQ ID NO:1中位置176的残基处的S;ii)对应于SEQ ID NO:1中位置191的残基处的L;jj)对应于SEQ ID NO:1中位置196的残基处的V;kk)对应于SEQ ID NO:1中位置198的残基处的I;ll)对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;mm)对应于SEQ ID NO:1中位置203的残基处的H;nn)对应于SEQ ID NO:1中位置204的残基处的V;oo)对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q;pp)对应于SEQ ID NO:1中位置217的残基处的V;qq)对应于SEQ ID NO:1中位置218的残基处的T、N、R、A、E、K、G、H、R、D、S或Q;rr)对应于SEQ ID NO:1中位置224的残基处的R;ss)对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的D、A、K、R、V、I、L、T、Y或E;tt)对应于SEQ ID NO:1中位置238的残基处的T、R、V、Q或E;uu)对应于SEQ ID NO:1中位置256的残基处的I、C、L、A、S、H、T、V或E;vv)对应于SEQ ID NO:1中位置262的残基处的E或S;ww)对应于SEQ ID NO:1中位置264的残基处的E;xx)对应于SEQ ID NO:1中位置265的残基处的N或H;yy)对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;zz)对应于SEQ ID NO:1中位置267的残基处的F;aaa)对应于SEQ ID NO:1中位置269的残基处的D或E;bbb)对应于SEQ ID NO:1中位置271的残基处的L或M;ccc)对应于SEQ ID NO:1中位置284的残基处的S、C、M、L、I、V或A;ddd)对应于SEQ ID NO:1中位置285的残基处的S或G;eee)对应于SEQ ID NO:1中位置287的残基处的A;fff)对应于SEQ ID NO:1中位置290的残基处的I;ggg)对应于SEQ ID NO:1中位置291的残基处的D;hhh)对应于SEQ ID NO:1中位置297的残基处的R、V、G、N、D、K、E、A或Q;iii)对应于SEQ ID NO:1中位置301的残基处的S、A、D、E或N;jjj)对应于SEQ ID NO:1中位置303的残基处的K;kkk)对应于SEQ ID NO:1中位置313的残基处的Y;lll)对应于SEQ ID NO:1中位置315的残基处的E或Y;mmm)对应于SEQID NO:1中位置319的残基处的R、P、E、V、A或K;nnn)对应于SEQ ID NO:1中位置325的残基处的T或S;ooo)对应于SEQ ID NO:1中位置329的残基处的H或N;ppp)对应于SEQ ID NO:1中位置335的残基处的A、M、R、V、N、T、L、S或Y;qqq)对应于SEQ ID NO:1中位置336的残基处的A或G;rrr)对应于SEQ ID NO:1中位置338的残基处的Y、F、W、S、D、V、A、L或N;sss)对应于SEQ IDNO:1中位置339的残基处的T、L、G或A;ttt)对应于SEQ ID NO:1中位置342的残基处的K、L、A、V、I、N、Y、T、E、S、M、R、C或D;uuu)对应于SEQ ID NO:1中位置343的残基处的A;vvv)对应于SEQ ID NO:1中位置346的残基处的A、M、I、L或F;www)对应于SEQ ID NO:1中位置350的残基处的A;xxx)对应于SEQ ID NO:1中位置355的残基处的E;yyy)对应于SEQ ID NO:1中位置365的残基处的D、E或P;zzz)对应于SEQ ID NO:1中位置374的残基处的E、G、A、R、H、Q或K;aaaa)对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的H、K、L、P或R;bbbb)对应于SEQ ID NO:1中位置382的残基处的S;和/或cccc)对应于SEQ ID NO:1中位置384的残基处的S或T。
在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,其包含:a)对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;b)对应于SEQ ID NO:1中位置9的残基处的F;c)对应于SEQ ID NO:1中位置16的残基处的Y;d)对应于SEQ ID NO:1中位置19的残基处的K或S;e)对应于SEQ ID NO:1中位置27的残基处的K、E、N、A、T或V;f)对应于SEQ ID NO:1中位置29的残基处的G、E、K、N、D、A、T或S;g)对应于SEQ ID NO:1中位置30的残基处的G、S、A、R或H;h)对应于SEQ ID NO:1中位置41的残基处的K;i)对应于SEQ ID NO:1中位置53的残基处的A;j)对应于SEQ ID NO:1中位置73的残基处的V;k)对应于SEQ ID NO:1中位置97的残基处的I或T;l)对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的W、R或T;m)对应于SEQ ID NO:1中位置101的残基处的F;n)对应于SEQ ID NO:1中位置120的残基处的G、A、H、S、F、Q、C、V或I;o)对应于SEQ ID NO:1中位置122的残基处的S;p)对应于SEQ ID NO:1中位置124的残基处的T、A、V;q)对应于SEQ ID NO:1中位置138的残基处的D;r)对应于SEQ ID NO:1中位置144的残基处的N、I、C、S、A或T;s)对应于SEQ ID NO:1中位置145的残基处的P或S;t)对应于SEQ ID NO:1中位置146的残基处的P、D、V、Q、N、G、Y、A、T、S或H;u)对应于SEQ ID NO:1中位置147的残基处的V、L、C、A;v)对应于SEQ ID NO:1中位置150的残基处的G、R、D、N、S、Q、E、L、T或V;w)对应于SEQ ID NO:1中位置151的残基处的T、A或C;x)对应于SEQ ID NO:1中位置155的残基处的F;y)对应于SEQ ID NO:1中位置175的残基处的R、I、V、A、T或E;z)对应于SEQID NO:1中位置176的残基处的S;aa)对应于SEQ ID NO:1中位置191的残基处的L;bb)对应于SEQ ID NO:1中位置198的残基处的I;cc)对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;dd)对应于SEQ ID NO:1中位置204的残基处的V;ee)对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q;ff)对应于SEQ ID NO:1中位置217的残基处的V;gg)对应于SEQ ID NO:1中位置218的残基处的T、N、R、A、E、K、G、H、D、S或Q;hh)对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的D、A、K、R、V、I、L、T、Y或E;ii)对应于SEQ ID NO:1中位置238的残基处的T、R、V、Q或E;jj)对应于SEQ ID NO:1中位置256的残基处的I、C、L、H、T、V、E、A或S;kk)对应于SEQ ID NO:1中位置262的残基处的E或S;ll)对应于SEQ ID NO:1中位置264的残基处的E;mm)对应于SEQ IDNO:1中位置265的残基处的N或H;nn)对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;oo)对应于SEQ ID NO:1中位置267的残基处的F;pp)对应于SEQ ID NO:1中位置269的残基处的D或E;qq)对应于SEQ ID NO:1中位置271的残基处的L或M;rr)对应于SEQ ID NO:1中位置284的残基处的L、I、V、S、C、M或A;ss)对应于SEQ ID NO:1中位置285的残基处的S或G;tt)对应于SEQ ID NO:1中位置287的残基处的A;uu)对应于SEQ ID NO:1中位置290的残基处的I;vv)对应于SEQ ID NO:1中位置291的残基处的D;ww)对应于SEQ ID NO:1中位置297的残基处的R、V、G、N、D、K、E、A或Q;xx)对应于SEQ ID NO:1中位置301的残基处的S、A、D、E或N;yy)对应于SEQ ID NO:1中位置303的残基处的K;zz)对应于SEQ ID NO:1中位置313的残基处的Y;aaa)对应于SEQ ID NO:1中位置319的残基处的R、P、E、V、A或K;bbb)对应于SEQ ID NO:1中位置325的残基处的T或S;ccc)对应于SEQ ID NO:1中位置329的残基处的H或N;ddd)对应于SEQ ID NO:1中位置335的残基处的R、S、A、M、V、N、T、L或Y;eee)对应于SEQ ID NO:1中位置336的残基处的A或G;fff)对应于SEQ ID NO:1中位置338的残基处的Y、F、W、L、S、D、V、A或N;ggg)对应于SEQ ID NO:1中位置339的残基处的L、G、A、T;hhh)对应于SEQ ID NO:1中位置342的残基处的K、L、V、I、N、Y、T、E、M、R、D、A、S或C;iii)对应于SEQ ID NO:1中位置346的残基处的M、A、I、L或F;jjj)对应于SEQ ID NO:1中位置350的残基处的A;kkk)对应于SEQ IDNO:1中位置355的残基处的E;lll)对应于SEQ ID NO:1中位置365的残基处的D、E或P;mmm)对应于SEQ ID NO:1中位置374的残基处的E、G、A、R、H、Q或K;nnn)对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的P、H、K、L或R;ooo)对应于SEQ ID NO:1中位置382的残基处的S;和/或ppp)对应于SEQ ID NO:1中位置384的残基处的S或T。
在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含:a)对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;b)对应于SEQ ID NO:1中位置9的残基处的F;c)对应于SEQ ID NO:1中位置16的残基处的Y;d)对应于SEQ ID NO:1中位置19的残基处的K或S;e)对应于SEQ ID NO:1中位置27的残基处的K、E、N、A、T或V;f)对应于SEQ ID NO:1中位置29的残基处的G、E、K、N、D、A、T或S;g)对应于SEQ ID NO:1中位置30的残基处的G、S、A、R或H;h)对应于SEQ ID NO:1中位置41的残基处的K;i)对应于SEQ IDNO:1中位置53的残基处的A;j)对应于SEQ ID NO:1中位置73的残基处的V;k)对应于SEQ IDNO:1中位置97的残基处的I或T;l)对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的S或T;m)对应于SEQ ID NO:1中位置101的残基处的F;n)对应于SEQ ID NO:1中位置120的残基处的C、V或I;o)对应于SEQ ID NO:1中位置122的残基处的S;p)对应于SEQ ID NO:1中位置124的残基处的V;q)对应于SEQ ID NO:1中位置138的残基处的D;r)对应于SEQ ID NO:1中位置144的残基处的I、C、S、A或T;s)对应于SEQ ID NO:1中位置145的残基处的S;t)对应于SEQ ID NO:1中位置146的残基处的Q、N、G、Y、A、T、S或H;u)对应于SEQ ID NO:1中位置147的残基处的A;v)对应于SEQ ID NO:1中位置150的残基处的T或V;w)对应于SEQ ID NO:1中位置151的残基处的A或C;x)对应于SEQ ID NO:1中位置155的残基处的F;y)对应于SEQ ID NO:1中位置175的残基处的R、I、V、A、T或E;z)对应于SEQ ID NO:1中位置176的残基处的S;aa)对应于SEQID NO:1中位置191的残基处的L;bb)对应于SEQ ID NO:1中位置198的残基处的I;cc)对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;dd)对应于SEQ ID NO:1中位置204的残基处的V;ee)对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q;ff)对应于SEQ ID NO:1中位置217的残基处的V;gg)对应于SEQ ID NO:1中位置218的残基处的T、N、R、A、E、K、G、H、D、S或Q;hh)对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的D、A、K、R、V、I、L、T、Y或E;ii)对应于SEQ ID NO:1中位置238的残基处的T、R、V、Q或E;jj)对应于SEQ ID NO:1中位置256的残基处的A或S;kk)对应于SEQ ID NO:1中位置262的残基处的E或S;ll)对应于SEQ ID NO:1中位置264的残基处的E;mm)对应于SEQ ID NO:1中位置265的残基处的N或H;nn)对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;oo)对应于SEQ ID NO:1中位置267的残基处的F;pp)对应于SEQ ID NO:1中位置269的残基处的D或E;qq)对应于SEQ ID NO:1中位置271的残基处的L或M;rr)对应于SEQ ID NO:1中位置284的残基处的S、C、M或A;ss)对应于SEQ ID NO:1中位置285的残基处的G;tt)对应于SEQ ID NO:1中位置287的残基处的A;uu)对应于SEQ ID NO:1中位置290的残基处的I;vv)对应于SEQ ID NO:1中位置291的残基处的D;ww)对应于SEQ ID NO:1中位置297的残基处的R、V、G、N、D、K、E、A或Q;xx)对应于SEQ ID NO:1中位置301的残基处的S、A、D、E或N;yy)对应于SEQ ID NO:1中位置303的残基处的K;zz)对应于SEQ ID NO:1中位置313的残基处的Y;aaa)对应于SEQ ID NO:1中位置319的残基处的R、P、E、V、A或K;bbb)对应于SEQID NO:1中位置325的残基处的T或S;ccc)对应于SEQ ID NO:1中位置329的残基处的H或N;ddd)对应于SEQ ID NO:1中位置335的残基处的S、A、M、V、N、T、L或Y;eee)对应于SEQ ID NO:1中位置336的残基处的A或G;fff)对应于SEQ ID NO:1中位置338的残基处的S、D、V、A或N;ggg)对应于SEQ ID NO:1中位置339的残基处的T;hhh)对应于SEQ ID NO:1中位置342的残基处的A、S或C;iii)对应于SEQ ID NO:1中位置346的残基处的I、L或F;jjj)对应于SEQ IDNO:1中位置350的残基处的A;kkk)对应于SEQ ID NO:1中位置355的残基处的E;lll)对应于SEQ ID NO:1中位置365的残基处的D、E或P;mmm)对应于SEQ ID NO:1中位置374的残基处的E、G、A、R、H、Q或K;nnn)对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的H、K、L或R;ooo)对应于SEQID NO:1中位置382的残基处的S;和/或ppp)对应于SEQ ID NO:1中位置384的残基处的S或T。
在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含:a)对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;b)对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的T;c)对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;d)对应于SEQID NO:1中位置206的残基处的Q;e)对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的A、K、R、T、E、Y、V、I或L;f)对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;和/或g)对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的P、K、L、R或H。
在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含a)对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;b)对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的T;c)对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;d)对应于SEQ IDNO:1中位置206的残基处的Q;e)对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的V、I或L;f)对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;和/或g)对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的H。
在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶的一个或更多个氨基酸改变是表7中描述的改变。例如,在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变导致工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含:a)对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K;b)对应于SEQID NO:2中位置64的残基处的V;c)对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E;d)对应于SEQID NO:2中位置91的残基处的S;e)对应于SEQ ID NO:2中位置97的残基处的N;f)对应于SEQID NO:2中位置111的残基处的T;g)对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I;h)对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L;i)对应于SEQ ID NO:2中位置164的残基处的V;j)对应于SEQ ID NO:2中位置187的残基处的G;k)对应于SEQ ID NO:2中位置188的残基处的C;l)对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T;m)对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的V、T或C;n)对应于SEQ ID NO:2中位置256的残基处的C;o)对应于SEQ ID NO:2中位置257的残基处的G或S;p)对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;q)对应于SEQ ID NO:2中位置312的残基处的V、F或T;r)对应于SEQ ID NO:2中位置313的残基处的G或A;s)对应于SEQ ID NO:2中位置315的残基处的C或S;t)对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的T或S;u)对应于SEQ ID NO:2中位置323的残基处的M;v)对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;和/或w)对应于SEQ ID NO:2中位置362的残基处的K。
在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含:a)对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K;b)对应于SEQ IDNO:2中位置64的残基处的V;c)对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E;d)对应于SEQ IDNO:2中位置91的残基处的S;e)对应于SEQ ID NO:2中位置97的残基处的N;f)对应于SEQ IDNO:2中位置111的残基处的T;g)对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I;h)对应于SEQID NO:2中位置162的残基处的L;i)对应于SEQ ID NO:2中位置164的残基处的V;j)对应于SEQ ID NO:2中位置187的残基处的G;k)对应于SEQ ID NO:2中位置188的残基处的C;l)对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T;m)对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的T或C;n)对应于SEQ ID NO:2中位置256的残基处的C;o)对应于SEQ ID NO:2中位置257的残基处的G或S;p)对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;q)对应于SEQ ID NO:2中位置312的残基处的V、F或T;r)对应于SEQ ID NO:2中位置313的残基处的G或A;s)对应于SEQ IDNO:2中位置315的残基处的C;t)对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的S;u)对应于SEQID NO:2中位置323的残基处的M;v)对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;和/或w)对应于SEQ ID NO:2中位置362的残基处的K。
在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含:a)对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K;b)对应于SEQ IDNO:2中位置64的残基处的V;c)对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E;d)对应于SEQ IDNO:2中位置111的残基处的T;e)对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I;f)对应于SEQID NO:2中位置162的残基处的L;g)对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T;h)对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的V、T或C;i)对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;j)对应于SEQ ID NO:2中位置315的残基处的C或S;k)对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的T或S;和/或l)对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R。
在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含:a)对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K;b)对应于SEQ IDNO:2中位置64的残基处的V;c)对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E;d)对应于SEQ IDNO:2中位置111的残基处的T;e)对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I;f)对应于SEQID NO:2中位置162的残基处的L;g)对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T;h)对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的T或C;i)对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;j)对应于SEQ ID NO:2中位置315的残基处的C;k)对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的S;和/或l)对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R。
在一些实施方案中,所述一个或更多个氨基酸改变产生工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含:a)对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的H;b)对应于SEQ IDNO:1中位置206的残基处的Q和对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的I;c)对应于SEQID NO:1中位置199的残基处的I;d)对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q和对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的V;e)对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I和对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的L;f)对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q和对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的L;g)对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;h)对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的T;i)对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的V和对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M;j)对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;k)对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;l)对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;m)对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;n)对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K、对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L、对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;o)对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;p)对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I和对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的S;q)对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;r)对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L;s)对应于SEQ IDNO:2中位置111的残基处的T、对应于SEQ ID NO:2中位置162残基处的L和对应于SEQ IDNO:2中位置361的残基处的R;t)对应于SEQ ID NO:2中位置64的残基处的V、对应于SEQ IDNO:2中位置162的残基处的L、对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T和对应于SEQ IDNO:2中位置361的残基处的R;或u)对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的C和对应于SEQID NO:2中位置315的残基处的C。
在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶的一个或更多个改变不会得到与SEQ IDNO:24相同的氨基酸序列。因此,在一些实施方案中,本文所述的工程化甲酸脱氢酶的氨基酸序列不由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。然而,在一些实施方案中,工程化甲酸脱氢酶是如表1所述的SEQ ID NO:1和2的同源物的变体,包括SEQ ID NO:3-24。此类工程化甲酸脱氢酶包含在对应于表6和/或表7中所述位置的位置处的一个或更多个改变。
产生和测定本文所述的工程化甲酸脱氢酶的方法是本领域技术人员熟知的。这些方法的实例在实施例1-8中描述。多种方法中的任何一种都可以用于产生本文公开的工程化甲酸脱氢酶。此类方法包括但不限于定点诱变、随机诱变、组合文库和本文所述的其他诱变方法(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,ColdSpring Harbor Laboratory,New York(2001);Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999);Gillman等人,DirectedEvolution Library Creation:Methods and Protocols(Methods in MolecularBiology)Springer,第2版(2014))。在一个非限制性实例中,本领域技术人员还能够使用SEQ ID NO:1和2的同源物产生本文所述的工程化甲酸脱氢酶,例如SEQ ID NO:3-24,所述工程化甲酸脱氢酶在与表6和/或表7中所述的位置对应的位置处具有一个或更多个改变,产生方法是用本文所述的比对程序执行靶序列的序列比对,使用定点诱变试剂盒(例如QuikChange(Agilent,Santa Clara,CA)、定点诱变试剂盒(New England BioLabs,Ipswich,MA)或QuikChange HT蛋白工程系统(Agilent,Santa Clara,CA))产生期望的改变,用DNA测序验证新突变体,然后利用裂解物或利用期望的生物衍生化合物途径的体内生产测定来验证新突变体,如实施例1-8中所述。用于制备工程化甲酸脱氢酶的方法的一个非限制性实例是使用本领域公知的方法在合适的微生物生物体(诸如细菌细胞、酵母细胞或其他合适的细胞)中表达编码工程化甲酸脱氢酶的重组核酸。
在一些实施方案中,本文提供的工程化甲酸脱氢酶是分离的甲酸脱氢酶。本文提供的分离的工程化甲酸脱氢酶可以通过本领域公知的多种方法分离,例如重组表达系统、沉淀、凝胶过滤、离子交换、反相和亲和色谱(reverse-phase and affinitychromatography)等。其他公知的方法描述于Deutscher等人,Guide to ProteinPurification:Methods in Enzymology,第182卷,(Academic Press,(1990))。可替选地,本公开的分离的多肽可以使用熟知的重组方法获得(参见例如Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001);和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley andSons,Baltimore,MD(1999))。本文所述多肽的生物化学纯化的方法和条件可由本领域技术人员选择,并且例如通过功能测定监测纯化。
在一些实施方案中,本文提供一种具有编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的核苷酸序列的重组核酸。因此,在一些实施方案中,本文提供一种选自以下的重组核酸:(a)编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的变体的工程化甲酸脱氢酶的核酸分子,其中所述工程化甲酸脱氢酶包含在表1和/或2中所述的位置处的一个或更多个改变;(b)在高度严格的杂交条件下与(a)的分离核酸杂交的重组核酸;和(c)与(a)或(b)互补的重组核酸。
在一些实施方案中,本文提供一种编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的变体的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸,其中所述工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变。在一些实施方案中,重组核酸编码包含在表6中所述的位置处的一个或更多个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含在表7中所述的位置处的一个或更多个改变的工程化甲酸脱氢酶。
在一些实施方案中,本文提供一种在高度严格的杂交条件下与编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的分离核酸杂交的重组核酸。因此,在一些实施方案中,重组核酸是在高度严格的杂交条件下与编码工程化甲酸脱氢酶的核酸杂交的分离核酸,所述工程化甲酸脱氢酶包含在表6中描述的位置处的一个或更多个改变。在一些实施方案中,重组核酸分子是在高度严格的杂交条件下与编码工程化甲酸脱氢酶的核酸杂交的分离核酸,所述工程化甲酸脱氢酶包含在表7中描述的位置处的一个或更多个改变。
在一些实施方案中,本文提供一种编码工程化甲酸脱氢酶的重组核酸,所述工程化甲酸脱氢酶包含作为SEQ ID NO:1或2的变体的氨基酸序列,所述氨基酸序列包含如表6和/或表7中所述的一个或更多个改变,其中工程化甲酸脱氢酶中除表6和/或表7所述的改变之外的部分与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性,或者是相同的。因此,在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少65%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少70%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少75%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少80%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少85%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少90%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少95%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表6中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表6中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:1具有至少99%的同一性。
在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2具有至少65%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQ IDNO:2具有至少70%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸分子编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2具有至少75%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2具有至少80%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2具有至少85%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2具有至少90%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQID NO:2具有至少95%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶具有包含如表7中所述的一个或更多个改变的氨基酸序列,并且工程化甲酸脱氢酶中除表7中所述的改变之外的部分与SEQ ID NO:2具有至少99%的同一性。
在一些实施方案中,重组核酸编码包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中,重组核酸编码包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变是非保守性氨基酸取代。在一些实施方案中,重组核酸编码包含在表6中所述的位置处的一个或更多个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含在表7中所述的位置处的一个或更多个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码在表6和/或表7中所示的1至10个氨基酸位置处包含保守性氨基酸取代和/或非保守性氨基酸取代的工程化甲酸脱氢酶。
在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶在1至50个氨基酸位置、或替选地2至50个氨基酸位置、或替选地3至50个氨基酸位置、或替选地4至50个氨基酸位置、或替选地5至50个氨基酸位置、或替选地6至50个氨基酸位置、或替选地7至50个氨基酸位置、或替选地8至50个氨基酸位置、或替选地9至50个氨基酸位置、或替选地10至50个氨基酸位置、或替选地15至50个氨基酸位置、或替选地20至50个氨基酸位置、或替选地30至50个氨基酸位置、或替选地40至50个氨基酸位置、或替选地45至50个氨基酸位置、或其中的任何整数的氨基酸位置处包含保守性氨基酸取代,其中这些位置不是表6和/或表7中所示的变体氨基酸位置。在某些方面,此类保守性氨基酸序列是化学上保守的或进化上保守的氨基酸取代。鉴定保守氨基酸的方法是本领域技术人员熟知的,其中任何一种都可用于产生本文所述的分离的多肽。
本文提供的重组核酸可编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含表6和/或表7中所示的改变的任何组合。单独的一种改变或改变的组合可产生工程化甲酸脱氢酶,其相对于参考多肽例如野生型(天然)甲酸脱氢酶保留或改善本文所述的活性。在一些实施方案中,重组核酸编码工程化甲酸脱氢酶,所述工程化甲酸脱氢酶包含如表1、2、3和/或4中所示的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个改变,包括多至在表6和/或表7中鉴定的所有位置处的改变。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少2个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少3个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少4个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少5个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少6个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少7个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少8个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少9个改变的工程化甲酸脱氢酶。在一些实施方案中,重组核酸编码包含如表6和/或表7中所示的至少10个改变的工程化甲酸脱氢酶。
在一些实施方案中,本文提供一种包含编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的核苷酸序列的重组核酸,所述核苷酸序列与启动子可操作地连接。这种启动子可以在如本文所述的微生物生物体中表达工程化甲酸脱氢酶。
在一些实施方案中,本文提供一种包含本文所述的重组核酸的载体。在一些实施方案中,载体是表达载体。在一些实施方案中,载体包含双链DNA。
编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸还包括与本文公开的核酸杂交的核酸或与编码公开的氨基酸序列的核酸杂交的核酸。杂交条件可包括本领域技术人员熟知的高度严格、中度严格或低度严格的杂交条件,诸如本文所述的那些。类似地,可用于本文所述的组合物和方法中的重组核酸可被描述为与本文公开的核酸或与编码本文公开的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸具有一定百分比的序列同一性。例如,核酸可与本文所述的核苷酸具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,或者是相同的。
严格杂交是指杂交多核苷酸稳定的条件。如本领域技术人员所知,杂交多核苷酸的稳定性由杂交体的解链温度(Tm)反映。一般来说,杂交多核苷酸的稳定性是盐浓度(例如钠离子浓度)和温度的函数。杂交反应可以在较低严格度的条件下进行,然后进行不同但更高严格度的洗涤。提及杂交严格性涉及此类洗涤条件。高度严格的杂交包括仅允许那些在65℃在0.018M NaCl中形成稳定的杂交多核苷酸的核苷酸序列的杂交的条件,例如,如果杂交体在65℃在0.018M NaCl中不稳定,则其在如本文所设想的高严格条件下将不稳定。例如,通过在50%甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2% SDS中在42℃杂交,然后在0.1×SSPE和0.1% SDS中在65℃洗涤,可以提供高度严格的条件。除高度严格的杂交条件之外的杂交条件也可用于描述本文公开的核苷酸序列。例如,短语中等严格杂交是指等同于在42℃在50%甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2% SDS中杂交,然后在42℃在0.2×SSPE、0.2% SDS中洗涤的条件。短语低严格杂交是指等同于在22℃在10%甲酰胺、5×Denhart溶液、6×SSPE、0.2% SDS中杂交,然后在37℃在1×SSPE、0.2% SDS中洗涤的条件。Denhart溶液含有1% Ficoll、1%聚乙烯吡咯烷酮和1%牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M EDTA。其他合适的低、中等和高严格度杂交缓冲液和条件是本领域技术人员熟知的,并且描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001);和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。
编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸可以与本文公开的核苷酸序列具有至少一定的序列同一性。因此,在本文所述的一些方面,编码工程化甲酸脱氢酶的重组核酸具有的核苷酸序列与本文公开的核酸或与编码本文公开的氨基酸序列的核酸杂交的核酸具有至少65%的同一性、至少70%的同一性、至少75%的同一性、至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、至少91%的同一性、至少92%的同一性、至少93%的同一性、至少94%的同一性、至少95%的同一性、至少96%的同一性、至少97%的同一性、至少98%的同一性或至少99%的同一性,或者是相同的。
应理解,本文所述的重组核酸或本文所述的工程化甲酸脱氢酶可排除野生型亲本序列,例如亲本序列,例如SEQ ID NO:1或2。本领域技术人员将基于本领域熟知的内容容易地理解亲本野生型序列的含义。还应理解,本文所述的这种重组核酸可以排除编码在自然界中发现的天然存在的氨基酸序列的核苷酸序列。类似地,本文所述的工程化甲酸脱氢酶可以排除在自然界中发现的氨基酸序列。因此,在一些实施方案中,本文所述的重组核酸或工程化甲酸脱氢酶如本文所示,条件是编码的氨基酸序列不是野生型亲本序列或天然存在的氨基酸序列和/或核苷酸序列不是野生型或天然存在的核苷酸序列。天然存在的氨基酸或核苷酸序列被本领域技术人员理解为与在自然界中发现的天然存在的生物体中发现的序列有关。因此,在本文所述的重组核苷酸和/或氨基酸序列的含义内包括未被发现与在天然存在的生物体中处于相同状态或具有相同的核苷酸或编码氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。例如,在来自亲本序列的一个或更多个核苷酸或氨基酸位置处已被改变的核苷酸或氨基酸序列(包括如本文所述的变体)包括在本文所述的非天然存在的核苷酸或氨基酸序列的含义内。本文所述的重组核酸排除含有所述核苷酸序列的天然存在的染色体,并且可以进一步排除在天然存在的细胞中发现的其他分子,例如DNA结合蛋白,例如与真核细胞内的染色体结合的蛋白质,例如组蛋白。
因此,本文所述的重组核酸与天然存在的核酸相比具有物理和化学差异。本文所述的重组或非天然存在的核酸不含有或不一定具有自然界中发现的天然存在的核酸的一些或全部化学键,无论是共价键还是非共价键。因此,本文所述的重组核酸与天然存在的核酸不同,例如,其化学结构不同于染色体中发现的天然存在的核酸。例如,通过裂解从天然存在的染色体释放重组核酸的磷酸二酯键,可以产生不同的化学结构。本文所述的重组核酸还可以通过从与原核或真核细胞中的染色体DNA结合的蛋白质分离或隔离核酸而与天然存在的核酸区分,从而通过不同的非共价键而与天然存在的核酸区分。关于原核来源的核酸,本文所述的非天然存在的核酸不一定具有染色体的天然存在的化学键中的一些或全部,例如与DNA结合蛋白如聚合酶或染色体结构蛋白的结合,或者不具有更高阶结构如超螺旋。关于真核来源的核酸,本文所述的非天然存在的核酸也不含有在染色质中发现的相同的内部核酸化学键或与结构蛋白的化学键。例如,本文所述的非天然存在的核酸不与组蛋白或支架蛋白化学键合,并且不包含在着丝粒或端粒中。因此,本文所述的非天然存在的核酸在化学上不同于天然存在的核酸,因为它们缺乏或含有与自然界中发现的核酸不同的范德华相互作用、氢键、离子或静电键和/或共价键。这种键的差异可以发生在核酸的独立区域内部(即顺式(cis)),或者这种键的差异可以反式(in trans)发生在例如与染色体蛋白的相互作用中。在真核来源的核酸的情况下,cDNA被认为是重组或非天然存在的核酸,因为cDNA内的化学键不同于染色体DNA上的基因的共价键,即序列。因此,本领域技术人员应理解,重组或非天然存在的核酸不同于天然存在的核酸。
在一些实施方案中,本文提供一种构建宿主菌株的方法,所述方法除其他步骤外可包括将本文公开的载体引入微生物生物体,例如能够表达由载体编码的氨基酸序列和/或能够发酵的微生物生物体。可以使用本领域熟知的技术将本文所述的载体稳定地或瞬时地引入微生物生物体,所述技术包括但不限于接合(conjugation)、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化。本文公开了其他方法,其中任何一种都可用于本文所述的方法中。
在一些实施方案中,本文提供一种微生物生物体,特别是非天然存在的微生物生物体,其包含本文所述的多肽,即本文所述的工程化甲酸脱氢酶。因此,本文提供一种非天然存在的微生物生物体,其具有编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸。因此,在一些实施方案中,本文提供微生物生物体(例如,宿主微生物生物体),其包含编码工程化甲酸脱氢酶的重组多核苷酸,其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、100、101、120、121、122、123、124、128、138、143、144、145、146、147、149、150、151、152、153、155、175、176、191、196、198、199、203、204、206、217、218、224、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、315、319、325、329、335、336、338、339、342、343、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸改变。在一些实施方案中,本文提供微生物生物体(例如宿主微生物生物体),其包含编码工程化甲酸脱氢酶的重组多核苷酸,其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:2中位置36、64、80、91、97、111、120、162、164、187、188、214、229、256、257、260、312、313、315、320、323、361或362或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸改变。
任选地,非天然存在的微生物生物体可以包含一种或更多种外源核酸,其编码一种或更多种用于将NADH转化为NADPH的酶。因此,在一些实施方案中,非天然存在的微生物生物体可以包含编码能够催化NADH转化为NADPH的转氢酶的外源核酸。此类转氢酶包括NAD(P)+转氢酶(EC1.6.1.1-Si特异性;和EC 1.6.1.2-Re/Si特异性)。非限制性示例性转氢酶包括由pntB_2基因(UniProtKB A0A377CI53)编码的大肠杆菌的NAD(P)转氢酶亚基β、由pntAb基因(UniProtKB P96833)编码的结核分枝杆菌(菌株ATCC 25618/H37Rv)的质子转运NAD(P)(+)转氢酶、由pntAB基因(UniProtKB P0C187)编码的深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)的NAD(P)转氢酶亚基α部分2、由pntAA基因(UniProtKB Q83AE6)编码的贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)(菌株RSA 493/Nine Mile phase I)的NAD(P)转氢酶α亚基、由sthA基因(UniProtKB P27306)编码的大肠杆菌(菌株K12)的可溶性吡啶核苷酸转氢酶、以及由sthA基因(UniProtKB O05139)编码的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的可溶性吡啶核苷酸转氢酶。在一些实施方案中,将一种或更多种编码转氢酶的外源核酸包含在内提供了由本文所述的工程化甲酸脱氢酶产生的NADH向NADPH的转化,其可用作生产本文所述的生物衍生化合物的辅因子。可替选地或另外地,可以依赖存在于非天然存在的微生物生物体中的内源性转氢酶将由本文所述的工程化甲酸脱氢酶产生的增加量的NADH转化为增加量的NADPH。在一些实施方案中,外源核酸是异源的。在一些实施方案中,外源核酸是同源的。
在一些实施方案中,本文提供一种如本文所述的非天然存在的微生物生物体,其还包含能够生产如本文所述的生物衍生化合物的途径。在一些实施方案中,这种途径将直接或间接地受益于辅因子的生产,例如由本文所述的工程化甲酸脱氢酶生产的NADH。将直接受益于辅因子生产的能够生产如本文所述的生物衍生化合物的途径包括,例如,其中的一种或更多种酶在被催化的酶促反应中依赖于NADH作为辅因子的途径。将间接受益于辅因子生产的能够生产如本文所述的生物衍生化合物的途径包括,例如,其中一种或更多种酶在被催化的酶促反应中依赖于NADPH作为辅因子的途径,其中NADPH通过如本文所述的转氢酶将NADH转化为NADPH而产生。此外,由于NADH在微生物分解代谢和细胞生长中通常很重要,因此包含能够生产生物衍生化合物的途径的非天然存在的微生物生物体即便不包含依赖于NADH或NADPH作为辅因子的酶,仍然可以间接受益于微生物分解代谢和细胞生长的改善。在一些实施方案中,生物衍生化合物是醇、二元醇、有机酸、烯烃、二烯烃、有机胺、有机醛、维生素、保健品或药物。
在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产如本文所述的醇的途径。因此,在一些实施方案中,醇选自:(i)生物燃料醇,其中所述生物燃料是包含C3至C10碳原子的伯醇、仲醇、二醇或三醇;(ii)正丙醇或异丙醇;和(iii)脂肪醇,其中所述脂肪醇包含C4至C27碳原子、C8至C18碳原子、C12至C18碳原子或C12至C14碳原子。在一些方面,生物燃料醇选自1-丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、1-戊醇、异戊烯醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、1-庚醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-己醇。
在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产二醇的途径。因此,在一些实施方案中,二醇是丙二醇或丁二醇。在一些方面,丁二醇是1,4-丁二醇、1,3-丁二醇或2,3-丁二醇。
在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产选自以下的生物衍生化合物的途径:(i)1,4-丁二醇或其中间体,其中所述中间体任选地为4-羟基丁酸(4-HB);(ii)丁二烯(1,3-丁二烯)或其中间体,其中所述中间体任选地为1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)或3-丁烯-1-醇;(iii)1,3-丁二醇或其中间体,其中所述中间体任选地为3-羟基丁酸酯/盐(3-HB)、2,4-戊二烯酸酯/盐、巴豆醇或3-丁烯-1-醇;(iv)己二酸酯/盐、6-氨基己酸、己内酰胺、己二胺、乙酰丙酸或其中间体,其中所述中间体任选地为己二酰辅酶A或4-氨基丁酰辅酶A;(v)甲基丙烯酸或其酯、3-羟基异丁酸酯/盐、2-羟基异丁酸酯/盐或其中间体,其中所述酯任选地为甲基丙烯酸甲酯或聚(甲基丙烯酸甲酯);(vi)1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、二丙二醇、三丙二醇、新戊二醇、双酚A或其中间体;(vii)琥珀酸或其中间体;和(viii)包含C4至C27碳原子、C8至C18碳原子、C12至C18碳原子或C12至C14碳原子的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸,其中所述脂肪醇任选地为十二烷醇(C12;月桂醇)、十三烷醇(C13;1-十三醇、十三醇、异十三醇)、肉豆蔻醇(C14;1-十四醇)、十五烷醇(C15;1-十五醇、十五醇)、鲸蜡醇(C16;1-十六醇)、十七烷醇(C17;1-正十七醇、十七醇)和硬脂醇(C18;1-十八醇)或棕榈油醇(C16不饱和;顺式-9-十六碳烯-1-醇)。因此,在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产1,4-丁二醇或其中间体的途径,其中所述中间体任选地为4-羟基丁酸(4-HB)。在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产丁二烯(1,3-丁二烯)或其中间体的途径,其中所述中间体任选地为1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)或3-丁烯-1-醇。在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产1,3-丁二醇或其中间体的途径,其中所述中间体任选地为3-羟基丁酸酯/盐(3-HB)、2,4-戊二烯酸酯/盐、巴豆醇或3-丁烯-1-醇。在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产己二酸酯/盐、6-氨基己酸、己内酰胺、己二胺、乙酰丙酸或其中间体的途径,其中所述中间体任选地为己二酰辅酶A或4-氨基丁酰辅酶A。在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产甲基丙烯酸或其酯、3-羟基异丁酸酯/盐、2-羟基异丁酸酯/盐或其中间体的途径,其中所述酯任选地为甲基丙烯酸甲酯或聚(甲基丙烯酸甲酯)。在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、二丙二醇、三丙二醇、新戊二醇、双酚A或其中间体的途径。在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含生产琥珀酸或其中间体的途径。在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体包含用于生产包含C4至C27碳原子、C8至C18碳原子、C12至C18碳原子或C12至C14碳原子的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的途径,其中所述脂肪醇任选地为十二烷醇(C12;月桂醇)、十三烷醇(C13;1-十三醇、十三醇、异十三醇)、肉豆蔻醇(C14;1-十四醇)、十五烷醇(C15;1-十五醇、十五醇)、鲸蜡醇(C16;1-十六醇)、十七烷醇(C17;1-正十七醇、十七醇)和硬脂醇(C18;1-十八醇)或棕榈油醇(C16不饱和;顺式-9-十六碳烯-1-醇)。
1,4-丁二醇及其中间体,如4-羟基丁酸(4-羟基丁酸酯/盐、4-羟丁酸酯/盐、4-HB),是可以通过本文和以下出版物中描述的酶促途径制备的生物衍生化合物。合适的生物衍生化合物途径和酶、筛选方法和分离方法可见于:2008年9月25日公布的WO2008115840A2,标题为“用于1,4-丁二醇及其前体的生物合成的组合物和方法(Compositions and Methods for the Biosynthesis of 1,4-Butanediol and ItsPrecursors)”;2010年12月9日公布的WO2010141780A1,标题为“分离发酵液的组分的方法(Process of Separating Components of A Fermentation Broth)”;2010年12月9日公布的WO2010141920A2,标题为“用于生产1,4-丁二醇的微生物和相关方法(Microorganismsfor the Production of 1,4-Butanediol and Related Methods)”;2010年3月18日公布的WO2010030711A2,标题为“用于生产1,4-丁二醇的微生物(Microorganisms for theProduction of 1,4-Butanediol)”;2010年6月24日公布的WO2010071697A1,标题为“用于将合成气和其他碳源转化为有用产品的微生物和方法(Microorganisms and Methods forConversion of Syngas and Other Carbon Sources to Useful Products)”;2009年7月30日公布的WO2009094485A1,标题为“用于利用合成气或其他气态碳源和甲醇的方法和生物体(Methods and Organisms for Utilizing Synthesis Gas or Other GaseousCarbon Sources and Methanol)”;2009年2月19日公布的WO2009023493A1,标题为“用于1,4-丁二醇的生长偶联生产的方法和生物体(Methods and Organisms for the Growth-Coupled Production of 1,4-Butanediol)”;以及2008年9月25日公布的WO2008115840A2,标题为“用于1,4-丁二醇及其前体的生物合成的组合物和方法(Compositions andMethods for the Biosynthesis of 1,4-Butanediol and Its Precursors)”,它们均通过引用并入本文。
丁二烯及其中间体,如1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、1,3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)和3-丁烯-1-醇,是能够通过本文和以下出版物中描述的酶促途径制备的生物衍生化合物。除了直接发酵生产丁二烯之外,1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)或3-丁烯-1-醇可以被分离、纯化(用于任何用途),然后通过金属基催化被化学脱水成丁二烯。合适的生物衍生化合物途径和酶、筛选方法和分离方法可见于:2011年11月10日公布的WO2011140171A2,标题为“用于丁二烯的生物合成的微生物和方法(Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Butadiene)”;2012年2月9日公布的WO2012018624A2,标题为“用于芳香族化合物、2,4-戊二烯酸酯和1,3-丁二烯的生物合成的微生物和方法(Microorganisms and Methods for the Biosynthesis ofAromatics,2,4-Pentadienoate and 1,3-Butadiene)”;2011年11月10日公布的WO2011140171A2,标题为“用于丁二烯的生物合成的微生物和方法(Microorganisms andMethods for the Biosynthesis of Butadiene)”;2013年3月21日公布的WO2013040383A1,标题为“用于生产烯烃的微生物和方法(Microorganisms and Methodsfor Producing Alkenes)”;2012年12月27日公布的WO2012177710A1,标题为“用于生产丁二烯的微生物及其相关方法(Microorganisms for Producing Butadiene and MethodsRelated thereto)”;2012年8月9日公布的WO2012106516A1,标题为“用于丁二烯的生物合成的微生物和方法(Microorganisms and Methods for the Biosynthesis ofButadiene)”;以及2013年2月28日公布的WO2013028519A1,标题为“用于生产2,4-戊二烯酸酯、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇和相关醇的微生物和方法(Microorganisms and Methodsfor Producing 2,4-Pentadienoate,Butadiene,Propylene,1,3-Butanediol andRelated Alcohols)”,它们均通过引用并入本文。
1,3-丁二醇及其中间体,如2,4-戊二烯酸酯/盐、巴豆醇或3-丁烯-1-醇,是能够通过本文和以下出版物中描述的酶促途径制备的生物衍生化合物。合适的生物衍生化合物途径和酶、筛选方法和分离方法见于:2011年6月16日公布的WO2011071682A1,标题为“用于将合成气体或其他气态碳源和甲醇转化为1,3-丁二醇的方法和生物体(Methods andOrganisms for Converting Synthesis Gas or Other Gaseous Carbon Sources andMethanol to 1,3-Butanediol)”;2011年3月17日公布的WO2011031897A,标题为“用于异丙醇与伯醇、二醇和酸的共生产的微生物和方法(Microorganisms and Methods for theCo-Production of Isopropanol with Primary Alcohols,Diols and Acids)”;2010年11月4日公布的WO2010127319A2,标题为“生产1,3-丁二醇的生物体(Organisms for theProduction of 1,3-Butanediol)”;2013年5月16日公布的WO2013071226A1,标题为“用于增加胞质乙酰辅酶A可用性和用于生产1,3-丁二醇的真核生物和方法(EukaryoticOrganisms and Methods for Increasing the Availability of Cytosolic Acetyl-CoA,and for Producing 1,3-Butanediol)”;2013年2月28日公布的WO2013028519A1,标题为“用于生产2,4-戊二烯酸酯、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇和相关醇的微生物和方法(Microorganisms and Methods for Producing 2,4-Pentadienoate,Butadiene,Propylene,1,3-Butanediol and Related Alcohols)”;2013年3月14日公布的WO2013036764A1,标题为“生产1,3-丁二醇的真核生物和方法(Eukaryotic Organisms andMethods for Producing 1,3-Butanediol)”;2013年1月24日公布的WO2013012975A1,标题为“增加产物产率的方法(Methods for Increasing Product Yields)”;2012年12月27日公布的WO2012177619A2,标题为“生产1,3-丁二醇的微生物和相关方法(Microorganismsfor Producing1,3-Butanediol and Methods Related Thereto)”;2018年10月4日公布的WO2018/183664A1,标题为“醛脱氢酶变体和使用方法(Aldehyde Dehydrogenase Variantsand Methods of Use)”;2018年10月4日公布的WO 2018/183640A1,标题为“3-羟丁酰辅酶A脱氢酶变体和使用方法(3-Hhydroxybutryl-CoA Dehydrogenase Variants and Methodsof Use)”;2019年11月14日公布的US2019/0345455,标题为“醇脱氢酶突变体及其在二芳基手性醇合成中的应用(Alcohol Dehydrogenase Mutant and Application thereof inSynthesis of Diaryl Chiral Alcohols)”;以及2019年11月14日公布的US 2019/0345455,标题为“醇脱氢酶突变体及其在二芳基手性醇合成中的应用(AlcoholDehydrogenase Mutant and Application thereof in Synthesis of Diaryl ChiralAlcohols)”,它们均通过引用并入本文。
己二酸酯/盐、6-氨基己酸、己内酰胺、己二胺和乙酰丙酸及其中间体(例如4-氨基丁酰辅酶A)是能够通过本文和以下出版物中描述的酶促途径制备的生物衍生化合物。合适的生物衍生化合物途径和酶、筛选方法和分离方法见于:2010年11月11日公布的WO2010129936A1,标题为“用于己二酸酯、己二胺和6-氨基己酸的生物合成的微生物和方法(Microorganisms and Methods for the Biosynthesis of Adipate,Hexamethylenediamine and 6-Aminocaproic Acid)”;2013年1月24日公布的WO2013012975A1,标题为“提高产物产率的方法(Methods for Increasing ProductYields)”;2012年12月27日公布的WO2012177721A1,标题为“生产6-氨基己酸的微生物(Microorganisms for Producing 6-Aminocaproic Acid)”;2012年7月26日公布的WO2012099621A1,标题为“提高产物产率的方法(Methods for Increasing ProductYields)”;以及2009年12月17日公布的WO2009151728,标题为“生产己二酸和其他化合物的微生物(Microorganisms for the production of adipic acid and othercompounds)”,它们均通过引用并入本文。
甲基丙烯酸(2-甲基-2-丙烯酸)用于制备其酯,统称为甲基丙烯酸酯(例如甲基丙烯酸甲酯,其最常用于制造聚合物)。甲基丙烯酸酯如甲基丙烯酸甲酯、3-羟基异丁酸酯/盐和/或2-羟基异丁酸酯/盐及其中间体是能够通过本文和以下出版物中描述的酶促途径制备的生物衍生化合物。合适的生物衍生化合物途径和酶、筛选方法和分离方法可见于:2012年10月4日公布的WO2012135789A2,标题为“用于生产甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯的微生物和其相关方法(Microorganisms for Producing Methacrylic Acid and MethacrylateEsters and Methods Related Thereto)”;和2009年11月5日公布的WO2009135074A2,标题为“用于生产甲基丙烯酸的微生物(Microorganisms for the Production ofMethacrylic Acid)”,它们均通过引用并入本文。
1,2-丙二醇(丙二醇)、正丙醇、1,3-丙二醇和甘油及其中间体是能够通过本文和以下出版物中描述的酶促途径制备的生物衍生化合物。合适的生物衍生化合物途径和酶、筛选方法和分离方法可见于:2009年11月9日公布的WO2009111672A1,标题为“伯醇生产生物体(Primary Alcohol Producing Organisms)”;2011年3月17日公布的WO2011031897A1,标题为“用于异丙醇与伯醇、二醇和酸的共生产的微生物和方法(Microorganisms andMethods for the Co-Production of Isopropanol with Primary Alcohols,Diols andAcids)”;2012年12月27日公布的WO2012177599A2,标题为“用于生产正丙醇、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇或甘油的微生物及其相关方法(Microorganisms for Producing N-Propanol1,3-Propanediol,1,2-Propanediol or Glycerol and Methods Related Thereto)”,它们均通过引用并入本文。
可用于生产包括聚合物(例如,PBS)、1,4-丁二醇、四氢呋喃、吡咯烷酮、溶剂、涂料、除冰剂、塑料、燃料添加剂、织物、地毯、颜料和洗涤剂的产品的琥珀酸及其中间体是能够通过本文和以下出版物中描述的酶促途径制备的生物衍生化合物。合适的生物衍生化合物途径和酶、筛选方法和分离方法可见于:2008年7月2日公布的EP1937821A2,标题为“用于琥珀酸酯的生长偶联生产的方法和生物体(Methods and Organisms for the Growth-Coupled Production of Succinate)”,其通过引用并入本文。
伯醇和脂肪醇(也称为长链醇)(包括其脂肪酸和脂肪醛)及其中间体是能够通过以下出版物中的酶促途径制备的生物衍生化合物。合适的生物衍生化合物途径和酶、筛选方法和分离方法可见于:2009年9月11日公布的WO2009111672,标题为“伯醇产生生物体(Primary Alcohol Producing Organisms)”;2012年12月27日公布的WO2012177726,标题为“用于生产伯醇和相关化合物的微生物及其相关方法(Microorganism for ProducingPrimary Alcohols and Related Compounds and Methods Related Thereto)”,它们均通过引用并入本文。
本文所述的微生物生物体可用于通过乙酰辅酶A(包括任选地进一步通过乙酰乙酰辅酶A和/或琥珀酰辅酶A)生产的其他合适的生物衍生化合物作为本公开的一部分被包括在内。示例性的公知的生物衍生化合物、它们的生产途径和酶、筛选方法和分离方法可见于以下专利和出版物中:琥珀酸酯/盐(美国公开2007/0111294、WO 2007/030830、WO 2013/003432)、3-羟基丙酸(3-羟丙酸酯)(美国公开2008/0199926、WO 2008/091627、美国公开2010/0021978)、1,4-丁二醇(美国专利8067214、WO 2008/115840、美国专利7947483、WO2009/023493、美国专利7858350、WO 2010/030711、美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国专利8129169、WO 2010/141920、美国公开2011/0201068、WO 2011/031897、美国专利8377666、WO 2011/047101、美国公开2011/0217742、WO 2011/066076、美国公开2013/0034884、WO 2012/177943)、4-羟基丁酸(4-羟基丁酸酯、4-羟丁酸酯/盐、4-羟基丁酸盐)(美国专利8067214、WO 2008/115840、美国专利7947483、WO 2009/023493、美国专利7858350、WO 2010/030711、美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国专利8129155、WO2010/071697)、γ-丁内酯(美国专利8067214、WO 2008/115840、美国专利7947483、WO2009/023493、美国专利7858350、WO 2010/030711、美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国公开2011/0217742、WO 2011/066076)、4-羟基丁酰辅酶A(美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国公开2013/0034884、WO 2012/177943)、4-羟基丁醛(美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国公开2013/0034884、WO 2012/177943)、腐胺(美国公开2011/0003355、WO 2010/141780、美国公开2013/0034884、WO 2012/177943)、烯烃(例如丙烯酸和丙烯酸酯/盐)(美国专利8026386、WO 2009/045637)、乙酰辅酶A(美国专利8323950、WO 2009/094485)、甲基四氢叶酸(美国专利8323950、WO 2009/094485)、乙醇(美国专利8129155、WO 2010/071697)、异丙醇(美国专利8129155、WO 2010/071697、美国公开2010/0323418、WO 2010/127303、美国公开2011/0201068、WO 2011/031897)、正丁醇(美国专利8129155、WO 2010/071697)、异丁醇(美国专利8129155、WO 2010/071697)、正丙醇(美国公开2011/0201068、WO 2011/031897)、甲基丙烯酸(甲基丙烯酸酯/盐)(美国公开2011/0201068、WO 2011/031897)、伯醇(美国专利7977084、WO 2009/111672、WO 2012/177726)、长链醇(美国专利7977084、WO 2009/111672、WO 2012/177726)、己二酸酯/盐(己二酸)(美国专利8062871、WO 2009/151728、美国专利8377680、WO 2010/129936、WO 2012/177721)、6-氨基己酸酯/盐(6-氨基己酸)(美国专利8062871、WO 2009/151728、美国专利8377680、WO2010/129936、WO 2012/177721)、己内酰胺(美国专利8062871、WO 2009/151728、美国专利8377680、WO 2010/129936、WO 2012/177721)、己二胺(美国专利8377680、WO 2010/129936、WO 2012/177721)、乙酰丙酸(美国专利8377680、WO 2010/129936)、2-羟基异丁酸(2-羟基异丁酸酯/盐)(美国专利8241877、WO 2009/135074、美国公开2013/0065279、WO 2012/135789)、3-羟基异丁酸(3-羟基异丁酸酯/盐)(美国专利8241877、WO 2009/135074、美国公开2013/0065279、WO 2012/135789)、甲基丙烯酸(甲基丙烯酸盐)(美国专利8241877、WO2009/135074、美国公开2013/0065279、WO 2012/135789)、甲基丙烯酸酯/盐(美国公开2013/0065279、WO 2012/135789)、富马酸酯/盐(富马酸)(美国专利8129154、WO 2009/155382)、苹果酸酯/盐(苹果酸)(美国专利8129154、WO 2009/155382)、丙烯酸酯/盐(羧酸)(美国专利8129154、WO 2009/155382)、甲基乙基酮(美国公开2010/0184173、WO 2010/057022、美国专利8420375、WO 2010/144746)、2-丁醇(美国公开2010/0184173、WO 2010/057022、美国专利8420375、WO 2010/144746)、1,3-丁二醇(美国公开2010/0330635、WO2010/127319、美国公开2011/0201068、WO 2011/031897、美国专利8268607、WO 2011/071682、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519、美国公开2013/0066035、WO 2013/036764)、环己酮(美国公开2011/0014668、WO 2010/132845)、对苯二甲酸酯/盐(对苯二甲酸)(美国公开2011/0124911、WO 2011/017560、美国公开2011/0207185、WO 2011/094131、美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、粘康酸酯/盐(粘康酸)(美国公开2011/0124911、WO 2011/017560)、苯胺(美国公开2011/0097767、WO 2011/050326)、对甲基苯甲酸酯/盐(对甲基苯甲酸)(美国公开2011/0207185、WO 2011/094131、美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、(2-羟基-3-甲基-4-氧代丁氧基)膦酸酯/盐(美国公开2011/0207185、WO 2011/094131、美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、乙二醇(美国公开2011/0312049、WO 2011/130378、WO 2012/177983)、丙烯(美国公开2011/0269204、WO2011/137198、美国公开2012/0329119、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、丁二烯(1,3-丁二烯)(美国公开2011/0300597、WO 2011/140171、美国公开2012/0021478、WO2012/018624、美国公开2012/0225466、WO 2012/106516、美国公开2013/0011891、WO 2012/177710、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、甲苯(美国公开2012/0021478、WO2012/018624)、苯(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、(2-羟基-4-氧代丁氧基)膦酸酯/盐(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、苯甲酸酯/盐(苯甲酸)(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、苯乙烯(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624)、2,4-戊二烯酸酯/盐(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624、美国公开2013/0109064、WO2013/028519)、3-丁烯-1-醇(美国公开2012/0021478、WO 2012/018624、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、3-丁烯-2-醇(美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、1,4-环己烷二甲醇(美国公开2012/0156740、WO 2012/082978)、巴豆醇(美国公开2013/0011891、WO 2012/177710、美国公开2013/0109064、WO 2013/028519)、烯烃(美国公开2013/0122563、WO 2013/040383、US2011/0196180)、羟基酸(WO 2012/109176)、酮酸(WO2012/109176)、蜡酯(WO 2007/136762)或己内酯(美国公开2013/0144029、WO 2013/067432)途径。公开生物衍生化合物途径的上述专利和专利申请公开通过引用并入本文。
本领域技术人员将理解,这些仅仅是示例性的,基于本文的教导,本领域技术人员能够容易地确定适于生产期望产物并且可用于将底物转化为产物的合适活性的本文公开的底物-产物对的任何一种。因此,在一些实施方案中,本文提供一种含有至少一种编码工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的非天然存在的微生物生物体,其中甲酸脱氢酶在用于生产生物衍生化合物的途径中起作用。
在一些实施方案中,本文提供一种具有本文所述的载体的非天然存在的微生物生物体,所述载体包含本文所述的核酸。还提供了一种具有本文所述的核酸的非天然存在的微生物生物体。在一些实施方案中,核酸被整合到生物体的染色体中。在一些实施方案中,整合是位点特异性的。在本文所述的实施方案中,核酸被表达。在一些实施方案中,本文提供一种具有本文所述的多肽的非天然存在的微生物生物体。
在一些实施方案中,微生物生物体是细菌、酵母或真菌的物种。在一些实施方案中,微生物生物体是细菌、酵母或真菌的物种。在一些实施方案中,微生物生物体是酵母的物种。在一些实施方案中,微生物生物体是真菌的物种。
在一些实施方案中,本文提供与不具有编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的对照微生物生物体相比,能够生产更多NADH或生物衍生化合物的非天然存在的微生物生物体。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,这种微生物生物体能够生产至少多10%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多20%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多30%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多40%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多50%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多60%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多70%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多80%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多90%的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.1倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.2倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.3倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.4倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.5倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.6倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.7倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.8倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多1.9倍的NADH或生物衍生化合物。在一些实施方案中,与对照微生物生物体相比,所述微生物生物体能够生产至少多2倍的NADH或生物衍生化合物。
本文描述的主题包括对代谢反应、反应物或其产物的一般参考,或对一种或更多种核酸或基因的特定参考,所述一种或更多种核酸或基因编码与所参考的代谢反应、反应物或产物相关或催化所参考的代谢反应、反应物或产物的酶,或与所参考的代谢反应、反应物或产物相关的蛋白质。除非本文明确说明,否则本领域技术人员将了解提及反应时同样表示提及反应的反应物和产物。类似地,除非本文另有明确说明,否则提及反应物或产物时同样表示提及反应,且提及任何这些代谢组分时同样表示提及一种或一种以上编码催化所提及的反应、反应物或产物的酶或与所提及的反应、反应物或产物相关的蛋白质的基因。同样,鉴于代谢生物化学、酶学和基因组学是熟知领域,本文对基因或编码核酸的提及也等同于提及对应的编码酶及其催化的反应,或与反应相关的蛋白质,以及反应的反应物和产物。
本文描述的非天然存在的微生物生物体可通过引入编码参与一种或更多种生物衍生化合物生物合成途径的一种或更多种酶或蛋白质的可表达核酸来产生。取决于为生物合成所选的宿主微生物生物体,可以表达针对特定生物衍生化合物生物合成途径中的一些或全部的核酸。举例来说,如果所选宿主缺乏期望生物合成途径的一种或更多种酶或蛋白质,则将针对缺乏的一种或多种酶或蛋白质的可表达核酸引入到宿主中以供随后的外源表达。或者,如果所选宿主展现出一些途径基因的内源表达,但缺乏其他基因,则需要缺乏的一种或多种酶或蛋白质的编码核酸以实现生物衍生化合物的生物合成。因此,本文描述的非天然存在的微生物生物体可通过引入外源酶或蛋白质活性以获得期望的生物合成途径来产生,或者期望的生物合成途径可通过引入一种或更多种外源酶或蛋白质活性来获得,所述一种或更多种外源酶或蛋白质活性与一种或更多种内源酶或蛋白质一起产生期望产物,例如生物衍生化合物。
宿主微生物生物体可选自例如细菌、酵母、真菌或多种适用于或适合于发酵过程的其他微生物中的任一种,且非天然存在的微生物生物体可在它们中产生。示例性细菌包括选自以下的任何物种:肠杆菌目(Enterobacteriales),肠杆菌科(Enterobacteriaceae),包括埃希氏菌属(Escherichia)和克雷伯氏菌属(Klebsiella);气单胞菌目(Aeromonadales),琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae),包括厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum);巴斯德氏菌目(Pasteurellales),巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae),包括放线杆菌属(Actinobacillus)和曼氏杆菌属(Mannheimia);根瘤菌目(Rhizobiales),慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae),包括根瘤菌属(Rhizobium);芽孢杆菌目(Bacillales),芽孢杆菌科(Bacillaceae),包括芽孢杆菌属(Bacillus);放线菌目(Actinomycetales),棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科(Streptomycetaceae),分别包括棒状杆菌属(Corynebacterium)和链霉菌属(Streptomyces);红螺菌目(Rhodospirillales),醋杆菌科(Acetobacteraceae),包括葡糖杆菌属(Gluconobacter);鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales),鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae),包括发酵单胞菌属(Zymomonas);乳杆菌目(Lactobacillales),乳杆菌科(Lactobacillaceae)和链球菌科(Streptococcaceae),分别包括乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus);梭菌目(Clostridiales),梭菌科(Clostridiaceae),梭菌属(Clostridium);和假单胞菌目(Pseudomonadales),假单胞菌科(Pseudomonadaceae),包括假单胞菌属(Pseudomonas)。宿主细菌的非限制性物种包括大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。示例性的细菌甲基营养菌包括例如芽孢杆菌属(Bacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Methyloversatilis、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)和生丝微菌属(Hyphomicrobium)。
类似地,酵母或真菌物种的示例性物种包括选自以下的任何物种:酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccaromycetaceae),包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和毕赤酵母属(Pichia);酵母目双足囊菌科(Dipodascaceaeae),包括耶氏酵母属(Yarrowia);裂殖酵母目(Schizosaccharomycetales)裂殖酵母科(Schizosaccaromycetaceae),包括裂殖酵母属(Schizosaccharomyces);散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Trichocomaceae),包括曲霉属(Aspergillus);以及毛霉目(Mucorales)毛霉科(Mucoraceae),包括根霉属(Rhizopus)。宿主酵母或真菌的非限制性物种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。大肠杆菌是尤其有用的宿主生物体,因为其是得到充分表征的适用于基因工程的微生物生物体。其他特别有用的宿主生物体包括酵母,如酿酒酵母,以及选自以下的酵母或真菌:酵母属、裂殖酵母属、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、红酵母属(Rhodotorula)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、曲霉属、克鲁维酵母属、伊萨酵母属(Issatchenkia)、耶氏酵母属、念珠菌属(Candida)、毕赤酵母属、Ogataea、Kuraishia、汉逊酵母属(Hansenula)和驹形氏酵母属(Komagataella)。有用的宿主生物体包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、博伊丁假丝酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉、巴斯德毕赤酵母、少根根霉、米根霉、解脂耶氏酵母、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)等。应当理解,任何合适的微生物宿主生物体都可以用于引入代谢和/或遗传修饰以生产期望产物。
根据所选宿主微生物生物体的生物衍生化合物生物合成途径成分,本文所述的非天然存在的微生物生物体可包含至少一种外源表达的生物衍生化合物途径编码核酸,和一种或更多种生物衍生化合物生物合成途径的至多所有编码核酸。例如,可以通过相应编码核酸的外源表达来在缺乏途径酶或蛋白质的宿主中建立生物衍生化合物生物合成。在缺乏生物衍生化合物途径的所有酶或蛋白质的宿主中,可以包含途径中所有酶或蛋白质的外源表达,然而应理解,即使宿主含有途径酶或蛋白质中的至少一种,也可以表达途径的所有酶或蛋白质。
鉴于本文提供的教导和指导,本领域技术人员将理解,以可表达形式引入的编码核酸的数量将至少与所选宿主微生物生物体的生物衍生化合物途径缺陷相当。因此,本文所述的非天然存在的微生物生物体可具有一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种,至多所有编码构成本文公开的生物衍生化合物生物合成途径的酶或蛋白质的核酸。在一些实施方案中,非天然存在的微生物生物体还可以包含促进或优化生物衍生化合物生物合成或对宿主微生物生物体赋予其他有用功能的其他遗传修饰。一种此类其他功能可以包括例如对一种或更多种生物衍生化合物途径前体的合成进行增强。
一般来说,对宿主微生物生物体进行选择,以便其产生作为天然产生的分子或工程化产物的生物衍生化合物途径的前体,所述天然产生的分子或工程化产物或者提供期望前体的从头产生,或者导致由宿主微生物生物体天然产生的前体的产生增多。例如,丙二酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A和丙酮酸酯/盐在宿主生物体如大肠杆菌中自然产生。如本文所公开的,宿主生物体可经工程化以增加前体的产生。此外,已被工程化以产生期望前体的微生物生物体可以用作宿主生物体并被进一步工程化以表达生物衍生化合物途径的酶或蛋白质。
在一些实施方案中,本文所述的非天然存在的微生物生物体由具有合成生物衍生化合物的酶促能力的宿主产生。在该具体实施方案中,增加NADH的合成或积累以例如驱动生物衍生化合物途径反应朝向生物衍生化合物生产可为有用的。增加的合成或积累可通过例如编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的核酸的表达(例如,过表达)和生物衍生化合物途径中的一种或多种酶和/或一种或多种蛋白质的表达(例如,过表达)来实现。生物衍生化合物途径中的一种或多种酶和/或一种或多种蛋白质的表达可以例如通过一种或多种内源基因的外源表达或通过一种或多种异源基因的外源表达发生。因此,通过过表达编码生物衍生化合物生物合成途径酶或蛋白质的核酸中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种,即多至所有核酸,天然存在的生物体可以容易地变成本文所述的非天然存在的微生物生物体,例如产生生物衍生化合物的非天然存在的微生物生物体。此外,非天然存在的生物体可通过内源基因的诱变产生,所述诱变导致酶在生物衍生化合物生物合成途径中的活性的增加。
在尤其有用的实施方案中,利用了编码核酸的外源性表达。外源性表达赋予了宿主定制调整表达和/或调控元件的能力,以及实现由使用者控制的期望表达水平的应用。在一些实施方案中,内源基因的表达可被操纵,例如通过去除负调控效应子或当与诱导型启动子或其他调控元件连接时对基因的启动子进行的诱导。因此,具有天然存在的诱导型启动子的内源基因可通过提供适当的诱导剂而被上调,或者内源基因的调控区可经工程化以掺入诱导型调控元件,从而允许在期望时间对内源基因增加的表达进行调控。类似地,可以包含诱导型启动子作为引入非天然存在的微生物生物体中的外源基因的调控元件。
应当理解,在本文所述的方法中,可以将一种或更多种重组和/或外源核酸中的任何一种引入微生物生物体中以产生本文所述的非天然存在的微生物生物体。可以将核酸引入以便例如将辅因子(诸如NADH和/或NADPH)的产生或生物衍生化合物生物合成途径赋予微生物生物体。或者,可以引入编码核酸以产生中间微生物生物体,该生物体具有生物合成能力以催化所需反应中的一些,从而赋予辅因子产生或生物衍生化合物生物合成能力。例如,具有NADH和生物衍生化合物生物合成途径的非天然存在的微生物生物体可包含至少两种编码期望酶或蛋白质的外源核酸,诸如本文提供的工程化甲酸脱氢酶与1,3-BDO途径酶的组合,或替选地本文提供的工程化甲酸脱氢酶与HMDA途径酶的组合,或替选地本文提供的工程化甲酸脱氢酶与MAA途径酶的组合等。因此,应理解,生物合成途径中的两种或更多种酶或蛋白质的任何组合可包含在本文所述的非天然存在的微生物生物体中。类似地,应理解,生物合成途径中的三种或更多种酶或蛋白质的任何组合可以根据需要包含在本文所述的非天然存在的微生物生物体中,例如,本文提供的工程化甲酸脱氢酶、转氢酶和1,3-BDO途径酶等,只要期望的生物合成途径的酶和/或蛋白质的组合导致产生相应的期望产物即可。类似地,本文公开的生物合成途径中的四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种酶或蛋白质的任何组合可以根据需要包含在本文描述的非天然存在的微生物生物体中,只要期望的生物合成途径中的酶和/或蛋白质的组合导致产生相应的期望产物即可。
除了如本文所述的NADH或生物衍生化合物的生物合成之外,本文所述的非天然存在的微生物生物体和方法也可以彼此以多种组合使用和/或与本领域熟知的其他微生物生物体和方法以多种组合使用,以通过其他路线实现产物的生物合成。例如,除了使用生物衍生化合物的生产者之外,生产生物衍生化合物的一种替选方案是通过添加另一种能够将生物衍生化合物途径中间体转化为生物衍生化合物的微生物生物体。一种这样的程序包括例如发酵产生生物衍生化合物途径中间体的微生物生物体。然后,生物衍生化合物途径中间体可用作底物以供第二微生物生物体将生物衍生化合物途径中间体转化为生物衍生化合物。生物衍生化合物途径中间体可以直接添加到第二生物体的另一培养物中,或者可以通过对生物衍生化合物途径中间体生产者的原始培养物进行例如细胞分离来除去这些微生物生物体,然后将第二生物体添加到发酵液中以生产最终产物,而无需中间纯化步骤。
鉴于本文提供的教导和指导,本领域技术人员将理解,对于本文所述的非天然存在的微生物生物体和方法,其与其他微生物生物体、其他具有亚途径的非天然存在的微生物生物体的共培养以及本领域熟知的产生生物衍生化合物的其他化学和/或生化程序的组合之间存在各种各样的组合和排列。
类似地,本领域技术人员应理解,可基于引入一种或更多种基因破坏以增加NADH或生物衍生化合物的合成或产生这一期望特征来选择宿主生物体。因此,应当理解,如果要将遗传修饰引入宿主生物体以破坏基因,则可以类似地破坏催化相似但不相同的代谢反应的任何同源物、直系同源物或旁系同源物,以确保期望的代谢反应被充分破坏。因为不同生物体之间的代谢网络存在某些差别,所以本领域技术人员将理解给定生物体中实际被破坏的基因在生物体之间可能有所不同。然而,鉴于本文提供的教导和指导,本领域技术人员还将理解,本文所述的方法可以应用于任何合适的宿主微生物,以鉴定在目的物种中构建将会提高NADH或生物衍生化合物生物合成的生物体所需的同源代谢改变。在特定实施方案中,增加的生产将NADH或生物衍生化合物的生物合成与生物体的生长偶联,并且如果需要,可以强制性地将NADH或生物衍生化合物的生产与生物体的生长偶联,如本文所公开的。
生物衍生化合物途径酶或蛋白质的编码核酸的来源可包括,例如,其中编码的基因产物能够催化所提及的反应的任何物种。此类物种包括原核生物体和真核生物体,包括(但不限于)细菌(包括古细菌和真细菌)和真核生物(包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物(包括人类))。这些来源的示例性物种包括,例如,大肠杆菌、巨冷杉(Abies grandis)、醋酸醋酸杆菌(Acetobacter aceti)、巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurians)、反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentans)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)Naval-82、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、不动杆菌属ADP1种、不动杆菌属M-1株、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸放线杆菌130Z、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、金属还原嗜碱菌(Alkaliphilus metalliredigenes)QYF、酒色着色菌(Allochromatium vinosum)DSM 180、Aminomonas aminovorus、浅黄拟无枝酸球菌(Amycolicicoccus subflavus)DQS3-9A1、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、人结肠厌氧棍状菌(Anaerotruncus colihominis)、嗜热产水菌(Aquifex aeolicus)VF5、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、拟南芥col、闪烁古生球菌(Archaeglubus fulgidus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、闪烁古生球菌DSM4304、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、猪蛔虫(Ascaris suum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黑曲霉CBS 513.88、土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624、极小阿托波菌(Atopobium parvulum)DSM 20469、葡萄园固氮菌(Azotobacter vinelandii)DJ、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)ATCC 27647、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)LMG9581、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、蜡状芽孢杆菌ATCC 14579、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)36D1、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)MGA3、甲醇芽孢杆菌PB1、甲醇芽孢杆菌PB-1、亚硒酸盐还原类芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)MLS10、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)ATCC 27678、假长双歧杆菌球形亚种(Bifidobacterium pseudolongum subsp.globosum)、牛(Bos taurus)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)、吡咯菌素伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)、稳定伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)、泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)E264、Burkholderia xenovorans、产丁酸菌L2-50、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、屈曲弯曲菌(Campylobacter curvus)525.92、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、白色念珠菌、博伊丁假丝酵母、甲基假丝酵母(Candida methylica)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、热带念珠菌MYA-3404、生氢一氧化碳嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)、生氢一氧化碳嗜热菌Z-2901、解芳烃卡斯特兰尼氏菌(Castellaniella defragrans)、柄杆菌属(Caulobacter)AP07种、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、褐杆状绿菌(Chlorobium phaeobacteroides)DSM 266、泥生绿菌(Chlorobium limicola)、微温绿菌(Chlorobium tepidum)、聚集绿屈挠菌(Chloroflexus aggregans)DSM 9485、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、橙色绿屈挠菌J-10-fl、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)ATCC BAA-895、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)、杨氏柠檬酸杆菌ATCC 29220、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌ATCC 824、尿酸梭菌(Clostridium acidurici)、氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、Clostridium asparagiforme DSM 15981、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、拜氏梭菌NCIMB 8052、拜氏梭菌NRRL B593、拜氏梭菌、鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613、C型肉毒杆菌埃克隆德菌株(Clostridiumbotulinum C str.Eklund)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)P7、解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)H10、食纤维素梭菌(Clostridium cellulovorans)743B、艰难梭菌(Clostridium difficile)、艰难梭菌630、平野梭菌(Clostridiumhiranonis)DSM 13275、海莱蒙梭菌(Clostridium hylemonae)DSM 15053、克鲁维梭菌(Clostridium kluyveri)、克鲁维梭菌DSM 555、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahli)、永达尔梭菌DSM、永达尔梭菌DSM 13528、甲基戊糖梭菌(Clostridium methylpentosum)DSM5476、诺维梭菌(Clostridium novyi)NT、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、巴氏梭菌DSM 525、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、产气荚膜梭菌ATCC 13124、产气荚膜梭菌13株、植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentans)ISDg、丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)N 1-4、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丛毛单胞菌属(Comamonas)CNB-1种、丛毛单胞菌属CNB-1种、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒状杆菌ATCC14067、谷氨酸棒状杆菌R、棒状杆菌属、棒状杆菌属U-96种、变异棒状杆菌(Corynebacterium variabile)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)Iowa II、黄瓜(Cucumis sativus)、杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)N-1、蓝菌属(Cyanobium)PCC7001、耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)R1、食烯烃脱硫杆菌(Desulfatibacillum alkenivorans)AK-01、哈夫尼脱硫杆菌(Desulfitobacteriumhafniense)、Desulfitobacterium metallireducens DSM 15288、Desulfotomaculumreducens MI-1、非洲脱硫弧菌(Desulfovibrio africanus)、非洲脱硫弧菌沃尔维斯湾株(Desulfovibrio africanus str.Walvis Bay)、脱硫脱硫弧菌(DesulfoVibriodesulfuricans)G20、脱硫脱硫弧菌脱硫亚种(Desulfovibrio desulfuricanssubsp.desulfuricans)ATCC 27774株、食果糖脱硫弧菌(Desulfovibrio fructosovorans)JJ、普通脱硫弧菌希尔登伯勒株(Desulfovibrio vulgaris str.Hildenborough)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)AX4、脑膜炎败血症伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、赤杆菌属(Erythrobacter)NAP1种、大肠杆菌C、大肠杆菌K12、大肠杆菌K-12MG1655、大肠杆菌W、巴氏真杆菌(Eubacteriumbarkeri)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)DSM 3353、直肠真杆菌(Eubacteriumrectale)ATCC 33656、纤细眼虫(Euglena gracilis)、冷域黄杆菌(Flavobacteriumfrigoris)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.Polymorphum)ATCC 10953、地芽孢杆菌属(Geobacillus)GHH01种、地芽孢杆菌属M10EXG种、地芽孢杆菌属Y4.1MC1种、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、嗜热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2、热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)、Geobacter bemidjiensis Bem、金属还原地杆菌(Geobactermetallireducens)GS-15、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、硫还原地杆菌PCA、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)、死海盐盒菌ATCC 43049、盐沼盐杆菌(Halobacteriumsalinarum)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)DL-1、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、幽门螺杆菌26695、幽门螺杆菌、智人(Homo sapiens)、人肠道宏基因组、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)、嗜热氢杆菌TK-6、脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)ATCC 51888、扎氏生丝微菌(Hyphomicrobium zavarzinii)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎克雷伯菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniaesubsp.Pneumoniae)MGH 78578、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)ATCC 367、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)、苹果(Malus x domestica)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimiasucciniciproducens)、海洋γ变形菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2080、海洋宏基因组JCVI SCAF 1096627185304、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099、勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)CQMa 102、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus janaschii)、詹氏甲烷球菌、嗜乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、嗜乙酸甲烷八叠球菌C2A、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、马氏甲烷八叠球菌Tuc01、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)、喜石甲基养菌(Methylibiumpetroleiphilum)PM1、鞭毛甲基杆菌(Methylobacillus flagellatus)、鞭毛甲基杆菌KT、海洋甲基杆菌(Methylobacter marinus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、扭脱甲基杆菌AM1、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatas)、白甲基微菌(Methylomicrobium album)BG8、临氨甲基单胞菌(Methylomonas aminofaciens)、食葡糖食甲基菌(Methylovorus glucosetrophus)SIP3-4、食甲基菌属MP688种、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、小鼠(Mus musculus)、分枝杆菌属的物种JC1 DSM 3803株、鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis)K-10、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG、胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)、海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)M、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、耻垢分枝杆菌MC2 155、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)M129、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、鞭毛藻丛赤壳菌(Nectria haematococca)mpVI 77-13-4、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、加尔加亚硝化球菌(Nitrososphaera gargensis)Ga9.2、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)IFM 10152、艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)、艾阿华诺卡氏菌(NRRL 5646种)、念珠藻属(Nostoc)PCC 7120种、Ogataea parapolymorpha DL-1(多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)DL-1)、生物体、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)、皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacilluspeoriae)KCTC 3763、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、甲醇降解居泥杆菌(Pelobacter carbinolicus)DSM 2380、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculumthermopropionicum)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、海水派琴虫(Perkinsusmarinus)ATCC 50983、深海发光杆菌(Photobacterium profundum)3TCK、欧洲云杉(Piceaabies)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、灼热嗜酸古菌(Picrophilus torridus)DSM9790、沙滨松(Pinus sabiniana)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、银白杨(Populus alba)、欧洲山杨x银白杨(Populus tremula x Populus alba)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、牙龈卟啉单胞菌W83、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、费氏丙酸杆菌谢氏种(Propionibacterium freudenreichii sp.Shermanii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、铜绿假单胞菌PA01、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、克氏假单胞菌(Pseudomonasknackmussii)、克氏假单胞菌(B13)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌属的物种、丁香假单胞菌丁香变种(Pseudomonassyringae pv.Syringae)B728a、扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquis)ATCC 700755、葛根(Pueraria montana)、喜气火棒菌(Pyrobaculum aerophilum)IM2株、冰岛火棒菌(Pyrobaculum islandicum)DSM 4184、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越火球菌(Pyrococcus horikoshii)OT3、富养罗尔斯通菌(Ralstonia eutropha)、富养罗尔斯通菌H16、褐家鼠(Rattus norvegicus)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、类球红细菌ATCC 17025、浑浊红球菌(Rhodococcus opacus)B4、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、沼泽红假单胞菌CGA009、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、深红红螺菌ATCC 11170、肠道罗氏菌(Roseburia intestinalis)L1-82、食葡糖罗氏菌(Roseburia inulinivorans)、罗氏菌属A2-183种、卡氏红弯曲菌(Roseiflexus castenholzii)、胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)ATCC 29174、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酿酒酵母s288c、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)、酿酒酵母、肠沙门氏菌(Salmonella enteric)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、肠道沙门氏菌亚利桑那亚种血清型(Salmonellaenterica subsp.arizonae serovar)、肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型(Salmonellaenterica subsp.enterica serovar Typhimurium)LT2株、鼠伤寒肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Typhimurium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、鼠伤寒沙门氏菌LT2、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白蚁塞巴鲁德氏菌(Sebaldella termitidis)ATCC 33386、变形斑沙雷菌(Serratia proteamaculans)、奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR-1、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021、番茄(Solanum lycopersicum)、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、毛韧革菌(Stereum hirsutum)FP-91666SS1、变形链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC 10782、环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)、带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、天蓝色链霉菌A3(2)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、灰色链霉菌灰色亚种NBRC 13350、链霉菌属CL190种、链霉菌属2065种、链霉菌属ACT-1种、链霉菌属KO-3988种、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocalarius)、嗜酸热硫化叶菌、硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、硫矿硫化叶菌P-2、硫化叶菌属(Sulfolobus)7株、东京工业大学硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、脱氮硫单胞菌(Sulfurimonas denitrificans)、野猪(Sus scrofa)、细长聚球藻(Synechococcuselongatus)PCC 7942、聚球藻属(Synechococcus)PCC 7002种、集胞藻属(Synechocystis)PCC 6803株、富马氧化互营杆菌(Syntrophobacter fumaroxidans)、芳香陶厄氏菌(Thauera aromatica)、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)HTD4、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)X514种、腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobactertengcongensis)MB4、小宝岛热球菌(Thermococcus kodakaraensis)、海岸嗜热球菌(Thermococcus litoralis)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、嗜中性热变形菌(Thermoproteus neutrophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、海栖热袍菌MSB8、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)、奥湖甲苯单胞菌(Tolumonas auensis)DSM 9187、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)G3、普通小麦(Triticum aestivum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、稍变冢村氏菌(Tsukamurellapaurometabola)DSM 20162、未经培养细菌、未经培养生物体、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ATCC BAA-1116、自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)Py2、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、弗氏耶尔森菌(Yersiniafrederiksenii)、中间耶尔森菌(Yersinia intermedia)、中间耶尔森菌ATCC 29909、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、玉米(Zea mays)、生枝胶团杆菌(Zoogloea ramigera)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis),以及本文公开的或可作为相应基因的来源生物体获得的其他示例性物种。然而,利用现在超过550个物种的完整基因组序列(其中一半以上可在公共数据库如NCBI上获得),包括395个微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组,对编码相关或远缘物种中一个或更多个基因的必需生物衍生化合物生物合成活性的基因(包括例如已知基因的同源物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换)以及生物体之间遗传改变的交换进行鉴定是常规的和本领域公知的。因此,本文参考特定生物体如大肠杆菌描述的允许生物合成生物衍生化合物的代谢改变可以容易地同样应用于其他微生物,包括原核生物和真核生物。鉴于本文所提供的教导和指导,本领域技术人员将知悉在一种生物体中举例说明的代谢改变可同样地应用于其他生物体。
在一些情况下,例如当替选的生物衍生化合物生物合成途径存在于不相关物种中时,可以通过外源性表达例如来自不相关物种的一种或多种催化相似但不相同的代谢反应的旁系同源物以取代所提到的反应,来将生物衍生化合物的生物合成赋予宿主物种。因为不同生物体的代谢网络之间存在某些差别,所以本领域技术人员将理解,不同生物体之间的实际基因使用可有所不同。然而,鉴于本文提供的教导和指导,本领域技术人员还将理解,本文描述的教导和方法可以应用于所有微生物生物体,使用与本文举例说明的代谢改变同源的代谢改变在目的物种中构建将会合成生物衍生化合物的微生物生物体。
构建和测试非天然存在的生物衍生化合物生产宿主的表达水平的方法可以例如通过本领域公知的重组和检测方法来进行。此种方法可以在例如Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001);和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley andSons,Baltimore,MD(1999)中找到描述。
可以使用本领域公知的技术,包括但不限于接合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化,将编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸和/或编码生产NADH或本文所述的生物衍生化合物的途径中所涉及的一种或更多种酶或蛋白质的外源核酸稳定地或瞬时地引入微生物生物体。对于在大肠杆菌或其他原核细胞中的外源表达,真核核酸的基因或cDNA中的一些核苷酸序列可以编码靶向信号(例如N-末端线粒体或其他靶向信号),如果需要,可以在转化至原核微生物生物体中之前去除这些靶向信号。举例来说,移除线粒体前导序列会导致在大肠杆菌中的表达有所增加(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于在酵母或其他真核细胞中的外源表达,可以在不添加前导序列的情况下在胞质中表达基因,或者可以通过添加合适的靶向序列,例如适用于微生物生物体的线粒体靶向信号或分泌信号来使基因靶向线粒体或其他细胞器,或者靶向分泌。因此,可以理解的是,可以在重组核酸或外源核酸中并入对核苷酸序列进行的适当修饰,以去除或包含靶向序列,从而赋予期望的性质。此外,可使用本领域中熟知的技术对基因进行密码子优化以获得蛋白质的优化表达。
可以构建一种或多种表达载体以包含编码如本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸和/或编码如本文所述的生物衍生化合物生物合成途径中的一种或更多种酶或蛋白质的外源核酸,其与在宿主生物体中起作用的表达控制序列可操作地连接。适用于本文所述的微生物宿主生物体的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体,包括用于稳定整合到宿主染色体中的可操作的载体和选择序列或标记物。此外,表达载体可包含一个或更多个可选择标记基因和适当的表达控制序列。也可包括选择性标记基因,其例如提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或供应培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共表达两种或更多种重组和/或外源编码核酸时,可以将两种核酸插入到例如单一表达载体中或分别的表达载体中。对于单一载体表达,编码核酸可以与一个共同的表达控制序列或不同的表达控制序列可操作地连接,例如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。参与代谢或合成途径的重组或外源核酸的转化可以使用本领域公知的方法来确认。此类方法包括例如核酸分析,例如mRNA的Northern印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增,或用于基因产物表达的免疫印迹法,或用于测试引入的核酸或其对应基因产物的表达的其他合适分析方法。本领域技术人员应当理解,重组和/或外源核酸以足够的量表达以产生期望产物,并且还应当理解,可使用本领域公知的和本文公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。
在一些实施方案中,本文提供了一种用于生产本文所述的生物衍生化合物的方法。这种方法可以包括在用于生产生物衍生化合物的条件下培养本文所述的非天然存在的微生物生物体,持续足以生产生物衍生化合物的时间段。因此,在一些实施方案中,本文提供了一种生产本文所述的生物衍生化合物的方法,包括培养本文所述的宿主细胞足以生产生物衍生化合物的时间段。在另一个实施方案中,方法还包括将生物衍生化合物与培养物中的其他成分分离。在这方面,分离可以包括萃取、连续液-液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、吸附色谱或超滤。
在一些实施方案中,取决于生物衍生化合物,本文所述的方法可以进一步包括将生物衍生化合物化学转化为定向的最终化合物。例如,在其中生物衍生化合物是丁二烯的一些实施方案中,本文描述的方法可以进一步包括化学脱水1,3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-2-醇以生产丁二烯。
可以使用公知的方法进行合适的纯化和/或测定,以测试NADH或生物衍生化合物的产生。对于待测试的每种经工程改造的菌株,可培养合适的重复,例如一式三份培养物。例如,可监测经工程改造的生产宿主中的产物和副产物形成。可通过例如HPLC(高效液相色谱)、GC-MS(气相色谱-质谱法)和LC-MS(液相色谱-质谱法)方法或其他合适的分析方法,使用本领域中熟知的常规程序来分析终产物和中间体及其他有机化合物。也可用培养物上清液来测试发酵液中的产物释放情况。可以通过HPLC,例如针对葡萄糖和醇使用折射率检测器,针对有机酸使用UV检测器(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005)),或本领域公知的其他合适的测定和检测方法来定量副产物和残留葡萄糖。来自重组和/或外源核酸的各个酶或蛋白质的活性也可以使用本领域公知的方法进行测定。
可以使用本领域公知的各种方法将生物衍生化合物与培养物中的其他成分分离。所述分离方法包括例如萃取程序,以及包括连续液-液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱和超滤的方法。所有上述方法皆为本领域所熟知的。
可以培养本文所述的任何非天然存在的微生物生物体以生产和/或分泌本文所述的生物合成产物。例如,可以培养生物衍生化合物生产者用于本文公开的生物衍生化合物的生物合成生产。因此,在一些实施方案中,本文提供了一种具有本文所述的生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体的培养基。在一些方面,培养基也可以与本文所述的生产生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体的非天然存在的微生物生物体分离。从培养基中分离微生物生物体的方法是本领域公知的。示例性方法包括过滤、絮凝、沉淀、离心、沉积等。
为了生产NADH或生物衍生化合物,在具有碳源和其他必需营养物的培养基中培养重组菌株。有时候需要在发酵罐中维持厌氧条件以降低全过程的成本,并且这可能是非常期望的。这样的条件可例如通过首先用氮气喷射培养基,然后用隔膜和螺纹盖密封烧瓶来获得。对于在厌氧条件下未观察到生长的菌株,可通过在隔膜上打出用于有限通气的小孔来施加微氧或基本上厌氧的条件。示例性厌氧条件先前已有描述且为本领域中所熟知。例如,在2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中描述了示例性需氧和厌氧条件。如本文所公开的,发酵可以以分批、补料分批或连续的方式进行。如果需要,发酵也可以分两个阶段进行。第一阶段可以是需氧的,以允许高生长并因此允许高生产力,随后是高生物衍生化合物产量的厌氧阶段。
必要时,可以使培养基的pH维持在期望pH,尤其中性pH,例如约7的pH,可以通过根据需要添加碱(例如NaOH或其他碱)或酸来使培养基维持在期望pH。生长速率可通过使用分光光度计(600nm)测量光学密度来确定,且葡萄糖摄取速率可通过监测碳源随时间的消耗来确定。
生长培养基可以包括例如任何碳水化合物源,其可以向本文所述的非天然存在的微生物生物体提供碳源。这些来源包括例如糖,如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉;或甘油,单独作为唯一的碳源或与本文所述或本领域已知的其他碳源组合。在一个实施方案中,碳源是糖。在一个实施方案中,碳源是含糖生物质。在一些实施方案中,糖是葡萄糖。在一个实施方案中,糖是木糖。在另一实施方案中,糖是阿拉伯糖。在一个实施方案中,糖是半乳糖。在另一实施方案中,糖是果糖。在另一些实施方案中,糖是蔗糖。在一个实施方案中,糖是淀粉。在某些实施方案中,碳源是甘油。在一些实施方案中,碳源是粗甘油。在一个实施方案中,碳源是未经处理的粗甘油。在另一些实施方案中,碳源是甘油和葡萄糖。在另一个实施方案中,碳源是甲醇和甘油。在一个实施方案中,碳源是二氧化碳。在一个实施方案中,碳源是甲酸。在一个实施方案中,碳源是甲烷。在一个实施方案中,碳源是甲醇。在某些实施方案中,甲醇单独用作唯一的碳源,或者与本文描述的或本领域已知的其他碳源组合使用。在一具体实施方案中,甲醇是仅有(唯一)碳源。在一个实施方案中,碳源是化学电生成的碳(参见例如Liao等人(2012)Science 335:1596)。在一个实施方案中,化学电生成的碳是甲醇。在一个实施方案中,化学电生成的碳是甲酸。在一个实施方案中,化学电生成的碳是甲酸和甲醇。在一个实施方案中,碳源是碳水化合物和甲醇。在一个实施方案中,碳源是糖和甲醇。在另一个实施方案中,碳源是糖和甘油。在另一些实施方案中,碳源是糖和粗甘油。在另一些实施方案中,碳源是糖和未经处理的粗甘油。在一个实施方案中,碳源是含糖生物质和甲醇。在另一个实施方案中,碳源是含糖生物质和甘油。在另一些实施方案中,碳源是含糖生物质和粗甘油。在再另一些实施方案中,碳源是含糖生物质和未经处理的粗甘油。在一些实施方案中,碳源是含糖生物质、甲醇和碳水化合物。碳水化合物的其他来源包括例如可再生原料和生物质。在本文提供的方法中可用作原料的示例性生物质类型包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或部分原料。这些生物质原料含有例如可用作碳源的碳水化合物底物,例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。鉴于本文提供的教导和指导,本领域技术人员将理解,除了上面举例说明的那些之外的可再生原料和生物质也可用于培养本文提供的微生物生物体,以生产琥珀酸和其他途径中间体。
使用如本文举例说明的本领域公知的方法构建本文所述的非天然存在的微生物生物体,以表达重组核酸和/或编码工程化甲酸脱氢酶或生物衍生化合物途径酶或蛋白质的一种或更多种核酸,其量足以生产NADH或生物衍生化合物。应当理解,本文所述的微生物生物体在足以生产NADH或生物衍生化合物的条件下培养。根据本文提供的教导和指导,本文描述的非天然存在的微生物生物体可以实现NADH或生物衍生化合物的生物合成,导致细胞内浓度为约0.1至200mM或更高。通常,NADH或生物衍生化合物的细胞内浓度为约3至150mM,特别地为约5至125mM,更特别为约8至100mM,包括约10mM、20mM、50mM、80mM或更高。本文所述的非天然存在的微生物生物体也可以实现在这些示例性范围中的每一个之间和之上的细胞内浓度。
在一些实施方案中,培养条件包括厌氧或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性厌氧条件先前已有描述且为本领域中所熟知。本文描述了发酵过程的示例性厌氧条件,并且例如在2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中描述了这些条件。这些条件中的任一种以及本领域中熟知的其他厌氧条件皆可用于非天然存在的微生物生物体。在这些厌氧或基本厌氧的条件下,NADH或生物衍生化合物生产者可以合成5至10mM或更高的细胞内浓度以及本文举例说明的所有其他浓度的NADH或生物衍生化合物。应当理解,尽管上述描述指的是细胞内浓度,但生产生物衍生化合物的微生物生物体可以在细胞内生产生物衍生化合物和/或将产物分泌到培养基中。
示例性发酵过程包括但不限于补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离;以及连续发酵和连续分离。在示例性分批发酵方案中,生产生物体在用适当气体喷射的适当大小的生物反应器中生长。在厌氧条件下,用惰性气体或气体组合喷射培养物,例如氮气、N2/CO2混合物、氩气、氦气等。当细胞生长并利用碳源时,额外的一或多种碳源和/或其他营养物以近似平衡的碳源和/或营养物消耗的速率被供给到生物反应器中。生物反应器的温度保持在期望的温度,通常在22℃至37℃的范围内,但是温度也可以保持在更高或更低的温度,这取决于生产生物体的生长特性和/或发酵过程的期望条件。生长持续一段期望的时间段,以获得发酵罐中培养物的期望特性,例如细胞密度、产物浓度等。在分批发酵过程中,发酵的时间段通常在几小时至几天的范围内,例如8至24小时,或1、2、3、4或5天,或多至一周,这取决于期望的培养条件。根据需要,可以控制或不控制pH,在pH未被控制的情况下,培养物的pH通常会在运行结束时降低到pH 3至6。在培养期完成后,发酵罐内容物可以通过细胞分离单元,例如离心机、过滤单元等,以去除细胞和细胞碎片。在期望产物在细胞内表达的情况下,根据需要,在从发酵液中分离细胞之前或之后,可以通过酶促法或化学法裂解或破坏细胞,以释放额外的产物。发酵液可以转移到产物分离单元。通过本领域采用的标准分离程序进行产物的分离,以从稀释水溶液中分离出期望产物。这样的方法包括但不限于使用水不混溶的有机溶剂(例如,甲苯或其他合适的溶剂,包括但不限于乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二氧六烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等)的液-液萃取以提供产物的有机溶液、(如果合适)标准蒸馏方法等,这取决于发酵过程的产品的化学特性。
在示例性的全连续发酵方案中,生产生物体通常首先以分批模式生长,以获得期望的细胞密度。当碳源和/或其他营养物耗尽时,以期望的速率连续供应相同组成的进料培养基,并以相同的速率抽出发酵液。在这样的条件下,生物反应器中的产物浓度以及细胞密度通常保持恒定。如上所述,发酵罐的温度保持在期望的温度。在连续发酵阶段期间,通常希望保持合适的pH范围以优化生产。可以使用常规方法监测和维持pH,包括添加合适的酸或碱以维持期望的pH范围。生物反应器连续运行延长的时间段,通常至少一周到几周,高至一个月,或更长,视情况和需要而定。定期监测发酵液和/或培养物,包括根据需要多至每天取样,以确保产物浓度和/或细胞密度的一致性。在连续模式下,随着新进料培养基的供应,发酵罐内容物不断被移除。包含细胞、培养基和产物的出口流通常经历连续的产物分离程序,根据需要去除或不去除细胞和细胞碎片。本领域采用的连续分离方法可用于从稀释水溶液中分离产物,包括但不限于使用水不混溶的有机溶剂(例如,甲苯或其他合适的溶剂,包括但不限于乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二氧六烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等)的连续液-液萃取,标准连续蒸馏方法等,或本领域公知的其他方法。
培养条件可包括例如液体培养程序以及发酵及其他大规模培养程序。如本文所述,本文所述的生物合成产物的特别有用的产率可以在厌氧或基本厌氧的培养条件下获得。
如本文所述,用于实现NADH或生物衍生化合物的生物合成的一种示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中,本文描述的非天然存在的微生物生物体可以在厌氧或基本厌氧的条件下维持、培养或发酵。简而言之,厌氧条件是指缺氧的环境。基本厌氧的条件包括例如分批发酵或连续发酵培养,使得培养基中的溶解氧浓度保持在0至10%的饱和度。基本厌氧的条件还包括在保持为低于1%氧气的气氛的密封室内,在液体培养基中或在固体琼脂上生长或静息细胞。氧气的百分比可以通过例如用N2/CO2混合物或其他一或多种合适的非氧气气体喷射培养物来保持。
本文所述的培养条件可以放大并连续生长以制造NADH或生物衍生化合物。示例性生长程序包括例如补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离;或连续发酵和连续分离。所有这些过程皆为本领域中所熟知。发酵程序对于商业数量的生物衍生化合物的生物合成生产特别有用。通常,与非连续培养程序一样,NADH或生物衍生化合物的连续和/或接近连续的生产将包括在足够的营养物和培养基中培养本文所述的非天然存在的NADH或生物衍生化合物生产生物体,以维持和/或几乎维持指数期的生长。在这些条件下的连续培养可以包括例如生长或培养1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。此外,连续培养可以包括1周、2周、3周、4周或5周或更多周以及长达几个月的更长时间段。或者,如果适合特定应用,本文所述的生物体可以培养数小时。应当理解,连续和/或接近连续的培养条件也可以包括这些示例性时间段之间的所有时间间隔。还应当理解,培养本文所述的微生物生物体的时间是足以生产用于期望目的的足够量产物的时间段。
发酵程序为本领域中所熟知。简而言之,用于NADH或生物衍生化合物的生物合成生产的发酵可用于例如补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离;或连续发酵和连续分离。分批和连续发酵程序的实例在本领域是公知的。
除了上述使用本文所述的NADH或生物衍生化合物生产者连续生产大量生物衍生化合物的发酵程序之外,如果需要,NADH或生物衍生化合物生产者还可以例如同时进行化学合成和/或酶促程序以将产物转化为其他化合物,或者可以将产物从发酵培养物中分离出来并顺序进行化学和/或酶促转化以将产物转化为其他化合物。
在一些实施方案中,可以选择碳原料和其他细胞摄取源,例如磷酸盐、氨、硫酸盐、氯化物和其他卤素,以改变生物衍生化合物或任何生物衍生化合物途径中间体中存在的原子的同位素分布。上面列举的各种碳原料和其他摄取源在本文统称为“摄取源”。摄取源可以为生物衍生化合物或途径中间体中存在的任何原子,或为由生物衍生化合物途径衍生出的反应中产生的副产物提供同位素富集。对于任何目标原子,包括例如碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯或其他卤素,都可以实现同位素富集。
在一些实施方案中,可选择摄取源以改变碳-12、碳-13和碳-14的比率。在一些实施方案中,可以选择摄取源以改变氧-16、氧-17和氧-18的比率。在一些实施方案中,可以选择摄取源以改变氢、氘和氚的比率。在一些实施方案中,可以选择摄取源以改变氮-14和氮-15的比率。在一些实施方案中,可以选择摄取源以改变硫-32、硫-33、硫-34和硫-35的比率。在一些实施方案中,可以选择摄取源以改变磷-31、磷-32和磷-33的比率。在一些实施方案中,可以选择摄取源以改变氯-35、氯-36和氯-37的比率。
在一些实施方案中,目标原子的同位素比率可以通过选择一种或更多种摄取源而变化到期望的比率。摄取源可以衍生自自然界中发现的天然源,或者衍生自人造源,并且本领域技术人员可以选择天然源、人造源或其组合,以实现目标原子的期望同位素比率。人造摄取源的实例包括例如至少部分衍生自化学合成反应的摄取源。这些同位素富集的摄取源可以商购或在实验室中制备,和/或任选地与摄取源的天然源混合,以实现期望的同位素比率。在一些实施方案中,摄取源的目标原子同位素比率可以通过选择自然界中发现的摄取源的期望来源实现。例如,如本文所讨论的,天然源可以是衍生自生物生物体或由生物生物体合成的生物基来源,或者是诸如石油基产品或大气的来源。在一些这样的实施方案中,例如,碳源可以选自化石燃料衍生的碳源,其可以相对缺少碳-14,或者环境或大气碳源,例如CO2,其可以具有比其石油衍生的对应物更大量的碳-14。
不稳定的碳同位素碳-14或放射性碳约占地球大气中碳原子的1012分之一,半衰期约为5700年。碳储备在高层大气中通过参与核反应的宇宙射线和普通氮(14N)而得到补充。化石燃料不含碳-14,因为其很久以前就衰变了。燃烧化石燃料会降低大气中的碳-14含量,即所谓的“苏斯效应(Suess effect)”。
测定化合物中原子同位素比率的方法是本领域技术人员熟知的。同位素富集可容易地通过使用本领域已知技术的质谱来评估,例如加速质谱(AMS)、稳定同位素比率质谱(SIRMS)和位点特异性天然同位素分馏-核磁共振(SNIF-NMR)。这些质谱技术可以与诸如液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)和/或气相色谱等分离技术相结合。
因此,在一些实施方案中,本文提供了一种具有反映大气碳(也称为环境碳)摄取源的碳-12、碳-13和碳-14比率的生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体。例如,在一些方面,生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体可以具有至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或高达100%的Fm值。在一些这样的实施方案中,摄取源是CO2。在一些实施方案中,本文提供了一种具有反映石油基碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14比率的生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体。在这方面,生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体可以具有小于95%、小于90%、小于85%、小于80%、小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%、小于50%、小于45%、小于40%、小于35%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2%或小于1%的Fm值。在一些实施方案中,本文提供了一种具有通过大气碳摄取源与石油基摄取源的组合获得的碳-12、碳-13和碳-14比率的生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体。使用此类摄取源的组合是可以改变碳-12、碳-13和碳-14比率的一种方式,并且相应的比率将反映摄取源的比例。
此外,本公开涉及本文所公开的生物产生的生物衍生化合物或途径中间体,以及由此衍生的产物,其中所述生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率与环境中出现的CO2的值大致相同。例如,在一些方面,本文提供了一种生物衍生化合物或生物衍生化合物中间体,其碳-12对碳-13对碳-14同位素比率与环境中出现的CO2或本文公开的任何其他比率的值大致相同。应当理解,如本文所公开的,产物的碳-12对碳-13对碳-14同位素比率可以与环境中出现的CO2或本文所公开的任何比率的值大致相同,其中产物由本文所公开的生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体产生,其中生物衍生产物被化学改性以产生最终产物。如本文所述,化学改性生物衍生化合物的生物衍生产物或其中间体以产生期望产物的方法对于本领域技术人员来说是公知的。本公开还提供了碳-12对碳-13对碳-14同位素比率与环境中出现的CO2的值大致相同的生物基产品,其中生物基产品直接由本文公开的生物衍生化合物或生物衍生化合物途径中间体产生或与之组合产生。
本公开还提供了一种组合物,其包含本文所述的生物衍生化合物和除所述生物衍生化合物以外的化合物。除生物衍生产物之外的化合物可以是细胞部分,例如痕量的细胞部分,或者可以是发酵液或培养基,或者为在本文所述的非天然存在的微生物生物体存在下产生的纯化或部分纯化的部分。如本文所公开的,当由生成更少的副产物的生物体产生时,组合物可包含例如减少水平的副产物。组合物可包含例如生物衍生化合物,或本文所述的微生物生物体的细胞裂解物或培养上清液。
本公开还提供了一种用于增加非天然存在的微生物生物体中NADH的可用性的方法。在一些实施方案中,这种方法包括在用于增加NADH可用性的条件下培养本文所述的非天然存在的微生物生物体(例如具有编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸),持续足以增加NADH可用性的时间段。应当理解,本领域技术人员使用本领域公知的方法或本文描述的方法,可以容易地确定增加非天然存在的微生物生物体中NADH的可用性所需的培养条件和时间段。在一些实施方案中,这种方法还包括将编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸引入非天然存在的微生物生物体中(例如,转导或整合到微生物生物体的基因组中)。
在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种用于增加非天然存在的微生物生物体中NADH的可用性的方法产生至少多10%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多20%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多30%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多40%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多50%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多60%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多70%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多80%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多90%的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.1倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.2倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.3倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.4倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.5倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.6倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.7倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.8倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.9倍的NADH。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多2倍的NADH。
在一些实施方案中,用于增加非天然存在的微生物生物体中NADH的可用性的方法导致本文所述的生物衍生化合物的产量增加,其中所述非天然存在的微生物生物体包括能够生产本文所述的生物衍生化合物的途径。在一些实施方案中,这种途径将直接或间接受益于本文所述的辅因子的生产。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少10%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少20%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少30%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少40%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少50%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少60%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少70%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少80%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少90%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.1倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.2倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.3倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.4倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.5倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.6倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.7倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.8倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少1.9倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的生物衍生化合物增加了至少2倍。
本公开还提供了一种用于降低非天然存在的微生物生物体中甲酸浓度的方法。在一些实施方案中,这种方法包括在用于增加甲酸向二氧化碳转化的条件下培养本文所述的非天然存在的微生物生物体(例如,具有编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸),持续足以增加甲酸向二氧化碳转化的时间段,从而增加微生物生物体产生的二氧化碳并降低微生物生物体中的甲酸浓度。应当理解,本领域技术人员使用本领域公知的方法或本文描述的方法,可以容易地确定增加非天然存在的微生物生物体中甲酸向二氧化碳转化所需的培养条件和时间段。在一些实施方案中,这种方法还包括将编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸引入非天然存在的微生物生物体中(例如,转导或整合到微生物生物体的基因组中)。
在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种用于降低非天然存在的微生物生物体中甲酸浓度的方法产生至少多10%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多20%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多30%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多40%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多50%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多60%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多70%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多80%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多90%的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.1倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.2倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.3倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.4倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.5倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.6倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.7倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.8倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多1.9倍的二氧化碳。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,所述方法产生至少多2倍的二氧化碳。
在一些实施方案中,降低非天然存在的微生物生物体中甲酸浓度的方法减少了本文所述的生物衍生化合物的生产方法中作为杂质的甲酸,其中生物衍生化合物的生产方法包括培养具有能够生产本文所述的生物衍生化合物的途径的非天然存在的微生物生物体。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少10%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少20%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少30%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少40%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少50%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少60%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少70%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少80%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少90%。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.1倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.2倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.3倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.4倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.5倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.6倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.7倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.8倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少1.9倍。在一些实施方案中,与培养不存在编码本文所述的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸的相同的微生物生物体相比,这种方法产生的作为杂质的甲酸减少了至少2倍。
在某些实施方案中,本文提供了一种组合物,其包含通过培养本文所述的非天然存在的微生物生物体而生产的本文所提供的生物衍生化合物。在一些实施方案中,组合物还包含除所述生物衍生化合物之外的化合物。在某些实施方案中,除了所述生物衍生化合物之外的化合物是本文所述的非天然存在的微生物生物体的痕量细胞部分。
序列
下表1中的序列示出了可用于生成FDH序列和/或组合物并执行本文所述方法的氨基酸序列。根据需要,可以容易地从DNA序列中推导出RNA序列。
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应当理解,在本文提供的本文描述的定义内也提供了实质上不影响本公开的各实施方案的活性的修改。因此,以下实施例旨在说明但不限制本公开。
实施例
实施例1
合成宏基因组和蛋白质工程FDH文库(初级FDH文库)
合成宏基因组FDH文库的获得和设计
使用大致对应于博伊丁假丝酵母的FDH(UniprotID:O13437;SEQ ID NO:2)的种子氨基酸序列,通过信息学方式从序列数据库获取约2500个FDH候选物。从2500个FDH候选物中选择300个序列(加上两个种子序列)用于基于序列质量、结构和相似性的进一步评估,例如,具有小于50%相似性或大于95%同一性的序列被省略。
然后使用tinker和标准大肠杆菌密码子表将这些蛋白质重新编码到DNA中,并克隆到pSC101ampR载体中。启动子/RBS序列与对照质粒上发现的相同。
基于模板序列的FDH文库的获得和设计
还通过计算设计从选择的模板序列生成蛋白质工程FDH文库。文库是从Ranomics公司订购的。该文库的突变复杂度设定为每个变体少于7个取代。
实施例2
酶文库的筛选
FDH测定的验证
在实施例1中描述的FDH文库的设计和合成之后,使用已知对照对基于Hopner和Knappe,Methods of Enzymatic Analysis,第III卷,1551-1555(1974)中描述的测定的FDH活性筛选测定进行优化,并按比例缩小以在384孔板上运行。下面提供了优化测定的简要描述。
将FDH文库转化株的解冻甘油储备液(5μL)压印到半高深孔板中的含有100μg/mL羧苄青霉素的500μL/孔的1×LB培养基中,并用AeraSeals密封。将板在35℃孵育,并在80%湿度以每分钟1,000转(RPM)的速度摇动16-20小时。将50μL/孔的所得培养物压印到半高深孔板中的含有100μg/mL羧苄青霉素的450μL/孔的1×LB培养基中,并用AeraSeals密封。将板在35℃孵育,并在80%湿度以每分钟1,000转(RPM)的速度摇动16-20小时。将10μL/孔的所得生产培养物压印到96孔平底板中的190μL/孔的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在酶标仪上进行光学测量,在600nm处测量吸光度。将125μL/孔的生产培养物压印到另一组半高深孔板中,密封并在4000×g离心15分钟。解封平板,并倾析除去上清液。将所得沉淀储存在-80℃,直到测定开始。
在测定当天,冷冻沉淀样品板在室温解冻至少一小时。将125μL/孔的裂解缓冲液(1×Bugbuster裂解试剂、2.5mM 1,4-二硫苏糖醇(DTT)、0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、3U/μLrLysozyme、0.0025U/μL Benzonase核酸酶)分配至沉淀板。使用Hamilton STARlet液体处理器中的重复移液装置将缓冲液和沉淀混合25次,得到裂解细胞悬浮液。将5μL/孔的裂解细胞悬浮液混合到96孔平底半区黑色平板中的45μL/孔的测定缓冲液(最终浓度:2.5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、10mM甲酸钠、50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH7.4)中。在酶标仪上进行连续的动态吸光度测量,在340nm处测量吸光度。以10分钟的时间间隔进行测量,在此期间,平板以缓慢的轨道运动连续摇动,并且温度保持在28℃。然后使用Python上的线性拟合和数据处理包处理来自酶标仪的动力学数据。合成宏基因组和蛋白质工程FDH文库的初步筛选
使用上述的优化FDH测定对实施例1中产生的变体进行初步筛选。对该初步筛选实验的结果进行如下处理:
1.绘制每个菌株重复的动力学数据;
2.基于第一个5分钟部分(即线性部分)的数据的线性拟合计算反应速率,并将单位从Abs/秒调整为mAbs/分钟;
3.用OD600数据对速率进行归一化,以获得“归一化速率”;
4.通过将每个容器中的归一化速率除以该容器中高对照速率的平均值得到“标准化率”;
5.基于每个容器中的标准化率和的平均高对照的比率,对所有样品的标准化率进行排序;和
6.通过设定标准化率和平均高对照(即,与高对照相比l.0倍活性)之间的比率的阈值来调用命中。
从筛选的1,386个菌株中,选择1.0倍活性作为截止值,并将270个菌株鉴定为“命中”。在图1中可见筛选中的对照的表现。在对照和命中代表的标准化率中,从左到右表示的样品类型如下:阴性对照(t679853);阳性对照(t594738);以及文库。
根据上述标准所定义的文库命中列于以下:
截止值为50%的命中数为527次。截止值为60%的命中数为464次。截止值为70%的命中数为415次。截止值为80%的命中数为371次。截止值为90%的命中数为328次。截止值为100%的命中数为270次。截止值为110%的命中数为225次。截止值为120%的命中数为183次。截止值为130%的命中数为145次。
实施例3
二级蛋白质工程文库(二级FDH文库)的设计和合成
利用实施例1和2中描述的先前宏基因组和蛋白质工程FDH文库(gen 1)的结果和学习内容进行第二代(gen2)蛋白质工程文库的构建。在先前的筛选工作中,鉴定了来自博伊丁假丝酵母的FDH(UniprotID:O13437;SEQ ID NO:2)的基因重编码(recode),其导致测量的活性提高2倍。宏基因组发现文库还鉴定了来自槲寄生吉布氏菌的FDH(UniprotID:A0A250B5N7;SEQ ID NO:1),其活性是种子(即,来自博伊丁假丝酵母的FDH)的两倍。在蛋白质工程文库中,1176个变体中有84个比来自博伊丁假丝酵母的野生型FDH活性更高。存在超过30个有益的点突变,定义为1.5倍野生型活性,其中前8个比来自博伊丁假丝酵母的野生型FDH大2倍以上。
gen2蛋白质工程文库使用在初始文库中鉴定的来自博伊丁假丝酵母基因重编码的FDH和从槲寄生吉布氏菌发现的FDH作为序列模板。对于来自博伊丁假丝酵母的FDH,采用了几种设计策略来产生变体文库。来自第一个蛋白质工程文库的排名最高的有益点突变被组合以产生具有2-4个点突变的变体。对来自博伊丁假丝酵母的野生型FDH的同源模型以及整合了来自表2中总结的gen1蛋白质工程文库的点突变的模型进行计算对接和设计。
表2:所整合的来自gen1蛋白质工程文库的点突变
残基 | 位置 | 改变 |
A | 91 | S |
H | 97 | N |
A | 257 | S |
T | 256 | C |
Y | 312 | V |
命中重组以及计算对接和设计策略分别产生386和321个构建体。
使用来自槲寄生吉布氏菌的FDH作为模板序列实施了几种不同的蛋白质工程设计策略,包括:(1)FDH同源物的多重序列分析;(2)考虑通常在FDH活性位点的10埃内发生的点突变;(3)考虑在来自博伊丁假丝酵母的FDH中鉴定的有益突变;和(4)使用槲寄生吉布氏菌FDH同源模型的计算对接和设计。这些序列生物信息学、活性位点诱变、命中转移以及对接和设计蛋白质工程策略分别产生了150、140、117和63个构建体。
将变体蛋白序列去重复,放入pG_10499质粒中,并提交1121个成员的文库进行合成,由此产生1,061个构建体规模的文库。
实施例4
二级FDH文库转化
对实施例3中描述的1,061个构建体规模的初始文库执行高通量转化方案。通过3个拣选回收约91%的构建体,并且2.7%(即29个)的构建体为0个拣选,这可能是由于延长的回收时间和增加的DNA量(表3)。
表3:拣选成功。按拣选的克隆数划分的样品数和百分比
拣选数 | 构建体 | 占文库的百分比 |
0 | 29.0 | 2.7% |
1 | 34.0 | 3.2% |
2 | 31.0 | 2.9% |
3+ | 968.0 | 91.1% |
总计 | 1,062.0 | 100.0% |
进一步评估了转化构建体的生长,并基于获得的OD值,在拣选后淘汰了另外的20个构建体(即,1.9%)。结果是,49个构建体(即,4.6%)没有出现在OD值合格的最终低温储备物(cryostock)中,918个构建体(即,86.4%)在OD值合格的最终低温储备物中各由3个克隆代表(表4)。
表4:最终转化株数据和生长成功率,具体展示了具有成功OD(即,生长的样品)的拣选样品的数目和百分比,包括阳性对照。
拣选数 | 构建体 | 占文库的百分比 |
0 | 49.0 | 4.6% |
1 | 34.0 | 3.2% |
2 | 61.0 | 5.7% |
3+ | 918.0 | 86.4% |
总计 | 1,062.0 | 100.0% |
实施例5
二级FDH文库的初步筛选
不同速率术语的定义和计算
以下提供的不同速率术语的定义和计算作为数据收集的参考。术语“原始速率”由反应前五分钟动力学数据的线性回归斜率定义。术语“OD归一化速率”被定义为每个样品的原始速率除以该特定样品的OD。“标准化率”被定义为OD归一化速率除以样品所在特定平板上选定阳性对照的平均OD归一化速率。在数据收集中描述了每个标准化率中使用的阳性对照。
初步筛选:原始速率、OD归一化速率和标准化率
使用实施例2中所述的优化FDH测定进行初步筛选。分析中包括以下阴性对照和三个阳性对照:(1)阴性对照t679853;和(2)阳性对照阳性1(t594738),其来自第一代文库筛选,即,该菌株为野生型FDH;阳性2(t729843),其为来自gen1文库的重编码的野生型命中,成为两个第二代文库模板之一;以及阳性3(t730034),其为来自gen1文库的宏基因组命中。皮尔逊相关系数(R)=0.297也表明略微正相关。总体R值较低可能是由于图右侧的OD异常值较高。使用OD对数据进行归一化以减轻OD依赖性效应,通过使用OD归一化速率(Y轴)观察到命中比阳性对照表现更好。由于阳性2菌株(t729843)在原始速率以及OD归一化速率和每个平板上的平均速率之间具有更好的相关性,因此使用阳性2菌株(t729843)对照来进一步归一化OD归一化数据,以产生具有较小平板间变化的“标准化率”。
初步筛选:命中选择
然后使用以下程序选择200株菌株进行二次筛选:1)仅基于平均标准化率(阳性2菌株(t728943)归一化和OD归一化)对菌株进行排序;2)将来自A和B工作池的数据合并为一个用于此排序过程;和3)选择来自阳性3菌株(t730034)(宏基因组FDH命中)模板的排序前150的菌株和来自阳性2菌株(t729843)(大肠杆菌重编码,密码子优化FDH)模板的排序前50的菌株。
对于所选的200个命中,绘制了重复次数与平均标准化率的对比图。命中包括6个单挑菌株、10个双挑菌株和184个三挑命中菌株。
实施例6
二级FDH文库的二次筛选
二次筛选:原始速率、OD归一化速率和标准化率
使用实施例2中所述的优化FDH测定进行二次筛选。对二次筛选结果的初步分析显示,文库样品的最小速率约为10个速率单位,表明所有的初步命中成员都具有明显的酶活性。速率(Y轴)与OD600(X轴)的点阵图表明,OD与原始速率之间呈正相关,与初步筛选类似。此外,OD归一化文库数据高于阳性3菌株(t730034)。
对于每个容器数据,观察到数据的分布非常均匀。为了与初步筛选相一致并针对不同的阳性对照对反应速率进行基准比较,二次筛选中的反应速率分别针对所有三个阳性对照(t594738;t729843;t730034)进行了标准化。
初步筛选和二次筛选之间的相关性
对初步筛选和二次筛选之间的相关性进行了评估,并且表5中的结果表明,大多数速率类型在两个筛选之间的相关性令人满意,皮尔逊相关性高于0.7,R平方高于0.5,斯皮尔曼相关性高于0.65。除了阳性1菌株(t594738)的标准化率值外,两个筛选的结果强相关,表明来自两个筛选的命中可能是真命中。对于那些表现优于特定阳性对照的命中,标准化(t729843)率或标准化(t730034)率是良好的观察指标。大多数具有良好正相关性的数据在支持相关值的数据中显示出强正斜率聚类。
表5:基于多种反应速率的初步筛选和二次筛选之间的相关性
实施例7
额外的FDH活性分析
通过如下所述进行额外的FDH活性筛选,对选定的变体进行了进一步评估。
产生含有质粒的大肠杆菌菌株,所述质粒在组成型启动子上具有编码FDH变体的核苷酸序列。将菌株接种到含有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB中,并在摇床培养箱中于35℃生长过夜。将过夜培养物稀释到含有羧苄青霉素的新鲜LB中,并在摇床培养箱中在35℃生长过夜。通过离心收集细胞,并将其冷冻在-20℃,直到进行体外裂解物测定的那天。
对于体外裂解物测定,将细胞沉淀解冻并重悬在0.1M Tris-HCl,pH7.0缓冲液中。测量细胞悬浮液的OD600,并将每个候选物归一化为OD为4。通过离心制备沉淀,然后用含有核酸酶和溶菌酶的化学裂解试剂在室温下裂解沉淀30分钟。该裂解物用于测量35℃的FDH活性,如下所示。将粗FDH裂解物的等分试样、期望浓度的甲酸盐(0-100mM)和0.5mM NAD混合在0.04mL 0.1M Tris-HCl,pH 7.4缓冲液中。通过将产物NADH偶联至10μM PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐)和2mM XTT(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺)(2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide),使用560nm处的吸光度监测反应动力学。测定相对于对照的相对活性(例如,SEQ ID NO:1或2,如表6、表7和表8所示)。
这些筛选的结果(包括鉴定的所选变体的活性)如表6和表7所示。
表6:使用来自槲寄生吉布氏菌的FDH(SEQ ID NO:1)作为模板进行工程化的示例性FDH相较于来自槲寄生吉布氏菌野生型对照的FDH的相对活性
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“+”=活性相对于对照增加0.5倍以上至1.5倍
“++”=活性相对于对照增加1.5倍以上
表7:使用来自博伊丁假丝酵母的FDH(SEQ ID NO:2)作为模板进行工程化的示例性FDH相较于来自博伊丁假丝酵母野生型对照的FDH的相对活性
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“+”=FDH活性相对于对照增加0.5至1.5倍以上
“++”=FDH活性相对于对照增加1.5倍以上
“+”=FDH活性相对于对照增加0.5倍以上至1.5倍
“++”=FDH活性相对于对照增加1.5倍以上
基于这些结果,基于槲寄生吉布氏菌的FDH(SEQ ID NO:1)的变体113、115、138、216、264、268、272、290和336以及基于博伊丁假丝酵母的FDH(SEQ ID NO:2)的变体8、13、16、17、25、27、29、32、33、55、58和62被鉴定为相对于对应对照FDH的活性具有最高的活性增加(例如,1.5倍以上的增加),而相对于对照,许多其他变体显示出FDH活性的适度增加(例如,0.5倍以上至1.5倍的增加)。
除了对上述鉴定的变体进行额外筛选外,还使用实施例2和本实施例中描述的相同测定来鉴定来自多种其他生物体的槲寄生吉布氏菌的FDH(SEQ ID NO:1)和博伊丁假丝酵母的FDH(SEQ ID NO:2)的同源物,并筛选了其活性。此筛选的结果提供于表8中。
表8:甲酸脱氢酶同源物
“-”=没有活性至很小的活性
“+”=活性相对于对照增加0.5倍以上至1.5倍
“++”=活性相对于对照增加1.5倍以上
基于这些结果,多种FDH同源物被鉴定为活性大于博伊丁假丝酵母的FDH(SEQ IDNO:2)的1.5倍,包括来自槲寄生吉布氏菌的FDH(SEQ ID NO:1)、博伊丁假丝酵母的FDH(SEQID NO:3)和Clohesyomyces aquaticus(SEQ ID NO:4)的FDH。
实施例8
表达FDH变体的大肠杆菌中1,3-BDO的产量增加
为了评估在实施例1-7中产生和分析的变体FDH对生物衍生产物生产的影响,将编码选定FDH的基因转化到大肠杆菌菌株中,所述大肠杆菌菌株还包括引入的编码1,3-BDO途径酶的基因:1)硫解酶(Thl)、2)3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(Hbd)、3)醛脱氢酶(Ald)和4)醇脱氢酶(Adh)。3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶利用NADH作为辅因子。醛脱氢酶利用NADH或NADPH作为辅因子,优选NADH。醇脱氢酶利用NADPH作为辅因子。引入的FDH包括槲寄生吉布氏菌的FDH(SEQ ID NO:1)、博伊丁假丝酵母的FDH(SEQ ID NO:2)或在实施例6中鉴定为活性大于野生型FDH的1.5倍(即相对于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的FDH)的FDH变体。
将用于表达变体FDH基因的载体转化到Thl/Hbd/Ald/Adh大肠杆菌菌株中,并测试转化株的1,3-BDO生产。在最低限度培养基中向工程化的大肠杆菌细胞提供2%的葡萄糖,并在35℃孵育18小时后收获细胞,并通过分析HPLC或标准LC/MS分析方法评估上清液的1,3-BDO生产。
变体的结果如表9所示。
表9:使用以槲寄生吉布氏菌的FDH(SEQ ID NO:1)作为模板进行工程化的示例性FDH生产1,3-BDO。
“+”=检测到1,3-BDO的生产。
槲寄生吉布氏菌的FDH(SEQ ID NO:1)和博伊丁假丝酵母的FDH(SEQ ID NO:2)均显示出1,3-BDO的生产。此外,测试的所有变体均显示1,3-BDO的生产。这些结果表明,通过采用工程化FDH的活性,NADH的产生和/或通过转化为二氧化碳的甲酸去除可用于生产生物衍生产物,如1,3-BDO。
本申请通篇引用了多篇出版物。这些出版物的公开内容以引用的方式整体并入到本申请中,以便更充分地描述本发明所属领域的发展水平。尽管已经参照上文提供的实施例描述了本发明,但应当理解,可以在不脱离本文所述精神的情况下进行各种修改。
由于可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下对上述主题进行各种变化,因此旨在将包含在上述描述中或在所附权利要求书中定义的所有主题解释为描述和举例说明本发明。根据上述教导,本发明的许多修改和变化是可能的。因此,本说明书旨在涵盖落入所附权利要求书的范围内的所有这些替代方案、修改和变型。
Claims (58)
1.一种工程化甲酸脱氢酶,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的变体或其功能片段,其中所述工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变。
2.根据权利要求1所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶能够:
a)催化甲酸转化为二氧化碳;
b)催化NAD+转化为NADH;或
c)催化甲酸转化为二氧化碳和催化NAD+转化为NADH。
3.根据权利要求1或2所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶能够催化甲酸转化为二氧化碳和催化NAD+转化为NADH。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶包含比由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的甲酸脱氢酶的活性高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍或至少2倍的活性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、100、101、120、121、122、123、124、128、138、143、144、145、146、147、149、150、151、152、153、155、175、176、191、196、198、199、203、204、206、217、218、224、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、315、319、325、329、335、336、338、339、342、343、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、101、120、122、124、138、144、145、146、147、150、151、155、175、176、191、198、199、204、206、217、218、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、319、325、329、335、336、338、339、342、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、98、199、206、231、266或381或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、101、120、122、124、138、144、145、146、147、150、151、155、175、176、191、198、199、204、217、218、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、319、325、329、335、336、338、339、342、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:2中位置36、64、80、91、97、111、120、162、164、187、188、214、229、256、257、260、312、313、315、320、323、361或362或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:2中位置36、64、80、111、120、162、214、229、260、315、320或361或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变为保守性氨基酸取代。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变为非保守性氨基酸取代。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶的一个或更多个氨基酸改变是表6中所述的改变。
14.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;
b)在对应于SEQ ID NO:1中位置9的残基处的F;
c)在对应于SEQ ID NO:1中位置16的残基处的Y;
d)在对应于SEQ ID NO:1中位置19的残基处的K或S;
e)在对应于SEQ ID NO:1中位置27的残基处的K、E、N、A、T或V;
f)在对应于SEQ ID NO:1中位置29的残基处的G、E、K、N、D、A、T或S;
g)在对应于SEQ ID NO:1中位置30的残基处的G、S、A、R或H;
h)在对应于SEQ ID NO:1中位置41的残基处的K;
i)在对应于SEQ ID NO:1中位置53的残基处的A;
j)在对应于SEQ ID NO:1中位置73的残基处的V;
k)在对应于SEQ ID NO:1中位置97的残基处的I或T;
l)在对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的W、S、T或R;
m)在对应于SEQ ID NO:1中位置100的残基处的A;
n)在对应于SEQ ID NO:1中位置101的残基处的F;
o)在对应于SEQ ID NO:1中位置120的残基处的C、G、A、V、H、I、S、F或Q;
p)在对应于SEQ ID NO:1中位置121的残基处的R;
q)在对应于SEQ ID NO:1中位置122的残基处的S;
r)在对应于SEQ ID NO:1中位置123的残基处的A;
s)在对应于SEQ ID NO:1中位置124的残基处的T、A、V;
t)在对应于SEQ ID NO:1中位置128的残基处的N、M或S;
u)在对应于SEQ ID NO:1中位置138的残基处的D;
v)在对应于SEQ ID NO:1中位置143的残基处的W或Y;
w)在对应于SEQ ID NO:1中位置144的残基处的I、C、S、A、N或T;
x)在对应于SEQ ID NO:1中位置145的残基处的P或S;
y)在对应于SEQ ID NO:1中位置146的残基处的Q、N、G、P、Y、A、T、D、S、H或V;
z)在对应于SEQ ID NO:1中位置147的残基处的A、L、V或C;
aa)在对应于SEQ ID NO:1中位置149的残基处的G、A、T或V;
bb)在对应于SEQ ID NO:1中位置150的残基处的T、G、R、D、N、S、Q、E、V或L;
cc)在对应于SEQ ID NO:1中位置151的残基处的A、C或T;
dd)在对应于SEQ ID NO:1中位置152的残基处的A;
ee)在对应于SEQ ID NO:1中位置153的残基处的T;
ff)在对应于SEQ ID NO:1中位置155的残基处的F;
gg)在对应于SEQ ID NO:1中位置175的残基处的R、I、V、A、T或E;
hh)在对应于SEQ ID NO:1中位置176的残基处的S;
ii)在对应于SEQ ID NO:1中位置191的残基处的L;
jj)在对应于SEQ ID NO:1中位置196的残基处的V;
kk)在对应于SEQ ID NO:1中位置198的残基处的I;
ll)在对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;
mm)在对应于SEQ ID NO:1中位置203的残基处的H;
nn)在对应于SEQ ID NO:1中位置204的残基处的V;
oo)在对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q;
pp)在对应于SEQ ID NO:1中位置217的残基处的V;
qq)在对应于SEQ ID NO:1中位置218的残基处的T、N、R、A、E、K、G、H、R、D、S或Q;
rr)在对应于SEQ ID NO:1中位置224的残基处的R;
ss)在对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的D、A、K、R、V、I、L、T、Y或E;
tt)在对应于SEQ ID NO:1中位置238的残基处的T、R、V、Q或E;
uu)在对应于SEQ ID NO:1中位置256的残基处的I、C、L、A、S、H、T、V或E;
vv)在对应于SEQ ID NO:1中位置262的残基处的E或S;
ww)在对应于SEQ ID NO:1中位置264的残基处的E;
xx)在对应于SEQ ID NO:1中位置265的残基处的N或H;
yy)在对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;
zz)在对应于SEQ ID NO:1中位置267的残基处的F;
aaa)在对应于SEQ ID NO:1中位置269的残基处的D或E;
bbb)在对应于SEQ ID NO:1中位置271的残基处的L或M;
ccc)在对应于SEQ ID NO:1中位置284的残基处的S、C、M、L、I、V或A;
ddd)在对应于SEQ ID NO:1中位置285的残基处的S或G;
eee)在对应于SEQ ID NO:1中位置287的残基处的A;
fff)在对应于SEQ ID NO:1中位置290的残基处的I;
ggg)在对应于SEQ ID NO:1中位置291的残基处的D;
hhh)在对应于SEQ ID NO:1中位置297的残基处的R、V、G、N、D、K、E、A或Q;
iii)在对应于SEQ ID NO:1中位置301的残基处的S、A、D、E或N;
jjj)在对应于SEQ ID NO:1中位置303的残基处的K;
kkk)在对应于SEQ ID NO:1中位置313的残基处的Y;
lll)在对应于SEQ ID NO:1中位置315的残基处的E或Y;
mmm)在对应于SEQ ID NO:1中位置319的残基处的R、P、E、V、A或K;
nnn)在对应于SEQ ID NO:1中位置325的残基处的T或S;
ooo)在对应于SEQ ID NO:1中位置329的残基处的H或N;
ppp)在对应于SEQ ID NO:1中位置335的残基处的M、R、V、N、T、L、S或Y;
qqq)在对应于SEQ ID NO:1中位置336的残基处的A或G;
rrr)在对应于SEQ ID NO:1中位置338的残基处的Y、F、W、S、D、V、A、L或N;
sss)在对应于SEQ ID NO:1中位置339的残基处的T、L、G或A;
ttt)在对应于SEQ ID NO:1中位置342的残基处的K、L、A、V、I、N、Y、T、E、S、M、R、C或D;
uuu)在对应于SEQ ID NO:1中位置343的残基处的A;
vvv)在对应于SEQ ID NO:1中位置346的残基处的A、M、I、L或F;
www)在对应于SEQ ID NO:1中位置350的残基处的A;
xxx)在对应于SEQ ID NO:1中位置355的残基处的E;
yyy)在对应于SEQ ID NO:1中位置365的残基处的D、E或P;
zzz)在对应于SEQ ID NO:1中位置374的残基处的E、G、A、R、H、Q或K;
aaaa)在对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的H、K、L、P或R;
bbbb)在对应于SEQ ID NO:1中位置382的残基处的S;和/或
cccc)在对应于SEQ ID NO:1中位置384的残基处的S或T。
15.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;
b)在对应于SEQ ID NO:1中位置9的残基处的F;
c)在对应于SEQ ID NO:1中位置16的残基处的Y;
d)在对应于SEQ ID NO:1中位置19的残基处的K或S;
e)在对应于SEQ ID NO:1中位置27的残基处的K、E、N、A、T或V;
f)在对应于SEQ ID NO:1中位置29的残基处的G、E、K、N、D、A、T或S;
g)在对应于SEQ ID NO:1中位置30的残基处的G、S、A、R或H;
h)在对应于SEQ ID NO:1中位置41的残基处的K;
i)在对应于SEQ ID NO:1中位置53的残基处的A;
j)在对应于SEQ ID NO:1中位置73的残基处的V;
k)在对应于SEQ ID NO:1中位置97的残基处的I或T;
l)在对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的W、R、S或T;
m)在对应于SEQ ID NO:1中位置101的残基处的F;
n)在对应于SEQ ID NO:1中位置120的残基处的G、A、H、S、F、Q、C、V或I;
o)在对应于SEQ ID NO:1中位置122的残基处的S;
p)在对应于SEQ ID NO:1中位置124的残基处的T、A或V;
q)在对应于SEQ ID NO:1中位置138的残基处的D;
r)在对应于SEQ ID NO:1中位置144的残基处的N、I、C、S、A或T;
s)在对应于SEQ ID NO:1中位置145的残基处的P或S;
t)在对应于SEQ ID NO:1中位置146的残基处的P、D、V、Q、N、G、Y、A、T、S或H;
u)在对应于SEQ ID NO:1中位置147的残基处的V、L、C或A;
v)在对应于SEQ ID NO:1中位置150的残基处的G、R、D、N、S、Q、E、L、T或V;
w)在对应于SEQ ID NO:1中位置151的残基处的T、A或C;
x)在对应于SEQ ID NO:1中位置155的残基处的F;
y)在对应于SEQ ID NO:1中位置175的残基处的R、I、V、A、T或E;
z)在对应于SEQ ID NO:1中位置176的残基处的S;
aa)在对应于SEQ ID NO:1中位置191的残基处的L;
bb)在对应于SEQ ID NO:1中位置198的残基处的I;
cc)在对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;
dd)在对应于SEQ ID NO:1中位置204的残基处的V;
ee)在对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q;
ff)在对应于SEQ ID NO:1中位置217的残基处的V;
gg)在对应于SEQ ID NO:1中位置218的残基处的T、N、R、A、E、K、G、H、D、S或Q;
hh)在对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的D、A、K、R、V、I、L、T、Y或E;
ii)在对应于SEQ ID NO:1中位置238的残基处的T、R、V、Q或E;
jj)在对应于SEQ ID NO:1中位置256的残基处的I、C、L、H、T、V、E、A或S;
kk)在对应于SEQ ID NO:1中位置262的残基处的E或S;
ll)在对应于SEQ ID NO:1中位置264的残基处的E;
mm)在对应于SEQ ID NO:1中位置265的残基处的N或H;
nn)在对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;
oo)在对应于SEQ ID NO:1中位置267的残基处的F;
pp)在对应于SEQ ID NO:1中位置269的残基处的D或E;
qq)在对应于SEQ ID NO:1中位置271的残基处的L或M;
rr)在对应于SEQ ID NO:1中位置284的残基处的L、I、V、S、C、M或A;
ss)在对应于SEQ ID NO:1中位置285的残基处的S或G;
tt)在对应于SEQ ID NO:1中位置287的残基处的A;
uu)在对应于SEQ ID NO:1中位置290的残基处的I;
vv)在对应于SEQ ID NO:1中位置291的残基处的D;
ww)在对应于SEQ ID NO:1中位置297的残基处的R、V、G、N、D、K、E、A或Q;
xx)在对应于SEQ ID NO:1中位置301的残基处的S、A、D、E或N;
yy)在对应于SEQ ID NO:1中位置303的残基处的K;
zz)在对应于SEQ ID NO:1中位置313的残基处的Y;
aaa)在对应于SEQ ID NO:1中位置319的残基处的R、P、E、V、A或K;
bbb)在对应于SEQ ID NO:1中位置325的残基处的T或S;
ccc)在对应于SEQ ID NO:1中位置329的残基处的H或N;
ddd)在对应于SEQ ID NO:1中位置335的残基处的R、S、A、M、V、N、T、L或Y;
eee)在对应于SEQ ID NO:1中位置336的残基处的A或G;
fff)在对应于SEQ ID NO:1中位置338的残基处的Y、F、W、L、S、D、V、A或N;
ggg)在对应于SEQ ID NO:1中位置339的残基处的L、G、A、T;
hhh)在对应于SEQ ID NO:1中位置342的残基处的K、L、V、I、N、Y、T、E、M、R、D、A、S或C;
iii)在对应于SEQ ID NO:1中位置346的残基处的M、A、I、L或F;
jjj)在对应于SEQ ID NO:1中位置350的残基处的A;
kkk)在对应于SEQ ID NO:1中位置355的残基处的E;
lll)在对应于SEQ ID NO:1中位置365的残基处的D、E或P;
mmm)在对应于SEQ ID NO:1中位置374的残基处的E、G、A、R、H、Q或K;
nnn)在对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的P、H、K、L或R;
ooo)在对应于SEQ ID NO:1中位置382的残基处的S;和/或
ppp)在对应于SEQ ID NO:1中位置384的残基处的S或T。
16.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;
b)在对应于SEQ ID NO:1中位置9的残基处的F;
c)在对应于SEQ ID NO:1中位置16的残基处的Y;
d)在对应于SEQ ID NO:1中位置19的残基处的K或S;
e)在对应于SEQ ID NO:1中位置27的残基处的K、E、N、A、T或V;
f)在对应于SEQ ID NO:1中位置29的残基处的G、E、K、N、D、A、T或S;
g)在对应于SEQ ID NO:1中位置30的残基处的G、S、A、R或H;
h)在对应于SEQ ID NO:1中位置41的残基处的K;
i)在对应于SEQ ID NO:1中位置53的残基处的A;
j)在对应于SEQ ID NO:1中位置73的残基处的V;
k)在对应于SEQ ID NO:1中位置97的残基处的I或T;
l)在对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的S或T;
m)在对应于SEQ ID NO:1中位置101的残基处的F;
n)在对应于SEQ ID NO:1中位置120的残基处的C、V或I;
o)在对应于SEQ ID NO:1中位置122的残基处的S;
p)在对应于SEQ ID NO:1中位置124的残基处的V;
q)在对应于SEQ ID NO:1中位置138的残基处的D;
r)在对应于SEQ ID NO:1中位置144的残基处的I、C、S、A或T;
s)在对应于SEQ ID NO:1中位置145的残基处的S;
t)在对应于SEQ ID NO:1中位置146的残基处的Q、N、G、Y、A、T、S或H;
u)在对应于SEQ ID NO:1中位置147的残基处的A;
v)在对应于SEQ ID NO:1中位置150的残基处的T或V;
w)在对应于SEQ ID NO:1中位置151的残基处的A或C;
x)在对应于SEQ ID NO:1中位置155的残基处的F;
y)在对应于SEQ ID NO:1中位置175的残基处的R、I、V、A、T或E;
z)在对应于SEQ ID NO:1中位置176的残基处的S;
aa)在对应于SEQ ID NO:1中位置191的残基处的L;
bb)在对应于SEQ ID NO:1中位置198的残基处的I;
cc)在对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;
dd)在对应于SEQ ID NO:1中位置204的残基处的V;
ee)在对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q;
ff)在对应于SEQ ID NO:1中位置217的残基处的V;
gg)在对应于SEQ ID NO:1中位置218的残基处的T、N、R、A、E、K、G、H、D、S或Q;
hh)在对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的D、A、K、R、V、I、L、T、Y或E;
ii)在对应于SEQ ID NO:1中位置238的残基处的T、R、V、Q或E;
jj)在对应于SEQ ID NO:1中位置256的残基处的A或S;
kk)在对应于SEQ ID NO:1中位置262的残基处的E或S;
ll)在对应于SEQ ID NO:1中位置264的残基处的E;
mm)在对应于SEQ ID NO:1中位置265的残基处的N或H;
nn)在对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;
oo)在对应于SEQ ID NO:1中位置267的残基处的F;
pp)在对应于SEQ ID NO:1中位置269的残基处的D或E;
qq)在对应于SEQ ID NO:1中位置271的残基处的L或M;
rr)在对应于SEQ ID NO:1中位置284的残基处的S、C、M或A;
ss)在对应于SEQ ID NO:1中位置285的残基处的G;
tt)在对应于SEQ ID NO:1中位置287的残基处的A;
uu)在对应于SEQ ID NO:1中位置290的残基处的I;
vv)在对应于SEQ ID NO:1中位置291的残基处的D;
ww)在对应于SEQ ID NO:1中位置297的残基处的R、V、G、N、D、K、E、A或Q;
xx)在对应于SEQ ID NO:1中位置301的残基处的S、A、D、E或N;
yy)在对应于SEQ ID NO:1中位置303的残基处的K;
zz)在对应于SEQ ID NO:1中位置313的残基处的Y;
aaa)在对应于SEQ ID NO:1中位置319的残基处的R、P、E、V、A或K;
bbb)在对应于SEQ ID NO:1中位置325的残基处的T或S;
ccc)在对应于SEQ ID NO:1中位置329的残基处的H或N;
ddd)在对应于SEQ ID NO:1中位置335的残基处的S、A、M、V、N、T、L或Y;
eee)在对应于SEQ ID NO:1中位置336的残基处的A或G;
fff)在对应于SEQ ID NO:1中位置338的残基处的S、D、V、A或N;
ggg)在对应于SEQ ID NO:1中位置339的残基处的T;
hhh)在对应于SEQ ID NO:1中位置342的残基处的A、S或C;
iii)在对应于SEQ ID NO:1中位置346的残基处的I、L或F;
jjj)在对应于SEQ ID NO:1中位置350的残基处的A;
kkk)在对应于SEQ ID NO:1中位置355的残基处的E;
lll)在对应于SEQ ID NO:1中位置365的残基处的D、E或P;
mmm)在对应于SEQ ID NO:1中位置374的残基处的E、G、A、R、H、Q或K;
nnn)在对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的H、K、L或R;
ooo)在对应于SEQ ID NO:1中位置382的残基处的S;和/或
ppp)在对应于SEQ ID NO:1中位置384的残基处的S或T。
17.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;
b)在对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的T;
c)在对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;
d)在对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q;
e)在对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的A、K、R、T、E、Y、V、I或L;
f)在对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;和/或
g)在对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的P、K、L、R、H。
18.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;
b)在对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的T;
c)在对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I或V;
d)在对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q;
e)在对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的V、I或L;
f)在对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M或L;和/或
g)在对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的H。
19.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶的一个或更多个氨基酸改变是表7中所述的改变。
20.根据权利要求19所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K;
b)在对应于SEQ ID NO:2中位置64的残基处的V;
c)在对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E;
d)在对应于SEQ ID NO:2中位置91的残基处的S;
e)在对应于SEQ ID NO:2中位置97的残基处的N;
f)在对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T;
g)在对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I;
h)在对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L;
i)在对应于SEQ ID NO:2中位置164的残基处的V;
j)在对应于SEQ ID NO:2中位置187的残基处的G;
k)在对应于SEQ ID NO:2中位置188的残基处的C;
l)在对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T;
m)在对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的V、T或C;
n)在对应于SEQ ID NO:2中位置256的残基处的C;
o)在对应于SEQ ID NO:2中位置257的残基处的G或S;
p)在对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;
q)在对应于SEQ ID NO:2中位置312的残基处的V、F或T;
r)在对应于SEQ ID NO:2中位置313的残基处的G或A;
s)在对应于SEQ ID NO:2中位置315的残基处的C或S;
t)在对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的T或S;
u)在对应于SEQ ID NO:2中位置323的残基处的M;
v)在对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;和/或
w)在对应于SEQ ID NO:2中位置362的残基处的K。
21.根据权利要求19所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K;
b)在对应于SEQ ID NO:2中位置64的残基处的V;
c)在对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E;
d)在对应于SEQ ID NO:2中位置91的残基处的S;
e)在对应于SEQ ID NO:2中位置97的残基处的N;
f)在对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T;
g)在对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I;
h)在对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L;
i)在对应于SEQ ID NO:2中位置164的残基处的V;
j)在对应于SEQ ID NO:2中位置187的残基处的G;
k)在对应于SEQ ID NO:2中位置188的残基处的C;
l)在对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T;
m)在对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的T或C;
n)在对应于SEQ ID NO:2中位置256的残基处的C;
o)在对应于SEQ ID NO:2中位置257的残基处的G或S;
p)在对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;
q)在对应于SEQ ID NO:2中位置312的残基处的V、F或T;
r)在对应于SEQ ID NO:2中位置313的残基处的G或A;
s)在对应于SEQ ID NO:2中位置315的残基处的C;
t)在对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的S;
u)在对应于SEQ ID NO:2中位置323的残基处的M;
v)在对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;和/或
w)在对应于SEQ ID NO:2中位置362的残基处的K。
22.根据权利要求19所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K;
b)在对应于SEQ ID NO:2中位置64的残基处的V;
c)在对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E;
d)在对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T;
e)在对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I;
f)在对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L;
g)在对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T;
h)在对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的V、T或C;
i)在对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;
j)在对应于SEQ ID NO:2中位置315的残基处的C或S;
k)在对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的T或S;和/或
l)在对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R。
23.根据权利要求19所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K;
b)在对应于SEQ ID NO:2中位置64的残基处的V;
c)在对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E;
d)在对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T;
e)在对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I;
f)在对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L;
g)在对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T;
h)在对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的T或C;
i)在对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;
j)在对应于SEQ ID NO:2中位置315的残基处的C;
k)在对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的S;和/或
l)在对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变包括至少一个、两个、三个或四个改变。
25.根据权利要求24所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶:
a)在对应于SEQ ID NO:1中位置381的残基处的H;
b)在对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q和对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的I;
c)在对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I;
d)在对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q和对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的V;
e)在对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的I和对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的L;
f)在对应于SEQ ID NO:1中位置206的残基处的Q和对应于SEQ ID NO:1中位置231的残基处的L;
g)在对应于SEQ ID NO:1中位置2的残基处的A;
h)在对应于SEQ ID NO:1中位置98的残基处的T;
i)在对应于SEQ ID NO:1中位置199的残基处的V和对应于SEQ ID NO:1中位置266的残基处的M;
j)在对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;
k)在对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;
l)在对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置260的残基处的G;
m)在对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;
n)在对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K、对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L、对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T、和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;
o)在对应于SEQ ID NO:2中位置80的残基处的E和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;
p)在对应于SEQ ID NO:2中位置120的残基处的I和对应于SEQ ID NO:2中位置320的残基处的S;
q)在对应于SEQ ID NO:2中位置36的残基处的K和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;
r)在对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T和对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L;
s)在对应于SEQ ID NO:2中位置111的残基处的T、对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L、和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;
t)在对应于SEQ ID NO:2中位置64的残基处的V、对应于SEQ ID NO:2中位置162的残基处的L、对应于SEQ ID NO:2中位置214的残基处的T、和对应于SEQ ID NO:2中位置361的残基处的R;或
u)在对应于SEQ ID NO:2中位置229的残基处的C和对应于SEQ ID NO:2中位置315的残基处的C。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶,其中所述工程化甲酸脱氢酶的氨基酸序列不由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。
27.一种工程化甲酸脱氢酶,其包含选自SEQ ID NO:3-24中任一者的氨基酸序列的变体,其中所述工程化甲酸脱氢酶包含在对应于表6和/或表7中所述位置的位置处的一个或更多个改变。
28.一种重组核酸,其编码根据权利要求1至27中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶。
29.根据权利要求28所述的重组核酸,其中所述核酸包含与启动子可操作地连接的编码所述工程化甲酸脱氢酶的核苷酸序列。
30.一种载体,其包含根据权利要求28或29所述的重组核酸。
31.一种非天然存在的微生物生物体,其包含编码选自权利要求1至27中任一项的工程化甲酸脱氢酶的重组核酸。
32.根据权利要求31所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述非天然存在的微生物生物体还包含能够产生生物衍生化合物的途径,其中所述途径中的一种或更多种酶使用NADH或NADPH作为辅因子来催化其酶促反应。
33.根据权利要求32所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述途径中的所述一种或更多种酶由外源核酸编码。
34.根据权利要求33所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述外源核酸是异源的。
35.根据权利要求34所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述外源核酸是同源的。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述生物衍生化合物是醇、二元醇、有机酸、烯烃、二烯烃、有机胺、有机醛、维生素、保健品或药物。
37.根据权利要求36所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述醇选自由以下组成的组:
a)生物燃料醇,其中所述生物燃料是包含C3至C10碳原子的伯醇、仲醇、二醇或三醇;
b)正丙醇或异丙醇;和
c)脂肪醇,其中所述脂肪醇包含C4至C27碳原子、C8至C18碳原子、C12至C18碳原子或C12至C14碳原子。
38.根据权利要求37所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述生物燃料醇是1-丙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、1-戊醇、异戊烯醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、1-庚醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-己醇。
39.根据权利要求37所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述二醇是丙二醇或丁二醇。
40.根据权利要求39所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述丁二醇是1,4-丁二醇、1,3-丁二醇或2,3-丁二醇。
41.根据权利要求39所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述丁二醇是1,3-丁二醇。
42.根据权利要求32所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述生物衍生化合物选自由以下组成的组:
a)1,4-丁二醇或其中间体,其中所述中间体任选地为4-羟基丁酸(4-HB);
b)丁二烯(1,3-丁二烯)或其中间体,其中所述中间体任选地为1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、巴豆醇、3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)或3-丁烯-1-醇;
c)1,3-丁二醇或其中间体,其中所述中间体任选地为3-羟基丁酸酯/盐(3-HB)、2,4-戊二烯酸酯/盐、巴豆醇或3-丁烯-1-醇;
d)己二酸酯/盐、6-氨基己酸、己内酰胺、己二胺、乙酰丙酸或其中间体,其中所述中间体任选地为己二酰辅酶A或4-氨基丁酰辅酶A;
e)甲基丙烯酸或其酯、3-羟基异丁酸酯/盐、2-羟基异丁酸酯/盐或其中间体,其中所述酯任选地为甲基丙烯酸甲酯或聚(甲基丙烯酸甲酯);
f)1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、二丙二醇、三丙二醇、新戊二醇、双酚A或其中间体;
g)琥珀酸或其中间体;和
h)包含C4至C27碳原子、C8至C18碳原子、C12至C18碳原子或C12至C14碳原子的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸,其中所述脂肪醇任选地为十二烷醇(C12;月桂醇)、十三烷醇(C13;1-十三醇、十三醇、异十三醇)、肉豆蔻醇(C14;1-十四醇)、十五烷醇(C15;1-十五醇、十五醇)、鲸蜡醇(C16;1-十六醇)、十七烷醇(C17;1-正十七醇、十七醇)和硬脂醇(C18;1-十八醇)或棕榈油醇(C16不饱和;顺式-9-十六碳烯-1-醇)。
43.根据权利要求31至42中任一项所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述非天然存在的微生物生物体是在基本上厌氧的培养基中。
44.根据权利要求31至43中任一项所述的非天然存在的微生物生物体,其中所述微生物生物体是细菌、酵母或真菌的物种。
45.根据权利要求31至44中任一项所述的非天然存在的微生物生物体,其中与不包含根据权利要求25或26所述的核酸的对照微生物生物体相比,所述非天然存在的微生物生物体能够生产多至少10%的NADH或生物衍生化合物。
46.一种生产生物衍生化合物的方法,其包括在用于生产所述生物衍生化合物的条件下培养根据权利要求32至45中任一项所述的非天然存在的微生物生物体,持续足以生产所述生物衍生化合物的时间段。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述方法还包括将所述生物衍生化合物与培养物中的其他组分进行分离。
48.根据权利要求47所述的方法,其中所述分离包括萃取、连续液-液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、吸附色谱或超滤。
49.一种培养基,其包含通过权利要求46至48中任一项所述的方法生产的所述生物衍生化合物,其中所述生物衍生化合物具有反映大气二氧化碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。
50.一种生物衍生化合物,其由根据权利要求46至48中任一项所述的方法生产。
51.根据权利要求50所述的生物衍生化合物,其中所述生物衍生化合物具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值。
52.一种组合物,其包含根据权利要求50或51所述的生物衍生化合物和除所述生物衍生化合物以外的化合物。
53.根据权利要求52所述的组合物,其中所述除所述生物衍生化合物以外的化合物是具有生物衍生化合物途径的非天然存在的微生物生物体的痕量细胞部分。
54.一种组合物,其包含根据权利要求50或51所述的生物衍生化合物或其细胞裂解物或培养上清液。
55.一种增加非天然存在的微生物生物体中NADH的可用性的方法,其包括在用于增加NADH的可用性的条件下培养根据权利要求31至45中任一项所述的非天然存在的微生物生物体,持续足以增加NADH的可用性的时间段。
56.根据权利要求55所述的方法,其中增加NADH的可用性导致权利要求32至42中任一项所描述的生物衍生化合物的产量增加。
57.一种降低非天然存在的微生物生物体中的甲酸浓度的方法,其包括在用于增加甲酸向二氧化碳转化的条件下培养根据权利要求31至45中任一项所述的非天然存在的微生物生物体,持续足以增加甲酸向二氧化碳转化的时间段。
58.根据权利要求57所述的方法,其中降低所述非天然存在的微生物生物体中的甲酸浓度导致在用于生产权利要求32至42任一项中所描述的生物衍生化合物的方法中作为杂质的甲酸的减少。
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