CN107750276A

CN107750276A - 用于改进巴豆醇生产的工程化微生物和方法

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Publication number: CN107750276A
Application number: CN201680034149.9A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬妮·J·卡勒; 尼古拉斯·伊克利; 凯文·格雷戈里·霍夫; 罗宾·E·奥斯特霍特; 普里蒂·法克雅; 埃里克·C·拉夫; 斯蒂芬·范·戴恩
Original assignee: Genomatica Inc
Current assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-07
Publication date: 2018-03-02
Also published as: EP3280808B1; US20210277426A1; US20180135082A1; WO2016164586A1; EP3280808A1; US10844404B2; BR112017021667A2; KR20170134682A

Abstract

本发明公开了用于增强或改进巴豆醇生产的方法和工程化微生物。该工程化微生物包括醇脱氢酶、烯烃还原酶或两种酶活性的基因修饰。通过这样的基因修饰，提供或改进了巴豆醇生产途径。

Description

用于改进巴豆醇生产的工程化微生物和方法

优先权要求

本申请要求2015年4月9日提交的序列号62/145,290的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

同时，亦以引用的方式将2016年3月29日创建的标题为“GNO0025WO序列ST25”、大小为31kb的ASCII文本文件的全部内容并入本申请。

背景技术

巴豆醇(Crotylalcohol)，也称为巴豆醇(crotonylalcohol)或2-丁烯-1-醇(but-2-en-l-ol)，是图1所示化学式C₄H₈O的不饱和醇。巴豆醇是一种有价值的化学中间体，用作烯烃的前体，包括1,3-丁二烯，巴豆酰卤，酯和醚，，而后者是聚合物、精细化学品、农药和药物生产中的化学中间体。

生产改进巴豆醇的工程化微生物是基于石油生产的具吸引力的替代物。但是当这些醇由细胞产生并释放时，它们会在培养过程中在培养基中累积。由于微生物，如细菌，通常具有低的醇耐受性，培养基条件的改变可影响微生物的生长和生存。

培养期间从培养基中移除酒精是解决这一问题的一种方法。但是这种移除过程可能是昂贵和低效的。另一种方法是使用对醇具有更高耐受性的天然细菌分离物。然而，这种菌株通常不适用于工业生产或工程。

发明内容

公开了用于生产作为生物产品或作为其他生物产品的中间体的巴豆醇的方法和工程化微生物。

在一个实施例中，提供了使用工程化微生物生产生物产品的方法，其中，巴豆醇是生物产品，或者巴豆醇是生物产品途径中的中间体(例如1,3-丁二烯，1,3-丁二醇，甲基乙烯基甲醇)，该方法包括：

在生产巴豆醇的条件下，或生产生物产品时使用巴豆醇作为生物产品途径的中间体的条件下，培养工程化微生物，其中，工程化微生物包括至少一种基因修饰，该基因修饰引起(a)将巴豆醇转化为巴豆醛的醇脱氢酶(ADH)，(b)将丁醛转化为丁醇的ADH，或(c)将巴豆醛转化为丁醛的烯烃还原酶或(a)，(b)和(c)的任何组合的活性的部分或完全丧失。

在一些实施例中，微生物还包含至少一种编码生物产品途径的酶的外源核酸，其中生物产品途径是巴豆醇途径，或者使用巴豆醇作为生物产品的途径的中间体。

在另一个实施例中，公开了一种工程化微生物，包括至少一种基因修饰，所述基因修饰引起(a)将巴豆醇转化为巴豆醛的醇脱氢酶(ADH)，(b)将丁醛转化为丁醇的ADH(C)将巴豆醛转化为丁醛的烯烃还原酶或(a)、(b)和(c)的任何组合的活性的部分或完全丧失，和至少一种编码生物产品途径的酶的外源核酸，其中，所述生物产品途径为巴豆醇途径或使用巴豆醇作为生物产品途径的中间体。

在其它实施例中，提供了使用工程化微生物生产生物产品的方法，其中巴豆醇是生物产品，或者巴豆醇是生物产品途径中的中间体(例如1,3-丁二烯，1,3-丁二醇，甲基乙烯基甲醇)，该方法包括：

提供工程化微生物，具有至少一种基因修饰，所述基因修饰引起(a)将巴豆醇转化为巴豆醛的醇脱氢酶(ADH)，(b)将丁醛转化为丁醇的ADH(c)将巴豆醛转化为丁醛的烯烃还原酶或(a)、(b)和(c)的任何组合的活性的部分或完全丧失；以及

在生产巴豆醇的条件下，或生产生物产品时使用巴豆醇作为生物产品途径的中间体的条件下，培养工程化微生物。

在一些实施例中，部分或完全丧失活性的醇脱氢酶和烯烃还原酶对微生物是天然的，并且醇脱氢酶能够将巴豆醇转化为巴豆醛和/或将丁醛转化为丁醇，并且烯烃还原酶能够将巴豆醛转化为丁醛。当这些天然活性与期望的酶活性竞争时被认为是非期望的活性，所述期望的酶活性包含向巴豆醇或巴豆醇衍生的生物产品的途径。

该微生物可以被进一步基因修饰以增加将巴豆醛转化为巴豆醇的酶的活性，例如巴豆醛还原酶(醇形成)，特别是在巴豆醛是副产物而不是生物产品途径中间体的情况下。

这些公开的方法和工程化微生物允许巴豆醇水平的生长高于没有基因修饰的微生物。这样的微生物也可以产生显著更多的巴豆醇。此外，所公开的方法和微生物可以通过减少或消除巴豆醇向不期望的或浪费的途径的转化，来提高巴豆醇产率的效率和/或降低工艺成本。

附图说明

图1为通过巴豆醇由乙酰辅酶A、戊烯二酰辅酶A(glutaconyl-CoA)、戊二酰辅酶A(glutaryl-CoA)、3-氨基丁酰辅酶A或4-羟基丁酰辅酶A生产巴豆醇和丁二烯的示例性途径。将识别的底物转化为产品的酶包括：A.乙酰辅酶A：乙酰辅酶A酰基转移酶，B.乙酰乙酰辅酶A还原酶，C.3-羟基丁酰辅酶A脱水酶，D.巴豆酰辅酶A还原酶(醛形成)，E.巴豆醛还原酶(醇形成)，F.巴豆醇激酶，G.2-丁烯基-4-磷酸激酶，H.丁二烯合成酶，I.巴豆酰辅酶A水解酶，合成酶，转移酶，J.巴豆酸还原酶，K.巴豆酰辅酶A还原酶(醇形成)，L.戊烯二酰辅酶A脱羧酶，M.戊烯二酰辅酶A脱氢酶，N.3-氨基丁酰辅酶A脱氨酶，O.4-羟基丁酰辅酶A脱水酶，P.巴豆醇二磷酸激酶。

图2为将巴豆醇(2-丁烯-1-醇)转化为3-丁烯-2-醇和/或丁二烯的示例性途径。酶为A.巴豆醇激酶，B.2-丁烯-4-磷酸激酶，C.丁二烯合成酶，D.3-丁烯-2-醇合成酶，E.3-丁烯-2-醇合成酶，F.巴豆醇异构酶，一种乙烯基异构酶，G.3-丁烯-2-醇脱水酶，H.巴豆醇脱水酶，一种脱水酶/乙烯基异构酶，I.巴豆醇二磷酸激酶，J.丁二烯合成酶(来自2-丁烯-4-磷酸)。巴豆醇可以化学脱水成丁二烯。

图3显示了将巴豆醇转化成副产物(步骤C，G和/或H)和将副产物巴豆醛转化成巴豆醇的反应(步骤B)。用于转化鉴定的底物的酶包括B.巴豆醛还原酶(醇形成)，也称为醛还原酶(醇形成)，C.巴豆醇脱氢酶，G.巴豆醛还原酶(也称为烯烃还原酶)，H.丁醛醛还原酶(醇形成)。

图4A-B为大肠杆菌菌株K-12substr.MG1655的生长曲线和在葡萄糖(图4A)和葡萄糖+巴豆醇(图4B)上生长的各种修饰，相对于培养时间根据在OD420-580的培养浊度。

图5A-B为大肠杆菌菌株ATCC 8739的生长曲线和在葡萄糖(图5A)和在葡萄糖+巴豆醇(图5B)上生长的各种修饰，相对于培养时间根据在OD420-580的培养浊度。

图6A-D显示各种nemA和yqhD缺失菌株(3-GGGF，3-GHDO，3-HAEF，3-HAEG)中的巴豆醇和丁醇测量。

具体实施方式

本申请中所述的实施例并不意在将本公开内容尽数穷举，或限制为以下详细描述中所公开的精确形式。相反，对实施例进行了选择和描述，以便本领域技术人员可以理解和明白本说明书中的原理和实施。

本文公开的所有出版物和专利申请在此整体引入作为参考。本申请所提供的出版物和专利仅用于公开。

本文所用的术语“醇脱氢酶”(也称为ADH)是指可将巴豆醇转化为巴豆醛和/或将丁醛转化成丁醇的酶，包括分类为EC 1.1.1的那些酶。将巴豆醇转化为巴豆醛的酶在本文中也称为巴豆醇脱氢酶(巴豆基ADH)。将丁醛转化为丁醇的醇脱氢酶在本文也成为丁醛还原酶(醇形成)。

术语“烯烃还原酶”是指可将巴豆醛转化为丁醛的酶。

本文所用的术语“生物生产”是指微生物合成。当涉及所需或所参考物质或产品的微生物合成时，术语“生产”和“生物合成”可以互换使用。

术语“工程化”是指具有至少一种基因修饰的微生物有机体或微生物，该基因修饰通常不存在于所参考物种的天然存在的菌株、野生型菌株或亲本宿主菌株中

本文所用术语“外源的”是指被引入到宿主微生物有机体中的所参考的分子或所参考的活性。该分子的引入可以是，例如，通过将编码核酸导入宿主遗传物质中，例如通过整合进宿主染色体中，或作为非染色体遗传物质，如质粒。因此，该术语用于编码核酸的表达时，是指将编码核酸的可表达形式引入微生物有机体中。当用于指代生物合成活性时或生物产品时，该术语是指引入亲本宿主有机体的活性。其来源可以是，例如，在导入亲本宿主微生物有机体后表达所指的活性的同源或异源的编码核酸。因此，外源包括对天然基因的调节区或天然基因的调节蛋白的基因修饰，其导致该天然基因或其编码酶的表达与不存在该修饰不同。因此，术语“内源的”是指存在于宿主中的参考分子或活性。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指包含在微生物有机体中的编码核酸的表达。术语“异源”是指来源于除参考物种之外的来源的分子或活性，而“同源”是指源自宿主微生物有机体的分子或活性。对应地，编码核酸的外源表达可以利用异源或同源编码核酸中的任一种或两种。

本文所用的术语“基因修饰”是指一种改变，其中核酸删除(缺失)或引入核酸、多肽的表达来编码或表达代谢多肽、酶或其他添加核酸、删除核酸和/或微生物及遗传物质的其他功能性破坏的改变。这样的修饰，例如，可以在参考物种的异源、同源或异源和同源的多肽的编码区和其功能片段中进行。其他的修饰包括，例如，非编码调节区，其中所述修饰改变了基因或操纵子的表达。术语“遗传改变”可与基因修饰互换使用。

术语“代谢修饰”是指从天然存在状态改变的生化反应。因此，工程化微生物可以在编码代谢多肽或其功能片段的核酸上具有基因修饰。

术语“微生物”“微生物有机体”“微生物体”是指以微小细胞存在并包括原核或真核细胞的有机体，或具有微观尺寸并且包括细菌、古细菌和真细菌的所有物种以及真核微生物如酵母和真菌的有机体。该术语还包括可以培养来用于生产生物产品的任何物种的细胞。

当在基因修饰的上下文中使用时，术语“亲本微生物有机体”或其语法等同物(和包括亲本宿主微生物或宿主微生物)被理解为是指未经特定基因修饰的亲本微生物或菌株，除此之外，还具有相同的基因组成。例如，如果使用微生物有机体的菌株来进行增加基因产物表达的基因修饰，则亲本菌株将是引入异源基因的起始菌株。类似地，对亲本微生物有机体进行基因修饰以降低表达，如基因破坏或基因删除，除了基因破坏或删除之外，亲本微生物有机体具有相同的遗传背景。然而，应当理解，根据是否考虑单个或多个基因修饰，亲本微生物有机体可以通过多于一种基因修饰而不同，基因添加和/或破坏。本领域技术人员将容易理解这种亲本微生物有机体的含义，因为如本领域所理解的，微生物有机体被认为是观察一种或多种基因修饰的作用的适当对照。

术语“部分损失”，“活性降低”等指微生物酶或分离的酶表现了比亲本微生物有机体或其天然酶低的活性水平。该术语还可以包括酶活性的消除。

公开了具有对ADH酶活性、烯烃还原酶活性或两者的基因修饰的工程化微生物。与不具有公开的基因修饰的亲本宿主菌株或微生物相比，这种工程化微生物能够积累更大的巴豆醇量(例如滴度)，具有更多的巴豆醇的可利用性，并且能够生长在较高的巴豆醇水平上。这种工程化微生物可用于巴豆醇的发酵生产。该工程化微生物也可用于提供改良的巴豆醇途径和通过巴豆醇作为中间体的其它生物产品途径。此外，所公开的方法和微生物可以通过减少或消除将巴豆醇转移到不需要的代谢产物或中间体的不期望的或浪费的途径来提高巴豆醇产率的效率和/或降低加工成本，其中一些代谢产物或中间体可能不利地影响微生物的健康。例如，通过与亲本菌株相比具有更大的巴豆醇的可利用性，可以将更多的巴豆醇酶催化转化为感兴趣的生物产品，例如丁二烯，1,3-丁二醇或甲基乙烯基甲醇或感兴趣的生物产品的中间体。使用本领域已知的方法和培养基在合适的培养基中培养细胞。

可用作待工程改造的亲本宿主微生物有机体的示例性微生物包括例如细菌、酵母、真菌或适用于发酵过程的各种其它微生物中的任何一种，包括甲基营养菌或被工程改造为甲基营养菌的微生物。示例性细菌包括选自以下的种类：不动杆菌属(Acinetobacter)，埃希氏杆菌属(Escherichia)，克雷伯菌属(Klebsiella)，厌氧菌属(Anaerobiospirillum)，放线杆菌属(Actinobacillus)，卡斯特利螨属(Castellamella)，曼海默氏菌属(Mannheimia)，芽孢杆菌属(Bacillus)，发酵单胞菌属(Zymomonas)，乳球菌属(Lactococcus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，梭菌属(Clostridium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，紫草属(Thauera)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。

示例性细菌包括选自以下的种类：大肠杆菌(Escherichiacoli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、Castellamella caeni、Castellamella daejeonensis、Castellamella defragrans、Castellamelladenitrificans、Castellamella ginsengisoli、Castellamella hirudinis、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、Thauera aminoaromatica、Thauera aromatica、Thauera butanivorans、Thauera chlorobenzoica、Thauerahumireducens、Thauera linaloolentis、Thauera mechernichensis、Thaueraphenylacetica、Thauera selenatis、Thauera terpenica和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)

示例性的酵母或真菌的物种包括选自以下的种类：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、Rhizobus oryzae、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)等。

大肠杆菌是一种特别有用的亲本宿主有机体，因为它是适合基因工程的良好表征的微生物有机体。其他特别有用的宿主微生物包括酵母，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。应当理解，任何合适的微生物可用于引入代谢和/或基因修饰以产生工程化微生物，其工程化微生物能够产生所需的生物产品。在一些实施例中，大肠杆菌包括大肠杆菌Str K-12substr.MG1655和大肠杆菌ATCC 8739变体。在一个实施例中，宿主有机体不是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

醇脱氢酶

在一些实施例中，编码ADH活性的基因被删除或破坏。所公开的作为基因删除或破坏的目标的ADH酶还可以包括使用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和/或NADPH作为电子供体的ADH酶。

在一些实施例中，巴豆醇量的增加和/或对巴豆醇耐受性的提高可以由所公开的ADH基因的破坏引起，所述ADH基因编码催化巴豆醇向巴豆醛转化和/或丁醛向丁醇转化的酶。

ADH活性的删除导致如图3酶C所示的ADH活性的减少或部分或完全删除。ADH的删除(例如，如C和/或H所示)驱使该过程向巴豆醇移动。在一些实施例中，待删除的ADH酶对于工程化微生物是天然的或内源的。当天然活性与包括巴豆醇或巴豆醇衍生生物产品的所需酶活性竞争时，它们可被认为是非期望活性。

在一些实施例中，用于将巴豆醇转化为巴豆醛和/或丁醛转化成丁醇的酶是相同的。在其它实施例中，用于将巴豆醇转化为巴豆醛的酶不同于用于将丁醛转化为丁醇的酶。

表1列出了可被破坏或删除的示例性ADH基因。

表1

可被破坏或删除的其他ADH基因包括对烯丙醇有活性的ADH酶，也可以适用于将巴豆醇氧化成巴豆醛(参见图3，酶C)。示例性的烯丙醇脱氢酶是来自烟草的NtRed-1酶(Matsushima et al,Bioorg.Chem.36:23-8(2008))。已经在恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)MB1中表征了类似的酶，但是迄今为止该酶尚未与基因相关联(Malone et al,Appl.Environ.Microbiol 65:2622-30(1999))。另一种烯丙醇脱氢酶是Castellanielladefragrans，Carpoglyphus lactis和Ocimum basilicum的香叶醇脱氢酶(Lueddeke etal,AEM 78:2128-36(2012))。具有广泛底物特异性的醇脱氢酶在这里也适用，例如包括编码C2-C14的中链醇脱氢酶alrA(Tani et al.,Appl.Environ.Microbiol.66:5231-5235(2000))，来自大肠杆菌的yqhD，yahK，adhE和fucO(Sulzenbacher et al.,J Mol Biol342:489-502(2004))和来自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)的bdh I和bdh II，其将丁醛转化为丁醇(Walter et al,J.Bacteriol.174:7149-7158(1992))。大肠杆菌的YqhD使用NADPH作为辅因子催化的范围广泛的醛的还原，优选长于C(3)的链长度(Sulzenbacher etal,J Mol Biol 342:489-502(2004)；Perez et al.,J Biol.Chem.283:7346-7353(2008))。来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的adhA基因产物已被证明对许多醛具有活性，包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛和丙烯醛(Kinoshita et al.,App.Microbiol.Biotechnol.22:249-254(1985))。

可被破坏或删除的其他ADH基因包括表2中列出的那些。

表2

可以根据与公开的ADH序列的序列同源性，来鉴定可作为基因破坏或删除的目标的其它ADH酶。在一些实施例中，ADH酶与SEQ ID NO：11-14中的全长蛋白质序列的多肽或多核苷酸序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性，如表5所示。示例性的删除如SEQ ID NOs：1-4所示。

公开的ADH酶可以将巴豆醇转化为巴豆醛和/或丁醛转化为丁醇。在一些实施例中，对ADH的基因修饰(例如删除或破坏)导致ADH活性的部分或完全丧失。在一些实施例中，ADH基因或活性的删除是天然基因或酶的删除。在其它实施例中，删除编码ADH活性的天然ADH基因，该ADH活性将巴豆醇转化为巴豆醛和或将丁醛转化为丁醇。在一些实施例中，ADH基因的删除包括至少一个、两个、三个、四个或五个ADH基因的删除。在一些实施例中，删除是编码大肠杆菌中的ADH基因的删除。在其他实施例中，删除是一个或多个这里公开的SEQID NOs：1-4序列的删除，如表5所示。

可以修饰的ADH酶包括由例如基因adhE、adhP、yqhD、yahK编码的活性。在一些实施例中，微生物可以包括adhE、adhP、yqhD、yahK、基因或其组合中的删除或破坏。例如，基因修饰可以包括对单个基因的基因删除，并表示为△adhE、△adhP、△yqhD和△yahK。△符号表示基因删除。删除可以包括多个删除，例如多于一个删除、两个、三个或四个删除。例如，所需adh基因中的两个删除可以表示为(△adhE△adhP)，(△adhE△adhP)，(△adhE△yqhD)和(△adhE△yahK)；所需adh基因中的三个删除表示为{△adhE△adhP△yqhD)，{△adhE△adhP△yahK)，所需adh基因中的四个删除表示为{△adhE△adhP△yqhD△yahK)。所公开的adh基因、多核苷酸和/或多肽的基因删除导致ADH活性的部分或完全丧失。

在一些实施例中，能够将巴豆醇转化为巴豆醛和/或将丁醛转化成丁醇的ADH活性部分或完全丧失。ADH活性的部分或完全丧失允许微生物在较高的巴豆醇水平上生长，并且在一些实施例中，与亲本宿主微生物或不具有基因修饰的微生物相比，在巴豆醇上生长速率更快。在其他实施例中，adh基因的基因修饰(例如删除)允许微生物积累较高的巴豆醇水平。

引入外源基因的方法在下文中结合巴豆醇途径和其他途径进一步详细地描述。

烯烃还原酶活性

在一些实施例中，对烯烃还原酶的基因修饰(例如删除或破坏)导致烯烃还原酶活性的部分或完全丧失。所公开的烯烃还原酶还可以使用还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和/或NADPH作为电子供体。

在一些实施例中，巴豆醇量的增加和/或对巴豆醇耐受性的提高可以由所公开的烯烃还原酶的破坏引起，否则所述烯烃还原酶催化巴豆醛向丁醛转化。烯烃还原酶基因中的删除导致烯烃还原酶活性的减少或部分或完全丧失，如图3所示的酶G，推动过程向巴豆醇移动。这反过来又消除巴豆醇进入其它途径，例如，如图3所示实例，通过巴豆醛进入丁醇。在一些实施例中，删除的烯烃还原酶对于工程化微生物是天然的或内源的。当天然活性与包括巴豆醇或巴豆醇衍生生物产品所需酶活性竞争时，它们可被认为是非期望活性。

这里还考虑到烯烃还原酶编码基因的删除/破坏，所述基因包括2-烯醛还原酶活性或α，β-烯醛还原酶酶活性或接受宽范围的α,β-不饱和烯烃的酶。在其它实施例中，还可以通过删除编码具有N-乙基马来酰亚胺还原酶活性的那些酶的基因来减少/消除烯烃还原酶活性。令人惊讶地发现，nemA基因产品在2-烯醛如巴豆醛上是有活性的。

在一些实施例中，也可以通过删除编码来自大肠杆菌K12亚组的酶的基因来减少/消除烯烃还原酶活性。在其它实施例中，烯烃还原酶来自大肠杆菌str.K12substr.MG1655或大肠杆菌ATCC 8739变体。在其它实施例中，烯烃还原酶活性是表5的GI：732684441，SEQID NO：15的序列的酶。在其它实施例中，作为基因删除或破坏的目标的烯烃还原酶活性由表5所示的SEQ ID.NO.5编码。在一些实施例中，所公开的作为减少活性消除的目标的烯烃还原酶活性可以由来自大肠杆菌的nemA基因编码。在一些实施例中，在微生物中删除可将巴豆醛转化为丁醛的天然或内源基因。

其他实施例包括由枯草芽孢杆菌的ygjM基因编码的烯烃还原酶活性，NADH依赖性黄素氧化还原酶，或可作为基因破坏或删除的目标的其它物种中的同源物或旁系同源物。其他细菌同系物包括PETN(季戊四醇四硝酸酯)还原酶(French C.E.,Nicklin S.,BruceN.C.Sequence and properties of pentaerythritol tetranitrate reductase fromEnterobacter cloacae PB2,J.Bacteriol.178:6623-6627,1996)、GTN(甘油三硝酸酯)还原酶(Snape et al.,Purification,properties,and sequence of glycerol trinitratereductase from Agrobacteri m radiobacter.J.Bacteriol.179:7796-7802,1997)、MR(吗啡酮还原酶)(French et al.,Bacterial morphinone reductase is related to OldYellow Enzyme.Biochem.J.312:671-678,1995)、2-环己烯酮还原酶(Rohde et al.,Thermoregulated expression and characterization of an NAD(P)H-dependent2-cyclohexen-l-one reductase in the plant pathogenic bacterium Pseudomonassyringae pv.glycinea.J.Bacteriol.181:814-822,1999)、和来自假单胞菌sp.的异型生物质还原酶A和B(Blehert et al.Cloning and sequence analysis of two Pseudomonasflavoprotein xenobiotic reductases.J.Bacteriol.181:6254-6263,1999)。

可以基于与所公开的nemA，ygjM和本文描述的其它序列的序列同源性来鉴定可作为基因破坏或删除的目标的另外的烯烃还原酶。在一些实施例中，烯烃还原酶与本文所描述的nemA、ygjM或其他烯烃还原酶的全长蛋白序列的多肽或多核苷酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性。

因此，在一些实施例中，微生物可包括△nemA基因或△ygjM基因或其同源物及其组合(例如△nem△ygjM)中的删除或破坏。在其它实施例中，ygjM基因可以来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在其它实施例中，可删除来自大肠杆菌的nemA基因。在其它实施例中，可删除大肠杆菌中yjgM基因的同系物或旁系同源物；可以从枯草芽孢杆菌或其他物种中删除nemA基因的同系物或旁系同源物。

所公开的nemA和/或ygjM基因、多核苷酸和/或多肽的这种基因删除导致烯烃还原酶活性的部分或完全丧失。烯烃还原酶活性的部分或完全丧失导致巴豆醛转化为丁醛，这使微生物在较高的巴豆醇水平上生长，并且在一些实施例中，与亲本宿主微生物有机体或不具有基因修饰的微生物相比，在巴豆醇上生长速率更快。在其他实施例中，烯烃还原酶基因或活性的基因修饰(例如删除)允许微生物积累较高的巴豆醇水平。

也可以从以下属的微生物中减少/移除烯烃还原酶：醋杆菌属(Acetobacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)、支顶孢属(Acremonium)、农杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、伯克霍尔德杆菌属(Burkholderia)，喜热菌属(Caloramator)、卡斯特兰尼氏菌属(Castellaniella)、头孢菌属(Cephalosporium)、梭菌属(Clostridium)、埃希氏杆菌属(Clostridium)、真杆菌属(Eubacterium)、产线菌属(Filifactor)，梭杆菌属(Fusobacterium)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、Moorella、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、嗜草酸菌属(Oxalophagus)、产醋杆菌属(Oxobacter)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、根瘤菌(Rhizobium)、红酵母属(Rhodotorula)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏杆菌(Shigella)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)、孢盐杆菌属(Sporohalobacter)、Syntrophospora、陶厄氏菌属(Thauera)、高温厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、杆菌属(Thermoanaerobacterium)、多头束霉属(Tilachlidium)、弧菌(Vibrio)、黄色杆菌属(Xanthobacter)或耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia)。

另外，具有α,β-烯酸还原酶活性的酶包括选自以下的酶：笔直顶孢霉(Acremoniumstrictum)CBS114157(保藏日期2003年12月19日，根据布达佩斯条约保藏)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)DSM1460(来自Deutsche Sammlung Mikroorganismen undZellkulturen)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)DSM1974(来自DeutscheSammlung Mikroorganismen und Zellkulturen)(一种也在DSM1974下的酶，在1980年1月1日前名为Clostridium thermoaceticum)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)NCIMB4200(保藏日期2003年12月16日，根据布达佩斯条约保藏)或克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)DSM555(来自Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen)。

在一些实施例中，删除烯烃还原酶和ADH基因。在一些实施例中，删除ADH基因adhE、adhP、yqhD、yahK或其各种组合以及nemA。例如，工程化微生物基因可以在nemA和选自adhE、adhP、yqhD和yahK的单一基因，或选自(adhE、adhP)、(adhE、adhP)或(adhE、yqhD)、(adhE、yahK)、(adhE、adhP、yqhD)、(adhE、adhP、yahK)和(adhE、adhP、yqhD、yahK)的多个基因中具有基因缺失。

在其他一些实施例中，删除ADH基因adhE、adhP、yqhD、yahK或其各种组合以及ygjM。例如，工程化微生物基因可在ygjM和选自adhE、adhP、yqhD和yahK的单一基因，或选自(adhE、adhP)、(adhE、adhP)或(adhE、yqhD)、(adhE、yahK)、(adhE、adhP、yqhD)、(adhE、adhP、yahK)和(adhE、adhP、yqhD、yahK)的多个基因中具有基因缺失。

在其他一些实施例中，删除大肠杆菌的ADH基因adhE、adhP、yqhD、yahK或其各种组合以及nemA。在其他一些实施例中，删除枯草芽孢杆菌的ADH基因和adhE、adhP、yqhD、yahK的同系物或旁系同源物或其各种组合以及ygjM。

包括编码ADH和/或烯还原酶的基因破坏或基因删除的所公开的基因修饰，包括整个基因的删除，基因的部分删除，转录或翻译所需的调控序列的删除或其他修饰，导致缩短基因产品(例如酶)的基因部分删除，或通过减少编码基因产品的活性(包括无可检测的活性水平)的各种突变策略中的任何一种。破坏可以广泛地包括删除编码该酶的全部或部分核酸序列，并且还包括但不限于其他类型的基因修饰，例如引入终止密码子，移码突变，引入或去除部分基因，引入条件敏感突变(例如温度敏感)和引入降解信号，那些影响mRNA转录水平和/或稳定性的基因修饰，改变编码酶的基因上游的启动子或阻遏物以及改变mRNA翻译，例如插入茎环或去除或灭活RBS。

在各种实施例中，基因修饰可以是DNA，从DNA编码的mRNA，以及导致多肽活性的部分或完全丧失的相应氨基酸序列。可以使用许多不同的方法来制备部分减少或完全丧失多肽活性的细胞。例如，可以使用常见的诱变或敲除技术将细胞工程化为具有破坏的调节序列或编码多肽的序列。参见，例如，Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci USA(2000),97(12):6640-6645和Methods in Yeast Genetics(1997edition)，Adams et al.,Cold Spring Harbor Press(1998)以及Manual of Industrial Microbiology andBiotechnology(3rd edition),edited by Richard H.Baltz,Arnold L.Demain,JulianE.Davies。

基因破坏的一个特别有用的方法是完整删除基因，因为它减少或消除了基因修饰微生物中基因回复(genetic reversions)的发生。因此，其产物是酶的基因的破坏会破坏酶功能。或者，反义技术可用于降低特定多肽的活性。例如，细胞可被工程化以含有编码反义分子的cDNA，该反义分子防止多肽被翻译。基因沉默也可用于降低特定多肽的活性(参见，例如，Metabolic Engineering of Escherichia Coli Using Synthetic SmallRegulatory RN As.Na D,Yoo SM,Chung H,Park H,Park JH,Lee SY；NatureBiotechnology.2013Feb 31(2):170-4)。

因此，在一些实施例中，降低部分活性降低了功能活性。功能活性可以在生长阶段或固定阶段或在两者期间减少。如所讨论，减少的活性的实现可以例如通过删除基因，降低基因表达或降低由该基因编码的多肽的活性或可用性来实现。该基因可以直接被修饰，例如，使用较弱的启动子，取代或删除或插入一个或多个氨基酸，或可以通过修饰例如其调节基因进行调节。

所产生的遗传破坏或删除可导致酶活性的部分减少或完全丧失。在一些实施例中，在已知的该酶的标准条件下，所指示的底物至指定产物的酶促转化比在天然(未修饰)或比在标准条件下通过天然(未修饰)或亲本宿主酶进行相同生化转化的酶活性低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

可以使用本领域任何已知方法鉴定具有降低酶活性的细胞。例如，酶活性测试可以用于鉴定酶活性降低的细胞，参见，例如，Enzyme Nomenclature,Academic Press,Inc.,New York 2007。可用于确定ADH和烯烃还原酶还原的其他测定法包括GC/MS分析。在其他实例中，可以光谱监测NADH/NADPH的水平。例如，可以使用来自ABCAM^TM的NADP/NADPH测定试剂盒(ab65349)比色测定NADH/NADPH。

基因删除可以通过突变基因删除方法实现，和/或从具有降低的或不表达一种或多种这些酶的菌株开始，和/或本领域技术人员已知的其它方法。基因删除可以通过许多已知的具体方法中的任何一种来实现，包括但不限于Red/ET方法。

RED/ET重组是本领域普通技术人员已知的，并且描述于Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci USA(2000),97(12):6640-6645。其他删除方法包括描述于U.S.Pat.Nos.6,355,412and 6,509,156,issued to Stewart et al中的方法。这些参考文献中的每一篇通过引用并入本文并用于该方法的教导。这种方法的材料和试剂盒可从GeneBridges^TM获得，该方法可以按照制造商的说明进行。该方法涉及通过由λ噬菌体的重组酶进行的同源重组，由选择性标记物置换靶基因。表达λ-红色重组酶的宿主有机体用线性DNA产物转化，线性DNA产物编码侧翼为与靶基因同源的末端区(通常～50bp，或高达约～300bp)的选择标记物。然后通过携带FPL重组酶或其他重组酶，例如Cre的质粒载体进行的另一重组步骤移除标志物。

可以实施微生物染色体DNA的部分靶向删除或向微生物染色体添加外来遗传物质以改变宿主细胞的代谢，从而减少或消除不需要的代谢产物的产生。这可以与其他基因修饰组合使用。

可进一步对该微生物进行基因修饰以增加将巴豆醛转化为巴豆醇的酶的活性(参见例如图1中的E和图3中的B)。在一些实施例中，酶是巴豆醛还原酶(醇形成)。巴豆醛还原酶的增加特别应用于巴豆醛为副产物而非生物产品途径的中间体的情况下。

在一些实施例中，一些微生物包括至少一种编码将巴豆醛转化为巴豆醇的酶的外源核酸。在一些实施例中，一些微生物包括至少一种编码导入微生物的巴豆醛还原酶(醇形成)的外源核酸。在其它实施例中，可以增加的外源核酸包括所公开的如SEQ ID NO：1-4和11-14的序列。在其他实施例中，删除所公开的adh和/或烯烃还原酶基因的工程化微生物还可以包括至少一种外源核酸，其具有可以将醛转化为醇的ADH活性。在一些实施例中，微生物包括至少一种SEQ ID NO:12和14的外源核酸。在其他实施例中，微生物表达基因yqhD和/或yahK。

表现出巴豆醛还原酶(醇形成)活性的酶能够从巴豆醛形成巴豆醇。以下酶可以自然地具有这种活性，或者可以被工程化后表现这种活性。编码将醛催化转化为醇(例如醇脱氢酶或等效醛还原酶)的酶的示例性基因包括编码用于C2-C14中链醇脱氢酶的基因(Taniet al,Appl.Environ.Microbiol.66:5231-5235(2000))，来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ADH2(Atsumi et al,Nature 451:86-89(2008))、来自大肠杆菌(E.coli)的优选长于C(3)的分子的yqhD(Sulzenbacher et al.,J.Mol.Biol.342:489-502(2004))以及将丁醛转化成丁醇的来自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)的bdh I和bdh//(Walteret al,J.Bacteriol.174:7149-7158(1992))。已经证明，来自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的ADH1具有对包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛和丙烯醛在内的许多醛的活性(Kinoshita,Appl.Microbiol.Biotechnol.22:249-254(1985))。来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052的Cbei_2181编码能将巴豆醛转化为巴豆醇的有用的醇脱氢酶。

表3

显示4-羟基丁酸脱氢酶活性(EC 1.1.1.61)的酶也属于这一类。这些酶已被表征于Ralstonia eutropha(Bravo et al.，J.Forensic Sci.49：379-387(2004))，Clostridium kluyveri(Wolff et al.，Protein Expr.Purif.6：206-212(1995))和Arabidopsis thaliana(Breitkreuz et al，J.Biol.Chem.278：41552-41556(2003))。

表4

蛋白	基因库ID	GI编号	有机体
				4hbd	YP_726053.1	113867564	Ralstonia eutropha H16
4hbd	L21902.1	146348486	Clostridium kluyveri DSM 555
				4hbd	Q94B07	75249805	Arabidopsis thaliana

巴豆醇途径

所公开的具有导致部分或完全丧失ADH和/或烯烃还原酶活性的基因删除或破坏的工程化微生物可用于巴豆醇的生产或使用巴豆醇作为中间体的生物产品的生产。这种公开的工程化微生物还可以包括巴豆醇途径。已知用于生产巴豆醇或使用巴豆醇作为生物产品中间体的许多微生物和酶途径。例如，参考图1，工程化微生物可以具有以下途径之一：EF；ABCDE；ABCK；ABCIJE；LK，MK，NK，OK；LDE；MDE；NDE，ODE；LIJE，MIJE；NIJE；01JE和A，B，C，D，E，F，I，J，K，L，M，N and O的任何一个或多个的组合。可以找到有关巴豆醇途径的细节，或者找到图1描述的巴豆醇转化为丁二烯的细节，例如，在PCT国际申请公开号WO 2011/140171标题为“用于生物合成丁二烯的微生物和方法”中找到。在一些实施例中，删除了ADH、烯烃还原酶或其二者的工程化微生物可以包括如图1所示的一个或多个步骤和酶。用于巴豆醇生产的其他示例性途径包括那些描述于PCT国际申请公开号WO 2011/140171标题为“生物合成丁二烯的微生物和方法”和PCT国际申请公开号WO2014/152434标题为“通过甲酸同化生产丁二烯和有关化合物的微生物和方法”中的途径。其他巴豆醇生产的示例性途径包括2014年7月3日提交的美国申请号62/020,901和2014年11月21日提交的美国专利申请62/082,747，两者题目均称为“生产不饱和度的4C-5C化合物的微生物和与之相关的方法”。其他将巴豆醇转化为丁二烯的示例性途径包括于PCT国际申请公开号WO 2013/057194标题为“从巴豆醇酶促生产丁二烯的过程”和PCT国际生产公开号WO 2013/188546标题为“生物合成1，3丁二烯的方法”。

每一个这些引用的专利或专利申请通过引用整体并入全文。

根据所选择的宿主微生物有机体的巴豆醇生物合成途径成分，工程化微生物可以包括至少一种外源表达的巴豆醇途径编码核酸和多达一个或多个巴豆醇生物合成途径的所有编码核酸。例如，通过相应编码核酸的外源表达，可以在缺乏途径酶或蛋白质的宿主中建立巴豆醇的生物合成。在缺乏巴豆醇途径的所有酶或蛋白质的宿主中，可以包括所述途径中的所有酶或蛋白质的外源表达，但是可以理解，即使宿主含有至少一种途径酶或蛋白质，也可以表达所有酶或蛋白质。例如，可以包括在生产巴豆醇的途径中编码酶或蛋白质的所有核苷酸和/或多肽的外源表达，如，乙酰辅酶A：乙酰辅酶A酰基转移酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶、巴豆酰辅酶A还原酶(醛形成)、巴豆醛还原酶(醇形成)、巴豆醇激酶(图1，步骤A-E))。

通过巴豆醇的生物产品

一旦通过所公开的工程化微生物和方法获得或产生巴豆醇，可将巴豆醇转化为所需的生物产品(例如丁二烯、1,3-丁二醇、甲基乙烯基甲醇)。例如，可以通过生物合成过程、化学或酶促过程，将巴豆醇进一步用作3-丁烯-2-醇(也称为甲基乙烯基甲醇(MVC))和/或丁二烯的生物生产中的中间体。

图1和图2提供从巴豆醇到丁二烯的示例性途径。图2提供了通过一种或多种以下中间体到丁二烯的示例性途径：2-丁烯-4-磷酸、2-丁烯基-4-二磷酸酯和/或3-丁烯-2-醇。可选地，可以通过本领域已知的任何产生巴豆醇的途径将巴豆醇引入该途径，并且包括从3-丁烯醇或3-丁烯-2-醇的转化。在一些实施例中，巴豆醇的产生通过图1的途径然后引入至图2的途径。

参考图2，工程化微生物可以具有任一以下途径：D；DG；AD；ADG；E；EG；BE；BEG；ABE；ABEG；IE；IEG；F；FG；G；H；J；AJ；A；AB；ABC以及图2中任一个和多个与步骤D，E，F的任一个和多个的每一个结合，其中，当存在A，B，C，H中至少一个时，然后(i)至少存在一个其他新的步骤或途径。图2描述的途径的进一步细节可以在以下找到:例如，PCT国际申请公开号WO2011/140171，PCT国际申请公开号WO 2014/152434标题为“通过甲酸同化生产丁二烯和有关化合物的微生物和方法”，和PCT国际申请公开号WO 2014/033129标题为“通过轻链烯醇的酶促脱水生产挥发性二烯”，2014年7月3日提交的美国申请号62/020,901和2014年11月21日提交的美国申请号62/082,747，标题均为“生产不饱和度的4C-5C化合物的微生物和与之相关的方法”以及本文描述的其他参考文献。例如，适用于图2中的步骤F，G或H的酶可以是EC 4.2.1类，在该类别下，EC 4.2.1.127类的芳樟醇脱水酶或其变体具有特别意义。芳樟醇脱氢酶的变体已被报道于PCT国际申请号WO 2014/184345中。还有其他微生物和途径可以在PCT国际申请公开号WO 2013/188546标题为“生物合成1,3丁二烯的方法”中找到。因此，本文提供的亲本细胞包括一种微生物，该微生物包含如图1所示的通向巴豆醇的途径和一种脱氢酶，如芳樟醇脱氢酶。

其他用于生产丁二烯的示例性途径包括那些描述于以下的途径：PCT国际申请公开号WO 2011/140171标题为“生物合成丁二烯的微生物和方法”，和2014年7月3日提交的美国申请号62/020,901和2014年11月21日提交的美国申请号62/082,747，标题均为“生产不饱和度的4C-5C化合物的微生物和与之相关的方法”

编码丁二烯、巴豆醇、3-丁烯-2-醇，途径酶或蛋白质的核酸的来源可以包括，例如，编码的基因产物能够催化所述反应的任何物种。这些物种包括原核和真核生物，包括但不限于细菌和真核生物，该细菌包括古细菌和真细菌，该真核生物包括酵母、植物、昆虫、动物和包括人的哺乳动物。

这些来源的示例性物种包括，例如，埃希氏杆菌属(Escherichia species)，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、Escherichia fergusonii、费格森埃希菌(Castellanielladefragrans)、Thauera linaloolentis、Thauera terpenica、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、Leptospira interrrogans、金属还原泥土杆菌(Geobacter sulfurreducens)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)sp.RS-1、Chloroflexs aggregans、木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxydans)，梭状芽胞杆菌(Clostrdia species)，包括克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)、共生梭菌(Clostridium symbiosum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)G3、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)，梭菌属(Fusobacteriumspecies)包括具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、死亡梭杆菌(Fusobacteriummortiferum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、智人(Homo sapiens)，酵母属(Saccharomyces)，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，曲霉属真菌(Apsergillus species)，包括土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)，分支杆菌(Mycobacteriumspecies)，包括包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)，鸟型结核分支杆菌(Mycobacterium avium)，包括subsp.pratuberculosis、Salinispora arenicolaPseudomonas，包括假单胞菌(Pseudomonas)sp.CF600、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，罗尔斯通菌属(Ralstonia species)，包括罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)、罗尔斯通氏菌JMP134、罗尔斯通氏菌H16、皮氏罗尔斯顿菌(Ralstoniapickettii)、Lactobacillus plantarum、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)，芽孢杆菌(Bacillus species)，包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、Pedicoccus pentosaceus，Chlorofexus属(Chlorofexus species)，包括橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、Chloroflexus aggregans、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、Leptospira interrrogans、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)，沙门氏菌属(Salmonella species)，包括鼠伤寒沙门菌(Salmonellaenterica serovar Typhimurium)，希瓦氏菌属(Shewanella)，包括希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)、希瓦氏菌属sp.MR-4、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、灵杆菌(Serratia marcescens)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、Eubacterium barkeri、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、Archaeoglobus fulgidus、Archaeoglobus fulgidus、Haloarcula marismortui、耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)str.IM2，根瘤菌属(Rhizobium species)，包括豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)，以及这里公开的其他示例性物种或作为相应基因的源生物。

使用现在超过550种物种的完整基因组序列(其中超过一半可在公共数据文库如NCBI上找到)，包括395种微生物基因组和各种酵母，真菌，植物和哺乳动物基因组，识别编码丁二烯、巴豆醇、3-丁烯-2-醇的生物活性的一个或多个基因，包括例如同源物、直系同源物、旁系同源物和已知基因的非直系基因置换，以及生物体之间的基因改变的交换，这在本领域中都是常规和公知的。因此，允许这里所描述的丁二烯，巴豆醇，3-丁烯-2-醇的生物合成与特定的生物体如大肠杆菌结合的代谢改变可被容易地应用于其它微生物，包括原核和真核生物。鉴于本申请提供的教导和指导，本领域技术人员可以知晓，以一种生物体举例说明的代谢改变可以同样适用于其它生物体。

除了直接发酵生产丁二烯外，巴豆醇或3-丁烯-2-醇(甲基乙烯基甲醇)可以被分离，纯化(用于任何用途)，然后在涉及金属基催化的第二步骤中脱水为丁二烯,参见图2的实例。合适的产品途径和酶，筛选方法和分离方法，可以在以下文件中找到：2011年11月10日公布的WO2011140171A2标题为“生物合成丁二烯的微生物和方法”；2012年2月9日公布的WO2012018624A2标题为“芳香烃、2,4-戊二烯酸和1,3-丁二烯生物合成的微生物和方法”；2011年11月10日公布的WO2011140171A2标题为“生物合成丁二烯的微生物和方法”；2013年3月21公布的WO2013040383A1标题为“生产烯烃的微生物和方法”；2012年12月27日公布的WO2012177710A1标题为“生产丁二烯的微生物和其相关的方法”；2012年8月9日公布的WO2012106516A1标题为“生物合成丁二烯的微生物和方法”；2013年2月28公布的WO2013028519A1标题为“用于生产2,4-戊二烯酸酯、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇和相关醇的微生物和方法”；和2013年3月15日提交的美国序列号61/799255。

化学过程包括脱氢成丁二烯。醇脱氢是本领域已知的，且可以包括催化和非催化的各种热处理。在一些实施例中，催化热脱氢采用金属氧化物催化剂或二氧化硅。在一些实施例中，该过程通过在催化剂存在下化学脱氢进行。例如，已经指出，巴豆醇可以在钼酸铋(Adams,C.R.J.Catal.10:355-361,1968)上脱氢，得到1,3-丁二烯(例如参见图2)。

脱氢的实现可以通过醇基的活化和随后的消除，消除可以通过标准的消除机制如E1或E2消除。活化可以通过将醇基转化成卤素如碘化物，氯化物或溴化物来实现。

活化的实现也可以通过磺酰基，磷酸酯或其它活化官能团将醇转化为好的离去基团。在一些实施例中，活化基团是硫酸盐或硫酸酯，选自甲苯磺酸酯，甲磺酸酯，苯磺酸酯，溴代磺酸酯和三氟甲磺酸酯。在一些实施例中，离去基团是磷酸盐或磷酸酯。在一些这样的实施例中，脱水剂是五氧化二磷。

在将巴豆醇转化为丁二烯的典型过程中，在存在或不存在蒸汽的条件下，使以纯物质或在溶剂中的形式的巴豆醇通过在反应容器或管内的加热至温度范围在40-400℃的固体的无机、有机或含金属的脱氢催化剂，导致水的去除和作为气体的丁二烯的释放，其被冷凝(丁二烯bp＝-4.4℃)并收集在储存器中用于进一步处理，储存，或使用。典型催化剂可以包括钼酸铋，磷酸-磷酸，氧化铈，高岭土-氧化铁，高岭土-磷酸，二氧化硅-氧化铝和氧化铝。典型的过程通量在0.1-20,000kg/h的范围内。典型的溶剂是甲苯，庚烷，辛烷，乙苯和二甲苯。

在其他实施例中，可以通过巴豆醇的酶促转化生产丁二烯，该酶促转化通过如WO2013/057194所公开的巴豆磷酸或巴豆二磷酸，或者通过EC 4.2.1类的酶进行酶促脱氢(异构化脱氢)，优选为芳樟醇脱氢酶，例如，如PCT国际申请公开号WO 2014/033129或WO 2014/184345所报道。

对实施例的描述一般涉及代谢反应、其反应物或其产物，或具体指代编码与所参考代谢反应、其反应物或其产物相关或催化的酶或相关的蛋白质的一种或多种核酸或基因。除非本申请另有明确说明，本领域技术人员将理解，指代反应也包含对反应物和反应产物的指代。类似地，除非另有明确说明，否则指代反应物或产物也涉及反应，并且指代这些代谢组件中的任何一种，也涉及了编码参与所述反应、反应物或产物的蛋白质或催化的酶的一种或多种基因。同样，鉴于代谢生物化学、酶学和基因组学的已知领域，本申请指代的基因或编码核酸也涉及对相应编码的酶及其催化的反应或与反应相关的蛋白以及所述反应的反应物和产物。

应当理解，如果在微生物有机体中包含多于一种的外源核酸，则所述多于一种的外源核酸是指所称的编码核酸或生物合成活性，如上所述。如本申请所公开的，进一步理解的是，可以将多于一种的外源核酸引入宿主微生物有机体中的单独核酸分子、多顺反子核酸分子或其组合上，并且仍被认为是多于一种外源核酸。例如，如本申请所公开的，微生物可被工程化以表达编码所需途径酶或蛋白质的两种或更多种外源核酸。在编码期望活性的两个外源核酸被引入宿主微生物有机体的情况下，可以理解，这两个外源核酸可以作为单一核酸，被引入至例如单个质粒，分开的质粒上，可以整合到宿主染色体中的单个或多个位点，而仍然被看作是两个外源核酸。类似地，可以理解，两个以上的外源核酸可以以任何期望组合引入到宿主有机体中，例如，单个质粒上，分开的质粒上，可以整合到宿主染色体中的单个或多个位点，而仍然被看作是两个或多个的外源核酸，例如三个外源核酸。因此，所指的外源核酸或生物合成活性的数量，是指编码核酸的数量或生物合成活性的数量，而不是引入到宿主生物体中的单独的核酸的数量。

工程化微生物可以含有稳定的基因改变，这指的是可培养超过五个世代而不丧失该改变的微生物。通常，稳定的基因改变包括持续超过10代的修饰，持续超过约25代的，持续超过50代的，包括无限期。

本领域技术人员将理解，本申请所列举的基因修饰，包括代谢修饰的描述，是相对于合适的宿主有机体如大肠杆菌及其相应的代谢反应，或所需遗传物质的合适来源微生物，例如基因所需的代谢途径。但是，鉴于各种有机体的完整基因组测序和基因组学和分子生物学领域的高水平技术，本领域技术人员将容易地将本申请提供的教导和指导应用于基本上所有其他有机体。例如，本申请示例的大肠杆菌代谢变化可以通过从参考物种以外的物种引入相同或类似的编码核酸而容易地应用于其它物种。这样的基因改变包括例如物种同源物的基因改变，一般而言，尤其是直系同源物，旁系同源物或非直系同源基因置换。

直系同源物是与垂直传递(vertical descent)相关的一种或多种基因，它们负责不同有机体中基本上相同或一致的功能。例如，鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶可被认为是环氧化物水解生物功能的直系同源物。例如，若基因共有的序列相似性足以表明其同源，或者通过从共同的祖先进化而来，则该基因通过直系传递相关。若基因共有的是三维结构而非一定是序列相似性，且足以表明其从一级序列相似性无法识别的共同祖先发展而来，则该基因也可以视为直系同源。直系同源基因可以编码具有约25％至100％氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白质。对于编码共享氨基酸相似性小于25％的蛋白质的基因，如果它们的三维结构也显示出相似性，则也可以被认为是来自垂直传递。

直系同源物包括通过例如进化在结构或整体活性上发生分化的基因或其编码的基因产物。例如，当一个物种编码表现出两个功能的基因产物，并且其中这些功能已经在第二个物种中分离成不同的基因时，这三个基因及其相应的产物被认为是直系同源物。本领域技术人员将理解，为了生产生物化学产品，选择待引入或破坏代谢活性的相关直系同源基因，用于构建工程化微生物。显示可分离活性的直系同源物的一个示例，是不同活性已经在两种或更多种物种或单种物种内分离成不同的基因产物。

相比之下，旁系同源物是通过例如重复和随后的进化分歧相关，并且具有相似或共同但不相同的功能的同源物。旁系同源物可以来自或衍生自例如同一物种或不同物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源物，因为它们代表从共同的祖先共同进化的两种不同的酶，其催化不同的反应并在相同种类中具有不同的功能。旁系同源物是来自相同物种的蛋白质，其彼此显著的序列相似性表明它们是同源的，或通过来自共同祖先的共同进化相关。

非直系同源基因置换，是指来自一个物种的非直系同源基因可以替代不同物种的参考基因功能。替代包括，例如，与不同物种中的参考功能相比，能够在原始物种中执行基本相同或相似的功能。尽管一般来说，非直系同源基因置换将被鉴定为与编码参考功能的已知基因结构相关，结构相关性较低但功能上相似的基因，其相应的基因产物仍将落在本申请所用术语的含义内。功能相似性要求，例如，与编码待置换的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性位点或结合区域中至少有一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源基因或不相关基因。

因此，在鉴定和构建具有生物合成能力的所公开的工程化微生物时，本领域技术人员将理解，将本申请提供的教导和指导应用于鉴定特定种类的代谢修饰，可以包括对直系同源物的鉴定和包含或失活。在旁系同源物和/或非直系基因置换存在于所指的微生物中、编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的程度范围上，本领域的技术人员也可以利用这些进化相关的基因。

直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换，可以通过本领域技术人员熟知的方法来确定。例如，对于两个多肽的核酸或氨基酸序列的检查，将揭示对比序列之间的序列同一性和相似性。基于这样的相似性，本领域的技术人员可确定该相似性是否足够高到可以表明这些蛋白质通过从共同祖先进化得到而相关。本领域技术人员公知的算法，诸如Align,BLAST,Clustal W等，比较并确定原始序列相似性或同一性，且还确定序列中的空位的存在或显著性，并可对其分配权重或分数。这种算法也是本领域已知的，并且同样适用于确定核苷酸序列相似性或同一性。基于用于计算统计学相似性(或在随机多肽中找到相似匹配的机会)以及确定匹配的显著性的公知方法，来计算相似性是否足以确定相关性的参数。根据需要，对两个或更多个序列的计算机比较，还可以由本领域技术人员进行视觉优化。可以期望，相关基因产物或蛋白质具有高相似性，例如，25％至100％的序列同一性。无相关性的蛋白质的同一性可以与在扫描了足够大的数据库的情况下偶然发生的预期结果基本相同(5％左右)。5％至24％之间的序列，可能表示同源性足以或不足以得出对比序列具有相关性的结论。在给定数据集大小能够用于确定这些序列的相关性的前提下，可以进行额外的统计分析来确定匹配的显著性。

使用BLAST算法来确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数，例如，可以是如下所述。简要地说，氨基酸序列比对可使用BLASTP版本2.2.29(2014年1月6日)和下列参数来执行。基质：0BLOSUM62；缝隙打开:1 1；缝隙延长：1；X退出:50；预期：10.0：字段大小3；过滤元件：打开。核酸序列比对可使用BLASTN版本2.2.29+(2014年1月6日)和下列参数执行。匹配：1；错误匹配：-2；缝隙打开5；缝隙延长2；x；退出50；预期：10.0：字段大小11；过滤元件：关闭。本领域技术人员知道，可以对上述参数进行改进以增加或减少比较的严格性，并且确定两个或多个序列的相关性。

对于各种实施例，基因修饰包括各种基因操作，包括对酶或所公开的任一途经中识别的酶的酶活性的改变调节，和最终活性。这样的基因修饰可以涉及在所选和/或鉴定的培养条件下导致酶活性和/或选择性变化的转录，翻译和翻译后修饰和/或提供另外的核酸序列，例如增加涉及巴豆醇生产的酶的拷贝数和/或突变体。实现这种基因修饰的具体方法和途径是本领域技术人员公知的，包括但不限于增加内源性遗传元件的表达；降低阻遏基因的功能；引入异源遗传元件；增加编码催化酶转化步骤以产生巴豆醇的多肽的核酸序列的拷贝数；使遗传元件突变以提供突变蛋白质以增加特异性酶活性；过表达；表达不足；过分表达伴侣；敲除蛋白酶；改变或修改反馈抑制；提供具有一个或多个阻遏物和/或竞争性抑制剂的受损结合位点的酶变体；敲除阻遏物基因；进化，选择和/或其他方法以改善mRNA的稳定性，以及使用具有有效拷贝数和启动子的质粒，以达到有效的改善水平。可以实施随机突变以提供可能落入这些或其他所述方法中的任何一种的基因修饰。基因修饰进一步广泛地属于在感兴趣的核酸中添加(包括插入)，删除(例如通过突变)和取代一个或多个核酸。在各种实施例中，基因修饰导致酶的特定活性和/或酶的转化数量的改善。

不受限制，可以通过以下一个或多个来衡量变化：K_m；k_oat；和K_cat/K_m＝催化效率。

在一个实施例中，具有部分或完全丧失ADH和/或烯烃还原酶活性的工程化微生物具有改善的对巴豆醛和/或巴豆醇的耐受性。在一些实施例中，工程化微生物包括引起ADH和/或烯烃还原酶活性的完全或部分丧失的基因修饰和包括使用巴豆醇作为中间体的巴豆醇和/或其它途径的基因修饰。这些各种实施例可以通过测定它们对不利于亲本菌株生长的巴豆醇浓度的生长进行评估。对巴豆醇的耐受度可以根据巴豆醇浓度，生长条件和特定工程菌株而变化。例如，如实施例2所示，在没有修饰的情况下，adh和/或nemA中的删除显示出优于亲本菌株的生长。

工程化微生物和方法可以根据它们在包括巴豆醇的培养基中的生长来描述。生长可任选根据其他参数(如其他培养基成分，细胞生长的温度和其他条件)来定义。应该理解，在培养过程中，由于细胞的培养基营养物的消耗和减少以及诸如巴豆醇等培养基中生物产品的量的增加，培养基条件将不断变化。因此，细胞的生长速度可能在培养期间的某些点发生变化。细胞的生长和生长速率可以任选地描述在一定量的培养基组分或一定范围的培养基中。

培养包括生长(增殖期)或将微生物维持在稳定期。巴豆醇或其下游产物的生产可以在两相之一或两者中发生。

在一些实施例中，根据其在含有一定量的巴豆醇的培养基中生长的能力来描述工程化微生物细胞的生长，其中相对于不具有提高对巴豆醇的耐受性和/或提高巴豆基生产的一种或多种基因的基因修饰的亲本菌株，测量其生长。例如，编码ADH和/或烯烃还原酶活性的基因中的删除与相比于不具有所述基因修饰的亲本宿主菌株或微生物的生长速率相比，培养基中生长速率增加1.1倍或更大。可以在含有0.001至约2重量％的巴豆醇的培养基中测量生长速率的增加。例如，工程化微生物可以表现出比没有基因修饰的亲本宿主菌株的生长速率的1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4和2.5倍。在其它实施例中，工程化微生物可以表现出比没有基因修饰的亲本宿主菌株的生长速率的约1.1倍至约3倍，或者约1.2倍至约2.5倍。

在一些实施例中，工程化微生物的培养基中具有大于0.001％(w/v)的巴豆醇或大于0.01％，0.1％，0.5％，1％或2％(w/v)的巴豆醇。

在一些实施例中，工程化微生物的培养基中具有多于0.138mM的巴豆醇，或者多于1.38mM，13.8mM，69mM，138mM或276mM的巴豆醇。

在一个实施例中，合适的ADH和/或烯烃还原酶在宿主细胞生理条件下最佳地催化反应。在另一个实施例中，合适使用的ADH和/或醛还原酶佳地从约pH 4至约pH 9催化反应。在另一个实施例中，合适的烯烃还原酶最佳地从约pH 4至约pH 8催化反应。在另一个实施例中，合适使用的ADH和/或烯烃还原酶佳地从约pH 6至约pH 7催化反应。在另一个实施例中，合适的烯烃还原酶最佳地从约pH 6.5至约pH 7催化反应。在另一个实施例中，合适使用的ADH和/或烯烃还原酶最佳地在约pH 4，4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5，或9催化反应。在另一个实施例中，合适使用的ADH和/或烯烃还原酶最佳地在约pH7催化反应。

在一个实施例中，合适使用的ADH和/或烯烃还原酶最佳地在高达约70℃下催化反应。在另一个实施例中，合适的ADH和/或烯烃还原酶最佳地在约10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，或70℃下催化反应。在另一个实施例中，合适的烯烃还原酶最佳地在约30℃下催化反应。

具体实施方式

实施例1

菌株构建/删除方法

从大肠杆菌ATCC 8739 C变体和大肠杆菌Str.K-12substr.MG1655删除醇脱氢酶；adhE(G\732684842)，yqhD(GI：16130909)，adhP(Gl：732684610)，yahK(GI.-1657523)和N-乙基马来酰亚胺还原酶，nemA(Gl：732684441)。如Datsenko和Wanner，Proc Natl Acad SciUSA(2000)，97(12)：6640-6645中所述使用λ红色重组构建菌株。简而言之，用含有阿拉伯糖诱导型λ红色重组酶基因的pRED质粒和赋予羧苄青霉素抗性的bla抗性盒。然后，携带pRED质粒的转化体在100μg/mL羧苄青霉素和134mM阿拉伯糖中生长，并用包含同源性臂的线性DNA构建体进行转化，所述同源性靶向包含组成型表达的sacB和kan基因的sacB-kan盒侧翼的基因。kan基因赋予卡那霉素抗性，并且当在50μg/mL卡那霉素上生长时允许选择具有整合的sacB-kan盒的细胞。sacB基因赋予蔗糖敏感性，允许反选择性压力来选择不再具有整合的sacB-kan盒的细胞。细胞在100μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素存在下生长，以证实sacB-kan盒的整合和pRed质粒的存在。然后用134mM阿拉伯糖诱导细胞，并用线性DNA构建体转化，用与所需删除侧翼的染色体DNA同源的DNA代替sacB-kan盒，有效地删除所需的DNA序列(参见表5各菌株的删除DNA序列)。通过在303mM蔗糖中生长来选择sacB-kan盒的替换。通过PCR扩增和测序确认染色体的删除(参见表5，用于扩增和测序的引物)。

在该实施例中，为了删除有机体中的多于一种基因，构建了具有第一删除的菌株，并用于每个随后的基因删除。

表5从染色体中删除DNA序列和序列表中使用和报道的引物。

染色体修饰	序列号编号
		adhE deletion	SEQ ID NO.：I
yqhD deletion	SEQ ID NO.：2
		adhP deletion	SEQ ID NO.：3
yahK deletion	SEQ ID NO.4
		nemA deletion	SEQ ID NO.：5
adhEFI	SEQ ID NO.6
		adhERI	SEQ ID NO.7
yqhDFI	SEQ ID NO.8
		yqhDRI	SEQ ID NO.9
adhPFI	SEQ ID NO.10
		adhPRI	SEQ ID NO.11
yahKFI	SEQ ID NO.12
		yahKRI	SEQ ID NO.13
nemAfI	SEQ ID NO.14
		nemARI	SEQ ID NO.15
adhE protein	SEQ ID NO.16
		yqhD proteiin	SEQ ID NO.17
adhP protein	SEQ ID NO.18
		yahK protein	SEQ ID NO.19
nemA protein	SEQ ID NO.20

实施例2

巴豆醇耐受性研究

将E.coli Str.K-12substr.MG1655菌株48(野生型)和缺失了多个蛋白的3-FEDB(△yahk△adhP△yqhD△adhE)；和E.coli ATCC 8739 C菌株(野生型)和它的变体3-FISC(△adhE)，3-GAEB(△adhE△yqhD)，3-GBOG(△adhE△yqhD△adhP)和3-GDOB(△adhE△yqhD△adhP△yahK)刺入(struck)来自甘油冷冻库存的LB琼脂从而形成单菌落。挑取每个菌株的四个单菌落，并接种到深井中的96孔板中的1mL LB+55.7mM葡萄糖中，在37℃下培养过夜(16-20小时)。摄取过夜培养物的光密度，将细胞归一化至OD₆₀₀＝1并旋转。将细胞重新悬浮于1mL M9基本培养基+11.1mM葡萄糖中。然后将细胞旋转并再次在1mL M9+11.1mM葡萄糖中洗涤。用198μL M9+1.1mM葡萄糖或M9+11.1mM葡萄糖+138mM巴豆醇(Sigma-Aldrich)填充Bioscreen蜂窝2板(目录号9502550)。将2μL清洗后的细胞以N＝4加入到每个孔中。把Bioscreen蜂窝2板加载到bioscreen C MBR(Oy Growth Curves Ab Ltd)中；孵育系统设置为在37℃每15分钟读取OD_420-580的浊度。生长曲线数据见图4A(大肠杆菌Str.K-12substr.MG1655菌株)和图4B(大肠杆菌ATCC 8739C变体菌株)。

图4A显示当在没有巴豆醇时生长，野生型或亲本菌株和工程化微生物显示类似的生长速率。图4B显示当在138mM巴豆醇存在下生长时，野生型或亲本菌株的生长被抑制，而工程化微生物3-FEDB(△yahK△adhP△yqhD△adhE)在巴豆醇上显示初始滞后。

图5A显示当在没有巴豆醇时生长，野生型或亲本菌株和工程化微生物显示类似的不规则生长速率。图5B显示当在138mM巴豆醇存在下生长时，野生型或亲本菌株的生长如3-FIDC(△adhE)和3-GAEB(△adhE△yqhD)被抑制，而工程化微生物3-GBOG(△yahK△adhP△yqhD△adhE)在和3-GBOB(△adhE△yqhD△adhP)巴豆醇上显示初始滞后。

实施例3

NemA验证试验

将菌株(ATCC 8739C变体)3-GGGF(yqhD+nemA+亲本菌株)，3-GHDO(△yqhD)，3-HAEF(△nemA)和3-HAEG(△yqhD△nemA)刺入来自甘油原液的LB琼脂平板上，过夜(16-20小时)。挑取单菌落，并在挡板烧瓶中接种到30mLM9+27.8mM葡萄糖+10mM巴豆醇中并培养过夜(16-20小时)。将隔夜培养物在OD₆₀₀＝0.1接种到挡板烧瓶中的新鲜30mL M9+55.7mM葡萄糖+10mM巴豆醇中。在巴豆醇生长4，8和27小时后各取1mL样品。将样品离心，并对上清液进行分析。通过液体注射液体样品中的巴豆醇和正丁醇进行GCMS分析。在GCMS色谱图和线图中量化丁醇的还原。

GCMS方法

开发了一种GCMS方法，监测以下挥发性化合物：正丁醇(n-ButOH)和巴豆醇(Crot-OH)。该方法具有良好的灵敏度，检测限制范围低(线性度在0.5-100mM)。该测定的灵敏度取决于化合物，在所使用的条件和MS电离/碎裂效率下是挥发性和分压的函数。巴豆醇和正丁醇标准品购自Sigma-Aldrich。

GCMS分析

使用以电子轰击电离(EI)模式操作的连接到质量选择性检测器(MSD)5973的Agilent气相色谱仪6890N进行分析。选择NOWAX柱(Agilent-19091N-133)，30m×0.25mmi.d.x0.25μm膜厚。通过直接注射模式操作的ALS自动进样器注射样品。使用的参数为：注射体积1.0μl(分流比为20∶1)，入口温度为250℃。使用氦气作为载气，流速保持在1.3mL/min。优化温度程序，以确保感兴趣的分析物的良好分辨率和最小的基质干扰：烘箱最初在40℃保持1min，然后以1℃/min升至41℃，以35℃/min第二次升温至60℃，最终以100℃/min升至250℃，保持4.06min(总运行时间10min)。使用低质量获得数据。MS调谐文件设置和28-150m/z质量范围扫描。用于定量感兴趣的分析物的典型保留时间(RT)和特征质量片段列于表6。标准组合的典型GCMS色谱图如下所示。基于使用二次拟合(通常被强制为零)的标准曲线进行定量。用Agiliment MSD Productivity ChemStationsoftware处理GCMS数据。

表6

Analyte	RT，min	Target m/z
			n-propanol(IS)	4.96	59
n-butanol	5.90	56
			Trans-crotyl alcohol	6.29	72
Cis-crotyl alcohol	6.40	72

如图6A-6D所报告的，基于在含有巴豆醇的培养基上生长的有机体的GC/MS色谱，并分析4,8和27小时时的正丙醇，丁醇工程化微生物3-GHDO(△yqhD)，3-HAEF(△nemA)和具有多个删除(△nemA△yqhD)的3-HAEG显示出不可检测到的丁醇的产生，而它们显示出巴豆醇和丙醇生产。

Claims

1.一种使用工程化微生物生产生物产品的方法，其中巴豆醇是生物产品，或者巴豆醇是生物产品途径中的中间体，所述方法包括：

在导致巴豆醇产生的条件下，或使用巴豆醇作为导致生物产品产生的生物产品途径的中间体的条件下，培养所述工程化微生物，其中，所述工程化微生物包括至少一种基因修饰，该基因修饰引起(a)将巴豆醇转化为巴豆醛的醇脱氢酶(ADH)，(b)将丁醛转化为丁醇的ADH，或(c)将巴豆醛转化为丁醛的烯烃还原酶，或(a)、(b)和(c)的任何组合，的活性的部分或完全丧失。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物还包含至少一种编码生物产品途径的酶的外源核酸，其中所述生物产品途径是巴豆醇途径，或者使用巴豆醇作为生物产品途径的中间体。

3.一种工程化微生物，包括至少一种基因修饰和至少一种编码生物产品途经的酶的外源核酸，所述基因修饰引起(a)将巴豆醇转化为巴豆醛的醇脱氢酶(ADH)，(b)将丁醛转化为丁醇的ADH，(C)将巴豆醛转化为丁醛的烯烃还原酶，或(a)、(b)和(c)的任何组合，的活性的部分或完全丧失，其中，所述生物产品途径为巴豆醇途径或使用巴豆醇作为生物产品途径的中间体。

4.根据前述任一项权利要求所述的工程化微生物，其特征在于，所述醇脱氢酶将巴豆醇转化为巴豆醛，将丁醛转化为丁醇，或二者皆有。

5.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在至少2、3、或4个基因中具有基因修饰。

6.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在至少2、3、或4个基因中具有基因缺失。

7.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述ADH活性由选自adhE、adhP、yqhD和yahK或其任何组合的基因编码。

8.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在选自adhE、adhP、yqhD和yahK的单个基因中，或选自(adhE,adhP)、(adhE,adhP),或(adhE,yqhD)、(adhE.yahK)、(adhE,adhP,yqhD)、(adhE,adhP,yahK)和(adhE,adhP,yqhD,yahK)的多个基因中具有基因缺失。

9.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述丧失是指活性完全丧失。

10.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，ADH的部分或完全丧失减少巴豆醇向巴豆醛或丁醛向丁醇或二者的积累或转化。

11.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物或微生物，其特征在于，所述烯烃还原酶活性选自EC No.1.3.1.-类。

12.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述烯烃还原酶的部分或完全丧失减少丁醛和/或丁醇的积累或转化。

13.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述烯烃还原酶的活性由nemA基因或ygjM或二者编码。

14.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在nemA基因或oxyqjM基因或二者中具有基因缺失。

15.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在大肠杆菌中具有nemA缺失。

16.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在枯草芽孢杆菌中具有ygjM缺失。

17.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在nemA和选自adhE、adhP、yqhD和yahK的单一基因，或选自(adhE、adhP)、(adhE、adhP)或(adhE、yqhD)、(adhE、yahK)、(adhE、adhP、yqhD)、(adhE、adhP、yahK)和(adhE、adhP、yqhD、yahK)的多个基因中具有基因缺失。

18.根据权利要求17中所述的方法或工程化微生物，其特征在于，具有所述缺失的所述工程化微生物为大肠杆菌。

19.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在yqjM和选自adhE、adhP、yqhD和yahK的单个基因，或选自(adhE、adhP)、(adhE、adhP)或(adhE、yqhD)、(adhE、yahK)、(adhE、adhP、yqhD)、(adhE、adhP、yahK)和(adhE、adhP、yqhD、yahK)的多个基因中具有基因缺失。

20.根据权利要求19中所述的方法或工程化微生物，其特征在于，具有所述缺失的工程化微生物为枯草芽孢杆菌。

21.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，还包括基因修饰，与外源或天然ADH酶相比，所述基因修饰引起活性提高以驱动从醛转化为醇的反应。

22.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述活性提高包括巴豆醛还原酶(醇形成)。

23.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述巴豆醇生物产品途径包括乙酰辅酶A：乙酰辅酶A酰基转移酶，乙酰乙酰辅酶A还原酶，3-羟基丁酰辅酶A脱水酶，巴豆酰辅酶A还原酶(醛形成)，巴豆醛还原酶(醇形成)，巴豆酰辅酶A水解酶，合成酶或转移酶，巴豆酸还原酶，巴豆酰辅酶A还原酶(醇形成)，戊酰辅酶A脱羧酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，3-氨基丁酰辅酶A脱氨酶或4-羟基丁酰辅酶A脱水酶。

24.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物包括以下一种或多种酶以驱动产生巴豆醇的反应：乙酰辅酶A：乙酰辅酶A酰基转移酶，乙酰乙酰辅酶A还原酶，3-羟基丁酰辅酶A脱水酶，戊二酰辅酶A脱羧酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，3-氨基丁酰辅酶A脱氨酶和4-羟基丁酰辅酶A脱水酶。

25.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述微生物包括将巴豆醇转化为1,3-丁二烯的酶，或其中该酶为芳樟醇脱水酶或其变体。

26.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所产生的所述巴豆醇转化为3-丁烯-2-醇和/或丁二烯。

27.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述巴豆醇转化为丁二烯是通过在催化剂存在下进行化学脱水；通过将巴豆醇酶转化成丁二烯或通过能使巴豆醇转化为丁二烯的工程化微生物的生长来实现的。

28.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物将巴豆醇转化为丁二烯的途径包括以下编码酶的外源核酸：巴豆醇激酶，2-丁烯-4-磷酸激酶，丁二烯合酶，3-丁烯-2-醇合成酶，巴豆醇异构酶，3-丁烯-2-醇脱水酶，巴豆醇脱水酶，巴豆醇二磷酸激酶，巴豆醇脱水酶/乙烯基异构酶。

29.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物选自genus Acinetobacter,Escherichia,Klebsiella,Anaerobiospirillum,Actinobacillus,Castellaniella,Mannheimia,Bacillus,Zymomonas,Lactococcus,Lactobacillus,Streptomyces,Clostridium,Pseudomonas,Thauera和Zymomonas。

30.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物为大肠杆菌K-12MG1655或大肠杆菌ATCC 8739 C变体。

31.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物与不具有基因修饰的亲本宿主微生物相比，表现出巴豆醇的生长的增加。

32.根据前述任一项权利要求所述的方法或工程化微生物，其特征在于，所述工程化微生物在含有约0.138mM至约138mM巴豆醇的培养基上生长。

33.细胞培养组合物，其包含根据前述任一项权利要求中所述的方法或工程化微生物制备的巴豆醇、甲基乙烯基甲醇或丁二烯。