JPH059061B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高アスパルターゼ活性を有するエシエ
リシア属に属する新規微生物を用いるＬ−アスパ
ラギン酸の製法に関する。 従来、エシエリシア・コリがアスパルターゼ活
性を有しており、この微生物を用いてフマール酸
アンモニウム（又はフマール酸とアンモニウム
塩）からＬ−アスパラギン酸を酵素的に製造する
方法が知られている〔Bull.Agr.Chem.Soc.
Japan.24，296（1960），Appl.Miorobiol.，27，
886（1974）、特公昭54−12553号、特公昭57−
18867号〕。しかしながら上記方法で用いられてい
るエシエリシア・コリのアスパルターゼ活性は工
業的に充分満足し得るほど高いとは云えないとい
う問題があつた。 本発明者らはエシエリシア属に属する微生物の
有するアスパルターゼ活性を司る染色体フラグメ
ントを切り出し、これをpSC101及びpBR322から
選ばれるプラスミドに組み込んだのち、エシエリ
シア属微生物に移入し、さらにＬ−アスパラギン
酸を唯一の炭素源もしくは窒素源として成育しう
る微生物を選択することにより、親株に比べて極
めて高いアスパルターゼ活性を有する微生物を調
製することに成功した。 即ち、本発明はエシエリシア属に属する微生物
から採取したアスパルターゼの遺伝情報を担うデ
オキシリボ核酸をpSC101及びpBR322から選ばれ
るプラスミドに組み込んだハイブリツドプラスミ
ドを含有し、かつＬ−アスパラギン酸を唯一の炭
素源もしくは窒素源として成育しうるエシエリシ
ア属に属する微生物菌体、その培養物もしくは該
菌体の処理物をフマール酸とアンモニアに作用さ
せることを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製法
である。 〔本発明微生物の調製法〕 本発明においてアスパルターゼの遺伝情報を担
うデオキシリボ核酸（以下、染色体DNAと称す
る）の供給源となる微生物としては、エシエリシ
ア属に属しアスパルターゼ活性を有するものであ
ればいかなる微生物であつてもよく、例えばエシ
エリシア・コリＫ−12MM294（ATCCNo.33625）、
エシエリシア・コリＫ−12C600r^-m^-（ATCNo.
33525）等を用いることができる。 上記の如き微生物から採取される染色体DNA
を組込むプラスミドとしては、pSC101〔Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，70，3240（1973）〕もしく
はpBR322〔Gene.，２，95（1977）〕を用いること
ができる。 また、染色体DNAをプラスミドに組み込んだ
ハイブリツドプラスミドを含有せしめる宿主とし
てはエシエリシア属に属し形質転換可能な微生物
であればよく、例えば前記染色体DNAの供給源
として用いた微生物を好適に用いることができ
る。 本発明に係る微生物を調製するに際しては、先
ずアスパルターゼ活性を有するエシエリシア属に
属する微生物より染色体DNAを採取する。染色
体DNAの採取は前記した如きエシエリシア属微
生物の菌体をリゾチーム処理・界面活性剤
〔SDS、ザルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン
酸ナトリウム）等〕で処理したのち、除蛋白しつ
いでエタノール沈殿せしめる常法〔J.Mol.Biol.，
３，208、（1961）、Biochem.Biophys.Acta.，72，
619（1963）〕により容易に実施できる。 かくして得られた染色体DNAとプラスミドと
の連結は制限エンドヌクレアーゼ（例えばHind
，Xho Ｉ，BamHI，SalI，EcoRI，EcoRV
等）を用いて染色体DNAとプラスミドのDNA鎖
を一重もしくは二重切断したのち、リガーゼ（例
えば、T4DNAリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼ
等）で処理するか、或いはその切断末端によつて
はターミナルトランスフエラーゼ、DNAポリメ
ラーゼ等で処理したのちリガーゼを作用させて
DNA鎖を結合する等の常法〔Methods in
Enzymology，68，41、遺伝子操作実験法（高木
康敬編著、講談社サイエンテイフイツク）〕によ
り実施することができる。 このようにして得たハイブリツドプラスミドに
よる形質転換方法は例えば低温下で塩化カルシウ
ム含有溶液で宿主敬生物細胞を処理して菌膜の透
過性を増大させ、ハイブリツドプラスミドDNA
を宿主微生物中にとり込ませる方法〔J.Mol.
Biol.，53，159（1970），J.Bacterol.，119，1072
（1974）〕等を採用できる。 かくして得られた形質転換株のうち、アスパル
ターゼの遺伝情報を担うハイブリツドプラスミド
が移入された菌株の選択はＬ−アスパラギン酸を
唯一の炭素源もしくは窒素源として良好に生育し
うる菌株を釣菌・分離することにより実施でき
る。又、形質転換に際しハイブリツドプラスミド
を各種の変異を有する変異株に移入して目的とす
るハイブリツドプラスミドを予め選択することも
できる。かかる選択に利用し得る変異株としては
例えばエシエリシア属に属する微生物であつてア
スパルターゼ欠損性変異株があげられ、グルタミ
ン酸を唯一の炭素源として生育しうる菌株として
選択できる。 かくすることにより本発明に係る微生物、即
ち、エシエリシア属に属する微生物から採取した
アスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核
酸をpSC101及びpBR322から選ばれるプラスミド
に組み込んだハイブリツドプラスミドを含有し、
かつＬ−アスパラギン酸を唯一の炭素源もしくは
窒素源として成育しうるエシエリシア属に属する
微生物を得ることができる。 かかる微生物としては具体的には例えばエシエ
リシア・コリTA5003（微工研菌寄第7091号）、エ
シエリシア・コリTA5004（微工研菌寄第7092号）
等があげられる。これらの微生物は親株に比べて
約５〜20倍の高いアスパルターゼ活性を有する。 〔Ｌ−アスパラギン酸の製造〕 本発明に係る微生物は前記の如く親株に較べて
顕著に優れたアスパルターゼ活性を有しているの
で、該微生物を用いてフマール酸とアンモニアか
らＬ−アスパラギン酸を好適に製造することがで
きる。 即ち、本発明に係る微生物の培養液、該培養液
から採取した菌体もしくは該菌体の処理物をフマ
ール酸とアンモニアに作用させることによりＬ−
アスパラギン酸を製造することができる。 本発明に係る微生物を培養するに際しては炭素
源、窒素源、有機栄養源、無機塩などを含む通常
の栄養培地が使用できる。培養は常法により行な
うことができ、例えば培地のPH5.0〜9.0に調整
し、微生物を接種したのち10〜45℃、好ましくは
28〜37℃で好気的に培養すればよい。又、上記培
地においてＬ−アスパラギン酸を炭素源、窒素源
として用いることができその際の添加量は約0.1
〜５％であるのが適当である。 酵素反応に際しては上記の如くして得られる培
養液のほか該培養液から採取した菌体、該菌体の
処理物をも用いることができ、ここに菌体の処理
物としては例えば洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕
物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌
体抽出物又はこれらをゲル抱活法や吸着法等のそ
れ自体公知の固定化方法により固定化したものが
あげられる。固化したものの具体例としては菌体
等を例えばポリアクリルアミドゲル、含硫多糖類
ゲル（カラギーナン、フアーセレラン等）、コラ
ーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコ
ールゲル、寒天ゲルで固定化したものがあげら
れ、ポリアクリルアミドゲルによる場合は例えば
特公昭53−1831号記載の方法により、又、含硫多
糖類による場合は例えば特開昭53−6483号記載の
方法により固定化することができる。コラーゲン
ゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコールゲ
ル、寒天ゲル等による場合も、例えば特開昭51−
144780号、特開昭49−30582号、特開昭49−80285
号、特開昭51−133484号記載の方法に従つて固定
化することができる。 基質たるフマール酸とアンモニアは種々の形で
反応系に供給することができ、例えばフマール酸
アンモニウム塩として供給してもよく、更にはフ
マール酸もしくはそのと無機アンモニウム塩とし
て供給してもよい。 フマール酸塩としては例えばフマール酸ナトリ
ウム、フマール酸カリウムを好適に用いることが
でき、無機アンモニウム塩としては例えば塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム又はこれらの混合物を好適に用いることがで
きる。 フマール酸もしくはその塩と無機アンモニウム
塩を用いる場合には、これら２成分のモル比１：
1.5〜１：２の間にあるのが適当である。 酵素反応は約５〜50℃の広い温度範囲で実施す
ることができるが微生物の酵素の安定性を考慮し
て20〜45℃で実施するのが好ましい。又、酵素反
応に際してそのPHは６〜10となるよう実施するの
が好ましい。尚、上記酵素反応に際してはカルシ
ウム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム
等の２価金属イオンを添加するのが好ましい。こ
れらの２価金属イオンの濃度は0.1〜10ミリモル
程度でよく、これにより酵素の安定性を高めるこ
とができる。 反応は微生物菌体を用いる場合にはバツチ法で
実施するのが好ましく、培養後集菌した微生物菌
体を前記した如き基質溶液にけん濁かく拌するこ
とによつてＬ−アスパラギン酸が生成する。又、
固定化微生物を用いる場合の反応は固定化微生物
が水に不溶性であるため、バツチ法によるのみな
らず、カラム法によつて連続的に実施することが
できる。例えば固定化微生物をカラムに充填し、
このカラムに基質溶液を適当な速度で流下すれ
ば、Ｌアスパラギン酸のみを含む流出液が得られ
る。またバツチ法による場合は基質溶液に固定化
微生物をけん濁させ、かく拌することによつてＬ
−アスパラギン酸が生成する。この場合には反応
終了液ら固定化微生物をロ過或いは遠心分離する
ことにより取得すれば再びこれを反覆使用するこ
とができる。上記反応を実施するにあたつては反
進行率は微生物の量、温度、反応時間、基質の流
速（特に線速度）その他により影響される。例え
ば、カラム法による場合は使用する固定化微生物
の量に従い基質溶液の流下速度を、またバツチ法
による場合はその反応時間を適当に調整すること
により反応進行率を100％にまで高める至適条件
を見出すことも容易である。 かくして反応液中に生成蓄積したＬ−アスパラ
ギン酸の分離精製は、通常のイオン交換樹脂法や
その他の公知方法を組合せて容易に行なうことが
できる。 以上の如く本発明に係る微生物は従来知られて
いるエシエリシア属微生物の有するアスパルター
ゼ活性より格段に高いアスパルターゼ活性を有
し、かかる高アスパルターゼ活性の微生物を用い
ることにより工的に極めて有利にＬ−アスパラギ
ン酸を製造し得る。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 尚、実施例中のアスパルターゼ活性は1.0Mフ
マール酸アンモニウム（8.5，1mM塩化マグネシ
ウム含有）と菌体又は菌体処理物とを接触させ、
37℃で１時間反応後反応液中のＬ−アスパラギン
酸をロイコノストツク・メセンテロイデスP60を
用いるバイオアツセイ法〔J.Biol.Chem.，172，
15（1948）〕により測定した。 実施例 １ (1) 染色体DNAの調製 エシエリシア・コリＫ−12MM294株を1.2の
グルコース0.2％を含むＬ−プロス（ペプトン１
％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％、PH
7.0）に接種し、37℃で８時間振とう培養し対数
増殖期後期の菌体を遠心分離により集めた。この
菌体をリゾチーム処理、ザルコシル処理して溶菌
し、フエノール処理により除蛋白したのちエタノ
ール処理して染色体DNAを沈殿させた。ついで
常法により染色体DNAを抽出精製することによ
り染色体DNA5.4mgを得た。 (2) プラスミドDNAの調製 エシエリシア・コリＫ−12C600r^-m^-株に
pSC101を含有させた菌株〔Proc.Natl.Acad.Soi.
USA，70，3240（1973）〕を800mlのグルコース
0.2％を含むＬ−プロスに接種して37℃で７時間
振とう培養した後、菌体を遠心分離して集菌し
た。ついで該菌体をリゾチーム処理、SDS処理に
より溶菌させ、最終1Mになるように塩化ナトリ
ウムを加えた後、100000×ｇ、30分間の遠心分離
を行なつた。上清を採取し、フエノール−クロロ
ホルム処理した後、エタノールを加えDNAを遠
心分離により集めた。沈殿したDNAを10mMト
リス塩酸−1mMEDTA（PH7.5）に溶解し、塩化
セシウム・エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠
心法によりプラスミドDNAを分離精製した。か
くして1.0mgのpSC101プラスミドDNAを得た。 (3) ハイブリツドプラスミドの調製 上記(1)で得た染色体DNA10μg、(2)で得たプラ
スミドDNA2μg、の各々に制限エンドヌクレア
ーゼEcoRIとXhoIを同時に通常の条件で作用さ
せDNA鎖を完全に切断した。65℃，10分間の熱
処理後、両反応液を混合しT₄フアージ由来の
DNAリガーゼを通常の条件下で作用させてDNA
鎖を連結させた。 (4) ハイブリツドプラスミドによる形質転換 (a) エシエリシア・コリＫ−12C600r^-m^-をＮ−
メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンで変異誘導処理し、Ｌ−グルタミン酸30mM
を炭素源とする最小寒天培地（リン酸第二カリ
ウム0.7％、リン酸−カリウム0.3％、硫酸アン
モニウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.01％、寒天1.5％）に塗布した。37℃で２日
間培養したのち、生じたコロニーのうち大きな
コロニーを釣菌分離しTK6株を得た。ついで
このTK6株をＮ−メチルN′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンで変異誘導処理し、0.2％の
グルコースを含むＬ−ブロス寒天培地に平板あ
たり約100個のコロニーが生じるように塗布し
た。生じたコロニーのうちＬ−グルタミン酸
30mMを炭素源として含む最小培地上で、37℃
で２日間培養しても生育しない株を選択（レプ
リカ法）した。かくして得られた株からアスパ
ルターゼ活性を欠損したTK237株を得た。 得られたTK237をグルコース0.2％を含むＬ
−ブロス30mlに接種し、37℃で振とう培養しそ
の対数増殖期の中期まで生育せしめた菌体を集
菌した。ついで氷冷した0.1M塩化マグネシウ
ム溶液15mlにけん濁したのち集菌し、氷冷した
0.1M塩化カルシウム溶液15mlにけん濁した。
０℃で20分間放置したのち集菌し、氷冷した
0.1M塩化カルシウム溶液３mlにけん濁した。
この細胞けん濁液に(3)で得たDNA溶液を加え
て60分間氷冷したのち、37℃で３分間熱処理す
ることによつてDNAを細胞内にとりこませた。
ついでこのけん濁液にグルコース0.2％を含む
Ｌ−ブロス15mlを加え37℃で２時間振とう培養
した後、集菌し、生理食塩水15mlにけん濁し
た。再度集菌し、生理食塩水15mlにけん濁した
のち集菌した。ついで生理食塩水15mlにけん濁
し、該けん濁液を0.5〜１mlずつＬ−グルタミ
ン酸30mMを炭素源とする寒天培地（テトラサ
イクリン5μg／ml含有）に塗布し、37℃で７日
間培養した。 生じたコロニーのうち、TK6株よりアスパ
ルターゼ活性の高いものをハイブリツドプラス
ミドDNAによる形質転換株として得た。かく
して得られた形質転換株をＬ−ブロス１で培
養したのち(2)と同様にしてハイブリツドプラス
ミドDNAを採取した。 (b) 得られたハイブリツドプラスミドDNAと
TK6株とを上記(a)と同様に処理して形質転換
株を調製し、グルコース0.2％、テトラサイク
リン5μg／mlを含むＬ−ブロス寒天培地上に塗
布して37℃で１夜培養することによりアスパル
ターゼの遺伝子を有するハイブリツドプラスミ
ドDNA（pTA503）を含み高アスパルターゼ活
性を有する形質転換株エシエリシア・コリ
TA5003（微工研条寄第531号）を得た。 上記で得られたエシエリシア・コリTA5003
と原株エシエリシア・コリＫ−12MM294のア
スパルターゼ活性を測定した。その結果は下記
第１表に示す通りである。 【表】 ［培地：フマール酸アンモニウム３％、リン酸第
１カリウム0.2％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.05％、コーンスチープリカー２％、ミースト２
％（PH7.0）］ 上記第１表から本発明の微生物エシエリシア・
コリTA5003は原株たるエシエリシア・コリＫ−
12MM294に比べ約７倍のアスパルターゼ活性を
有することが明らかである。 実施例 ２ (1) プラスミドDNAの調製 実施例１−(2)においてプラスミドpSC101に代
えてpBR322を用い、以下同様にして処理するこ
とによりpBR322プラスミドDNA1.0mgを得た。
他方、実施例１で得たエシエリシア・コリ
TA5003を実施例１−(2)と同様にして処理するこ
とによりDNApTA503 0.6mgを得た。 (2) ハイブリツドプラスミドの調製 (a) 上記(1)で得たpBR322 15μgとpTA503の
DNA15μgに各々制限エンドヌクレアーゼ
BamHIとSalIを同時に通常の条件で作用させ
て両プラスミドPNA鎖を切断した。65℃，10
分間の熱処理後、両反応液を混合しT4DNAリ
ガーゼを通常の条件下で作用させてDNA鎖を
連結させた。 (b) エシエリシア・コリTK237を上記(2)−(a)で
得たDNA溶液で形質転換し、得られる菌株を
グルコース0.2％、アンピシリン50μg／mlを含
むＬ−ブロス寒天培地で37℃，８時間培養した
のち、実施例１−(2)と同様に処理することによ
りハイブリツドプラスミドDNA0.7mgを得た。
ついで得られたハイブリツドプラスミド
DNA4μgに制限エンドヌクレアーゼEcoRVを
通常の条件で作用させてプラスミドDNA鎖を
切断した。65℃，10分間の熱処理後、T4DNA
リガーゼを通常の条件下で作用させてDNA鎖
を連結させた。 (4) ハイブリツドプラスミドによる形質転換 得られたハイブリツドプラスミドDNAと
TK237を実施例１−(4)と同様にして形質転換し、
グルコース0.2％、アンピシリン50μg／mlを含む
Ｌ−ブロス寒天培地を用いて生育する菌株を採取
し高アスパルターゼ活性を有する微生物を選択す
ることによりアスパルターゼの遺伝子を有するハ
イブリツドプラスミド（pTA504）を含み高アス
パルターゼ活性を有する形質転換株エシエリシ
ア・コリTA5004（微工研条寄第532号）を得た。 上記で得られたエシエリシア・コリTA5004と
原株エシエリシア・コリＫ−12MM294のアスパ
ルターゼ活性を測定した。その結果は下記第２表
に示す通りである。 【表】 上記第２表から本発明の微生物エシエリシア・
コリTA5004は原株たるエシエリシア・コリＫ−
12MM294に比べ約15倍のアスパルターゼ活性を
有することが明らかである。又、エシエリシア・
コリTA5004のハイブリツドプラスミド
DNApTA504を抽出し、制限エンドヌクレアー
ゼEcoR ＶとSalIで同時にDNA鎖を切断した。
生じたDNA断片を通常のアガロース・ゲル電気
泳動法で調べた。その結果、pTA504はPBR322
プラスミドDNAをEcoRVとSalIで切断して生じ
る大きい方のDNA断片とpTA503由来のDNA断
片とから成ることがわかつた。 実施例 ３ フマール酸アンモニウム３％、第１リン酸カリ
ウム0.2％、硫酸マグネシウム・７水和物0.05％、
コーンスチープリカー４％、ミースト２％を含む
培地（PH7.0）500mlにエシエリシア・コリ
TA5004を植菌し、37℃で24時間培養した。この
培養液のPHをアンモニア水でPH8.5とし、フマー
ル酸アンモニウム65gおよびトリトンＸ−100
500mgを添加してさらに37℃で６時間静置して酵
素反応を行なつた。反応終了液液をろ過、濃縮し
たのちPH2.8に調整し析出晶をろ取することによ
りＬ−アスパラギン酸の粗結晶を得た。ついで該
粗結晶を水から再結晶することによりＬ−アスパ
ラギン酸47.0gを得た。 実施例 ４ (1) フマール酸アンモニウム３％、第１リン酸カ
リウム0.2％、硫酸マグネシウム・７水和物0.05
％、コーンスチープリカー４％、ミースト２％を
含む培地（PH7.0）にエシエリシア・コリTA5004
を植菌し、37℃で24時間振とう培養した。この培
養液から遠心分離により集菌した菌体を生理食塩
水16mlにけん濁し、あらかじめ40℃に保温した
3.2％ゲニユーゲルWG水溶液64mlを加え40℃の
温溶中で混合した。この混合液を1Mフマール酸
アンモニウム水溶液（PH8.5，1mM塩化マグネシ
ウム含有）中に滴下することにより球状ゲル（直
径３mm）のアスパルターゼ活性を有する固定化エ
シエリシア・コリ61g（湿潤量）を得た。この固
定化菌体1gのアスパルターゼ活性は
22.3mmoks／hrであつた。 (2) 上記(1)で得られた固定化エシエリシア・コリ
61gを外套管付カラム（４cm／８cm）に充填し、
37℃にて48時間インキユベートすることにより活
性化（アスパルターゼ活性1980mmoles／hr）
後、同温度にて1Mフマール酸アンモニウム溶液
（PH8.5，1mM塩化マグネシウム含有）1000mlを
50ml／hrの流速で流下した。流出液をPH2.8とす
ることにより結晶を析出させた。析出晶をろ取す
ることによりＬ−アスパラギン酸128gを得た。 実施例 ５ (1) エシエリシア・コリTA5004の菌体8gを生理
食塩水５mlにけん濁し、これにあらかじめ40℃に
保温した2.2％ゲニユーゲルWG水溶液（１％ロ
ーカストビンガム含有）80mlを加えて混合した。
この混合液を冷却してゲル化させ、更に２％塩化
カリウム水溶液25mlを静かに加え30分詰静置し
た。得られたゲルを１辺３mmの立方体に成型し２
％塩化カリウム水溶液で洗浄した。得られたゲル
91gを冷エタノール100mlに浸漬し、これにグル
タルアルデヒドを最終濃度0.49％になるよう加
え、氷冷下に15分間静置した。ついでゲルをろ取
し２％塩化カリウム水溶液で洗浄した後、活性化
することによりアスパルターゼ活性を有する固定
化エシエリシア・コリ87g（湿潤量、30.0mmole／
hr／ｇ菌体）を得た。 (2) 上記(1)で得られた固定化エシエリシア・コリ
11gを外套管付カラム（1.6cm／12cm）に充填し、
37℃にて1Mフマール酸アンモニウム水溶液（PH
8.5，1mM塩化マグネシウム含有）を６ml／hrの
流速で昼夜連続して導通し経時的にアスパルター
ゼ活性を測定した。その結果20日間経過後もなお
活性の低下は殆ど認められなかつた。 実施例 ６ エシエリシア・コリTA5004の菌体10gを0.05M
リン酸緩衝液（PH8.5）50mlにけん濁し9Kcで15
分間音波処理を行なつた。ついで該けん濁液を遠
心分離し得られる上澄液40mlを弱塩基性イオン交
換樹脂デユオライト−A7（米国、ダイアモンドシ
ヤムロツク社製）60mlを充填したカラムに30ml／
hrで室温下に導通した。次に0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.5）300mlと0.4％グルタルアルデヒド300ml
を含む溶液で30分間架橋しグルタルアルデヒドを
充分洗浄して固定化酵素を調製した。この固定化
酵素を50ml容量のカラムに充填し、1Mフマール
酸アンモニウム（PH8.5，1mM塩化マグネシウム
含有）500mlを25ml／hrの流速で導通した。流出
液を合しPH2.8とすることによりＬ−アスパラギ
ン酸55gを得る。 実施例 ７ エシエリシア・コリTA5004を用いて実施例６
と同様にして得られた上澄液を硫案分画（30〜50
％飽和）し得られた沈殿を水５mlに溶解した。こ
の溶液を水に対して１夜透析し透析内液を酵素液
（アスパルターゼ標品）とした。ついでこの酵素
液２mlと3.2％ゲニユーゲルWG水溶液12mlを37
℃の温溶中にて混合した。該混合液を２％塩化カ
リウム水溶液中に滴下することにより球状ゲル
（直径約３mm）を得た。得られた固定化アスパル
ターゼの活性は18.7mmoles／hr／ｇであつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エシエリシア属に属する微生物から採取した
   アスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核
   酸をpSC101及びpBR322から選ばれるプラスミド
   に組み込んだハイブリツドプラスミドを含有し、
   かつＬ−アスパラギン酸を唯一の炭素源もしくは
   窒素源として成育しうるエシエリシア属に属する
   微生物菌体、その培養物もしくは該菌体の処理物
   をフマール酸とアンモニアに作用させることを特
   徴とするＬ−アスパラギン酸の製法。 ２ フマール酸とアンモニアをフマール酸アンモ
   ニウムとして供給する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。