JPS59175882A - 好熱性アミラ−ゼの製造法 - Google Patents
好熱性アミラ−ゼの製造法Info
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- JPS59175882A JPS59175882A JP5014883A JP5014883A JPS59175882A JP S59175882 A JPS59175882 A JP S59175882A JP 5014883 A JP5014883 A JP 5014883A JP 5014883 A JP5014883 A JP 5014883A JP S59175882 A JPS59175882 A JP S59175882A
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- thermophilic amylase
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は好熱性アミラーゼの製造法に関する。
α−アミラーゼは種々の微生物により生産されることが
知られている。しかし、高温下でも失活しない好熱性ア
ミラーゼの製造に関する報告は比較的少ない。特開昭５
７−１５９０９７号公報には好熱性α−アミラーゼを生
産するバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｔｅａｒｏｔｈｅｎｎｏｐｈｉｌｕｓ ）の
全ＤＮＡ ヲ阻荊■で切断して得たＤＮＡ ７ラグメン
トをプラスミドベクターに組み込み、これをエシェリヒ
ア・フリ（］Ｄｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）に
導入して該エシェリヒア・コリに好熱性アミラーゼ生産
在を付与せしめた例が記載されている。しかし、ここに
報告されている方法では好熱性アミラーゼの生産性は必
ずしも十分とけ云えず、さらに改善する必要がある。
知られている。しかし、高温下でも失活しない好熱性ア
ミラーゼの製造に関する報告は比較的少ない。特開昭５
７−１５９０９７号公報には好熱性α−アミラーゼを生
産するバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｔｅａｒｏｔｈｅｎｎｏｐｈｉｌｕｓ ）の
全ＤＮＡ ヲ阻荊■で切断して得たＤＮＡ ７ラグメン
トをプラスミドベクターに組み込み、これをエシェリヒ
ア・フリ（］Ｄｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）に
導入して該エシェリヒア・コリに好熱性アミラーゼ生産
在を付与せしめた例が記載されている。しかし、ここに
報告されている方法では好熱性アミラーゼの生産性は必
ずしも十分とけ云えず、さらに改善する必要がある。
本発明者らは、好熱性アミラーゼの効率的な製造法を開
発すべく検討を重ねた結果、バチルス・ステアロサーモ
フィルスの染色体ＤＮＡよ多分前され、ＤＮＡ鎖中にＢ
ａｍ Ｈ工で切断される個所、その２．４Ｘ １０”
ｂｐ下流にＳａｌ工で切断される個所、その０．５Ｘ
１０２ ｂｐＴ流にＰｓｔ 工で切断される個所および
その１．４×１０３ｂｐＴ流にＢａ＋ｎｌ（工で切断さ
れる個所があるＤＮＡフラグメントをプラスミドベクタ
ーに組み込み、これを宿主微生物に導入することにより
非常に高い生産性を有する微生物菌株が得られることを
見出した。この場合、特に分子量が２．９Ｘ１０３ｋｂ
ｐであるＤＮＡフラグメントを用いることによりさらに
良い結果を与えることを知見した。本発明はかかる知見
に基いて完成されたものである。
発すべく検討を重ねた結果、バチルス・ステアロサーモ
フィルスの染色体ＤＮＡよ多分前され、ＤＮＡ鎖中にＢ
ａｍ Ｈ工で切断される個所、その２．４Ｘ １０”
ｂｐ下流にＳａｌ工で切断される個所、その０．５Ｘ
１０２ ｂｐＴ流にＰｓｔ 工で切断される個所および
その１．４×１０３ｂｐＴ流にＢａ＋ｎｌ（工で切断さ
れる個所があるＤＮＡフラグメントをプラスミドベクタ
ーに組み込み、これを宿主微生物に導入することにより
非常に高い生産性を有する微生物菌株が得られることを
見出した。この場合、特に分子量が２．９Ｘ１０３ｋｂ
ｐであるＤＮＡフラグメントを用いることによりさらに
良い結果を与えることを知見した。本発明はかかる知見
に基いて完成されたものである。
本発明は、］）ＮＡ鎖中にＢａｍ Ｈ工で切断される個
所、その２．４Ｘ１０２ｂｐ下流にＳａｌ工で切断され
る個所、その０．５Ｘ１０２ｂｐ下流Ｋ Ｐｓｔ工で切
断される個所およびその１．４Ｘ１０３ｂｐ下流にＥａ
ｍ Ｈ工で切断される個所があり、２．９ Ｘ １０’
ｋｂｐの分子量を有し、好熱性アミラーゼ蛋白をコー
ドしている遺伝子が組み込まれているプラスミドベクタ
ーを含有するエシェリヒア属の微生物を培養し、培養物
から好熱性アミラーゼを採取することを特徴エシェリヒ
ア属の微生物は、たとえば以下の方法によって造成する
ことができる。
所、その２．４Ｘ１０２ｂｐ下流にＳａｌ工で切断され
る個所、その０．５Ｘ１０２ｂｐ下流Ｋ Ｐｓｔ工で切
断される個所およびその１．４Ｘ１０３ｂｐ下流にＥａ
ｍ Ｈ工で切断される個所があり、２．９ Ｘ １０’
ｋｂｐの分子量を有し、好熱性アミラーゼ蛋白をコー
ドしている遺伝子が組み込まれているプラスミドベクタ
ーを含有するエシェリヒア属の微生物を培養し、培養物
から好熱性アミラーゼを採取することを特徴エシェリヒ
ア属の微生物は、たとえば以下の方法によって造成する
ことができる。
好熱性アミラーゼ生産菌の原株としては各種のものを使
用できるが、好熱性アミラーゼ生産菌として知うれるバ
チルス・ステアロサーモフィルスが好ましい。
用できるが、好熱性アミラーゼ生産菌として知うれるバ
チルス・ステアロサーモフィルスが好ましい。
原株の好熱性アミラーゼ生株菌から好熱性アミラーゼ生
産性を遺伝情報としてもつ染色体ＤＮＡを抽出するには
斉０−三浦の方法（Ｂｉｏｃｈａｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
。
産性を遺伝情報としてもつ染色体ＤＮＡを抽出するには
斉０−三浦の方法（Ｂｉｏｃｈａｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
。
Ａｃｔａ、 ７２．６１９ （１９６５） ）やＪ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、 ８９ 。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、 ８９ 。
−噌−−■階−−−弊一一一一−−−−−１０６５ （
１９６５）に記載されている方法によって行なうことが
できる。得られたＤＮＡを好熱性アミラーゼ遺伝子のＤ
ＮＡ源として用いる。
１９６５）に記載されている方法によって行なうことが
できる。得られたＤＮＡを好熱性アミラーゼ遺伝子のＤ
ＮＡ源として用いる。
一方、プラスミドベクターとしては任意のものを使用す
ることができ、たとえば蛋白質核酸酵素、第２６巻、第
４号（１９８１）に記載されている以下のものが好まし
いものである。
ることができ、たとえば蛋白質核酸酵素、第２６巻、第
４号（１９８１）に記載されている以下のものが好まし
いものである。
ｐｓｃｌｏｌ 、 ｐＲＫ３５３ 、 ｐＲＫ６４６
、ｐＲＫ２４Ｂ 、 ｐＤＩＦ４１ 。
、ｐＲＫ２４Ｂ 、 ｐＤＩＦ４１ 。
０ｏ１１ｎｌ 、 ｐＶＨ５１、ｐＡ○１０５ 、 Ｒ
８１？’２１２４ 、 ｐｃ！Ｒ１。
８１？’２１２４ 、 ｐｃ！Ｒ１。
ＴＩＭＢ９ 、 ｐＢＲ５１３、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ
３２４、ｐＢＲ３２５。
３２４、ｐＢＲ３２５。
ｐＢＲ３２７、ｐＥＲ３２８、ｐＫＹ２２８９ 、ｐＫ
Ｙ２７００ 、ｐＫＮ８０ 。
Ｙ２７００ 、ｐＫＮ８０ 。
ｐＫＱ７ 、ｐＫＢ１５８ 、 ｐＭＫ２０Ｄ４ 、
ｐＡｃｙｃｌ、 ｐＡＯＹ０１Ｂ４ 。
ｐＡｃｙｃｌ、 ｐＡＯＹ０１Ｂ４ 。
λａｕ、１ 、λｇｔ−λＣ１λｇｔ・λＢ、λｗ］１
Ｃｓ−λＣ２λｖｎｃｓ−λＢ′。
Ｃｓ−λＣ２λｖｎｃｓ−λＢ′。
λＺＪｖｉｒ−λＢ′、λＡＬＯ−λＢ、λＷＦｉＳ−
Ｔｓ＋！ｉ２！２ 、 λＤａｍなど。
Ｔｓ＋！ｉ２！２ 、 λＤａｍなど。
染色体ＤＮＡおよびプラスミドベクターはそれぞれ制限
酵素工〉ドヌクレアーゼを用いて切断する。
酵素工〉ドヌクレアーゼを用いて切断する。
この場合、ベクターの種類によシそれぞれ適した制限酵
素があるので適切な制限酵素を用いるべきである。また
、染色体ＤＮＡについては制限酵素による切断が部分的
に行なわれるように反応条件を調節することにより各種
の制限酵素の使用が可能である。染色体ＤＮＡおよびベ
クターＤＮＡをそれぞれ制限酵素により処理した後、ベ
クターＤＮＡについてはバクテリア起源の市販アルカリ
・ホスファターゼによる処理を行なって５′−末端のリ
ン酸基を除くことが望ましい。一方、染色体ＤＮＡにつ
いてはアミラーゼ遺伝子が分解されないように配慮する
必要がある。
素があるので適切な制限酵素を用いるべきである。また
、染色体ＤＮＡについては制限酵素による切断が部分的
に行なわれるように反応条件を調節することにより各種
の制限酵素の使用が可能である。染色体ＤＮＡおよびベ
クターＤＮＡをそれぞれ制限酵素により処理した後、ベ
クターＤＮＡについてはバクテリア起源の市販アルカリ
・ホスファターゼによる処理を行なって５′−末端のリ
ン酸基を除くことが望ましい。一方、染色体ＤＮＡにつ
いてはアミラーゼ遺伝子が分解されないように配慮する
必要がある。
このようにして得られた染色体ＤＮＡ断片と、切断され
たプラスミドベクターをＴ４−ファージＤＮＡリガーゼ
などのりガーゼを用いる通常の方法によって連結する。
たプラスミドベクターをＴ４−ファージＤＮＡリガーゼ
などのりガーゼを用いる通常の方法によって連結する。
なお、ターミナルトランスフェラーゼを用いて染色体Ｄ
ＮＡ断片と開裂したプラスミドベクターのそれぞれにデ
オキシアデニル酸とデオキシシチジル酸を付加Ｌ、混合
したのちア二ｌＪングして連結する方法も採用できる。
ＮＡ断片と開裂したプラスミドベクターのそれぞれにデ
オキシアデニル酸とデオキシシチジル酸を付加Ｌ、混合
したのちア二ｌＪングして連結する方法も採用できる。
かくして調製した組み換えＤＮＡを宿主のエシェリヒア
属微生物に導入するには、たとえば、Ｔ、 Ｍｏｌ。
属微生物に導入するには、たとえば、Ｔ、 Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、５３．１５９ （１９７０）に記載されてい
るような通常の形質転換法を適用することができる。
るような通常の形質転換法を適用することができる。
形質転換株の中から好熱性アミラーゼ遺伝子を含むクロ
ーンを選択するには、まずベクタープラスミド上のマー
カーの性質を有する株を選択し、次イテこれを濾紙等に
レプリカし、リシス・バッファー（１ｙｓｉｓ ｂｕｆ
ｆθｒ）の如き溶液を浸した濾紙上にコロニーが上面に
位置するようにのせてインキュベートしたのち、コロニ
ーが下面に位置するようにスターチプレート上にのせて
インキュベートする。しかる後、発色試薬を用いて残存
するスターチを発色させ、コロニーの周辺が透明になっ
ているものを検索することによって好熱性アミラーゼ遺
伝子を含むクローンを検出することができる。
ーンを選択するには、まずベクタープラスミド上のマー
カーの性質を有する株を選択し、次イテこれを濾紙等に
レプリカし、リシス・バッファー（１ｙｓｉｓ ｂｕｆ
ｆθｒ）の如き溶液を浸した濾紙上にコロニーが上面に
位置するようにのせてインキュベートしたのち、コロニ
ーが下面に位置するようにスターチプレート上にのせて
インキュベートする。しかる後、発色試薬を用いて残存
するスターチを発色させ、コロニーの周辺が透明になっ
ているものを検索することによって好熱性アミラーゼ遺
伝子を含むクローンを検出することができる。
このようにして得られた好熱性アミラーゼをコ−ドする
遺伝子は好熱性アミラーゼの生産に不要な染色体ＤＮＡ
を含むことがあるので、不要なりＮＡ区分を除けばより
生産性が高くなる。
遺伝子は好熱性アミラーゼの生産に不要な染色体ＤＮＡ
を含むことがあるので、不要なりＮＡ区分を除けばより
生産性が高くなる。
本発明の好熱性アミラーゼ生産菌としては具体的にけエ
シェリヒア１コリＨＢ１０１／ＰＨ工３０１ （ＦＩＲ
Ｍｐ−７００！９）がある。
シェリヒア１コリＨＢ１０１／ＰＨ工３０１ （ＦＩＲ
Ｍｐ−７００！９）がある。
かくして得られた好熱性アミラーゼ生産能を有するエシ
ェリヒア属の微生物を用いて常法により好熱性アミラー
ゼを製造する。すなわち、培地としては炭素源、窒素源
、無機塩および必要によりビタミン、アミノ酸等の有機
栄養素を含有する通常の培地が使用できる。炭素源とし
てはグルコース、７ラクトース、ラクトース、シュクロ
ースおよびこれらの糖を含有するモラセス、果汁、乳ホ
エイ、澱粉加水分解物等が、窒素源としてはアンモニウ
ム塩、アンモニア水、アンモニアガス等力使用できる。
ェリヒア属の微生物を用いて常法により好熱性アミラー
ゼを製造する。すなわち、培地としては炭素源、窒素源
、無機塩および必要によりビタミン、アミノ酸等の有機
栄養素を含有する通常の培地が使用できる。炭素源とし
てはグルコース、７ラクトース、ラクトース、シュクロ
ースおよびこれらの糖を含有するモラセス、果汁、乳ホ
エイ、澱粉加水分解物等が、窒素源としてはアンモニウ
ム塩、アンモニア水、アンモニアガス等力使用できる。
培養は好ましくは３０〜４０°Ｃ１好ましくけｐＨ６〜
８にて行なう。
８にて行なう。
培養終了後、培養液から菌体を集め、次いで超音波処理
などの手段によって細胞を破壊すれば好熱性アミラーゼ
を含む溶液を得ることができる。
などの手段によって細胞を破壊すれば好熱性アミラーゼ
を含む溶液を得ることができる。
好熱性アミラーゼを分離するには、アフィニティークロ
マトグラフィー、硫安分画などの方法があるが、カルシ
ウム存在下で７０〜８０℃、１５分間程加熱することに
より不要な蛋白質を変性沈澱せしめて除去すれば好熱性
アミラーゼが容易に純化できる。
マトグラフィー、硫安分画などの方法があるが、カルシ
ウム存在下で７０〜８０℃、１５分間程加熱することに
より不要な蛋白質を変性沈澱せしめて除去すれば好熱性
アミラーゼが容易に純化できる。
この好熱性アミラーゼはカルシウムイオン存在下で８０
°Ｃにて１５分間処理しても安定であり、バチルス１ス
テアロサーモフイルスの生産する好熱性アミラーゼと同
じ性質であることが確かめられた。
°Ｃにて１５分間処理しても安定であり、バチルス１ス
テアロサーモフイルスの生産する好熱性アミラーゼと同
じ性質であることが確かめられた。
次に、本発明を実施例によシ詳しく説明する。
実施例１
バチルス・ステアロサーモフィルスＤＹ−５ヲｌｊＸ株
とし、これより次のようなプロセスにより著量の好熱性
アミラーゼを生産する大腸菌を造成した。
とし、これより次のようなプロセスにより著量の好熱性
アミラーゼを生産する大腸菌を造成した。
（１１好熱性アミラーゼ生産能を遺伝情報としてもつ染
色体ＤＮＡの調製 好熱性アミラーゼ生産菌として得られるバチルス・ステ
アロサーモフィルスＤＹ−５を液体栄養培地（１％トリ
プトン、０．５％酵母エキス、１％グルコース、２％ス
ターチ、０．３％ＮａＯ４； ｐＨ７，０）１ｔに植菌
し、５５°Ｃで対数増殖期まで生育させた。菌を遠心分
離操作により集菌洗滌後、斉藤・三浦の方法（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ、 Ｅｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２ 、６１
９（１９６３））によって染色体ＤＮＡ ２． Ｉ Ｑ
を得た。
色体ＤＮＡの調製 好熱性アミラーゼ生産菌として得られるバチルス・ステ
アロサーモフィルスＤＹ−５を液体栄養培地（１％トリ
プトン、０．５％酵母エキス、１％グルコース、２％ス
ターチ、０．３％ＮａＯ４； ｐＨ７，０）１ｔに植菌
し、５５°Ｃで対数増殖期まで生育させた。菌を遠心分
離操作により集菌洗滌後、斉藤・三浦の方法（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ、 Ｅｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２ 、６１
９（１９６３））によって染色体ＤＮＡ ２． Ｉ Ｑ
を得た。
（２）染色体ＤＮＡとプラスミドｐＢＲ３２２の制限酵
素による切断 バチルス・ステアロサーモフィルスＤＹ−５（Ｄ染色体
ＤＮＡ ２ｐｔ ＋制限酵素Ｈ１ｎｄ ■１０単位（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａＥｔｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ社製） 、 Ｎａ０４５０ｍＭ、 ）リス−
ａｏｔｌ ｏｍＭ（ｐａ７．５）およびＭｇ０４６ ｍ
Ｍを含有する溶液１００μｔを３７℃、３０分間反応し
た。その後、６５°Ｃで１０分間熱処理を行なって反応
を停止せしめた。一方、プラスミドｐＢＲ５２２の２μ
ｍをＤＹ−５の染色体ＤＮＡの場合と同様な反応組成お
よび反応条件により切断し、次いで、アルカリフォスフ
ァターゼ処理を行ない５′末端のリン酸基を除去しＤＮ
Ａの再結合を防止した。その後、６５°Ｃ２１０分間の
熱処理を行なって反応を停止せしめた。
素による切断 バチルス・ステアロサーモフィルスＤＹ−５（Ｄ染色体
ＤＮＡ ２ｐｔ ＋制限酵素Ｈ１ｎｄ ■１０単位（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａＥｔｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ社製） 、 Ｎａ０４５０ｍＭ、 ）リス−
ａｏｔｌ ｏｍＭ（ｐａ７．５）およびＭｇ０４６ ｍ
Ｍを含有する溶液１００μｔを３７℃、３０分間反応し
た。その後、６５°Ｃで１０分間熱処理を行なって反応
を停止せしめた。一方、プラスミドｐＢＲ５２２の２μ
ｍをＤＹ−５の染色体ＤＮＡの場合と同様な反応組成お
よび反応条件により切断し、次いで、アルカリフォスフ
ァターゼ処理を行ない５′末端のリン酸基を除去しＤＮ
Ａの再結合を防止した。その後、６５°Ｃ２１０分間の
熱処理を行なって反応を停止せしめた。
（３）連結酵素によるプラスミドへの染色体断片の挿入
（２）で得た染色体ＤＮＡ並びにプラスミドＤＮＡ ノ
それぞれ１μｍを取シ混合した。
それぞれ１μｍを取シ混合した。
これにＡＴＰ 、ジチオスレイトールおよびＴ４ファー
ジ由来のＤＮＡリガーゼを加え１２℃、１６時間ＤＮＡ
鎮の連結反応を行なった。
ジ由来のＤＮＡリガーゼを加え１２℃、１６時間ＤＮＡ
鎮の連結反応を行なった。
（４）好熱性アミラーゼ生産遺伝子を担ったプラスミド
を有する形質転換株の選択 エシェリヒア・コリＨＢ１旧株をＬ培地（１％トリプト
ン、α５％酵母エキス、０．５％Ｍａｉｌ。
を有する形質転換株の選択 エシェリヒア・コリＨＢ１旧株をＬ培地（１％トリプト
ン、α５％酵母エキス、０．５％Ｍａｉｌ。
０．０２５ ｆ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，Ｏ；ｐａ７．２
） １ｏｄに接種し、３７°Ｃで振盪培養を行ない対
数増殖期中期まで生育させた後集菌した。これを氷冷下
１０ｍＭＮａ０ｔで洗浄した後、菌体を３０ ｍＭ ０
ａ０４に懸濁し、氷上３０分間保持していわゆるコンピ
テントな（ＤＩＩＩＡ取り込み能を有する）細胞を調製
した。
） １ｏｄに接種し、３７°Ｃで振盪培養を行ない対
数増殖期中期まで生育させた後集菌した。これを氷冷下
１０ｍＭＮａ０ｔで洗浄した後、菌体を３０ ｍＭ ０
ａ０４に懸濁し、氷上３０分間保持していわゆるコンピ
テントな（ＤＩＩＩＡ取り込み能を有する）細胞を調製
した。
このコンピテントな細胞懸濁液に（３）で得たＤＮＡ（
好熱性アミラーゼ生産遺伝子を担ったプラスミドＤＮＡ
が含まれる）の溶解液を加えて水冷下５０分保ち、直ち
に４２°Ｃ，２分間ヒートショックを与えた。次に、こ
の細胞懸濁液の一定量を新たなＬ培地に接種し、６７℃
１時間振盪培養を行なって形質転換反応を完了させた。
好熱性アミラーゼ生産遺伝子を担ったプラスミドＤＮＡ
が含まれる）の溶解液を加えて水冷下５０分保ち、直ち
に４２°Ｃ，２分間ヒートショックを与えた。次に、こ
の細胞懸濁液の一定量を新たなＬ培地に接種し、６７℃
１時間振盪培養を行なって形質転換反応を完了させた。
培養液をアンピシリン５０μＦ！−／ｍ を含むＬ寒天
培地上に塗布し、３７°Ｃに保温した。１〜２日後、上
記培地に出現した４０００コロニーをニトロセルロース
膜にレプリカし、コロニーを上側にしてリシス・バッフ
ァー（０，０５Ｍ ）リス塩酸バッファー（ｐＨ７５）
、０．１％トリトンＸ１００，２１１ｇ／ゴリゾチーム
）に浸した濾紙上にのせて室温で６０分間保持した後。
培地上に塗布し、３７°Ｃに保温した。１〜２日後、上
記培地に出現した４０００コロニーをニトロセルロース
膜にレプリカし、コロニーを上側にしてリシス・バッフ
ァー（０，０５Ｍ ）リス塩酸バッファー（ｐＨ７５）
、０．１％トリトンＸ１００，２１１ｇ／ゴリゾチーム
）に浸した濾紙上にのせて室温で６０分間保持した後。
スターチ・プレート〔１％可溶性澱粉、１００μＰ／Ｉ
ｌ＋／クロラムフエニコール、０．０４Ｍリン酸バッフ
ァー（Ｉ）Ｈ６，０）〕上にコロニー側を下にしてのせ
、３７℃で一晩インキュベート後、ヨード液で寒天を覆
い残存スターチを赤紫色に発色させた。コロニーの周辺
が透明になっているクローンを好熱性アミラーゼ遺伝子
をもつ株として速選択した。かくして４株の好熱性アミ
ラーゼ生産株が分離された。
ｌ＋／クロラムフエニコール、０．０４Ｍリン酸バッフ
ァー（Ｉ）Ｈ６，０）〕上にコロニー側を下にしてのせ
、３７℃で一晩インキュベート後、ヨード液で寒天を覆
い残存スターチを赤紫色に発色させた。コロニーの周辺
が透明になっているクローンを好熱性アミラーゼ遺伝子
をもつ株として速選択した。かくして４株の好熱性アミ
ラーゼ生産株が分離された。
次に、これら４株の中、第１図に示した組み換えプラス
ミド（ｐＨ１３００）を有する菌株（エシェリヒア・コ
リＨＢ １ ｏ １ ／ｐＨｐＨ１３００選択し、それ
よυ同級み換えプラスミドの小型化を図った。すなわち
、ｐＨ工３００をＨｌｎｄ ■で完全に分解した後、さ
らにＢａｍＨ工で部分分解を行ない、得られた２、９×
１０３ｋｂｐのＤＮＡ フラグメントとｐＢＲ３２２と
を接続せしめ、組み換えプラスミドｐＨ工６０１を得だ
（第２図）。
ミド（ｐＨ１３００）を有する菌株（エシェリヒア・コ
リＨＢ １ ｏ １ ／ｐＨｐＨ１３００選択し、それ
よυ同級み換えプラスミドの小型化を図った。すなわち
、ｐＨ工３００をＨｌｎｄ ■で完全に分解した後、さ
らにＢａｍＨ工で部分分解を行ない、得られた２、９×
１０３ｋｂｐのＤＮＡ フラグメントとｐＢＲ３２２と
を接続せしめ、組み換えプラスミドｐＨ工６０１を得だ
（第２図）。
（５）新規好熱性アミラーゼ生産株による好熱性アミラ
ーゼの生産 （４）で得られたエシェリヒア・コリＨＢ １０１ ／
ｐＨ工！＋０１ （ＦＩＲＭ Ｐ−７００９）を用い
て好熱性アミラーゼの発酵生産を行なった。結果を第１
表に示した。
ーゼの生産 （４）で得られたエシェリヒア・コリＨＢ １０１ ／
ｐＨ工！＋０１ （ＦＩＲＭ Ｐ−７００９）を用い
て好熱性アミラーゼの発酵生産を行なった。結果を第１
表に示した。
発酵は５０μｍ／ゴのア〉ピシリンを含むＬ培地５０ｍ
／を５００１容坂ロフラスコに入れ３７°Ｃ１１８時間
培養した。次いで、細胞を遠心分離で集め０．０５ Ｍ
）リス塩酸バッファー（ｐＨ７，５）で洗滌後、５ｍ
ｌのバッファーに懸濁し、超音波処理で細胞を破壊した
。これに最終濃度１１０ｆｆ１になるようにＯａＯ４を
加え、７５°Ｃで１５分間遠心分離を行ない、その上清
を酵素液として得だ。酵素活性はＨ，Ｅ’ｕＷａの方法
の松崎変法（１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１ 。
／を５００１容坂ロフラスコに入れ３７°Ｃ１１８時間
培養した。次いで、細胞を遠心分離で集め０．０５ Ｍ
）リス塩酸バッファー（ｐＨ７，５）で洗滌後、５ｍ
ｌのバッファーに懸濁し、超音波処理で細胞を破壊した
。これに最終濃度１１０ｆｆ１になるようにＯａＯ４を
加え、７５°Ｃで１５分間遠心分離を行ない、その上清
を酵素液として得だ。酵素活性はＨ，Ｅ’ｕＷａの方法
の松崎変法（１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１ 。
５ｅｘ （１９５４））によって測定した。
一方、対照としてバチルス・ステアロサーモフィルスＤ
Ｙ−５を２０ ｆ／ｌポリペプトン＋４Ｖｌｔカゼイン
・トリプシン消化物、（ＮＺケース）。
Ｙ−５を２０ ｆ／ｌポリペプトン＋４Ｖｌｔカゼイン
・トリプシン消化物、（ＮＺケース）。
１１／を可溶性澱粉ｒ ５ ｇ−／ ｔ ＫＮＯ３から
なる培地８０ｍ１含む５００ ｍｌ容坂ロコルペンに接
種し、５５°Ｃで４８時間培養を行ない、細胞を遠心分
離で除去し上清を酵素液としてα−アミラーゼ活性を測
定した。酵素活性の表示は４０°Ｃ，１分間に基質とし
た澱粉の０．１１１ｇを消化する酵素活性を１単位とし
た。
なる培地８０ｍ１含む５００ ｍｌ容坂ロコルペンに接
種し、５５°Ｃで４８時間培養を行ない、細胞を遠心分
離で除去し上清を酵素液としてα−アミラーゼ活性を測
定した。酵素活性の表示は４０°Ｃ，１分間に基質とし
た澱粉の０．１１１ｇを消化する酵素活性を１単位とし
た。
第 １ 表
（６）好熱性アミラーゼの精製
（５）で得られた酵素液に２倍容の冷却したア七トンを
加えて蛋白を沈澱ぜしめ、５０ｍＭ）リス塩酸バッファ
ー（Ｉ）Ｈ７，５）に溶かし、同バッファーに１夜透析
した。透析内液を［セファデックスＧ−７ＳＪカラムに
通し、活性を有する両分１１１ｇを得た。その蛋白質純
度は約９５％であった。
加えて蛋白を沈澱ぜしめ、５０ｍＭ）リス塩酸バッファ
ー（Ｉ）Ｈ７，５）に溶かし、同バッファーに１夜透析
した。透析内液を［セファデックスＧ−７ＳＪカラムに
通し、活性を有する両分１１１ｇを得た。その蛋白質純
度は約９５％であった。
（７）酵素の性質
ＨＢ１０１／ｐＨ工３０１ の生産するα−アミラーゼ
はＫ。
はＫ。
ｗｅｂｅｒらの方法（：ｒ、ｎ、ａ、、 ２４４ 、４
４０６ （１９６９） ）によってポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分子量を測定した結果約７．２ ｋｂ
ｐであった。また、活性発現の最適温度は６５℃〜８５
°Ｃで、ｃａ廿存在下で８０℃、１５分間または９０°
Ｃ１１０分間処理して安定であった。この性質はバチル
ス・ステ了りサーモフィルスの生産する好熱性アミラー
ゼと同一であった。
４０６ （１９６９） ）によってポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分子量を測定した結果約７．２ ｋｂ
ｐであった。また、活性発現の最適温度は６５℃〜８５
°Ｃで、ｃａ廿存在下で８０℃、１５分間または９０°
Ｃ１１０分間処理して安定であった。この性質はバチル
ス・ステ了りサーモフィルスの生産する好熱性アミラー
ゼと同一であった。
第１図は組み換えプラスミドｐＨ１３００の制限酵素切
断地図である。第２図は組み換えプラスミドｐＨ工３０
１ の制限酵素切断地図である。 特許出願人 鵜 高 重 三 代理 人 弁理士 久保田藤部 第１図 第２図
断地図である。第２図は組み換えプラスミドｐＨ工３０
１ の制限酵素切断地図である。 特許出願人 鵜 高 重 三 代理 人 弁理士 久保田藤部 第１図 第２図
Claims (1)
- ＤＮＡ鎖中にＢａｍＨＩで切断される個所、その２．４
×１０２ｂｐ下流にＳａｌ Ｉで切断される個所、その
０．５×１０２ｂｐ下流にＰｓｔ工で切断される個所お
よびその１．４Ｘ１０３ｂｐ下流にＢａｍＨ工で切断さ
れる個所があり、２．９ Ｘ １０３ｋｂｐの分子量を
有し、好熱性アミラーゼ蛋白をコードしている遺伝子が
組み込まれているプラスミドベクターを含有するエシェ
リヒア属の微生物を培養し、培養物から好熱性アミラー
ゼを採取することを特徴とする好熱性アミラーゼの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5014883A JPS59175882A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | 好熱性アミラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5014883A JPS59175882A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | 好熱性アミラ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59175882A true JPS59175882A (ja) | 1984-10-04 |
Family
ID=12851089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5014883A Pending JPS59175882A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | 好熱性アミラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59175882A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63158074A (ja) * | 1986-12-22 | 1988-07-01 | マツダ工業株式会社 | 走り高跳び用スタンド |
-
1983
- 1983-03-25 JP JP5014883A patent/JPS59175882A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63158074A (ja) * | 1986-12-22 | 1988-07-01 | マツダ工業株式会社 | 走り高跳び用スタンド |
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