JPS62259589A - β―チロシナーゼ活性を有するＤＮＡ断片および形質転換された原核生物細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はβ−チロシナーゼ遺伝子、該遺伝子で形質転換
された原核生物細胞および該細胞を用いるし一ドーパま
たはＬ−チロシンの製造方法に関する。

〔従来の技術とその問題点〕

β−チロシナーゼはカテコール（またはフェノール）と
ピルビン酸およびアンモニアまたはアンモニウム塩から
し一ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）（ま
たはＬ−チロシン）を生成する反応を行なう酵素として
知られている。

β−チロシナーゼ・活性を有する微生物は種々知られて
おり、該微生物もしくはその処理物を用いてＩ７−ドー
パやＬ−チロシンを製造する方法も提案されている。

しかしながら、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の
取扱いが不都合であったり、目的とするＬ−−ドーパや
■、−チロシンの収率が十分でないという問題があった
。

また、従来ばβ−チロシナーゼ遺伝子を単箭した例もな
く、β−チロシナーゼ活性を有しない微生物への該活性
の付与という試みも全くなされていない。

ｒ問題点を解決するための手段〕 本発明者は、β−チロシナーゼ活性を有する微生物から
β−チロシナーゼ遺伝子を分離することに成功し、単離
した遺伝子の性質について検討し、該遺伝子をβ−チロ
シナーゼ活性を持たない微生に 物に導入するこゴ成功した。また、該遺伝子で形質転換
された微生物を用いることによってＬ　−ドーパや■、
−チロシンの製造を効率よく行なうことができることを
見出した。本発明はかかる知見により完成されたもので
ある。

本発明は第１に、β−チロシナーゼ活性を有し、塩基対
数が１．ｌｂであり、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素１！ｃ
ｏＲＴで切断される個所を含むβ−チロシナーゼ遺伝子
を提供するものである。

第２に、該遺伝子とベクターよりなる組換え体ＤＮＡに
より形質転換された原核生物細胞に関し、第３に該原核
生物細胞の存在下に、カテコールまたはフェノールをピ
ルビン酸およびアンモニアまたはアンモニウム塩と反応
させることを特徴とするＩ、−ドーパまたはＩ７−チロ
シンの製造方法に関する。

β−チロシナーゼ遺伝子は、β−チロシナーゼ活性を保
持する微生物から次のようにして調製することができる
。なお、β−チロシナーゼ活性を保持する微生物は種々
のものが知られており、たとえばＡｇｒ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　、　３６．　Ｎｌｌ］ｌ、　１８６１〜
１８６８頁（１９７２）、特公昭４７−２２２７５号公
報、同５］−５４７５号公報などに記載されている。以
下に、代表的な菌株を例示する。

エルヴイニア・ハービコラ便堕槙ｕｈｅｒｂ−崩１搬Ａ
ＴＣＣ２１４３３，同ＡＴＣＣ２１４３４，アエロバク
タ−・アエロゲネス旦９．エン９□匝蛙ゴ憇皿４タ１ｒ
１５艷号１う□へＴＣＣ２１２１４゜シュードモナス・
オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｖａｌｉｓ）Ａ
ＴＣＣ１５１７５，キサントモナス・キャンペストリス
仄り１的竺９□η、９□旦５艷５し≦−（に」−＝Ω八
へＣＣ６４２０，アクロモバクタ−・キャンディカンス
（＾ｃｈｒｏｍｏｂａｃ、ｔ、ｅｒ９閃１ｃａｎｓ）　
０ＩＩＴ　８００５　、バチルス・セレウス（、す、孕
□すｌ１ｕｓ　ｃｅｒ−明吋ＩへＭ　１０２９．エシェ
リヒア・インターメディア（Ｅｓｃ！！ｅｒ山事神１ｎ
ｔｅｒ町屯達すＡＴＣＣ２１０７３＋エシエリヒア・コ
リー（旦、傅）八ＴＣＣ１５２８９，プロテウス・ミラ
ビリス（Ｐｒｏｔｅｕユｆ□ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）八Ｔ
ＣＣまずはじめに、β−チロシナーゼ活性保持菌株から
通常の［ｌＮＡ抽出法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉｏｔ、、
　３．２０８（１４１６１））によって染色体ＤＮＡを
抽出し、制限酵素で切断して染色体ＤＮＡ断片を得る。

一方、適当なベクタープラスミドを同じ制限酵素で切断
したのち、これを上記染色体ＤＮＡと連結させる。次い
で、この組換え体ｒ］ＮＡをβ−チロシナーゼ活性を持
たない微生物、たとえば大腸菌ＪＩ８１０１株に対し通
常の方法（たとえばＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　５
３．１５９（１９７０））により形質転換する。常法に
よりクローニングを行なったのち単離した遺伝子がβ−
チロシナーゼ遺伝子であることを確認し、この遺伝子領
域の小型化を行なう。すなわち、形質転換株からプラス
ミドｌ］Ｎ＾を抽出し、制限酵素で部分分解して得たＩ
’１Ｎ１１断片のそれぞれを前述の如くベクターと連結
し、大腸菌１１８１０１株に対し形質転換を行ない、目
的とする遺伝子領域を有する株を選抜する。次いで、選
抜した菌株からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素に
よる切断を行い、β−チロシナーゼ遺伝子を得る。この
ものについて制限酵素による切断解析を行なって制限酵
素地図（第３図）を作成する。

このβ−チロシナーゼ遺伝子は、上記手法によってβ−
チロシナーゼ活性を持たない生物、特に原核生物細胞に
導入することができる。ここでβ−チロシナーゼ活性を
持たない原核生物細胞としては様々なものがあるが、特
に大腸菌が好適である。形質転換された原核生物細胞を
用い、該細胞の存在下にカテコールまたはフェノールを
ピルビン酸およびアンモニアもしくはアンモニウム塩と
反応させることによってＬ−ドーバまたは■、−チロシ
ンを効率よく製造することができる。

〔発明の効果〕

本発明によりβ−チロシナーゼ遺伝子がはじめて提供さ
れ、該遺伝子を大腸菌などのβ−チロシナーゼ活性を持
たない微生物に導入し、β−チロシナーゼ活性を付与さ
せることが可能となった。

しかも、遺伝子増幅効果によるβ−チロシナーゼ活性の
活性を高めることができる。したがって、Ｉ２−ドーパ
やＩ、−チロシンを非常に効率よく生産質を構成する芳
香族アミノ酸の１つとして知られ、様々の用途に供され
ている。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ （１）染色体ＤＮＡおよびその断片の調製β−チロシナ
ーゼ活性保持菌株として知られるエルヴイニア・ハービ
コラへＴＣＣ２１，４３４株Ｆ２００ｍ　ｌの１４３培
地中で３０℃にて２４時間振とう培養を行なった。菌体
を集菌したのち通常のｌ′ｌＮＡ抽出法（Ｊ、　Ｍｏｌ
。

Ｒｉａｌ、、　３．２０８（１９６１））により染色体
を抽出、精製して最終３．０■を得た。この染色体１］
ＮＡ　ＩｏＯμｇを制限酵素Ｒａｍ１ｌ　Ｔで切断（３
７℃、１５分間）し、染色体ｒ）Ｎへ断片を得た。

（２）　　β−チロシナーゼ遺伝子のクローン化大腸菌
において一般的に使用されるヘクタープラスミド（ｐＲ
Ｒ３２２）　　５　μｇを制限酵素口ａｍｌｌＩで切断
（３７°Ｃ１２時間）した後、ベクターの自己閉環を防
止するため、アルカリフォスファターゼ処理を行なった
。この切断したベクターｒｌＮＡ　１μｇに」二記（１
）で得た染色体１１ＮＡ断片１０μｇを混合し、ＡＴＰ
およびジチオスレイトール、　ＭｇＣｌ□存在下にＴ４
−ＤＮＡリガーゼにて４°Ｃで２４時間ｒｌＮＡ鎖の連
結反応を行なった。

この反応液を用いてコンピテントな大腸菌１（８１０１
株に対して通常の方法（、Ｌ　Ｍｏ１．旧ｏｆ、、　５
３．１５９（１９７０））により形質転換を行ない、ア
ンピシリン５０ｐｇ／ｍ１１．　　Ｔ−−チロシン２＋
ｎｇ／＋ｎｊ！含有１、Ｂプレート上にコロニーを得た
。このコロニーの中からＩ、−チロシンを分解してコロ
ニーの周辺に透明な領域（クリアーゾーン）を形成する
１株を分離した。

この菌株よりプラスミドＤＮＡを抽出（Ｎｕｃｌｅｊｃ
Ａｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７．１５１３（１９７
３））　シ、上記コンピテントな大腸菌ＪＩ８１０１株
に対して再度形質転換したところ、アンピシリン５０μ
ｇ／ｍｊ！、Ｌ−チロシン２ｗ／ｍｌ含有Ｌｌ’ｌプレ
ート上に生育したコロニーはすべてクリアーゾーン形成
株であった。

（３）　　クローン化遺伝子がβ−チロシナーゼ遺伝子
であることの確認上記（２）により得られたクリアーゾ
ーン形成株をアンピシリン５０μｇ／ｍρを含むＬＢ培
地（１０ｍ　ｊ！　）中で３０°Ｃにて１８時間培養し
た。

集菌後、カテコールｌＯｇ／　Ｒ、ピルビン酸１０ｇ／
ρ。

酢酸アンモニウム５　ｇ／　７！を含む反応液１０ｍ　
ｅ　（ｐｔ１８．０）に菌体を懸濁し、３０℃で５時間
反応させた。

反応終了液の一部をシリカゲル薄層クロマトプレート上
にスポットし、ブタノール：酢酸：水−４＝２：１の溶
媒で展開させ、ニンヒドリン溶液噴霧により発色させた
ところ、標準Ｉ、−ドーパと同一のＲｆ値（０，３７）
を示した。

このことは、少なくともエルヴイニア・ハービコラＡＴ
ＣＣ２］４３４株のβ−チロシナーゼ遺伝子を含む遺伝
子領域がベクターｐＢＲ３２２に挿入され、大腸菌中で
発現したことを意味している。

（４）　　β−チロシナーゼ遺伝子領域の小型化前記（
２）により得られたクリアーゾーン形成株が保持するプ
ラスミドｒｌＮＡ　　（ｐｓ＋　２０００と称する。）
を抽出し、制限酵素Ｓａｕ　３ＡＩで部分分解（３７℃
、５分間）した。生じたＤＮＡ断片を予めＲａｍ１ｌｌ
で切断したベクターｐＦＩＲ３２２と混合し、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結したのち、大腸菌１１１１１０
１株に対して形質転換を行なった。アンピシリン５０　
／Ｚ　ｇ／ｍ　ｊ！　。

Ｌ−チロシン２　ｍｇ／ｍ　１を含む１、Ｂプレート上
に生育し、大きなりリアーゾーンを形成する５株を選抜
した。これらの株よりプラスミドロＮへを抽出し、各種
制限酵素による切断を行なった。その結果、比較的小さ
なりＮＡ断片の連結された２種のプラスミドｐＳＴ　２
０７３およびｐｓＴ２０７４について第１図に示す制限
酵素地図を得た。

（５）　　β−チロシナーゼ遺伝子領域の限定上記（４
）で得られたプラスミドρＳｒ　２０７３より、さらに
必須部分を限定するため、該プラスミドｐｓＩ２０７３
を制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで切断（３７℃、２時間）した。

生成したＤＮＡ断片を予めＰｓｔｌで切断したｐＵＣ１
８プラスミドと混合し、Ｔ４−１１ＮＡリガーゼで連結
し、大腸菌１１１１１０１株に対し形質転換を行なった
。上記（４）と同じ１、Ｂプレート上に生育した株の中
からクリアーゾーンを形成する株を選択し、該菌株が保
持するプラスミドの制限酵素解析を行なった。その結果
、最小のＤＮＡ断片を連結したプラスミドとしてｐｓｌ
　２２Ｂ３とｐｓｌ　２２８４を得た。これらプラスミ
ドの作製法を第２図に示す。

プラスミドｐｓ１２２８３とｐｓＴ　２２８４を保持す
る菌株のクリアーゾーンの大きさはプラスミドｐｓＴ　
２０７３を保持する菌株と比較すると小さいものであっ
た。

これらの結果より、プラスミドｐｓ１２２８３．　ｐｓ
ｒ２２８４に含まれるエルヴイニア・ハービコラへＴＣ
Ｃ２１４３４株の染色体１１Ｎ八由来の断片（１，７Ｋ
ｂ）が、β−チロシナーゼ活性を発現させるためには少
なくとも必要であると云える。プラスミドｐＳＴ　２２
８３とｐｓｌ　２２８４の制限酵素地図を第３図に示す
。

実施例２ 第１表に示した菌株のそれぞれをＬ−チロシン２■７ｍ
１．Ｉ−−フェニルアラニン２曙／ｍｆｆを含むＬＢ培
地（１０＋＋＋　１　）に接種し、３０°Ｃで２０時間
培養した。

培養終了液より集菌し、生理的食塩水にて洗浄後、１０
ｍ７！の下記反応液に懸濁し、３０℃にて反応を開始し
た。

反応液組成 カテコール１０ｇ／　ｆｉ　、　　ピルビン酸１０ｇ／
　７！、酢酸ア７−Ｅ二６ム５ｇ／ｆｆｉ、　［！ＤＴ
Ａ１ｇ／ｆｆｉ、亜硫酸ソーダ２ｇ／β　（ｐＨ８，０
） ２時間後の反応液中のＬ−ドーパ住産量を高速液体クロ
マトグラフィー（日本分光型、カラム：カテコールパッ
ク）を用いて定量した。結果を第１表に示す。

大腸菌　１１８１０１　　　　　　　　　　０実施例３ 実施例２と同様に処理した菌株を用いてＬ−チロシンの
製造を行なった。なお、反応液組成中のカテコールをフ
ェノールに変えたこと以外は実施例２と同様に行なった
。結果を第２表に示す。

ｘｙｂｔｔ仁７・ハービコラ　ＡＴＣＣ２１４３４２，
７大腸菌　１１Ｂ　１０１　　　　　　　　　　　０大
腸菌　ＨＢ　１０１　（９３１２０７４保持）８．３

【図面の簡単な説明】

第１図はβ−チロシナーゼ活性を有する遺伝子ｐｓＴ２
０７３とｐｓＩ　２０７４の制限酵素地図である。 第２図はｐｓｒ　２２８３およびｐｓｉ　２２１？４の
作製法を示す説明図である。 第３図はβ−チロシナーゼ活性を有する遺伝子ｐＳＩ２
２８３およびｐｓｌ　２２８４の制限酵素地図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）β−チロシナーゼ活性を有し、塩基対数が１．７
   Ｋｂであり、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素ＥｃｏＲＩで切
   断される個所を含むβ−チロシナーゼ遺伝子。
2. （２）β−チロシナーゼ活性を有し、塩基対数が１．７
   Ｋｂであり、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素ＥｃｏＲＩで切
   断される個所を含むβ−チロシナーゼ遺伝子とベクター
   よりなる組換え体ＤＮＡにより形質転換された原核生物
   細胞。
3. （３）原核生物が大腸菌である特許請求の範囲第２項記
   載の細胞。
4. （４）大腸菌がエシエリヒア・コリＳＩ２０７４（ＦＥ
   ＲＭ　Ｐ−８７４７）である特許請求の範囲第３項記載
   の細胞。
5. （５）β−チロシナーゼ活性を有し、塩基対数が１．７
   Ｋｂであり、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素ＥｃｏＲＩで切
   断される個所を含むβ−チロシナーゼ遺伝子とベクター
   よりなる組換え体ＤＮＡにより形質転換された原核生物
   細胞の存在下に、カテコールまたはフェノールをピルビ
   ン酸およびアンモニアまたはアンモニウム塩と反応させ
   ることを特徴とするＬ−ドーパまたはＬ−チロシンの製
   造方法。
6. （６）原核生物細胞が大腸菌である特許請求の範囲第５
   項記載の方法。
7. （７）大腸菌がエシエリヒア・コリＳＩ２０７４（ＦＥ
   ＲＭ　Ｐ−８７４７）である特許請求の範囲第６項記載
   の方法。