JP2521945B2 - β−チロシナ−ゼの製造法及びβ−チロシナ−ゼ生産菌 - Google Patents
β−チロシナ−ゼの製造法及びβ−チロシナ−ゼ生産菌Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の新規形質発現方法によりβ−チロシ
ナーゼを製造する方法及び新規微生物に関与する。さら
に詳細には本発明はβ−チロシナーゼに関与する遺伝子
を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNAを用いエ
シェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム
属、バチルス属、セラチア属、キサントモナス属、アグ
ロバクテリウム属、アクロモバクター属、エアロバクタ
ー属、エルビニア属、プロテウス属、サルモナラ属、チ
トロバクター属、エンテロバクター属、コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ば
れる宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地
に培養しβ−チロシナーゼを生成蓄積せしめるβ−チロ
シナーゼの製造法及び創製した新規微生物に関する。
ナーゼを製造する方法及び新規微生物に関与する。さら
に詳細には本発明はβ−チロシナーゼに関与する遺伝子
を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNAを用いエ
シェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム
属、バチルス属、セラチア属、キサントモナス属、アグ
ロバクテリウム属、アクロモバクター属、エアロバクタ
ー属、エルビニア属、プロテウス属、サルモナラ属、チ
トロバクター属、エンテロバクター属、コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ば
れる宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地
に培養しβ−チロシナーゼを生成蓄積せしめるβ−チロ
シナーゼの製造法及び創製した新規微生物に関する。
アミノ酸は従来より飼料・食品添加剤、化粧品、医薬
などの原料として広く用いられている。
などの原料として広く用いられている。
従来醗酵によるアミノ酸生産が行われているが、醗酵
液からのアミノ酸採取コスト、アミノ酸採取後の醗酵液
の廃棄法等に問題があり、酵素を使用したアミノ酸の製
造法が注目されてきた。
液からのアミノ酸採取コスト、アミノ酸採取後の醗酵液
の廃棄法等に問題があり、酵素を使用したアミノ酸の製
造法が注目されてきた。
酵素を用いたアミノ酸の製法に、β−チロシナーゼ
（チロシンフェノールリアーゼ）を用いる方法が知られ
ている。本酵素はエシェリヒア属、シュードモナス属、
フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、キサ
ントモナス属、アグロバクテリウム属、アクロモバクタ
ー属、エアロバクター属、エルビニア属、プロテウス
属、サルモネラ属、チトロバクター属、エンテロバクタ
ー属など広範な微生物によって生産されることが知られ
ていて、酵素学的諸性質についても、「Biochem,Biopny
s Res,Commun.」33,10（1963）で明らかにされている。
本酵素を用いたアミノ酸製法としてはピルビン酸とアン
モニア、または、セリンのいずれかと、フェノールまた
はカテコールのいずれかの組み合せによるチロシン、ド
ーパの生産が知られている。さらに本酵素は一般式
（Ｉ）： （Ｚは低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、ベンジル
チオ基、チオール基、アルキルチオ基、または、−Cl）
と一般式（II）： （R1,R2,R3は水素原子、水酸基またはアセトキシ基）で
表わされる物質を縮合することが知られており、本基質
を適当に組み合せチロシン、ドーパ、及びこれら類縁体
を合成できる。
（チロシンフェノールリアーゼ）を用いる方法が知られ
ている。本酵素はエシェリヒア属、シュードモナス属、
フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、キサ
ントモナス属、アグロバクテリウム属、アクロモバクタ
ー属、エアロバクター属、エルビニア属、プロテウス
属、サルモネラ属、チトロバクター属、エンテロバクタ
ー属など広範な微生物によって生産されることが知られ
ていて、酵素学的諸性質についても、「Biochem,Biopny
s Res,Commun.」33,10（1963）で明らかにされている。
本酵素を用いたアミノ酸製法としてはピルビン酸とアン
モニア、または、セリンのいずれかと、フェノールまた
はカテコールのいずれかの組み合せによるチロシン、ド
ーパの生産が知られている。さらに本酵素は一般式
（Ｉ）： （Ｚは低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、ベンジル
チオ基、チオール基、アルキルチオ基、または、−Cl）
と一般式（II）： （R1,R2,R3は水素原子、水酸基またはアセトキシ基）で
表わされる物質を縮合することが知られており、本基質
を適当に組み合せチロシン、ドーパ、及びこれら類縁体
を合成できる。
従来より知られているβ−チロシナーゼの生産法はい
ずれも酵素生産量が十分でなく、酵素代が高く酵素の生
産にチロシンを必要とし、チロシン以外のアミノ酸を生
産する場合、混入チロシンを除去するために煩雑な操作
を必要とするなどの欠点を有していた。
ずれも酵素生産量が十分でなく、酵素代が高く酵素の生
産にチロシンを必要とし、チロシン以外のアミノ酸を生
産する場合、混入チロシンを除去するために煩雑な操作
を必要とするなどの欠点を有していた。
本発明はこのような問題点を解決すべく酵素の生産性
が高い微生物を創製するとともに、このようにして得ら
れた微生物を使用し、β−チロシナーゼを効率よく生産
することを目的として行われた。また目的の酵素の遺伝
子またはベクターを含む組み換え体DNAを導入して該目
的遺伝子の形質を発現させた例は今まで全く知られてい
ない。
が高い微生物を創製するとともに、このようにして得ら
れた微生物を使用し、β−チロシナーゼを効率よく生産
することを目的として行われた。また目的の酵素の遺伝
子またはベクターを含む組み換え体DNAを導入して該目
的遺伝子の形質を発現させた例は今まで全く知られてい
ない。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明はβ−チロシナーゼに関与する遺伝子を含むDN
A断片とベクターDNAとの組換え体DNAを用いエシェリヒ
ア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチ
ルス属、セラチア属、キサントモナス属、アグロバクテ
リウム属、アクロモバクター属、エアロバクター属、エ
ルビニア属、プロテウス属、サルモネラ属、チトロバク
ター属、エンテロバクター属、コリネバクテリウム属、
ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿主
菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養
し、β−チロシナーゼを製造する方法を提供する。
A断片とベクターDNAとの組換え体DNAを用いエシェリヒ
ア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチ
ルス属、セラチア属、キサントモナス属、アグロバクテ
リウム属、アクロモバクター属、エアロバクター属、エ
ルビニア属、プロテウス属、サルモネラ属、チトロバク
ター属、エンテロバクター属、コリネバクテリウム属、
ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿主
菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養
し、β−チロシナーゼを製造する方法を提供する。
本発明に用いる遺伝子を含むDNA断片は、エシェリヒ
ア・フロインディに由来し、β−チロシナーゼの生成に
係る遺伝子を含むDNA断片である。
ア・フロインディに由来し、β−チロシナーゼの生成に
係る遺伝子を含むDNA断片である。
本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞内で自
律増殖できるものであればいずれのベクターでもかまわ
ない。また酵素の生産量を上昇させるために強力な構造
プロモーターをもつように改質したベクターなどを使用
することもできる。
律増殖できるものであればいずれのベクターでもかまわ
ない。また酵素の生産量を上昇させるために強力な構造
プロモーターをもつように改質したベクターなどを使用
することもできる。
遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組み換え体の
作製は、公知の試験管内組み換えDNA技法を駆使するこ
とにより実施できる。
作製は、公知の試験管内組み換えDNA技法を駆使するこ
とにより実施できる。
試験管内のDNA組み換えは、通常、目的の遺伝子を含
む供与体DNAとベクターDNAの切断と結合（リガーゼ反
応）により行われる（特願昭56−211908号、USP4,237,2
24参照）。
む供与体DNAとベクターDNAの切断と結合（リガーゼ反
応）により行われる（特願昭56−211908号、USP4,237,2
24参照）。
リガーゼ反応により目的の組み換え体以外に他の組み
換え体も生成するが、目的の組み換え体を取得するには
このDNA混成液を用いてエシェリヒア属、シュードモナ
ス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア
属、キサントモナス属、アグロバクテリウム属、アクロ
モバクター属、エアロバクター属、エルビニア属、プロ
テウス属、サルモネラ属、チトロバクター属、エンテロ
バクター属、コリネバクテリウム属、ブロビバクテリウ
ム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に
由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選択分離
し、その培養菌体から抽出単離することによって達成で
きる。
換え体も生成するが、目的の組み換え体を取得するには
このDNA混成液を用いてエシェリヒア属、シュードモナ
ス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア
属、キサントモナス属、アグロバクテリウム属、アクロ
モバクター属、エアロバクター属、エルビニア属、プロ
テウス属、サルモネラ属、チトロバクター属、エンテロ
バクター属、コリネバクテリウム属、ブロビバクテリウ
ム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に
由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選択分離
し、その培養菌体から抽出単離することによって達成で
きる。
前記属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよ
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を一
旦クローン化し、しかる後に適当なベクターとの組み換
え体を試験管内で作製してから前記属菌種を形質転換し
前記と同様に形質転換株を選択分離しても組み換え体を
取得できる。
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を一
旦クローン化し、しかる後に適当なベクターとの組み換
え体を試験管内で作製してから前記属菌種を形質転換し
前記と同様に形質転換株を選択分離しても組み換え体を
取得できる。
組み換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用
できる。
できる。
S.N.Cohen.et al.U.S.Patent 4,237,224、遺伝子操作
実験法〔高木康敬編著、講談社サイエンティフィック
（1980）〕、Method in Enzymology68,Recombinant DN
A,edited by Ray Mu,Academic Press 1979.特願昭56−2
11908。
実験法〔高木康敬編著、講談社サイエンティフィック
（1980）〕、Method in Enzymology68,Recombinant DN
A,edited by Ray Mu,Academic Press 1979.特願昭56−2
11908。
形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導
入した組み換え体DNAの形質を発現させることができ
る。組み換え体DNAに遺伝子DNAまたはベクターDNA由来
の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて培
地に薬剤を補ってもかまわない。
入した組み換え体DNAの形質を発現させることができ
る。組み換え体DNAに遺伝子DNAまたはベクターDNA由来
の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて培
地に薬剤を補ってもかまわない。
このようにして得られた形質転換株を酵素源として得
るのには、通常の培地を用いて培養を行えばよいが必要
に応じてチロシン・IPTG IAAなどの添加、温度上昇等酵
素誘導のための処理を行うこともできる。
るのには、通常の培地を用いて培養を行えばよいが必要
に応じてチロシン・IPTG IAAなどの添加、温度上昇等酵
素誘導のための処理を行うこともできる。
本微生物の培養のために用いられる培地は通常炭素
源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地である。
更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。
源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地である。
更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。
炭素源としては、グルコース、シュクロース等の炭水
化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使
用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオ
ンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイ
オン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。
化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使
用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオ
ンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイ
オン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。
培養は好気的条件下にpH4ないし９、温度20ないし45
℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10日培養を行えば
望ましい結果が得られる。
℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10日培養を行えば
望ましい結果が得られる。
菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、培養液
より分離された菌体、洗浄された菌体などいずれも使用
可能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体、トルエン、界面活性剤等と接触せしめた菌
体、リゾチームで処理した菌体、超音波にさらした菌
体、機械的に摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物
から得られたβ−チロシナーゼ活性を有する酵素蛋白区
分、更には、これらの菌体の固定化物、菌体処理物の不
溶化物、その他いずれも酵素源として使用できる。
より分離された菌体、洗浄された菌体などいずれも使用
可能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体、トルエン、界面活性剤等と接触せしめた菌
体、リゾチームで処理した菌体、超音波にさらした菌
体、機械的に摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物
から得られたβ−チロシナーゼ活性を有する酵素蛋白区
分、更には、これらの菌体の固定化物、菌体処理物の不
溶化物、その他いずれも酵素源として使用できる。
このように得られたβ−チロシナーゼは従来より知ら
れているチロシン、ドーパ、及びこれら化合物の類縁体
の合成及び分解に使用することができる。すなわちピル
ビン酸とアンモニア、または、セリンのいずれかとフェ
ノールまたはカテコールのいずれかの組み合せに本酵素
を作用させチロシン、ドーパを合成することができ、さ
らに、本酵素は一般式（Ｉ）： （Ｚは低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、ベンジル
チオ基、チオール基、アルキルチオ基、または、−Cl）
と一般式（II）： （R1,R2,R3は水素原子、水酸基またはアセトキシ基）で
表わされる物質の適当な組み合せに作用し、チロシン、
ドーパ、及びこれら類縁体を合成できる。また、β−チ
ロシナーゼを反応に関与させる方法は菌体もしくは菌体
処理物を水溶性媒体中で基質と共存させてもよいし、菌
体の培養時に基質を添加し反応させてもよい。
れているチロシン、ドーパ、及びこれら化合物の類縁体
の合成及び分解に使用することができる。すなわちピル
ビン酸とアンモニア、または、セリンのいずれかとフェ
ノールまたはカテコールのいずれかの組み合せに本酵素
を作用させチロシン、ドーパを合成することができ、さ
らに、本酵素は一般式（Ｉ）： （Ｚは低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、ベンジル
チオ基、チオール基、アルキルチオ基、または、−Cl）
と一般式（II）： （R1,R2,R3は水素原子、水酸基またはアセトキシ基）で
表わされる物質の適当な組み合せに作用し、チロシン、
ドーパ、及びこれら類縁体を合成できる。また、β−チ
ロシナーゼを反応に関与させる方法は菌体もしくは菌体
処理物を水溶性媒体中で基質と共存させてもよいし、菌
体の培養時に基質を添加し反応させてもよい。
なお水溶性媒体としては、水、バッファーおよびエタ
ノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。更に必要
に応じて、微生物の生育に必要な栄養素、抗酸化剤、界
面活性剤、補酵素、および金属イオン等を水性媒体に添
加することもできる。また、本酵素の逆反応を利用し、
チロシン、ドーパ及びこれら類縁体を選択的に分解除去
することもできる。
ノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。更に必要
に応じて、微生物の生育に必要な栄養素、抗酸化剤、界
面活性剤、補酵素、および金属イオン等を水性媒体に添
加することもできる。また、本酵素の逆反応を利用し、
チロシン、ドーパ及びこれら類縁体を選択的に分解除去
することもできる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ エシェリヒア・フロインディAJ2608（FERM−P9232）由
来のβ−チロシナーゼ遺伝子のクローン化 （１） エシェリヒア・フロインディAJ2608（FERM−P9
232）の全DNAの抽出； 400mlのＬ−Broth（Peptone10g/、Yeastextract5g/
、NaCl5g/ pH7.0）にエシェリヒア・フロインディA
J2608（FERM−P 9232）を培養し、対数増殖期の菌体１
〜2gを得た。これに6mlのTESS buffer（30mM Tris、5mM
EDTA50mM NaCl25％（w/v）Sucrose pH8.0）を加えよく
懸濁した。これにLysozymeを5mg/mlになるようにTESS b
ufferに溶かした溶液を2ml添加し、37℃で１時間放置し
た。さらにプロナーゼＥをTESS bufferで5mg/mlの溶液
にしたものを1ml加え37℃１時間放置した。10％のSDS溶
液を1ml加えよくかくはんした後に等容の水飽和フェノ
ールを加えかくはん後静置し、下層を別容器にうつし
た。再び等容の水飽和フェノールを加え同様の操作を行
い、下層の溶液にエタノールを等容加え、ゆるやかに混
合した。この操作によってDNAが析出したのでこれを別
容器にとり、TEbuffer（10mM Tris 1mM EDTA pH8.0）で
透析した。これら操作によってエシェリヒア・フロイン
ディAJ2608（FERM−P9232）の全DNAが得られた。
来のβ−チロシナーゼ遺伝子のクローン化 （１） エシェリヒア・フロインディAJ2608（FERM−P9
232）の全DNAの抽出； 400mlのＬ−Broth（Peptone10g/、Yeastextract5g/
、NaCl5g/ pH7.0）にエシェリヒア・フロインディA
J2608（FERM−P 9232）を培養し、対数増殖期の菌体１
〜2gを得た。これに6mlのTESS buffer（30mM Tris、5mM
EDTA50mM NaCl25％（w/v）Sucrose pH8.0）を加えよく
懸濁した。これにLysozymeを5mg/mlになるようにTESS b
ufferに溶かした溶液を2ml添加し、37℃で１時間放置し
た。さらにプロナーゼＥをTESS bufferで5mg/mlの溶液
にしたものを1ml加え37℃１時間放置した。10％のSDS溶
液を1ml加えよくかくはんした後に等容の水飽和フェノ
ールを加えかくはん後静置し、下層を別容器にうつし
た。再び等容の水飽和フェノールを加え同様の操作を行
い、下層の溶液にエタノールを等容加え、ゆるやかに混
合した。この操作によってDNAが析出したのでこれを別
容器にとり、TEbuffer（10mM Tris 1mM EDTA pH8.0）で
透析した。これら操作によってエシェリヒア・フロイン
ディAJ2608（FERM−P9232）の全DNAが得られた。
（２） 組み換え体の創製 （１）の方法によって得られたエシェリヒア・フロイ
ンディの全DNA10μｇに制限酵素Sau 3AIを0.01U/μg DN
Aになるように添加し、37℃１時間反応を行い全DNAを部
分分解した。一方、別にプラスミドpUC18を制限酵素Bam
HIで切断したものを用意し、この両者を常法により結合
させ多様のプラスミドを含む混成液を得た。
ンディの全DNA10μｇに制限酵素Sau 3AIを0.01U/μg DN
Aになるように添加し、37℃１時間反応を行い全DNAを部
分分解した。一方、別にプラスミドpUC18を制限酵素Bam
HIで切断したものを用意し、この両者を常法により結合
させ多様のプラスミドを含む混成液を得た。
（３） 目的遺伝子を含むプラスミドの選出 上記プラスミド混液を用い、常法によりエシェリヒア
・コリJM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシ
リン耐性を選択マーカーとして選別し、目的酵素の活性
を測定した。活性測定は形質転換株をＬ−Brothで37℃1
6時間培養した後に1mlの培養液に２％フェノール、４％
セリン、１％塩化アンモニウム0.2％EDTA0.4％亜硫酸ナ
トリウム（pH8.0）溶液を1ml加え、30℃で反応させ継時
的に生成するＬ−Tyrをアミノ酸アナライザーで定量し
た。
・コリJM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシ
リン耐性を選択マーカーとして選別し、目的酵素の活性
を測定した。活性測定は形質転換株をＬ−Brothで37℃1
6時間培養した後に1mlの培養液に２％フェノール、４％
セリン、１％塩化アンモニウム0.2％EDTA0.4％亜硫酸ナ
トリウム（pH8.0）溶液を1ml加え、30℃で反応させ継時
的に生成するＬ−Tyrをアミノ酸アナライザーで定量し
た。
以上の操作で目的遺伝子をもつプラスミドが得られ
た。この形質転換株を用い、プラスミドを大量調製し、
マッピングしたところ第１図に示す構造を有していた。
た。この形質転換株を用い、プラスミドを大量調製し、
マッピングしたところ第１図に示す構造を有していた。
実施例２ 実施例１で得られたプラスミドpBT4を用い常法に従い
エシェリヒア・コリJM109株を形質転換した（エシェリ
ヒア・コリJM109 pBT4 AJ12307（FERM−P9231））。こ
の株をアンピシリン50μg/ml IPTG20μg/mlを含むＬ−B
rothで37℃16h培養した。この培養液5mlを遠心し、菌体
を集菌し、50mMKPB（リン酸バッファー）（pH8.0）で２
回洗浄した後に2.5mlの50mM KPB（pH8.0）を加え氷冷
中、遠音波破砕した。これに２％フェノール、４％セリ
ン、１％塩化アンモニウム、0.2％EDTA、0.4％亜硫酸ナ
トリウム（pH8.0）からなる基質溶液を2.5mlを加え、30
℃で20時間反応を行った。この結果88mgのチロシンが生
成した。定量はアミノ酸アナライザーを使用した。
エシェリヒア・コリJM109株を形質転換した（エシェリ
ヒア・コリJM109 pBT4 AJ12307（FERM−P9231））。こ
の株をアンピシリン50μg/ml IPTG20μg/mlを含むＬ−B
rothで37℃16h培養した。この培養液5mlを遠心し、菌体
を集菌し、50mMKPB（リン酸バッファー）（pH8.0）で２
回洗浄した後に2.5mlの50mM KPB（pH8.0）を加え氷冷
中、遠音波破砕した。これに２％フェノール、４％セリ
ン、１％塩化アンモニウム、0.2％EDTA、0.4％亜硫酸ナ
トリウム（pH8.0）からなる基質溶液を2.5mlを加え、30
℃で20時間反応を行った。この結果88mgのチロシンが生
成した。定量はアミノ酸アナライザーを使用した。
実施例３ エシェリヒア・コリJM109/pBT4 AJ1230/（FERM−P923
1）を実施例２のごとく培養し、培養液500mlを得た。こ
れを実施例２同様に集菌洗浄した後に250mlの50mM KPB
（pH8.0）を加え超音波破砕した。この溶液2.5mlに実施
例２の、フェノール及びフェノールの代わりにカテコー
ル、1,2−ジアセトキシベンゼン、1,3−ジヒドロキシベ
ンゼン、1,2,3−トリヒドロキシベンゼンを、そしてセ
リン及びセリンの代わりにピルビン酸とアンモニア、Ｏ
−メチル−セリン、Ｏ−エチル−セリン、Ｏ−プロピル
−セリン、Ｏ−ブチル−セリン、Ｏ−ベンジル−セリ
ン、システィン、Ｓ−メチル−システイン、Ｓ−エチル
−システイン、Ｓ−ベンジル−システイン、β−クロロ
−アラニンを用いた基質溶液2.5mlを加え、20℃で３日
間反応させた。この結果を表１に示した。
1）を実施例２のごとく培養し、培養液500mlを得た。こ
れを実施例２同様に集菌洗浄した後に250mlの50mM KPB
（pH8.0）を加え超音波破砕した。この溶液2.5mlに実施
例２の、フェノール及びフェノールの代わりにカテコー
ル、1,2−ジアセトキシベンゼン、1,3−ジヒドロキシベ
ンゼン、1,2,3−トリヒドロキシベンゼンを、そしてセ
リン及びセリンの代わりにピルビン酸とアンモニア、Ｏ
−メチル−セリン、Ｏ−エチル−セリン、Ｏ−プロピル
−セリン、Ｏ−ブチル−セリン、Ｏ−ベンジル−セリ
ン、システィン、Ｓ−メチル−システイン、Ｓ−エチル
−システイン、Ｓ−ベンジル−システイン、β−クロロ
−アラニンを用いた基質溶液2.5mlを加え、20℃で３日
間反応させた。この結果を表１に示した。
実施例４ 実施例２と同様に培養したエシェリヒア・コリJM109
PBT4 AJ12307（FERM−P9231）1gを脱イオン水4mlに加え
て懸濁し、氷冷したのちアクリルアミド50mgとメチレン
ビスアクリルアミド45mgを加えて溶解させ、窒素ガスを
通じて酸素を追い出した後、過硫酸アンモニウム3.5mg
およびN,N′−ジメチルアミノプロピオニトリル８μ
を加えて氷冷下に静置した。１時間後、生成した菌体含
有ゲルを50メッシュの金網で裏ごしし、生理食塩水で洗
浄し、ゲル固定化物を調製した。この固定化物2gを10ml
の１％フェノール、２％セリン、0.5％塩化アンモニウ
ム、0.1％EDTA、0.2％亜硫酸ナトリウム（pH8.0）から
なる基質溶液に添加し、30℃で48時間反応した。このと
き生成したＬ−チロシンは1.7g/dlであった。
PBT4 AJ12307（FERM−P9231）1gを脱イオン水4mlに加え
て懸濁し、氷冷したのちアクリルアミド50mgとメチレン
ビスアクリルアミド45mgを加えて溶解させ、窒素ガスを
通じて酸素を追い出した後、過硫酸アンモニウム3.5mg
およびN,N′−ジメチルアミノプロピオニトリル８μ
を加えて氷冷下に静置した。１時間後、生成した菌体含
有ゲルを50メッシュの金網で裏ごしし、生理食塩水で洗
浄し、ゲル固定化物を調製した。この固定化物2gを10ml
の１％フェノール、２％セリン、0.5％塩化アンモニウ
ム、0.1％EDTA、0.2％亜硫酸ナトリウム（pH8.0）から
なる基質溶液に添加し、30℃で48時間反応した。このと
き生成したＬ−チロシンは1.7g/dlであった。
第１図はβ−チロシナーゼ遺伝子をもつプラスミドpBT4
の制限酵素地図。
の制限酵素地図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/88 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/88 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:425） Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｎ 9/88 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/88 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/88 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:425） Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:31） Ｃ１２Ｒ 1:31） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (3)
- 【請求項１】下記の制限酵素地図で示されるプラスミド
pBT4上に存在するエシェリヒア・フロインディ由来のβ
−チロシナーゼ遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの
組換え体DNAを用いエシェリヒア属、シュードモナス
層、バチルス層、セラチア属、アグロバクテリウム属、
コリネバクテリウム属またはブロビバクテリウム属に属
する微生物から選ばれる宿主菌体を形質転換して得られ
る形質転換株を培地に培養し、培養物もしくは培地中に
β−チロシナーゼを生成蓄積せしめることを特徴とする
β−チロシナーゼの製造法。 - 【請求項２】下記の制限酵素地図で示されるプラスミド
pBT4上に存在するエシェリヒア・フロインディ由来のβ
−チロシナーゼ遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの
組換え体DNAを含む微生物。 - 【請求項３】該組換え体DNAを含む微生物が、エシェリ
ヒア属、シュードモナス属、バチルス属、セラチア属、
アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる微生物
であることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の微
生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62054335A JP2521945B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | β−チロシナ−ゼの製造法及びβ−チロシナ−ゼ生産菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62054335A JP2521945B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | β−チロシナ−ゼの製造法及びβ−チロシナ−ゼ生産菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63222682A JPS63222682A (ja) | 1988-09-16 |
| JP2521945B2 true JP2521945B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=12967731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62054335A Expired - Lifetime JP2521945B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | β−チロシナ−ゼの製造法及びβ−チロシナ−ゼ生産菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2521945B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990004031A1 (en) * | 1988-10-06 | 1990-04-19 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Gene coding for tyrosine phenol-lyase and its utilization |
| JP2754689B2 (ja) * | 1989-03-28 | 1998-05-20 | 東レ株式会社 | トリプトファナーゼ生産能を有する形質転換体およびｌ―トリプトファンの製造法 |
| CN103097530B (zh) * | 2010-09-08 | 2016-11-09 | 绿色苯酚开发株式会社 | 棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62259589A (ja) * | 1986-05-02 | 1987-11-11 | Idemitsu Kosan Co Ltd | β―チロシナーゼ活性を有するＤＮＡ断片および形質転換された原核生物細胞 |
-
1987
- 1987-03-10 JP JP62054335A patent/JP2521945B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62259589A (ja) * | 1986-05-02 | 1987-11-11 | Idemitsu Kosan Co Ltd | β―チロシナーゼ活性を有するＤＮＡ断片および形質転換された原核生物細胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63222682A (ja) | 1988-09-16 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |