JP2679031B2 - アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌 - Google Patents

アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌

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    • C12N9/78Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の新規形質発現方法によりアミノ酸を
製造する方法及び新規微生物に関与する。さらに詳細に
は本発明はN−カルバミルアミノ酸に作用し対応するア
ミノ酸に変換する酵素に関与する遺伝子を含むDNA断片
とベクターDNAとの組換え体DNAを用いエシェリヒア属、
シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス
属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテ
リウム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転
換して得られる形質転換株を培地に培養し培養物とN−
カルバミルアミノ酸を水性媒体中で保温し対応するアミ
ノ酸を生成蓄積せしめ、アミノ酸を採取することを特徴
とするアミノ酸の製造法及び創製した新規微生物に関す
る。 〔産業上の利用分野〕 アミノ酸は従来より飼料・食品添加剤、化粧品、医薬
などの原料として広く用いられている。 〔従来の技術〕 従来、醗酵によるアミノ酸生産が行われているが、醗
酵液からのアミノ酸採取コスト、アミノ酸採取後の醗酵
液の廃棄法等に問題があり、酵素を使用したアミノ酸の
製造法が注目されてきた。 酵素を用いたアミノ酸の製法には化学的に安価に合成
されるヒダントイン化合物類を出発物質としてこれを光
学活性なアミノ酸にまで不斉水解する方法が知られてい
る。この反応は中間体として、N−カルバミルアミノ酸
を経由し、このN−カルバミルアミノ酸を水解する過程
を含んでいる。この過程を触媒する酵素にはフラボバク
テリウム属、シュードモナス属、バチルス属に属する微
生物起源のそれが知られていて、アミノ酸生産にはこれ
らの微生物を培養した培養物とN−カルバミルアミノ酸
を水性媒体中で保温し、生成蓄積するアミノ酸を採取す
る方法があった。 〔本発明が解決しようとする問題点〕 このN−カルバミルアミノ酸を対応するアミノ酸に変
換する酵素の供給源としてはフラボバクテリウム属、シ
ュードモナス属、バチルス属に属する細菌が知られてい
るが、いずれも酵素生産量が十分でなく、酵素の生産に
高価なヒダントイン化合物類またはN−カルバミルアミ
ノ酸類が必要である、などの欠点を有していた。 〔問題点を解決しようとする手段〕 本発明はこのような問題点を解決すべく酵素の生産性
が高い微生物を創製するとともに、このようにして得ら
れた酵素源を使用し、アミノ酸を効率よく生産すること
を目的として行われた。また目的の酵素の遺伝子または
ベクターを含む組み換え体DNAを導入して該目的遺伝式
の形質を発現させた例は今まで全く知られていない。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明はN−カルバミルアミノ酸に作用し対応するア
ミノ酸に変換する酵素に関与する遺伝子を含むDNA断片
とベクターDNAとの組換え体DNAを用いエシェリヒア属、
シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス
属、セラチア属、コリネバチルス属、ブレビバチルス属
に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得
られる形質転換株を培地に培養し、培養物とN−カルバ
ミルアミノ酸を水性媒体中で保温させ対応するアミノ酸
を製造する方法を提供する。 本発明に用いる遺伝子を含むDNA断片としては、真核
生物、原核生物、ウイルス、バクテリオファージまたは
プラスミドに由来しN−カルバミルアミノ酸に作用し、
対応するアミノ酸を生成する酵素に関与する遺伝子を含
むDNA断片があげられる。原核生物に由来する遺伝子と
しては細菌とくにフラボバクテリウム属、シュードモナ
ス属およびバチルス属に属する細菌の菌株に由来する遺
伝子で、N−カルバミルアミノ酸に作用し対応するアミ
ノ酸を生成する酵素の生成に係る遺伝子が好適にあげら
れる。 本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞内で自
律増殖できるものであればいずれのベクターでもかまわ
ない。また酵素の生産量を上昇させるために強力な構造
プロモーターをもつように改質したベクターなどを使用
することもできる。 遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組み換え体の
作製は、公知の試験官内組み換えDNA技法を駆使するこ
とにより実施できる。 試験官内のDNA組み換えは、通常、目的の遺伝子を含
む供与体DNAとベクターDNAの切断と結合(リガーゼ反
応)により行われる(特願昭56−211908号、USP4,237,2
24参照)。 リガーゼ反応により目的の組み換え体以外に他の組み
換え体も生成するが、目的の組み換え体を取得するには
このDNA混成液を用いてエシェリヒア属、シュードモナ
ス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア
属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属菌種
を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に由来する
遺伝形質を付与された形質転換株を選択分離し、その培
養菌体から抽出単離することによって達成できる。 前記属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよ
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を一
旦クローン化し、しかる後に適当なベクターとの組み換
え体を試験官内で作製してから前記属菌種を形質転換し
前記と同様に形質転換株を選択分離しても組み換え体を
取得できる。 組み換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用
できる。 S.N.Cohen.et al.U.S.Patent 4,237,224、遺伝子操
作実験法〔高木康敬編著、講談社サイエンティフィック
(1980)〕、Method in Enzymology 68,Recombinant
DNA,edited by Ray Mu,Academic Press 1979.特
願昭56−211908。 形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導
入した組み換え体DNAの形質を発現させることができ
る。組み換え体DNAに遺伝子DNAまたはベクターDNA由来
の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて培
地に薬剤を補ってもかまわない。 このようにして得られた形質転換株を酵素源として得
るのには、通常の培地を用いて培養を行えばよいが必要
に応じてヒダントイン化合物・N−カルバミルアミノ酸
・IPTGなどの添加、温度上昇等酵素誘導のための処理を
行うこともできる。 本微生物の培養のために用いられる培地は通常炭素
源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地である。
更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シュクロース等の炭水
化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使
用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニア塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイオ
ン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下にpH4ないし8、温度25ないし45
℃の適当な範囲に制御しつつ1ないし10日培養を行えば
望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、培養液
より分離された菌体、洗浄された菌体などいずれも使用
可能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体、トルエン、界面活性剤等と接触せしめた菌
体、リゾチームで処理した菌体、超音波にさらした菌
体、機械的に摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物
から得られたN−カルバミルアミノ酸を対応するアミノ
酸に変換する酵素活性を有する酵素蛋白画分、更には、
これらの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、その
他のいずれも使用できる。 水溶性媒体としては、水、バッファーおよびエタノー
ル等の有機溶媒を含むものが使用できる。更に必要に応
じて、微生物の生育に必要な栄養素、抗酸化剤、界面活
性剤、補酵素、ヒドロキシルアミンおよび金属イオン等
を水性媒体に添加することもできる。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しながら、菌
体とN−カルバミルアミノ酸を接触せしめて作用せしめ
る場合には、N−カルバミルアミノ酸を含み、かつ微生
物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄
養素を含む水性媒体が用いられる。更にビタミン、アミ
ノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得
られる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シュクロース等の炭水
化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使
用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオ
ンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイ
オン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養に好気的条件下に、pH4ないし8、温度25ないし4
5℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結果が得
られる。 かくして1ないし10日間も培養を行えば、N−カルバ
ミルアミノ酸はアミノ酸のみに効率よく変換される。 これに対し、上記微生物の培養液のそのまま、培養菌
体あるいは菌体処理物をN−カルバミルアミノ酸と接触
せしめて作用せしめる場合には、N−カルバミルアミノ
酸と培養液、培養菌体あるいは菌体処理物を溶解または
懸濁した水性媒体を10℃ないし70℃の適当な温度に調節
しpHを4ないし9.5に保ちつつ、暫時静置または撹拌す
ればよい。かくして5ないし100時間も経過すれば水性
媒体中に多量のアミノ酸が生成蓄積される。また、N−
カルバミルアミノ酸は反応の進行に伴って分割添加して
もよい。 尚N−カルバミルアミノ酸は2つの光学異性体を含む
が本酵素の光学特異性を利用し、未変換で残った一方の
光学異性体を常法でアミノ酸に変換することによりL体
D体のアミノ酸を別々に取得することも可能である。 生成したアミノ酸は、公知の分離方法により分離精製
する事ができる。生成したアミノ酸はアミノ酸アナライ
ザーを用いて測定した。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例1 フラゴバクテリウム・アミノゲネスAJ3912(FERMP−3
133)由来のN−カルバミルアミノ酸の対応するアミノ
酸への変換に関与する遺伝子のクローン化 (1) フラボバクテリウム・アミノゲネスAJ3912(FE
RMP−3133)の全DNAの抽出; 400mlのL−Broth(Peptone10g/、Yeast extract 5
g/、NaCl 5g/pH7.0)にフラボバクテリウム・アミ
ノゲネスAJ3912(FERMP−3133)を培養し、対数増殖期
の菌体1〜2gを得た。これに6mlのTESS buffer(30mM T
ris、5mM EDTA50mM NaCl 25%(w/v)Sucrose pH80)を
加えよく懸濁した。これにLysozymeを5mg/mlになるよう
にTESS bufferに溶かした溶液を2ml添加し、37℃で1時
間放置した。さらにプロナーゼEをTESS bufferで5mg/m
lの溶液にしたものを1ml加え37℃1時間放置した。10%
のSDS溶液を1ml加えよくかくはんした後に等容の水飽和
フェノールを加えかくはん後静置し、下層を別容器にう
つした。再び等容の水飽和フェノールを加え同様の操作
を行い、下層の溶液にエタノールを等容加え、ゆるやか
に混合した。この操作によってDNAが折出したのでこれ
を別容器にとり、TE buffer(10mM Tris 1mM EDTA pH
8.0)で透析した。これら操作によってフラボバクテリ
ウム・アミノゲネスAJ 3912(FERMP−3133)の全DNAが
得られた。 (2)組み換え体の創製 (1)の方法によって得られたフラボバクテリウム・
アミノゲネスの全DNA10μgに制限酵素Sau3AIを0.01U/
μgDNAになるように添加し、37℃1時間反応を行い全DN
Aを部分分解した。一方、別にプラスミドpUC18を制限酵
素BamHIで切断したものを用意し、この両者を常法によ
り結合させ多種のプラスミドを含む混成液を得た。 (3) 目的遺伝子を含むプラスミドの選出 上記プラスミド混液を用い、常法によりエシェリヒア
・コリC600株を形質転換した。形質転換株をアンピシリ
ン耐性を選択マーカーとして、選別し、目的酵素の活性
を測定した。活性測定は形質転換株をL−Brothで37℃1
6時間培養した後に1mlの培養液に20g/のN−カルバミ
ル−L−phe溶液(100mM KPB(pH7.5))(リン酸バッ
ファー)を1ml加え、37℃で反応させ継時的に生成する
L−pheをアミノ酸アナライザーで定量した。 以上の操作で目的遺伝子をもつプラスミドが得られ
た。この形質転換株を用い、プラスミドを大量調整し、
マッピングしたところ第1図に示す構造を有していた。 実施例2 実施例1で得られたプラスミドpUC18HA3を用い常法に
従いエシェリヒア・コリJM109株を形質転換した(エシ
ェリヒ・コリJM109 HA3AJ12297(FERMP−8813))。こ
の株をアンピシリン50μg/ml IPTG 20μg/mlを含むL−
Brothで37℃ 16h培養した。この培養液5mlを遠心し、菌
体を集菌し、50mMKPB(リン酸バッファー)(pH7.5)で
2回洗浄した後には2.5mlの50mMKPB(pH7.5)を加え水
冷中、遠音波破砕した。これに最終濃度10Mmになるよう
に表1に示すN−カルバミルアミノ酸を添加し全量を50
mMKPB(pH7.5)で5mlにし、30℃で1時間反応を行っ
た。この結果を表1に示す。尚定量は光学分割カラムを
使用した。 実施例3 エシェリヒア・コリJM109 HA3AJ12297(FERMP−883
1)を実施例2のごとく培養し、培養液500mlを得た。こ
れを実施例2同様に集菌洗浄した後に25mlの50mMKPB(p
H7.6)を加え超音波破砕した。この溶液にN−カルバミ
ル−DL−Pheを反応溶液中の最終濃度が20g/になるよ
うに添加し50mMKBP(pH7.5)で全量を50mlにした。これ
を30℃48時間反応させた後に反応液をpH6.0に適当な酸
を用い調製した。この溶液を遠心し上清をDiaion SK−1
Bカラムに流した。非吸着画分を2等分し、一方を適当
な酸を用いpH2.5にしたところN−カルバミル−D−Phe
が0.23g結晶として得られた。もたもう一方の非吸着画
分に塩酸を最終1Nになるように加え氷冷下亜硝酸を1.2m
mol加え氷冷下1晩放置した。これを常法により晶析し
たところD−Pheが0.18g(光学純度96%)得られた。ま
た吸着画分を2〜4Nのアンモニア水を溶出しアンモニア
水を減圧除去した後常法により晶析したところL−Phe
が0.4g(光学純度98%)得られた。 実施例4 実施例2と同様に培養したエシェリヒア・コリJM109
HA3AJ12297(FERMP−8831)1gを脱イオン水4mlに加えて
懸濁し、氷冷したのちアクリルアミド50mgとメチレンビ
スアクリルアミド45mgを加えて溶解させ、窒素ガスを通
じて酸素を追い出した後、過硫酸アンモニウム3.5mgお
よびN,N′−ジメチルアミノプロピオニトリル8μを
加えて氷冷下に静置した。1時間後、生成した菌体含有
ゲルを50メッシュの金網で裏ごしし、生理食塩水で洗浄
し、ゲル固定化物を調製した。この固定化物2gを10mlの
20g/のN−カルバミル−L−Phe溶液(50mMKPB(pH7.
5))に添加し、30℃で16h反応した。このとき生成した
L−Pheは1.2g/であった。
【図面の簡単な説明】 第1図は、N−カルバミルアミノ酸をアミノ酸に変換す
る酵素をコードするプラスミドpUC18HA3の制限酵素地
図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:20) (72)発明者 久保田 浩二 神奈川県川崎市川崎区鈴木町1−1 味 の素株式会社中央研究所内 審査官 植野 浩志 (56)参考文献 特開 昭60−24192(JP,A) 特開 昭60−62992(JP,A) 特開 昭61−9292(JP,A)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 1.エシェリヒア・コリJM109 HA3(FERM P−8831)
    が保有する下記の制限酵素地図にて特定されるプラスミ
    ドpUC18HA3に由来しN−カルバミルアミノ酸に作用し対
    応するアミノ酸に変換する酵素に関与する遺伝子を含む
    DNA断片、または、フラボバクテリウム属細菌に由来し
    N−カルバミルアミノ酸に作用し対応するアミノ酸に変
    換する酵素に関与する遺伝子を含むDNA断片とベクターD
    NAとの組換え体DNAを用いエシェリヒア属、シュードモ
    ナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア
    属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
    に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得
    られる形質転換株を培地に培養し、培養物にN−カルバ
    ミルアミノ酸を加え水性媒体中で対応するアミノ酸を生
    成蓄積せしめ、アミノ酸を採取することを特徴とするア
    ミノ酸の製造法。 2.該DNA断片がフラボバクテリウム・アミノゲネスAJ
    3912(FERM−P3133)、フラボバクテリウム・アミノ
    ゲネスAJ 3940(FERM−P3135)に由来することを特徴
    とする特許請求の範囲第1項記載の方法。 3.該ベクターがエシェリヒア属、シュードモナス属、
    フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、コリ
    ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌中で
    自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまた
    はその誘導体であることを特徴とする特許請求の範囲第
    1項記載の方法。 4.該宿主菌株がエシェリヒア・コリ、シュードモナス
    ・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、フラボバク
    テリウム・アミノゲネス、バチルス・ズブチリス、セラ
    チア・マルセスセンス、コリネバクテリウム・グルタミ
    カム、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバク
    テリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクト
    ファーメンタムからえらばれることを特徴とする特許請
    求の範囲第3項記載の方法。
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