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Bereich der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren. Genauer
gesagt, betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoylα-aminosäuren unter
Verwendung einer neuen Transformante mit einem Gen für ein Enzym,
welches 5-substituierte Hydantoine in die korrespondierenden D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch
asymmetrische hydrolytische Spaltung umwandelt (nachfolgend als
Hydantoinase bezeichnet).
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Hintergrund
der Erfindung
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Optisch
aktive D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren können in
die korrespondierenden D-α-Aminosäuren umgewandelt
werden und optisch aktive D-α-Aminosäuren sind
wichtige Zwischenprodukte für
medizinische Wirkstoffe. Insbesondere umfassen Beispiele von industriell
nützlichen
Verbindungen D-Phenylglycin und D-(p-Hydroxyphenyl)glycin als Zwischenprodukte
zur Herstellung von semisynthetischen Penicillinen und semisynthetischen
Cephalosporinen.
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In
der Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren sind Verfahren unter Verwendung
mikrobieller enzymatischer Reaktionen bekannt, um 5-substituierte
Hydantoine in die korrespondierenden D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren durch
asymmetrische hydrolytische Spaltung umzuwandeln und derartige Verfahren
werden beschrieben in JP-A 53-91189, JP-A 53-44690, JP-A 53-69884,
JP-A 53-133688 und dergleichen.
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Zusätzlich wird
ein Gen betreffend eine Hydantoinase, welches ein Enzym ist zur
Umwandlung von 5-substituiertem Hydantoin in die korrespondierende
D-N-Carbamoyl-α-aminosäure erhalten aus
thermophilen Mikroorganismen und wird in mesophile Mikroorganismen
eingeführt,
um transformierte Mikroorganismen mit Hydantoinaseaktivität herzustellen.
Des Weiteren wird in WO 94/00577 ein Hydantoinasegenfragment aus
einem Mikroorganismus, der zum Genus Agrobacterium gehört, isoliert
und in Escherichia coli oder einen Mikroorganismus des Genus Agrobacterium
eingeführt,
um die Aktivität
zu exprimieren.
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Gegenstand
der Erfindung
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In
den oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung mikrobieller enzymatischer
Reaktionen bestehen die Nachteile, dass die Ausbeuten der Enzyme
von Mikroorganismen, die hierfür
bekannte Quellen sind, unzureichend ist, und des Weiteren die Kulturmedien
teuer sind.
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Zusätzlich ist
in Bezug auf die transformierten Mikroorganismen, die in JP-A 62-87089
offenbart sind, die Verbesserung der enzymatischen Aktivität nur mehrere
Male im Vergleich zu sporulierenden thermophilen Mikroorganismen
mit Hydantoinaseaktivität
und die Ausbeuten des Enzyms sind immer noch unzureichend.
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Des
Weiteren gibt es im Stand der Technik kein Beispiel, dass ein 5-substituiertes
Hytantoin einer asymmetrischen hydrolytischen Spaltung unterworfen
wird unter Verwendung der oben beschriebenen transformierten Mikroorganismen,
um die korrespondierende D-N-Carbamoyl-α-aminosäure herzustellen und zu akkumulieren.
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Die
vorliegende Erfindung löst
diese Probleme und ist gerichtet auf die Herstellung eines Mikroorganismus
mit einer sehr hohen Enzymproduktivität und auf die effiziente Herstellung
von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren unter
Verwendung der so erhaltenen Enzymquelle.
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Zusammenfassung der Erfindung
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JP-A
62-87089 und WO 94/00577 offenbaren das Verfahren zum Erhalten von
Hydantoinase-herstellenden Mikroorgansimen unter Verwendung rekombinanter
DNA-Techniken. Es sind jedoch die Ursprungs-Mikroorganismen zur
Bereitstellung der Hydantoinasegene komplett unterschiedlich von
den Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung zum Erhalt
der Hydantoinasegene verwendet werden. Zusätzlich sind die Nucleotidsequenzen
und Aminosäuresequenzen
der Hydantoinasegene erheblich unterschiedlich von jenen der vorliegenden
Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung soll ein Verfahren zur Herstellung einer D-N-Carbamoyl-α-aminosäure zur Verfügung stellen,
welches umfasst Reagierenlassen eines 5-substituierten Hydantoins
in einem wässrigen Medium
mit einer Hydantoinase, hergestellt durch eine Transformante, erhalten
durch Transformieren eines Wirtsmikroorganismus, wie ein Mikroorganismus,
der zum Genus Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus,
Serratia, Agrobacterium, Corynebacterium oder Brevibacterium gehört, mit
einer rekombinanten DNA oder einem DNA-Fragment enthaltend ein Gen
für Hydantoinase,
abgeleitet von Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863), und eine Vektor-DNA.
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Eine
Transformante mit sehr hoher Hydantoinaseproduktivität, wie jene,
die in der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, ist zuvor im Stand
der Technik nicht bekannt gewesen und die äußerst effiziente und ökonomische
Herstellung von D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren wird
unter Verwendung der Reaktion des Enzyms der Transformante möglich.
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Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung im Detail in Bezug auf die beigefügten Abbildungen
beschrieben.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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1 ist
eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pAH1043.
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2 ist
eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pTH102.
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3 ist
eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pTH103.
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4 ist
eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pTH104.
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5 ist
eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pPHD301.
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6 ist
eine Restriktionsenzymkarte von Plasmid pTHB301.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Ein
DNA-Fragment enthaltend das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende
Gen kann von Bacillus sp. KNK245 erhalten werden. Agrobacterium
sp. KNK712 und Pseudomonas sp. KNK003A sind beim National Institute
of Bioscience and Human-Technology,
Agency of Industrial Science & Technology
(NIBH), Ministry of International Trade and Industry, hinterlegt
worden vom Anmelder unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-1900 und
FERM BP-3181, und sind bekannte Stämme, welche im Detail in WO
92/10579 beschrieben wurden. Bacillus sp. KNK245 ist ein von den
vorliegenden Erfindern neu gefundener Stamm und ist bei NIBH hinterlegt
worden am 2. November 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4863.
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Mikrobielle
Charakteristika von Bacillus sp. KNK245 sind wie folgt. Bacillus
sp. KNK245
Form | Stäbchen, filamentös |
Größe | 0,5-0,8 × 3-10 (μm) |
Gram-Färbbarkeit | + |
Sporen | + |
Mobilität | - |
Wachstumstemperatur | 37-60°C |
Wachstums-pH | 5,0-8,9 |
Wachstum
in 5 % NaCl | - |
Wachstum
in 7 % NaCl | - |
Wachstum
in 0,02 % Azid | - |
Wachstum
in 0,001 % Lysozym | - |
Nitratreduktion | - |
Stärkehydrolyse | + |
Kaseinabbau | + |
Tyrosinabbau | - |
Katalase | - |
Oxidase | + |
Indolproduktion | - |
Produktion
von Säuren
aus Kohlenwasserstoffen
Mannose | (+) |
Xylose | - |
Arabinose | + |
Rhamnose | - |
Glucose | + |
Fructose | + |
Raffinose | - |
Sucrose | + |
Maltose | + |
Lactose | - |
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Zum
Erhalt eines Hydantoinasegens aus diesen Stämmen wird üblicherweise die folgende Prozedur durchgeführt.
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Zunächst wird
genomische DNA aus einer mikrobiellen Zelle extrahiert und dann
wird die DNA partiell hydrolisiert mit einem geeigneten Restriktionsenzym,
z. B., Sau3AI oder dergleichen. Die resultierenden Fragmente werden
mit Vektor-DNA ligiert,
um rekombinante DNA-Moleküle
mit unterschiedlichen genomischen DNA-Fragmenten als eine Genbibliothek
zu erhalten (siehe JP-A 58-126798 und U.S. Patent Nr. 4,237,224).
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Dann
wird eine Rekombinante, enthaltend das erwünschte Gen, aus dieser Genbibliothek
selektiert. Z. B. kann die Selektion durchgeführt werden durch Delektion
eines exprimierten Proteins unter Verwendung seiner enzymatischen
Aktivität
als Indikator, oder die Selektion kann durchgeführt werden durch Analyse der N-terminalen
Sequenz eines Proteins, Synthetisieren einer korrespondierenden
DNA-Probe und Detektieren des Vorhandenseins des erwünschten
Gens durch Koloniehybridisierung oder dergleichen. Zusätzlich kann das
erwünschte
Gen erhalten werden durch Koloniehybridisierung oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verfahren
unter Verwendung von DNA-Primern, welche synthetisierte, geeignete
Teile einer bekannten Hydantoinase-Basensequenz sind. Sobald das
erwünschte
Gen erhalten wurde, wird seine Nucleotidsequenz analysiert. Zusätzlich wird
ein Hydantoinase-herstellender Mikroorganismus und eine Rekombinante
enthaltend dieses Enzymgen kultiviert. Das resultierende Enzym wird
gereinigt und das Molekulargewicht des resultierenden Proteins wird
bestimmt. Zur selben Zeit wird die Aminosäuresequenz seiner N-terminalen
Region mit einem Gasphasenproteinsequenzer oder dergleichen bestimmt.
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Dann
wird durch Vergleich dieser DNA-Nucleotidsequenz mit den N-terminalen
Aminosäuresequenzen
die Initiierungsstelle für
die Translation der Nucleotidsequenzportion, die das Hydantoinaseprotein
kodiert, in ein Protein bestimmt, und, durch Bezugnahme auf das
Verhältnis
zum Molekulargewicht des Proteins wird bestätigt, dass das Enzymprotein
von der Genportion kodiert wird, welche sich von dieser Stelle bis
zum Endkodon erstreckt, wodurch das erwünschte Gen verifiziert wird
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Chapters 4 and 13). So wurden die DNA-Fragmente
der SEQ ID Nr. 1 und 2 von Agrobacterium sp. KNK712 und Pseudomonas
sp. KNK003A erhalten. Wie allgemein bekannt ist, sind das so erhaltene
Gen, welches das Enzym kodiert und/oder DNA-Fragmente, die es enthalten, äquivalent
zu DNA-Fragmenten mit einer anderen Nucleotidsequenz, welche eine
Aminosäuresequenz
kodiert, die zu dem obigen Gen und/oder DNA-Fragment korrespondiert,
da eine Aminosäure üblicherweise
zu einer Mehrzahl von Basenkodons korrespondiert.
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Als
Vektor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann,
können
Plasmide, Phagen oder Derivate davon verwendet werden, welche von
Mikroorganismen abgeleitet sind und autonom vermehrt werden können in
Zellen von Bakterien, die zum Genus Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium,
Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium gehören.
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Zum
Beispiel können
Wirts-Vektorsysteme, beschrieben in „Guidelines on Recombinant
DNA Experiments, -Commentation, Q and A-" (the Life Science Section of the Research
Development Office in the Science and Technology Agency, Ed., revidiert
16. September 1987), Seiten 25 bis 27 und 36 bis 38, verwendet werden.
Zusätzlich
kann rekombinante DNA mit einer Translations-Initiationsstelle,
die mit einer geeigneten Stelle eines Vektors verbunden ist, welcher
modifiziert wurde, um einen starken strukturellen Promotor aufzuweisen, verwendet
werden für
den Zweck, die Menge an hergestelltem Enzym zu erhöhen. Beide
Enden dieser Fragmente werden mit einem Restriktionsenzym geschnitten,
um eine Rekombinante mit einerm geeigneten Vektor zu erzeugen. Ein
rekombinanter Hydantoinase-herstellender Mikroorganismus kann hergestellt
werden durch direkte Transformation eines Mikroorganismus, der zum
Genus Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia,
Agrobacterium, Corynebacterium oder Brevibacterium gehört.
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Ein
Hydantoinase-herstellender rekombinanter Mirkoorganismus kann auch
erhalten werden ohne direkte Transformation eines Mikroorganismus
des oben beschriebenen Genus, d. h., das erwünschte Gen wird einmal in ein
Wirts-Vektorsystem kloniert unter Verwendung eines anderen Mikroorganismus,
wie Escherichia coli, wonach rekombinante DNA mit einem geeigneten
Vektor hergestellt wird.
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Die
Beschreibung der folgenden Dokumente kann allgemein angewandt werden
auf die Herstellung von Rekombinanten: die Beschreibung von U.S.
Patent Nr. 4,237,244 auf S. N. Cohen et al.; „Idenshi-sousa Jikken-hou
(Experimental Method of Gene Manipulation)" [Ed. Yasuyuki Takagi, Kohdan-sha Scientific
(1980)]; Method in Enzymology, 68, Recombinant DNA [Ed., Ray Mv,
Academic Press (1979)], die Beschreibung von JP-A 58-126789 und
dergleichen.
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Das
erwünschte
Gen wird kloniert und unnötige
DNA wird entfernt. Rekombinante DNA mit seiner Translations-Startstelle, verbunden
mit einer geeigneten Position eines Vektors, welcher modifiziert
wurde, um einen starken strukturellen Promotor aufzuweisen, kann
verwendet werden für
die Transformation der obigen Wirtszelle, um die Menge des produzierten
Enzyms zu erhöhen.
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Die
Transformante wird kultiviert in einem konventionellen Nährstoff-Kulturmedium,
um die eingeführte rekombinante
DNA zu exprimieren. Wenn eine bestimmte Eigenschaft, abgeleitet
von der Gen-DNA oder Vektor-DNA, auf die rekombinante DNA übertragen
wird, kann eine geeignete Komponente zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden,
gemäß einer
bestimmten Eigenschaft.
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Um
die so erhaltene Transformante als Enzymquelle zu nehmen, kann sie
kultiviert werden unter Verwendung eines konventionellen Kulturmediums.
Falls nötig,
ist es auch möglich,
eine Behandlung zur Enzyminduktion durchzuführen, wie das Hinzufügen von
Hydantoinverbindungen, Uracil, Isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) oder dergleichen
und einen Temperaturanstieg. Üblicherweise
ist das Kulturmedium, das zum Kultivieren der Transformante verwendet
wird, ein konventionelles Kulturmedium, enthaltend Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen und anorganische Ionen. In vielen Fällen können die
gewünschten
Ergebnisse erhalten werden durch weiteres Hinzufügen von organischen Spurennährstoffen,
wie Vitaminen, Aminosäuren
und dergleichen. Als Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate, wie Glucose
und Sucrose, organische Säuren,
wie Essigsäuren,
Alkohole und dergleichen praktisch verwendet werden. Als Stickstoffquellen
können
Ammoniumgas, Ammoniumwasser, Ammoniumsalze und dergleichen verwendet
werden. Als anorganische Ionen können Phosphationen,
Magnesiumionen, Kaliumionen, Eisenionen, Manganionen, Kobaltionen,
Nickelionen, Kupferionen, Aluminiumionen, Molybdenionen und dergleichen
verwendet werden.
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Wenn
die Kultivierung unter aeroben Bedingungen für 1 bis 10 Tage durchgeführt wird,
während
der pH und die Temperatur auf einen geeigneten Bereich von 4 bis
8 beziehungsweise 25 bis 60°C
eingestellt werden, können
die gewünschten
Ergebnisse erhalten werden.
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Die
enzymatische Aktivität
eines von der Transformante hergestellten Enzyms kann ausgedrückt werden
in Form von, z. B., einer Kulturlösung der Transformante, seiner
mikrobiellen Zellen, dem aus den mikrobiellen Zellen extrahierten
Enzym, immobilisierten mikrobiellen Zellen und dergleichen.
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Als
mikrobielle Zellen können
eine Kulturlösung,
wie sie nach der Fertigstellung der Kultivierung vorliegt, mikrobielle
Zellen, die von der Kulturlösung
getrennt wurden, gewaschene mikrobielle Zellen und dergleichen verwendet
werden. Als die behandelten mikrobiellen Zellen können lyophilisierte
mikrobielle Zellen, Azeton-getrocknete mikrobielle Zellen, mikrobielle
Zellen, die in Kontakt mit Toluol oder einem Detergens gebracht wurden,
Lysozym-behandelte mikrobielle Zellen, ultrabeschallte mikrobielle
Zellen, mechanisch zerriebene mikrobielle Zellen und dergleichen
verwendet werden. Zusätzlich
können
Enzymextrakte mit Hydantoinase-Aktivität, erhalten
aus diesen behandelten mikrobiellen Zellen, diesen immobilisierten
mikrobiellen Zellen, diesen unlöslich
gemachten mikrobiellen Zellen, diesen Enzymproteinen, die auf einen
Träger
zur Immobilisierung fixiert wurden (z. B. Anionenaustauscherharz)
und dergleichen verwendet werden. Als Immobilisierungsverfahren
kann z. B. Bezug genommen werden auf die Beschreibung von JP-A 63-185382
und dergleichen.
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Als
Träger
zur Verwendung für
die Immobilisierung sind Phenol-Formaldehydanionen-Austauscherharze,
wie Duolite A568 oder DS17186 (Rohm & Haas Co.: registrierte Handelsmarke),
und verschiedene Anionenaustauscherharze enthaltend verschiedene
Amine, Ammoniumsalze oder funktionelle Gruppen von der Art der Diethanolamine,
z. B. Polystylolharze, wie Amberlite IRA935, IRA945, IRA901 (Rohm & Haas Co.: registrierte
Handelsmarke), Lewatit OC1037 (Bayer A.G.: registrierte Handelsmarke)
und Diaion EX-05 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.: registrierte
Handelsmarke) geeignet. Andere Träger, wie DEAE-Zellulose, können auch
verwendet werden.
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Des
Weiteren werden, um stärkere
und stabiliere Adsorption von Enzymen zu erhalten, üblicherweise Kreuzvernetzungsmittel
verwendet, wovon das bevorzugte Beispiel Glutaraldehyd ist. Als
zu verwendendes Enzym kommen nicht nur gereinigte Enzyme, sondern
auch jene mit unterschiedlichen Graden an Aufreinigung, wie teilweise
gereinigte Enzyme, Suspensionen von disintegrierten mikrobiellen
Zellen und zellfreie Extrakte verwendet werden. Die Herstellung
von immobilisierten Enzymen kann durchgeführt werden gemäß einem
konventionellen Verfahren, z. B. durch Absorbieren von Enzymen auf
einem Träger,
gefolgt durch eine Kreuzvernetzungsbehandlung.
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Das
5-substituierte Hydantoin, das zu verwenden ist als Substrat der
enzymatischen Reaktion der vorliegenden Erfindung, ist nicht besonders
limitiert und kann jede Verbindung sein, die üblicherweise in dieser Art
von Reaktion verwendet wird. Beispiele davon umfassen jene dargestellt
durch die allgemeine Formel (1):
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Der
Rest R in der Verbindung der Formel (1) kann in einem weiten Bereich
ausgewählt
werden. Um industriell nützliche
Produkte, wie Zwischenprodukte von medizinischen Wirkstoffen zur
Verfügung
zu stellen, ist R vorzugsweise Phenyl, Phenylsubstituiert mit Hydroxy,
Alkyl, substituiertes Alkyl, Aralkyl oder Thienyl. Im Fall von Phenyl
substituiert mit Hydroxy, kann die Anzahl von Hydroxygruppen eine
oder mehrere sein und sie können
an jeder der o-, m- und p-Positionen lokalisiert sein, wobei ein
typisches Beispiel davon p-Hydroxyphenyl ist. Die Alkylgruppe ist
eine Gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, so dass die korrespondierende
D-N-Carbamoyl-α-aminosäure D-N-Carbamoyl-alanin,
D-N-Carbamoyl-valin, D-N-Carbamoyl-leucin, D-N-Carbamoylisoleucin
oder dergleichen ist. Die substituierte Alkylgruppe ist eine solche
Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, substituiert mit Hydroxy,
Alkylthio, Carboxyl, Amino, Phenyl, Phenyl-substituiert mit Hydroxy,
Amido oder dergleichen, das die korrespondierende D-N-Carbamoyl-aminosäure, D-N-Carbamoyl-serin,
D-N-Carbamoyl-threonin, D-N-Carbamoyl-methionin, D-N-Carbamoyl-cystein,
D-N-Carbamoyl-asparagin, D-N-Carbamoyl-Blutamin, D-N-Carbamoyl-tyrosin,
D-N-Carbamoyl-tryptophan, D-N-Carbamoyl-aspartat, D-N-Carbamoyl-glutamat,
D-N-Carbamoyl-histidin, D-N-Carbamoyl-lysin, D-N-Carbamoyl-arginin,
D-N-Carbamoyl-citrullin oder dergleichen ist. Die Aralkylgruppe
ist eine solche Gruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen, z. B. Benzyl
oder Phenethyl, dass die korrespondierende D-N-Carbamoyl-α-aminosäure, D-N-Carbamoyl-phenylalanin
oder dergleichen ist.
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Als
wässriges
Medium können
solche enthaltend Wasser, Puffer oder organische Lösungsmittel,
wie Ethanol, verwendet werden. Des Weiteren können, falls nötig, Nährstoffe,
die für
das Wachstum der Mikroorganismen benötigt werden, Antioxidantien,
Detergenzien, Coenzyme, Hydroxylamine, Metalle und dergleichen zu
dem wässrigen
Medium hinzugefügt
werden.
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In
dem Fall, wo während
der Kultivierung der mikrobiellen Zellen des obigen Mikroorganismus
in einem wasserlöslichen
Medium die mikrobiellen Zellen mit einem bestimmten 5-substituierten
Hydantoin in Kontakt gebracht werden, wird ein wässriges Medium, welches nicht
nur das 5-substituierte Hydantoin enthält, sondern auch Nährstoffe,
die für
das Wachstum der Mikroorganismen benötigt werden, wie Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen und anorganische Ionen, verwendet. Wenn organische
Spurennährstoffe,
wie Vitamine und Aminosäuren,
des Weiteren dazu hinzugefügt
werden, können
in vielen Fällen
zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden. Als Kohlenstoffquellen
werden Kohlenhydrate wie Glucose, Sucrose, organische Säuren wie Essigsäure, Alkohole
und dergleichen praktischerweise verwendet. Als Stickstoffquellen
können
Ammoniumgas, Ammoniumwasser, Ammoniumsalze und dergleichen verwendet
werden. Als anorganische Ionen können Phosphationen,
Magnesiumionen, Kaliumionen, Eisenionen, Manganionen, Kobaltionen,
Nickelionen, Kupferionen, Aluminiumionen, Molybdenionen und dergleichen
verwendet werden.
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Die
Kultivierung wird durchgeführt
unter aeroben Bedingungen, während
der pH und die Temperatur auf einen geeigneten Bereich von 4 bis
8 bzw. 25 bis 60°C
eingestellt werden. Wenn die Kultivierung durchgeführt wird
für 1 bis
10 Tage, werden 5 substituierte Hydantoine mit einer hohen Effizienz
nur in D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren umgewandelt.
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Auf
der anderen Seite, in dem Fall, wo die Kulturlösung der obigen Mikroorganismen
so wie sie ist reagieren gelassen wird mit kultivierten mikrobiellen
Zellen, behandelten mikrobiellen Zellen, Enzymextrakten, immobilisiert
mikrobiellen Zellen, unlöslich
gemachten mikrobiellen Zellen oder fixierten Enzymproteinen in einem
wässrigen
Medium, enthaltend ein gelöstes
oder suspendiertes 5-substituiertes Hydantoin, kann die Reaktionsmischung
für einige
Zeit stehen gelassen oder gerührt
werden, während
sie bei einer geeigneten Temperatur von 10-80°C und einem pH von 4 bis 9,5
gehalten wird. Somit erfolgen, wenn 5 bis 100 Stunden verangen sind,
die D-spezifische Hydrolysereaktion des Substrats durch Hydantinase
und chemische Racemisierung des Substrats und jegliche von D-, DL-
oder L-5-substituierten Hydantoinen werden in die korrespondierenden
D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren umgewandelt,
um in einer großen
Menge der Aminosäuren
in dem wässrigen
Medium zu akkumulieren. Zusätzlich
können
5-substituierte Hydantoine in separaten Portionen hinzugefügt werden
mit dem Fortschreiten der Reaktion.
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Die
hergestellte D-N-Carbamoyl-α-aminosäure kann
isoliert und gereinigt werden durch konventionelle Trennungsverfahren.
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D-α-Aminosäuren können einfach
erhalten werden unter Verwendung der isolierten und gereinigten D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren, erhalten
durch die oben beschriebenen Verfahren oder die Reaktionsmischungen
erhalten durch die Hydantoinasereaktion wie sie sind, durch die
Aktion und das Umwandeln der D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren in die korrespondierenden
D-α-aminosäuren, chemisch
oder enzymatisch mit Enzymen, die Decarbamylaseaktivität aufweisen.
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Die
folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung weiter
im Detail.
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Beispiel 1
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Isolierung eines Mikroorganismus
mit Hydantoinaseaktivität
aus Boden
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Nach
dem Suspendieren von 0,5 g einer Bodenprobe in 2 ml physologischer
Salzlösung
wurde die Suspension stehen gelassen und ein Tropfen des Überstands
wurde auf ein Isolations-Agar-Plattenmedium gestrichen (1,0 % Fleischextrakt,
1,0 % Pepton, 1,0 % Hefeextrakt, 0,3 % Natriumchlorid, 2,0 % Agar,
pH 7,5). Dieses wurde bei 50°C
für 2 Tage
kultiviert und die erhaltene Kolonie wurde auf das gleiche Isolationsplattenmedium
transferiert, zu welchem 0,1 % Uracil und 20 ppm Manganchlorid hinzugefügt worden
waren und dann 1 Tag bei 50°C
weiter kultiviert. Die so erhaltenen mikrobiellen Zellen wurden
in 100 μl
einer Reaktionssubstratlösung
suspendiert [DL-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin, 30 mM, Natriumsulfit
0,1 %, Caronatpuffer 50 mM] und wurden für 2 Stunden bei 50°C reagieren
gelassen. Dann wurde die Reaktionsmischung auf eine TLC-Platte punktförmig aufgebracht
und entwickelt mit einem Entwicklungs-Lösungsmittel aus Butanol:Essigsäure:Wasser
(4:1:1), gefolgt durch das Farbentwickeln mit einer 10 Lösung von
p-Dimethylamino-benzaldehyd in konzentrierter Salzsäure und
Detektieren eines gelben Punktes, um mikrobielle Stämme zu selektieren, welche
N-Carbamoyl-p-hydroxyphenylglycin
herstellten. So wurde unter 2.740 Kolonien Bacillus sp. KNK245 (FERM
BP-4863) mit einer hohen Hydantinaseaktivität isoliert.
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Beispiel 2
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N-terminale Aminosäure-Sequenzierung
von der Hydantoinase, abgeleitet von Bacillus sp. KNK245
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Eine
kleine Menge („loopful") Bacillus sp. KNK245
wurde in 100 ml eines Startkulturmediums inokuliert (1,0 % Fleischextrakt,
1,0 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, pH 7,5) in einem 500 ml Sakaguchi-Behälter und
bei 55°C
für 19
Stunden kultiviert. Dann wurden 2 % davon inokuliert in 500 ml eines
Hauptkulturmediums (1,0 % Fleischextrakt, 1,0 % Pepton, 0,5 % Uracil,
20 ppm Manganchloridtetrahydrat, pH 7,5) in einem 2 Liter Sakaguchi-Behälter und
bei 55°C
für 19
Stunden kultiviert. Mikrobielle Zellen wurden von 9 Litern der so
erhaltenen Kulturflüssigkeit
durch Zentrifugation gesammelt. Sie wurden in 0,2 M Tris-HCl (pH
8,0) mit 20 mM Mangansulfat suspendiert, ultrabeschallt und zentrifugiert,
um ein zellfreies Extrakt zu erhalten. Dann wurde das Extrakt bis
zu 32-fach aufgereinigt durch Ammoniumsulfat-Präzitipationsfraktionierungen,
DEAE-Sepharose und Phenyl-Sepharose.
Des Weiteren wurden Hydantoinasekristalle erhalten durch Ammoniumsulfat.
Die Kristalle wurden in Wasser aufgelöst und unter Verwendung eines
470 A Gasphasen-Protein-Sequenzers
(hergestellt von Applied Biosystems) analysiert. Im Ergebnis wurde
gefunden, dass die Hydantoinase die Aminosäuresequenz:
an ihrem N-Terminus aufwies.
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Referenzbeispiel 1
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Erhalten eines Plasmids
enthaltend das Gen für
Hydantoinase, abgeleitet von Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900)
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Durch
eine Untersuchung gemäß dem folgenden
Verfahren wurde gefunden, dass ein Hydantoinasegen auf dem DNA-Fragment,
welches in dem Plasmid pAHD101, beschrieben in WO 92/10579, lokalisiert
ist. Escherichia coli JM109 wurde mit pAHD101 transformiert gemäß einem
herkömmlichen
Verfahren, in 50 ml L-Medium inokuliert (10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt,
5 g/l Natiumchlorid, pH 7,0), enthaltend 100 mg/l Ampicillin und
bei 37°C
für 16
Stunden kultiviert. Dann wurden 50 ml der Kulturlösung gesammelt,
gefolgt vom Entfernen des Überstands,
Suspendieren der mikrobiellen Zellen in 50 ml Substratlösung (0,5
% 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin, 0,05 % Triton X-100, 0,05 M Phosphatpuffer,
pH 8,7) und Reagieren lassen bei 37°C für 3 Stunden in einem Fluss
von Stickstoff. Die Reaktionsmischung wurde auf eine TLC-Platte
punktförmig
aufgetragen, entwickelt und gefärbt
mit einer Lösung
von p-Dimethylamino-benzaldehyd in Salzsäure, um einem Punkt von D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin
zu detektieren, in Übereinstimmung
mit einer Kontrollprobe. Angesichts des Obigen wurde bestätigt, dass
die Transformante von pAHD101 ein Gen exprimiert, welches Hydantoinase
kodiert.
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Ein
2,1 kbp-Fragment, erhalten durch Spalten des Plasmids pAHD101 mit
SacI und SalI, um das eingesetzte Fragment zu verkürzen, wurde
an ein pUC18-Fragment, gespalten mit SacI und SalI, ligiert, um
das Plasmid pAH1043 zu erhalten (siehe 1).
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Zusätzlich wurde
das Sequenzieren des Hydantoinasegens durchgeführt unter Verwendung eines DNA-Sequenz-Kits
(hergestellt von Applied Biosystems). Die Ergebnisse werden in SEQ
ID Nr. 1 gezeigt.
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Escherichia
coli HB101 wurde transformiert mit dem Plasmid pAH1043, um eine
Transformante, Escherichia coli HB101 pAH1043 zu erhalten (FERM
BP-4865).
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Beispiel 3
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Herstellung rekombinanter
DNA aus genomischer DNA von Bacillus sp. KNK245 und Vektor-DNA
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Bacillus
sp. KNK245 (FERM BP-4863) wurde in 2 Litern einer Lösung kultiviert
(10 g/l Fleischextrakt, 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt, pH 7,5)
bei 45°C
für 24
Stunden, und die mikrobiellen Zellen wurden gesammelt. Genomische
DNA wurde aus den erhaltenen mikrobiellen Zellen extrahiert gemäß der Marmur-Methode. Zehn
Einheiten BamHI wurden zu 1 μg
der genomischen DNA hinzugefügt
und bei 37°C
für 16
Stunden reagieren gelassen.
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Auf
der anderen Seite wurde das Plasmid pUC19 komplett gespalten mit
BamHI und die oben erhaltenen genomischen DNA-Fragmente wurden daran ligiert mit T4DNA-Ligase,
um eine Mischung von verschiedenen rekombinanten Plasmiden zu erhalten.
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Beispiel 4
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Erhalten des Hydantoinasegens,
abgeleitet von Bacillus sp. KNK245
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Basierend
auf der Nucleotidsequenz des Hydantoinasegens, abgeleitet von Agrobacterium
sp. KNK712 (FERM BP-1900) aus Referenzbeispiel 1 und dem Lu1220-Stamm,
offenbart in JP-A 62-87089, wurden zwei Arten von Primern 1 und
2 (siehe Tabelle 1) mit Sequenzen jedes komplementären Strangs
der obigen Nucleotidsequenzen, orientiert in unterschiedlichen Richtungen,
von 1.155 bp unterbrechenden Nucleotiden synthetisiert. Eine Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) wurde ausgeführt
unter Verwendung von zwei Primern, welche synthetisiert wurden durch
Verwendung genomischer DNA, abgeleitet von Bacillus sp. KNK245, hergestellt
in Beispiel 3 als ein Template, um ein etwa 1,2 kbp-Fragment zu
erhalten. Die Nucleotidsequenzierung dieses Fragments wurde ausgeführt unter
Verwendung eines DNA-Sequenz-Kits (hergestellt von Applied Biosystems).
Im Ergebnis hatte es eine hohe Komplementarität mit einem bekannten Hydantoinasegen
und es wurde gefunden, dass das erhaltene PCR-Fragment ein Teil
des Hydantoinasegens war. Dann wurden die zwei Primer 3 und 4 (Tabelle
1) mit in unterschiedliche Richtungen ausgerichtete Sequenzen der
jeweiligen komplementären
Stränge
dieses Fragments synthetisiert.
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Des
Weiteren wurde Primer 5 (Tabelle 1) mit der Sequenz eines Vektorteils
in der rekombinanten DNA von Beispiel 3 synthetisiert und unter
Verwendung der obigen synthetisierten Primer und des letzteren Primers und
Verwendung der rekombinanten DNA von Beispiel 3 als Template wurde
PCR durchgeführt,
um zwei Arten von DNA-Fragmenten, enthaltend die vordere Hälfte bzw.
die hintere Hälfte
des Hydantoinasegens zu erhalten. Diese DNA-Fragmente wurden der
Nucleotidsequenzierung unterworfen. Auf Basis der Nucleotidsequenzen,
welche anhand der N-terminalen Aminosäuresequenz des Hydantoinaseproteins
von Beispiel 2 erwartet wurden, wurde das Translationskodon bestimmt.
Zusammen mit den Ergebnissen der oben bestimmten Nucleotidsequenzen
wurde die gesamte Nucleotidsequenz des Gens, welches Hydantoinase
kodiert, bestimmt.
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Dann
wurden, auf Basis der so erhaltenen Nucleotidsequenz, Primer 6 (Tabelle
1) mit einer Sequenz im Bereich des Initiationskodons des Hydantoinasegens
und der NdeI-Restriktionsstelle
und Primer 7 (Tabelle 1) mit einer Sequenz im Bereich der PstI-Restriktionsstelle
in dem Hydantoinasegen synthetisiert und PCR wurde durchgeführt unter
Verwendung der genomischen DNA von Beispiel 3 als Template, um ein
1,2 kb Fragment 1 zu erhalten. Dann wurden Primer 8 (Tabelle 1)
mit einer entgegengesetzt ausgerichteten Sequenz an der obigen PstI-Restriktionsstelle
und Primer 9 (Tabelle 1) mit einer Sequenz, die zur Downstream-Sequenz des
Terminationskodons korrespondiert und der HindIII-Restriktionsstelle
synthetisiert und PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der genomischen
DNA von Beispiel 3 als Template, um ein 0,25 kb Fragment 2 zu erhalten.
Fragment 1 wurde mit NdeI und PstI geschnitten, Fragment 2 wurde
mit PstI und HindIII geschnitten und pUCNT, welches ein verbessertes
Vektorplasmid von pUC19, beschrieben in WO 94/03613, ist, wurde
mit NdeI und HindIII geschnitten. Die geschnittenen Fragmente wurden
mit T4DNA-Ligase ligiert, um das Plasmid pTH102, enthaltend das
Hydantoinasegen (siehe 2), zu erhalten.
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Beispiel 5
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Herstellung rekombinanter
DNA zur Expression des Bacillus sp. KNK245 Hydantoinasegens
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PCR
wurde in derselben Weise, wie zum Erhalt des Fragments 2 in Beispiel
4 durchgeführt,
um ein 0,25 kb Fragement 3 zu erhalten, abgesehen davon, dass an
Stelle des Primers mit einer PstI-Restriktionsstelle, welcher für die Herstellung
des Fragments 2 verwendet worden war, der synthetisierte Primer
10 (Tabelle 1), worin ein Nucleotid an der NdeI-Restriktionsstelle nahe der PstI-Restriktionsstelle
substituiert wurde, um die Spaltung mit NdeI zu blockieren, verwendet
wurde, und anstelle des Primers mit der Sequenz im Bereich des Terminationskodons,
der synthetisierte Primer 11 (Tabelle 1), worin die Anzahl der Nucleotide
downstream des Terminationskodons noch weiter reduziert worden waren,
verwendet wurde. Dann wurde in derselben Weise, wie für das Erhalten
von pTH102 in Beispiel 4 das Plasmid pTH103 aus den Fragmenten 1
und 3 und pUCNT (siehe 3) erhalten.
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Des
Weiteren wurde in derselben Weise, wie für das Erhalten von pTH103,
pTH104 erhalten, abgesehen davon, dass anstelle des Primers 11 mit
der Downstream-Sequenz im Bereich des Terminationskodons, Primer
12 (Tabelle 1) verwendet wurde.
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Escherichia
coli HB101, transformiert mit pTH104, wurde als Escherichia coli
HB101 pTH104 bezeichnet. Dieser Stamm ist hinterlegt worden bei
dem National Institute of Bioscience and Human Technology am 2.
November 1994 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4864.
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Referenzbeispiel 2
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Zum Erhalt des Plasmids
enthaltend das Gen für
Hydantoinase, abgeleitet von Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP-3181)
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In
derselben Weise, wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, wurde gefunden,
dass auf dem in WO 92/10579 beschriebenen Plasmid pPHD301 ein Hydantoinasegen
lokalisiert ist.
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Escherichia
coli HB101 wurde mit pPHD301 transformiert, um Escherichia coli
HB101pPHD301 (FERM BP-4866) zu erhalten. Die Restriktionsenzymkarte
von pPHD301 ist in 5 gezeigt.
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Die
Sequenzierung des Hydantoinasegens wurde in derselben Weise ausgeführt, wie
in Referenzbeispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse werden in SEQ
Nr. 2 gezeigt.
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Beispiel 6
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Umwandlung von 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin
in D-N-Carbamoyl(p-hydroxyphenyl)glycin durch die erhaltene Transformante
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Die
in Beispiel 5 erhaltene Transformante, Escherichia coli HB101pTH104
wurde in 50 ml 2YT-Medium (16 g/l Polypepton, 10 g/l Hefeextrakt,
5 g/l Natriumchlorid, pH 7,0), enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 400 ppm
Manganchloridtetrahydrat, inokuliert, und bei 37°C für 24 Stunden kultiviert. Die
mikrobiellen Zellen wurden aus 50 ml dieses Kulturmediums gesammelt
und in 0,05 M Carbonatpuffer (pH 8,7) suspendiert, um ein Volumen
von 50 ml zu ergeben. Triton X-100 wurde hinzugefügt, so dass
die Endkonzentration 0,05 % betrug. Hierzu wurden 1,5 g 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin
hinzugefügt
und die Mischung wurde unter Rühren
bei 40°C
für 3 Stunden
in einem Strom von Stickstoff reagieren gelassen, wobei der pH auf
8,7 durch 6 N Natriumhydroxid eingestellt wurde. Nach Beenden der
Reaktion wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert und der Überstand
wurde einer colorimetrischen Bestimmung von D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin
unterworfen durch Farbentwicklung mit einer 10 % Lösung von
p-Dimethylaminobenzaldehyd in konzentrierter Salzsäure. Im
Ergebnis wurde D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin mit einer Umwandlungsausbeute
von 97,5 % produziert.
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Die
Reaktionsmischung wurde auf pH 5 mit Salzsäure eingestellt. Nach der Zentrifugation
wurde der Überstand
konzentriert, mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2 eingestellt und
bei 4°C
gelagert. Die präzipitierten
Kristalle wurden abgefiltert und aus Wasser-Ethanol rekristallisiert,
um 970 mg D-N-Carbamoyl-(phydroxyphenyl)glycin, m.p. 176-177°C, [α]D20 = -177,0°C (c = 0,5, 5 % Ethanol), zu
erhalten.
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Beispiel 7
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Herstellung
immobilisierter Hydantoinase
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Mikrobielle
Zellen wurden aus 1 l einer Kulturlösung von Escherichia coli HB101pTH104
gesammelt, welche erhalten wurde in derselben Weise, wie in Referenzbeispiel
2 beschrieben, in wässriger
1 mM Mangangsulfatlösung
suspendiert, um ein Volumen von 60 ml zu ergeben, auf einen pH von
8,5 eingestellt und durch Ultraschall aufgeschlossen. Zu der so
erhaltenen Enzymlösung
wurden 20 g eines Anionenaustauschharzes, Duolite A-568, äquilibriert
auf pH 8,5, hinzugefügt,
und die Mischung wurde bei 15°C
für 20
Stunden gerührt,
um das Enzym zu absorbieren. Zu dieser Mischung wurde Glutaraldehyd
hinzugefügt,
so dass die Endkonzentration davon 0,1 % war und die Mischung wurde
für 1 Stunde
gerührt,
um die Quervernetzungsreaktion zu bewirken. Dann wurde das Harz
gesammelt und gewaschen, um 20 g einer immobilisierten Hydantoinase
zu erhalten.
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Beispiel 8
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Umwandlung von 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin
in D-Carbamoyl(p-hydroxyphenyl)glycin durch immobilisiertes Enzym
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5
g der immobilisierten Hydantoinase, die in Beispiel 7 erhalten wurde,
wurde zu 100 ml einer wässrigen
1 mM Mangansulfatlösung
bei 40°C
hinzugefügt,
welche von Stickstoff durchströmt
wurde. Hierzu wurden 3 g 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin
hinzugefügt
und die Reaktion wurde unter Rühren
bei 40°C
für 3 Stunden und
Durchströmen
mit Stickstoff durchgeführt.
Nach Fertigstellen der Reaktion wurde die Reaktionsmischung stehen
gelassen und abgesaugt, um die Reaktionsmischung zu erhalten. In
derselben Weise, wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde das Carbamoylaminosäureprodukt
gereinigt, um 2,2 g D-N-Carbamoyl-(p-hydroxyphenyl)glycin zu erhalten.
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Beispiel 9
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Expression von Bacillus
sp. KNK245 Hydantoinasegen in Bacillus subtilis
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In
derselben Weise, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde PCR ausgeführt unter
Verwendung genomischer DNA von Bacillus sp. KNK245 als Template
und unter Verwendung von den Primern 12 und 13 (Tabelle 1), um ein
1,7 kb Fragment zu erhalten. Dieses wurde mit BamHI und HindIII
geschnitten und in das Plasmid pHY300PLK (Takara Shuzo) ligiert,
welches in einer ähnlichen
Weise geschnitten worden war, um das Plasmid pTHB301 zu erhalten.
Seine Restriktionsenzymkarte wird in 6 gezeigt.
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Dieses
Plasmid pTHB301 wurde in Bacillus subtilis ISW1214 (erhältlich von
Takara Shuzo), Bacillis subtilis YS-11 (IAM12019) oder Bacillus
subtilis 3115 (IAM12020) durch Elektroporation (unter Verwendung des
Shimadzu Corporation GTE-10 Modells, 10 KV/cm, 2 ms) eingeführt, und
in dem Kulturmedium, welches in Beispiel 3 gezeigt wurde, zu welchem
0,02 g/l Manganchloridtetrahydrat hinzugefügt worden waren, bei 37°C für 20 Stunden
kultiviert. Ein zellfreies Extrakt wurde durch Sammeln der mikrobiellen
Zellen und Zerstören
durch Ultrabeschallung hergestellt. Im Ergebnis war die jeweilige
Hydantoinaseaktivität
etwa 2,2-fach höher
als jene, die durch Kultivierung von Bacillus sp. KNK245 unter den
gleichen Bedingungen erhalten wurde.
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Beispiel 10
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Expression von Bacillus
sp. KNK245 Hydantoinasegen in Thermophilen
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Bacillus
stearothermophilus IFO12550 wurde mit dem Plasmid pTHB301, welches
in Beispiel 9 hergestellt worden war, durch die Protoplasten-Methode
gemäße J. Bacteriol.,
149, 824 (1982) transformiert und kultiviert in derselben Weise,
wie in Beispiel 11 beschrieben, um ein zellfreies Extrakt herzustellen.
Die Hydantoinase-Aktivität
war etwa 3,6-fach höher
als jene von Bacillus sp. KNK245, welches unter den gleichen Bedingungen
hergestellt worden war.
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Wie
voranstehend beschrieben, kann gemäß der vorliegenden Erfindung
ein Mikroorganismus mit sehr hoher Hydantoinase-Aktivität hergestellt werden und unter
Verwendung desselben als Enzymquelle, können D-N-Carbamoyl-α-aminosäuren effizient
produziert werden.
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Hinterlegung
der Microorganismen
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Agrobacterium
sp. KNK712 ist hinterlegt worden am 31. Mai 1988 unter der Hinterlegungs-Nr.
FERM BP-1900, Pseudomonas sp. KNK003A ist am 1. Dezember 1990 hinterlegt
worden unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-3181, Bacillus sp. KNK245
ist am 2. November 1994 hinterlegt worden unter der Hinterlegungs-Nr. FERM
BP-4863 und Escherichia coli HB101pAH1043 ist am 2. November 1994
hinterlegt worden unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4866 bei der
folgenden Hinterlegungsstelle gemäß dem Budapester Vertrag.
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Name:
National Institute of Bioscience and Human-Technology (früher Fermentation
Research Institute), Agency of Industrial Science & Technology, Ministery
of International Trade & Industry
Adresse: 1-3, Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japan SEQUENZLISTE (substituiert)