KR987001034A

KR987001034A - D-N-카르바모일-알파-아미노산의 제조법(Process for Producing D-N-Carbamoyl-Alpha-Amino Acid)

Info

Publication number: KR987001034A
Application number: KR1019970704499A
Authority: KR
Inventors: 히로까즈 난바; 가즈요시 야지마; 마사유끼 다까노; 유끼오 야마다; 야스히로 이께나까; 사또미 다까하시
Original assignee: 후루따 다께시; 가네가후찌 가가꾸 고오교 가부시끼 가이샤
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1995-12-26
Publication date: 1998-04-30
Also published as: EP0801131B1; CN100516197C; KR100244066B1; CN1916164A; EP0801131A4; EP0801131A1; DE69535653T2; CN100406553C; DE69535398D1; CN1502701A; EP1616946A1; WO1996020275A1; EP1616945B1; CN1171812A; DE69535398T2; EP1616945A1; CN1082090C; DE69535653D1; ES2281075T3

Abstract

바실러스, 아그로박테륨 또는 슈도모나스속에 속하는 특정 미생물에서 기원하는 하이단토인나아제와 관련된 유전자를 포함하는 DNA의 절편 및 벡터 DNA를 갖는 재조합 DNA로 형질전환된 미생물로 제조한 하이단토인나아제를 이용하여 5-치환 하이단토인으로부터 D-N-카르바모일-α-아미노산을 제조하는 방법.

Description

[기술분야]

본 발명은 D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 이는 비대칭 절단 가수분해(asymmetric cleavage hydrolysis)로 5-치환 하이단토인(hydantoin)을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소(이후 하이단토인나아제로 칭함)에 대한 유전자를 갖는 새로운 형질전환체를 이용한 D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

[배경기술]

광학 활성 D-N-카르바모일-α-아미노산은 대응하는 D-α-아미노산으로 전환될 수 있고, 광학 활성 D-α-아미노산은 약제용 중간 화합물로서 중요한 화합물이다. 특히 산업적으로 유용한 화합물의 예로는 반합성 페니실린 및 반합성 세파로스포린의 제조를 위한 중간 화합물로서의 D-페닐글리신 및 D-(p-히드록시페닐) 글리신을 들 수 있다. D-N-카르바모일-α-아미노산을 제조하기 위해서는, 비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는, 미생물 효소반응이 공지되어 있고, 이러한 방법은 JP-A 53-91189, JP-A 53-44690, JP-A 53-69884, JP-A 53-133688 등에 기재되어 있다. 또한, 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키기 위한 효소인 하이단토인나아제와 관련된 유전자를 호열성 미생물로부터 수득하고, 이를 중온성 미생물에 삽입하여 하이단토인나아제 활성을 갖는 형질전환 미생물을 제조한다. 더욱이, WO94/00577에는, 하이단토인나아제 유전자 절편을 아그로박테륨()속에 속하는 미생물로부터 분리하고, 대장균() 또는 활성을 발현시키는 아그로박테륨 속의 미생물에 도입한다.

[발명의 목적]

미생물 효소 반응을 이용한 전술한 방법은, 원천이 공지된 미생물에 의한 효소의 수율은 불충분하고, 또한, 배양배지가 비싼것과 같은 결점이다. 또한, JP-A 62-87089에 기재된 형질전환 미생물에 있어서는, 효소활성의 향상은 하이단토인나아제 활성을 갖는 포자형성 호열성 미생물과 비교하여 단지 수회뿐이고, 효소의 수율은 불충분하다. 더욱이 전술한 형질전환 미생물을 이용하여, 5-치환 하이단토인을 비대칭 절단 가수분해시켜 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산을 생성 및 축적시키는 것은 종래의 기술에는 예가 없다. 본 발명은 이러한 문제점을 해소하고, 매우 높은 효소 생산성을 갖는 미생물을 만들어내고, 이렇게 수득한 효소원을 이용하여 효과적으로 D-N-카르바모일-α-아미노산을 제조하는 것이다.

[발명의 요약]

JP-A 62-87089 및 WO94/00577에는 재조합 DNA 기술을 이용하여 하이단토인나아제 생산(producer) 미생물을 수득하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 하이단토인나아제 유전자 제공용 미생물원은 본 발명에서 하이단토인나아제 유전자를 수득하기 위하여 사용하는 미생물과는 완전히 상이하다. 또한, 하이단토인나아제 유전자의 뉴클레이티드 서열 및 아미노산 서열은 본 발명의 것과 상당히 상이하다. 본 발명은 바실러스 에스피() KNK245(FERM BP-4863), 아그로 박테륨 에스피 KNK712 (FERM BP-1900) 또는 슈도모나스 에스피() KNK003A (FE RM BP-3181)에서 유래한 하이단토인나아제에 대한 유전자를 포함하는 DNA 절편 및 벡터 DNA의 재조합 DNA로 에스춰리키아(), 슈도모나스, 플라보박테륨 (), 바실러스(), 세라티스(), 아그로박테륨(), 코리네박테륨() 또는 브레비박테륨()속에 속하는 미생물과 같은 숙주 미생물을 형질전환시켜 수득한 형질전환체로 제조한 하이단토인나아제와 수성배지에서 5-치환 하이단토인을 반응시키는 것을 특징으로 하는 D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조방법을 제공한다. 본 발명에서 수득한 것과 같은 매우 높은 하이단토인나아제 생산성을 갖는 형질전환제는 지금까지 종래기술에 공지된바 없으며, 상당히 효율적이고 경제적인 D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조가 형질전환제의 효소 반응의 이용으로 가능해졌다. 이후, 본 발명은 첨부된 도면을 참조로하여 좀더 상세히 설명될 것이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명에서 사용하는 유전자를 포함하는 DNA 절편은 바실러스 에스피 KNK24 5, 아그로박테륨 에스피. KNK712 또는 슈도모나스 에스피, KNK003A로부터 수득할 수 있다. 아그로박테륨 에스피 KNK712 및 슈도모나스 에스피 KNK003A는 각각 FERM BP-1900 및 FERM BP-3181의 숙탁번호로 본출원인에 의하여 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(NIBH)에 기탁되었으며, WO92/10579에 상세히 기재되어 있는 공지된 균주이다. KNK245은 본 발명자에 의해 새로이 발견된 균주이고, FERM BP-4863 의 수탁번호로 1994년 11월 2일자로 NIBH에 기탁되었다.

바실러스 에스피, KNK245의 미생물학적 특성은 하기와 같다.

바실러스 에스피, KNK245

형태 막대, 섬유상

크기 0.5-0.8×3-10(㎛)

그람염색 +

포자 +

고유운동성 -

성장온도 37-60℃

성장pH 5.0-8.9

5% NaCl에서의 성장 -

7% NaCl에서의 성장 -

0.02% 아지드에서의 성장 -

0.001% 라이소자임에서의 성장 -

질산염 감수 -

전분 가수분해 +

타이로신 분해 +

카탈라아제 -

옥시다아제 +

인돌생산 -

탄수화물로부터 산의 생산

만노오스 (+)

크실로오스 -

아라비노오스 +

람노오스 _

글루코오스 +

푸록토오스 +

라피노오스 -

수크로오스 +

말토오스 +

락토오스 -

이런 균주들로부터 하이단토인나아제 유전자를 수득하기 위해서는, 통상적으로, 하기의 절차를 행한다. 처음에 게놈 DNA를 미생물 세포로부터, 추출한후, DNA를 적당한 제한효소, 예컨대, Sau3AI 등으로 부분적으로 가수분해시킨다. 생성된 절편을 벡터 DNA에 결합시켜 유전자 라이브러리로서 다양한 게놈 DNA 절편을 갖는 제조합 DNA분자를 수득한다.(참조, JP-A 58-126789 및 U.S. 특허 제 4,237,224).

이어서, 목적 유전자를 포함하는 재조합체를 상기 유전자 라이브러리로부터 선별한다. 예로서, 선별은 표식으로 발현 단백질의 효소활성을 이용한 발현 단백질의 검출로 행하거나, 선별은 단백질의 N-말단 서열의 분석, 대응하는 DNA 프로브의 합성 및 콜로니 교잡 등에 의한 목적 유전자의 존재의 검출로 행할 수 있다. 또한, 목적 유전자는 공지된 하이단토인나아제 염기 서열의 부분에 적합하도록 합성된 DNA 프라이머를 이용한 폴리머라아제 사슬 반응(PCR) 방법 또는 콜로니 교잡으로 수득할 수 있다. 일단 목적 유전자가 수득되면, 이의 뉴클레오티드 서열을 분석한다. 또한, 하이단토이나아제 생산 미생물 및 이 효소 유전자를 포함하는 재조합체를 배양한다. 생성된 효소는 정제하고, 생성된 단백질의 분자량을 측정한다. 동시에, 이의 N-말단 영역주위의 아미노산 서열을 비교하여, 하이단토인나아제 단백질을 코팅하는 뉴클레오티드 서열 부분의 단백질로의 번역개시부위를 결정하고, 단백질의 분자량과의 관계를 고려하여, 효소 단백질은 이 부위에서 종결코돈까지 걸친 유전자 부분에서 코딩되는 것을 확인하여, 목적 유전자를 입증한다. (Molec ular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laborator y Press, Chapters 4 & 13). 따라서 SEQ ID No. 1,2 및 3의 DNA 절편이 바실러스 에스피 KNK245, 아그로박테륨 에스피, KNK712 또는 슈도모나스 에스피, KNK300A로부터 수득된다. 공지된 바와 같이, 이렇게 수득된 효소를 코팅하는 유전자 및 / 또는 이를 함유한 DNA 절편은, 하나의 아미노산은 퉁상 복수의 염기 코돈에 대응하기 때문에, 상기 유전자 및/또는 DNA 절편에 대응하는 아미노산 서열을 코팅하는 또다른 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 절편과 동일하다.

본 발명에서 사용하는 벡터로는 플라스미드, 피아지 또는 이의 파생물을 사용할 수 있고, 이는 미생물로부터 유래되고, 에스췌리키아, 슈도모나스, 플라보박테륨, 바실러스, 세라티스, 아그로박테륨, 코리네박테륨 또는 브레비박테륨 속에 속하는 박테리아의 세포에서 자율증식할 수 있다.

예로서, 문헌["Guidelines on Recombinant DNA Experiments, Commentation, Q & A" (the Life Science Section of the Research Development Office in the Science and Technology Agency, Ed., revised September 16, 1987), pages 25 to 27 and 36 to 38]에 기재되어 있는 숙주 벡터계를 사용할 수 있다. 또한, 강력한 구조 프로모터를 갖도록 수정된 벡터의 적당한 부분에 연결된 번역 초기 부위를 갖는 재조합 DNA를 사용하여 생산할 효소의 양을 증가시킬 수 있다. 이절편의 양 말단은 제한 효소를 절단하여 적합한 벡터를 갖는 재조합체를 제조할 수 있다. 하이단토인나아제 생산 재조합 미생물은 에스춰리키아, 슈도모나스, 플라보박테륨, 바실러스, 세라티스, 아그로박테륨, 코리네박테륨 또는 브레비박테륨속에 속하는 미생물을 직접 형질전환시켜 제조할 수 있다. 또한 하이단토인나아제 생산 재조합 미생물은 전술한 속의 미생물의 직접적 형질전환없이 수득가능하다; 즉, 목적 유전자를 일단 대장균과 같은 기타 미생물을 이용하여 숙주 벡터계에 클론시킨후, 적당한 벡터를 갖는 재조합 DNA를 제조한다. 하기 문헌의 설명은 재조합체의 제조에 광범위하게 적용할 수 있다; 에스.엔.코엔 등에 특허된 U.S. 특허 No.4,237,244의 명세서: "Idenshi-sousa Jikken-hou(Experimental Method of GeneManipulation )" [Ed., Yasuyuko TAKAGI, Kohdan-sha Scientific(1980 )]: Me thod in Enzymology, 68, Recombinant DNA [Ed., Ray Mv, Academic Press(1970 )], JP-A 58-126789의 명세서 등.

목적 유전자는 클론되고, 이의 불필요한 DNA는 제거된다. 강력한 구조 프로모터를 갖도룩 수정된 벡터의 적당한 위치에 연결된 번역 개시 부위를 갖는 재조합 DNA를 사용하여 상기 숙주 세포를 형질전환시켜 생산코자하는 효소의 양을 증가시킬 수 있다. 형질전환제는 도입된 재조합 DNA를 발현시키는 통상적 영양 배양 배지에서 배양한다.유전자 DNA 또는 벡터 DNA로부터 유래한 특성이 재조합 DNA로 전달되었을 때, 적당한 성분을 특정 특성에 따라 배양 배지에 첨가할 수 있다. 이렇게 수득한 형질전환체를 효소공급원으로서, 취하기 위해서는, 이는 통상적 배양 배지를 이용하여 배양할 수 있다. 필요하다면, 또한 하이단토인 화합물, 우라실, 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드(IPTG)등의 첨가와 같은 효소 유도를 위해 처리를 하거나, 온도를 증가시킬 수 있다. 통상적으로, 형질전환제를 배양하기 위하여 사용하는 배양 배지는 탄소원, 질소 원 및 무기이온을 함유하는 통상적 배양 배지일 수 있다. 많은 경우에 있어서, 목적하는 결과는 추가로 비타민, 아미노산등과 같은 유기 미량영양물을 첨가하여 얻을 수 있다. 탄소원으로서, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 탄수화물, 아세트산과 같은 유기산, 알코올 등을 통상적으로 사용할 수 있다. 질소원으로는, 암모니아가스, 암모니아수, 암모늄염 등을 사용할 수 있다. 무기이온으로는, 포스페이트이온, 마그네슘이온, 칼륨이온, 철이온, 망간이온, 코발트이온, 니켈이온, 구리이온, 알루미늄이온, 몰리부덴이온 등을 이용할 수 있다. pH 및 온도를 각각 4 내지 25 내지 60℃의 적당한 범위로 조정하면서, 만일 배양을 호기 조건하 1 내지 10일동안 행하면, 목적하는 결과를 얻을 수 있다. 형질전환체로 제조한 효소의 효소활성은 예컨대, 형질전환체의 배양액, 이의 미생물 세포, 미생물 세포로부터 추출한 효소, 고정화 미생물 세포 등의 형태로 발휘될 수 있다. 미생물 세포로서는, 배양종결후 그 자체로의 임의의 배양액, 배양액으로부터 분리한 미생물 세포, 세정된 미생물 세포 등을 사용할 수 있다. 처리된 미생물 세포로는, 냉동건조된 미생물세포, 아세톤 건조 미생물 세포, 기계적으로 분쇄된 미생물 세포 등을 사용할 수 있다. 또한, 이런 처리된 미생물 세포로부터 수득한 하이단토이나아제 활성을 갖는 효소추출물, 이런 고정화 미생물 세포, 불용화처리된 미생물 세포, 고정화용 지지체(예, 이온교환수지)에 고정된 효소 단백질 등을 사용할 수 있다. 고정화방법의 예로는, JP-A 63-185382 등의 명세서 등을 들 수 있다. 고정화용 지지체로서는, Duolite A568 또는 DS17186(Rohm & Hass Co.: 등록상표)와 같은 페놀-포름알데히드 음이온 교환수지: 및 각종 아민, 아모늄염, 또는 디에탄올아민형의 작용기를 함유하는 각종 음이온 교환 수지, 예컨대, Amberlite IRA935, IRA901(Rohm & Hass Co.:등록상표)와 같은 페놀-포름알데히드 음이온 교환수지; 및 각종 아민, 아모늄염, 또는 디에탄올아민형의 작용기를 함유하는 각종 음이온 교환 수지, 예컨대, Amberlite IRA935, IRA945, IRA901(Rohm & Hass Co.: 등록상표), IEWATT oc1037(Bayer A.G.:등록상표) 및 Diaion EX-05(Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.: 등록상표)와 IEWATIT oc1037(Bayer A.G.: 등록상표) 및 로오스와 같은 기타 지지체를 또한 사용할 수 있다. 또한, 효소의 좀더 강력하고, 좀더 안정한 흡착을 위해서는, 통상, 가교제를 사용하며, 이의 바람직한 예는 글루타르알데히드이다. 사용하는 효소로는, 정제된 효소뿐만 아니라, 부분 정제 효소, 붕괴된 미생물 세포의 현탁액 및 무세포 추출물과 같은 상이한 정제도를 갖는 것을 사용할 수 있다. 고정화 효소의 제조는 통상적 방법, 예컨대, 지지체상에 효소를 흡착시킨후, 가교처리하여 행할 수 있다.

본 발명의 효소반응의 지질로서 사용하는 5-치환 하이단토인은 특별한 제한응 없으며, 이런 종류의 반응에서 통상적으로 사용되는 임의의 화합물일 수 있다. 이의 예로는 하기 화학식(1)로 나타낸 것이 포함된다.

[화학식 1]

화학식 1의 화합물에서 치환제 R은 광범위하게 선택할 수 있다. 약제의 중간 화합물과 같은 산업적으로 유용한 제품을 제공하기 위해서는, 바람직하게는 R은 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 알킬, 치환된 알칼, 아르알킬 또는 티에닐이다. 히드록시로 치환된 페닐의 경우에 있어서는, 히드록시의 수는 하나 이상일 수 있고, 임의의 o-, m- 및 p-위치에 위치할 수 있으며, 이의 전형적인 예는 p-히드록시페닐이다. 알킬기는 탄소수 1 내지 4의 기로서, 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산은 D-N-카르바모일-알라닌, D-N-카르바모일-발린, D-N-카르바모일-루이신, D-N-카르바모일-이소루이신등이다.

치환 알킬기는 히드록시, 알킬티오, 카르복실, 아미노, 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 아미도등으로 치환된 탄소수 1 내지 4의 알킬기로서, 대응하는 D-N-카르바모일-아미노산은 D-N-카르바모일-세린, D-N-카르바모일-트레오닌, D-N-카르바모일-메틴오닌, D-N-카르바모일-시스테인, D-N-카르바모일-아스파라긴, D-N-카르바모일 -글루타민, D-N-카르바모일-타이로신, D-N-카르바모일-트립토판, D-N-카르바모일-아스파르트산, D-N-카르바모일-글루탐산, D-N-카르바모일-히스티딘, D-N-카르바모일-라이신, D-N-카르바모일-아르기닌, D-N-카르바모일-시트룰린 등이다. 아르알킬기는 탄소수 7 또는 8의 기, 예컨대 벤질 또는 펜에틸로서, 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산은 D-N-카르바모일-페닐알라닌 등이다.

수성 배지로는, 물, 버퍼 또는 에탄올과 같은 유기 용매를 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 또한, 필요한 경우 미생물의 성장에 필요한 영양물, 산화방지제, 세정제, 보조효소, 히드록시아민, 금속 등을 또한 수성 배지에 첨가할 수 있다. 전술한 미생물의 미생물 세포로 수용성 배지에서 배양하면서, 미생물 세포를 특정 5-치환 하이단토인과 접촉시키는 경우에 있어서는, 5-치환 하이단토인 뿐만 아니라 탄소원, 질소원 및 무기원과 같은 미생물이 성장에 필요한 영양물을 함유하는 수성배지를 사용할 수 있다. 만일 여기에 비타민 및 아미노산과 같은 유기 미량 영양물을 추가하면, 많은 경우에 있어서 만족스런 결과를 얻을 수 있다. 탄소원으로는, 글루코오스, 수크로오스와 같은 탄수화물:아세트산과 같은 유기산: 알코올 등을 통상적으로 사용한다. 질소원으로는, 암모니아가스, 암모니아수, 암모늄염 등을 사용할 수 있다. 무기이온으로는, 포스페이트이온, 마그네슘이온, 칼륨이온, 철이온, 망간이온, 코발트이온, 니켈이온, 구리이온, 알루미늄이온, 몰리부덴이온, 등을 이용할 수 있다.

배양은 pH 및 온도를 각가 4 내지 8 및 25 내지 60℃의 적당한 범위로 조정하면서, 호기조건하에서 실행한다. 만일 배양을 1 내지 10일동안 행하면, 5-치환 하이단토인을 함유하는 수성 배지에서, 진술한 미생물의 배양액을 그대로 배양된 미생물 세포, 처리된 미생물 세포, 효소 추출물, 고정화 미생물 세포, 불용화 미생물 세포 또는 고정된 효소 단백질과 반응시키는 경우에 있어서는, 반응 혼합물은 10 내지 80℃의 적당한 온도 및 4 내지 9.5의 pH를 유지하면서, 얼마동안 정치시키거나 교반시킬 수 있다. 따라서, 만일 5 내지 100시간동안 이 코스를 행하면, 하이단토인나아제에 의한 기질의 D-특이 가수분해 반응 및 기질의 화학적 라세미화가 진행되고, 임의의 D, DL 또는 L-5치환 하이단토인은 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환되어 수성배지에 다량의 아미노산을 축적시킨다. 또한, 5-치환 하이단토인은 반응의 진행에 따랄 일부씩 첨가할 수 있다.

생성된 D-N-카르바모일-α-아미노산은 통상적 방법으로 분리 및 정제시킬 수 있다. D-α-아미노산은 전술한 방법으로 수득한 분리 및 정재된 D-N-카르바모일 -α-아미노산 또는 하이단토인나아제 반응 그 자체의 작용으로 수득되는 반응 혼합물을 이용하고, D-N-카르바모일-α-아미노산을 화학 또는 효소적으로 데카르바밀라아제활성을 갖는 효소로 대응하는 D-α-아미노산으로 전환시켜 수득할 수 있다.

하기의 실시예는 추가로 본 발명을 상세히 설명한다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 플라스미드 pAH1043의 제한효소지도이다. 도 2는 플라스미드 pTH102의 제한효소지도이다. 도 3은 플라스미드 pTH103의 제한효소지도이다. 도 4는 플라스미드 pTH104의 제한효소지도이다. 도 5는 플라스미드 pPHD301의 제한효소지도이다. 도 6은 플라스미트 pTHB301의 제한효소지도이다.

[실시예]

1. 토양으로부터 하이단토인나아제 활성을 갖는 미생물의 분리

생리식염수 2ml에 토양 시료 0.5g을 현탁시킨후, 현탁액을 정치시키고, 상충액 한 방울을 분리 아가 플레이트 배지(1.0%의 육추출물, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 이스트 추출물, 0.3%의 염화나트륨, 2.0%의 아가:pH 7.5)상에 바른다. 이것을 50℃에서 2일간 배양하고, 수득한 콜로니를 0.1%의 우라실 및 20ppm의 염화망간이 첨가된 동일한 분리 플레이트 배지로 옮긴후, 추가로 50℃에서 1일간 배양한다. 이렇게 수득한 미생물 세포를 100㎕의 반응 기질 용액[DU-(p-히드록시페닐)하이단토인 30mM, 아황산나트륨 0.1%, 탄산염 버퍼 50mM]에 현탁시키고, 이것들을 50℃에서 2시간동안 반응시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 TLC 플레이트상에 점적하고, 부탄올:아세트산:물(4:1:1)의 전개용매로 전개시킨후, 진한 염산중의 p-디메틸아미노벤즈알데히드의 10% 용액으로 색을 현상하고, 노란색 반점을 검출하여 N-카르바모일-p-히드록시페닐글리신을 생산하는 미생물 균주를 선별한다. 따라, 2740 콜로니중에서, 높은 하이단토인나아제 활성을 갖는 바실러스 에스피, KNK245(FERM BP-4863)가 분리된다.

2. 바실러스 에스피. KNK245로부터 유래한 하이단토인나아제의 N-말단 아미노산 시퀀싱

한분량의 바실러스 에스피, KNK245를 500ml 사까구찌 플라스크내의 100ml의 종배양배지(1.%의 육추출물, 1.0%의 펩톤. 0.5%의 이스트 추출물:pH 7.5)에 접종하고, 55℃에서 19시간동안 배양한다. 이어서, 이의 2%를 21 사까구찌 플라스크내의 500ml의 주배양배지(1.0%의 육추출물, 1.0%의 펩톤. 0.%의 우라실, 20ppm의 염화망간 사수화물:pH 7.5)에 접종하고, 55℃에서 19시간동안 배양한다. 미생물 세포를 이렇게 수득한 91의 배양 육즙으로부터 원심분리로 수거한다. 이를 20mM 황산마그네슘을 갖는 0.2M Tris-HCI(pH 8.0) 중에 현탁시키고, 초음파파괴 및 원심분리하여 무세포 추출물을 수득한다. 이어서, 추출물을 황산암모늄 침전 분별, DEAE-세파로오스 및 페닐-세파로오스를 이용하여 32회까지 정제시킨다. 추가로, 하이단토인나아제 결정을 황산암모늄을 이용하여 수득한다. 결정은 물에 용해시켜, 470A 모델 기상 단백질 시퀀서(어플라이드 바이오시스템사제)를 이용하여 분석한다. 그 결과, 하이단토인나아제는 N-말단에 아미노산서열을 갖는 것으로 밝혀졌다:

3. 아그로박테륨 에스피. KNK712(FERM BP-1900)으로부터 유래한 하이단토인나아제에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드의 수득.

하기의 방법에 따른 연구로, 하이단토인나아제 유전자는 WO92/10579에 기재된 플라스미드 pAHD101내에 클론된 DNA 절편상에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 대장균 JM109를 통상적인 방법에 따라 pAHD101로 형질전환 시키고, 100mg/l의 암피실린을 함유하는 50ml의 L-육즙(10g/l의 펩톤, 5g/l의 이스트 추출물, 5g/l 염화나트륨: pH 7. 0)에 접종한후, 37℃에서 16시간동안 배양한다. 이어서, 50ml의 배양 육즙을 채집한후, 상충액을 제거하고, 50ml의 기질 용액(0.5%의 5-(p-히드록시페닐)하이단토인, 0.05%의 트리톤 X-100, 005M 포스페이트 버퍼; 이스트상에 점적하고, 전개 및 히드로클로라이드중의 p-디메틸아미노벤즈알데히드의 용액으로 색현상시켜, 입증된 시료와 일치하는 D- N-카르바모일-(p-히드록시페닐) 글리신의 반점을 검출한다. 상기에 비추어, pAHD101의 형질전환제는 하이단토인나아제를 코딩하는 유전자를 발현시킨다는 것이 확인되었다. 삽입된 절편을 단축시키기 위하여 플라스미드 pAHD101을 Sacl 및 Sall로 절단하여 수득한 2.1kpb 절편을 SacI 및 Sall로 절단한 pUC18 절편에 결합시켜 플라스미드 pAHD1043 절편(도 1 참조)을 수득한다. 또한, 하이단토인나아제 유전자의 뉴클레오티드 시퀀싱은 DNA 서열 키트(어플라이드 바이오시스템사제)를 이용하여 실행한다. 결과는 SEQ ID No. 1에 나타내었다. 대장균 HB101을 플라스미드 pAHD1043으로 형질전환시켜 형질전환제 대장균 HB101 pAHD1043(FERM BP-4865)을 수득한다.

4. 바실러스 에스피. KNK245의 게놈 DNA 및 벡터 DNA의 재조합 DNA의 제조

바실러스 에스피. KNK245(FERM BP-4863)를 21의 육즙(10g/l dml dbrcncnfanf , 10g/l의 펩톤, 5g/l의 이스트 추출물;pH 7.5)에서 45℃로 24시간동안 배양하고, 미생물 세포를 채집한다. 게놈 DNA를 마머(marmur)방법에 따라 수득한 미생물 세포로부터 추출한다. 10단위의 BamHI를 1㎍의 게놈 DNA에 첨가하고, 이것을 37℃에서 16시간동안 반응시킨다. 한편, 플라스미드 pUC19를 BamHI로 완전히 절단하고, 여기에 T4DNA리가아제로 앞서 수득한 게놈 DNA를 결합시켜 다양한 재조합 플라스미드의 혼합물을 수득한다.

5. 바실러스 에스피, KNK245로부터 유래한 하이단토인나아제 유전자의 수득

실시예 3의 아그로박테륨 에스피 KNK712(FERM BP-1900) 및 JP-A 62-87089에 개시된 Lu1220 균주로부터 유래한 하이단토인나아제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기초로하여, 1155bp 개재 뉴클레오티드로부터 역방향쪽으로 배얗된 상기 뉴클레오티드 서열의 각각 상보가닥의 서열을 갖는 두 종류의 프라이며 1 및 2(표 1 참조)를 합성한다. 실시예 4에서 제조한 바실러스 에스피. KNK245로부터 유래한 게놈 DNA를 이용하여 합성된 두 개의 프라이머를 주형으로 이용하여 폴리머라아제 사슬반응(PCR)를 행하여 약 1.2kbp 절편을 수득한다. 이 절편의 뉴클레오티드 시퀀싱은 DNA서열 키드(어플라이드 바오시스템사제)를 이용하여 실행한다. 그결과, 이는 공지된 하이단토인나아제 유전자와 상당한 상보성을 가지며, 수득된 PCR 절편은 하이단토인나아제 유전자의 일부임이 밝혀졌다. 이어서, 이 절편의 각각의 상보가닥의 역방향 서열을 갖는 프라이머 5(표 1)를 3 및 4(표 1)을 합성한다. 추가로, 실시예 4의 재조합 DNA에서 벡터 부분의 서열을 갖는 프라이머 5(표 1)를 합성하고 상기 합성된 프라이머 및 후자 프라이머를 이용하고, 실시예 4의 재조합 DNA를 주형으로 사용하여, PCR를 실행하여 각각 하이단토인나아제 유전자의 전단부 반 및 하단부 반을 포함하는 두종류의 DNA 절편을 수득한다. 이 DNA 절편을 뉴클레오티드 시퀀싱시킨다. 실시예 2의 하이단토인나아제 단백질 N-말단 아미노산 서열로부터 기대되는 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 번역 코돈을 결정한다. 상기 졀정된 뉴클레오드티드 서열에 기초하여, 번역 코돈을 결정한다. 상기 결정된 뉴클레오티드 서열의 결과와 함께, 하이단토인나아제를 코딩하는 유전자의 전 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 상기 결정된 뉴클레오티드 서열의 결과와 함께, 하이단토인나아제를 코딩하는 유전자의 전 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 결과를 SEQ ID No.2에 나타내었다. 이어서, 이렇게 수득한 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 하이단토인나아제 유전자의 개시코돈 및 NdeI 제한효소 서열을 갖는 프라이머 7(표 1)를 합성하고, 실시예 4의 게놈 DNA를 주형으로 이용하여 PCR를 행하여 1.2kb 절편 1을 수득한다. 이어서, 상기 PstI 제한 부위에서 역방향 서열을 갖는 프라이머 8(표 1) 및 종결 코돈의 하류에 대응하는 서열 및 HindIII 제한부위를 갖는 프라이머 9(표 1)를 합성하고, 실시예 4의 게놈 DNA를 주형으로 이용하여 PCR를 행하여 0.25kb 절편 2를 수득한다. 절편 1을 NdeI 및 PstI로 제한하고, 절편 2는 PstI 및 HindIII로 제한하며, WO94/03613에 기재된 pCU19의 개선된 벡터 플라스미드인 pUCNT는 Ndel 및 HindIII로 제한한다. 제한된 절편을 T4DNA 리가아제로 결합시켜 하이단토인나아제 유전자를 포함하는 플라스미드 pTH102을 수득한다(도 2 참조).

6. 바실러스 에스피. KNK245 하이단토인나아제 유전자의 발현을 위한 재조합 DNA의 제조

절편 2의 제조에 사용하는 PstI 제한 부위를 갖는 프라이머 대신에, PstI 제한 부위 부근의 NdeI 제한 부위에서 하나의 뉴클레오티드가 치환되어 NdeI에 의한 절단이 차단된 합성 프라이머 10(표 1)을 사용하고, 종결코돈 주위의 서열을 갖는 프라이머 대신에, 종결 코돈의 하류에서의 뉴클레오티드의 수가 추가로 감소된 합성프라이머 11(표 1)를 사용하는 것만 제외하고, 실시예 5에서 절편 2를 수득하기위한 것과 동일한 방법에 따라, PCR을 행하여 0.25kb 절편 3를 수득한다. 이어서, 실시예 5에서 pTH102를 수득하기위한 것과 동일한 방법에 따라, 플라스미드 pTH102를 수득하기위한 것과 동일한 방법에 따라, 플라스미드 pTH103을 절편 1 및 3 및 pUCNT로부터 수득한다.(도 3 참조).

추가로, 종결코돈 주위의 하류 서열을 갖는 프라이머 11 대신에 프라이머 12(표 1)을 사용하는 것만 제외하고, pTH103을 수득하기위한 동일한 방법에 따라, pTH104를 수득한다. pTH104로 형질전환된 대장균 HB101은 대장균 HB104로 나타낸다. 이 균주는 FERM BP-4864의 수탁번호로 1994년 11월 2일자로 기탁되었다.

7. 슈도모나스 에스피. KMK003A(FERM BP-3181)로부터 유래한 하이단토인나아제 대한 유전자를 포함하는 플라스미드의 수득.

실시예 3에 기재된 것과 동일한 방법에 따라, 하이단토인나아제 유전자는 WO92/10579에 기재된 플라스미드 pPHD301에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 대장균 HB101을 pPHD 301로 형질전환시켜 대장균 HB101 pPHD301(FERM BP-4866)을 수득한다. pPHD301의 제한효소지도는 도 5에 나타내었다. 하이단토인나아제 유전자의 뉴클레오티드 시퀀싱은 실시예 3에 기재된 것과 동일한 방법에 따라 행한다. 결과는 SEQ ID No. 3에 나타내었다.

8. 수득한 형질전환체의 의한 5-(p-히드록시페닐)하이단토인의 D-N-카르바모일-(p-히도록시페닐)글리신으로의 전환

실시예 6에서 수득한 형질전환체, 대장균 HB101 pTH104를 100㎍/ml의 암피실린 및 400ppm의 염화망간 사수화물을 함유하는 50ml의 2YT 육즙(16g/l의 폴리펩티드, 10g/l의 이스트 추출물, 5g/l의 염화나트륨: pH 7.0)에 접종하고, 37℃에서 24시간 배양한다.

미생물 세포를 50ml의 이 배양육즙으로부터 채집하고, 0.05M 탄산염 버퍼(pH 8.7)에 현탁시켜 부피를 50ml로 만든다. 트리톤 X-100을 가하여 최종 농도를 0.05%로 만든다. 여기에 1.5g의 5-(p-히드록시페닐)하이단토인을 가하고, 혼합물을 6N 수산화나트륨으로 pH를 8.7로 조정하면서 질소기류하, 40℃에서 3시간동안 교반하면서 반응시킨다. 반응 종결후, 반응 혼합물을 원심분리시키고, 상충액을 진한 염산중의 p-디메틸아미노벤즈알데히드의 10% 용액으로 색현상시켜 D- N-카르바모일-(p-히드록시페닐) 글리신이 97.5%의 전환률로 수득된다. 반응 혼합물을 염산으로 pH 5로 조정한다. 원심분리후, 상충액을 농축하고, 진한 염산으로 pH 2 조정하여 4℃에서 저장한다. 침전된 결정을 여거하고, 물-에탄올로부터 재결정시켜 970mg의 D-N-카르바모일-(p-히드록시페닐)글리신을 수득한다. 융점 176-177℃, [α]D20=177.0℃ (c=0.5, 5% 에탄올).

9. 고정화 하이단토인나아제의 제조

실시예 7에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라 수득한 대장균 HB101 pTH104의 11의 배양 육즙으로부터 미생물 세포를 채집하고, 1mM 황산망간수에 현탁시켜 부피를 60ml로 만들고, pH는 8.5로 조정하고, 초음파로 분쇄한다. 이렇게 수득한 효소용액에, 음이온 교환수지 20g, pH 8.5로 평형된 Duolite A-568을 가하고, 혼합물을 15℃에서 20시간동안 교반하여 효소를 흡착시킨다. 이 혼합물에 글루타르알데히드를 가하여, 이의 최종 농도를 0.1%로 만들고, 혼합물을 1시간동안 교반하여 가교반응을 진행시킨다. 이어서, 수지를 채집하고 세정하고 고정화된 하이단토인나아제 20g을 수득한다.

10. 고정화 효소에 의한 5-(p-히드록시페닐) 하이단토인의 D-N-카르바모일-(p-히드록시페닐)글리신으로의 전환.

실시예 9의 수득한 고정화 하이단토인나아제 5g을 질소로 버블링된 40℃의 1mM 황산망간수 100ml에 가한다. 여기에 5-(p-히드록시페닐)하이단토인 3g을 가하고, 질소를 버블링시키면서 반응을 40℃에서 3시간동안 교반하면서 행한다. 반응 종결후, 반응 혼합물을 정치시키고, 흡수하여 반응 혼합물을 채집한다. 실시예 8에 기재된 것과 동일한 방법에 따라, 카르바모일 아미노산 생성물을 정제하여 D-N-카르바모일-(p-히드록시페닐)글리신 2.2g을 수득한다.

11. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서의 바실러스 에스피. KNK245 하이단토인나아제 유전자의 발현.

실시예 5에 기재된 것과 동일한 방법에 따라, 주형으로 바실러스 에스피. KNK245의 게놈 DNA를 이용하고, 프라이머 12 및 13(표 1)을 이용하여 PCR를 행하여 1.7kb 절편을 수득한다. 이것을 BamHI 및 HindIII로 절단하고, 동일한 방식으로 절단된 플라스미드 pHY300PLK(다까라 슈조)에 결합시켜 플라스미드 pTHB301을 수득한다. 이의 제한효소지도는 도 6에 나타내었다. 이 플라스미드 pTHB301은 전기영동(시마드조사 GTE-10 모델, 10KV/cm, 2ms)으로 바실러스 서브틸러스 ISW1214(다까라 슈조사 시판), 바실러스 서브틸리스 YS-11(IAM 12019) 또는 바실러스 서브틸리스 3115(IAM 1220)에 도입하고, 0.02g/l의 염화망간 사수화물이 첨가된 실시예 4에 나타낸 바와 같은 배양배지에서 37℃로 20시간 배양하다. 미생물 세포를 채집하고, 이를 초음파로 파괴하여 무세포 추출물을 제조한다. 그 결과, 각각의 하이단토인나아제 활성은 동일 조건하 바실러스 에스피. KNK245의 배양으로 수득한 것보다 약 2.2배 더 높다.

12. 호열성생물에서 바실러스 에스피. KNK245 하이단토인나아제의 발현

바실러스 스테아로써머필러스(Bacillus Stearothermophilus) IFO12550을 문헌 [J. Bact eriol., 149, 824(1982)]에 따른 원형질체 방법으로 실시예 11에서 제조한 플라스미드 pT HB301로 형질전환시키고, 실시예 11에 기재된것과 동일한 방법에 따라 배양하여 무세포 추출물을 제조한다. 하이단토인나아제 활성은 동일한 조건하에서 제조한 바실러스 에스피. KNK245보다 약 3.6배 더 높다.

[]

아그로박테륨 에스피. KNK712는 FERM BP-1900의 수탁번호로 1988년 5월 31일자로 기탁되었고;슈도모나스 에스피. KNK003A는 FERM BP-3181의 수탁번호로 1990년 12월 1일자로 기탁되었으며;바실러스 에스피. KNK245는 FERM BP-4863의 수탁번호로 1994년 11월 2일자로 기탁되었고;대장균 HB101 pAH1043는 FERM BP-4866의 수탁번호로 1994년 11월 2일자로 각각 부다페스트 조약하기의 기탁기관에 기탁되었다.

명칭:통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(전 발효연구소)

주소:일본 이바라끼껭 305 쓰꾸바시 히가시 1 쵸메 1-3

Claims

바실러스 에스피.() KNK245(FERM BP-4863). 아그로박테륨 에스피() KNK712(FERM BP-1900) 또는 슈도모나스 에스피 () KNK003A(FERM BP-318 1)에서 유래한, 비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소(이후, 하이단토인나아제로 칭함)를 코팅하는 유전자를 포함하는 DNA절편 및 벡처 DNA의 재조합 DNA로 숙주 미생물을 형질전환시켜 수득한 형질전환 미생물.
제1항에 있어서 숙주 미생물 에스춰리키아(), 슈도모나스(), 플라보박테륨(), 바실러스(), 세라티스() , 아그로박테륨(), 코리네박테륨() 또는 브레비박테륨()속에 속하는 미생물로부터 선택하는 형질전환 미생물.
제2항에 있어서, 형질전환 미생물 대장균() HB101 pTH102, 대장균 HB101 pTH103, 대장균 HB101 pTH104(FERM BP-4864), 대장균 HB101 pAH1043(FERM B P-4865) 또는 대장균 HB101 pPHD301(FERM BP-4866)인 형질전환 미생물.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 따른 형질전환 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소의 제조방법.
제4항의 방법으로 수득한 효소를 이용하는 것을 특징으로하는, D-N-카르바모일 -α-아미노산의 제조방법.
제5항에 있어서, 5-치환 하이단토인은 하기 화학식 1로 나타낸 화합물인 방법;

[화학식 1]

[식중, R은 페닐, 히드록시로 치환된 페닐, 알킬, 치환된 알킬, 아르알킬 또는 티에닐이다]
바실러스 에스피. KNK245(FERM BP-4863)로부터 유래한 하이단토인나아제를 코딩하는 DNA 절편과 플라스미드(pUCNT)의 재조합으로 수득되고, 임의의 도 2 내지 4의 제한효소지도를 갖는 재조합 플라스미드.
제7항에 있어서, 재조합 플라스미드는 pTH102, pTH103 또는 pTH104인 재조합 플라스미드.
아그로박테륨 에스피. KNK712(FERM BP-1900)로부터 유래한 하이단토인나아제를 코팅하는 DNA 절편과 플라스미드 pUC18의 재조합으로 수득할 수 있고, 도 1의 제한효소지도를 갖는 재조합 플라스미드.
제9항에 있어서, 재조합 프라스미드는 pAH1043인 재조합 플라스미드.
슈도모나스 에스피. KNK003A(FERM BP-3181)로부터 유래한 하이단토인나아제를 코딩하는 DNA 절편과 플라스미드 pUC18의 재조합으로 수득할 수 있고, 도 5의 제한효소지도를 갖는 재조합 플라스미드
제11항에 있어서, 재조합 플라스미드는 pPHD301인 재조합 플라스미드
비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소 활성을 갖는 단백질에 대한 유전자에 있어서, SEQI No. 2에 나타낸 첫 번째 472번째 아미노산의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자.
비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소 활성을 갖는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 DNA 절편에 있어서, 유전자는 SEQ ID No.2에 나타낸 첫 번째 내지 1776번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 동등한 것의 전부 또는 일부를 갖는 DNA 절편
비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소 활성을 갖는 단백질에 대한 유전자에 있어서, SEQ ID No.1에 나타낸 첫 번째 내지 457번째 아미노산의 아미노산 서열에 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자
비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소 활성을 갖는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 DNA 절편에 있어서, 유전지는 SEQ ID No.1에 나타낸 첫 번째 내지 2518번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 동등한 것의 전부 또는 일부를 갖는 DNA 절편
SEQ ID No.2에 나타낸 첫 번째 내지 472번째 아미노산의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 비대칭 절단 가수분해 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소활성을 갖는 효소 단백질.
SEQ ID No.1에 나타낸 첫 번째 내지 457번째 아미노산의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 비대칭 절단 가수분해 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소활성을 갖는 효소 단백질.
비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소 활성을 갖는 단백질에 대한 유전자에 있어서, SEQ ID No.3에 나타낸 첫 번째 내지 485번째 아미노산의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자.
비대칭 절단 가수분해로 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소 활성을 갖는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 DNA 절편에 있어서, 유전자는 SEQ ID No.3에 나타낸 첫 번째 내지 1569번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 동등한 것의 전부 또는 일부를 갖는 DNA 절편
SEQ ID No.3에 나타낸 첫 번째 내지 485번째 아미노산의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 비대칭 절단 가수분해 5-치환 하이단토인을 대응하는 D-N-카르바모일-α-아미노산으로 전환시키는 효소활성을 갖는 효소 단백질.

※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.