ES2281075T3 - Un procedimiento para producir d-n-carbamoil-alfa-aminoacidos. - Google Patents
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Abstract
UN PROCESO PARA PRODUCIR D - N - CARBAMOIL - AL - AMINOACIDO A PARTIR DE UNA HIDANTOINA 5 - SUSTITUIDA UTILIZANDO UNA HIDANTOINASA PRODUCIDA POR UN MICROORGANISMO TRANSFORMADO CON UN ADN RECOMBINANTE CON UN ADN VECTOR Y LOS FRAGMENTOS DE UN ADN QUE CONTIENEN GENES ASOCIADOS A UNA HIDANTOINASA QUE SE ORIGINA EN UN MICROORGANISMO ESPECIFICO PERTENECIENTE AL GENERO BACILLUS, AGROBACTERIUM O PSEUDOMONAS.
Description
Procedimiento para producir
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos.
Más específicamente, se refiere a un procedimiento para producir
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
utilizando un transformante novedoso que tiene un gen para una
enzima que convierte hidantoínas sustituidas en la posición 5 en
los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
correspondientes mediante hidrólisis de escisión asimétrica
(referida más adelante como hidantoinasa).
Los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
ópticamente activos se pueden convertir en los
D-\alpha-aminoácidos
correspondientes y los
D-\alpha-aminoácidos ópticamente
activos son compuestos importantes como compuestos intermedios para
fármacos. En concreto, los ejemplos de los compuestos
industrialmente útiles incluyen D-fenilglicina y
D-(hidroxife-
nil)glicina como compuestos intermedios para la producción de penicilinas semisintéticas y cefalosporinas semisintéticas.
nil)glicina como compuestos intermedios para la producción de penicilinas semisintéticas y cefalosporinas semisintéticas.
Para la producción de
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos,
se sabe que los procedimiento que utilizan reacciones enzimáticas
microbianas convierten hidantoínas sustituidas en la posición 5 en
los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
correspondientes mediante hidrólisis de escisión asimétrica y tales
procedimientos se describen en JP-A
53-91189, JP-A
53-44690, JP-A
53-69884, JP-A
53-133688 y similares.
Además, se obtiene un gen relacionado con la
hidantoinasa que es una enzima para convertir una hidantoína
sustituida en la posición 5 en el
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácido
correspondiente de microorganismos termófilos y se inserta en un
microorganismo mesófilo para producir microorganismos transformantes
que tienen actividad hidantoinasa. Además, en WO94/00577, se aísla
un fragmento génico de hidantoinasa de un microorganismo
perteneciente al género Agrobacterium y se introduce en
Escherichia coli o un microorganismo del género
Agrobacterium para expresar la actividad.
En los procedimientos descritos anteriormente en
los que se utilizan reacciones enzimáticas microbianas, existen
inconvenientes tales como que se sabe que la producción de enzima
por los microorganismos es insuficiente y, adicionalmente, los
medios de cultivo son costosos.
Por añadidura, con respecto a los
microorganismos transformantes descritos en JP-A
62-87089, la mejora de la actividad enzimática es
sólo de varias veces en comparación con los microorganismos
termófilos esporulantes que tienen actividad hidantoinasa y la
producción de enzima es todavía insuficiente.
Además, no existen ejemplos en la técnica
anterior en los que una hidantoína sustituida en la posición 5 se
somete a hidrólisis de escisión asimétrica utilizando el
microorganismo transformante anteriormente descrito para producir y
acumular el
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácido
correspondiente.
La presente invención es para resolver estos
problemas y se refiere a la creación de un microorganismo que tiene
una productividad enzimática muy alta y para la producción de
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
eficazmente utilizando la fuente enzimática obtenida de este
modo.
En JP-A 62-87089
y WO94/00577 se describe el método para obtener microorganismos
productores de hidantoinasa utilizando técnicas de ADN
recombinante. No obstante, las fuentes de microorganismos para
aportar los genes de hidantoinasa son completamente diferentes para
los microorganismos utilizados para obtener los genes de
hidantoinasa de la presente invención. Además, las secuencias de
nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de los genes de la
hidantoinasa son considerablemente diferentes de las de la presente
invención.
La presente invención es para proporcionar un
procedimiento para producir un
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácido
que comprende hacer reaccionar una hidantoína sustituida en la
posición 5 en un medio acuoso con hidantoinasa producida por un
transformante obtenido transformando un microorganismos anfitrión
tal como un microorganismo perteneciente al género Escherichia,
Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Agrobacterium,
Corynebacterium o Brevibacterium con un ADN recombinante
o un fragmento de ADN que contiene el gen para la hidantoinasa
derivado de Bacillus sp. KNK245 (FERM
BP-4863), y un ADN vector.
Hasta ahora no se conocía en la técnica un
transformante que tuviera una productividad de hidantoinasa muy
alta tal como el obtenido en la presente invención y la producción
extremadamente eficaz y económica de
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
se ha hecho posible utilizando la reacción de la enzima del
transformante.
Más adelante, la presente invención se
describirá con detalle con referencia a los Dibujos adjuntos.
La Fig. 1 es un mapa enzimático de restricción
del plásmido pAH1043.
La Fig. 2 es un mapa enzimático de restricción
del plásmido pTH102.
La Fig. 3 es un mapa enzimático de restricción
del plásmido pTH103.
La Fig. 4 es un mapa enzimático de restricción
del plásmido pTH104.
La Fig. 5 es un mapa enzimático de restricción
del plásmido pPHD301.
La Fig. 6 es un mapa enzimático de restricción
del plásmido pTHB301.
Un fragmento de ADN que contiene el gen que se
va a utilizar en la presente invención se puede obtener de
Bacillus sp. KNK245, Agrobacterium sp. KNK712 y
Pseudomonas sp. KNK003A que han sido consignados en el
National Institute de Bioscience and
Human-Technology, Agency de Industrial Science &
Technology (NIBH), Ministry de International Trade & Industry
por el presente solicitante bajo los números de acceso FERM
BP-1900 y FERM BP-3181,
respectivamente y son cepas conocidas descritas con detalle en
WO92/10579. Bacillus sp. KNK245 es una cepa recién
encontrada por los autores de la presente invención y ha sido
consignada en el NIBH el 2 de Noviembre de 1.994 bajo el número de
acceso FERM BP-4863.
Las características microbiológicas de
Bacillus sp. KNK245 son las siguientes.
Para obtener un gen de la hidantoinasa a partir
de estas cepas, normalmente, se lleva a cabo el siguiente
procedimiento.
En primer lugar, se extrae el ADN genómico de
una célula microbiana y después se hidroliza parcialmente el ADN
con una enzima de restricción adecuada, por ejemplo, Sau3AI o
similares. Los fragmentos resultantes se ligan al ADN vector para
obtener moléculas de ADN recombinantes que tienen varios fragmentos
de ADN genómico como genoteca (ver JP-A
58-126789 y Patente de los Estados Unidos Núm.
4.237.224).
Después, se selecciona de esta genoteca un
recombinante que contiene el gen deseado. Por ejemplo, la selección
se puede llevar a cabo mediante la detección de una proteína
expresada utilizando su actividad enzimática como indicación, o la
selección se puede llevar a cabo analizando la secuencia
N-terminal de una proteína, sintetizando una sonda
de ADN correspondiente y detectando la presencia del gen deseado
mediante hibridación de colonias o similares. Además, el gen
deseado se puede obtener mediante hibridación de colonias o el
método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando
cebadores de ADN que son porciones adecuadas sintetizadas de una
secuencia de bases de hidantoinasa conocida. Una vez obtenido el gen
deseado, se analiza su secuencia de nucleótidos. Además, se
cultivan un microorganismo productor de hidantoinasa y un
recombinante que contiene esta enzima. La enzima resultante se
purifica y se determina el peso molecular de la proteína resultante.
Al mismo tiempo, se determina la secuencia de aminoácidos de su
región N-terminal con un secuenciador de proteínas
de fase gaseosa o similares.
Después, comparando estas secuencias de
nucleótidos de ADN y las secuencias de aminoácidos
N-terminales, se determina el sitio de comienzo de
la traducción de la porción de la secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína hidantoinasa en la proteína, considerando la
relación con el peso molecular de la proteína, se confirma que la
proteína enzimática está codificada por una porción génica que se
extiende desde este sito al codón de terminación, verificándose de
ese modo el gen deseado (Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
2^{a} Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Capítulos 4 y 13).
Así, los fragmentos de ADN de los SEQ ID Nos. 1 and 2 se obtuvieron
a partir de Agrobacterium sp. KNK712 y Pseudomonas sp.
KNK003A. Como es bien sabido, el gen que codifica la enzima
obtenida de este modo y/o el fragmento de ADN que lo contiene son
equivalentes a fragmentos de ADN que tienen otra secuencia de
nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos
correspondiente al gen y/o fragmento de ADN anteriores puesto que
un aminoácido corresponde usualmente a una pluralidad de codones de
bases.
En cuanto al vector que se va a utilizar en la
presente invención, se pueden utilizar plásmidos, fagos o derivados
de los mismos, que están derivados de microorganismos y pueden
crecer autónomamente en células de bacterias pertenecientes al
género Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus,
Serratia, Corynebacterium o Brevibacterium.
Por ejemplo, se pueden utilizar los sistemas
anfitrión-vector descritos en "Guidelines on
Recombinant DNA Experiments, -Commentation, Q and A-" (the Life
Science Section de the Research Development Office in the Science
and Technology Agency, Ed., revised September 16, 1987), páginas 25
a 27 y 36 a 38. Además, se puede utilizar un ADN recombinante que
tiene un sitio de iniciación de la traducción conectado a una
posición adecuada de un vector que ha sido modificado para tener un
promotor estructural fuerte con el fin de aumentar la cantidad de
enzima que se va a producir. Ambos extremos de estos fragmentos son
escindidos con una enzima de restricción para producir un
recombinante con un vector apropiado. Se puede producir un
microorganismo recombinante productor de hidantoinasa transformando
directamente un microorganismo perteneciente al género
Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia,
Agrobacterium, Corynebacterium o Brevibacterium.
También se puede obtener un microorganismo
recombinante productor de hidantoinasa sin transformación directa de
un microorganismo del género anteriormente descrito; esto es, el
gen deseado se clona en un sistema vector anfitrión utilizando
otros microorganismos tales como Escherichia coli, después de
lo cual se produce un ADN recombinante con un vector apropiado.
La descripción de los siguientes documentos se
puede aplicar ampliamente a la producción de recombinantes: la
memoria de la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.237.244 de S. N.
Cohen et al.; "Idenshi-sousa
Jikken-hou (Experimental Method de Gene
Manipulation)" [Ed., Yasuyuki TAKAGI, Kohdan-sha
Scientific (1980)]; Method in Enzymology, 68, Recombinant
DNA [Ed., Ray Mv, Academic Press (1979)], la memoria de
JP-A 58-126789 y similares.
El gen deseado se clona y se elimina el ADN
innecesario. El ADN recombinante que tiene su sitio de iniciación
de la traducción conectado a una posición adecuada de un vector que
ha sido modificado para que tenga un promotor estructural fuerte se
puede utilizar para la transformación de la célula anfitriona
anterior para incrementar la cantidad de enzima que se va a
producir.
El transformante se cultiva en un medio de
cultivo nutriente convencional para expresar el ADN recombinante
introducido. Cuando se confiere un carácter derivado del ADN del
gen o del ADN del vector al ADN recombinante, se puede añadir un
componente apropiado al medio de cultivo según el carácter
concreto.
Para adoptar el transformante obtenido de este
modo como fuente de aporte de enzima, éste se puede cultivar
utilizando el medio de cultivo convencional. Si fuera necesario,
también es posible llevar a cabo un tratamiento para la inducción
enzimática tal como la adición de compuestos de hidantoína, uracilo,
isopropil-1-tio-\beta-D-galactósidos
(IPTG) o similares y un incremento de temperatura. Usualmente, el
medio de cultivo utilizado para cultivar el transformante puede ser
un medio de cultivo convencional que contiene fuentes de carbono,
fuentes de nitrógeno e iones inorgánicos. En muchos casos, se
pueden obtener los resultados deseados añadiendo adicionalmente
nutrientes traza orgánicos tales como vitaminas, aminoácidos y
similares. Como fuentes de carbono, se pueden utilizar
convenientemente carbohidratos tales como glucosa y sacarosa, ácidos
orgánicos tales como ácido acético, alcoholes y similares. Como
fuentes de nitrógeno, se pueden utilizar gas amoníaco, agua
amoniacal, sales de amonio y similares. Como iones inorgánicos se
pueden utilizar ión fosfato, ión magnesio, ión potasio, ión hierro,
ión manganeso, ión cobalto, ión níquel, ión cobre, ión aluminio,
ión molibdeno y similares.
Si el cultivo se lleva a cabo en condiciones
aerobias durante 1 a 10 días, mientras se ajustan el pH y la
temperatura a un intervalo apropiado de 4 a 8 y de 25 a 60ºC,
respectivamente, se pueden obtener los resultados deseados.
La actividad enzimática de una enzima producida
por el transformante se puede mostrar en forma, por ejemplo, de una
solución de cultivo del transformante, sus células microbianas, la
enzima extraída de las células microbianas, las células microbianas
inmovilizadas y similares.
\newpage
Como células microbianas, se pueden utilizar
cualquiera de la solución de cultivo tal cual tras la finalización
del cultivo, células microbianas separadas de la solución de
cultivo, células microbianas lavadas y similares. Como células
microbianas tratadas, se pueden utilizar células microbianas
liofilizadas, células microbianas secadas con acetona, células
microbianas puestas en contacto con tolueno o un detergente, células
microbianas tratadas con lisozima, células microbianas sometidas a
ultrasonicación, células microbianas trituradas mecánicamente y
similares. Además, se pueden utilizar extractos enzimáticos que
tienen actividad hidantoinasa obtenidos de estas células
microbianas tratadas, estas células microbianas inmovilizadas,
células microbianas tratadas insolubilizadas, proteínas enzimáticas
fijadas a un soporte para la inmovilización (v.g., resina de
intercambio aniónico) y similares. Para el método de
inmovilización, por ejemplo, se pueden mencionar la memoria de
JP-A 63-185382 y similares.
Como soporte utilizado para la inmovilización,
son adecuadas resinas de intercambio aniónico de
fenol-formaldehído tales como Duolite A568 o
DS17186 (Rohm & Haas Co.: marca registrada); y diferentes
resinas de intercambio aniónico que contienen diferentes aminas,
sales de amonio, o grupos funcionales de tipo dietanolamina, por
ejemplo, resinas de poliestireno tales como Amberlite IRA935,
IRA945, IRA901 (Rohm & Haas Co.: marca registrada), Lewatit
OC1037 (Bayer A.G.: marca registrada) y Diaion
EX-05 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.: marca
registrada). También se pueden utilizar otros soportes tales como
DEAE-celulosa.
Adicionalmente, con el fin de obtener la
absorción de enzimas más fuerte y más estable, usualmente, se
utilizan agentes de entrecruzamiento, siendo el glutaraldehído un
ejemplo preferido de los mismos. En cuanto a la enzima que se va a
utilizar, se pueden utilizar no sólo enzimas purificadas, sino
también aquellas con diferentes grados de purificación tales como
enzimas parcialmente purificadas, suspensiones de células
microbianas disgregadas y extractos sin células. La preparación de
las enzimas inmovilizadas se puede llevar a cabo según un método
convencional, por ejemplo, adsorbiendo enzimas sobre un soporte,
seguido de tratamiento de entrecruzamiento.
La hidantoína sustituida en la posición 5 que se
va a utilizar como sustrato de la reacción enzimática de la
presente invención no está específicamente limitada y puede ser
cualquier compuesto utilizado normalmente en esta clase de
reacción. Los ejemplos de la misma incluyen la representada por la
fórmula general (1):
El sustituyente R en el compuesto de fórmula (1)
se puede seleccionar de un amplio intervalo. Con el fin de
proporcionar productos industrialmente útiles como compuestos
intermedios de fármacos, preferiblemente, R es fenilo, fenilo
sustituido con hidroxi, alquilo, alquilo sustituido, aralquilo o
tienilo. En el caso del fenilo sustituido con hidroxi, el número de
hidroxi puede ser uno o más y pueden estar localizados en cualquiera
de las posiciones o, m y p, siendo su ejemplo típico
p-hidroxifenilo. El grupo alquilo es un grupo de 1 a
4 átomos de carbono de manera que el correspondiente
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácido
es
D-N-carbamoil-alanina,
D-N-carbamoil-valina,
D-N-carbamoil-leucina,
D-N-carbamoil-isoleucina
o similares. El grupo alquilo sustituido es un grupo alquilo de 1 a
4 átomos de carbono sustituido con hidroxi, alquiltio, carboxilo,
amino, fenilo, fenilo sustituido con hidroxi, amido o similares de
manera que el correspondiente
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácido
es
D-N-carbamoil-serina,
D-N-carbamoil-treonina,
D-N-carbamoil-metionina,
D-N-carbamoil-cisteína,
D-N-carbamoil-asparragina,
D-N-carbamoil-glutamina,
D-N-carbamoil-tirosina,
D-N-carbamoil-triptófano,
D-N-carbamoil-ácido aspártico,
D-N-carbamoil-ácido glutámico,
D-N-carbamoil-histidina,
D-N-carbamoil-lisina,
D-N-carbamoil-arginina,
D-N-carbamoil-citrulina
o similares. El grupo aralquilo es un grupo que tiene de 7 a 8
átomos de carbono, por ejemplo bencilo o fenetilo, de manera que el
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácido
es
D-N-carbamoil-fenilalanina
o similares.
Como medio acuoso, se pueden utilizar aquellos
que contienen agua, tampones o disolventes orgánicos tales como
etanol. Adicionalmente, cuando sea necesario, también se pueden
añadir al medio acuoso los nutrientes requeridos para el
crecimiento de los microorganismos, antioxidantes, detergentes,
coenzimas, hidroxilaminas, metales y
similares.
similares.
En el caso en el que, mientras se cultivan las
células microbianas de los microorganismos anteriores en un medio
soluble en agua, las células microbianas se ponen en contacto con
una hidantoína sustituida en la posición 5 concreta, se utiliza un
medio acuoso que contiene no sólo la hidantoína sustituida en la
posición 5 sino también los nutrientes requeridos para el
crecimiento de los microorganismos tales como fuentes de carbono,
fuentes de nitrógeno e iones inorgánicos. Si se añaden a esto
adicionalmente nutrientes traza orgánicos tales como vitaminas y
aminoácidos, se pueden obtener resultados satisfactorios en muchos
casos. Como fuentes de carbono, se utilizan convenientemente
carbohidratos tales como glucosa, sacarosa; ácidos orgánicos tales
como ácido acético; alcoholes y similares. Como fuentes de
nitrógeno, se pueden utilizar gas amoníaco, agua amoniacal, sales
de amonio y similares. Como iones inorgánicos, se pueden utilizar
ión fosfato, ión potasio, ión hierro, ión manganeso, ión cobalto,
ión níquel, ión cobre, ión aluminio, ión molibdeno y similares.
El cultivo se lleva a cabo en condiciones
aerobias, ajustando el pH y la temperatura a un intervalo apropiado
de 4 a 8 y de 25 a 60ºC, respectivamente. Si el cultivo se lleva a
cabo durante 1 a 10 días, las hidantoínas sustituidas en la
posición 5 se convierten sólo en
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
con alta eficacia.
Por otra parte, en el caso en el se permite que
la solución de cultivo de los microorganismos anteriores reaccione
tal cual con las células microbianas cultivadas, las células
microbianas tratadas, los extractos enzimáticos, las células
microbianas inmovilizadas, las células microbianas insolubilizadas o
las proteínas enzimáticas fijadas en un medio acuoso que contiene
una hidantoína sustituida en la posición 5 disuelta o suspendida,
se puede dejar que la mezcla de reacción repose durante algún tiempo
o se agite, mientras se mantiene a una temperatura apropiada de 10
a 80ºC y a un pH de 4 a 9,5. Así, si han transcurrido de 5 a 100
horas, prosiguen la reacción de hidrólisis específica de D del
sustrato por la hidantoinasa y la racemización química y cualquiera
de las hidantoínas D-, DL- o L- sustituidas en la posición 5 se
convierten en los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
acumulándose una gran cantidad de aminoácidos en el medio acuoso.
Además, se pueden añadir hidantoínas sustituidas en la posición 5
en porciones separadas con el progreso de la reacción.
El
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácido
producido se puede aislar y purificar mediante un método de
separación convencional.
Los
D-\alpha-aminoácidos se pueden
obtener fácilmente utilizando los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
aislados y purificados obtenidos mediante el método anteriormente
descrito o las mezclas de reacción tal cual obtenidas mediante la
reacción con hidantoinasa por la acción y convirtiendo los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
en los D-\alpha-aminoácidos
correspondientes químicamente o enzimáticamente con enzimas que
tienen actividad descarbamilasa.
Los siguientes Ejemplos ilustran adicionalmente
la presente invención en detalle.
Después de suspender 0,5 g de una muestra de
suelo en 2 ml de solución salina fisiológica, la suspensión se dejó
reposar y se untó una gota del sobrenadante sobre un medio en placa
de agar de aislamiento (1,0% de extracto de carne, 1,0% de peptona,
1,0% de extracto de levadura, 0,3% de cloruro de sodio, 2,0% de
agar; pH 7,5). Esto se cultivó a 50ºC durante 2 días y la colonia
obtenida se transfirió al mismo medio en placa de aislamiento al
que se añadieron el 0,1% de uracilo y 20 ppm de cloruro de manganeso
y después se cultivó adicionalmente a 50ºC durante 1 día. Las
células microbianas obtenidas de este modo se suspendieron en 100
\mul de una solución sustrato de reacción
[DL-(p-hidroxifenil)hidantoína 30 mM, sulfito
de sodio al 0,1%, tampón carbonato 50 mM] y se hicieron reaccionar
a 50ºC durante 2 horas. Después, la mezcla de reacción se aplicó a
una placa de TLC y se desarrolló con un disolvente de desarrollo de
butanol: ácido acético: agua (4 : 1 : 1), seguido de desarrollo de
color con una solución al 10% de
p-dimetilaminobenzaldehído en ácido clorhídrico
concentrado y detección de un punto de color amarillo para
seleccionar las cepas microbianas que producen
N-carbamoil-p-hidroxifenilglicina.
Así, entre 2.740 colonias, se aisló Bacillus sp. KNK245
(FERM BP-4863) que tenía una elevada actividad
hidantoinasa.
Se inoculó un asa de siembra de Bacillus
sp. KNK245 en 100 ml de un medio de cultivo de siembra (1,0% de
extracto de carne, 1,0% de peptona, 0,5% de extracto de levadura;
pH 7,5) en un matraz Sakaguchi de 500 ml y se cultivó a 55ºC
durante 19 horas. Después, el 2% de esto se inoculó en 500 ml de un
medio de cultivo principal (1,0 de extracto de carne, 1,0% de
peptona, 0,5% de uracilo, 20 ppm de tetrahidrato de cloruro de
manganeso; pH 7,5) en un matraz Sakaguchi de 2 litros y se cultivó
a 55ºC durante 19 horas. Las células microbianas se recogieron de 9
litros del caldo de cultivo obtenido de este modo mediante
centrifugación. Se suspendieron en Tris-HCl (pH
8,0) con sulfato de manganeso 20 mM, se sometieron a ultrasonicación
y se centrifugaron para obtener un extracto sin células. Después,
el extracto se purificó hasta 32 veces por medio de fraccionamiento
por precipitación con sulfato de amonio,
DEAE-Sefarosa y fenil-Sefarosa.
Adicionalmente, se obtuvieron cristales de hidantoinasa utilizando
sulfato de amonio. Los cristales se disolvieron en agua y se
analizaron utilizando 470 A Model Gas Phase Protein Sequencer
(fabricado por Applied Biosystems). Como resultado, se encontró que
la hidantoinasa tenía la secuencia de aminoácidos:
en su extremo
N.
Ejemplo de Referencia
1
Se encontró que el gen de la hidantoinasa estaba
localizado en el fragmento de ADN clonado en el plásmido pAHD101
descrito en WO92/10579 mediante un estudio según el siguiente
método. Se transformó Escherichia coli JM109 con pAHD101
según un método convencional, se inoculó en 50 ml de caldo L (10
g/litro de peptona, 5 g/litro de extracto de levadura, 5 g/litro de
cloruro de sodio; pH 7,0) conteniendo 100 mg/litro de ampicilina y
se cultivó a 37ºC durante 16 horas. Después, se recogieron 50 ml
del caldo de cultivo, seguido de la eliminación del sobrenadante,
suspensión de las células microbianas en 50 ml de una solución
sustrato (0,5% de
5-(p-hidroxifenil)hidantoína, 0,05% de
Triton X-100, tampón fosfato 0,05 M; pH 8,7) y
reacción a 37ºC durante 3 horas en una corriente de nitrógeno. La
mezcla de reacción se aplicó a una placa de TLC, se desarrolló y se
sometió a desarrollo de color con una solución de
p-dimetilaminobenzaldehído en hidrocloruro para
detectar un punto de
D-N-carbamoil-(p-hidroxifenil)glicina
en concordancia con una muestra auténtica. En vista de lo anterior,
se confirmó que el transformante de pAHD101 expresa un gen que
codifica una hidantoinasa.
Un fragmento de 2,1 kpb obtenido escindiendo el
plásmido pAHD101 con SacI y SalI para acortar el fragmento
insertado se ligó al fragmento pUC18 escindido de SacI y SalI para
obtener el plásmido pAH1043 (ver la
Fig. 1).
Fig. 1).
Además, se llevó a cabo la secuenciación de
nucleótidos del gen de la hidantoinasa utilizando el kit para la
secuencia de ADN (fabricado por Applied Biosystems). Los resultados
se muestran en el SEQ ID NO. 1.
Se transformó Escherichia coli HB101 con
el plásmido pAH1043 para obtener un transformante, Escherichia
coli HB101 pAH1043 (FERM BP-4865).
Se cultivó Bacillus sp. KNK245 (FERM
BP-4863) en 2 litros de un caldo (10 g/litro de
extracto de carne, 10 g/litro de peptona, 5 g/litro de extracto de
levadura; pH 7,5) a 45°C durante 24 horas y se recogieron las
células microbianas. El ADN genómico se extrajo de las células
microbianas obtenidas según el método Marmur. Se añadieron 10
unidades de BamHI a 1 \mug del ADN genómico y se hicieron
reaccionar a 37ºC durante 16 horas.
Por otra parte, el plásmido pUC19 se escindió
completamente con BamHI y a esto se ligó el fragmento de ADN
genómico obtenido antes con ADN ligasa de T4 para obtener una mezcla
de diferentes plásmidos recombi-
nantes.
nantes.
Basándose en las secuencias de nucleótidos de
los genes de la hidantoinasa derivados de Agrobacterium sp.
KNK712 (FERM BP-1900) del Ejemplo de Referencia 1 y
la cepa Lu1220 descrita en JP-A
62-87089, se sintetizaron dos clases de cebadores 1
y 2 (ver la Tabla 1) que tenían las secuencias de cada hebra
complementaria de las secuencias de nucleótidos anteriores
orientadas en direcciones opuestas desde los nucleótidos
interpuestos de 1.155 pb. Se llevó a cabo una reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) utilizando dos cebadores que se sintetizaron
utilizando ADN genómico derivado de Bacillus sp. KNK245
preparado en el Ejemplo 3 como molde para obtener un fragmento de
aproximadamente 1,2 kpb. La secuenciación de los nucleótidos de este
fragmento se llevó a cabo utilizando un kit para la secuencia de
ADN (fabricado por Applied Biosystems). Como resultado, tuvo una
alta complementación con un gen de la hidantoinasa conocido y se ha
encontrado que el fragmento de la PCR obtenido era una parte del
gen de la hidantoinasa. Después se sintetizaron dos cebadores 3 y 4
(Tabla 1) que tenían secuencias dirigidas opuestamente de las
respectivas hebras complementarias de este fragmento.
Adicionalmente, se sintetizó un cebador 5 (Tabla
1) que tiene la secuencia de la porción del vector en el ADN
recombinante del Ejemplo 3 y, utilizando los cebadores sintetizados
anteriormente y el último cebador y utilizando el ADN recombinante
del Ejemplo 3 como molde, se llevó a cabo la PCR para obtener dos
clases de fragmento de ADN que contenían las partes de la mitad
delantera y la mitad trasera del gen de la hidantoinasa,
respectivamente. Estos fragmentos de ADN se sometieron a
secuenciación de nucleótidos. Basándose en las secuencias de
nucleótidos esperadas de la secuencia de aminoácido
N-terminal de la proteína hidantoinasa del Ejemplo
2, se determinó el codón de traducción. Junto con los resultados de
las secuencias de nucleótidos anteriormente determinadas, se
determinó la secuencia de nucleótidos completa del gen que codifica
la hidantoinasa.
Después, basándose en la secuencia de
nucleótidos obtenida de este modo se sintetizaron un cebador 6
(Tabla 1) que tenía una secuencia junto al codón de iniciación del
gen de la hidantoinasa y un sitio de restricción NdeI y un cebador
7 (Tabla 1) que tenía una secuencia junto al sitio de restricción
PstI en el gen de la hidantoinasa y se llevó a cabo la PCR
utilizando el ADN genómico del Ejemplo 3 como molde para obtener un
fragmento 1 de 1,2 kb. Después se sintetizaron un cebador 8 (Tabla
1) que tenía una secuencia dirigida opuestamente en el sitio de
restricción PstI anterior y un cebador 9 (Tabla 1) que tenía una
secuencia correspondiente a la región aguas abajo del codón de
terminación y del sitio de restricción HindIII y se llevó a cabo la
PCR utilizando el ADN genómico del Ejemplo 3 como molde para
obtener un fragmento 2 de 0,25 kb. El fragmento 2 se trató con las
enzimas de restricción PstI y HindIII y pUCNT que era un plásmido
vector mejorado de pUC19 descrito en WO94/03613 se trató con las
enzimas de restricción NdeI y HindIII. Los fragmentos sometidos a
restricción se ligaron con ADN ligasa de T4 para obtener el
plásmido pTH102 que contenía el gen de la hidantoinasa (ver la Fig.
2).
Se llevó a cabo una PCR de la misma manera que
para obtener el fragmento 2 en el Ejemplo 4 para obtener un
fragmento 3 de 0,25 kb excepto que, en lugar del cebador que tiene
el sitio de restricción PstI utilizado para la producción del
fragmento 2, se utilizó un cebador 10 sintetizado (Tabla 1) donde se
sustituyó un nucleótido en el sitio de restricción NdeI próximo al
sitio de restricción PstI para bloquear la escisión con NdeI y en
lugar del cebador que tenía la secuencia junto al codón de
terminación, se utilizó un cebador 11 sintetizado (Tabla 1) donde
se redujo adicionalmente el número de nucleótidos aguas abajo del
codón de terminación. Después, de la misma manera que para obtener
pTH102 en el Ejemplo 4, se obtuvo el plásmido pTH103 a partir de los
fragmentos 1 y 3 de pUNCT (ver la Figura 3).
Adicionalmente, de la misma manera que para
obtener pTH103, se obtuvo pTH104 excepto que, en lugar del cebador
11 que tiene la secuencia aguas abajo junto al codón de terminación,
se utilizó el cebador 12 (Tabla 1).
Escherichia coli HB101 transformada con
pTH104 se denominó Escherichia coli HB101 pTH104. Esta cepa
ha sido consignada en el National Institute de Bioscience and
Human-Technology el 2 de Noviembre 2 de 1994 bajo el
número de acceso FERM BP-4864.
Ejemplo de Referencia
2
De la misma manera que se ha descrito en el
Ejemplo de Referencia 1, se encontró que el gen de la hidantoinasa
estaba localizado en el plásmido pPHD301 descrito en WO92/10579.
Escherichia coli HB101 fue transformada
con pPHD301 para obtener Escherichia coli HB101pPHD301 (FERM
BP-4866). El mapa enzimático de restricción de
pPHD301 se muestra en la Fig. 5.
La secuenciación de los nucleótidos del gen de
la hidantoinasa se llevó a cabo de la misma manera que se ha
descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los resultados se muestran
en la SEQ. No. 2.
El transformante obtenido en el Ejemplo 5,
Escherichia coli HB101pTH104 se inoculó en 50 ml de caldo 2YT
(16 g/litro de polipeptona, 10 g/litro de extracto de levadura, 5
g/litro de cloruro de sodio; pH 7,0) que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina y 400 ppm de tetrahidrato de cloruro de manganeso y se
cultivó a 37ºC durante 24 horas. Las células microbianas se
recogieron de 50 ml de este caldo de cultivo y se suspendieron en
tampón carbonato 0,05 M (pH 8,7) para completar el volumen hasta 50
ml. Se añadió Triton X-100 de manera que la
concentración final fue del 0,05%. A esto se le añadieron 1,5 g de
5-(p-hidroxifenil)hidantoína y se dejó
reaccionar la mezcla agitando a 40ºC durante 3 horas en la
corriente de nitrógeno ajustando el pH a 8,7 con hidróxido de sodio
6 N. Después de completar la reacción, la mezcla de reacción se
centrifugó y el sobrenadante se sometió a la determinación
colorimétrica de
D-N-carbamoil-(p-hidroxifenil)glicina
mediante desarrollo de color con una solución al 10% de
p-dimetilaminobenzaldehído en ácido clorhídrico
concentrado. Como resultado la
D-N-carbamoil-(p-hidroxifenil)glicina
se produjo con un rendimiento de conversión del 97,5%.
La mezcla de reacción se ajustó a pH 5 con ácido
clorhídrico. Después de la centrifugación, el sobrenadante se
concentró, se ajustó a pH 2 con ácido clorhídrico conc. y se
almacenó a 4ºC. Los cristales precipitados se separaron mediante
filtración y se recristalizaron en agua-etanol para
obtener 970 mg de
D-N-carbamoil-(p-hidroxifenil)glicina,
p.f. 176-177ºC. [\alpha]_{D}^{20} =
-177,0º (c=0,5, etanol al 5%).
Las células microbianas se recogieron de 1 litro
de un caldo de cultivo de Escherichia coli HB101pTH104
obtenido de la misma manera que en el Ejemplo de Referencia 2
suspendido en sulfato de manganeso 1 mM acuoso para completar el
volumen hasta 60 ml, se ajustó a pH 8,5 y se rompió mediante
ultrasonicación. A la solución enzimática obtenida de este modo se
le añadieron 20 g de una resina de intercambio aniónico, Duolite
A-568 equilibrada a pH 8,5 y la mezcla se agitó a
15ºC durante 20 horas para adsorber la enzima. A esta mezcla se le
añadió glutaraldehído de manera que la concentración final de la
misma fuera del 0,1% y la mezcla se agitó durante 1 hora para que
prosiguiera la reacción de entrecruzamiento. Después, la resina se
recogió y se lavó para obtener 20 g de una hidantoinasa
inmovilizada.
Se añadieron 5 g de la hidantoinasa inmovilizada
obtenida en el Ejemplo 9 a 100 ml de sulfato de manganeso 1 mM
acuoso a 40ºC en el que se hizo burbujear nitrógeno. A esto se le
añadieron 3 g de 5-(p-hidroxifenil)hidantoína
y la reacción se llevó a cabo agitando a 40ºC durante 3 horas
haciendo burbujear nitrógeno. Después de completar la reacción, la
mezcla de reacción se dejó estar y se aspiró para recoger la mezcla
de reacción. De la misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 6,
el carbamoil-aminoácido producto se purificó para
obtener 2,2 g de
D-N-carbamoil-(p-hidroxifenil)glicina.
De la misma manera que se ha descrito en el
Ejemplo 4, se llevó a cabo la PCR utilizando el ADN genómico de
Bacillus sp. KNK245 como molde y utilizando los cebadores 12
y 13 (Tabla 1) para obtener un fragmento de 1,7 kb. Este se
escindió con BamHI y HindIII y se ligó al plásmido pHY300PLK (Takara
Shuzo) que había sido escindido de una manera similar para obtener
el plásmido pTHB301. Su mapa enzimático de restricción se muestra en
la Fig. 6.
El plásmido pTHB301 se introdujo en Bacillus
subtilis ISW1214 (asequible de Takara Shuzo), Bacillus
subtilis YS-11 (IAM12019) o Bacillus
subtilis 3115 (IAM12020) mediante electroporación (utilizando
Shimadzu Corporation GTE-10 Model, 10 KV/cm, 2 ms)
y se cultivó en el medio de cultivo como se ha mostrado en el
Ejemplo 3 a lo que se añadieron 0,02 g/litro de tetrahidrato de
cloruro de manganeso a 37°C durante 20 horas. Se preparó una
extracción sin células recogiendo las células microbianas y
rompiéndolas con ultrasonicación. Como resultado, cada actividad
hidantoinasa fue aproximadamente 2,2 veces superior a la obtenida
mediante el cultivo de Bacillus sp. KNK245 en las mismas
condiciones.
Se transformó Bacillus stearothermophilus
IFO12550 con el plásmido pTHB301 preparado en el Ejemplo 9 mediante
el método del protoplasto según J. Bacteriol., 149, 824
(1982) y se cultivó de la misma manera que se ha descrito en el
Ejemplo 11 para preparar un extracto sin células. La actividad
hidantoinasa fue aproximadamente 3,6 veces superior a la de
Bacillus sp. KNK245 preparada en las mismas condiciones.
Como se ha descrito antes, según la presente
invención, se puede crear un microorganismo que tiene una actividad
hidantoinasa muy alta y, utilizándolo como fuente de enzima, se
pueden producir
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos,
eficazmente.
Agrobacterium sp. KNK712 ha sido
consignado el 31 de mayo de 1.988 bajo el número de acceso FERM
BP-1900; Pseudomonas sp. KNK003A ha sido
consignado el 1 de Diciembre de 1.990 bajo en número de acceso FERM
BP-3181; Bacillus sp. KNK245 ha sido
consignado el 2 de Noviembre de 1.994 bajo el número de acceso FERM
BP-4863; y Escherichia coli HB101 pAH1043 ha
sido consignado el 2 de Noviembre de 1.994 bajo el número de acceso
FERM BP-4866 en la siguiente Autoridad
Consignataria bajo el Tratado de Budapest, respectivamente.
Nombre: National Institute de Bioscience and
Human-Technology (antiguamente Fermentation Research
Institute), Agency de Industrial Science & Technology, Ministry
de International Trade & Industry Address: 1-3,
Higashi 1 chome Tsukuba-shi
Ibaraki-ken 305, Japón.
SEQ ID NO: 1 |
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2105 |
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico |
SECUENCIA: |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEQ ID NO: 2 |
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1569 |
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico |
SECUENCIA: |
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Un microorganismo transformante obtenible
transformando un microorganismo anfitrión con un ADN recombinante
de un fragmento de ADN que contiene un gen que codifica una enzima
que convierte hidantoínas sustituidas en la posición 5 en los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
correspondientes mediante hidrólisis de escisión asimétrica
(referida más adelante como hidantoinasa) derivada de
Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863) y un ADN
vector.
2. Un microorganismo transformante según la
reivindicación 1, donde el microorganismo anfitrión se selecciona
entre un microorganismo perteneciente al género Escherichia,
Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Agrobacterium,
Corynebacterium o Brevibacterium.
3. Un microorganismo transformante según la
reivindicación 2, donde el microorganismo transformante es
Escherichia coli HB101 pTH102, Escherichia coli HB101
pTH103, Escherichia coli HB101 pTH104 (FERM
BP-4864).
4. Un procedimiento para producir una enzima que
convierte hidantoínas sustituidas en la posición 5 en los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
correspondientes mediante hidrólisis de escisión asimétrica de la
misma que comprende utilizar el microorganismo transformante según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un procedimiento para producir
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
que comprende utilizar la enzima obtenida mediante un procedimiento
según la reivindicación 4.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5,
donde la hidantoína sustituida en la posición 5 es un compuesto
representado por la fórmula general (1):
donde R es fenilo, fenilo
sustituido con hidroxi, alquilo, alquilo sustituido, aralquilo o
tienilo.
7. Un plásmido recombinante obtenido mediante la
recombinación de un fragmento de ADN que codifica una hidantoinasa
derivada de Bacillus sp. KNK245 (FERM
BP-4863) y el plásmido pUCNT que tiene el mapa
enzimático de restricción de cualquiera de las Figs. 2 a 4.
8. Un gen para una proteína que tiene una
actividad enzimática para la conversión de hidantoínas sustituidas
en la posición 5 en los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
correspondientes mediante hidrólisis de escisión asimétrica de las
mismas, donde la proteína puede derivar de Bacillus sp KNK245
(FERM BP-4863).
9. Una proteína enzimática obtenible mediante el
método de la reivindicación 4.
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