JPH03133386A - 固定化微生物を用いた酵素反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素を産生ずる微生物を天然多糖系の包括基材
で固定化した固定化微生物ビーズを用いて酵素反応を行
なう方法に関し、更に詳しくは酵素反応の結果生成する
酸性物質を中和するためにアルカリを投入しながら反応
を行なう酵素反応に適用されるものである。

〔従来技術と問題点〕

Ｄ−α−アミノ酸は抗生物質アモキシリンを製造する際
の原料として使用されており、現在、５置換ヒダントイ
ン類をヒダントイナーゼを用いて不斉加水分解してカル
バモイル誘導体を作り、次いで酸性条件下で亜硝酸ソー
ダを作用させることによって製造されている。

ヒダントイナーゼを生産する微生物については既に数多
く知られており（特開昭５３−４４６９０、特開昭５３
−６９８８４、特開昭５３−９１１８９、特開昭５３−
１３３６８８）、これらの微生物が産生ずるヒダントイ
ナーゼを利用してＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸
を製造するには、微生物を含んだ培養液中に原料物質で
ある５置換ヒダントイン類を投入して培養液中で酵素反
応を実施している。反応終了後の培養液はそのまま次の
工程（亜硝酸反応）で処理されるので、ヒダントイナー
ゼは１回使用されるだけであり、また反応液は反応生成
物であるＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の他に菌
体、培地成分、菌体分泌物を含んだ汚／ｒｉＪ液の状態
である。このような製造方法は次に述べる２つの欠点を
持つ；（１）ヒダントイナーゼの使用は１回限りである
ので有効利用が計れず、培養コストが高い。

（２）純度の高いＤ−α−アミノ酸を回収する際の精製
操作が煩雑であり、且つコストが大きい。

このような問題を克服するために、以前からヒダントイ
ナーゼの固定化が試みられてきた（特開昭５６−５８４
９３、特開昭５４−８４０８６）が、酵素自体が不安定
なため工業的には問題を含み実用化には到らなかった。

ところが、最近ある種の苗株が産生ずるヒダントイナー
ゼが比較的安定しており、１回反応に使用した後の残存
酵素活性が９０％以上という結果が得られている。この
ような安定したヒダントイナーゼに対しては工業的に固
定化する利点が出てきており、実際に固定化方法が開示
されている（特開昭６３−１８５３８２）。上記特開昭
６３１８５３８２は適当な支持体上に固定化したヒダン
トイナーゼを安定化用２価金属イオンの下で反応させる
方法を開示しているが、固定化方法自体は既知であり、
酵素の保護作用を有する２価の金属イオンを存在させる
ことを特徴としている。

一方、本発明者らは微生物や組繊細胞の固定化基材とし
てよく使用されているアルギン酸カルシウム等の天然多
糖系の包括基材ビーズ内にヒダントイナーゼ生産菌等を
包括させ、ヒダントイナーゼ等を再利用する方法につい
て検討を行なってきたが、酵素反応を繰り返し実施して
いる間にヒダントイナーゼ生産菌等を包括したビーズが
表面から溶解ないし剥離する現象が観察された。このよ
うな現象が続けば、該ビーズ内に閉じ込めた菌体が洩れ
出すことになるので、ビーズを繰り返し使用する毎に反
応速度が急激に低下していくことは避けられない。

ヒダントイナーゼ反応を例として更に詳述すれば、原料
物質である５−置換ヒダントイン類は一般的に水難溶性
であって速やかに溶解させるためにはヒダントイン粒子
を均一に分散させる必要がある。一方、反応生成物であ
るカルバモイル誘導体は水溶性であるが酸性物質であり
、ＮａＯＨ，Ｎ１１３等で中和する必要がある。このた
め、反応槽内は流動状態下に置かれ、反応が進行するに
つれてＮａ゛やＮＨ，”濃度が増し、包括ビーズはこの
ような状態に置かれるので該ビーズは歪みを受けやすく
、Ｃａ”とＮａ’　、ＮＨ４゜との置換も起こりやすい
。

（問題点を解決するための手段〕 本発明者らはかかる実情に鑑み、上記した如き包括ビー
ズの溶解ないし剥離という問題を解消するべく鋭意研究
の結果、本発明に到達した。

即ち、本発明は酵素反応の結果生成する酸性物質を中和
するためにアルカリを投入しながら反応させる酵素反応
において、酵素を産生ずる微生物を天然多糖系包括基材
ビーズ内に包括した後、前記ビーズをグルタルアルデヒ
ド単独で架橋又はポリエチレンイミンもしくはジアミン
類とグルタルアルデヒドとで架橋を行なって得られた固
定化微生物ビーズを用いるとともに、前記包括基材と結
合する能力を有する金属イオンを反応液に添加すること
を特徴とする固定化微生物を用いた酵素反応方法を内容
とするものである。

以下、ヒダントイナーゼを例に挙げて説明するが、本発
明はこれにのみ限定されるものではないことは勿論であ
る。

例えばアルギン酸カルシウムゲルは室温以下の低い温度
下でもアルギン酸をＣａ”°の水溶液中に滴下するだけ
で生成するので、熱に弱い微生物や酵素、動植物の組繊
細胞の固定化によく用いられるが、格子の目が荒く酵素
程度の分子量の物質は完全に固定化できず徐々に洩れ出
すといわれている。

バクテリア以上の微生物であればこのような洩れはない
が、自己消化、溶菌酵素の作用等で酵素が菌体外に洩れ
た場合には、やはり酵素の洩れが起こる。酵素や微生物
にグルタルアルデヒドを作用させて架橋を促すと、酵素
同志、酵素と＆［ｌ織とが架橋により高分子化されるの
で、目の荒いゲルでも洩れにくくなる。ポリエチレンイ
ミンやジアミン類を添加する場合も同様であり、種々の
方法が報告されている（特開昭５７−３９７９４、特開
昭５９−１４７８９．１４７９０、特開昭６３−３６７
８５、特開昭６３−１０５６７８）。ところが、ヒダン
トイナーゼ反応のようにｐＨ８〜９の条件でＮａ’　、
ＮＨ，’が蓄積する反応系では、アルギン酸カルシウム
ビーズのＣａ”結合部位がＮａ”やＮＨｏに置換して水
溶性に戻るためか、徐々にほぐれてきて架橋処理を促し
ても基材自体の崩壊を防がなければ包括ビーズは長期間
使用できない。本発明者らは、酵素反応中に起こる包括
基材の溶解もしくは剥離を防ぐにはアルギン酸と強く結
合する金属イオンＣａ”、　Ｂａ”、　Ｓｒ”Ｚ　Ａｌ
３＋等を反応液中に添加することが有効であることを見
出した。

本発明に用いられる天然多糖系の包括基材としてはアル
ギン酸カルシウムの他に、ペクチン酸カルシウム等が挙
げられる。これらは最もマイルドな包括ゲル化剤であり
、それ故に使用される範囲が広いので非常に有用である
。

包括基材で微生物を包括したビーズを形成後、架橋処理
を施しビーズの溶解を抑え、保型性を高める。架橋処理
剤としてはグルタルアルデヒドのみでもよいし、ジアミ
ン類ないしポリエチレンイミンとグルタルアルデヒドで
あってもよい。ジアミン類としてはエチレンジアミン、
トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ペン
タメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等が挙げ
られ、これらは単独又は２種以上混合して使用される。

ポリエチレンイミンとしては数万〜数十万の分子量を有
するものが使用できるが、３００００〜７００００の分
子量のものが好適である。グルタルアルデヒド濃度とし
ては０．１〜２００１、ジアミン類、ポリエチレンイミ
ン濃度としては１〜１００ｍＭが好適である。特に数万
の分子量のポリエチレンイミンとグルタルアルデヒドを
包括ビーズの内で架橋すると包括基材のゲルと絡み合っ
てほぐれにくくなり、酵素の洩れが一層効果的に防止で
きる。

反応中に添加する金属イオンとしてはアルギン酸やペク
チン酸等の包括基材との結合力が強い金属イオンであれ
ばよいが、酵素に対し■害作用を有するものは除外され
る。具体的には、Ｃａ”、　Ｂａ”、　Ｓｒ”、　Ａｌ
３＋等から少なくとも１種が選択されるが、就中Ｃａ”
が好適である。添加する金属イオン濃度は好ましくは０
．１〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭである。

本発明は酵素反応の結果酸性物質が生成し、これを中和
するためにアルカリを投入しながら反応させる酵素反応
、特に至適ｐＨがアルカリ側にある場合に効果があり、
具体的にはヒダントイナーゼ反応等が挙げられる。

〔実施例］ 以下、本発明を実施例及び比較例を挙げて更に詳細に説
明するが、本発明の範囲はこれらにより何ら制限を受け
るものではない。

比較例１ ヒダントイナーゼを産生ずるバチルス・スファエリカス
（Ｂａｃｊｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）　ＩＦＯ
０３５２５の培養液（菌体濃度２　ｇ−ｄｒｙ／　ｌ、
ヒダントイナーゼ活性１ｕ／ｄ）　１０００ｒｎｌｌを
２〜３回生理食塩水で洗浄後遠心分離して菌体濃縮１５
０ｄを得た。一方、アルギン酸ソーダ３．７５　ｇを２
００ｄの生理食塩水に溶解し、次いで菌体濃縮液５０ｄ
を加えてよく混合し、菌体を含んだ１．５％アルギン酸
ソーダ水？８液（菌体濃縮率４倍）を得た。次に、この
液を針径０．３　ｍｍφの注射器を用いて２％塩化カル
シウム水溶液中に滴下して粒径３ＷＬｍφの菌体を含ん
だアルギン酸カルシウムビーズを得た。

一方、容量２１の反応器に純水１０００＋１１１！を仕
込み、ＤＬ−５−（ヒドロキシフェニル）−ヒダントイ
ン（以後ＨＰＧＨと記す）を１００ｇ投入してｐＨを８
．７に調整した６次いで上記アルギン酸カルシウムビー
ズ２５０−を投入し、ヒダントイナーゼ反応を実施した
。反応条件は温度４５°Ｃ２ｐｌ＋８．７、中和用アル
カリとして７Ｎ−アンモニアを使用した。反応開始後２
時間目に反応液をサンプリングし、反応生成物であるＮ
−カルバミル−〇−ヒドロキシフェニルグリジン（以後
Ｃ−ＨＰＧと記す）の濃度を液体クロマトグラフィーで
測定し、２時間のＣ−ＨＰＧ生成量からビーズ内ヒダン
トイナーゼ活性を算出した。

反応開始から２２時間目に反応を止めて反応液部だけを
抜き出し、新たに純水１０００ｄｌｌ！：ＨＰＧＨｌｏ
ｏｇを反応器に仕込んで反応を繰り返し、ビーズ内ヒダ
ントイナーゼ活性を測定した。

このような方法で反応を繰り返し、ビーズ内ヒダントイ
ナーゼ活性の半減期（ヒダントイナーゼ活性が初期の１
７２になるまでの繰り返し反応回数）及びビーズの形状
の変化を調べた。

その結果、反応の繰り返し回数３〜４回でビーズは初期
の弾力性を失って扁平な楕円体に変形し、反応中に破壊
されたものが多く、回収した反応液には細かいゲル状破
片が多数分散していた。このため、反応を繰り返すこと
自体が物理的に難しく、第１図に示したごとく半減期も
５回にとどまった。

比較例２ 比較例１と同じ方法でアルギン酸カルシウムビーズを作
製した後、２％ポリエチレンイミン（以後ＰＥＩと記す
）水溶液に浸して３０分間攪拌しながらビーズ内にＰＥ
Ｉを浸透させた。次いで、最終的に１％となるようにグ
ルタルアルデヒドを徐々に添加し、１時間撹拌しながら
架橋処理を行なった。次にビーズを生理食塩水で２〜３
回洗浄して薬剤を取り除いた。

このようにして得られたアルギン酸カルシウムビーズを
用いて比較例１と同様の方法で繰り返し反応を実施した
。その結果、第１図に示したように半減期は１２回であ
った。またビーズは５〜６回ごろから次第に表面からゲ
ル片が剥離するようになり、弾力性が失われていた。１
０回を越えるとビーズ粒径が３価φ以下になっており、
明らかにビーズが表面から失われていることがわかった
。

実施例１ 比較例２と同じ方法で架橋処理を施したアルギン酸カル
シウムビーズを作製した。この微生物固定化ビーズを用
いて反応する際、仕込液として５ｍＭＣａ　２’水溶液
１０００　ｍｌを用いた。その他の反応条件は比較例１
と全く同じであるが、繰り返し反応の仕込液は全て５ｍ
ＭＣａ”水溶液とした。その結果、第１図に示したよう
に、半減期は２５回であった。またビーズは初期の弾力
性を保持しており、ビーズの粒径も繰り返し反応回数が
２０回を越えても３ｒｒａφ以上であり、ビーズの溶解
ないし剥離は僅かであった。

（作用・効果〕 叙上の通り、本発明によれば固定化微生物ビーズの溶解
又は剥離が防止され、実用的な酵素反応方法が提供され
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は比較例１．２及び実施例１における繰り返し反
応回数とヒダントイナーゼの残存活性との関係を示すグ
ラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵素反応の結果生成する酸性物質を中和するために
   アルカリを投入しながら反応させる酵素反応において、
   酵素を産生する微生物を天然多糖系包括基材ビーズ内に
   包括した後、前記ビーズをグルタルアルデヒド単独で架
   橋又はポリエチレンイミンもしくはジアミン類とグルタ
   ルアルデヒドとで架橋を行なって得られた固定化微生物
   ビーズを用いるとともに、前記包括基材と結合する能力
   を有する金属イオンを反応液に添加することを特徴とす
   る固定化微生物を用いた酵素反応方法。 ２、金属イオンがＣａ＾２＾＋、Ｂａ＾２＾＋、Ｓｒ＾
   ２＾＋及びＡｌ＾３＾＋から選択される少なくとも１種
   である請求項１記載の方法。 ３、金属イオン濃度が０．１〜２０ｍＭである請求項１
   記載の方法。 ４、グルタルアルデヒド濃度が０．１〜２００ｍＭであ
   る請求項１記載の方法。 ５、ジアミン類がエチレンジアミン、トリメチレンジア
   ミン、テトラメチレンジアミン、ペンタメチレンジアミ
   ン及びヘキサメチレンジアミンから選択される少なくと
   も１種である請求項１記載の方法。 ６、ジアミン類の濃度が１〜１００ｍＭである請求項１
   又は５記載の方法。 ７、ポリエチレンイミンの分子量が３００００〜７００
   ００である請求項１記載の方法。８、包括基材がアルギ
   ン酸カルシウム又はペクチン酸カルシウムである請求項
   １記載の方法。 ９、酵素反応がヒダントイン類を不斉加水分解して、Ｄ
   −α−アミノ酸のカルバモイル誘導体を生成する反応で
   ある請求項１記載の方法。 １０、微生物が５−置換ヒダントイン類を不斉加水分解
   してＤ−α−アミノ酸のカルバモイル誘導体を生成する
   ヒダントイナーゼを産生する微生物である請求項１記載
   の方法。