JPH01285189A - 微生物細胞の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は接触的に活性の固定化微生物細胞およびその製
造方法に関し、固定化はグルクロン酸、ラムノースおよ
びグルコースを含むポリサッカライドから本質的に成る
組成物により全微生物細胞又は接触的に活性の生物学的
物質を捕捉することにより行なう。微生物細胞および酵
素を水不溶性支持体上に同定化する各種技術が提案され
た。これらの方法は酵素活性に必須でない酵素の官能基
を使用する支持体への共有化学結合、基質および生成物
を自由に通過させると共に接触的活性物質を保有する親
水性ｒル格子内に微生物細胞又は酵素の捕捉、イオン結
合、又は親水性イオン交挨樹脂又は木炭又はガラスピー
ズ上への物理的吸収および２官能性化合物との架橋結合
による酵素の結合を含んだ。

固定化の捕捉方法はもつとも変通性がある。例えば米国
特許第６，７９１．９２６号明細−ｇｉｊ：は微生物細
胞および酵素を重合体マトリックス内に捕捉する方法を
開示する。米国特許第５．９５７．５８０号明細書は微
生物細胞を重合体システム内に捕捉する方法を開示し、
システム内で固定化細胞はグルタルアルデヒドのような
多官能性剤を使用して重合体マトリックスにさらに架橋
結合する。

しかし、上記タイプの合成重合体システムはいくつかの
欠点を有する。固定化細胞の製造はモノマー、開始剤お
よび架橋結合剤のような有毒物質の使用を含む。支持体
マトリックスは商業規模のバイオリアクターシステムで
使用する場合変形又は圧縮することができる。

従って、本発明の全体的目的は酵素活性を保有する接触
的に活性の微生物細胞を固定化する方法を供することで
ある。

本発明の別の目的は良好な機械的強度を示す組成物を形
成する接触的に活性の微生物細胞を固定化する方法を供
することである。

本発明の局別の目的は可溶性酵素に匹敵する動力学を示
す組成物を形成する固定化方法を供することである。

本発明の局別の目的は使用が容易で安価なカシセル化重
合体を使用する固定化方法を供することである。

これらおよび他の目的および利点は次の記載および例示
例から明らかとなろう。

発明の記載 本発明は微生物細胞の改良固定化方法を供し、この方法
では細胞はグルキュロン酸、ラムノースおよびグルコー
スを含むポリサッカライドから本質的に成る組成物にカ
プセル化する。特に、本発明はゲランガムとして既知の
組成物を使用する。

本発明の目的に対し「ゲランガム」とは、Ｋ、Ｓ。

Ｋａｎｇらに対し１９８２年４月２０日発行の米国特許
第４．５２６，０５２号明細書に記載および特許請求し
た脱アセチル化へテロポリサッカライド５−６０を意味
する。本方法により形成する固定化細胞調製品は上記開
示のカプセル化方法以上に驚くべき利点、すなわち機械
強度、酵素安定性、容易／安価な製造、および溶解性酵
素に匹敵できる動力学を示す。

安定で、固定化した接触的活性物質を得る好ましい方法
は、微生物、ゲランガムおよび水の混合物から形成する
小滴をＭｇＳＯ４又は１価又は２価カチオンを含有する
他の塩の溶液知より硬化することである。他の各種形状
は可能であるが、球状ビーズはこの形状が単位容積につ
き最大表面積を与えるので好ましい。本方法はカプセル
化物質の機械強度の決定にかなりの融通性を許容する。

本方法では１．２〜１．８重量−のゲランガムを脱イオ
ン水に溶解し、少なくとも８０℃に加熱し、約２５〜５
５℃に冷却し、ゲランガム溶液の５０重量％より多くな
い、好ましくは約２５１より少ない重量の微生物ペース
トと混合する。ゲランガム／細胞混合物は当業者に既知
の通例方法によりビーズ形に成形し、次に０．１〜０．
４Ｍ硫酸マグネシウム（Ｍｇｓｏ４）　１ｇ液又は別の
２価カチオン溶液と室温で接触させるのがよい。形成ビ
ーズは約１０分硬化させ、次に硫酸マグネシウム溶液か
ら濾過する。

所望の場合、硫酸マグネシウム溶液は再使用できる。１
価カチオン塩溶液をビーズの硬化に使用する場合、−ｊ
→高濃度、約０．５〜２．０Ｍ塩が必要である。ゲラン
ガム、細胞ペーストおよびＭｇ５Ｏ，溶液の許容できる
濃度に対する好ましい限界は狭い。

その理由はこれらの範囲外の条件は圧縮し過ぎか、又は
ビーズに容易に成形するには粘稠過ぎておシ、早期硬化
しやすい混合物であるビーズを与えるからである。

ビーズはゲランガム／ａ胞混合物を小口径ピペット又は
注射器を通すことによって容易に形成できる。ビーズの
大きさはピペット又は注射器の周シの同中心空気流によ
り調整できる。Ｃ，Ｄ。

５ｃｏｔｔ＋　１９８５．　Ｌｎｔ’ｌ　Ｅｎｚｙｍｅ
　ＣｏｎｆｅｒｅｎＣｅ　；巻、７号、ｐ−４８５〜４
９０（１９８６）；Ｔ。

ｐ、１１１〜１１４（１９８６）；およびＡ、Ｃ。

Ｈｕｌｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｂｉｏｅｎｇｒ、＋
　１７巻、ｐ、８７０〜８７６（１９８５）に記載のよ
うな他のビーズ製造方法は使用できる。

他の捕捉方法とは異って、ゲランがムの使用は選択条件
に非常に敏感であることがわかった。この敏感さに対す
る１つの理由は本方法では少量のゲランがムの使用であ
る。カラギーナンに比し約Ｖ２〜Ｖ−％のプランがムを
使用し形成ビーズは機械的に一層強い。

ゲランが広濃度の小変化は形成するビーズのタイプに変
通性を供する。ゲランガム濃度は予期する使用に対し適
当な強度を有するビーズを製造するのに十分である一方
、ゲランガムの早期硬化を防止するのに十分な低さであ
るべきである。好ましくは、ゲランガムの最初の濃度（
細胞ペーストの添加前）は１．２％以下であってはなら
ない。そうであるならビーズは容易に変形し、多くの場
合カラムリアクターに対し不適当になる。１．８重量％
以上のゲランガムの最初の濃度はゲランガム溶液に存在
するカチオンにより移動ライン中で早期硬化し、ゲラン
ガム／細胞混合物を小滴て分配できない問題を生ずる。

１．２〜１．８チの好ましい使用範囲についてさえ、細
胞の生長に使用する醗酵培地に依り細胞ペーストに存在
する残留物質は、細胞を添加する場合ゲランガムを凝固
させることができる。従って、固定化処理の調整を改良
するために、細胞は好ましくは脱イオン水中で洗滌し媒
体から残留塩を除去した後、細胞をゲランがムと合せる
。細胞洗滌工程は固化方法の一層良好な調整を与える。

すなわち、実質的にカチオンを含まない細胞ペーストは
早期同化を生ぜずに一層低温でゲランガムに添加できる
。細胞は十分な浸透圧強度の他の非イオンｄ液中で洗滌
し、細胞溶解を防止することもてきる。適当な非イオン
溶液はブドウ糖および蔗糖のような糖〆液を含む。細胞
洗滌工程は除外できるが、その場合一定量のゲランガム
に対し使用する細胞ペースト量は減少しなければならな
い。細胞を洗滌することにより、シばしば細胞密度、従
ってバイオリアクターの容積生産性の相当する増加と共
に固定化調製品の活性密度を増加することができる。

同様に、処理は細胞ペーストの湿潤度に敏感である。細
胞と共に存在する水分量が多すぎると許容しつるビーズ
形成に必要な臨界レベル以下にゲランガムの最終濃度を
稀釈する。細胞ペーストは出来るだけ濃厚で、移動およ
び混合しゃすぐするためにのみ稀釈すべきである。本発
明の目的に対し、細胞ペーストの細胞含量はそこに含ま
れる細胞の乾燥重量規準で約１４重量％である。細咽ペ
ーストは好ましくはゲランがム／細胞ペースト混合物重
量の約５０チより少ない割合にすべきで、そうでなけれ
ばビーズは軟かくなシ過ぎる。２５重量％より少ない細
胞ペースト含量は多くの場合好ましい。ペーストの細胞
含量が１４１より多い場合、細胞ペーストは混合物の５
０゛チより多い割合にすることができる。Ｍｇ　＋＋イ
オンの濃度は臨界的ではないが、［Ｊ、１Ｍ以下の濃度
でビーズ強度の著しい減少がある。

上記方法により製造した、同定化した接触的活性物質は
、通常他のカプセル化方法に必要である付加的架橋結合
処理を行なわずに驚くべき安定性を有する。実＋ｐに一
態様では、上記方法によりカプセル化した、Ｆ、　ｃｏ
ｌｉ細胞（ＡＴＣＣ１１５０６）のアスパルターゼ活性
に対する半減期は少なくとも１５０日であることが測定
された。この安定度はグルタルアルデヒド処理せずにカ
ラギーナンでカプセル化した同じ細胞は僅かに７０〜９
０日の半減期しか示さない（米国特許筒４，５２６，８
６７号明細書参照）事実に照して予期されない。遊離細
胞の半減期は僅か約１７日に過ぎないから、プランがム
による固定化は細胞が酵素反応に対し利用できる有用期
間を有意に延長する。

固定化による活性損失はカプセル化および硬化に必要な
条件が温和であるため無視できる。安定性を付与する一
方、活性をいくらか破壊するグルタルアルデヒド処理は
必要ではないが、固定化に有害に作用することなく使用
できる。新たに収穫したＬ　ｃｏｌｉ細胞（ＡＴＣＣ１
１５０６）は固定化し、６７℃の基質で２４時間活性化
した同じ細胞より７〜８倍低いアスパルターゼ活性を示
す。遊離細胞はピーク活性に到達するために基質中で約
６日を必要とするが、−刃固定化細胞は１８〜２４時間
後に最高になる。ピーク活性に対するこ几らの時間的差
は遊離細胞対固定化細胞の活性レベルの比較を困難にす
る。他のカプセル化方法に対する活性保有の、刊行情報
は分析時期に対し特定していない。活性測定の臨界的タ
イミングは、ぎ−ク（６日）活性にある遊離細胞の固定
化が、新鮮細胞（より低い活性を有する）をカプセル化
した場合と同じ活性を有する固定化調製品を製造しない
という事実により示される。

低分子量物質さえマトリックスに拡散することの困難さ
のために、重合体物質にカプセル化される酵素はしばし
ば増加したミカエリス定数を有することを当業者は認め
る。可溶性アスパルターゼに対するＫｍは０．１５Ｍで
あると報告される（Ｓａｔ。

ら、明か５７０．１７９〜１８６．１９７９）。

アスパルターゼを含有するＦ、、　ｃｏｌｉ細胞（ＡＴ
ＣＣ１１３０３）を固定化したプランがムに対する馳け
０．２〜０．２５　Ｍと実験的に測定された。ゲランガ
ムシステムに対するＫｍが可溶性酵素のものに近似する
事実は、酵素に妨害環境効果を加えない固定化方法を示
す。Ｌ　ｃｏｌｉ細胞を捕捉したカラギーナンのアスパ
ルターゼに対するＫｍは０．７１〜０．８５Ｍ（５ａｔ
ｏ、１９７９）であるからこの結果は全く予期されない
。低い見掛はミカエリス定数はゲランガム同定化に対１
望ましく、かつ驚くべき利点である。

本発明の別の態様では、ゲランガムはイオン交換樹脂ビ
ーズ上に被覆し、樹脂上のカチオンにより硬化できる。

この態様の利点は：小さい、−層薄い輸送層を有する機
械的に安定なビーズである。

これはデル化剤を架橋結合する新規方法である。

実際に、すべての先行技術方法はマトリックスを硬化す
るためにＯＴＭ性カチオンを必要とする。このタイプの
態様では、ゲランガムは樹脂の孔隙内および外部表面上
で硬化することが好ましい。これは樹脂の孔隙が固定化
する微生物細胞に適応するだけの大きさであることを必
要とする。孔隙が小さ過ぎる場合、ゲランガム／細胞混
合物は多くの場合デルを硬化させる十分なカチオン密度
を有しないビーズの外部表面に強制される。

本発明は多様の酵素システムに対し同様に適用できる。

例えば、特にペニシリンアシラーゼ、グルコースイソメ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フマラーゼ、フェニ
ルアラニンアンモニアリアーゼ、アスパルテートアミノ
トランスフェラーゼ、インベルターゼ、シスートランス
マレイン酸インメラーゼ、およびＬ−アスパルテートベ
ーターデカルボキシラーゼは本発明方法によりすべて＊
４１Ｊできる。ペニシリンアシラーゼを所望する場合、
ｐｒｏｔｅ口８　ｒｅｔｔｇｅｒｉの細胞は使用できる
。グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、
フマラーセ、インベルターゼ、シスートランスマレイン
酸インメラーゼ、又はＬ−アスパルテートベーターデカ
ルボキシラーゼ（特に）を含有する細胞の固定化を所望
する場合、使用できる微生物はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｌｉｌ属、Ｂａｃｉｌｌｕａ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ属、ｐＨｌｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、およびＡｅｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ属のものを含むことができる。このタイプ
の微生物は必ずしも完全な生活細胞でなくてもよく、本
発明に使用前に物理的又は化学的処理してもよい。

本システムは部分精製又はｆ＃裏酵素の捕捉に適するこ
とを当業者は認める。実際に、このアプローチは関心を
有する酵素がプロテアーゼによる攻撃を受けやすい場合
有用である。別法では、ある場合には所望の反応生成物
をさらに異化する微生物細胞に含まれる他の酵素を除去
することが望ましい。精製酵素をプランがムビーズから
浸出する場合、少量のゼラチンを含み、グルタルアルデ
ヒドのような適当な化学薬剤と架橋結合することにより
酵素の損失を減少することができる。

次側は本発明の実施を一層よく説明するために供し、本
発明の範囲を限定するためのものでは決してない。

例　　１ Ｅ？、、　ｃｏｌｉ細胞、Ａ’ｒＣ’Ｃ１１５０３は標
準醗酵条件下で振盪フラスコで生育した。プロスは８分
間８０００　ＸＧで遠心分離し、細胞ペーストを得た。

約１．２ｇ（７）ペーストを１００−のプロスから得た
。

細胞ｉｊ５ｍ／の水に４ｇの細胞を再サスペンドするこ
とにより脱イオン（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水中で洗滌し、５
分８０００　ｘｏで遠心分離し、次いで第２回洗滌工程
を行なった。ゲランガムｍ液は０．２４　ｇのゲランガ
ムを１９．６ｒｌｌの水に添加し、混合物を９０００に
攪拌しながら加熱し、次に５４℃に冷却することにより
製造した。洗滌細胞は１　ｍｌの水にスラリーにし、次
に５４°Ｃゲランガム溶液に添加した。

ケ９ランガムー細胞混合物は室温に保持した０、２ＭＭ
ｇ５Ｏ，Ｍ液に直ちにピペットで滴加した。ビーズはお
だやかに１０分間攪拌して硬化を完了させ、次にＭｇＳ
Ｏ４溶液から真空濾過した。固定化調製品の最終重量は
１６．９ｇであった。固定化細胞は１・５Ｍ７マール酸
基質溶液中で６７℃で一夜インキユペートした。固定化
細胞はｇｉ抱−時間につｅ　Ｏ，（１２）５５モルアス
パラギン酸の生成割合を後に示した。

例　　２ 高度に多孔性（孔径２１ミクロン）のカチオン交換樹脂
は標準技術を使用してＭｇ　＋＋イオン形にした。次に
樹脂は乾燥した。ゲランガムの１重量％脱イオン水溶液
を０．０８　ｇのゲランガムを８Ｉ＋Ｉｌの脱イオン水
に溶解して調製する。ゲランガム溶液は約８０°Ｃに加
熱し、次に約４０℃に冷却する。

例１記載のように得たＥ、　Ｃｏ１１細胞（ＡＴｃｃ１
１３０５）を８ｍｌのゲランガム溶液につき約１ｇの細
胞イーストの量で上記ゲランガムに添加する。樹脂と約
４０°ｃｃｏゲランガム／細胞混合物を烈しく攪拌し、
次に室温（〜２５°Ｃ）に冷却することによりゲランガ
ム／細胞混合物を乾燥多孔性カチオン交換樹脂上に被覆
する。十分量の樹脂を使用するので本質的にすべての物
質は樹脂に吸収される。冷却するとゲランガムは樹脂ビ
ーズ内および上に細胞を捕捉して硬化する。

例　　６ 固定化したＷ、　ｃｏｌｉ細胞、ＡＴＣＣ１１５０６層
例１記載のように製造した。半減期測定のため固定化細
胞をカラムバイオリアクターに詰めた。カラムへの供給
流は１．５　Ｍ　ＮＨ４−フマレート（工業用）、１　
ｍＭ　ＭｇＳＯ４、Ｐ）（８，５であった。

１〜１９日間カラムは８時間／日、供給割合を変えて操
作し、機能障害を生ずる温度調整が約２０チの酵素損失
を生じた場合の６日間を含んだ。

バイオリアクターは２４時間／日、しかし２０日から６
０日に供給割合を変えて操作した。安定性データは１時
間につき２層−容積の供給割合および６７℃で３１〜６
６日に得た。

動力学的データは１時間につき２層−容積の供給割合で
６７％転換の零時間インターセプトを示す。安定性デー
タの線状回帰分析は約１５０日の半減期を示す。

比較のため、グリセロール−フマレート培地ニ生育し、
ピークレベルの５０％の活性に到達するまでの時間とし
て計算した遊離細胞の半減期は約１７日と見積もられる
。上記データは６７℃で２時間のバッチ反応およびｐＨ
８，５で１．５　Ｍ　ＮＨ４−７マレートを使用して得
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）接触的に活性の微生物細胞の固定化方法において
   、 （ａ）微生物ペーストとゲランガムの水性溶液を混合し
   、ゲランガム水性溶液の濃度は硬化する場合ビーズを形
   成するのに十分であり、かつ微生物ペースト中の残留物
   質により早期硬化しない濃度を有し、そして （ｂ）工程（ａ）の混合物の硬化を促進する十分な濃度
   および温度のカチオン水性溶液に工程（ａ）の混合物を
   滴下して混合し、それによつてこの微生物を含有する硬
   化ビーズを形成し、そして （ｃ）工程（ｂ）で製造した硬化ビーズを回収すること
   を特徴とする、上記固定化方法。（２）ゲランガム水性
   溶液は１．２〜１．８重量％のゲランガム濃度を有し、
   微生物ペーストは形成混合物の約５０重量％より少なく
   含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）微生物はアスパルターゼ活性を有する、特許請求
   の範囲第２項記載の方法。 （４）微生物はＥ．ｃｏｌｉである、特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 （５）微生物はＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ１１３０３）で
   ある、特許請求の範囲第２項記載の方法。 （６）カチオン水性溶液は約０．１〜０．４Ｍ濃度でマ
   グネシウムイオンを含む、特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 （７）ゲランガムは１．２〜１．６重量％の濃度を有す
   る、特許請求の範囲第２項記載の方法。 （８）接触的に活性の微生物細胞の固定化方法において
   、 （ａ）微生物ペーストと約１．２〜１．８重量％のゲラ
   ンガム濃度を有するゲランガム水性溶液を混合し、微生
   物ペーストは形成混合物の約５０重量より少なく含み、
   そして （ｂ）工程（ａ）の混合物と多孔性カチオン交換樹脂を
   混合し、樹脂は微生物が進入できる十分な多孔性で、ゲ
   ランガムが硬化できる十分なカチオン装荷密度を有する ことを特徴とする、上記固定化方法。 （９）微生物はアスパルターゼ活性を有する、特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 （１０）微生物はＥ．ｃｏｌｉである、特許請求の範囲
   第８項記載の方法。 （１１）微生物はＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ１１３０３）
   である、特許請求の範囲第８項記載の方法。 （１２）カチオン交換樹脂はマグネシウムイオン形であ
   る、特許請求の範囲第８項記載の方法。