JPS6228679B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は不動化酵素に関する。

不活性支持体材料に酵素を不動化することは、
工業規模で化学的変換をなすために酵素を利用す
る将来性のある魅力的方法である。不動化せずに
は酵素は除去することが困難で、通例は生成物中
に残存する。酵素は高価であり、不動化は当然節
約を伴ない酵素の再利用を可能にする。特に、粒
状不活性支持体材料上への不動化は流動床操作も
しくは単純逆流操作を可能にする。通例の不活性
支持体材料は濃密材料のコアとして作用し、不動
化生成物の流れを基質流中で最少にする。

物理的および化学的方法は不活性支持体材料、
特にガラス、アルミナもしくは他の無機材料の球
体に対する酵素の不動化に利用できる。

物理的方法の例は(i)支持体表面上への酵素の吸
着および(ii)支持体材料内への酵素の吸蔵もしくは
閉じこめを含み、一方化学的方法の例は(iii)支持体
表面への酵素の共有結合および(iv)支持体材料の細
孔内の酵素の共有架橋結合を含む。

方法(i)、すなわち物理的吸着は多孔性支持体を
使用することが好ましく、それによつて吸着に利
用できる表面積をより大きくする。たとえば英国
特許第1440703号明細書は100〜1000オングストロ
ムの平均孔径を有する多孔性アルミナの細孔内に
吸着されるグルコースイソメラーゼより成る不動
化酵素複合材料を使用する、グルコースをフラク
トースに変換する方法を記載する。この細孔の大
きさは細孔内に酵素をもつとも多く収容させる。

方法(ii)、すなわち物理的閉じこめも多孔性マト
リツクスを使用し、その内側で酵素は不動化され
る。各種技術は酵素の物理的閉じこめに利用でき
る。たとえば英国特許第1461025号明細書はPHを
調整し酵素分子によつて占められる容積を変化さ
せることを含む方法を記載する。すなわち、酵素
溶液のPHは最初に最小もしくは最小に近い酵素容
積を得るように調整され、溶液は微小孔キヤリア
材料と混合され、そして次にPHは酵素容積を増大
するように調整され、それによつて微小孔内に分
子を閉じこめる。

方法(iii)、すなわち共有結合は代表的には支持体
材料の表面に酵素分子を結合させることができる
反応性２官能性結合剤を使用することを含む。１
例として、英国特許第1484565号明細書はジアゾ
化−ｍ−ジアミノベンゼンを使用する支持体材料
の表面に酵素もしくは他の生物学的に活性の大分
子の結合を記載する。

共有結合の別の処理では、支持体材料の表面は
酵素と反応させるためにそれ自体官能化される。
英国特許第1412563号明細書は重合性材料が遊離
カルボン酸基を生成するために処理され、次に酵
素もしくは他の生物学的に活性化合物とその後反
応させるために反応性無水基に変換される。

最後に、方法(iv)、すなわち共有架橋結合は支持
体材料に吸着後、酵素の分子間架橋結合である。
たとえば、英国特許第1398018号明細書は、多孔
性無機キヤリアおよびキヤリアの細孔および内部
表面内に吸着された酵素より成り、吸着酵素分子
は水不溶性架橋結合剤により架橋結合される不溶
性酵素複合物を記載する。明細書が説明するよう
にこのような複合物の主要な利点は、酵素を不動
化するために利用される細孔容積量が大きければ
大きい程、比例的により少ない酵素量がキヤリア
の表面に暴露され、そしてより高度の酵素不動化
が細孔内に達成されることである。

(i)〜(iv)の方法のうち、化学的方法(iii)および(iv)
は
酵素が一層堅固に支持体材料と結合し、使用中溶
解しないのでより大きい利益に遭遇した。物理的
に吸着もしくは閉じこめられた物質は、PH、温度
もしくは溶媒と関連するような、特に局部環境の
変化がある場合、支持体から容易に離脱される。

実際に、化学的方法および支持体材料の選択は
しばしば限定される。１例を挙げると、知られて
いる限り、でん粉からグルコースを製造するのに
広く使用される酵素であるアミログルコシダーゼ
の不動化についてこれまでは誰一人として経済的
利益を挙げることはできなかつた。技術および支
持体材料は不動化に利用できるが、それらの費用
は通例高価すぎることがわかつた。

ユナイテツドキングドムアトミツクエネルギー
オーソリテイ、UKAEAは、その英国特許第
1514707号明細書で、多孔性支持体材料の細孔内
に、アミログルコシダーゼのような生物学的に活
性物質を不動化する方法を記載した。UKAEAの
方法（その特許明細書の特許請求の範囲第１項に
記載のように）は「多孔性支持体材料の細孔内に
生物学的活性物質を導入し、生物学的活性物質を
処理し多孔性支持体材料の細孔にそれらを一時的
に保留させてその細孔内に架標結合するために利
用できる生物学的活性物質を保持させ、そして多
孔性支持体材料の細孔内で生物学的活性物質を架
橋結合させて多孔性支持体材料の細孔内で生物学
的活性物質を不動化する」ことを含む。

特許第1514707号明細書の説明のように、この
発明は多孔性支持体材料の細孔を利用する。この
方法では支持体材料の表面面積／容積比は著しく
増大するからである。

多孔性支持体材料を使用する他の方法と同様
に、細孔内で生物学的活性物質を架橋結合する方
法は多孔性支持体材料の孔径および細孔構造が不
動化される物質を入孔させ、最後に不動化物質が
反応する種を入孔させるようなものであるべきで
あるという要求を前提要件として有する。実際
に、数個の支持体材料のみが有効な不動化を望む
場合使用することができることを意味する。特許
第1514707号明細書は支持体として使用できる多
数の無機および有機材料を記載するが、特許第
1514707号明細書の方法は特定孔径を有するよう
に注意深く調整された方法で製造した或種のガラ
スもしくはタイタニア球体を使用するのでなけれ
ば不十分であることがわかつた。調整された孔径
を有するこれらの材料は非常に高価であり、その
点では不動化技術により供される可能な節約の利
益を得ることが通例できない。

不活性支持体材料に酵素を不動化するための既
知技術に関する前記論議から明らかなように、特
に化学的方法に対しては支持体材料の細孔内の酵
素の不動化は、活性酵素に対し付加的表面面積を
細孔が供することが成功への鍵であることが予め
一般に適用される。

不活性支持体への酵素の不動化に対するこの通
例的思考に対し、本発明によれば活性不動化酵素
は不活性支持体材料上の外部固着物の部分である
生成物を供することである。外部固着物は包囲被
覆の形をとることができ、もしくは特に粒状支持
体材料については外部固着物は支持体材料の個々
の塊り上の不連続性もしくは不規則性被覆である
ことができる。

更に詳細には、しかし排他的にではなく、不動
化酵素を含み、且少なくとも生成物の３容量％を
形成する外部固着物を有する不活性支持体材料よ
り成る不動化酵素生成物を供する。

不活性支持体材料に付着し、不動化酵素を含む
外部固着物は通例生成物容積の10〜75％、更に代
表的には生成物容積の10〜50％を形成するであろ
う。好ましい生成物に対しては、表面固着物は生
成物の15〜40容積％の範囲である。

更に不動化酵素を含む固着物は通例酵素より多
い水分を含むであろう。代表的にはゲルであろ
う。適当なゲルは50〜90％水分、更に好ましくは
70〜85％水分より成るものを含む。しかし固着物
の相対容積に対し得られる数字についてはその値
は所望のように変えることができる。

不動化酵素の他に水分を含む外部固着物は次に
材料を通して基質の拡散が可能になる利益を有す
る。換言すれば、活性を示すことができる不動化
酵素はもつとも外側もしくはさもなければ基質に
暴露されるこれらの分子に限定されない。基質透
過性外部酵素固着物は本発明の有利な特徴であ
る。実際に不活性支持体材料上の不動化酵素ゲル
固着物を使用することにより活性酵素の付加面積
よりむしろ活性酵素の付加容積を供することがで
きる。本生成物に対し、活性酵素の全部もしくは
主要部分は外部固着物に含まれる。すなわちいく
らかの見込みとは反対に不活性支持体材料の外側
に活性酵素を保留することができることが、従つ
て好ましい。

本発明によれば、不動化酵素生成物の製造方法
をも供する。その方法は不活性支持体材料に不動
化される酵素の水溶液および水混合性有機溶媒を
接触させることにより支持体材料にゲル化性、外
部酵素含有被覆を形成させ、外部被覆支持体材料
を架橋結合剤と接触させて被覆をゲル化させるこ
とより成る。

このような方法で製造した各種生成物の光学顕
微鏡検査はそれらが不活性支持体材料上に固着し
たゲルより成ることを示す。架橋結合ゲルは通例
支持体の周りに完全もしくは部分的被覆として明
らかに見ることができる。ゲルは通常いくらか透
明度を有する。

明らかなように、本方法は序文で論議した通例
の先行技術方法と同じではない。実際に、不活性
支持体材料に酵素を不動化しない（従つて上記(i)
〜(iv)の部類に入らない）が、ゲル化性たん白を使
用する他の提案とほとんど相似性がない。たとえ
ば、米国特許第3838007号明細書および英国特許
第1571987号明細書を参照されたい。

簡単には、米国特許においては水不溶性酵素製
剤は非たん白分解酵素をゼラチンもしくは新鮮卵
白と混合し、水と非混合性有機溶媒を添加するこ
とによつて混合物を不溶化して粒子を得、サスペ
ンジヨンを処理してゼラチンをゲル化し（冷却に
より）もしくは卵白をゲル化し（加熱により）、
そしてゲル化たん白を粒状形に架橋結合して粒状
生成物を得る工程により製造される。高級アルコ
ールのような水非混合性溶媒の使用は酵素および
ゲル化たん白を粒状形にすること、およびこの粒
状形はその後の工程において維持されることは容
易にわかる。この粒子の性質の結果として支持体
材料は全く必要がないと思われる。

英国特許においては、アミログルコシダーゼも
しくは麦芽起源のα−アミラーゼはグルタルアル
デヒドおよび卵白と共に粒状カゼイン粒子上に被
覆され、カゼイン粒子に対する液体透過性の架橋
結合酵素／卵白被覆を得る。英国特許第1571987
号明細書は第３頁第15行〜第20行にカゼイン粒子
および卵白の使用は必須であることを示すことは
注目すべきもつとも重要なことである。無機起源
もしくは他のたん白のキヤリア材料を使用する試
みは不成功であることがわかつたという。この結
論は、本発明の特徴である水混合性有機溶媒を存
在させずに酵素とグルタルアルデヒドの直接架橋
結合を試みた後に到達した。

本方法では、不活性の支持体材料は酵素溶液、
水混合性有機溶媒および架橋結合剤と接触し、支
持体材料上に外部の酵素含有ゲル固着物を形成す
る。代表的ゲルは比較的強く、耐剪断性であるの
で生成物の使用は酵素活性のロスによる固着物の
急速の損耗を生じることはない。実際に酵素活性
は代表的には長期安定性を有し、10日以上の酵素
活性の半減期が好ましい。

本方法についての成功の鍵は、しばしば一時的
ではあるが、不活性支持体材料上のゲル化性被覆
の形成である。このような被覆は各種方法で形成
させることができる。しかし、本方法では酵素水
溶液を水混合性有機溶媒と共に使用した。このシ
ステムを使用して、日常的手順を使用して試行錯
誤による適当な試験後はゲル化性被覆の形成にほ
とんど困難はない。

支持体材料を酵素溶液、水混合性溶媒および架
橋結合剤と接触させる順序は、終局的にゲル被覆
が得られることを条件として所望のように変える
ことができる。たとえば不活性支持体材料は溶媒
と接触させ、酵素溶液を添加し、次いで架橋結合
剤と接触させることができる。別法として、水混
合性溶媒は酵素溶液と接触させた不活性支持体材
料に架橋結合剤と共に添加することができる。

本発明は本生成物の製造、貯蔵もしくは使用中
に起こることができる不必要な物理的および化学
的作用の双方に実質的に不活性の不活性支持体材
料を使用する。このような支持体材料は、たとえ
ば水と接触する場合寸法変化を受けない。同様
に、カセイン粒子のようなたん白性支持体材料に
不動化した場合、特にたん白分解酵素により、あ
りうるように、酵素の攻撃を受けにくい。

不活性であるとすれば、支持体材料の性質は臨
界的ではない。不活性に対しては、支持体は有機
重合材料のものでないことが非常に好ましい。事
実、支持体材料は通例「無機物」であろう。その
用語では有機化合物の存在を排除するが、炭素元
素を含む支持体の可能性を含む。好ましくは支持
体材料は250〜1500ミクロンの寸法を有する粒子
より成る。約150ミクロンより小さい最大寸法は
生成物が流動床反応器で使用される場合望ましく
ない。

本発明は活性不動化酵素を得るために不活性支
持体材料の細孔の存在に依存しない。それにも拘
らず、酵素層が破壊されにくい一層じようぶな生
成物を得るのに細孔はいくらかの利益があると思
われる。

使用することができる支持体材料の例は天然産
かもしくは製造材料の粒子を含む。たとえば、川
砂粒子（細孔なし）、モラカイト（molachito）粒
子（約２％多孔度を有する天然産アルミノシリケ
ート）、多孔性タイタニアもしくはヒドロキシア
パタイト球体（英国特許第14215318号明細書記載
の方法により製造、約35％多孔度）もしくは市販
骨炭粒子（約30％多孔度）を使用して満足すべき
不動化が達成された。

骨炭、別にはボーンブラツクとして既知であ
り、ボーンチヤーコールもしくはアニマルチヤー
コールは本発明に対する好ましい支持体材料であ
る。骨炭は予め支持体材料として使用を提案され
た材料では満たされない複合利益を供する。これ
らの利益は本発明による生成物で特に明らかにさ
れた。

骨炭は天然産原料から経済的に有利な価格で得
られ、主として活性炭素の薄い平均に分散した被
覆があるヒドロキシアパタイト構造より成る。粒
子は不規則形で、外部固着物を付着させるための
適当な「鍵」を供する。更に永年の間糖の精製に
世界中で使用された。その使用は食品工業で有害
問題を全く残さないことは十分に確立されてい
る。良好な熱安定度を示し、通常温和酸性条件で
使用された場合でさえ更に問題を生ずることがで
きる人工添加物を全く含まない。

骨炭の粒径は不動化達成のために臨界的ではな
い。２mmより小さい、更に好ましくは１mmより小
さい最小寸法および６mmより小さい、更に好まし
くは２mmより小さい最大寸法を有する粒子を使用
することが好ましい。

支持体材料を酵素溶液と接触させる場合、支持
体材料が酵素で飽和されるように過剰の溶液を使
用することが好ましい。少なくとも多孔性支持体
材料では十分な酵素溶液を使用して酵素が支持体
材料の外側に外部被覆を形成するために利用でき
ることを確保することが必要である。

利用できる支持体材料すべてに対し適用できる
酵素使用量の数字を与えることは困難である。特
にいくらかの酵素は多孔性支持体材料の細孔に吸
収されるからである。所望の場合、細孔に吸収さ
れるであろう酵素溶液量を決定し、次に細孔に所
要の量以上の過剰溶液が添加されることを保証す
ることができる。細孔に吸収される量を決定する
ための有利な１方法は支持体材料を過剰溶液に浸
漬し、次に溶液を、好ましくは吸引して排出させ
ることである。前後に支持体材料を秤量すると過
剰溶液の存在で細孔に吸収された溶液重量の合理
的近似値を得るであろう。

砂粒子のような無細孔材料では、支持体材料
100mlにつき酵素製剤の１〜25ｇ乾燥重量、更に
好ましくは支持体材料100mlにつき酵素製剤４〜
20ｇそして特に100mlにつき５〜15ｇを含む溶液
を使用することが一般には好ましい。これらの範
囲は限定多孔度（容積で10％までの多孔度）を有
する材料に対しても適当であるように思われ、そ
して細孔が満たされた後多孔性材料の表面被覆に
所要の過剰酵素溶液量に指針を与えるために使用
することができる。

骨炭のようなきわめて多孔性の支持体材料に対
しては、支持体材料100mlにつき酵素製剤５〜70
ｇ乾燥重量、更に好ましくは15〜40ｇ、特に100
mlにつき15〜25ｇを含む溶液を使用することが一
般に好ましい。これらの範囲は10％以上の多孔度
を有する他の材料に対しても適当であると思われ
る。一般に多孔性材料については本方法は前に使
用されたよりも、支持体材料の単位容積につき酵
素製剤のより多い重量を使用する。

ゲル化性被覆の形成を助けるために、本方法は
前に物理的もしくは化学的不動化に対し使用され
たより高濃度の酵素溶液もしばしば使用する。15
〜20％固形の溶液は代表的にはペーストに使用さ
れた。一方本方法は少なくとも25％固形、更に好
ましくは少なくとも35％固形を含む酵素溶液の使
用を基準とすることが好ましい。

少なくとも25％固形を含む酵素溶液は多少の粘
度を有し、これはゲル化性被覆の良好な形成を得
るのに要因であることができる。更に酵素溶液の
適性を考慮する場合、予備試験としてこのような
溶液は水混合性溶媒により粒状もしくは他の沈で
ん生成物を通常与えないことは注目すべきであ
る。事実、パテ状もしくは他の可塑性塊りを得る
が、しかし、本方法における他の変数は最終的に
適否を決定するであろうからこの試験は結論的で
はない。

好ましい濃度範囲は35〜60％固形であるが、固
形は溶液であることを条件としてより高濃度は使
用することができる。

アミログルコシダーゼの不動化に使用するため
に本方法を特に開発したが、酵素の性質は臨界的
ではない。本方法はアミログルコシダーゼのみで
はなく、アミラーゼをも含む糖化酵素に対し特に
適する。しかし、更に一般的には、本方法はたと
えば、オキシド−リダクターゼ、トランスフエラ
ーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼお
よびリアーゼについて使用することができる。本
方法は商業的に入手しうる酵素製剤を容易に使用
することができる。濃厚溶液の製剤は通例必要で
あるが、酵素を精製することは通常不必要であ
る。実際に通例の安定剤の存在は有利であること
ができる。

酵素溶液は水溶液で、好ましくは10〜70重量％
の水分、たとえば35〜60％の水分を含む。更に重
要なことは酵素溶液は好ましくは他の添加材料を
含まない。特にたん白に対するいかなる不溶化剤
をも含むべきではない。支持体材料への酵素のゲ
ル化性被覆の形成は非可逆的に沈でんされない酵
素を支持体材料に加えることを含む。

本方法におけるゲル化性被覆の形成は水混合性
溶媒の存在に更に基づく。アセトンは多くの利益
を、特に価格において供する。その場合には次の
使用のために回収することができ、そして好まし
い水混合性溶媒である。しかし、アセトンの使用
は必須ではなく、他のケトンもしくは低級アルコ
ール、たとえばエタノールのような水混合性溶媒
の他の種類を使用することができる。

上記のように支持体材料は水混合性溶媒と接触
する好ましい２方法がある。もつとも好ましい方
法では、支持体材料は溶媒と混合され、次に酵素
溶液が添加される。別の好ましい方法では、支持
体材料は最初に酵素溶液と接触し、次に溶媒が添
加され、好ましくは架橋結合剤と混合してゲル化
性被覆をゲル化するために使用される。

アセトンもしくは他の水混合性溶媒によつて演
じられる正確な役割および不活性支持体材料の外
側のゲル化性被覆の形成をいかにしてそれが助け
るかについては明らかでない。少なくとも溶媒は
酵素の通例の沈でん形成に作用しないことは明ら
かである。実際に本方法では、溶媒はゲル化性被
覆の形成を助長し、架橋結合に際しゲルを与え、
真の沈でんを与えない可溶性もしくは擬似可溶形
に酵素を保持する。

その作用の部分として、溶媒は支持体材料の表
面位置で酵素溶液の水分含量を修正することを助
けると信じられる。支持体材料を水混合性溶媒と
接触させ、酵素水溶液を添加し、次に架橋結合剤
と接触させることを含むもつとも好ましい方法で
は、酵素溶液の添加中有機溶媒で置換し、それに
よつてシステムから水を除去することは有利であ
ることは明らかである。

溶媒量はシステムに添加された全水分量を通常
超過するであろう。溶媒と水の比率については
２：１以上、特に３：１〜５：１が好ましい。溶
媒の所要量は通例他の変数によるので試行錯誤に
よつて見出されるであろう。従つてすべての場合
に適用されるであろう至適値は挙げることはでき
ない。

不活性支持体材料の外側にゲル化性被覆の形成
中もしくは後に、架橋結合剤は支持体材料上にゲ
ルを形成させるために使用される。好ましい剤は
グルタルアルデヒド、特に50％グルタルアルデヒ
ド水溶液である。前述特許明細書に示されたもの
から選択された他の既知架橋結合剤は使用するこ
とができる。

架橋結合剤は好ましくはゲルの不適当な硬化を
避けるために比較的少量で使用される。グルタル
アルデヒドに対しては、グルタルアルデヒド対酵
素の重量比は１：３〜３：１が特に有利である。

架橋結合剤の使用は不活性支持体材料が酵素含
有ゲルで被覆される所望の生成物を生ずる。特に
ゲル形成工程中全く撹拌がなされない場合、生成
物は支持体材料を含むマトリツクスとして作用す
る連続性ゲル相を有することができる。このよう
な生成物はゲル固有物が不規則被覆である生成物
を与える大きさに破壊することができ、不規則性
はゲルの剪断から生ずる。尚、より良くは、粒状
支持体材料についてゲルマトリツクスの形成は架
橋結合中撹拌−穏かなタンブリングが撹拌の好ま
しい様式である−することにより非常にもしくは
完全に避けることができる。いくつかの状況では
ゲルマトリツクスを維持することが望ましい−こ
のような生成物も本発明の対象の部分である。

架橋結合工程後、生成した生成物は好ましくは
水で洗滌され、何らかの各種試薬の過剰が除去さ
れる。

本発明方法は製造に使用された当初の支持体材
料よりかなり大きい容積を有する生成物を与え
る。代表的には生成物容積は支持体材料の容積よ
り５〜300％、一層しばしば10〜100％大きい。20
〜60％の増加が好ましい。これらの容積増加は支
持体材料の実際容積を規準にして計算することが
できるが、大部分の目的に対しては支持体材料の
嵩容積と関連させ実際的単純化される。

本発明の生成物は次に基質の酵素−媒介変換を
行なうために使用することができる。不動化酵素
は他の不動化システムと同様の方法で使用するこ
とができ、たとえばカラムのような反応容器に入
れることができ、基質は溶液形でカラムを通過す
ることができ、カラムの上方への通過が好まし
い。

本発明を例示する例を示す前に、不活性支持体
上のゲルとしてアミログルコシダーゼの不動化に
対し開発した技術を更に詳細に考える。アミログ
ルコシダーゼは好ましくは次のような２処理のう
ちの１つを使用することによる本発明により不動
化される： 処理Ａ：「回転法」 （） 未使用骨炭粒子を骨炭がもはや酸に対し
て緩衝作用を示さなくなるまで稀塩酸で洗滌す
る。骨炭は付着酸を洗滌して除去し、次に過剰
容量、好ましくは３倍過剰もしくはそのくらい
のアセトンにサスペンドする。生成スラリーは
回転して穏かに撹拌し、濃厚溶液として酵素溶
液を添加するための準備ができる。

（） アミログルコシダーゼ製剤は英国、スト
ツクポートのABMインダストリアルプロダク
ツリミテツドから入手したものを使用する。
ABMから得たアミログルコシダーゼ水溶液は
代表的には20重量％位の固形を含む。先づ若干
の水を蒸発させ酵素濃度を高める。適当には固
形濃度は少なくとも40重量％に高め、有利には
約20ｇもしくはそれ以上の酵素製剤（乾燥固形
として）を骨炭各100mlに対し使用する。酵素
溶液はゆつくり添加し、酵素溶液から水分吸収
するように恐らくはアセトンの間欠的置換をす
ることが最善である。

（） 過剰液体は工程（）の後に骨炭から排
出させる。次に粒子は任意にはアセトンで洗滌
する。この段階で、外部被覆が骨炭粒子上に形
成したことは明らかである。すなわち粒子はね
ばつき相互に粘着しがちである。

（） 酵素被覆は次にグルタルアルデヒドもし
くは他の架橋結合剤を使用して架橋結合させ
る。回転法に関する最善結果は50％グルタルア
ルデヒド水溶液を使用して得た。初めの酵素溶
液が高固形含量（および従つて低水分含量）を
有する場合、いくらかの水を特に添加すること
ができる。タンニン酸はグルタルアルデヒドに
添加しない。グルタルアルデヒド対酵素比は好
ましくは２：３にきめる。更に回転後生成物は
水で洗滌する。いくらか凝集物はあるが、大部
分粒子である。すなわちゲル被覆の形成は明ら
かである。篩別もしくは他の処理は凝集物を破
壊するために使用することができる。

処理Ｂ：「スラリータンク法」 （） 回転法の場合のように製造した酸洗滌骨
炭はほぼ等容の濃酵素溶液と接触させる。適当
には50ｇ位の酵素固形は骨炭各100mlに対し存
在する。

（） 次に被覆骨炭をアセトンおよび50％グル
タルアルデヒド水溶液の撹拌混合物に少量ずつ
添加する。アセトンは液の主要成分であり、ア
セトン対50％グルタルアルデヒド比は約６：１
が有利である。グルタルアルデヒドは好ましく
は工程（）で添加した酵素固形重量の約半分
量で使用する。この工程（）中の撹拌は粒状
生成物を得るのを助ける。しかし、個々のゲル
被覆粒子を特に所望する場合篩別は必要である
ことができる。

工程（）〜（）もしくは（）および
（）を具体化するこのような方法は経済的に有
利な方法で大規模に行なうことができる。酸洗滌
骨炭はUKAEAの開発した不働化方法に対する最
善の特別ガラスもしくはタイタニア球体の約1/10
の価格である。本発明の経費は初めて工業規模で
使用するためのアミログルコシダーゼの不働化に
対し経済的に有利な方法を有することを示唆す
る。

本発明は次の非限定例で例示される。例中、引
用は図面に対しなされる。

第１図は例１の支持体材料として使用された骨
炭粒子の透過光による顕微鏡写真である。

第２図は例１で得た粒状生成物の第１図と同様
の写真である。

第３図は例１で得た粒状生成物の反射光による
顕微鏡写真である。そして 第４図は各種支持体材料の酵素添加量に対する
容積増加グラフで、例８で引用される。

例 １ アミログルコシダーゼを骨炭上で不動化し、生
成物の性質を決定しる。工程（）でアセトンお
よびグルタルアルデヒドの混合物を被覆骨炭に滴
加したことを除いて、上記「スラリータンク法」
と実質的に同じ処理を実験規模の方法で使用し
た。

(i) 製造 ABMインダストリアル プロダクツ リミ
テツドから得たアミログルコシダーゼ水溶液を
40重量％固形まで濃縮した。40％酵素溶液の78
ｇ（69ml）をビーカーで500〜1000ミクロンの
メツシユ径を有する酸洗滌骨炭100ml（80ｇ）
と混合した。溶液は骨炭細孔を満たすのに要し
た容量よりかなり過剰量で含ませた。124mlア
セトンおよび26ml50％グルタルアルデヒド水溶
液の混合物150mlを骨炭に滴加した。生成混合
物は10秒間撹拌し次に１時間放置した。

この方法で、骨炭粒子の分散したゲルの塊り
より成るブロツク生成物を得た。ブロツクは実
験を行なつたビーカーの形をとつた。

ブロツク生成物は水で洗滌し、次に2000ミク
ロン篩を強制通過させて破壊し、アミログルコ
シダーゼのゲル固着物を有する骨炭粒子より成
る粒状生成物197mlを得た。

(ii) 顕微鏡検査 引用は図面の第１図〜第３図に対するもので
ある。

第１図は本試験に作用した骨炭の光学顕微鏡
写真である。この場合透過光を使用する（すな
わち、光は粒子のうしろから来る）。粒子は不
規則であるが、明白な規定表面を有することが
わかる。

第２図も透過光による写真で、本試験で得た
粒状生成物の同じ倍率のものである。暗黒粒子
を尚見ることができるが、明らかにゲル材料の
沈着物を付着させている。

固着ゲルの存在も第３図から明らかである。
それは第１図および第２図と同じ倍率で写した
同じ生成物の写真である。しかしこの場合、反
射光を使用する（すなわち、光は粒子の前面か
ら来る）。ゲルは明瞭に円形の光反射区域とし
て見ることができる。骨炭自体はきわめて僅か
の光反射性しか有しない。反射光により骨炭自
体を写真にとる試みは明らかな特色を有さない
均一黒色像を示した。

(iii) 性質 粒状生成物の酵素活性は標準方法で分析し
た。試験カラムは生成物を使用して満たしグル
コースシラツプのDEを上げる能力を分析し
た。DEはデキストロースとして定量し乾燥重
量の％として計算した場合、存在する還元糖量
である。PH4.5、55℃および40％固形の42DE酸
−稀薄化シラツプを各種流速（１時間当りのか
らのカラム容積で測定、ecv／時間）でカラム
を下に通し、排出するシラツプのDEを測定し
た。

約81.3％デキストロースのシラツプを
10ecv／時間の流速で得た。一方12ecv／時間
で生成物は80％デキストロースシラツプであつ
た。

例 ２ 69mlの40％酵素溶液の代りに66mlの50％酵素溶
液を使用して例１を反復した。ブロツク生成物を
同じ方法で得た。しかし剪断に対し一層抵抗性の
あることは注目に値した。篩別後223mlの粒状生
成物を得た。

同じ方法で分析すると、42DEシラツプは
10ecv／時間で80％デキストロースシラツプに、
12ecv／時間で78.2％デキストロースシラツプに
変換した。

例３および４ 76mlの61％酵素溶液（例３）もしくは72mlの
30.5％溶液（例４）を使用して例１を反復した。
それぞれ生成粒状生成物は292mlもしくは129mlの
容積であつた。

同じ方法で分析すると、例３の生成物は
10ecv／時間で76％デキストロースシラツプおよ
び12ecv／時間で73.4％デキストロースシラツプ
を示した。

例４の生成物は10ecv／時間で78.2％デキスト
ロースシラツプおよび12ecv／時間で76.7％デキ
ストロースシラツプを示した。

比較例 １ 粒状生成物を英国特許第1514707号明細書記載
の方法に基づく最善の方法を使用し上記例に使用
したアミログルコシダーゼから製造した。

25mlの17％酵素溶液を４℃で100mlのタイタニ
ア球体に添加した。１ｇのタンニン酸（酵素沈で
ん剤）および９ｇのグルタルアルデヒドを含む60
mlの冷却不動化液を撹拌しながら加え、不動化は
５時間続行した。

生成した生成物は顆粒であつた。

洗滌後、生成物は上記例におけると同じ方法で
分析した。10ecv／時間で67.2％デキストロース
のシラツプを得た。12ecv／時間では生成物は
61.6％デキストロースであつた。僅か5ecv／時間
の流速は81.3％デキストロースシラツプを製造す
るのに所要であつた（81.3％デキストロースシラ
ツプは10ecv／時間で得た例１と比較せよ）。

比較例 ２ 支持体材料として100mlの骨炭を使用すること
を除いて比較例１の方法を反復した。

生成した生成物も顆粒であつた。

分析すると61.7％デキストロースシラツプを
10ecv／時間で、12ecv／時間で56.5％デキストロ
ースシラツプを得た。5ecv／時間で生成物は74.7
％デキストロースシラツプを示した。

例 ５ グルタルアルデヒドの代りにホルムアルデヒド
を使用して例１を反復した。

生成物により42DEシラツプから4.6ecv／時間
で78％デキストロースシラツプを生成した。

例 ６ アミログルコシダーゼを回転法で不動化した。
５Kgの酸洗滌骨炭（500〜1000ミクロン）を20
のアセトンにサスペンドし、大混合機で回転し
た。2.5Kgの60％固形アミログルコシダーゼを50
分にわたつてポンプで加えた。その後７の湿ア
セトンを取り出し４Kgの50％グルタルアルデヒド
を1.75Kgの水と共に添加した。混合物は２時間回
転し、次に水洗し、いくらか凝集物のある主とし
て粒状生成物を得た。生成物は使用前に2000ミク
ロン篩を通した。

生成物中の酵素の安定性は半減期として測定し
た。300mlの生成物をカラムに入れ、42DEシラツ
プを88DEシラツプに連続規準で変換するために
60℃で使用した。週間隔で88DEシラツプを得る
に要した流速を記録した。試験続行と共に88DE
シラツプに対する流速は減少した。

結果から、そして半減期数学を使用して、生成
物の酵素活性は40日の半減期を有することを計算
した。

スラリータンク法により製造した生成物でも同
じ40日の半減期であることがわかつた。

例 ７ スラリータンク法を他の酵素の不動化に使用し
た。

(a) デキストラナーゼ 70ｇの20％固形デキストラナーゼを74ｇの骨
炭と混合し、アセトンで200mlにした48ｇの50
％グルタルアルデヒドを添加した。1.5時間後
生成物を洗滌し、破壊した。

生成物カラムは110mlであつた。PH5.0および
55℃で５％デキストラン溶液を使用して分析し
た。3.6ecv／時間で丁度20％を超えたデキスト
ロース、マルトースおよびトリオースの組合せ
物を生成した。

(b) かびα−アミラーゼ ノボ インダストリーからのフアンガミル
（Fungamyl）800L200ｇを骨炭400ｇに添加し
た。アセトン中の50％グルタルアルデヒドの60
ｇ／混合物を添加し、1.5時間不動化を続行
した。洗滌後850mlの生成物を得、篩別し次に
使用の準備を整えた。

42DE酸−稀薄化シラツプをPH6.0、40％固形
および50℃で変換し、18ecv／時間で30％マル
トースを得た。

(c) 細菌α−アミラーゼ ノボ インダストリーからのバン（Ban）
L120 100ｇを骨炭200ｇに撹拌しながら加え
た。アセトン中の50％グルタルアルデヒド60
ｇ／を加え、混合物は1.5時間放置した。

洗滌および篩別後生成物はPH6.0および55℃
で、３（DP₃）以上の重合度を有するオリゴサ
ツカライド75％を含む酵素−稀薄化シラツプを
使用して分析した。3.9ecv／時間の流速で、シ
ラツプはDP₃以上のオリゴサツカライド45％を
有する生成物に変換した。

(d) プルラナーゼ ABM ケミカルズ リミテツドから得たプ
ルラナーゼ溶液100ｇを200ｇの骨炭に添加し
た。アセトン中の50％グルタルアルデヒド60
ｇ／を添加し、混合物は1.5時間放置した。

洗滌および篩別後、生成物はDP₄以上のオリ
ゴサツカライド22.5％を含む13％ビール麦芽汁
を使用して分析した。55℃、PH6.0および
20ecv／時間で、麦芽汁はDP₄以上のオリゴサ
ツカライド15％を含む生成物に変換した。

(e) ラクターゼ アスペルギルス オリゼー（Aspergillus
oryzae）からのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで
あるスミラクト（Sumylact）45ｇを40ｇの水
に溶解し、60ｇの骨炭を撹拌加えた。15mlの33
％グルタルアルデヒドを185mlのアセトンに溶
解し、添加した。不動化は1.5時間続行した。

洗滌後、生成物は175mlの容積を有する。PH
5.0および50℃で11％再構成ホエイに対し分析
した。１時間につき酵素生成物１当りホエイ
固形0.45Kgで、10％残留ラクトースを含むシラ
ツプを生成した。

(f) インベルターゼ グルセロールを含む80ｇのインベルターゼ溶
液（屈折率1.408）を74ｇの骨炭に添加し、次
いで骨炭は200mlアセトンの３バツチで洗滌し
た。アセトンで240ｇ／にした。50％グルタ
ルアルデヒドを添加し、混合物は10秒間撹拌
し、次いで１時間放置した。

洗滌および篩別後、生成物はPH6.5および40
℃で40％固形シユクロース溶液に対し分析し
た。2.4ecv／時間で、シユクロースは45％グル
コース、45％フラクトースおよび６％シユクロ
ースに変換したが、一方6.6ecv／時間で30％グ
ルコース、30％フラクトースおよび30％シユク
ロースを得た。

例 ８ 各種支持体上の不動化アミログルコシダーゼの
シリーズを例１に基づく方法を使用して行なつ
た。

不動化は40％固形酵素および425〜600ミクロン
の範囲の粒径の異る３支持体試料100mlを使用し
て行なつた。酸洗滌骨炭およびタイタニア粒子は
細孔を有する支持体を表わし、一方砂は無細孔支
持体として使用した。できる限りの最高までの酵
素荷量範囲にわたつて各支持体について数個の不
動化を行なつた。この最高は細孔を有する支持体
に対しては70ml付近で、無細孔支持体に対しては
40mlであつた。

不動化生成物は水洗し、850ミクロン篩を通し
て圧搾し、個々の粒子を得た。最終容積を測定し
た。

第４図を引用する。図では生成物容積は添加酵
素量に対しプロツトする。毎回100mlの支持体材
料を使用したことに留意すると、砂が常にゲル形
成を示すより大きい生成物容積であることがわか
る。

他方、多孔性支持体材料については、酵素の或
る量（骨炭では12ｇ、タイタニアでは16ｇ）が添
加されるまで容積は全く増加しない。その後酵素
量の増加につれて生成物容積の漸増がある。

第４図において、骨炭の細孔は酵素溶液30ml
（すなわち、12ｇ固形）を吸収するが、一方タイ
タニアは溶液40mlを吸収する、砂は満たす細孔が
ないから、ということに基づいて容易に説明する
ことができることを結果は示す。

存在する細孔が一度満たされると、３支持体材
料はすべて同じ仕方で作用し、酵素添加量と容積
増加間に同じ関係を与える。

酵素活性は42DEシラツプに対して評価した。
この場合79％デキストロースシラツプを生成する
のに要した流速は初めの支持体容積100mlに対し
約60mlの容積増加を示した生成物を使用して測定
した。

30ｇの酵素を使用して製造した最終容積163ml
の骨炭生成物は7.4ecv／時間で79％デキストロー
スシラツプを生成した。最終容積160mlで32ｇの
酵素により製造したタイタニア生成物は7.2ecv／
時間で79デキストロースシラツプを生成した。最
終容積162mで、15ｇの酵素により製造した砂生
成物は7.0ecv／時間で所望のシラツプを生成し
た。

これらの結果は細孔内に不動化された酵素は
42DEシラツプを79％デキストロースシラツプに
変換するのに、何らかの役割があるとすればほと
んど演じていないことを明らかに示す。

対照的に、外部ではなく細胞内への酵素の最高
添加量は著しく異る結果を示した。骨炭もしくは
タイタニアの100mlに対しそれぞれ12ｇもしくは
16ｇの酵素を使用して最終生成物は実質的に100
mlの容積であつた。79％デキストロースシラツプ
は骨炭生成物から4.9ecv／時間で、タイタニア生
成物から5.8evc／時間で得た。これらの流速は最
終容積160mlを有する本発明生成物に対し測定さ
れた流速のそれぞれ約60％および約80％である。

ゲル固着物の水分含量は支持体材料を含めて
160mlの生成物容積を生じた試験を反復すること
によつて評価した。この方法はゲル自体のブロツ
クの密度1.02ｇ／mlおよび水分含量80％を示し
た。60％酵素溶液を使用し反復して水分含量72％
を有するブロツクを得た。メツシユを強制通過さ
せた後ゲルは42DEシラツプを変換する能力を示
した。操作の延長は困難であつた。流動床はゲル
がシラツプと同じ密度であつたのでできなかつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は骨炭粒子の透過光による顕微鏡写真
（粒子構造）を示す。第２図は骨炭粒子を不動化
処理した生成物の透過光による顕微鏡写真（粒子
構造）を示す。第３図は骨炭粒子を不動化処理し
た生成物の反射光による顕微鏡写真（粒子構造）
を示す。第４図は各種支持体材料の酵素添加量に
対する容積増加を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 基質透過性外部固着物を有する不活性支持体
   材料からなる不動化酵素生成物であつて、基質透
   過性外部固着物は分子間架橋により不動化されて
   いる酵素調製物および水分50〜95％より基本的に
   なるゲルであり、そして不活性支持体材料の嵩容
   積よりも５〜300％大きい嵩容積を有することを
   特徴とする不動化酵素生成物。 ２ 不活性支持体材料が粒状骨炭である特許請求
   の範囲第１項の不動化酵素生成物。 ３ 酵素源として、基質透過性外部固着物を有す
   る不活性支持体材料からなる不動化酵素生成物で
   あつて、基質透過性外部固着物は分子間架橋によ
   り不動化されている酵素調製物および水分50〜95
   ％より基本的になるゲルであり、そして不活性支
   持体材料の嵩容積よりも５〜300％大きい嵩容積
   を有する不動化酵素生成物を用いることを特徴と
   する、基質の酵素変換方法。 ４ 不動化酵素生成物の製造方法であつて、不活
   性支持体材料100ml当り酵素調製物５〜70ｇ（乾
   燥重量）の量の酵素調製物から製造された不動化
   させる酵素の25〜65％水溶液および酵素水溶液の
   容積の1.5〜５倍の量の水−混和性有機溶媒と接
   触させることにより、不活性支持体材料上にゲル
   化しうる酵素含有外部被覆を形成させ、次いでこ
   の外部被覆した支持体材料を酵素調製物の１ｇ乾
   燥重量当り0.3〜３ｇの量の架橋剤と接触させ
   て、不動化酵素調製物および水分50〜95％よりな
   るゲルを形成させ、その嵩容積が不活性支持体材
   料の初期嵩容積より５〜300％大きいことを特徴
   とする不動化酵素生成物の製造方法。