JPS6221513B2 - - Google Patents
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Description
本発明はグルタルジアルデヒドを用いて、酵素
沈殿物質の存在下に、乾燥重量に関して２ないし
８倍の水を吸収する容量を有する硬化タンパク質
からなる高分子量の水不溶性多孔質重合体へ結合
した固定酵素に関する。更にまた、本発明はこれ
ら固定酵素の製造ならびに生物技術的反応の実行
のためのこれらの使用に関する。 最近２，３年で酵素を水不溶性担体へ付着させ
る多数の方法が技術文献および特許文献から知ら
れるようになつた。例えば、R.A.メツシング
（Messing）（編集者）、工業的反応のための固定
化酵素、アカデミツク プレス、ニユーヨーク
1975年により要約された概説がなされた。現状の
知識によれば、酵素を不溶性にするための四つの
付着法、即ち１吸着、２イオン的結合、３カプセ
ル化、４担体への共有結合による結合あるいは酵
素の架橋が考えられる。これら固定化の基本型の
組み合わせも知られている。 無酵素担体、例えば活性炭または多糖類へ吸着
により結合させた酵素は比較的弱い吸着的付着の
結合として容易に脱着が起こるという欠点をも
つ。特に、もしイオン濃度および温度の変化が起
これば吸着結合の離脱、従つていわゆる酵素の
「滲出」が容易に起る。 多陰イオン性あるいは多陽イオン性担体（例え
ば、イオン交換樹脂のような）への酵素のイオン
的結合の場合にも、酵素が原則として非常に弱い
イオン性の基を含むに過ぎないので、多イオン性
担体と酵素との間の結合は比較的弱いという欠点
がある。例えば、飲料処理の進行中に飲料からあ
る種のイオンの故意でない除去につながる付着酵
素のイオン交換効果は多くの反応を乱す決定的な
欠点である。 重合体物質（例えば、架橋ポリアクリルアミ
ド）中にカプセル化された酵素は、その封入材料
の分子の網を通しての拡散が比較的困難であると
いう主な欠点を有する。このように封入された酵
素の見掛けミハエリス定数は低分子基質に比較し
てこれにより増加する。その上、封入された酵素
がその弾性のために封入材料の細孔から突き出
し、このようにして「滲出する」という危険があ
る。 ここに述べた付着の第四の型に関しては、酵素
が共有結合であり、それ故に水不溶性担体の反応
基へ非常に固く結合される。酵素の固定に関する
発行物の殆ど、ならびに本特許願はこの型の固定
化に関する、しかし、このようにして製造された
公知の調整物は全体的一部類として経済的、技術
的観点から有用でない。それはカツプリング（結
合）試薬または担体物質が余りに高価すぎるか、
または余りに高価な製造法を使用せねばならない
からである。現在知られている方法によるカツプ
リングのためには、このカツプリングの手順の間
に酵素の大部分が不活性化されるので、相当に過
剰の酵素を用いて作業しなければならない。この
方法の殆どは、担体物質がその表面を酵素タンパ
ク質で覆われるに過ぎないので、担体物質当りの
酵素量は小部分に過ぎない。仕上げり製品の微粉
化（ミクロ化）によりある程度の補助は可能であ
るが、これら調整物はそれらの細かさと充填床反
応器内での使用のために、液流により辛うじて通
されるに過ぎない。酵素の固定化法の殆どのもう
一つの欠点は担体物質（例えば、ガラス、ケイソ
ウ土）がある形態に束縛されること、そしてこれ
らに球形、裂片または膜状を与えたりこれらの他
の物質に対する覆い（例えば、網）として使用し
たりすることが不可能なことである。また担体物
質およびカツプリング試薬のあるものはその毒性
のために疑問視される。 公知の固定酵素の上記欠点の幾つかは、従来の
方法による非タンパク分解酵素に対しては、これ
ら酵素を例えばグルタルジアルデヒドでコラーゲ
ンに結合させることにより克服された。しかし、
このようにして製造された調製物は微生物による
攻撃を受け易くそしてその比活性は低い。同様な
問題がゲル形成性タンパク質で酵素を橋かけする
ことにより得られる調製物に存在する（ドイツ
OS22 46 002参照）。この場合は酵素およびゲル
形成性タンパク質が不規則に橋かけするので均質
な混合物を生ずる。これら調製物は微生物に対し
て一層安定であるが、酵素が粒子の全横断面にわ
たり均一に分布するのでその効果は乏しい。高活
性に関しては、橋かけが比較的弱く起こるだけで
ある。これは充填床で使用したとき酵素の封鎖お
よび滲出が起こる程軟質の調製物に導く。しか
も、より強い橋かけの場合には、余りに強い結合
のためにそして内部酵素分子の封入のために不活
性化が起こる。最後に述べた固定法の一つの重大
な欠点は、これらをタンパク分解酵素に対して使
用できないという事実である。 本発明の主題は、下記の利点をもし可能ならば
同時に所有する水不溶性の非タンパク分解酵素お
よびタンパク分解酵素を製造することにある： ・ 安価な製造法、 ・ 固定処理中ならびに長い反復使用後に高度の
活性を得る、 ・ 微生物に対する大きい抵抗、 ・ 担体物質の形の大きい変動性、 ・ 充填床形を使用する場合の良好な通過性、 ・ 高い比活性、 ・ 低い見掛けミハエリス定数、 ・ 望まないイオン交換体性または吸着性がな
い、 ・ 毒性が余り問題とならない融和性担体。 もし酵素を先ずその量の２ないし８倍の水を吸
収する容量を有する膨潤性硬化（変性）タンパク
質によつて水性溶解形で浸漬し、その後酵素沈殿
物質の存在でグルタルジアルデヒドにより結合す
ると、上記評価基準を満足する固定化酵素が得ら
れることが、ここに発見された。このようにする
と、酵素が高分子量の多孔質硬化タンパク質担体
の外部および内部の幾つかの場所につるしたよう
な調製物を生ずる。 水不溶性担体の製造に向く原料として各種の型
の水溶性タンパク質（例えば、ゼラチン、卵白、
アルブミン、大豆タンパクなど）が考えられる。
これらタンパク質を硬化により（例えば、ホルム
アルデヒド、グルタルジアルデヒド等のアルデヒ
ド化合物により）水に不溶性となし、そして任意
に他の処理（例えば温度の変性作用）によつて修
飾し、０ないし110℃の温度範囲でこれらがその
乾燥重量の２ないし８倍量の水を吸収する容量
（容量は本質的に一様に留まる）を有するように
することが肝要である。しかし、未処理の出発タ
ンパク質の膨潤挙動は変動しうる：例えば、乾燥
ゼラチンは冷水中で約10％の水（＝その乾燥重量
の10分の１）を吸収するだけであるが、他方アル
ブミンおよび卵白は冷水に完溶する。しかし、実
例として述べたタンパク質からまた他の本来非常
に異なるタンパク質から、それら出発タンパク質
を適当な温度で水に溶解し、これを硬化、架橋剤
（例えば、ホルマリン）で橋かけし、次にそれを
乾燥熱処理に付することによつて、単純な方法で
本発明に望まれる性質を有する重合体をつくり出
すことが可能である。このようにして、本発明は
比較的高価なゲル形成性タンパク質に頼らねばな
らないということはなく、価値の低いタンパク
質、例えば低ブルーム価のゼラチン、あるいはも
うゲル化しない液状廃ゼラチン、ならびに他の非
ゲル化タンパク質も使用できる。 酵素を固定しようとする多孔質硬化タンパク質
の製造法は使用した出発タンパク質、用いた硬化
剤、利用できる装置、担体の望む形状（例えば、
裂片、球、膜、網など）等に応じて広い範囲内で
変化しうる。実施例は幾つかの基本的可能性、判
断に依存する任意の変動および熟練者の技術的能
力を示す。 硬化剤として通常のタンパク質硬化性アルデヒ
ド化合物（例えば、ホルムアルデヒド、グルタル
ジアルデヒド他）を考えることができる。例え
ば、グルタルジアルデヒドによつて硬化したタン
パク質に関して後により多くの酵素活性を結合し
うるような方法で硬化した担体物質に関しては、
ホルムアルデヒドの使用が特に有利である。その
上、グルタルジアルデヒドで橋かけした担体は、
余計なしばしば望まないタンニン吸着活性を有す
るが、この活性はホルムアルデヒド硬化タンパク
質は有しない。経済性理由からもタンパク質のホ
ルムアルデヒド硬化は本発明の特に適当な具体例
を表わす。 本発明の特に適当な具体例によれば、担体物質
の製造に企画された水溶性の出発タンパク質を３
ないし10倍量の水（タンパク質の量に関して）に
入れ、混合物を40ないし80℃に加熱する。このタ
ンパク質溶液へホルムアルデヒド溶液（例えば、
ホルマリン）を、用いた乾燥タンパク物質に関し
てホルムアルデヒド約２ないし５％となる量で加
え、溶液と混合する。ある時間後、かきまぜた溶
液は凝固するが、この凝固時間は一般にできるだ
け温度を高くし、PH値をできるだけ８ないし10に
近づけ、そして多量のホルムアルデヒドを添加す
ることにより短縮しうる。しかし、普通には余り
に迅速な凝固は望ましくない。これがタンパク質
−ホルムアルデヒド−水混合物の均一な混合を困
難にするからである。更にまた、遅い凝固はあら
かじめ担体を望みの形状につくる可能性をもたら
す。例えば、担体を対象物（かきまぜ機、網）の
浸漬によりこれら対象物へ覆いとして固定でき、
あるいは噴霧乾燥によつて非常に細かい球状の粒
子につくることができる。 本発明による担体として、人工角の名前で知ら
れる硬化タンパク質は適当でない。人工角はその
乾燥重量の３分の１までの水を吸収する容量を有
するだけであり、非常に限定された方法でのみ酵
素と結合でき、そしてこのようにして得られた固
定酵素調製物は非常に低い比活性にしか達しない
ことが示された。 酵素をカツプリングするには、乾燥状態の硬化
担体を、水に溶解した酵素と共に、水不溶性担体
が膨潤しつつある間に全酵素含有液体が吸収され
るような量で使用するのがよい。このように行な
う際は、担体の外面と内面とを酵素溶液で濡ら
す。次に酵素を沈殿させる活性を有しグルタルジ
アルデヒドが可溶である通常の液体、例えばアセ
トン、エタノール、イソプロパノールをその中に
カツプリング剤としてグルタルジアルデヒドを溶
解して加える。酵素が結合し終つた後、調製物を
よく水洗し、望むならば安定化物質（例えば、グ
リセリン、ソルビトール、プロピレングリコー
ル）を添加して、適当な方法で（例えば、溶媒を
用いて、あるいは噴霧乾燥により）乾燥するか、
あるいは湿つた状態で保存し、そして先の目的に
向ける。 酵素のカツプリング手順に対しては次の条件が
特によい：酵素水溶液を担体乾燥重量の８倍まで
の量で加える。酵素沈殿活性を有する液体を、概
して固定を望む酵素が溶解しないような量で加え
る。知られる通り、これらの量は酵素および沈殿
剤に応じて大きく変動するが、熟練者によつて各
酵素について試みることにより簡単に決定できる
かもしれない。なるべくはグルタルジアルデヒド
を、反応バツチ中の濃度が0.5ないし５％となる
量で用いるのがよい。全体のカツプリング反応は
室温で５分から５時間までの時間内に果すのがよ
い。 本発明に係る方法によれば、公知の方法と反対
にタンパク分解活性のある酵素もまた結合でき
る。担体の硬化によつてそのタンパク質を結合し
ようとするプロテアーゼのタンパク分解による質
低下に対み抵抗性にすることに成功し、従つて担
体材料の破壊を伴なうことなく固定化をなし遂げ
うるのである。この目的に対して２ないし４倍の
水を吸収しうる前硬化タンパク質を担体として使
用するのがよい。その量の４ないし８倍の水を吸
収しうる担体もある種のタンパク分解酵素、例え
ばラブに対して適当である。個々の場合における
有用な限界の決定は熟練者次第である。望むなら
ば、酵素沈殿活性を有する物質の添加まで、例え
ば担体に低温をかけることによりプロテアーゼの
タンパク分解攻撃から保護できる。グルタルアル
デヒドカツプリング反応後はもはや担体の質低下
の危険はない。 本発明により固定された酵素は、対応する可溶
性酵素が適する同じ生物技術的反応の実施に一般
に適当である。更にまた、これらは反復および継
続使用に、ならびにまた反応混合物からの（例え
ば、飲料からの）酵素の除去が望まれ、そして法
律で規定されている場合に対して特に好適であ
る。反復の長時間使用に対し本調製物の微生物に
対する高い抵抗性ならびに公知の滅菌剤（例え
ば、第四アンモニウム化合物、溶媒など）により
容易に滅菌できることは特に有利である。 下記の実施例は本発明を制限することなく本発
明を説明するためのものである。 実施例 １ 粉末化ゼラチン（アルカリで可溶化、80ブルー
ム）１Kgを６の冷水中に入れ、60℃に加熱す
る。このようにするとゼラチンが溶解する。次
に、かきまぜながら、ホルマリン（＝ホルムアル
デヒドの35重量％溶液）150mlを加える。２分30
秒後全体が凝固しゲルを形成する。このゲル化塊
を粗い湿つたゲル片が生ずるようにミンサーを通
して回す。高さ５cmの層としてゲル片を115℃で
空気を循環させた乾燥キヤビネツト中のトレー上
で15時間乾かす。乾いた粒子を網をもつブロウイ
ングミルで粉砕し殆どが50ないし100μｍの粒度
とする。裂片形のこれら粒子は水に不容であり、
その乾燥重量の4.8倍の水を吸収する容量を有す
る。 この担体粉末0.5Kgに市販液状グルコースオキ
シダーゼ−カラターゼ混合物0.1と蒸留水1.4
からなる溶液1.5をまぜ込む。市販グルコール
オキシダーゼ−カタラーゼ混合物は1780サリー
（Sarrett）単位／mlのグルコース オキシターゼ
活性および880ベーカー（Baker）単位／mlのカ
タラーゼ活性を有する。次にこの混合物ヘアセト
ン２および25％グルタルジアルデヒド溶液200
mlを加える。その後、反応混合物を30℃で60分間
放置する。次にこれを過し、固体粒子を約50
の蒸留水で過器上で徹底的に洗浄する。残留す
る湿つた塊は1.95Kgの目方を有する。グリセリ
ン1.05Kgを添加して塊を細かく懸濁し、先の使用
に供するため冷蔵庫に保存する。 活性の検査前ならびに他の試験の前にこのグリ
セリン溶液を各度毎に水でよく洗浄する。表１は
調製物の最も重要な分析データを示す。 表 １ 酵素乾燥物質含量 〔ｇ／100ｇ〕17.6 グルコース−オキシターゼ活性
〔SU／ｇ TS〕178 カタラーゼ活性 〔BU／ｇ TS〕96 洗浄に対する調製物の安定性を調べるため、10
ｇをカラムとして蒸留水で連続的に洗浄する。１
日間隔で酵素粒子の活性を調べる。14日以内で有
意な活性減少が起こらなかつたことが見出され
た。洗浄液として水の代りにビールを用いたとき
も同じ結果が得られた。 固定酵素調製物のミハエリス定数ならびに可溶
性グルコースオキシダーゼのそれを基質としてグ
ルコースを用いて決定する。溶解酵素形と固定酵
素形との間に有意差が見出されない。第１図はグ
ルコース濃度の関数としての可溶性酵素および固
定化酵素の相対反応速度を示す。 実施例 ２ 乾燥卵白３ｇを40℃の水10mlに溶解し、ホルマ
リン0.3mlと混合する。この混合物を真空乾燥キ
ヤビネツト中100℃、10ないし20トルで乾燥す
る。乾燥したプラスチツクを100から200μｍの粒
度に粉砕し、ふるい別する。このものは水に不溶
であり、その乾燥重量の４倍の水を吸収する容量
をもつ。520LU／ｇのラクターゼ活性を有するア
スペルギルス フラブス（Aspergillus flavus）
からの市販ラクターゼ0.1ｇを蒸留水1.5mlに溶解
する。この酵素溶液中に前記プラスチツク粉末
0.5ｇをまぜ込む。次にかきまぜながらアセトン
３mlおよび25％グルタルジアルデヒド0.25mlを加
える。この混合物を25℃で60分間放置し次に過
する。過器残留物として残る結合酵素を蒸留水
でよく洗浄する。このものは乾燥物質１ｇにつき
42LUの活性を有する。結合酵素調製物の乾燥物
質の全量は0.61ｇに達する。 実施例 ３ 粉末化ゼラチン（酸により可溶化、80ブルー
ン）１Kgを冷水５中でかきまぜ、45℃に加熱す
る。ゼラチンの溶解後、100mlのホルマリンを加
える。溶液を45℃に保ち、空気取入れ口温度210
℃、空気出口温度100℃そして空気量500Nm3／時
間で２物質ノズルを有する実験室用噴霧乾燥器内
で噴霧乾燥する。乾燥重量の７倍の水を吸収する
容量を有する水不溶性微細粉末を生ずる。750サ
リー単位／mlの活性を有するカタラーゼ不含グル
コース−オキシダーゼ溶液0.50mlを蒸留水１mlと
混合する。次に前記粒末化重合体0.5ｇを加え
る。この混合物をアセトン２mlおよび25％グルタ
ルジアルデヒド溶液0.2mlと混合し、室温で60分
間放置する。調製物を過器上で蒸留水によりよ
く洗浄する。計0.59ｇの固定乾燥酵素物質が得ら
れ、そのグルコース−オキシダーゼ活性は乾燥物
質１ｇにつき290サリー単位である。 実施例 ４ 粉末化ゼラチン（酸により可溶化、80ブルー
ム）20ｇを60℃でかきまぜながら蒸留水100mlで
溶かす。溶解したゼラチンへホルマリン２mlを加
える。次に20cm2の表面を有するかいをもち油をよ
く除去したかきまぜ機をこのゼラチン−ホルマリ
ン混合物中に浸し、直ちにそれから除く。過剰の
ゼラチン−ホルマリン混合物を滴り落させ、かき
まぜ機を乾燥およびホルマリン−ゼラチン混合物
の架橋のため105℃の乾燥キヤビネツト中に置
く。ここで薄いプラスチツク層で覆われたかきま
ぜ機を次に冷却し、水100ml中原子牛レンニン
（Messrs.Hauser）20ｇの溶液中に１分間浸す。
次にレンニンで濡らしたかきまぜ機をアセトン70
ml、水30mlおよび25％グルタルジアルデヒド10ml
の溶液中に60分間放置し、その後、流水下で60分
洗う。 その凝乳活性を検査するため、新鮮な全クリー
ム牛乳200mlをゆつくりかきまぜるのにこのかき
まぜ機を使用する。約60秒後に強いカゼイン沈殿
形成を起こしたが、これはかきまぜ機が依然凝乳
活性を有することを証明するものである。次にか
きまぜ機を洗浄し、再び新鮮な全クリーム牛乳
200mlをかきまぜるのに使用する。この手順を10
回くり返したとき、各回とも50から70秒後に強い
カゼイン沈殿を起こした。 実施例 ５ 粉末化ゼラチン（アルカリで可溶化、80ブルー
ム）１Kgを冷水６中に入れ、60℃に加熱する。
このようにするとゼラチンが溶ける。次にかきま
ぜながら25％グルタルジアルデヒド溶液250mlを
加える。約２分後全体が凝固してゲルを生ずる。
これをミキサーを通して回し、120℃で空気を循
環させた乾燥キヤビネツト中のトレー上に約５cm
の層として乾かす。 乾いた粒子を網を有するブロウイングミルで粉
砕し、大部分が50ないし100μｍの粒度を得るよ
うにする。これら破片状の粒子は水に不溶であ
り、その乾燥重量の3.1倍の水を吸収する容量を
有する。 担体粉末0.5Kg中に市販液状グルコースオキシ
ダーゼ−カタラーゼ混合物0.1および蒸留水1.3
からなる溶液1.4をまぜ込む。市販グルコー
スオキシダーゼ−カタラーゼ混合物は1780サリー
単位／mlのグルコースオキシダーゼ活性と800ベ
ーカー単位／mlのカタラーゼ活性を有する。次に
この混合物にアセトン２と25％グルタルジアル
デヒド溶液200mlを加える。反応混合物を30℃で
60分間放置する。その後、これを過し、固体の
粒子を過器上約50の蒸留水で徹底的に洗浄す
る。残留する湿つた塊は1.80Kgの重量を有す
る。このものをグリセリン1.20Kg中に微細に懸濁
し、先の使用まで冷蔵庫に保存する。 活性を調べる前ならびに他の検査の前にグリセ
リン溶液を水でよく洗浄する。表２はこの調製物
の最も重要な分析データを示す。 表 ２ 酵素−乾燥物質含量 〔ｇ／100ｇ〕17.8 グルコースオキシダーゼ活性
〔SU／ｇ TS〕134 カタラーゼ活性 〔BU／ｇ TS〕58 洗浄に対する安定性およびグルコール基質に対
するミハエリス定数に関して、分析の許容範囲内
で実施例１と同じ値が見出された。 実施例 ６ 粉末化ゼラチン（アルカリで可溶化、80ブルー
ム）10Kgを約20℃の水60中に入れ、50℃に30分
間加熱する。次にかきまぜながらホルマリン3.5
を加える。約２分後、全体が凝固してゲルを生
ずる。これをミンサーで回わし、約５cmの層とし
て108℃の空気を循環させた乾燥キヤビネツト中
のトレー上で24時間乾燥する。乾いた粒子を網を
有するブロウイングミルで粉砕し、粒度50から
100μｍの担体粉末が得られるようにする。破片
状の粒子は水に不溶であり、その乾燥重量の3.2
倍の水を吸収する容量を有する。 この担体粉末５Kgに45.000NF単位／mgの活性
を有する市販パパイン0.5Kgからなる０℃に冷却
した溶液13を０℃で加える。次にイソプロパノ
ール30と25％グルタルジアルデヒド１をこれ
にまぜ込む。この反応混合物を５分以内に25℃に
加熱し、この温度に60分間保つ。その後これを
過し、脱イオン水約200で十分によく洗浄す
る。約18Kgの重量を有する残留塊を脱イオン水
20中に再懸濁し、２物質ノズルを有する実験室
用噴霧乾燥器で空気取入れ口温度180℃、空気出
口温度85℃および空気流450Nm3／時間で乾燥す
る。520NF単位／mgの活性を有する固定乾燥調整
物5.34Kgが得られる。 実施例 ７ 1070グルコアミラーゼ単位／ｇを有する黒カビ
（Aspergillus niger）からの市販アミログルコシ
ダーゼ１Kgを14の脱イオン水で溶かす。次に実
施例１に記載のようにして調製した担体粉末５Kg
をこの中に混入する。担体粉末による酵素溶液の
吸収後、アセトン20およびグルタルジアルデヒ
ド１をかきまぜながら加え、混合物を30℃で60
分間放置する。その後これを過し、約300の
水で洗浄する。残留する塊を約30の脱イオン
水に再懸濁し、２物質ノズルを有する実験室用噴
霧乾燥器で空気取入れ口温度170℃、空気出口温
度85℃、および空気流400Nm3／時間で乾かす。
162グルコースアミラーゼ単位／ｇの活性を有す
る固定乾燥調製物5.20Kgが得られる。 ホツプを添加したライトビール麦芽汁５をの
り状ボトム酵母（Rh株、ベルリンの
「Versuchsund Lehr−anstalt ｆｕ¨ｒ
Brauerei」）20mlおよび上記固定アミロ−グルコ
シダーゼ調整物１ｇと混合する。これと並行し
て、同様に第二のバツチを用意するが、しかしア
ミログルコシダーゼ調製物を使用しない。両バツ
チを８℃の水浴中で７日間発酵させる。次にビー
ルを管で導き、通常の方法で測定する密度により
希釈度を決定する。アミログルコシダーゼ調製物
を用いたものと用いないものとの各バツチで沈降
したボトム酵母を各々20mlに戻し、更にビール発
酵を行なうために使用する。この方法で酵母を４
回発行させる。アミログルコシダーゼ粒子により
充満させた酵母の場合には、これら粒子を次の発
酵の仕込みに完全に導くのが比較的簡単であるこ
とが証明されたが、それは酵母層の洗浄後これら
が底部に沈降するのが常であるからである。表３
はアミログルコシダーゼ調製物を用いた場合と用
いない場合との４回の発酵で到達した希釈度を反
映している。
沈殿物質の存在下に、乾燥重量に関して２ないし
８倍の水を吸収する容量を有する硬化タンパク質
からなる高分子量の水不溶性多孔質重合体へ結合
した固定酵素に関する。更にまた、本発明はこれ
ら固定酵素の製造ならびに生物技術的反応の実行
のためのこれらの使用に関する。 最近２，３年で酵素を水不溶性担体へ付着させ
る多数の方法が技術文献および特許文献から知ら
れるようになつた。例えば、R.A.メツシング
（Messing）（編集者）、工業的反応のための固定
化酵素、アカデミツク プレス、ニユーヨーク
1975年により要約された概説がなされた。現状の
知識によれば、酵素を不溶性にするための四つの
付着法、即ち１吸着、２イオン的結合、３カプセ
ル化、４担体への共有結合による結合あるいは酵
素の架橋が考えられる。これら固定化の基本型の
組み合わせも知られている。 無酵素担体、例えば活性炭または多糖類へ吸着
により結合させた酵素は比較的弱い吸着的付着の
結合として容易に脱着が起こるという欠点をも
つ。特に、もしイオン濃度および温度の変化が起
これば吸着結合の離脱、従つていわゆる酵素の
「滲出」が容易に起る。 多陰イオン性あるいは多陽イオン性担体（例え
ば、イオン交換樹脂のような）への酵素のイオン
的結合の場合にも、酵素が原則として非常に弱い
イオン性の基を含むに過ぎないので、多イオン性
担体と酵素との間の結合は比較的弱いという欠点
がある。例えば、飲料処理の進行中に飲料からあ
る種のイオンの故意でない除去につながる付着酵
素のイオン交換効果は多くの反応を乱す決定的な
欠点である。 重合体物質（例えば、架橋ポリアクリルアミ
ド）中にカプセル化された酵素は、その封入材料
の分子の網を通しての拡散が比較的困難であると
いう主な欠点を有する。このように封入された酵
素の見掛けミハエリス定数は低分子基質に比較し
てこれにより増加する。その上、封入された酵素
がその弾性のために封入材料の細孔から突き出
し、このようにして「滲出する」という危険があ
る。 ここに述べた付着の第四の型に関しては、酵素
が共有結合であり、それ故に水不溶性担体の反応
基へ非常に固く結合される。酵素の固定に関する
発行物の殆ど、ならびに本特許願はこの型の固定
化に関する、しかし、このようにして製造された
公知の調整物は全体的一部類として経済的、技術
的観点から有用でない。それはカツプリング（結
合）試薬または担体物質が余りに高価すぎるか、
または余りに高価な製造法を使用せねばならない
からである。現在知られている方法によるカツプ
リングのためには、このカツプリングの手順の間
に酵素の大部分が不活性化されるので、相当に過
剰の酵素を用いて作業しなければならない。この
方法の殆どは、担体物質がその表面を酵素タンパ
ク質で覆われるに過ぎないので、担体物質当りの
酵素量は小部分に過ぎない。仕上げり製品の微粉
化（ミクロ化）によりある程度の補助は可能であ
るが、これら調整物はそれらの細かさと充填床反
応器内での使用のために、液流により辛うじて通
されるに過ぎない。酵素の固定化法の殆どのもう
一つの欠点は担体物質（例えば、ガラス、ケイソ
ウ土）がある形態に束縛されること、そしてこれ
らに球形、裂片または膜状を与えたりこれらの他
の物質に対する覆い（例えば、網）として使用し
たりすることが不可能なことである。また担体物
質およびカツプリング試薬のあるものはその毒性
のために疑問視される。 公知の固定酵素の上記欠点の幾つかは、従来の
方法による非タンパク分解酵素に対しては、これ
ら酵素を例えばグルタルジアルデヒドでコラーゲ
ンに結合させることにより克服された。しかし、
このようにして製造された調製物は微生物による
攻撃を受け易くそしてその比活性は低い。同様な
問題がゲル形成性タンパク質で酵素を橋かけする
ことにより得られる調製物に存在する（ドイツ
OS22 46 002参照）。この場合は酵素およびゲル
形成性タンパク質が不規則に橋かけするので均質
な混合物を生ずる。これら調製物は微生物に対し
て一層安定であるが、酵素が粒子の全横断面にわ
たり均一に分布するのでその効果は乏しい。高活
性に関しては、橋かけが比較的弱く起こるだけで
ある。これは充填床で使用したとき酵素の封鎖お
よび滲出が起こる程軟質の調製物に導く。しか
も、より強い橋かけの場合には、余りに強い結合
のためにそして内部酵素分子の封入のために不活
性化が起こる。最後に述べた固定法の一つの重大
な欠点は、これらをタンパク分解酵素に対して使
用できないという事実である。 本発明の主題は、下記の利点をもし可能ならば
同時に所有する水不溶性の非タンパク分解酵素お
よびタンパク分解酵素を製造することにある： ・ 安価な製造法、 ・ 固定処理中ならびに長い反復使用後に高度の
活性を得る、 ・ 微生物に対する大きい抵抗、 ・ 担体物質の形の大きい変動性、 ・ 充填床形を使用する場合の良好な通過性、 ・ 高い比活性、 ・ 低い見掛けミハエリス定数、 ・ 望まないイオン交換体性または吸着性がな
い、 ・ 毒性が余り問題とならない融和性担体。 もし酵素を先ずその量の２ないし８倍の水を吸
収する容量を有する膨潤性硬化（変性）タンパク
質によつて水性溶解形で浸漬し、その後酵素沈殿
物質の存在でグルタルジアルデヒドにより結合す
ると、上記評価基準を満足する固定化酵素が得ら
れることが、ここに発見された。このようにする
と、酵素が高分子量の多孔質硬化タンパク質担体
の外部および内部の幾つかの場所につるしたよう
な調製物を生ずる。 水不溶性担体の製造に向く原料として各種の型
の水溶性タンパク質（例えば、ゼラチン、卵白、
アルブミン、大豆タンパクなど）が考えられる。
これらタンパク質を硬化により（例えば、ホルム
アルデヒド、グルタルジアルデヒド等のアルデヒ
ド化合物により）水に不溶性となし、そして任意
に他の処理（例えば温度の変性作用）によつて修
飾し、０ないし110℃の温度範囲でこれらがその
乾燥重量の２ないし８倍量の水を吸収する容量
（容量は本質的に一様に留まる）を有するように
することが肝要である。しかし、未処理の出発タ
ンパク質の膨潤挙動は変動しうる：例えば、乾燥
ゼラチンは冷水中で約10％の水（＝その乾燥重量
の10分の１）を吸収するだけであるが、他方アル
ブミンおよび卵白は冷水に完溶する。しかし、実
例として述べたタンパク質からまた他の本来非常
に異なるタンパク質から、それら出発タンパク質
を適当な温度で水に溶解し、これを硬化、架橋剤
（例えば、ホルマリン）で橋かけし、次にそれを
乾燥熱処理に付することによつて、単純な方法で
本発明に望まれる性質を有する重合体をつくり出
すことが可能である。このようにして、本発明は
比較的高価なゲル形成性タンパク質に頼らねばな
らないということはなく、価値の低いタンパク
質、例えば低ブルーム価のゼラチン、あるいはも
うゲル化しない液状廃ゼラチン、ならびに他の非
ゲル化タンパク質も使用できる。 酵素を固定しようとする多孔質硬化タンパク質
の製造法は使用した出発タンパク質、用いた硬化
剤、利用できる装置、担体の望む形状（例えば、
裂片、球、膜、網など）等に応じて広い範囲内で
変化しうる。実施例は幾つかの基本的可能性、判
断に依存する任意の変動および熟練者の技術的能
力を示す。 硬化剤として通常のタンパク質硬化性アルデヒ
ド化合物（例えば、ホルムアルデヒド、グルタル
ジアルデヒド他）を考えることができる。例え
ば、グルタルジアルデヒドによつて硬化したタン
パク質に関して後により多くの酵素活性を結合し
うるような方法で硬化した担体物質に関しては、
ホルムアルデヒドの使用が特に有利である。その
上、グルタルジアルデヒドで橋かけした担体は、
余計なしばしば望まないタンニン吸着活性を有す
るが、この活性はホルムアルデヒド硬化タンパク
質は有しない。経済性理由からもタンパク質のホ
ルムアルデヒド硬化は本発明の特に適当な具体例
を表わす。 本発明の特に適当な具体例によれば、担体物質
の製造に企画された水溶性の出発タンパク質を３
ないし10倍量の水（タンパク質の量に関して）に
入れ、混合物を40ないし80℃に加熱する。このタ
ンパク質溶液へホルムアルデヒド溶液（例えば、
ホルマリン）を、用いた乾燥タンパク物質に関し
てホルムアルデヒド約２ないし５％となる量で加
え、溶液と混合する。ある時間後、かきまぜた溶
液は凝固するが、この凝固時間は一般にできるだ
け温度を高くし、PH値をできるだけ８ないし10に
近づけ、そして多量のホルムアルデヒドを添加す
ることにより短縮しうる。しかし、普通には余り
に迅速な凝固は望ましくない。これがタンパク質
−ホルムアルデヒド−水混合物の均一な混合を困
難にするからである。更にまた、遅い凝固はあら
かじめ担体を望みの形状につくる可能性をもたら
す。例えば、担体を対象物（かきまぜ機、網）の
浸漬によりこれら対象物へ覆いとして固定でき、
あるいは噴霧乾燥によつて非常に細かい球状の粒
子につくることができる。 本発明による担体として、人工角の名前で知ら
れる硬化タンパク質は適当でない。人工角はその
乾燥重量の３分の１までの水を吸収する容量を有
するだけであり、非常に限定された方法でのみ酵
素と結合でき、そしてこのようにして得られた固
定酵素調製物は非常に低い比活性にしか達しない
ことが示された。 酵素をカツプリングするには、乾燥状態の硬化
担体を、水に溶解した酵素と共に、水不溶性担体
が膨潤しつつある間に全酵素含有液体が吸収され
るような量で使用するのがよい。このように行な
う際は、担体の外面と内面とを酵素溶液で濡ら
す。次に酵素を沈殿させる活性を有しグルタルジ
アルデヒドが可溶である通常の液体、例えばアセ
トン、エタノール、イソプロパノールをその中に
カツプリング剤としてグルタルジアルデヒドを溶
解して加える。酵素が結合し終つた後、調製物を
よく水洗し、望むならば安定化物質（例えば、グ
リセリン、ソルビトール、プロピレングリコー
ル）を添加して、適当な方法で（例えば、溶媒を
用いて、あるいは噴霧乾燥により）乾燥するか、
あるいは湿つた状態で保存し、そして先の目的に
向ける。 酵素のカツプリング手順に対しては次の条件が
特によい：酵素水溶液を担体乾燥重量の８倍まで
の量で加える。酵素沈殿活性を有する液体を、概
して固定を望む酵素が溶解しないような量で加え
る。知られる通り、これらの量は酵素および沈殿
剤に応じて大きく変動するが、熟練者によつて各
酵素について試みることにより簡単に決定できる
かもしれない。なるべくはグルタルジアルデヒド
を、反応バツチ中の濃度が0.5ないし５％となる
量で用いるのがよい。全体のカツプリング反応は
室温で５分から５時間までの時間内に果すのがよ
い。 本発明に係る方法によれば、公知の方法と反対
にタンパク分解活性のある酵素もまた結合でき
る。担体の硬化によつてそのタンパク質を結合し
ようとするプロテアーゼのタンパク分解による質
低下に対み抵抗性にすることに成功し、従つて担
体材料の破壊を伴なうことなく固定化をなし遂げ
うるのである。この目的に対して２ないし４倍の
水を吸収しうる前硬化タンパク質を担体として使
用するのがよい。その量の４ないし８倍の水を吸
収しうる担体もある種のタンパク分解酵素、例え
ばラブに対して適当である。個々の場合における
有用な限界の決定は熟練者次第である。望むなら
ば、酵素沈殿活性を有する物質の添加まで、例え
ば担体に低温をかけることによりプロテアーゼの
タンパク分解攻撃から保護できる。グルタルアル
デヒドカツプリング反応後はもはや担体の質低下
の危険はない。 本発明により固定された酵素は、対応する可溶
性酵素が適する同じ生物技術的反応の実施に一般
に適当である。更にまた、これらは反復および継
続使用に、ならびにまた反応混合物からの（例え
ば、飲料からの）酵素の除去が望まれ、そして法
律で規定されている場合に対して特に好適であ
る。反復の長時間使用に対し本調製物の微生物に
対する高い抵抗性ならびに公知の滅菌剤（例え
ば、第四アンモニウム化合物、溶媒など）により
容易に滅菌できることは特に有利である。 下記の実施例は本発明を制限することなく本発
明を説明するためのものである。 実施例 １ 粉末化ゼラチン（アルカリで可溶化、80ブルー
ム）１Kgを６の冷水中に入れ、60℃に加熱す
る。このようにするとゼラチンが溶解する。次
に、かきまぜながら、ホルマリン（＝ホルムアル
デヒドの35重量％溶液）150mlを加える。２分30
秒後全体が凝固しゲルを形成する。このゲル化塊
を粗い湿つたゲル片が生ずるようにミンサーを通
して回す。高さ５cmの層としてゲル片を115℃で
空気を循環させた乾燥キヤビネツト中のトレー上
で15時間乾かす。乾いた粒子を網をもつブロウイ
ングミルで粉砕し殆どが50ないし100μｍの粒度
とする。裂片形のこれら粒子は水に不容であり、
その乾燥重量の4.8倍の水を吸収する容量を有す
る。 この担体粉末0.5Kgに市販液状グルコースオキ
シダーゼ−カラターゼ混合物0.1と蒸留水1.4
からなる溶液1.5をまぜ込む。市販グルコール
オキシダーゼ−カタラーゼ混合物は1780サリー
（Sarrett）単位／mlのグルコース オキシターゼ
活性および880ベーカー（Baker）単位／mlのカ
タラーゼ活性を有する。次にこの混合物ヘアセト
ン２および25％グルタルジアルデヒド溶液200
mlを加える。その後、反応混合物を30℃で60分間
放置する。次にこれを過し、固体粒子を約50
の蒸留水で過器上で徹底的に洗浄する。残留す
る湿つた塊は1.95Kgの目方を有する。グリセリ
ン1.05Kgを添加して塊を細かく懸濁し、先の使用
に供するため冷蔵庫に保存する。 活性の検査前ならびに他の試験の前にこのグリ
セリン溶液を各度毎に水でよく洗浄する。表１は
調製物の最も重要な分析データを示す。 表 １ 酵素乾燥物質含量 〔ｇ／100ｇ〕17.6 グルコース−オキシターゼ活性
〔SU／ｇ TS〕178 カタラーゼ活性 〔BU／ｇ TS〕96 洗浄に対する調製物の安定性を調べるため、10
ｇをカラムとして蒸留水で連続的に洗浄する。１
日間隔で酵素粒子の活性を調べる。14日以内で有
意な活性減少が起こらなかつたことが見出され
た。洗浄液として水の代りにビールを用いたとき
も同じ結果が得られた。 固定酵素調製物のミハエリス定数ならびに可溶
性グルコースオキシダーゼのそれを基質としてグ
ルコースを用いて決定する。溶解酵素形と固定酵
素形との間に有意差が見出されない。第１図はグ
ルコース濃度の関数としての可溶性酵素および固
定化酵素の相対反応速度を示す。 実施例 ２ 乾燥卵白３ｇを40℃の水10mlに溶解し、ホルマ
リン0.3mlと混合する。この混合物を真空乾燥キ
ヤビネツト中100℃、10ないし20トルで乾燥す
る。乾燥したプラスチツクを100から200μｍの粒
度に粉砕し、ふるい別する。このものは水に不溶
であり、その乾燥重量の４倍の水を吸収する容量
をもつ。520LU／ｇのラクターゼ活性を有するア
スペルギルス フラブス（Aspergillus flavus）
からの市販ラクターゼ0.1ｇを蒸留水1.5mlに溶解
する。この酵素溶液中に前記プラスチツク粉末
0.5ｇをまぜ込む。次にかきまぜながらアセトン
３mlおよび25％グルタルジアルデヒド0.25mlを加
える。この混合物を25℃で60分間放置し次に過
する。過器残留物として残る結合酵素を蒸留水
でよく洗浄する。このものは乾燥物質１ｇにつき
42LUの活性を有する。結合酵素調製物の乾燥物
質の全量は0.61ｇに達する。 実施例 ３ 粉末化ゼラチン（酸により可溶化、80ブルー
ン）１Kgを冷水５中でかきまぜ、45℃に加熱す
る。ゼラチンの溶解後、100mlのホルマリンを加
える。溶液を45℃に保ち、空気取入れ口温度210
℃、空気出口温度100℃そして空気量500Nm3／時
間で２物質ノズルを有する実験室用噴霧乾燥器内
で噴霧乾燥する。乾燥重量の７倍の水を吸収する
容量を有する水不溶性微細粉末を生ずる。750サ
リー単位／mlの活性を有するカタラーゼ不含グル
コース−オキシダーゼ溶液0.50mlを蒸留水１mlと
混合する。次に前記粒末化重合体0.5ｇを加え
る。この混合物をアセトン２mlおよび25％グルタ
ルジアルデヒド溶液0.2mlと混合し、室温で60分
間放置する。調製物を過器上で蒸留水によりよ
く洗浄する。計0.59ｇの固定乾燥酵素物質が得ら
れ、そのグルコース−オキシダーゼ活性は乾燥物
質１ｇにつき290サリー単位である。 実施例 ４ 粉末化ゼラチン（酸により可溶化、80ブルー
ム）20ｇを60℃でかきまぜながら蒸留水100mlで
溶かす。溶解したゼラチンへホルマリン２mlを加
える。次に20cm2の表面を有するかいをもち油をよ
く除去したかきまぜ機をこのゼラチン−ホルマリ
ン混合物中に浸し、直ちにそれから除く。過剰の
ゼラチン−ホルマリン混合物を滴り落させ、かき
まぜ機を乾燥およびホルマリン−ゼラチン混合物
の架橋のため105℃の乾燥キヤビネツト中に置
く。ここで薄いプラスチツク層で覆われたかきま
ぜ機を次に冷却し、水100ml中原子牛レンニン
（Messrs.Hauser）20ｇの溶液中に１分間浸す。
次にレンニンで濡らしたかきまぜ機をアセトン70
ml、水30mlおよび25％グルタルジアルデヒド10ml
の溶液中に60分間放置し、その後、流水下で60分
洗う。 その凝乳活性を検査するため、新鮮な全クリー
ム牛乳200mlをゆつくりかきまぜるのにこのかき
まぜ機を使用する。約60秒後に強いカゼイン沈殿
形成を起こしたが、これはかきまぜ機が依然凝乳
活性を有することを証明するものである。次にか
きまぜ機を洗浄し、再び新鮮な全クリーム牛乳
200mlをかきまぜるのに使用する。この手順を10
回くり返したとき、各回とも50から70秒後に強い
カゼイン沈殿を起こした。 実施例 ５ 粉末化ゼラチン（アルカリで可溶化、80ブルー
ム）１Kgを冷水６中に入れ、60℃に加熱する。
このようにするとゼラチンが溶ける。次にかきま
ぜながら25％グルタルジアルデヒド溶液250mlを
加える。約２分後全体が凝固してゲルを生ずる。
これをミキサーを通して回し、120℃で空気を循
環させた乾燥キヤビネツト中のトレー上に約５cm
の層として乾かす。 乾いた粒子を網を有するブロウイングミルで粉
砕し、大部分が50ないし100μｍの粒度を得るよ
うにする。これら破片状の粒子は水に不溶であ
り、その乾燥重量の3.1倍の水を吸収する容量を
有する。 担体粉末0.5Kg中に市販液状グルコースオキシ
ダーゼ−カタラーゼ混合物0.1および蒸留水1.3
からなる溶液1.4をまぜ込む。市販グルコー
スオキシダーゼ−カタラーゼ混合物は1780サリー
単位／mlのグルコースオキシダーゼ活性と800ベ
ーカー単位／mlのカタラーゼ活性を有する。次に
この混合物にアセトン２と25％グルタルジアル
デヒド溶液200mlを加える。反応混合物を30℃で
60分間放置する。その後、これを過し、固体の
粒子を過器上約50の蒸留水で徹底的に洗浄す
る。残留する湿つた塊は1.80Kgの重量を有す
る。このものをグリセリン1.20Kg中に微細に懸濁
し、先の使用まで冷蔵庫に保存する。 活性を調べる前ならびに他の検査の前にグリセ
リン溶液を水でよく洗浄する。表２はこの調製物
の最も重要な分析データを示す。 表 ２ 酵素−乾燥物質含量 〔ｇ／100ｇ〕17.8 グルコースオキシダーゼ活性
〔SU／ｇ TS〕134 カタラーゼ活性 〔BU／ｇ TS〕58 洗浄に対する安定性およびグルコール基質に対
するミハエリス定数に関して、分析の許容範囲内
で実施例１と同じ値が見出された。 実施例 ６ 粉末化ゼラチン（アルカリで可溶化、80ブルー
ム）10Kgを約20℃の水60中に入れ、50℃に30分
間加熱する。次にかきまぜながらホルマリン3.5
を加える。約２分後、全体が凝固してゲルを生
ずる。これをミンサーで回わし、約５cmの層とし
て108℃の空気を循環させた乾燥キヤビネツト中
のトレー上で24時間乾燥する。乾いた粒子を網を
有するブロウイングミルで粉砕し、粒度50から
100μｍの担体粉末が得られるようにする。破片
状の粒子は水に不溶であり、その乾燥重量の3.2
倍の水を吸収する容量を有する。 この担体粉末５Kgに45.000NF単位／mgの活性
を有する市販パパイン0.5Kgからなる０℃に冷却
した溶液13を０℃で加える。次にイソプロパノ
ール30と25％グルタルジアルデヒド１をこれ
にまぜ込む。この反応混合物を５分以内に25℃に
加熱し、この温度に60分間保つ。その後これを
過し、脱イオン水約200で十分によく洗浄す
る。約18Kgの重量を有する残留塊を脱イオン水
20中に再懸濁し、２物質ノズルを有する実験室
用噴霧乾燥器で空気取入れ口温度180℃、空気出
口温度85℃および空気流450Nm3／時間で乾燥す
る。520NF単位／mgの活性を有する固定乾燥調整
物5.34Kgが得られる。 実施例 ７ 1070グルコアミラーゼ単位／ｇを有する黒カビ
（Aspergillus niger）からの市販アミログルコシ
ダーゼ１Kgを14の脱イオン水で溶かす。次に実
施例１に記載のようにして調製した担体粉末５Kg
をこの中に混入する。担体粉末による酵素溶液の
吸収後、アセトン20およびグルタルジアルデヒ
ド１をかきまぜながら加え、混合物を30℃で60
分間放置する。その後これを過し、約300の
水で洗浄する。残留する塊を約30の脱イオン
水に再懸濁し、２物質ノズルを有する実験室用噴
霧乾燥器で空気取入れ口温度170℃、空気出口温
度85℃、および空気流400Nm3／時間で乾かす。
162グルコースアミラーゼ単位／ｇの活性を有す
る固定乾燥調製物5.20Kgが得られる。 ホツプを添加したライトビール麦芽汁５をの
り状ボトム酵母（Rh株、ベルリンの
「Versuchsund Lehr−anstalt ｆｕ¨ｒ
Brauerei」）20mlおよび上記固定アミロ−グルコ
シダーゼ調整物１ｇと混合する。これと並行し
て、同様に第二のバツチを用意するが、しかしア
ミログルコシダーゼ調製物を使用しない。両バツ
チを８℃の水浴中で７日間発酵させる。次にビー
ルを管で導き、通常の方法で測定する密度により
希釈度を決定する。アミログルコシダーゼ調製物
を用いたものと用いないものとの各バツチで沈降
したボトム酵母を各々20mlに戻し、更にビール発
酵を行なうために使用する。この方法で酵母を４
回発行させる。アミログルコシダーゼ粒子により
充満させた酵母の場合には、これら粒子を次の発
酵の仕込みに完全に導くのが比較的簡単であるこ
とが証明されたが、それは酵母層の洗浄後これら
が底部に沈降するのが常であるからである。表３
はアミログルコシダーゼ調製物を用いた場合と用
いない場合との４回の発酵で到達した希釈度を反
映している。
【表】
実施例 ８
乾燥物質含量70％を有するゲル化能力のない液
状廃ゼラチン25ｇを50℃の脱イオン水100mlに溶
かす。この溶解ゼラチンへホルマリン３mlを加え
る。次に反応混合物を油布で前以てこすつたガラ
ス板上に注ぎ薄層を生ずるように混合物をひろげ
る。反応混合物を付けたガラス板を105℃で空気
を循環させた乾燥キヤビネツト中で乾かす。乾燥
後、架橋担体をガラス板から膜状に離す。乾燥状
態で厚さ0.1mm、寸法５×５cmの担体物質膜を市
販液状グルコースオキシダーゼ−カタラーゼ（実
施例１と同じ）10mlおよび蒸留水50mlの溶液に２
分間浸す。次に膜をアセトン70ml、水30mlおよび
25％グルタルジアルヂヒド12mlからなる混合物中
に室温で60分間入れる。次に膜に充分よく水をか
ける。その後これを先の使用までグリセリン下に
保つ。膜の一部について活性を測定したところ乾
燥物質１ｇにつき112SUのグルコースオキシダー
ゼ活性と乾燥物質１ｇにつき96BUのカタラーゼ
活性が認められた。 実施例 ９ 粉末化ゼラチン（酸で可溶化、80ブルーム）20
ｇをかきまぜながら60℃の蒸留水100mlで溶か
す。溶解したゼラチンにホルマリン２mlを加え
る。次に直径５cm、網目の寸法１mm、針金の強度
0.1mmの高品等鋼の脱油脂丸網を反応溶液中に浸
し、直ちに取出す。余分の反応混合物を空気流で
吹き払い、針金が反応混合物の薄層のみを留める
ようにする。網を空気循環させた乾燥キヤビネツ
ト中105℃で４時間乾かす。その後、担体物質の
薄層で覆われた網を市販液状グルコースオキシダ
ーゼ−カタラーゼ10mlおよび蒸留水50mlの溶液中
に２分間浸す。次に網をアセトン70ml、水30mlお
よび25％グルタルジアルデヒド15mlの混合物中に
室温で60分間置く。その後網を徹底的に水洗す
る。 その酵素活性を調べるため、網をフリツトを通
して下方から激しく空気を通じた3.5％グルコー
ス溶液100ml中に置く。この溶液のPH値を滴定に
より同じ水準に保つ。表４に測定された0.01n
NaOHの消費量を示した。 表 ４時間（分） 0.01n NaOH消費量（ml） ０ 0.00 15 0.35 30 0.85 45 1.41 60 1.85 75 2.41 90 2.96 105 3.58 120 4.19 酵素活性の測定 酵素活性の測定は次の方法に従い行なう。固定
酵素の場合、そのインキユベーシヨン バツチは
たとえ原典に示されていなくてもかきまぜるか振
とうした。 カタラーゼ活性：第一増補、Food Chem.
Codex，第２版、67−68頁。発行所ナシヨナル・
アカデミイ・オブ・サイエンス、ワシントン1974
年。 グルコースオキシダーゼ活性：第一増補、Food
Chem.Codex，第２版、78−79頁。発行所ナシヨ
ナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、ワシント
ン1974年。 ラクターゼ活性：第一増補、Food Chem.
Codex，第２版、81−83頁。発行所ナシヨナル・
アカデミイ・オブ・サイエンス、ワシントン1974
年。 アミログルコシダーゼ活性：H.J.ピーペル
（Pieper），Mikrobielle Amylasen bei der
Alkoholgewinnung，48−49頁、発行所ウルマ
ー，スタツトガルト。 パパイン活性：第一増補、Food Chem.Codex，
第２版、86−87頁。発行所ナシヨナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス、ワシントン1974年。
状廃ゼラチン25ｇを50℃の脱イオン水100mlに溶
かす。この溶解ゼラチンへホルマリン３mlを加え
る。次に反応混合物を油布で前以てこすつたガラ
ス板上に注ぎ薄層を生ずるように混合物をひろげ
る。反応混合物を付けたガラス板を105℃で空気
を循環させた乾燥キヤビネツト中で乾かす。乾燥
後、架橋担体をガラス板から膜状に離す。乾燥状
態で厚さ0.1mm、寸法５×５cmの担体物質膜を市
販液状グルコースオキシダーゼ−カタラーゼ（実
施例１と同じ）10mlおよび蒸留水50mlの溶液に２
分間浸す。次に膜をアセトン70ml、水30mlおよび
25％グルタルジアルヂヒド12mlからなる混合物中
に室温で60分間入れる。次に膜に充分よく水をか
ける。その後これを先の使用までグリセリン下に
保つ。膜の一部について活性を測定したところ乾
燥物質１ｇにつき112SUのグルコースオキシダー
ゼ活性と乾燥物質１ｇにつき96BUのカタラーゼ
活性が認められた。 実施例 ９ 粉末化ゼラチン（酸で可溶化、80ブルーム）20
ｇをかきまぜながら60℃の蒸留水100mlで溶か
す。溶解したゼラチンにホルマリン２mlを加え
る。次に直径５cm、網目の寸法１mm、針金の強度
0.1mmの高品等鋼の脱油脂丸網を反応溶液中に浸
し、直ちに取出す。余分の反応混合物を空気流で
吹き払い、針金が反応混合物の薄層のみを留める
ようにする。網を空気循環させた乾燥キヤビネツ
ト中105℃で４時間乾かす。その後、担体物質の
薄層で覆われた網を市販液状グルコースオキシダ
ーゼ−カタラーゼ10mlおよび蒸留水50mlの溶液中
に２分間浸す。次に網をアセトン70ml、水30mlお
よび25％グルタルジアルデヒド15mlの混合物中に
室温で60分間置く。その後網を徹底的に水洗す
る。 その酵素活性を調べるため、網をフリツトを通
して下方から激しく空気を通じた3.5％グルコー
ス溶液100ml中に置く。この溶液のPH値を滴定に
より同じ水準に保つ。表４に測定された0.01n
NaOHの消費量を示した。 表 ４時間（分） 0.01n NaOH消費量（ml） ０ 0.00 15 0.35 30 0.85 45 1.41 60 1.85 75 2.41 90 2.96 105 3.58 120 4.19 酵素活性の測定 酵素活性の測定は次の方法に従い行なう。固定
酵素の場合、そのインキユベーシヨン バツチは
たとえ原典に示されていなくてもかきまぜるか振
とうした。 カタラーゼ活性：第一増補、Food Chem.
Codex，第２版、67−68頁。発行所ナシヨナル・
アカデミイ・オブ・サイエンス、ワシントン1974
年。 グルコースオキシダーゼ活性：第一増補、Food
Chem.Codex，第２版、78−79頁。発行所ナシヨ
ナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、ワシント
ン1974年。 ラクターゼ活性：第一増補、Food Chem.
Codex，第２版、81−83頁。発行所ナシヨナル・
アカデミイ・オブ・サイエンス、ワシントン1974
年。 アミログルコシダーゼ活性：H.J.ピーペル
（Pieper），Mikrobielle Amylasen bei der
Alkoholgewinnung，48−49頁、発行所ウルマ
ー，スタツトガルト。 パパイン活性：第一増補、Food Chem.Codex，
第２版、86−87頁。発行所ナシヨナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス、ワシントン1974年。
第１図はグルコース濃度の関数として可溶性酵
素および固定化酵素の相対的反応速度を示すグラ
フである。
素および固定化酵素の相対的反応速度を示すグラ
フである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵素また酵素混合物が、重合体の乾燥重量の
２〜８倍の量の水を吸収する容量を有する、アル
デヒド化合物により硬化された高分子量の多孔質
硬化タンパク質からなる重合体に結合しているこ
とを特徴とする、グルタルジアルデヒドによつて
担体タンパク質へ共有結合で固定されている酵素
を基礎とする水不溶性酵素調製物。 ２ 多孔質硬化タンパク質として、ホルムアルデ
ヒドにより硬化されたタンパク質を使用する特許
請求の範囲第１項に記載の酵素調製物。 ３ 多孔質硬化タンパク質として、ホルムアルデ
ヒドにより処理し、次いで100〜120℃の温度で熱
処理されたタンパク質を使用する特許請求の範囲
第１項に記載の酵素調製物。 ４ 多孔質硬化タンパク質としてホルムアルデヒ
ド処理ゼラチンを使用する、特許請求の範囲第１
項に記載の酵素調製物。 ５ 乾燥重量の２〜４倍の水を吸収する容量を有
する硬化タンパク質に結合されているプロテアー
ゼよりなる、特許請求の範囲第１項〜第４項のい
ずれか一項に記載の酵素調製物。 ６ ２〜８倍の水を吸収する容量を有する（乾燥
重量に対して）硬化タンパク質に結合されている
グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼよりな
る、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一
項に記載の酵素調製物。 ７ ２〜８倍の水（乾燥重量に対して）を吸収す
る容量を有する硬化タンパク質に結合されている
レンニンよりなる、特許請求の範囲第１項〜第４
項のいずれか一項に記載の酵素調製物。 ８ グルタルジアルデヒドによつて担体タンパク
質に共有結合で固定されている酵素を基礎とする
水不溶性酵素調製物であつて、酵素または酵素混
合物が重合体の乾燥重量の２〜８倍の量の水を吸
収する容量を有する、アルデヒド化合物により硬
化された高分子量の多孔質硬化タンパク質からな
る重合体に結合している水不溶性酵素調製物の製
造にあたり、 水溶性タンパク質をアルデヒド化合物により硬
化させ、必要に応じて次いで乾燥熱処理すること
により得られる、乾燥重量に対して２〜８倍の水
を吸収する容量を有する高分子量の多孔質硬化タ
ンパク質を酵素含有液体と、この液体が多孔質硬
化タンパク質により完全に吸い上げられると同時
に後者が膨潤するような量で混合し、次いで酵素
沈殿液体内にグルタルジアルデヒドの溶液を添加
することからなる、水不溶性酵素調製物の製造方
法。 ９ 多孔質硬化タンパク質としてホルムアルデヒ
ドにより硬化された水溶性タンパク質を使用す
る、特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０ 多孔質硬化タンパク質としてホルムアルデ
ヒドにより硬化されたゼラチンを使用する特許請
求の範囲第８項または第９項のいずれか一項に記
載の方法。 １１ 高分子量の多孔質硬化タンパク質を適量の
酵素水溶液と混合し、低級脂肪族アルコールおよ
び（または）ケトン中のグルタルジアルデヒドの
溶液を加える、特許請求の範囲第８項に記載の方
法。 １２ 高分子量の多孔質硬化タンパク質を担体物
質の乾燥重量の８倍量までの酵素水溶液と混合
し、酵素沈殿液体を実質的な量の酵素がもはや溶
解し得ないような量で加え、そして固定に用いる
グルタルジアルデヒドの量を反応バツチについて
0.5〜５％となるようにする、特許請求の範囲第
８項〜第１１項のいずれか一項に記載の方法。 １３ 結合反応を５分〜５時間の時間内で行う、
特許請求の範囲第８項〜第１２項のいずれか一項
に記載の方法。
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