DK170730B1 - Enzymprodukt og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i DK 170730 B1

Den foreliggende opfindelse angår et stabiliseret enzym-produkt og fremgangsmåde til fremstilling heraf. Det stabiliserede enzymprodukt kan foreligge i form af en vandig opløsning eller lyofiliseret tørt produkt. Det omhandlede 5 stabiliserede enzymprodukt kan eventuelt yderligere sta biliseres ved immobilisering.

En af de iboende problemer, der ofte hindrer yderligere udvikling af analytiske og syntetiske anvendelser af en-10 zymer, er mange enzymers Iboende instabilitet. Denne begrænsning er af afgørende betydning specielt i de tilfælde, hvor anvendelserne indebærer langt tids udsættelse af enzymerne for forhøjede temperaturer eller for tilstedeværelsen af organiske opløsningsmidler (litteraturhenvis-15 ning 1, 2, 3).

Tab af enzymatisk aktivitet kan være et resultat af adskillige faktorer, der indvirker via forskellige mekanismer, af hvilke den strukturelle åbning af enzymet er den 20 mest hyppigt forekommende (litteraturhenvisning 2 og 4).

Enzymstabilisering ved hjælp af restriktioner lagt på enzymet, der begrænser dets store strukturændringer, blev tidligere forsøgt foretaget ved hjælp af en af to hoved-25 metoder: fastlåsning af proteinstrukturen ved multi- punktstilknytning til vanduopløselige polymere understøttelser (litteraturhenvisning 1, 2, 4 og 5) eller ved tilsætning af forskellige opløste stoffer (litteraturhenvisning 6, 7, 8 og 9).

30

Adskillige litteraturhenvisninger beskriver kobling af vandopløselige polymere til enzymer, hvilket har til formål at stabilisere enzymerne i opløselig form (oversigt herover se litteraturhenvisning 1). Vandopløselige enzym-35 polymere konjugater, ved enzymkobling til polysaccharider er beskrevet i (litteraturhenvisning 1, 10, 11 og 12), polyvinylalkohol (litteraturhenvisning 13), polyvinylpyr- DK 170730 B1 2 rolidon (litteraturhenvisning 14) og polymethacrylsyre (litteraturhenvisning 4).

Effektiv stabilisering af opløselige enzymer ved hjælp af 5 denne metode er stærkt afhængig af at opnå en kraftig flerpunkts polymer-enzym interaktion på komplementær måde (henvisning 1, 4). Effektiviteten af disse enzym-polymer-konjugater afhænger også af polymergruppens kemiske art, idet der skabes et hydrofilt eller ladet mikromiljø i en-10 zymets umiddelbare omgivelser. Det mest effektive konju-gat af denne art synes at være chymotrypsin-polymeth-acrylsyrekonjugatet, der fremstilles ved copolymerisering af methacrylsyre og acryloylchloridbehandlet enzym (henvisning 4). Det fremstillede poly-anioniske enzymderivat 15 udviser stabilitet, der svarer til stabiliteten af gelin-desluttede enzymanaloge, fremstillet ved copolymerisering af methacrylamid eller acrylamid, med bisacrylamid og acryloylchloridbehandlet enzym.

20 Opfindelsen tilvejebringer således et stabiliseret, biologisk aktivt vandopløseligt enzymprodukt, der er ejendommeligt ved at enzymmolekylerne har en bi-lag beskyttende struktur omfattende en polyaldehyd basisbelægning knyttet til enzymets fri aminogrupper og tværbundet her-25 med en ydre polymerbelægning, idet polymerene der udgør den ydre belægning er af en sådan art, der i ikke-fastgjort tilstand omfatter frie amino og/eller acylhydrazid-grupper.

30 Herudover tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til at fremstillet et stabiliseret, biologisk aktivt enzymprodukt af den nævnte art, der er ejendommeligt ved at i et første trin omsættes et oprindeligt enzymprodukt i * vandig opløsning med et overskud af en vandopløselig po-35 lyaldehyd til frembringelse af et intermediært enzymprodukt, hvori enzymmolekylerne er beklædt med polyaldehyd-basisbelægningen, og i et andet trin, hvor det intermedi- DK 170730 B1 3 ære enzymprodukt omsættes i vandig opløsning med et polymert reagens, der indeholder frie amino og/eller frie acylhydrazidgrupper.

5 Den bi-lag beskyttende struktur opnået ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil af og til blive omtalt som et "bur" og dets fremstilling som "indeslutning". Den frem-byder adskillige fordele i forhold til tidligere kendte strukturer som f.eks.: "buret" er af en almindelig natur 10 og muliggør også stabilisering af enzymer, der indeholder et lavt antal lysilrester. Dette er fordi polyaldehydet anvendt i det første trin forstærker det totale antal tværbindingsbroer, der er dannes, og som en følge heraf i forhold til tidligere kendt metode (henvisning 4) vil 15 stabiliseringsgraden ikke kun afhænge af lysilindholdet i enzymet (henvisning 4).

Indeslutningsmetoden er baseret på anvendelsen af vandopløselige polymerreagenser, og den er således næsten fuld-20 stændig uden toxiske og hæmmende virkninger, der forekommer, dersom lavmolekylære reagenser skal anvendes som f.eks. acryloylchlorid og acrylamid.

Anvendelse af "buret" muliggør kontrol af mikromiljøet af 25 det "indesluttede" enzym ved passende at modificere eller udvælge den kemiske art af det polymere reagens, der anvendes ved dannelsen af det ydre lag. F.eks. kan hydrofi-licitet eller hydrophobicitet indføres i det polymere reagens afhængigt af hvad der kræves af hensyn til enzy-30 met eller brugen af dette.

På grund af den kombinerede virkning af de to bestående "bur" belægninger, er stabiliseringen af enzymet mere effektiv end enkeltbeklædte enzym-polymerkonjugater.

Arten af reaktanterne i første og andet trin er ikke kritisk. I det første trin kan således et hvilket som helst 35 DK 170730 B1 4 vandopløseligt polyaldehyd anvendes, der er i stand til at reagere med frie aminogrupper, der udgør en del af lysilresterne af enzymet, idet et typisk eksempel er poly-glutaraldehyd. På samme måde er der intet kritisk med 5 hensyn til udvælgelsen af det vandopløselige polymere 4 reagens anvendt i det andet trin, forudsat at det indeholder frie amino og/eller acylhydrazidgrupper, da det er disse grupper, der tværbinder med carbonylgrupperne fra polyaldehydets basisbelægning. Typiske eksempler på poly-10 mere reaktanter anvendt ved det andet trin er polyacryl-amider, N-alkylerede polyacrylamider, acylhydrazid eller aminoderivater af polyacrylamider, polyvinylhydraziner, polyvinylaminer, polylysin, forskellige proteiner og lignende.

15

Eventuelt kan et stabiliseret enzymprodukt med "indesluttede" enzymmolekyler ifølge opfindelsen yderligere stabiliseres ved immobilisering. Som en ydre belægning af det stabiliserede enzym ifølge opfindelsen kan anvendes poly-20 acrylamid-amin eller acylhydrazidderivater, idet dets immobilisering, enten ved kemisk binding eller tværbinding, let kan foretages. Sidstnævnte metode er specielt velegnet, idet man skal påse, at den opnåede stabiliserede enzymopløsning ved afslutningen af det andet trin indehol-25 der et stort overskud af ubundet polymer, der kan anvendes til at udgøre en matrix ved passende tværbinding. Immobilisering af enzymer ved hjælp af gelmatricer er velkendt som sådan og er med held blevet anvendt til at im-mobilisere enzymer i geler fremstillet ud fra polyacryl-30 amid-hydrazid tværbundet med glyoxal (litteraturhenvisning 21 og 25).

Det antages, at stabiliseringen af de omhandlede "inde- * sluttede" enzymer er et resultat af en kombination af to 35 virkninger. En er, at der sker fysisk undertrykkelse af opfoldningsprocessen ved hjælp af det tværbundne polymere "bur" bygget uden om enzymet. For det andet sker der en DK 170730 B1 5 kemisk undertrykkelse af konformationelle forandringer på grund af mikromiljøvirkningen af den bundne hydrofile polymere gruppe.

5 Et omhandlet stabiliseret enzymprodukt kan lagres i vandig opløsning eller lyofiliseres til et tørt pulver og lagres som sådan. Det har overraskende vist sig, at lyo-filisering af det "indesluttede" enzymprodukt yderligere forøger stabiliteten heraf. Yderligere bevirker immobili-10 sering af lyofiliserede "indesluttede" enzymer i glyoxal tværbundet polyacrylamid-hydrazidgel i maksimal forstærkning af selve stabiliseringen.

De omhandlede stabiliserede og eventuelt immobiliserede 15 enzymprodukter kan anvendes til en hel række enzymkatalyserede kemiske processer, hvad enten disse udføres batch-vis eller kontinuert.

Opfindelsen beskrives nu nærmere under henvisning til 20 tegningen, hvor fig. 1 er et diagram, der viser stabiliseringen af svine-leveresterase ved "indeslutning" udtrykt som modstand mod kombineret temperatur-coopløsningsmiddeldenaturerende 25 virkninger i tre forskellige opløsningsmidler, sammenlignet med opførselen af den oprindelige carboxylesterase under lignende betingelser? fig. 2 er et diagram, der viser den termiske stabilitet 30 af en lyofiliseret "indesluttet" svineleveresterase inde sluttet i en polyacrylamid-hydrazidgel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen i forhold til opførselen af oprindelig svineleveresterase under lignende betingelser; og 35 fig. 3 er en skematisk illustration af dannelsen af et bi-lag beskyttende bur ifølge opfindelsen.

DK 170730 B1 6

Stabilisering af "indesluttede" enzymer i vandig opløsning og i nærværelse af vandblandbare organiske opløsningsmidler blev undersøgt. Stabilisering overfor denaturering af organiske co-opløsningsmidler er af stor prak-5 tisk værdi, da disse co-opløsningsmidler kan anvendes til at forøge substrat og produktopløseligheder og ændring af "naturlige” reaktionsveje (litteraturhenvisning 3 og 21).

Den stabiliserende virkning bestemtes ved at måle inaktiverings-hastighedskonstanten (Kina) værdier for oprinde-10 lige og "indesluttede" enzymer (lyofiliseret) inkuberet ved 55 °C i nærværelse af co-opløsningsmiddel.

Co-opløsningsmidler, der repræsenterende den gruppe, der kun virker svagt ind på bibeholdelse af enzymstabilitet i 15 deres nærvær (f.eks. ethylenglycol, DMSO (henvisning 21)), såvel som co-opløsningsmidler, der udviser stærkt denaturerende virkninger (f.eks. ethanol) anvendtes, og stabiliseringen ifølge opfindelsen viste sig at være effektiv med opløsningsmidler af begge grupper. I fig. 1 er 20 de åbne cirkler en stabiliseret indespærret carboxyleste-rase ifølge opfindelsen, og de sorte udfyldte cirkler er det oprindelige enzym, og det fremgår klart, at inaktiveringshastigheden af førstnævnte er betydelig lavere end for sidstnævnte. Denne forøgede stabilitet overfor dena-25 turering med ethylenglycol, DMSO og ethanol muliggør signifikant forøgelse med hensyn til indhold af tilstedeværende co-opløsningsmiddel uden at ødelægge den enzymatiske aktivitet. De stabiliserede enzymprodukter ifølge opfindelsen kan således med fordel anvendes som katalysato-30 rer til at udføre reaktioner, hvori co-opløsningsmidler «* er nødvendige fra starten eller dannes i løbet af reaktionen.

r

Fig. 2 viser, at et lyofiliseret "indesluttet" og immobi-35 liseret enzymprodukt ifølge opfindelsen (åbne cirkler) bibeholder aktiviteten over 16 dage bogstavelig talt uden nogen ændring, medens aktiviteten af et oprindeligt enzym DK 170730 B1 7 (fuldt udfyldte cirkler) falder skarpt i løbet af den første dag og herefter asymptotisk nærmer sig nul aktivitet. I disse forsøg inkuberedes enzymerne ved 55 "C i 0. 05 M tris puffer (pH 8), og aktiviteterne undersøgtes 5 med passende mellemrum.

Fig. 3 viser skematisk dannelsen af en bi-lag "indeslutning" ifølge opfindelsen. Som angivet omsættes i et første trin et ethylmolekyle med en polyaldehyd til opnåelse 10 af et enzym med en basisbelægning. Dette produkt omsættes herefter med en "polymer 2", der er en amino og/eller acylhydrazidgruppeholdig vandopløselig polymer til opnåelse af et enzym inden i et bi-lags bur.

15 Opfindelsen beskrives nærmere i de efterfølgende eksempler. Alle temperaturer er °C.

EKSEMPEL 1 20 Stabilisering af glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4) ved bi-lag indespærring 1. Fremstilling af polymere reagenser: 25 (a) Vandopløselig polymerglutardialdehyd: I en 100 ml rundbundet kolbe termostatindstillet til 50 °C anbragtes 20 ml 1 M K2C0g (pH = 10) efterfulgt af 20 ml 25 vægt/rumfang-% glutardialdehyd (Merck, katalog nr.

30 4239). Man lod polymeriseringen skride fremad i 2 timer ved 50 °C. Herefter afkøledes reaktionsblandingen til stuetemperatur, pH indstilledes til 7 ved tilsætning af koncentreret HC1, og bundfald fjernedes ved centrifugering (7000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter). Den 35 tilbageblevne opløsning sattes herefter til et tifold rumfang acetone for at fjerne ^CO^ og salte ved udfældning. Herefter skiltes opløsningen, acetonen afdampedes, DK 170730 B1 8 og den øvrige opløsning lyofiliseredes og lagredes ved -20 °C (udbytte 3,3 g? 66%).

c

Den vandopløselige polymere glutaraldehyd fremstillet på 5 denne måde indeholdt 0,35 mmol aldehydgrupper pr. g (tør vægt) bestemt efter metoden beskrevet af J.S. Thompson og G.D. Shockman (1968) Analytical Biochemistry 22, 260- 268), og molvægten bestemt ved gelfiltrering ("Biogel" p-6) overfor proteinstandarder var 1000.

10 (b) Fremstilling af polyacrylamider b-1) Polacrylamid med molekylvægt 8000: 15 I en 1 liters rundbundet kolbe udstyret med en magnetisk omrøring anbragtes 680 ml vand. Temperaturen indstilledes til 4 °C ved hjælp af et isbad og under nitrogengennemskylning tilsattes 4 g (0,056 mol) acrylamidmonomer. Efter fuldstændig opløsning af den monomere tilsattes 4,6 20 ml (0,034 mol) Ν,Ν,Ν,Ν-tetramethylethylendiamin efterfulgt umiddelbart af tilsætning af 20 ml 0,8777 M (4 g i 20 ml) ammoniumpersulfat. Polymeriseringen (over is under en nitrogenatmosfære) skred fremad i 1 time.

25 Polymeropløsningen dryppedes herefter til 3,5 liter iskold methanol, bundfaldet frafiltreredes, det henstod natten over ved 4 °C under methanol, fraskiltes og tørredes på en roterende inddamper i 30 minutter ved 40 °C.

Til slut blev den polymere tørret ved tørring i vakuum 30 over P2°5* Den tØ1'1'® polymer lagredes i en tæt lukkede beholdere ved stuetemperatur (udbytte 3,2 g (80%)).

b-2) Alkylamin-derivat; 35 I en 0,25 liter rundbundet kolbe udstyret med en magnetisk omrører anbragtes 100 ml ethylenglycol, og temperaturen justeredes til 50 °C (oliebad). 1 g polyacrylamid DK 170730 B1 9 tilsattes, og man lod opløsningen ske i løbet af natten ved 50 °C. Temperaturen indstilledes herefter til 100 °C og 13 ml (0,13 mol) 1,4-diaminobutan tilsattes. Aminoly-sen foregik 3 timer ved 100 °C. Herefter afkøledes opløs-5 ningen over is og blandedes med 100 ml iskold 2 N HC1. Opløsningens pH indstilledes til 6,3, og opløsningen dialyseredes (4 gange: overfor 5 liter 0,02 M phosphat, pH 6,3; 0,02 M phosphat, pH 6,3; 0,02 M phosphat, pH 6,3 og endeligt overfor vand). Til sidst udvandtes den polymere 10 ved lyofilisering (udbytte: i det væsentlige kvantitativt, aminindhold 2 milliækvivalent/g tør polymer (12,5% omdannelse, bestemt titrimetrisk som beskrevet af J.F. Inman og H.M. Dintzis, (1969) Biochemistry 8, 4074-4082) og lagret ved -20 °C.

15 2. Bi-lag indeslutning af glucoseoxidase 2-a) I et 20 ml bæreglas udstyret med en magnetisk omrører og med termostat holdt ved 4 °C anbragtes 9,8 ml 10 20 mg/ml opløsning af polymer glutaraldehyd i 0,2 M phosphat pH 8,2, efterfulgt af 0,2 ml 50 mg/ml glucoseoxidaseop-løsning i 0,2 M phosphat pH 6,0. Koblingsreaktionen foregik i 3 timer ved 4 °C. Ikke-bunden polymer fjernedes ved dialyse (3 gange overfor 0,2 M phosphatpuffer, pH 8).

25 2-b) I et 20 ml bæreglas udstyret med en magnetisk omrører og holdt med termostat ved 4 °C anbragtes 16 ml ami-nobutylderivat af polyacrylamidopløsning (0,25 mg/ml i 0,2 M phosphat, pH 8,0) efterfulgt af 4 ml polyglutaral-30 dehyd beklædt glucoseoxidaseopløsning (fremstillet som beskrevet ovenfor). Omsætningen foregik i 3 timer ved 4 °C og pH indstilledes til 6,0 ved dialyse overfor 0,2 M phosphat pH 6,0.

35 Det stabiliseredes enzym lagredes enten som opløsning ved 4 °C eller som et lyofiliseret pulver.

10 DK 170730 B1 3. Stabilierlng af glucoseoxidase mod termisk inaktivering;

Stabiliseringen af glucoseoxidase mod termisk denature-5 ring påvistes ved at måle hastigheden for inaktivering af det oprindelige eller stabiliserede enzym ved en fastsat forhøjet temperatur (55 °C). Hastighedskonstanten defineredes som: 10 ln E(T)/E(o)

Kina = ............

t hvor: E(t) « enzymatisk aktivitet målt ved tiden "t" 15 E(o) enzymatisk aktivitet målt ved tiden "o" (for beskrivelse af denne metode se litteraturhenvisning 24).

20 Resultaterne er angivet i tabel 1.

25 30 35

Virkning af bi-lag indeslutning på den termiske stabili tet af glucoseoxidase 5 DK 170730 B1 TABEL 1 11

Restaktivitet Kina Relativ efter 5 timer

Enzym (t \ 55 °C) Kina (%) ved 55 °C

10 oprindelig (kontrol) 0,19 100 43 polyglutaralde- 15 hydbehandlet 0,066 35 60 bi-lag ("indesluttet") 0,032 17 80 20 4. Stabilisering af glucoseoxidase mod inaktivering, der skyldes tilstedeværelsen af organiske co-opløsnings-midler

Stabiliseringen af glucoseoxidase mod den denaturerende 25 virkning af vandblandbare organiske opløsningsmidler demonstreredes ved at måle inaktiveringshastigheden (Kina) for det oprindelige enzym og det stabiliserede enzym ved en fastsat forhøjet temperatur (55 °C) i tilstedeværelse af 3,5 M (20%) co-opløsningsmiddel. Resultaterne er angi-30 vet i tabel 2.

35 DK 170730 B1 TABEL 2 12

Virkning af bi-lag indeslutning på glucoseoxldasens tolerance overfor organiske opløsningsmidler 5 _1 * Co-opløsnings- Kina (t , 55 °C) middel (alle Oprindeligt Indesluttet Relativ ved 3,5 M) enzym (a) enzym (b) (b/a,%) 10

Ingen 0,19 0,055 29 ethylenglycol 0,16 0,074 46 DMSO 0,19 0,075 40 DMF 0,40 0,22 55 ' 15 ethanol 1,020 0,40 39 formamid 1,74 0,50 29 EKSEMPEL 2 20 Stabilisering af svineleveresterase (E.C.3.1.1.1) ved bilag indeslutning 1. Fremstilling af polymere reagenser: 25 Polymer polymerglutardialdehyd og polyacrylamid fremstilledes som beskrevet i eksempel 1.

Et acylhydrazid-derivat af polyacarylamid fremstilles på følgende måde: I 100 ml rundbundet kolbe udstyret med en 30 magnetisk omrøring og holdt ved 50 °C anbragtes 38 ml vand og 1,5 g polyacrylamid. Efter fuldstændig opløsning tilsattes 12 ml (0,23 mol) hydrazinhydrat, og hydrazinol-ysereaktionen skred fremad i 4 timer. Acylhydrazidderiva- ~ tet fremstillet på denne måde fraskiltes ved udfældning 35 induceret ved dråbevis tilsætning af den vandige reaktionsopløsning til 250 ml methanol, udvinding ved centrifugering, genopløsning og genudfældning som beskrevet 13 DK 170730 B1 ovenfor, lagret natten over ved 4 °C under methanol, adskillelse af lagene og tørring på en roterende inddamper (30 minutter ved 40 °C) og til slut tørring i vakuum over P2OP-. Den tørre polymer (acyl-hydrazidindhold: 1,5 mmol/g 5 bestemt som beskrevet i henvisning 19, udbytte: i det væsentlige kvantitativ) lagredes ved -20 °C.

2. Bi-lag indeslutning af svineleveresterase 10 2-a) I et 50 ml bæreglas udstyret med en magnetisk omrø rer og holdt med termostat ved 4 °C anbragtes 19,7 ml 4 mg/ml polyglutaraldehydopløsning i 0,05 M phosphat pH 8,0 efterfulgt af 0,3 ml 11 mg/ml enzymstamopløsning (Sigma, katalog nr. E-3128). Man lod koblingsreaktionen foregå 15 ved 4 °C i 3 timer, og overskud af polyglutaraldehyd fjernedes ved dialyse (3 gange overfor 0,05 M phosphat, pH 8,0).

2-b) X et 100 ml bæreglas udstyret med en magnetisk omrø-20 rer og med termostatkontrol holdt ved 4 °C anbragtes 41 ml 5 mg/ml acylhydrazidderivat af polyacrylamid i 0,05 M phosphat, pH 8, hvorefter der tilsattes 19 ml polyglutar-aldehydenzymopløsning (fremstillet som beskrevet ovenfor). Man omsatte i 3 timer ved 4 °C og dialyseredes til 25 sidst overfor 0,05 M trispuffer pH 8. Det stabiliserede enzym lagredes som opløsning ved 4 °C eller som lyofili-seret pulver.

3. Stabiliering af svineleveresterase mod termisk inakti- 30 vering:

Stabilisering af svineleveresterase mod termisk denaturering påvistes ved at måle Kina (t 55 °C) som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne er angivet i tabel 3.

35

Virkning af bi-lag indeslutning på den termiske stabili tet af svineleveresterase 5 TABEL 3 DK 170730 B1 14

Restaktivitet Kina Relativ efter 5 timer

Enzym (t-^, 55 °C) Kina (%) ved 55 °C

10 oprindelig (kontrol) 0,140 100 47 polyglutaralde- 15 hydbehandlet 0,047 34 50 bi-lag ("indesluttet") 0,032 23 82 20 4. Stabilisering af svineleveresterase overfor tilstede værelsen af vandblandbare opløsningsmidler

Stabilisering overfor den denaturerende virkning af vandblandbare co-opløsningsmidler tilstede i en koncentration 25 på 3,5 M (“20%) demonstreredes som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne er angivet i tabel 4, og de er målt på lyofiliserede indesluttede enzympræparater.

30 35 TABEL 4 DK 170730 B1 15

Virkning af bi-lags Indeslutning på svineleveresterasens tolerance overfor organiske opløsningsmidler 5

Co-opløsnings- Kina (t , 55 °C) middel (alle Oprindeligt Indesluttet en- ved 3,5 M) enzym (a) zym lyofiliseret) 10

Ingen 0,14 0,00 ethylenglycol 0,24 0,00 DMSO 0,24 0,01 propylenglycol 0,50 0,00 15 ethanol 2,95 0,093 EKSEMPEL 3

Stabilisering af g-lactamase (E.C.3.5.2.6) bi-lag inde-20 slutning 1. Fremstilling af polymere reagenser: polymerglutaralde-hyd fremstilledes som beskrevet i eksempel 1. Polyacryl-amid, delvist substitueret med acylhydrazidgrupper, frem- 25 stilledes som beskrevet i eksempel 2.

2. Totrinsmetoden anvendtes i det væsentlige som beskrevet i eksempel for svineleveresterase.

30 3. Stabilisering af Ø-lactamase overfor termisk denature ring af den omhandlede bi-lags indeslutning demonstreredes ved at måle Kina (t-1, 55 °C) som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne er angivet i tabel 5.

35 TABEL 5 DK 170730 B1 16

Virkning af bi-lag indeslutning på den termiske stabilitet af /)-lactamase 5

Restaktivitet Kina Relativ efter 5 timer

Enzym (t-1, 55 °C) Kina (%) ved 55 °C

10 oprindelig (kontrol) 0,52 100 10 polyglutaralde- 15 hydbehandlet 0,10 19 28 bi-lag ("indesluttet") 0,03 6 70 20 EKSEMPEL 4

Stabilisering af "indesluttede" enzymer ved lyofilisering

Lyofilisering af "indesluttede" enzymer bevirker signifi-25 kant yderligere forbedring af enzymstabiliteten. Dette er i modsætning til den almindelige virkning af lyofilisering på native enzymer; i mange tilfælde aftager deres stabilitet, i andre forbliver den udforandret.

30 Virkning af lyofilisering på "indesluttet" enzymstabilitet er angivet i tabel 6 for svineleveresterase og Ø-lac- * tamase.

35

Virkning af lyofilisering for den termiske stabilitet af "indesluttet" og native enzymer 5 DK 170730 B1 17 TABEL 6

Co-opløsnings- Kina (t-1, 55 °C) middel (alle Inden lyo- Efter lyo-

Enzym filisering filisering 10

Svineleveresterase - oprindelig 0,12 0,14

Svineleveresterase - indesluttet 0,032 0,00 15 Ø-lactamase - oprindelig 0,52 2,59 å-lactamase - indesluttet 0,03 0,00 20 EKSEMPEL 5

Immobilisering og stabilisering af lyofiliseret "inde sluttet" enzym 25 Immobiliseringsmetode

Til en 1,5 g opløsning af polyacrylhydrazid (molvægt 100 000) i 8,5 ml destilleret vand sattes 0,5 ml 1 M phosphatpuffer (pH 8), og der blandedes grundigt. En puf-30 ret opløsning af den lyofiliserede "indesluttede" svine- leverestererase fremstilledes som beskrevet i eksempel 2 (150 mg i 1 ml 0,05 M phosphat, pH 8,30 EU) og tilsattes herefter, der blandedes grundigt ved magnetisk omrøring, og den således fremstillede opløsning indsprøjtedes (in-35 jektorfraledning 2 mm) i en iskold 1% glyoxalopløsning.

Gel "nudlerne" fremstillet på denne måde henstod for at hærde 1 time, hvorefter de opdeltes i stykker på ca. 2 mm DK 170730 B1 18 ved at presses gennem en injektionssprøjte (fralednings-diameter 2 mm). Herefter inkuberedes gelen i 20 timer ved 4 °C og opdeltes yderligere i småpartikler på ca. 0,25 mm ved hjælp af en bladhomogenisator ("Sorval Omnimixer", 5 7000 omdrejninger pr. minut, 1 minut). Gelpartiklerne va- ς skedes med 1 liter iskoldt 0,05 M tris-puffer (pH 8), genopslæmmedes i 50 ml af samme puffer og lagredes ved 4 °C indtil anvendelsen.

10 Den termiske stabilitet ved 55 °C af dette præparat er vist i fig. 2.

Litteraturliste 15 1. Klibanov, A.M., Adv. Appl. Microb. 1983, 29, 1-28.

2. Martinek, K. og Berezin, I.V., J. Solid Phase Bio-chem. 1978, 2, 343-385.

20 3. Butler, L.G., Enzyme Microb. Technol., 1979, 1, 253- 259.

4. Martinek, K., Klibanov, A.M., Goldmacher, V.S. og Berezin, I.V., Biochim, Biophys. Acta 1977, 485, 1-12.

25 5. Klibanov, A.M., Anal. Biochem, 1979, 93, 1-25.

6. Schmid, R.D. Adv. Biochem. Eng. 1979, 12, 41-118.

30 7. Back, J.R., Oakenfull, D. og Smith, M.B., Biochemistry 1979, 18, 5191-5196. s 8. Tonchilin, V.P. og Martinek, K., Enzyme Microb. Technol. 1979, 1, 74-82.

35 9. Greco. G. og Gianfreda, L., Biotechnol. Bioeng. 1981, 23, 2199-2210.

DK 170730 B1 19 10. Wykes, J.R., Dunill, P. og Lilly, M.D., Biochim. Bio-phys. Acta 1971, 250, 522-529.

11. Marshall, J.J., Trends in Biochem. Sci. 1978, 3, 79- 5 83.

12. Lenders. J.P. og Crichton, R.R., Biotech. Bioeng.

1984, 26, 1343-1351.

10 13. Hixon, H.F. Biotech. Bioeng. 1973, 15, 1011-1016.

14. von Specht, B.U., Seinfeld, H. og Brendel, W., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1973, 354(s), 1659-1660.

15 15. Paz. M.A., Blumenfeld, 0.0., Rojkind, M., Henson, E.,

Furfine, C., og Gallop, P.M., Arch. Biochem Biophys., 1965, 109, 548-559.

16. Gary, W.L., Johnson, R.N. og Kho, B.T., J. Chromatog.

20 1978, 156, 285-291.

17. Freeman, A., Methods. Enzymol. 1987, 135, 216-222.

18. Collinson, E., Dainton, F.S. og McNaughton, G.S., 25 Trans. Faraday Soc. 1957, 53, 489-498.

19. Freeman, A. og Aharonowitz, Y., Biotech. Bioeng., 1981, 23, 2747-2759.

30 20. Reuveny, S., Mizrahi, A., Kotier, M. og Freeman, A.,

Biotech. Bioeng. 1983, 25, 469-480.

21. Blank-Koblenc, T., Tor, R og Freeman, A., Biotechnol.

Appl. Biochem., 1988, 10, 32-41.

35 22. Nichols, C.S og Cromartie, T.H., J. Chem. Educ., 1979, 56, 832-834.

20 DK 170730 B1 23. Samuni, A., Anal. Biochem., 1975, 63, 17-26.

24. Malikkides, C.O. og Weiland, R.H., Biotech. Bioeng. 1982, 24, 1911-1914.

5 25. Freeman, A., Blank, T. og Haimovich, B., Annal. N.Y. Acad. Sci., 1983, 413, 557-559.

26. Goldstein, L. og Manecke, G., Appl. Biochem. Bioeng., 10 1976, 1, 23-126.

27. Dror, Y., Cohen, 0. og Freeman, A., Enz. Microb. Technol., 1988, 10, 273-279.

15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Stabiliseret, biologisk aktivt vandopløseligt enzym-5 produkt, kendetegnet ved enzymmolekyler med en bi-lag beskyttende konstruktion omfattende en polyaldehyd basisbelægning knyttet til enzymets fri aminogrupper og tværbundet hermed en ydre polymerbelægning, idet polymerne, der udgør den ydre belægning, er af den art, der i 10 ikke-fastgjort tilstand omfatter frie amino og/eller acylhydrazidgrupper.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af det stabiliserede, biologisk aktive enzymprodukt ifølge krav 1, kende- 15 tegnet ved, at et nativt enzymprodukt i et første trin i vandig opløsning omsættes med et overskud af en vandopløselig polyaldehyd til frembringelse af et inter-mediært enzymprodukt, hvori enzymmolekylerne er belagt med polyaldehyd-basisbelægningen, og at det intermediære 20 enzymprodukt i et andet trin i vandig opløsning omsættes med et polymert reagens, der indeholder frie amino-og/eller frie acylhydrazidgrupper.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet 25 ved, at det i det andet trin fremstillede produkt lyofi- liseres.

4. Enzymprodukt ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er immobiliseret med en matrix. 30

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt ifølge krav 4, kendetegnet ved, at en vandig opløsning opnået efter afslutningen af det andet trin som defineret i krav 2 og som indeholder uomsat 35 polymer underkastes tværbinding. 22 DK 170730 B1

6. Enzymprodukt ifølge et vilkårligt af kravene 1 og 4, kendetegnet ved, at basisbelægningen er fremstillet af polyglutaraldehyd.

7. Enzymprodukt ifølge et vilkårligt af kravene 1, 4 og * 6, kendetegnet ved, at den ydre belægning er fremstillet af en polymer valgt blandt polyacrylamider, N-alkyleret polyacrylamider og acylhydrazidderivater af polyacrylamider. 10

8. Enzymprodukt ifølge et vilkårligt af kravene 1, 4, 6 og 7, kendetegnet ved, at enzymet er glucose-oxidase.

9. Enzymprodukt ifølge et vilkårligt af kravene 1, 4, 6 og 7, kendetegnet ved, at enzymet er svinele-veresterase.

10. Enzymprodukt ifølge et vilkårligt af kravene 1, 4, 6 20 og 7,kendetegnet ved, at enzymet er Ø-lactama-se. 25 30 'r 35