SE450493B - Forfarande for framstellning av sampolymerer av polysackarider som berare av enzymatisk aktivitet - Google Patents

Description

450 493 beskrivits exempelvis av J.J. Hamsher, franska patentet nr. 7 325 614. Dessa sätt är emellertid baserade på en för- reaktion mellan en vinylmonomer, som innehåller en reaktiv grupp, och ett enzym till bildning av ett enzym, som bär vinylgrupper, följd av en sampolymerisationsreaktion initie- rad av katalysatorer, som inte är specifika initiatorer för immobiliseringsreaktioner.

I andra fall används polymerisationsreaktioner i när- varo av enzymer men immobiliseringen av enzymerna erhålles med funktionella reagens, som åstadkommer tvärbindningar mellan enzymerna och polymererna såsom bromcyan, kloftriazin, karbodiimid med polymerer, som har en polyhydroxyetylakrylat- bas eller en bas av polyakrylsyra, etc.

Uttrycket "sampolymerisation av proteiner" betecknar metoder, vilka är analoga med den metod som har beskrivits ovan och vilka har diskuterats av D. Jaworek, H. Botsch och J. Maier, Methods in Enzymology, gå, Ed. Klaus Mosbach, Academic Press; New York, 1976 sid. 195-201, D. Jaworek, tysk Offenlegungsschrift nr. 22 60 185 och 21 28 743.

Dessa metoder är baserade på vinyleringsreaktion av enzymer med bifunktionella monomerer, exempelvis acylerings- och/eller alkyleringsmedel såsom 3,4-epoxybuten, 2,3-epoxy- propylakrylat och akryloylklorid.

Med denna procedur är det möjligt att immobilisera åtskilliga vinylenzymer i huvudsak med användning av en polyakrylamidgel som bärare med ett förhållande mellan syn- tetisk polymer och enzym i allmänhet större än tio.

Sättet enligt föreliggande uppfinning tillåter åstad- kommande av immobilisering av en mycket stor enzymmängd, företrädesvis i ytzoner eller i zoner som är lättillgängliga i den matris som fungerar som den fasta bäraren och består av polysackarider, med användning av små mängder vinylmono- merer, varvid mängderna av vinylmonomererna ofta är mindre än eller lika med enzymmängden. Sättet enligt föreliggande uppfinning möjliggör även slopandet av alla förreaktioner med substanser, såsom ofta förekommer vid vinylenzymer och vilka leder till icke-homogena produkter med avseende på substi- 450 495 tutionsgraden och vilka även är ansvariga för deaktiverings- fenomen vid enzymerna. Det är även möjligt att med sättet enligt föreliggande uppfinning undvika alla de nackdelar som man finner vid sampolymerisationsreaktioner initierade med högenergistrålning, vilka reaktioner ofta leder till de- aktivering av enzymerna och/eller till produkter som har kinetiska egenskaper, som är tillräckligt skilda från egen- skaperna hos de fria enzymer som använts som utgångsmaterial.

Speciellt har åtskilliga på sampolymerer immobiliserade en- zymer.under den tid som gått framställts efter vinylering av enzymmolekylen på matriser av en polysackarid menflreaktio- nens effektivitet är inte tillfredsställande.

Man har nu funnit att det är möjligt att genom lämp- ligt val av det system som används för att starta polymeri- sationsreaktionen, lämpligt val av den matris som.används som bärare och lämpligt val av vinylmonomer och enzym er- hålla enzymer som är immobiliserade på en förformad fast matris olöslig i en vattenhaltig fas så att matrisen i avse- värd utsträckning bevarar enzymets ursprungliga biologiska aktivitet.

Närmare bestämt så är det möjligt att erhålla produkter med ökad effektivitet i enzymets immobilisering, med kine- tiska egenskaper som mer liknar egenskaperna hos det fria enzymet med användning av en väsentligt mindre komplicerad teknologi. Produkterna erhålles i form av pulver, fibrer, pärlor, filmer, ark, geler beroende på arten av den matris som används som bärare.

Kärnan i uppfinningen består i bildningen av fria radikaler alstrade genom ultraviolett ljus i närvaro av Jjärn-Illr-klorla, som lätt överför sin aktivitet till både den matris som används som bärare och till enzymet och vinylmonomeren i enlighet med följande reaktionsschema: MeXn + hv + bärare _ bärare- “ + " + enzym - enzym- l " + " + mommmm ~ monomer- X = Cl 5 n = 2,3 eller 4; Me = Fe; 450 495 Bildningen av enzymet immobiliserat på sampolymeren försiggår genom polymerisering av monomeren och slutar i en- lighet med de vanliga möjliga termineringsreaktionerna för makroradikaler under polymerens tillväxtstadium, dvs. huvud- sakligen genom överföring till monomermolekyler, överföring till makromolekyler av enzym, överföring till makromolekyler av bäraren eller kombination av två makroradikaler.

I enlighet med förfarandet enligt föreliggande uppfin- ning kan en suspension eller lösning av en polysackarid i ett vattenhaltigt medium användas. Vinylmonomeren och_en:y- met, företrädesvis i vattenhaltig lösning, tillsättas sam- tidigt följda av katalysatorn, som består av järn(III)saltet.

Därefter avlägsnas syre löst i suspensionen eller lösningen genom att kväve eller en annan inert gas bubblas genom. Där- efter används en källa för ultraviolett ljus med ett spektrum mellan omkring 250 och omkring 340 mp för att bestràla mate- rialet. Strålningen får pågå under en tid mellan några minu- ter och omkring en timme. Det fasta material som så erhålles efter grundlig tvättning kan användas som sådant eller kan bevaras i fuktigt tillstånd eller lyofiliseras.

Vinylmonomererna har formeln H __ 2c=c-R' I R där R är väte eller metyl, R' är CN eller COOR", där R" är en lägre alkyl, vilken senare eventuellt innehåller epoxy- eller hydroxylgrupper.

Man har även funnit att en del N-akryloylderivat av kväveheterocykliska föreningar även kan vara lika lämpliga, såsom exempelvis N,N'-bis-akryloylpiperazin och N,N',N“- tris-akryloyl-symmetriskt hexahydrotriazin.

Det bör observeras att järn(III)saltet i de koncentra- tioner som vanligen används i många fall verkar som inhi- bitor för den enzymatiska reaktionen, medan den inhiberande 1:» 450 493 effekt som tillskrivs järnet i förfarandet enligt uppfin- ningen minskas väsentligt eller till och med är noll.

Man har funnit att bildningen av ett enzym immobilise- rat på sampolymeren uppnås under förfarandet enligt förelig- gande uppfinning. Denna bildning visas genom följande expe- riment som dessutom visar möjligheten att immobilisera varje typ av protein, dvs. proteiner, som inte nödvändigtvis har enzymatisk aktivitet.

Immobilisering av albumèn med metylakrylat I Älbumin i mängden 100 mg löses i 5 ml vatten. En por- tion om 250 ml metylakrylat tillsättes och materialet ut- sätts för ultraviolett strålning från en lampa, vid lågt tryck av kvicksilverånga såsom en Philips-lampa, i närvaro av järn(III)klorid, FeCl3, i en mängd mellan 0,1 och 100 mM.

Kväve bubblas genom lösningen för att avlägsna syrgas. Reak- tionen får fortgå under 30 minuter. Den produkt som sålun- da bildas fälls ut från den mjölkaktiga lösningen genom tillsats av en volym metanol vid en temperatur mellan 4 och 20°C. Fällningen tillvaratages och extraheras upprepade gånger med aceton, som är ett lösningsmedel för polymetyl- akrylat men inte är ett lösningsmedel för albuminet, vid en temperatur mellan 4 och TOOC i syfte att avlägsna homo- polymeren, dvs. det polymetylakrylat som kan ha bildats.

Den i aceton olösliga återstoden extraheras upprepade gånger med en buffert med pH 5,6, som är lösningsmedel för albuminet, i syfte att avlägsna eventuellt närvarande oreage- rat albumin. Extraktionsproceduren med aceton och med vatten- lösningen upprepas med återstoden. På detta sätt erhålles som slutprodukt en i aceton och vatten olöslig återstod, som underkastas infrarödanalys. Spektret visar absorptions- band, som kan hänföras till både albuminet och polymetyl- akrylatet så att sampolymerens sammansättning bekräftas.

I enlighet med förfarandet enligt föreliggande uppfin- ning är det möjligt att framställa sampolymerer av vilket enzym som helst i allmänhet och av proteolytiska enzymer såsom papain, trypsin och kymotrypsin i synnerhet. 450 493 Förfarandet kan även tillämpas på hydrolytiska enzymer såsom amylaser, cellulaser, B-glukuronidas-arylsulfataser, esteraser, heparinaser, penicillinamidaser och ureaser; oxidaser såsom aminosyraoxidaser, diaforaser, glukosoxidaser och peroxidaser; hydrogenaser såsom steroidodehydrogenaser, mjölksyradehydrogenaser, alkoholdehydrogenaser; katalaser; isomeraser såsom invertaser och steroidoisomeraser.

Såsom redan har nämnts ovan är det möjligt att fram- ställa sampolymerer av polysackarider och proteiner även i det fall när proteinerna inte är enzymer. _ šlera exempel nedan illustrerar föreliggande uppfin- ning med flera monomerer, flera enzymer och flera bärare.

Exempel 1 Framställning av cellulosa-sampolyglycidylmetyl- akrylat-peroxidas Cellulosa i en mängd av 100 mg i olika fysikaliska former såsom fibrer, filmer eller ark suspenderas i 10 ml vatten. Sedan tillsättes FeCl3 i en mängd mellan 0,1 och 100 mg medan pH justeras till ett värde omkring 4. Peroxi~ das, exempelvis den typ som kallas "Horseradish peroxidase", tillsättes i en mängd av 1 ~ 100 mg och också 1 - 100 mg glyeidylmetakrylat. Blandningen bestrålas med en källa för ultraviolett ljus vid ett lågt tryck av kvicksilverånga, medan man sörjer för absorption av den termiska strålningen med ett lämpligt filter. Sampolymerisationen tillåts försåg- gå i kväveatmosfär under 30 minuter.

Det fasta material som erhålles tvättas upprepade gånger med en buffertlösning med pH 6 och sedan upprepade gånger med en 0,3% M NaCl-lösning. Slutligen bestäms sampolymerens enzymatiska aktivitet genom att peroxidasets specifika reak- tion utföres, exempelvis en spektrofotometrisk bestämning med H2O2-guajakol eller p-aminofenazon. En reaktionseffek- tivitet uttryckt i den mängd enzymatisk aktivitet som är immobiliserad per mängd enzymatisk aktivitet som är reagerad, multiplicerad med 100, mellan 10 och 24% erhålles beroende på enzymets koncentration. 450 493 Sampolymeren, som kan bevaras även i fuktigt tillstånd vid en temperatur mellan 4 och 5°C, bibehåller 80% av sin aktivitet efter mer än ett âr. De analytiska egenskaperna motsvarar egenskaperna hos kompositionen innehållande cellu- losapolyglycidylmetakrylat-peroxidas.

Exempel 2 Framställning av cellulosa-sampolymetylakrylat- peroxidas ' Reaktionen enligt exempel 1 upprepas med den skillnaden att vinylmonomeren är metylakrylat. Det fasta material som tillvaratages från reaktionen tvättas med lösningar med pH 5,3. På basis av bestämningen av sampolymerens enzymatiska aktivitet motsvarar immobiliseringens effektivitet ett värde av 3%.

Exempel 3 Framställning av cellulosa-sampolyakrylonitril- peroxidas Den reaktion som beskrivs i exempel 1 upprepas med föl- jande modifikationer: _ Cellulosan är 5 g svällt material i form av pärlor, vinylmonomeren är akrylonitril och sampolymeren uppvisar efter tvättning med lösningar med pH 5,3 peroxidasaktivitet och reaktionens effektivitet är 70%.

Exempel 4 Framställning av cellulosa-sampolymetylmetakrylat- peroxidas Den reaktion som beskriv i exempel 2 upprepas med den modifieringen att vinylmonomeren är metylmetakrylat. Effek- tiviteten hos reaktionen är 7%. 450 493 Exempel 5 Framställning av cellulosa-sampoly(hexahydro- trísakryloyl-s-triazin) Den reaktion som beskrivs i exempel 1 upprepas med den modifieringen att monomeren är hexahydrotriakryloyl-s- triazin. Effektiviteten hos reaktionen är 28%.

Exempel 6 Framställning av cellulosa-sampoly(bis-akryloyl- _piperazin) _ Den reaktion som beskrivs i exempel 1 upprepas med den modifieringen att vinylmonomeren är bis-akryloylpipera- zin. Effektiviteten hos reaktionen är 20%.

Exempel 7 Framställning av Sepharoseüa-sampolyglycidylmeta- krylat-cellulas Sepharoseqä i en mängd av 100 mg suspenderas i 10 ml vatten. Man tillsätter 0,1 - 100 mg FeCl3 och pH justeras till mellan 4 och 5,1 per 100 mg cellulas såsom cellulas F och glycidylmetakrylat i en mängd av mellan 1 och 100 mg.

En av de monomerer som används i exemplen 2-6 kan även-an- vändas. Temperaturen hålls under 200C. Bestrålning utföres med en källa för ultraviolett ljus med kvicksilverånga vid lågt tryck. Sampolymerisationen får försiggå i 30 minuter.

Sampolymeren tvättas såsom i exempel 1 och den enzymatiska aktiviteten bestäms med en karboxymetylcellulosa som sub- strat. Immobiliseringens effektivitet, vilken beräknas på basis av aktivitetsmätningen, är 82%.

Exempel 8 Framställning av SepharoseC)-sampolyglycidy1- metakrylat-a-amylas a-amylas immobiliseras med samma reaktion som anges i exempel 7 med den enda modifieringen att enzymet är G-amylas. fl- 9 450 493 Immobiliseringens effektivitet är 5%.

Exempel 9 Framställning av Sepharoseq-sampoly-(hexahydro- triakryloyl-s-triazin)-peroxidas Immobiliseringsreaktionen upprepas med Sepharoseqë så- som beskrivits i exempel 7 med följande modifieringar: Det använda enzymet är peroxidas och vinylmonomeren är hexahydro-triakryloyl~s-triazin. Immobiliseringseffektivi- teten är 38%.

Exempel 10 Framställning av Sepharoseqä-sampolyglycidylmetakrylat- glukosoxidas Den reaktion som beskrivs i exempel 6 upprepas med modi- fieringen att det använda enzymet är glukosoxidas (E.C.).

Immobiliseringseffektiviteten är 52%.

Exempel 11 Framställning av stärkelse-sampolyglycidyl- metakrylat-peroxidas Stärkelse i mängden 100 mg löses i 10 ml vatten.

Följande tillsatser görs: FeCl3 i en mängd av 0,1 - 100 mg medan pH justeras till 4; glycidylmetakrylat-peroxidas i en mängd av 1 - 100 mg tillsättes. En av de monomerer som använts i exempel 2-7 kan även användas. Temperaturen hålls under ZOOC. Sedan används en källa för ultraviolett ljus, dvs. en lampa med kvicksilverånga av lågt tryck.

Sampolymerisationen får försiggâ i 30 minuter. Den fällning som erhålles tvättas som i exempel 1 och sampolymerens aktivi~ tet bestäms. Immobiliseringseffektiviteten beräknad på basis av aktivitetsmätningen är 40%.

Produktens analytiska egenskaper motsvarar som väntat en produkt innehållande stärkelse-polyglycidylmetakrylat~ peroxidas. 450 495 10 De exempel som beskrivits i detalj ovan är endast en del av de exempel som illustrerar sättet att immobilisera enzymer på en fast bärare bestående av en polysackarid med enkla immobiliseringsreaktioner. Uppenbarligen beror pro- cessens effektivitet på ett antal faktorer såsom bärarens fysikaliska egenskaper, monomerens fysikaliska egenskaper och enzymets fysikaliska egenskaper. ' Det skall även observeras att det är möjligt att på samma matris immobilisera flera enzymer samtidigt.

Claims (9)

11 450 493 P A T E N T K R A V

1. Förfarande för framställning av en sampolymer av en poly- sackarid med enzymatisk aktivitet, k ä n n e t e c k n a d av att till en suspension av polysackariden i ett vattenhaltigt mediumsåüies en vinylmonomer och ett enzym, varvid vinylmono- meren är en monomer med formeln I H C = R' C- 2 1 (I) R där R är väte eller metyl och R' CN eller COOR", där R" är en lägre alkyl, vilken eventuellt är substituerad med minst en epoxy - eller hydroxylgrupp, och sedan en katalysator,vilken utgöres av ett järn(III)salt, och den erhållna blandningen bestrålas med en källa för ultraviolett ljus.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att vinylmonomeren är metylakrylat, glycidylmetakrylat eller akryl- nitril.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att vinylmonomeren är ett N-akryloylderivat av en förening inne- hållande en kväveheterocyklisk ring, företrädesvis bis-akryl- oylpiperazin eller symmetrisk N,N',N"-trisakryloylhexahydro- triazin.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e C k n a t av att enzymet är ett proteolytiskt enzym valt ur gruppen bestående av papain, trypsin och kymotrypsin.

5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet är ett hydrolytiskt enzym, som är medlem i gruppen bestående av amylaser, cellulaser, Q-glukuronidasarylsulfataser, esteraser, heparinaser, penicillinamidaser och ureaser.

6. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet är ett oxidas, som är medlem i gruppen aminosyraoxider, diaforaser, glukosoxidaser och peroxidaser. 450 493

7. Förfarande enzymet är ett *12 enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av dehydrogenas valt ur gruppen bestående av steroidodehydrogenas, mjölksyradehydrogenas och alkoholde- hydrogenas.

8. enzymet är ett Förfarande

9. Förfaranäe enzyqet är ett invertaser och enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av katalas. enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av isomeras, som är medlem i gruppen bestående steroidoisomeraser. att att att ElV