NL8100728A

NL8100728A - Werkwijze voor de bereiding van copolymeren van poly-sacchariden met een enzymatische activiteit.

Info

Publication number: NL8100728A
Application number: NL8100728A
Authority: NL
Original assignee: Italfarmaco Spa
Priority date: 1980-02-28
Filing date: 1981-02-14
Publication date: 1981-10-01
Also published as: ES499862A0; FR2477175B1; SE450493B; SE8100864L; CA1154715A; US4338401A; JPS56140891A; IT1141249B; GB2071669A; FR2477175A1; GB2071669B; IT8020213A0; DE3027929A1; NL185855C; DE3027929C2; ES8202043A1; NL185855B

Description

*X

* -1- 21737/Vk/jg

Aanvrager: Italfarmaco s.p.a., Milaan, Italië.

Korte aanduiding: Werkwijze voor de bereiding van copolymeren van poly-sacchariden met een enzymatische activiteit.

5 De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het berei den van een copolymeer van een polysaccharide met een enzymatische activiteit. Met name heeft de uitvinding betrekking op het immobiliseren van enzymen ,op een vaste-matrix. Er zijn een aantal werkwijzen bekend voor het immobiliseren van enzymen op een vaste matrix en er is verder onderzoek 10 gedaan om nieuwe werkwijzen te ontwikkelen die het verder mogelijk maken om enzymen te immobiliseren op een vaste matrix door het uitvoeren van eenvoudigere bewerkingen.

Eén van de doelstellingen volgens de uitvinding is het verkrijgen van vaste matrices met geïmmobiliseerde enzymen hierin die aanwezig 15 zijn in een technologisch "leefbare vorm". Een andere doelstelling is het gebruik van katalysatoren, zowel bij de synthese als bij de chemische qf biologische analyse, welke stoffen de specifieke activiteit hebben van de natuurlijke enzymen die worden.toegepast bij de immobilisatie-reacties.

Er zijn diverse reactieschema's bekend voor de immibolisatie.

20 Zo is vaak de adsorptie op een vaste matrix toegepast. Ook is voorgesteld om een covalente binding te vormen tussen het macromolecuul van het enzym en een vaste drager die op een geschikte wijze wordt geactiveerd of die geschikte reactieve groepen bevat. Verder is voorgesteld om de enzymen te omgeven met een geschikte drager zoals een polymeervormig gel, membraan 25 op proteinebase of synthetische polymeren. Ten slotte is de polymerisatie voorgesteld van geschikte monomeren in aanwezigheid van enzymert of de copolymerisatie van een geschikt monoméer met bepaalde geactiveerde enzymen. De laatste twee werkwijzen hebben enkele voordelen ten opzichte van de eerder voorgestelde methoden omdat de vaste drager, waarop het en-30 zym is aangebracht op geschikte wijze kan worden bereid voor een specifiek bedoeld gebruik en.met de hiervoor geschikte fysisch-chemische eigenschappen, evenals een mechanische stabiliteit, porositeit en de hydrofobe en hydrofiele eigenschappen.

Het immobiliseren onder toepassing van polymerisatiereacties is 35 vermeld in het Franse octrooischrift 7325614.Deze werkwijzen zijn echter gebaseerd op een pre-reactie tussen een vinylmonomeer dat een reactieve groep bevat en een enzym onder de vorming van een enzym dat vinylgroepen heeft, gevolgd door een copolymerisatiereactie die wordt geïnitieerd door 81 00 72 8 -2- 21737/Vk/jg t Λ φ. *· • katalysatoren die geen specifieke initiator zijn voor immobilisatie-reac-ties.

Anderzijds zijn polymerisatiereacties uitgevoerd in aanwezigheid van enzymen, maar het immobiliseren van de enzymen werd verkregen met 5 functionele reagentia die verknopingen bewerkstelligen tussen de enzymen en de polymeren, zoals broomcyanide, chloortriazine, carbodiimide met polymeren met een polyhydroxyethylacrylaatbase of een base van een poly-acrylzuur en dergelijke.

De uitdrukking "copolymerisatie van proteïnen” betreft methoden 10 die analoog zijn met de werkwijze die hierboven is vermeld en die nader is besproken door D. Jaworek, H. Botsch en J. Maier, in Methods in Enjsy-mology, 44^, Ed. Klaus Mosbach, Academie Press, New York, 1976, blz. 195-201, en in de Duitse Offenlegungsschriften 22.60.185 en 21.28.743.

15 Deze werkwijzen zijn gebaseerd op de vinyleerreactie van enzymen met bifunctionele monomeren, bijvoorbeeld acyleer- en/of alkyleermid-delen zoals 3,4-epoxybuteen, 2,3-epoxypropylacrylaat, en acryloylehloride.

Met deze werkwijze is het mogelijk om diverse vinylenzymen te immobiliseren onder toepassing van in hoofdzaak een polyacrylamidegel als 20 drager met een verhouding synthetisch polymeer tot enzym die in het algemeen hoger is dan 10.

Met de werkwijze volgens de uitvinding is het mogelijk om een grote hoeveelheid enzymen te immobiliseren, bij voorkeur in de bovenste zone of in zones die gemakkelijk toegankelijk zijn van de matrix die 25 werkt als vaste drager en die bestaat uit polysacchariden, waarbij kleine hoeveelheden vinylmonomeren worden toegepast, welke hoeveelheden van de vinylmonomeren vaak minder zijn dan of gelijk aan de hoeveelheid enzym.

De werkwijze volgens de uitvinding maakt het ook mogelijk om alle pre-re-acties met de stoffen, te elimineren, die vaak optreden met vinyl-enzy-30 men, hetgeen leidt tot een niet-homogeen produkt ten aanzien van de mate van substitutie en.hieraan is ook het verschijnsel te wijten»dat enzymen worden gedesactiveerd. Het is ook mogelijk met de werkwijze volgens de uitvinding om alle nadelen te voorkomen die optreden bij copolymerisatie- V «· » .

reacties die worden geïnitieerd door een bestraling onder hoge energie, 35 welke reacties vaak leiden tot een desactivering van enzymen en/of tot produkten met kinetische eigenschappen die voldoende verschillend zijn van de eigenschappen van de vrije enzymen die worden toegepast als uitgangsmateriaal. Met name zijn diverse enzymen geïmmobiliseerd op copoly- 81 00 72 8 -3- 21737/Vk/jg f t * l meren die tot nu toe zijn bereid na vinylering van het enzymmolecuul op de matrices van een polycarbohydraat, maar de effectiviteit van de reactie is dan niet voldoende.

1 y \

Het is nu gebleken dat door een geschikte keuze van het systeem 5 dat wordt toegepast om de polymerisatiereactie te starten, een geschikte keuze van de matrix die wordt gebruikt als drager en door een geschikte keuze van de vinylmonomeren en het enzym, het mogelijk is* om enzymen te verkrijgen die geïmmobiliseerd zijn op een voorgevormde vaste matrix die onoplosbaar is in een waterige fase, zodat de matrix de oorspronkelijke "O biologische activiteit van het enzym voldoende behoudt. Meer specifiek is het mogelijk om produkten te verkrijgen met een verhoogde immobilisatie-effectiviteit van het enzym, met kinetische eigenschappen die meer lijken op de eigenschappen van het vrije enzym onder toepassing van een minder complexe bewerking. De produkten worden verkregen in de vorm van poeders, 15 vezels, korrels, films, lagen en gel in afhankelijkheid van de aard van de matrix die wordt gebruikt als drager.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt hierdoor gekenmerkt, dat aan een suspensie van een polysaccharide in een waterig medium eên vinylmonomeer en een enzym worden toegevoegd en dan een katalysator die 20 een metallisch zout bevat en het verkregen mengsel wordt bestraald met ultraviolet licht. Door deze werkwijze worden vrije radicalen ontwikkeld met behulp van het ultraviolette licht in aanwezigheid van de geschikte metallische chloriden die makkelijk hun activiteit overdragen aan zowel de matrix die wordt toegepast als drager en op het enzym en op het vinyl-25 monomeer volgens het hieronder vermelde reactieschema:

MeXn + hv + drager => drager ·

MeX + hv + enzym => enzym· n

MeX + hv + monomeer => monomeer· n waarbij geldt: X = Cl, n = 2, 3 of 4 en Me = Fe.

30 De chloriden van cerium en koper, evenals van andere metalen kunnen worden gebruikt, maar ijzerchloride verdient de voorkeur. De vorming van het enzym dat geïmmobiliseerd is op het copolymeer in plaats door een polymerisatie van het monomeer en de bewerking wordt beëindigd volgens de gebruikelijke mogelijke beëindigingsreacties van maeroradica-35 len tijdens het groeien van het polymeer, hetgeen in wezen plaats heeft door overdracht aan monomeermoleculen, overdracht aan macrorholeculen van enzymen, overdnacht aan macromoleculen van de drager of een combinatie van twee macroradicalen.

81 00 72 8 -4- 21737/Vk/jg ( ( + *

Volgens de werkwijze van de uitvinding kan een suspensie of oplossing van een polycarbohydraat in een waterig medium worden toegepast. Het vinylmonomeer en het enzym Worden bij voorkeur in een waterige oplossing gelijktijdig toegevoegd, gevolgd door de katalysator die in het alge-5 meen bestaat uit een ijzer(III)zout. Daarna wordt de zuurstof die in de 'suspensie of oplossing is opgelost, verwijderd door stikstof of een ander inert gas hierdoor te borrelen. Vervolgens wordt een bron* voor ultraviolet lich.t met een spectrum tussen 250 en ongeveer 3^0 mpm gebruikt om het materiaal te bestralen. De bestraling heeft plaats gedurende enkele minu-10 ten tot ongeveer 1 uur. Het aldus verkregen vaste materiaal kan na zorgvuldig wassen als zodanig worden gebruikt of worden bewaard onder vochtige omstandigheden of worden gelyofiliseerd.

Het is gebleken dat met name geschikte vinylmonomeren overeenkomen met formule H C=C(R)-R’, 15 waarbij R waterstof of methyl voorstelt, R* is CN of C00R", waar bij R" een lagere alkylgroep is, eventueel met epoxy- of hydroxylgroepen. Het is ook gebleken dat enkele N-acryloylderivaten van stikstof houdende heterocyclische verbindingen op geschikte wijze kunnen worden toegepast, zoals N, N’-bis-acryloylpiperazine en N,tf,N"-tris-acryloyl-symmetrisch 20 hexahydrotriazine.

Hierbij moet worden opgemerkt dat het ijzer(III)zout in de normaal toegepaste concentraties in veel gevallen werkt als inhibitor voor de enzymatische reactie, terwijl bij de werkwijze volgens de uitvinding de remmende werking die wordt toegeschreven aan het ijzer, aanzienlijk 25 wordt verlaagd of zelfs nul wordt.

Het is gebleken dat de vorming van een geïmmobiliseerd enzym op het copolymeer wordt bewerkstelligd tijdens de werkwijze die volgens de uitvinding wordt toegepast. Deze vorming wordt aangetoond door het volgende experiment dat boyendien de mogelijkheid aangeeft van het immobi-30 liseren van elk type eiwit, hetgeen de eiwitten betreft die niet noodzakelijk een enzymatische activiteit hebben.

Immobiliseren van albumen met methylacrylaat.

Albumins werd in een hoeveelheid van 100 mg opgelost in 5 ml water. Een hoeveelheid van 250 ml methylacrylaat werd toegevoegd en 35 het materiaal werd blootgesteld aan ultraviolette straling met behulp van een lage druk kwiklamp, zoals een Philips-lamp in aanwezigheid van ijzer- (III) chloride, (FeCl^) in een hoeveelheid tussen 0,1 en 100 mM. Stikstof werd door de oplossing geblazen om zuurstof te verwijderen. De reactie 8100728 * ί· -5- 21737/Vk/Jg werd voortgezet gedurende een periode van 30 minuten. Het aldus gevormde produkt sloeg neer uit de melkachtige oplossing door het toevoegen van methanol bij een temperatuur tussen 4 en 20 °C. Het precipitaat werd ge-wonnen en enkele keren geëxtraheerd met aceton, hetgeen een oplosmiddel 5 is voor polymethylacrylaat maar geen oplosmiddel voor albumine, bij een temperatuur tussen 4 en 10 °C, zodat het homopolymeer werd verwijderd, hetgeen het-polymethylacrylaat is,dat zou kunnen zijn gevormd.

. De rest die-onoplosbaar is in aceton werd enkele keren geëxtraheerd met een buffer van een pH van 5,6, hetgeen een oplosmiddel is voor 10 albumine, ten einde niet-gereageerd albumine, dat eventueel aanwezig is te verwijderen.De extractie met aceton en met de waterige oplossing werd met het residu herhaald. Op deze manier werd een eindprodukt verkregen, dat bestond uit een rest die onoplosbaar was in aceton en in water en deze werd onderworpen aan een infrarood analyse. Het spectrum geeft ab-15 sorptiebanden weer die kunnen worden toegeschreven aan zowel het albumine als het polymethylacrylaat, zodat de samenstelling van het copolymeer werd bevestigd.

Volgens de werkwijze van de uitvinding is het mogelijk om in het algemeen copolymeren te bereiden van een willekeurig enzym, én met name 20 van proteolytische enzymen, zoals papai'ne, trypsine en chymotrypsine.

De werkwijze volgens de uitvinding is ook toepasbaar op hydro-lytische enzymen zoals amylasen, cellulasen, /¾-glucuronidase-arylsulfa-tase, esterase, heparinase, penicillinamidasen en ureasen, evenals op oxydasen zoals aminoazijnzuuroxydasen, diaforasen, glucoseoxidasen, en 25 peroxydasen, hydrogenasen,^met name steroidodehydrogenasen, melkzuur- dehydrogenasen, alcohol-dehydrogenasen, catalasen, isomerasen zoals inver-tasen en steroidoisomerasen.

Het is volgens de werkwijze volgens de uitvinding ook mogelijk om copolymeren te bereiden van polysacchariden en eiwitten, ook wanneer 30 de eiwitten geen enzymen zijn.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden, waarbij diverse monomeren, enzymen en dragers zijn toegepast.

Voorbeeld I

De bereiding van cellulose-copolyglycidyl-methylacrylaat-peroxy-35 dase.

Cellulose werd in een hoeveelheid van 100 mg in diverse fysische vormen zoals in de vorm van vezels, films of lagen gesuspendeerd in 10 ml water. Vervolgens werd FeCl^ toegevoegd in een hoeveelheid tussen 0,1 en 81 00 72 8

V V

-6- 21737/Vk/jg TOO'-mg, terwijl de pH werd ingesteld op een waarde van ongeveer 4. Eer-oxydase, met name het type aangegeven als "Horseradish peroxidase" werd toegevoegd in een hoeveelheid van 1-100 mg en ook werd 1-100 mg glycidyl-methacrylaat toegevoegd. Het mengsel werd bestraald mét ultraviolet licht 5 afkomstig uit een lage druk kwiklamp, waarbij het mogelijk werd gemaakt om de thermische stralen te absorberen met een hiertoe geschikt filter.

De copolymerisatie werd bewerkstelligd in een stikstofatmosfeer gedurende een periode van 30 minuten. Het vaste materiaal dat werd verkregen werd herhaaldelijk gewassen met een bufferoplossing -met een pH-waarde van 6 10 en vervolgens enkele keren met een oplossing van 0,3ίΜ NaCl. Tenslotte werd de enzymatische activiteit van het copolymeer bepaald door het uitvoeren van de specifieke reactie voor het peröxydase, bijvoorbeeld een spectrofotometrische bepaling met H^-guaiacol of p-aminofenazon. Hierbij werd een reactie-effectiviteit verkregen die is uitgedrukt in de hoe-15 veelheid enzymatische activiteit die werd geïmmobiliseerd per hoeveelheid enzymatische activiteit die in reactie werd gebracht, vermenigvuldigd met 100, en deze lag tussen 10 en 24/6 , in afhankelijkheid van de concentratie van het enzym.

Het copolymeer dat onder vochtige omstandigheden kan worden be-20 waard bij een temperatuur tussen 4 °C en 5 °C, behoudt 80/6 van de activiteit gedurende een periode langer dan 1 jaar. De analytische eigenschappen komen overeen met de eigenschappen van de samenstelling die cellulose-polyglycidylmethacrylaat-peroxydase bevat.

Voorbeeld II

25 De bereiding van cellulose-copolymethylacrylaat-peroxydase.

'De reactie die is aangegeven in voorbeeld I werd herhaald met dit verschil dat als vinylmonomeer methylacrylaat werd toegepast. De vaste * stof werd uit de reactie gewonnen en gewassen met oplossingen met een pH van 5,3- Op basis van.de bepaling van.de enzymatische activiteit van het 30 copolymeer bleek de effectiviteit van de immobilisatie te corresponderen met een waarde van.3%·

Voorbeeld III

De bereiding van cellulose-copolyacrylonitrile-peroxidase.

De reactie die is beschreven in voorbeeld I werd herhaald met 35 de volgende veranderingen:

De hoeveelheid cellulose bedroeg 5 g en werd gebruikt in gezwollen toestand in de vorm van korrels, als vinylmonomeer werd acrylonitrile toegepast en het copolymeer bleek na wassen met oplossingen met een pH

8100728

Ji' V

-7- 21737/Vk/jg van 5,3 een) peroxidase-activiteit te hebben en de effectiviteit van de reactie was 70%.

Voorbeeld IV.

' \

De bereiding van cellulose-copolymethylnethacrylaat-peroxidase.

5 De reactie, vermeld in voorbeeld II werd herhaald met die veran dering dat als vinylmonomeer methylmethacrylaat werd toegepast. De effectiviteit van de reactie bedroeg 7%, . Voorbeeld V·*

De bereiding van cellulose-copoly(hexahydro-tris-acryloyl-s-tri- 10 azine).

De reactie die is aangegeven in voorbeeld I werd herhaald met die wijziging dat als monomeer hexahydrotriacryloyl-s-triazine werd toegepast. De effectiviteit van de reactie bedroeg 28%.

Voorbeeld VI

15 De’bereiding van cellulose-copoly(bis-acryloylpiperazine),

De reactie beschreven in voorbeeld I werd herhaald met die wijziging, dat als vinylmonomeer bis-acryloylpiperazine werd toegepast. De effectiviteit van de reactie bedroeg 20%.

Voorbeeld VII

20 De bereiding van Sefarosë (r)-eopolyglycidy1-methacrylaat-cellu- lase.

Sepharose, hetgeen een merkaanduiding is, werd in een hoeveelheid van 100 mè gesuspendeerd in 10 ml water. Hieraan werd toegevoegd 0,1-100 mg FeCl^ en de pH werd ingesteld op een waarde tussen 4 en 5,1 per 100 mg 25 cellulase zoals Cellulase F en glycidylmethacrylaat in hoeveelheden tussen 1 en 100 mg,. Een van de monomeren, toegepast in de voorbeelden II-VI kan eveneens worden toegepast. De temperatuur werd beneden 20 °C gehouden. Het bestralen werd uitgevoerd met ultraviolet licht , verkregen uit een lage druk-kwiklamp.. De copolymerisatie werd voortgezet gedurende 30 30 minuten. Het copolymeer werd gewassen zoals aangegeven in voorbeeld I en de enzymatische activiteit werd bepaald met carboxymethylcellulose als substraat. De effectiviteit van de immobilisatie werd berekend op basis van de gemeten activiteit en bleek 82? te zijn.

Voorbeeld VIII

35 De bereiding van Sepharose φ- eopolyglycidylmethacrylaat-¢^- amylase.

Op eenzelfde wijze als aangegeven in voorbeeld VII werd ^-amylase geïmmobiliseerd, met slechts dit verschil dat als enzym (^-amylase werd 8 1 00 72 8 -8- 21737/Vk/jg I >

r V

toegepast. De effectiviteit van de immobilisatie was 5%.

Voorbeeld IX

De bereiding van Sepharose(S) -copoly(hexahydrotriacryloyl-s-tri- azine)peroxidase. ' 5 De immobilisatie-reactie werd herhaald met Sepharose, hetgeen een merkaanduiding is, zoals aangegeven in voorbeeld VII, met uitzondering hiervan dat als enzym peroxidase werd toegepast en als vinylmonomeer hexahydro-triacryloyl-s-triazine. De immobilisatie-effectiviteit was 38%.

Voorbeeld X

10 De bereiding van Sepharose(r) -copolygiycidyl-methacrylaat-gluco- seoxidase.

De reactie die aangegeven is in voorbeeld VI werd herhaald met uitzondering hiervan dat als enzym glucose-oxidase (E.C.)werd toegepast. De immobilisatie-effectiviteit bedroeg 52¾.

15 Voorbeeld XI

De bereiding van zetmeel-copolyglycidylmethacrylaat-peroxidase.

Zetmeel werd in een hoeveelheid van 100 mg opgelost in 10 ml water. Hieraan werd toegevoegd 0,1-100 mg FeCl^, terwijl de pH werd ingesteld op *J. Verder werd 1-100 mg glycidylmethacrylaat-peroxidase toe-20 gevoegd. Een van de mon'omeren, vermeld in voorbeelden II-VII kan eveneens worden gebruikt. De temperatuur werd gehouden beneden 20 °C. Vervolgens werd het mengsel bestraald met ultraviolet licht, verkregen met een lage druk kwiklamp. De copolymerisatie werd gedurende 30 minuten voortgezet. Het verkregen precipitaat werd gewassen zoals aangegeven in voorbeeld I 25 en de activiteit van het copolymeer werd bepaald. De effectiviteit van de immobilisatie, berekend op basis van de activiteitsmeting bedroeg 110¾. De analytische eigenschappen van het produkt, komen, zoals te verwachten was, overeen met een produkt dat zetmeel-polyglycidylmethracrylaat-peroxidase bevat. De bovenvermelde, voorbeelden geven de wijze van immobilisatie van 30 enzymen weer op een vaste drager, bestaande uit een polycarbohydraat door het uitvoeren van een eenvoudige reactie voor het bewerkstelligen van de Immobilisatie. De effectiviteit van de toegepafete werkwijze is afhankelijk van een aantal factoren, zoals de fysische eigenschappen van de drager, de fysische eigenschappen van het monomeer en de fysische eigen-35 schappen van het enzym. Hierbij moet worden<>opgemerkt dat het mogeldjjk is om op dezelfde matrix meerdere enzymen gelijktijdig de immobiliseren.

Uit het bovenstaande blijkt dat de werkwijze volgens de uitvinding betrekking heeft op de bereiding van een copolymeer van een poly- 81 00 72 8 -9- 21737/Vk/jg saccharide met een enzymatische activiteit, door aan een suspensie van een polysaccharide in een waterig medium een vinylmonomeer en een enzym toe te voegen en vervolgens een katalysator die een metallisch zout bevat en het mengsel te bestralen met ultraviolet licht. Als metallisch zout 5 wordt bij voorkeur een ijzer(III)zout toegepast. Het vinylmonomeer-kan methylacrylaat, glycidylmethacrylaat, acrylonitrile, bis-acryloylpipera-zine of symmetrisch N,N',NM-trisacryloylhexahydrotriazine zijn. Deze werkwijze kan worden toegepast op een groot aantal enzymen zoals proteolyti-sche enzymen, hydrolytische enzymen, oxidasen,.dehydrogenasen en isomera-10 sen.

-CONCLUSIES- v 81 00 72 8

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van een copolymeer van een polysaccharide met een enzymatische activiteit, met het kenmerk, dat aan een 5 suspensie van een polysaccharide in een waterig medium een vinylmonomeer en een enzym worden toegevoegd en dan een katalysator die een metallisch zout bevat en het verkregen mengsel wordt bestraald met Ultraviolet licht. . 2. Werkwijze· volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als metallisch zout een ijzer(III)-zout wordt toegepast.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als vi nylmonomeer een monomeer wordt toegepast met formule HgCsC-CR’)(R), waarbij R waterstof of methyl is, R’ is CN of COOR", en R" is een lagere alkylgroep.

4. Werkwijze volgens conclusie 3> met het kenmerk, dat het vinyl-15 monomeer R" is gesubstitueerd door ten minste een epoxy-of hydroxygroep.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat als vinylmonomeer methylacrylaat wordt toegepast.

6. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het vinylmonomeer glycidylmethacrylaat is.

7. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat als vinyl monomeer acrylonitrile wordt toegepast.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als vinylmonomeer een N-acryloylderivaat wordt toegepast van een verbinding met een stikstof houdende heterocyclische ring.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat als vinyl monomeer bis-acryloylpiperazine wordt toegepast.

10. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat als vinylmonomeer symmetrisch N,Nt,N”-trisacryloyl-hexahydrotriazine wordt toegepast. ; · 30 tl, Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als en zym een proteolytisch enzym wordt gebruikt, gekozen uit de groep bestaande uit papalne, trypsine en chimotrypsine.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als enzym een hydrolytisch enzym wordt toegepast, gekozen uit een groep, bestaan-35 de uit amylasen, cellolasen, β-glucuronidase-arylsulfatasen, esterase, heparinase, penicillinamydase en urease. 13* Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzym een oxydase is, gekozen uit de groep, bestaande uit aminoazijnzuur- 81 00 72 8 ï *w -11- 21737/Vk/jg 's-» oxydase, diaforase, glucoseoxydase en peroxydase.

14. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzym een dehydrogenase is, gekozen uit de groep bestaande uit steroidozuur-genase, melkzuurhydrogenase en alcohol-dehydrogenÈlse.

15. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het en zym een katalyse is.

16. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzym een isomerase isK gekozen uit de groep bestaande uit invertasen en steroidoisomerasen. 10 Eindhoven, februari 1981. 81 00 72 8