JPS6023837B2 - 非可動化微生物細胞組成物及び微生物細胞の非可動化法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、重合酵素生成物に関する。

更に特定すれば、非可動化微生物細胞及びその製造に関
する。酵素は、その高特異性により、多くの化学反応に
おいて通常の触媒よりはるかに優れている。

しかし、最近までは、亀隣コストが高い、細胞に含まれ
た状態（ｗｈｏｌｅｃｅｌｌｅｎｖｌｒｏｎｍｅｎｔ）
から除去する時不安定になる傾向がある。溶解状態での
み入手できるなどの要因により、その用途が厳しく制限
されていた。固体支持物質に結合させ、あるいはそれに
取り込むことによる酵素の非可動化が、これら困難点の
解消に、又酵素の使用を更に経済的にするのに役立って
いる。

この非可動化に用いられる様々な物理的、化学的方法は
、０．Ｒ．Ｚａめｒｅｋｙによる“イ ン モ ビ ラ
イズド エ ン ザーイ ム ズ（ｌｍｍｏｂｉｌ
ｉｚｅｄＥｎｚｙｍｅｓ）”（ＣＲＣ出版、１９７３）
などの書物で論じられている。酵素の単離と安定性の問
題を克服するための、酵素を含んだ細胞（ｗｈｏｌｅｃ
ｅｌｌ；以下全細胞と呼ぶ）自体の非可動化も又用いら
れている。

典型例は、活性グルコースイソメラーゼを含むストレプ
トマイセスフェオクロモゲネス菌（ｓ口ｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓｐｈａｅＭｈｍｍｏ蟹ｎｅｓ）細胞の還元獣皮コラ
ーゲンへの吸着（Ｂｉｏにｃｈ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．、Ｘ
Ｖ、５６５頁、１９７２王）、及び化合物Ｓをコルチソ
ル（ｃｏｎｉｓｏｌ）に変えるためのヒドロキシラーゼ
酵素を含む真菌細砲のゲル内取り込み〔ｇｅｌｅｎｔ○
ｐｍｅｎｔ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｎｃａｎ、
Ｍａｒ、１９７１、Ｐ．３０）〕である。

しかし、これら非可動化方法では、支持媒体から一細胞
を分離する必要がある。結合力の性質により、酵素活性
の損失と恐らくは処理流の汚染を伴なうかかる分離を防
止又は最小にするために反応条件は厳しく限定される。
それゆえ、一層安定な細胞非可動化系が本発明の目的で
ある。今や、微生物細胞を、細胞の水不溶性粒状ポリマ
ーマトリックスへの化学的共有結合により有効に非可動
化できることが発見された。

この化学結合は、前もって形成したポリマーと、あるい
は重合前の反応性モノマーと形成できる。更に、細胞を
結合前、中、後のいずれかに多官能架橋剤で処理すれば
、細胞からの酵素の損失が少なくなる。本発明により、
水不落’性粒状ポリマーマトリックスに共有結合した微
生物細胞からなる組成物が提供される。更に、微生物細
胞をポリマーの結合基と反応させて、水不熔性粒状ポリ
マーマトリックスと共有結合を形成することからなる、
微生物細胞の非可動化方法も提供される。

本発明の実施においては、自然状態の微生物細胞をポリ
マーの反応基を通じて水不溶性粒状ポリマーに化学結合
する。

単離酵素のポリマーへの化学的共有結合は現在の一般法
ではあるが、酵素より大きい全細胞自体も化学的共有結
合により有効に非可動化できるという発見はまさに驚く
べきことである。かかる結合は、多くは細胞アミ／基と
ポリマーの反応性置換基との反応により生ずる。更に、
ヒドロキシル基、スルフヒドリル基などの他の基も細胞
にあり、この結合機構の一役を担うものと思われる。ポ
リマーのアミ／反応性置換基、例えばェポキシド基、ハ
ロカルボニル基及びハロメチルカルボニル基、は細胞に
存在するヒドロキシル基及びスルフヒドリル基に対して
も反応性なのでこれは真実である。上記結合は、ポリマ
ー形成の前か後のいずれの場合に生じてもよい。

前者の場合は、細胞を、反応基を含む重合性エチレン型
不飽和モノマーと接触させ、ついで細胞保持モノマーを
架橋剤モノマーと開始剤系との存在下で重合もしくは共
重合する。後者の場合は、細胞を、反応基を含む粒状ポ
リマーと直蚤に接触させる。この粒状ポリマーには合成
有機ポリマーと天然有機ポリマーとがある。結合前法も
しくは結合後法のいずれかによる本発明の実施に適した
重合性エチレン型不飽和モノマー及びこれから誘導され
るポリマーは式１を有するものである：〔式中Ｒ，ごＨ
、メチル基又はＣＩ： 又は Ｚ； Ｒ２はヒドロキシ、ハロゲン原子、アジド基、２・３ー
ヱポキシプロポキシ基、２・３−ェピチオプロポキシ基
、Ｎ−（２・３ーェポキシプロピル）アミノ基、Ｎ−〔
（ｐージアゾニウムクロリド）フェニル〕アミ／基、ア
クリルオイルオキシ基、低級アルコキシカルボニルオキ
シ基又はベンゼンスルホニルオキシ基：Ｘ＝酸素原子又
はＮＲ３（Ｒ３はＨ又はＣ，〜６アルキル基）：Ｙ＝Ｃ
２〜３アルキレン基： ｎ＝整数１又は２： Ｚ＝水素、ハロアセチル基、２一（４・６−ジクロル）
−ｓ−トリアジニル基、ｐ−トルェンスルホニル基、ｐ
−（ハロメチル）ペンゾィル基又はシアノ基；そして Ｘ′＝Ｘ（但し、Ｚがｐートルェンスルホニル基である
時には酸素原子である）〕ェポキシド基、ハロカルボニ
ル基及びハロメチルカルボニル基を含むモノマー及びポ
リマーが上託結合に好ましい。

特に望ましいものは、反応性モノモー；メタクリル酸２
・３−ェポキシプロピル（メタクリル酸グリシジル）、
メタクリル酸２・３ーェピチオプロピル、塩化メタクリ
ロィル及びメタクリル酸ブロムアセチルヒドロキシヱチ
ル；を含むポリマーである。非反応性官能基を含むモノ
マー及びポリマー（上記式１でＲ２がヒドロキシ基であ
るかＺが日である時）の場合には、この官能基は当業界
で良く知られた方法により反応性置換に変えることがで
きる。

これには多官能低分子量試薬の使用が必要であることが
多い。例えば、式１でＲ２がヒドロキシ基である時には
、適当なカルボン酸基活性試薬（例えば、ジシクロヘキ
シルカルボジィミド、エチルモルホリノカルボジイミド
などのカルボジィミド類；Ｎ−エチル−５ーフヱニルィ
ソキサゾリウムー３−スルホネート（ウッドワード試薬
Ｋ）；ペンタメチレンケテンシクロヘキシルイミンなど
のアセチレンエーテル；へキサハロシクロトリホスフア
トリアジン類；Ｎーヒドロキシフタルイミド、Ｎーヒド
ロキシスクシンイミド）その他の、ベプチド結合を形成
するために使用される試薬との反応により、モノマー又
はポリマーのカルボキシル基を活性化できる。式１でＺ
が日である時には、ハローＺ、特に臭化プロムアセチル
、臭化シアン、２ーアミノー４・６−ジクロル−１・３
・５ートリアジンを用いる標準方法によりモノマー又は
ポリマーのヒドロキシル基を同様に活性化できる。本発
明の非可動化法は、バクテリア、イースト、放線菌、真
菌などの微生物細胞に適用できる。

好ましい細胞は、一次酵素系が酸化還元酵素：特に溶解
補助因子を必要としないグルコールオキシターゼ；Ｑ・
８ーアミラーゼ、ベプチダ−ゼ、そして特にペニシリン
アシラーゼなどのハイドロラーゼ；リアーゼ、好ましく
はＣ−○結合する切断するもの、特に、Ｃ−Ｎ結合の切
断に関与するフエニルアラニン アンモニア リアーゼ
、アスパルテート アンモニア リアーゼ；そしてラセ
マーゼ、エピメラーゼ、シスートランス イソメラーゼ
、そして特にグルコース ィソメラーゼなどのイソメラ
ーゼ；を含む細胞である。好ましいバクテリア属は、プ
ソイドモナス（ＰｓＭｕｄｏｍｏ脇ｓ 入 キ サ ン
ト モ ナ ス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 入 ア
セ ト バ ク タ −（ Ａｃｅｂｂａｃｔｃｒ ）
、ア ル カ リ ゲ ネ ス（Ｎｃａｌｉ鞍ｎｅｓ）
、フ ラ ボバクテリウ ム（Ｆ１ａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ）、 エ シ エ リ ヒ ア（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ
）、エルビニア（ＥＭｉｎｉａ）、セラツチア（Ｓｅｎ
ａｔｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏにｕｓ）、ミクロコツ
カス（Ｍｉｃｒ比比ｃｕｓ）、サルチナ（Ｓａｒｃｉｎ
ａ）、ラクトバチルス（いｃｔｏｂａｃｉｌｌ船）、バ
チルス（欧ｃｉｌｌｕｓ）、／力ルジア（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏび肥ｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）である。

好ましい真菌及びイーストの属は、ロドトルラ（Ｒｈｏ
ｄｏｔｏｒ山ａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐ
ｏｒｉｄｉｕｍ）、スポロボロ マイセ ス（Ｓｐｏｒ
ｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ）、ム コ（Ｍｕｃｏｒ）、フ
サリウム（Ｆ瓜ａｒｉ山ｍ）、ベニシリウム（Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ ）、ア ス ベ ルギル ス（松ｐｅ
ｒｇｉｌｌ雌）、グロメレラ（ＧＩｏｍｅｒｅｌｌａ）
、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐ船）、サツカロマイセス（Ｓ
ａｃｃ舷ｒｏｍｙｃｅｓ ）、 コ ニ ジ オ ポ
ル ス（Ｃｏｎｉｄｉｏ瓜ｌｕｓ ）、ビ ス ソ ク
ラ マ イ ス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍ＄）、力ンジ
ダ（Ｃａｎｄｉ船）、ケトミウ ム（Ｃｈａｅｔｏｍｉ
肌入 トリ コ デル マ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｎｎａ）
、セブトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）、コプリヌス（Ｃｏ
ｐｎｎｕｓ）、ニューロ スポ ラ（Ｎｅ山。ｓｐｃて
ａ）、フラコラ（Ｈｕｍｕｃ。ｌａ）、トリコスポ。ン
（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）である。好ましい放線菌
の属は、ミクロポリスポラ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏ
ｔａ）である。

特に好ましい種は、Ｅ．コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｉｌ）、バクテリウム カダベリス（Ｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｃａ船ｖｅｒｊｓ）、プロテウスレツトゲリ（Ｐ
ｒｏｔｅｕｓｒｅｔｔ袋ｒｉ）、ロドトルラグラチリス
（Ｒｈｏｄｏｔｏｍｌａ餌ａｃｍｓ）、ベニシリウム
ク リ ソ ゲ ヌ ム （ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ皿
ｃｈｒ＄ｏｇｅｎｕｍ）、アスベルギルス ニガー（
船ｐｅｒ蟹１１ｕｓｎｉ繋ｒ）である。細胞の反応性ポ
リマーへの共有結合、反応性モノマーへの結合及びこれ
に続くホモ重合又は共重合は水性嬢質中で行なう。

ポリマー又はモノマーへの結合、モノマーへ結合した後
の重合の際の温度は広範囲に変えることができるが、好
ましい範囲は５〜５０ｑｏ、特に１０〜３ぴ○である。
結合に要する時間は、系及び結合温度に左右されるが、
通常０．５〜３５時間であり、ポリマーに結合するのに
好ましい時間は１５〜３餌時間、モノマーに結合するの
に好ましい時間は１〜５時間である。重合は通常１〜６
時間で完了する。ポリマー対細胞（乾燥ベース）の重量
比はかなり変えることができるが、好ましい比は０．１
〜２５特に０．５〜４である。細胞を反応性モノマーに
結合する時には、その後の水性添加重合は、二官能架橋
剤モノマー及び開始剤系の存在下で（１以上のコーモノ
マ−を用いて、あるいは用いずに）行なう。この種の重
合で普通使用され、又細胞の酵素活性を破壊することの
ないコーモノマー、架橋剤モノマー、開始剤系ならいず
れをも容易に使用できる。適当なコーモノマーは例えば
アクリル酸、Ｑ−クロルアクリル酸、メタクリル酸及び
それらのグリシジルェステル、低級アルキルェステル、
Ｎ・Ｎ−（ジ置換）アミノアルキルェステル、アミド、
低級アルキル置換アミド、メチロール置換アミド、Ｎ一
層襖アミノアルキルアミド、及びＮ・Ｎ一二置換アミノ
アルキルアミド、スチレン、フタジェン、イソブレンで
ある。

好ましいコーモノマーはスチレン、アクリル酸、メタク
リル酸２ーヒドロキシ−３一（１一〔４ーメチルピベラ
ジニル）〕−プロピル、特にメタクリル酸メチルである
。最終ポリマーに三次元縫目特性と水不瀞性とを与える
広範囲の架橋剤モ／マー、例えばアクリルモノマー、オ
レフイン化合物その他当業界で知られているものを使用
できる。

かかるモノマーの代表例は、ジアクリル酸１・３ープチ
レン、ジメタクリル酸エチレングリコール、ジメタクリ
ル酸１・３−ブチレン、ジアクリル酸１・６ーヘキサメ
チレン、ジアクリル酸エチレン、ジメタクリル酸ジェチ
レングリコール、Ｎ・Ｎ′−メチレンビスアクリルアミ
ド、ジメタクリル酸ネオベンチルグＪコール、トリメタ
クリル酸１・１・１−トリメチロールェタン、ジビニル
ベンゼンである。好ましい架橋剤モノマーは、Ｎ・Ｎ′
ーメチレンビスアクリルアミドである。本発明の重合・
共重合反応は、フリーラジカルにより開始される。

通等なフリーラジカル開始剤系は、細胞の酵素部分の熱
感受性により余儀なくされる緩和な条牛下で重合又は共
重合に適当な速度でフリーラジカルを発生させるもので
ある。この理由により、レドツクス開始剤系が好ましい
。かかる系の代表例は、チオ硫酸ナトリウム、メタ重亜
硫酸ナトリウム、硫酸第二鉄アンモニウム、六水和物、
ジメチルアミノプロピオニトリル、リボフラビンなどの
還元剤と組み合わせた過酸化合物、例えばアンモニア、
ナトリウム、カリウムの過硫酸塩、過酸化ペンゾィル、
パーオキシジ炭酸ジ（ｓｅｃーブチル）である。好まし
い開始剤系は、ジメチルアミノプロピオニトリル一過硫
酸アンモニウムである。本発明のポリマー組成物の組成
はかなり変えることができるが、好ましい組成物は、モ
ノマー全モルに対して１５〜９０％の細胞反応性モノマ
ー、０〜６０のコーモノマー、１０〜４０％の架橋剤モ
／マ−を含む物である。

これらの割合が、細胞をモノマ−に結合するにしても前
もって形成したポリマーに結合するにしても好ましい。
特定の場合、細胞を多官能架橋剤で処理して、細胞から
の酵素損失を少なくする。正確な機構は十分にはわかっ
ていないが、一群の多官能試薬が細胞膜のアミノ基と反
応し、これにより架橋し、かくて膜の多孔性を有効に低
下させ、他庚羊の試薬は、膜中に存在するカルボキシル
基を活性化させ、ついでアミド結合形成により膜のアミ
ノ基と反応させることによりこの結果を得ると考えられ
る。最初の群の代表例はピルビンアルデヒド、グリオキ
サール、ヒドロキシアジポアルデヒド、塩化シアヌ−ル
、四アザ化ｏ−ジアニシジン、ビス−ニアザ化ペンジジ
ン、１・３−ジフルオル−４・６ージニトロベンゼン、
トルエン２・４ージィソシアネート、そして特にグルタ
ルアルデヒドなどの試薬であり、二番目の群の例は、ク
ロルギ酸エチル、水溶性カルボジイミド〔例えば１ーェ
チル−３一（３ージメチルアミノプロピル）カルボジィ
ミド塩酸塩〕などの試薬である。細胞は反応性モノマー
又はポリマーへ結合する前でも、中でも、後でも処理で
きる。

細胞結合の場合には、この処理は水性煤質中で行なう。
細胞は広い温度範囲にわたって有効に処理できるが、好
ましい範囲は５〜５０ｑｏ、特に１０〜３０午○である
。用いる温度と試薬に左右されるが、処理には通常０．
５〜１斑時間、好ましくは２〜４時間を要する。必要な
試薬の量はかなり変えることができるが、普通には細胞
（乾燥ベース）の１〜５の重量％、好ましくは５〜２５
重量％である。本発明の、化学的共有結合（所望により
、細胞からの酵素の漏れを最小にする処理を行なう）に
よる細胞の水不溶性モノマーへの固定により、目的酵素
を軍雛する必要なく安定な非可動化酵素系が得られる。

その安定性及び容易に炉過できる粒状形により、この製
品は、再循環バッチが連結操作かを必要とする水性触媒
化学方法で有効に使用できる。本発明の具体例を以下の
実施例に示す。

実施例 １ ８０夕のメタクリル酸グリシジルと１．０その水との混
合物に、燈拝しながら３０夕のＮ・Ｎ′−メチレンビス
アクリルアミドを加えた。

室温で１５分蝿拝した後に１０夕のメタクリル酸メチル
を加え、約５℃にまで冷却し、得た袷混合物に窒素ガス
を１５分通気した。ついで２０のとのジメチルアミノプ
ロピオニトリルと２夕の過硫酸アンモニウムとを加えた
。窒素下の混合物を重合開始まで１０℃で渡洋し、つい
で周囲温度で更に１時間網拝し、最後に２時間放置した
。得られた固体に約７５０叫の水を加え、激しく蝿拝し
てポリマーを分解した。固体を炉取し、水で洗い、風乾
して１２０夕の白色粒状ポリマーを得た。グルコース基
質で３３００、ｐＨ５．８〜７．０の液内好気条件下で
発育させたアルベルギルス ニガー（Ａニガー）菌（Ｎ
ＲＲＬ−３；ファイザー培養菌ＦＤ２４５４）発酵肉汁
を炉過し、得た細胞を水で洗い、ついで水を絞り半乾燥
ペーストにした。

この細胞（２５０夕；乾燥ベースで５５夕）を、ｌ００
０の‘の水に２２夕の２５重量％グルタルアルデヒド水
溶液を含めて得た溶液に入れた。得た細胞浮遊液をｐＨ
６‐比調整し、室温で・拳醐拝した。固体を炉取し、水
で洗って、最初のグルコ山スオキシターゼ活性の７６％
を有する１０４夕の湿潤細胞を得た。２４０の‘の水に
３２夕の湿潤細胞と１６夕のメタクリル酸グリシジルポ
リマーとを含めて得た浮遊液を室温で３■ふ燈拝し、つ
いで炉遇した。

得た固体を水で洗い、初めの未処理細胞のグリコースオ
キシターゼ活性の歌％を有する１２６夕の非可動化湿潤
細胞を得た。実施例 ２ 実施例１で製造したＡ．ニガー菌湿潤細胞（グルコース
オキシターゼ活性＝２３単位／１００の９）の６００の
ｏを２０泌のアセトニトリルに含めて得たスラリーに、
６００の９の塩化メタクリルオイルと４００ｍｏのトリ
ェチルアミンとを同時に加えた。

室温で２時間凝拝し、ついで２０のこの水に入れた（冊
は６．０３になった）。窒素下これに１．３夕のＮ・Ｎ
′−メチレンビスアクリルアミド、７５０雌のメタクリ
ル酸メチル及び３００雌のアクリル酸を加えた。ＰＨを
６７に調整し、０．５泌のジメチルアミノプロピオニト
リルと２５０の９の過硫酸アンモニウムとで処理した。
２時間後に更に１５０の９の過硫酸アンモニウムで処理
し、１時間縄拝した。

等体積の水を加え、遠心分離した。残澄を炉取し、水で
洗って、最初の未処理細胞のグルコースオキシターゼ活
性の７８％を有する３２．２５夕の非可動化湿潤細胞を
得た。実施例 ３実施例１の非可動化湿潤細胞（４７．
３夕）を、１０夕のグルコースを含む１００私の水溶液
に入れ、室温で通気しながら２１時間渡洋した。

グルコン酸とデルターグルコノラクトンとの混合物に９
９％が変えられ、又最初の酵素活性の７５％が回収され
た。この酸化を、実施例２の非可動化湿潤細胞の３０夕
を、２夕のグルコースを含む２０の【の水溶液中で使用
して繰り返し、上記に匹敵する転化率と酵素活性回収率
とを得ることができた。実施例 ４乳酸カゼイン基質で
２８℃、ｐＨ６．８〜７．０の液内好気条件下で発育さ
せたプロテウス レツトゲリ菌（ＡＴＣＣ９２５０：フ
ァイザー培養菌ＦＤ（８４７０−７６一６０）発酵肉汁
を遠心分離し、細胞を水で再スラリー化し、ついで絞り
半乾燥ペーストにした。

この湿潤細胞（乾燥重量７．５多）を１００地の水に入
れてスラリ−を得、これに４夕の２５重量％グルタルア
ルデヒド水溶液を加えた。ＰＨ７．０で３時間鷹拝し、
ついで遠心分離した。処理細胞を１００似の水に再浮遊
させ、濃伴しながら実施例１のメタクリル酸グリシジル
ポリマ−の７．５夕を加えた。斑７．０、室温で３０時
間蝿拝した。得た固体を炉取し、水で洗い、使用するま
で湿潤ケーキとして貯蔵した。この非可動化細胞は、ペ
ニシリンＧの６ーアミ／べニシラン酸への転化率により
測定して最初の未処理細胞の活性の６５％を有していた
。実施例 ５実施例４の非可動化プロテウス レットゲ
リ菌細胞の２０夕（乾燥ベースで５．０多）を５００の
‘の水に入れて得た軸８．０、３７℃のスラリーに、５
夕のペニシリンＧカリウムを加えた。

ＩＮＮａＯＨをモニターしながら添加してｐＨを８．０
に維持し、加水分解を３時間後に完了した。得た非可動
化細胞を炉取し、水で洗い、使用するまで湿潤ケーキと
して貯蔵した。炉液を州ＨＣＩでＰＨ２に調整し、酢酸
エチルで抽出した。得た水層をがＮａＯＨでＰＨ４．３
に調整し、濃縮し、冷却して白色結晶固体を得た。この
結晶固体を炉取し、水で洗い、嵐乾して２．１７夕（収
率７５％）の精製６−アミノベニシラン酸を得た。２０
回加水分解した後も非可動化細胞は最初の非可動化細胞
（実施例４）のペニシリンアシラーゼ活性の約５０％を
保持していた。

実施例 ６ ３．６夕のメタクリル酸ブロムアセチルヒドロキシェチ
ルを１５私の水に入れ、窒素下蝉拝したものに３７５の
９のＮ・Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドを加えた。

５℃にまで冷却し、０．２５のジメチルアミノプロピオ
ニトリルと滋倣の過硫酸アンモニウムとで処理した。重
合が始まるまで室温でゆっくりと燈拝した。ついで蝿梓
装置を停止し、反応混合物を室温で２時間放置した。得
られたスラリーを２５私の水で希釈し、炉過した。得た
ケーキを水で洗い、風乾して３．７夕の粒状ポリマーを
得た。実施例４で発育・軍離し、水を絞った湿潤プロテ
ウス レットゲリ菌細胞を、５０の‘の水に０‘８夕の
２５重量％グルタルアルデヒド水溶液を含めて得た溶液
に入れた。得た浮遊液をｐＨ７．０に調整し、室温で３
時間欄辞し、遠心分離した。この処理細胞を５０泌の水
に再スラリーし、半乾燥ペーストに圧した。この処理細
胞の１０夕と２０９のメタクリル酸ブ。

ムアセチルヒドロキシエチルポリマーを１２０地の水に
浮遊させ、室温、ｐＨ７．０で３斑時間燭拝した。炉過
し、得たケーキを水で洗って、最初の未処理細胞のペニ
シリンアシラーゼ活性の７５％を有する３６．８夕の非
可動化湿潤細胞を得た。実施例 ７ 実施例６の非可動化湿潤細胞の４６夕をＰＨ８．０、３
７０の５００の【の水を含めた得たスラリ一に５夕のペ
ニシリンＧカリウムを加えた。

ＩＮＮａＯＨをモニターしながら添加してｐＨを８．０
に維持し、加水分解を３時間後に完了した。非可動化細
胞を炉取し、水で洗い、使用するまで湿潤ケーキとして
貯蔵した。州ＨＣＩで炉液をｐＨ２に調整し、酢酸エチ
ルで抽出した。得た水層を州ＮａＯＨでＰＨ４．３に調
整し、濃縮し、冷却して結晶６−アミ／べニシラン酸を
得た。実施例 ８ 実施例１の処理済のＡ．ニガー細胞の２５夕と２夕のメ
タクリル酸グリシジルとを６０の‘の水に浮遊させ、７
℃で１７時間理拝した。

ついでこの浮遊液を、４０の‘の水に２．２夕のＮ・Ｎ
−メチレンビスアクリルアミド、２泌のスチレン、４５
０の３のメタクリル酸メチル、０．５の‘のジメチルア
ミノプロピオニトリル及び１．５夕のメタクリル酸２−
ヒドロキシ−３−〔１一（４ーメチルピベラジニル）〕
−プロピルを含めて得たｐＨ６．８の混合物に加えた。
窒素下２０倣ｏの過硫酸アンモニウムで処理し、室温で
３時間損拝した。反応団体を炉駁し、水で洗い、最初の
未処理細胞のグルコースオキシターゼ活性の７５％を有
する４３．６夕の非可動化湿潤細胞を得た。実施例 ９ ２０夕のグルコースを含む２００のとの水溶液に実施例
８の非可動化湿潤細胞（２８．３のを入れ、通気しなが
ら室温で２１時間縄拝した。

グルコン酸とデルターグルコノラクトンとの混合物が収
率８０％で得られた。反応スラリ−を炉過し、得た固体
を水で洗って、最初の酵素活性の８２％を有する２８夕
のきＥ可動化繊酒細胞を得た。実施例 １０ 実施例４と同機に発育・軍離し、水を絞った５夕の湿潤
プロテウス レットゲリ菌細胞と実施例１のメタクリル
酸グリシジルポリマーの１０夕とを６５机‘の水に浮遊
させ、室温で２４時間燈拝した。

炉過し、炉過ケーキを水で洗って、最初のペニシリンア
シラーゼ活性の６２％を有する２６．９夕の非可動化湿
潤細胞を得た。この非可動化細胞（２５夕：乾燥細胞の
重量は１夕）を、０．４夕の２５重量％グルタルアルデ
ヒドを５０の【の水に含めて得た溶液に入れた。

得た浮遊液をｐＨ７．０に調整し、室温で３時間額拝し
た。得たスラリーを炉過し、炉過ケーキを水で洗って、
未処理非可動化細胞のペニシリンアシラーゼ活性の７９
％を有する２３．２夕の非可動化湿潤細胞を得た。実施
例 １１実施例１０の処理済の非可動化湿潤細胞の１２
夕をＰＨ８．リ３７０の１００の‘の水に含めて得たス
ラリーに１夕にペニシリンＧカリウムを加えた。

ＩＮＮａＯＨをモニターしながら添加してｐＨを８．０
に維持し、反応を３時間後に完了した。得た非可動化細
胞物質を炉取し、水で洗い、使用するまで湿潤ケーキと
して貯蔵した。炉液を州ＨＣＩで斑２に調整し、酢酸エ
チルで抽出した。得た水層を州ＮａＯＨで柑４．３に調
整し、濃縮し、冷却して、結晶６一ＡＰＡを得た。０実
施例 １２ 実施例１と同様に発育・軍離したＡニガ−菌細砲（２０
夕；乾燥重量４夕）と８夕のメタクリル酸グリシジルと
を１００の‘の水に浮遊させ、ｐＨ７．５に調整し、室
温で１８時間振とうした。

Ｎ・Ｎ′−メタチレンビスアクリルアミド（１．５夕）
を加え、得たスラリ−を窒素化１８分蝿拝し、ついで５
℃にまで冷却し、１５０のｏの過硫酸アンモニウムと１
の‘のジメチルアミ／プロピオニトリルとで処理し、周
囲温度で３時間蝿拝した。生じた反応固体を炉取し、水
で洗って、最初のグルコースオキシターゼ活性の６２％
を有する７１夕の非可動化湿潤細胞を得た。この非可動
化細胞（１８夕；乾燥細胞重量１夕）を、０．４夕の２
５重量％グルタルアルデヒド水溶液を１００の‘の水に
含めて得た水溶液に入れた。

ｐＨを７．０に調整し、室温で３時間蝿拝した。生じた
固体を炉取し、水で洗って、グルタルアルデヒド処理前
の非可動化細胞のグルコースオキシターゼ活性の７５％
を有する１７．３夕の非可動化湿潤細胞を得た。実施例
１３ 実施例１２の処理済の非可動化湿潤細胞（１４夕）を、
１．５夕のグルコースを含む１５の‘の水溶液に入れ、
通気しながら室温で２１時間蝿拝し、実施例３に匹敵す
るグルコン酸転化率と酵素活性回収率とを得た。

実施例 １４ グルコース基質で２８ｑｏ、ｐＨ６．８〜７．０の液内
好気条件で発育させた発酵肉汁からロドトルラグラチリ
ス菌（ＮＲＲＬＹＩＯ９１；フアィザ−培養菌ＦＤ６５
２１）細胞を遠心分離により軍離した。

５０夕の洗浄細胞を２５０地の水に入れ、実施例１の５
夕のメタクリル酸グリシジルポリマーで処理した。

室温で２畑時間縄拝した。生じた浮遊液を炉遇し、炉過
ケーキを水で洗って、最初のフェニルアラニン アンモ
ニアーリアーゼ活性の４９％を有する６３夕の非可動化
湿潤細胞を得た。実施例 １５ ２．２５夕のトランス桂皮酸、６５２のｏの塩化アンモ
ニウム及び３．３の‘の濃水酸化アンモニウムを含む３
０私の水に実施例１４の１４．７４夕の非可動化湿潤細
胞を浮遊させ、ｐＨ９．５に調整した。

３７０で１朝時間振とうし、回収桂皮酸に基づき約９０
％の収率でＬ−フェニルアラニンを得た。

反応固体を炉取し、水で洗って、最初のフェニルアラニ
ン アンモニアーリアーゼ活性の７７％を有する１４夕
の非可動化湿潤細胞を得た。標準方法を使って炉液から
Ｌ−フェニルアラニンを単離した。実施例 １６ 実施例１４と同機に発育・軍離した４０夕の洗浄ロドト
ルラ グラチリス菌細胞と８夕のメタクリル酸グリシジ
ルとを８０の‘の水に浮遊させ、ｐＨを７．２に調整し
、室温で１．虫時間渡洋した。

Ｎ・Ｎ′ーメチレンビスアクリルアミド（１．５夕）を
加え、生じたスラリーを窒素下で１び分雌拝し、ついで
５℃にまで冷却し、１５０級の過硫酸アンモニウムと１
私のジメチルアミノプｏピオニトリルとで処理し、室温
で３時間燈拝した。この最終反応スラリーを水で希釈し
、炉過した。得たポリマーケーキを水で洗い、最初のフ
ェニルアラニンアンモニアーリアーゼ活性の４４％を有
する６２．３夕の非可動化湿潤細胞を得た。実施例 １
７ 実施例１６の１５夕の非可動化湿潤細胞を、１．１２夕
のトランス−桂皮酸、３２０の９の塩化アンモニウム及
び１．６叫の濃水酸化アンモニウムを含む３０の‘の水
に浮遊させ、ｐＨを９．５に調整した。

３７℃で１８時間振とうして、実施例１５に匹敵するＬ
ーフェニルアラニンを形成した。

実施例 １８ 実施例４と同様に発育・軍離し、水が絞った１５夕のプ
ロテウス レットゲリ菌湿潤細胞と、実施例１の３０夕
のメタクリル酸グリシジルポリマ−とを１００の‘の水
に浮遊させ、室温、ｐＨ７で１糊時間櫨拝した。

この浮遊液をついで遠心分離し、固体を水で洗って、最
初のペニシリンアシラーゼ活性の１００％を有する１０
０夕の非可動化湿潤細胞を得た。この非可動化湿潤細胞
の２５夕をＰＨ８．０、３７０の７０舷の水に入れてス
ラリーとし、これに１夕のペニシリンＧカリウムを加え
た。ＩＮＮａＯＨをモニターしながら添加して餌を８．
０に維持して加水分解を３時間で完了した。ついで炉過
し、炉取した非可動化細胞を水で洗い、使用するまで湿
潤ケーキとして貯蔵した。しかし、わずか２回加水分解
に使用した後、この細胞は最初の細胞のペニシリンアシ
ラーゼ活性の１５％を有するにすぎなかったので、６−
アミノベニシラン酸製造に対する有効性は実施例４の非
可動化細胞ほどではなかった。実施例 １９２５夕のメ
タクリル酸２−ヒドロキシェチルを１００の‘の水に入
れ、これに臭化シアン（１２．５夕）の水（１００机上
）溶液を加えた。

印ＮａＯＨで直ちにｐＨｉｌに調整して反応温度を４が
０に上げ、もはや塩基が必要なくなるまで斑をその値に
維持した。ついで室温にまで冷却し、ｐＨ６．５に調整
し、これを、凍結乾燥前に前もって実施例４と同様に発
育・単離した５０夕のプロテウス レットゲ１」菌凍結
乾燥細胞を５００の【の水に入れて得たスラリ−で処理
した。得た浮遊液を４粉ご損梓した。ついで２５夕のア
クリルアミドと２．５夕のＮ・Ｎ′ーメチレンビスアク
リルアミドとを加え、１５分間燭拝し、４℃にまで冷却
し、４の上のジメチルアミノプロピオニトリルと４２５
の９の過硫酸アンモニウムとで処理した。放置して室温
にまで温ため、更に１時間放置した。ついでワーリング
ブレンダーでブレンドし、遠心分離した。得たゲル状遠
心分離固体を水に再浮遊させ、再遠心分離し、水で洗い
、凍結乾燥して、最初のべニシＩＪンァシラーゼ活性の
１９％を有する１１２夕の非可動化乾燥細胞を得た。実
施例 ２０実施例４と同様に発育・単離し、水を絞った
プロテウス レツトゲリ菌湿潤細胞の２０夕を８０Ｍの
水に浮遊させ、これに１夕の２５重量％グルタルアルデ
ヒド水溶液と１０夕のメタクリル酸グリシジルとを加え
た。

柵６．８に調整し、室温で２時間櫨拝した。ついで窒素
下１．９夕のＮ・Ｎ′ーメチレンビスアクリルアミドと
２の【のジメチルアミノプロピオニトリルとで処理し、
ｐＨ７に調整し、２００の９の過硫酸アンモニウムで処
理した。このように処理比織機歩鰯糊、小で室温‘こ・
歩間放置した。

固体を炉取し、水で洗って、未処理細胞の最初のペニシ
リンアシラ−ゼ活性の５４％を有する８１．３夕の非可
動化湿潤細胞を得た。この非可動化湿潤細胞は実施例７
に記載した様に、ペニシリンＧカリウムを６−アミノベ
ニシラン酸に変えるのに役立ち、また実施例７に匹敵す
る結果を与えた。実施例 ２１ 蛋白水解物基質で２８ｏｏ、ｐＨ６〜８の液内好気条件
下で発育させたバクテリゥム カバベリス菌（ＡＴＣＣ
９７６０：ファイザー培養菌ＦＤ２４０１６）発酵肉汁
を遠Ｄ分離し、ついで菌細砲を水に再スラリー化し、水
を絞って半乾燥ペーストとした。

この湿潤細胞で乾燥重量７．５夕）を１００の‘の水に
入れてスラリーを得、これに４夕の２５重量％グルタル
アルデヒド水溶液を加えた。ｐＨ７で約２時間凝拝し、
ついで遠心分離した。この処理細胞を１００柵の水に再
浮遊させ、実施例１の７．５のメタクリル酸グリシジル
ポリマーを婿拝しながら加えた。約ｐＨ７．止 室温で
３び分煙拝した。固体を炉取し、水で洗い、使用するま
で湿潤ケーキとして貯蔵した。実施例 ２２ フマール酸（１２０９）を１４０の‘の濃水酸化アンモ
ニウムに加えた。

水酸化アンモニウムによりｐＨ８．５に調整し、水で６
００の【の量とした。７０００仏のァスパルテートアン
モニアーリパーゼ活性を有する実施例２１の非可動化細
胞を加え、３７０で４時間壇拝した。

生じたスラリーを炉過し、炉液を硫酸でｐＨ２．８に調
整したらアスパルギン酸が沈殿した。本発明の好適具体
例は次のように要約できる。‘１｝ 上記細胞はグルコ
ースオキシターゼ、ペニシリンアシラーゼ、フエニルア
ラニンアンモニアリアーゼおよびアスパルテートアンモ
ニアリアーゼのうちの１つの酵素を有することを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の組成物。【２｝ 上記
細砲にはグルコースオキシターゼ、ペニシリンアシラー
ゼ、フエニルアラニンアンモニアリアーゼおよびアスパ
ルテートアンモニアリアーゼのうちの１つの酵素を有す
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 非可動化微生物細胞からなる組成物であつて：該細
   胞は式▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＿１は水素、メチルまたはクロル；Ｗは▲数式
   、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ＿２はヒドロキシ、ハロ、アジド、２・３−
   エポキシプロポキシ、２・３−エピチオプロポキシ、Ｎ
   −（２・３−エポキシプロピル）アミノ、Ｎ−〔ｐ−（
   ジアゾニウムクロリド）フエニル〕アミノ、アクリロイ
   ルオキシ、低級アルコキシカルボニルオキシまたはベン
   ゼンスルホニルオキシ； Ｘは酸素またはＮＲ＿３（Ｒ
   ＿３は水素または炭素数１〜６のアルキル）； Ｙは炭
   素数２〜３のアルキレン； ｎは１ないし２の整数； Ｚは水素、ハロアセチル、２−（４・６−ジクロル）
   −ｓ−トリアジニル、ｐ−トルエンスルホニル、ｐ−（
   ハロメチル）ベンゾイルまたはシアノ； Ｘ′は酸素ま
   たはＮＲ＿３（ここでＲ＿３は上記定義のとおりである
   ）であるが、Ｚがｐ−トルエンスルホニルであるときＸ
   ′は酸素である〕のモノマーから誘導される水不溶性粒
   状ポリマーに共有結合されていることを特徴とする組成
   物。 ２ 微生物細胞を非可動化する方法であつて：該細胞を
   水性培地中で式▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＿１は水素、メチルまたはクロル；Ｗは▲数式
   、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ＿２はヒドロキシ、ハロ、アジド、２・３−
   エポキシプロポキシ、２・３−エピチオプロポキシ、Ｎ
   −（２・３−エポキシプロピル）アミノ、Ｎ−〔ｐ−（
   ジアゾニウムクロリド）フエニル〕アミノ、アクリロイ
   ルオキシ、低級アルコキシカルボニルオキシまたはベン
   ゼンスルホニルオキシ； Ｘは酸素またはＮＲ＿３（Ｒ
   ＿３は水素または炭素数１〜６のアルキル）； Ｙは炭
   素数２〜３のアルキレン； ｎは１ないし２の整数； Ｚは水素、ハロアセチル、２−（４・６−ジクロル）
   −ｓ−トリアジニル、ｐ−トルエンスルホニル、ｐ−（
   ハロメチル）ベンゾイルまたはシアノ； Ｘ′は酸素ま
   たはＮＲ＿３（ここでＲ＿３は上記定義のとおりである
   ）であるが、Ｚがｐ−トルエンスルホニルであるときは
   Ｘ′は酸素である）のモノマーあるいはその粒状付加重
   合体と接触させて上記モノマーまたは重合体のアミノ反
   応体基と共有結合を形成させ、モノマーが使用された場
   合は続いて該モノマーを交叉結合モノマーおよび重合開
   始剤の存在下に重合化させ、Ｒ＿２がヒドロキシである
   かまたはＺが水素である場合該モノマーまたはポリマー
   は上記細胞との反応の前にカルボン酸活性化試薬または
   式ハロゲン−Ｚ（Ｚは水素以外の上記定義のもの）の化
   合物との反応により活性化されることを特徴とする方法
   。