JPS5948079A

JPS5948079A - 固定化酵素及びその製造方法

Info

Publication number: JPS5948079A
Application number: JP15775982A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Kihara; 木原　康夫; Takashi Kawasaki; 隆志川崎; Toshio Higuchi; 俊男樋口; Yutaka Moroishi; 裕諸石
Original assignee: Nitto Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1982-09-10
Filing date: 1982-09-10
Publication date: 1984-03-19
Also published as: JPH0361421B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は固定化酵素及びその製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に／８
解させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しか
し、このような方法によれば反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。その・うえ
、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶性の担体
に酵素を固定化し、この固定化酵素に基質を反応させる
ことが提案されている。このよ・うな酵素の固定化方法
の代表的なものに、水不溶性の担体に酵素を共有結合、
イオン結合又は物理吸着によって結合さ−ける担体結合
法が知られている。

しかし、従来、この方法において用いられている担体は
、通當、セル１コース、デギストラン、アガロース等の
多糖類の誘導体、ポリアクリルアミｌケル、多孔性ガラ
ス等の径１鰭乃至除重の粒子であり、このような粒子に
酵素が固定化された固定化酵素は、通雷、カラノ、に充
填され、固定されて基質゛溶液と接触されるので、基質
が高分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応
に長時間を要すると共に、反応収率が低いという問題が
ある。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化＾ゲ素表面への基質の拡散が殆ど
問題にならない高活性の固定化酵素の製造方法を提供す
ることを特徴とする特に、本発明は、イオン交換性基又
は官能基を高密度に有する水分散性高分子重合体粒子に
酵素を高負荷量で固定化すると共に、酵素活性が長期に
わたって高く保持される固定化酵素、及びその製造方法
を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素は、第１のエチレン性単量体組
成物の重合体からなる５０〜９８重量％の重合体芯部と
、イオン交換性基又は官能基を有するエチレン性単量体
を含む第２の単量体組成物の重合体からなる２〜５０重
量％の重合体殻部とより構成される水分散性高分子重合
体粒子に、上記イオン交換性基又は官能基を介して酵素
が固定化されていることを特徴とし、かかる固定化酵素
は、本発明に従って、第１のエチレン性単量体組成物を
水媒体中で乳化共重合させて水分散性高分子重合体粒子
からなる重合体芯部を形成した後、水媒体中でこの重合
体芯部の存在下にイオン交換性基又は官能基を有するエ
チレン性単量体を含む第２の単量体組成物を乳化共重合
さ−Ｕて、」−記市合体芯邪の上に重合体殻部を有する
水分散性高分子重合体粒子を形成さ−Ｕ、次いで、この
重合体粒子に上記イオン交換性基又は官能基を介してｈ
ｙ素を固定化することにより製造される。

本発明においては、先ず、第１の中量体組成物を水媒体
中で乳化共重合させて水分散性高分子重合体粒子からな
る重合体芯部を形成する。ここにｊｑられる重合体芯部
は、酵素反応が行なわれろ温度、一般的には５〜９０°
Ｃの温度て熔融軟化しないことを要し、従って、得られ
る重合体粒子のカラス転移温度か少なくとも０°Ｃであ
るようにｔＰＪ体組成が選ばれ、々ｆましくは５℃以上
であるように選ばれる。従って、本発明においては、第
１の単量体組成として、スチレン、メチルスチレン、ビ
ニルトルエン、塩化ビニル、アクリル酸エステル、メタ
クリル酸エステル、特に炭素数ｉ〜４のアルキルエステ
ル、アクリロム１〜リル、ｌアクリロニトリル、酢酸ビ
ニル、プロピオン酸ビニル、ブクジエン、イソプレン、
アクリルアミド、メタクリルアミド等の１種又は２種以
上が用いられる。

尚、よく知られているように、ガラス転移点が０　’ｃ
以下の単独重合体を形成する単量体でも、他の単量体と
共に共重合させることにより、得られる共重合体のガラ
ス転移点を０°Ｃ以上とすることができ、従って、ガラ
ス転移点がＯ’ｃ以下の単独重合体を与えるアクリル酸
エチルやアクリル酸ブチル等を単量体成分として用いる
ことは何ら差支えない。例えば、アクリル酸エチルの単
独重合体のガラス転移点は一２２°Ｃであるが、単独重
合体のガラス転移点が１０５°Ｃであるメタクリル酸メ
チルとアクリル酸エチルを共重合することによって、通
常、ガラス転移点が約３０　”ｃである共重合体を得る
ことができる。

本発明においては、第１の単量体組成が１〜８０重量％
のアクリロニトリル及び／又はｌアクリロニトリルを含
有するのが好ましい。この単量体を存在させることによ
り、乳化剤を用いなくとも、重合の安定性が確保される
と共に、得られる水分散性高分子重合体粒子の分散性も
また、良好となるからである。

特に、本発明において々ルましい第１の小量体組成物は
、（ａｌアクリロニトリル及び／叉はメタクリロムトリ
ル１〜８０重量％、好ましくは５〜７５重量％、特に好
ましくは１０へ・６０千臣％、（１））多官能性内部架
橋用ｔＰ、ｉ体０−１ｏ重隈％、好ましくはＯ，１〜１
５重量％、特に好ましくは０．５〜ｌＯ重量％、及び（
Ｃ）アクリル酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキ
ルエステル及びスチレンから選ばれる少なくとも１種の
単票体２０〜９９重慴％、ＩＩＴましくは２５〜９５重
最％１、特に々Ｙまし７くは４０〜９０重量％からなる
。かかる中、竜体絹成物を用いることにより、乳化剤の
不存在［゛にも重合は非席に安定に行なわれ、望ましく
ない水溶性重合体等の副生を抑えることができるからで
ある。

尚、多官能性内部架橋用屯早体は後述するように、重合
の安定性を高めるのに役立ら、その具体例については、
後述する。

上記の第１の単量体組成物の乳化共重合は水媒体中で行
なわれ、重合開始剤としては、例えば、２．２゛−アゾ
ヒスイソブヂルアミジウム塩酸塩、２゜２゛−７ゾヒス
シアノハレリアン酸、過硫酸塩等が用いられる。このよ
うにして得られる水分散性高分子重合体粒子は、本発明
において担体として用いる水分散性高分子重合体粒子の
芯部を構成し、通常、平均粒径が０．０３〜１．５μの
範囲である。

本発明においては、乳化剤を用いないで乳化共重合体さ
セるのが好ましく、また、上記したように乳化剤なしで
共重合させることができる。得られる水分散性高分子重
合体粒子に乳化剤が混入していると、酵素の固定化の際
に酵素が失活することがあり、また、固定化された６ゲ
素が脱離しやすい等の有害な影響を及ぼす傾向があるか
らである。

しかし、乳化剤がかかる有害な影響を与えないときは、
乳化剤の存在下に乳化共重合を行なってもよいのは勿論
である。

次に、本発明においては、水媒体中で上で得た重合体芯
部をなす重合体粒子の存在下に、イオンエ１交換性基又は官能基を有する単票体を含む第２の巾量体
絹成を乳化共重合さ・Ｕ、−１−記第１の単量体組成物
からなる重合体芯部の−にに重合体殻部を形成させる。

この場合においても、乳化剤を用いないのが好ましいの
は前記と同し７である。尚、本発明においては、共重合
した後、化ゲ反応によって一４二記官能基に変換し得る
側鎖を有する単量体を単量体組成物の成分として用いる
場合も、官能基を有する単量体を共重合さモる場合に含
めることとする。

本゛発明において、イオン交換性基とは、これにより酵
素をイオン結合により固定化し得る有機基を意味し、ま
た、官能基とは、これを介して酵素を共有結合にて固定
化し得る有機基を意味し、従つζ、有機基によつ一ζは
イオン交換性基であると同時に官能基であることもある
。

ここに、イオン交換性基としてＬ；１、例えば、スルホ
ン酸基、カルボキシル基、リン酸基等の酸１（１基、第
３級アミノ基、第４級アミノ基等の塩基性基等を挙げる
ことができる。このようなイオン交２換性基を有する単量体の具体例としては、スチレンスル
ホン酸、スルホプロピルメタクリレートのようなスルボ
ン酸基を有する単量体、アクリル酸、メタクリル酸、イ
タコン酸のようにカルボキシル基ヲ有する単量体、アシ
ッドホスホキシエチルメタクリレート、３−クロロ−２
−アシッドホスホキシエチルメタクリレートのようなリ
ン酸基を有する単量体、ジメチルアミノエチルメタクリ
レート、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミドのよ
うな第３級アミノ基を有する単量体、メタクリルアミド
プロピルトリメチルアンモニウムクロライド、メタクリ
ロイルオキシェチルトリメヂルアンモニウＬりロライト
のような第４級アミノ基を有する単量体を挙げることが
できる。

また、官能基としては、カルボキシル基、第１級アミノ
基、ヒドラジド基、グリシジル基等を挙げることができ
る。かかる官能基を有する単票体の具体例として、例え
ば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸のようなカ
ルボキシル基を有する単量体、ヒドロキシエチルアクリ
レート、ヒト３０キシエチルメククリレ−１・のような水酸基を有する
単量体、グリシジルメタクリレートのようなグリシジル
基を有する単量体を挙りるこ吉ができまた、重合体芯部
をなす重合体粒子の存在下に水媒体中で、アクリルア１
）のような゛アミＩＸ基を有する単量体、及びアクリル
酸メチル、メタクリル酸メヂルのようなメチルエステル
基を有する単量体をそれぞれ含有する第２の単量体組成
物を乳化共重合し、上記重合体芯部の上にこれらを単塑
体組成として有する共重合体を重合体殻部として生成さ
せ、次いて、この共重合体中の一１記アミ１−基をホフ
マン分解し、また、メチルエステル基にヒ］・ラジンを
作用させることによって、官能基としてアミ１基やヒド
ラジド基を有する共重合体からなる重合体殻部を形成さ
せることができる。また、第２のＩＩ体組成物にアクリ
ル酸エステルのようなエステル基を有する１、Ｍ体を含
有さ・Ｖｌ、これを重合体芯部の存在下に共重合させ、
次いで、このエステル基を加水分解することにより、官
能４基としてカルボキシル基を有する共重合体からなる重合
体殻部を形成させることもできる。

第２の単量体組成において、イオン交換性基又は官能基
を有する単量体は水溶性であることが多く、従って、こ
れを単独で乳化重合させると、望ましくない水溶性重合
体が生じることがある。従って、本発明においては、第
２の単量体組成物として、」二記イオン交換性基又は官
能基を有する単量体１〜７０重量％と共に、アクリロニ
トリル及び／又はメククリロニトリル１〜８０重量％と
、多官能性内部架橋用単量体０〜２０重量％と、これら
と共重合性を有する単量体２０〜９８重量％を含有する
単量体組成物を乳化共重合させるのがよい。また、ここ
においても、形成される重合体殻部が酵素反応の行なわ
れる温度で熔融軟化しないことを要し、従って、形成さ
れる重合体殻部のガラス転移温度が少なくとも０℃、好
ましくは５℃以上であるように選ばれる。

上記共重合性単量体としては、前記したスチレン、メチ
ルスチレン、ビニルトルエン、塩化ビニ５ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、特に
炭素数１〜４のアルキルエステル、アクリレートリル、
メタクリレートリル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル
、ブクジエン、イソプレン、アクリルアミＩ・、メタク
リルアミ１等の１種又は２種″以上が好ましく用いられ
るが、特に、アクリル酸及びメタクリル酸の炭素数１〜
４のアルキルエステル及びスチレンが好ましく用いられ
る。

従って、特に本発明において灯ましい第２の中量体組成
物は、＋ａ＋イオン交換性基又は官能基を有する単量体
１〜７０重量％、好ましくは５〜６５重量％、特に々了
ましくは１０〜６０重量％、（ｂ）アクリロニトリル及
び／又はメタクリロニトリル１〜８０重量％、好ましく
は５〜７５重量９≦、特に好ましくは１０〜６０重量％
、（Ｃ１多官能性内部架橋用単量体０〜２０重量％、々
Ｙましくは０．１〜１５重量％、特に好ましくは０．５
〜ｌＯ重量％、及び（ｄｌアクリル酸エステル、メタク
リル酸エステル及びスチレンから選ばれる少なくとも１
種の１体２０〜９８重量％、好ましくは２５〜９５重量
６％、特に好ましくは４０〜８０重量％とからなる。

このような単量体組成物を乳化共重合させることにより
、イオン交換性基又は官能基を有する単量体からなる単
独重合体の生成が抑制されて、特に重合が安定に行なわ
れると共に、得られる水分散性高分子重合体粒子もまた
、分散安定性にすぐれ、更に、これに酵素を固定化した
とき、酵素の脱離も抑えられ、るからである。

上記の内部架橋用多官能性単量体としては、多価アルコ
ールのポリ　（メタ）アクリレートが好ましく、具体的
には、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコー
ルジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリ
レート、１，３−ブチレングリコールジメタクリレ−１
・、（・ジエチレングリコールジアクリレート、トリメ
チロールプロパントリメタクリレート、トリメヂロール
プロパントリアクリレート、テトラメチロールメタンテ
トラアクリレ−１・等が用いられる。ジビニルベンゼン
も好ましく用いられる。

７一般に、イオン交換性基や官能基を有する中量体は親水
性であるため、これを単独で乳化重合すると、重合が不
安定になると共に、望ましくない水溶性重合体等の副生
が多く、分散性の良好な重合体粒子を１ηることが困ｙ
＃である。

特に、水溶性重合体が生成すると、その−・部は水不溶
性高分子重合体粒子上に吸着されて残り、これを担体と
して酵素を固定化すると、この水溶性重合体にも酵素が
固定化される。このような水溶性重合体を含む担体に酵
素が固定化された固定化酵素によれば、酵素反応の際に
酵素が水溶性重合体と共に基質ン容液中に熔出して、酵
素活性の経時低下が著しいうえに、熔出した酵素か基質
や反応生成物と混在することとなるので、反応後乙こそ
の分離を要する等の種々の不都合を住じる。

しかしながら、本発明に従って、予め調製された重合体
芯部の存在下に、イオン交換性基又は官能基を有する中
量体と、アクリｒｌ二１−リル及び／又はメタクリレー
トリルと、好まり、　＜は多宮能性内部架橋用単量体と
を乳化共重合さ−Ｕるごとに、１；８リ、乳化剤の不存在下においても、重合の安定性が確保
されると共に、望ましくない水溶性重合体の生成が抑え
られて、これらの単量体組成物を重合体芯部の上に安定
に共重合させることができ、かくして、表面にイオン性
基又は官能基を高密度に有する水分散性高分子重合体粒
子を得ることができるのである。

このような結果が得られる理由は必ずしも明らかではな
いが、第２の単量体組成物の乳化共重合に際しては、既
に重合の場として第１の単量体組成物からなる重合体芯
部が与えられており、且つ、重合初期に生しるイオン性
基又は官能基を有する単量体を主成分とする水溶性の低
分子量の重合体にアクリロニトリル及び／又はメタクリ
ロニトリルと多官能性内部架橋用単量体とが有効に共重
合して水不溶化すると共に、芯部重合体粒子との親和性
がよくなって、その表面に円滑にグラフト化され、かく
して、重合が安定化するのであろう。

従って、本発明においては、第２の単量体組成物は、前
記したように、アクリロニトリル及び／又９はメタクリロニトリル、及び多官能性内部架橋用単量体
を含有するのが望ましいのである。

また、重合体芯部の−Ｌに上記のような第２の中塑体組
成物を乳化共重合さ−Ｕて、重合体殻部を形成すること
により、酵素の固定化に役立つイオン交換性基又は官能
基を水分散性高分子重合体粒子の表面に高密度で形成さ
せることができ、かくして、本発明によれば、酵素を高
負前量で固定化することができるのである。

更に、本発明においでは、以ヒのよ）にし７て得られる
水分散性高分子重合体粒子において、重合体応；部が５
０〜９８重量％であり、重合体殻部か２〜５０重量％と
なるように第１及び第２の単量体組成物を逐次的に乳化
共重合さ一已る必要がある。

酸部が重合体粒子において２重量％よりも少ないときは
、重合体殻部として重合体粒子がその表面に有する共重
合体のイオン交換性基又は官能基の量が少なくなり、固
定化し得る酵素の量が限られることとなって、高い酵素
活性を有する固定化酵素を得難くなるからである。一方
、５０重量％を０越えるときは、イオン交換性基及び官能基が親水性であ
るために、重合体芯部をなす水分散性高分子重合体粒子
の存在下に第２の単量体組成物を共重合を行なっても、
酸部を形成する以外に、第２の単量体組成物のみによる
水溶性重合体を生成し、前記したような不都合を注し、
更に、重合の安定性や重合体粒子の分散性も損なわれる
ことがあるからである。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、そ
の平均粒径が０．０５μ〜２μ、好ましくは０．１μ〜
１μである。粒径が小さすぎると、これを担体とする固
定化酵素を水中に分散させて酵素反応を行なわせた後の
回収が困難となり、一方、粒径が大きずぎると、単位体
積当りの粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化量が少
なくなると共に、水中に分散させるのが困雌となるので
好ましくない。

上記のような水分散性高分子重合体粒子の有するイオン
交換性基に酵素をイオン結合にて固定化し、又は官能基
にこれを介して酵素を固定化する１方法は特に制限されず、従来より知られている方法が適
宜に採用される。

例えば、イオン交換性基を有する水分散性高分子重合体
粒子に酵素をイオン結合にて固定化Ｊるには、酵素の失
活の起こらない温度１．Ｉ　１１等適宜の条件で重合体
粒子の分散液と酵素溶液とを混合すればよい。例えば、
反応時のｐｌ＋は酵素の等重点、イオン交換性基の種類
等に応して適宜に選ばれるが、一般的には５〜８が好ま
しい。この後、必要に応じて、遠心分離、膜分離等き適
宜の手段に°ζ未固定の酵素を除去すれば、本発明によ
る固定化酵素を得ることができる。

また、官能基を有する水分散性高分子重合体粒子に酵素
を固定化する方法も特に制御恨されず、ｉ尾来より一般
に知られている方法が適宜に採用される。かかる方法と
して、官能基の種類に１６して、例えば、ジアゾ法、カ
ルボジイミｌ法、臭化シアン法、アジド法等が挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。例えば、水酸
基をもつ水分散性高分子重合体粒子に酵素を共有結合に
て固足２化するには、水酸基をエビクロロヒドリンによりエポキ
シ化した後、このエポキシ基に酵素のアミノ基を反応さ
せ、アミＦ基を形成させることにより、酵素を重合体粒
子に結合させることができる。

このエポキシ化は従来知られている通常の条件の下に行
なわれ、例えば、水分散性高分子重合体粒子の有する水
酸基の１〜１０倍当量のエピクロロヒドリンを用い、ア
ルカリ水溶液中、室温で反応させる。このエポキシ基へ
の酵素の固定化も従来の普通の条件下に行なわれる。

また、カルボキシル基に酵素を固定化する一つの方法と
して、水溶性力ルホジイミトを用いて、酵素のアミノ基
と水分散性高分子重合体粒子表面のカルボキシル基とを
直接アミド結合を形成させることにより結合させること
ができる。水溶性カルボジイミドとしては、例えば、ｌ
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩、■−シクロヘキシルー３−（２−モル
ホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンス
ルホネート等を挙げることができる。この３ような水溶性カルポジ・（］を用いる酵素固定化は従来
知られている通常の条件のＦで行なわれ例えば、水分散
性高分子重べ体粒子の有するカルボキシル基の３〜５０
倍当尾のカルボシイｌの水溶液に酵素を混合し、温度を
５°Ｃ程度、ｐａ＋を４゜５〜６．０に保持して、−夜
反応さ−Ｕればよい。

また、本発明においては、酵素を重合体粒子の官能基を
介して共有結合にて固定化するに際シフ゛乙必要に応じ
て、重合体粒子にヘキ男メチレンシアミン、１デカメチ
レンジアミン、クリシルクリシルグリシン等のスペーサ
基を介して酵素を結合させ、固定化された酵素の重合体
粒７−１−での自由度を拡大することができる。

以上のようにして、酵素を重合体粒子に固定化させた後
、用いた反応試薬や固定化されていない酵素を遠心分１
ｉ１Ｌｌｉｉ分離等の適宜の手段によって除去すれば、
本発明の固定化酵素を得る。

本発明による固定化酵素は水分散液として用いられ、基
質と接触される。固定化酵素の使用量は、固定化酵素の
粒径や酵素の固定化量、必要とする４反応速度、基質濃度等により適宜に決定される。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素でもよ（
、菌体外ｈゲ素でもよい。また、酵素は必ずしも高度に
精製されている必要はなく、抽出液や部分精製品も用い
られる。更に、本発明に従って、単一の酵素を固定化し
てもよいが、複数の酵素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の酵素が用
いられる。具体例として、アミノ酸オキシダーゼ、カタ
ラーセ、キサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーセ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
タミン酸デヒドロヶデーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ
、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラギ
ン酸アセデルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミ
ントランスフェラーゼ、グリシンアミノトランスフェラ
ーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミノトランスフェ
ラーゼ、グルタミン酸−ピ５ルピン酸アミントランスフエラーセ、クレアチンホスホ
キナーセ、ヒスタミンメヂル［−ランスフエラー、ゼ、
ピルヒン酸キデーセ、プラク１−キナーセ、ヘキソキナ
ーゼ、δ−リジンアセチルトランスフェラーゼ、ロイシ
ンアミノベプヂダーセのような転移酵素、アスパラギン
酸セ、アセチルτ１リンエステラーゼ、アミノアシラー
セ、アミラーセ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンディミ
デーゼ、インへルクーゼ、ウレアーセ、ウリカーセ、ウ
ロキデーセ、エステラーセ、β−ガラク１シダー１２、
カリクレイン、キモ１リブシン、］−リブシン、ｉ・し
νンヒン、ナリンギデーゼ、ヌクレオチダーセ、パパイ
ン、ヒヤウロニターゼ、プラスミン、ベクヂデーセ、ヘ
スペリジデーセ、ペプシン、ペニソリデーセ、ペニシリ
ンアミターセ、ボスボリパーセ、ボスファターセ、ラク
ターセ、リバーセ、リボヌクレアーゼ、レンニンのよう
な加水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、
アスパルターゼ、クエン酸すアーセ、グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ、ヒスヂジンアンモニアリアーセ、フ工
６ニルアラニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フマー
ル酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテターゼのようなリア
ーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、
グルコースホスフェートイソメラーゼ、グルタミン酸ラ
セマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼのよ
うな異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタチオ
ンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼのようなりガーゼ
等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上のように、水不溶性の担
体としての水分散性高分子重合体粒子が、重合体芯部の
上に高密度にイオン交換性基又は官能基を有する重合体
殻部が形成されている。従って、従来のセルロース誘導
体粒子等を担体とする場合と異なり、酵素が高負荷量に
て固定化されると共に、固定化酵素自体が遊離の酵素と
同様に反応系内を自由に移動できるため、基質の拡散が
反応に殆ど影響を与えず、従って、高分子量の基質の場
合にも遊離の酵素と同様の高い反応速度で酵素反応を行
なわせることができる。

７しかも、本発明による固定化酵素は水不溶性の担体に固
定化されているため、酵素反応後には遠心分離、塩析、
凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によ
って容易に回収でき、かくして、長期間にわたって高い
酵素活性を保持させつつ、繰返して使用することができ
る。

また、本発明の固定化酵素をその製造面からめれば、一
般にイオン交換性基又は官能基を有する単量体を含む単
量体組成物を乳化共重合さゼて、表面に高密度にこれら
イオン交換性基や官能基を有する水分散性高分子重合体
粒子を生成させることは困難であるが、本発明によれＣ
ｔ：、、　Ｔ−め重合体芯部を形成しておき、この」二
にイオン交換性基又は官能基を有する単量体を含む単量
体組成物を乳化共重合さ・ｌるので、安定な共重合によ
って重合体粒子を得ることができ、月つ、得られる水分
散性高分子重合体粒子は第２の単量体組成物のめを乳化
共重合させる場合と異なって、表面に高密度でこれらイ
オン交換性基又は官能基を有することとなり、この結果
、本発明の方法により得られる８水分散性高分子重合体粒子には高負荷量にて酵素を固定
化することができるのである。

以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例により限定されるものではない。

実施例１メタクリル酸メチル８０ｇ及びアクリロニトリル１５ｇ
を蒸留水４２１ｇに加え、２，２゛−アゾヒス−２−ア
ミジノプロパンニ塩酸塩０．３ｇを水１０ｇに熔解した
重合開始、削氷溶液を６０℃の温度で窒素気流下に加え
、１２０　ｒｐｍで攪拌しつつ４時間重合させて、重合
体芯部としての水分散性高分子重合体粒子を得た。次い
で、これに上記と同じ重合開始剤０．０３　ｇを水１０
ｍ１に熔解した重合開始剤水溶液を加え、更に、メタク
リル酸メチル５．５ｇ、アクリロニトリル５ｇ、メタク
リル酸３ｇ及びトリエチレングリコールジメタクリレー
ト０．５ｇの混合物を１時間要して添加し、３時間反応
させて、上記芯部の上に官能基としてカルボキシル基を
有する重合体殻部を形成させた。このようにして得た重
合体粒子の水分散液は、固形分２９０％、重合体粒子の平均粒径は０．４５　／７であった
。

平均粒径０．４５μの重合体粒子の水分散液を得た。

重合は非當に安定に行なわれて、凝集物は０．０８％で
あった。

この分散液を遠心分離し、上澄中のカルボキシル基につ
いて定量したところ、仕込ｂＷ’ｔの０．９％のカルボ
キシル基しか定量されず、水溶性重合の生成は僅かであ
った。

次に、上記重合体粒子を固形分２０重量％になるように
蒸留水に分散さゼて分散液５０和１を得、■−シク１コ
ヘキシルー３−（２＝Ｔ−ルホリノエヂル）カルボジイ
ミ（゛−メｔ−−ｐ　−トルエンスルホネー）　２．５
　ｇを水３０ｍ１に熔解した水溶液を」１記分散液に加
え、ｐｌ＋を塩酸で６．５に調整した。この後、α−ア
ミラーゼ５００■を水１０ｍ１に１ｇ解させた酵素水溶
液を加え、５℃でｐｌ＋を６．５に調整しつつ、２４時
１４放置して反応さ・Ｕ、α−アミラーゼを共有結合に
て重合体粒子６、二固定化した。次いで、遠心分離し、
沈降した重合体粒子を塩化す１〜リウム、酢酸ナトリウ
ム及び酢酸カルシラノ・をそ０れぞれ０．　Ｉ　Ｍ、０．０２Ｍ及び０．００１Ｍとな
るように溶解したｐｌ＋７．０の緩衝液中に再分散させ
、かくして、本発明による固定化α−アミラーゼを（ｑ
た。

この固定化酵素において、α−アミラーゼの固定化量は
重合体粒子１ｇ当り４０ｔｒｗであり、また、活性収率
ば４５％であった。

尚、活性収率とは、固定化された酵素の活性の理論量に
対する実際の活性の割合として定義される。ここでは、
１％デンプン水溶液を基質として固定化酵素を３５°Ｃ
で１０分間反応させ、ヨウ素デンプン反応からデンプン
の分解量を求めることにより、固定化酵素の活性、即ち
、デンプン分解速度（■／分）を得、これと等しい活性
を有する遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。

参考例本参考例は、実施例１と同様にして単量体組成物を段階
的に共重合させた場合において、第１及び第２の単量体
組成を種々に変化させて共重合したときの凝集物及び重
合後の分散液の上澄中の力１ルボキシル基量を示す。結果を表に示す。

また、実験番号４の単量体組成を一括して共重合させた
とき、凝集物は７．３％、カルボキシル基量は６％であ
って、分散液中の重合体粒子はその１ｇ当りカルボキシ
ル基をｏ、　ｏ　８ミリモル有していた。しかし、段階
的に共重合した場合の重合体粒子はその１ｇ当りカルボ
キシル基を０．３５　ミリモル有していた。

実施例２実施例１で得たカルボキシル基を有する重合体粒子をｐ
１１７．０のリン酸塩緩衝ｉ’ｌｋ５０ｍｌ中に固形分
２０重量％となるように分散させ、α−キ′Ｆ：１す７
’シフ５０ｍｇをにと１司しに’ｉｉ　ｆ畢ｉ　ｌｐｉ
、ニｌ’ＲＭ！　サセｌコｆ’ｌ　％水溶液を上記重合
体粒子分散液に加え、５℃で２４時間放置した後−１遠
心分！ｉ１１した。沈降した重合体粒子を緩衝液にて洗
滌して未固定のα−キＴ−ｌ−リプシンを除去し、再び
緩衝液に分散さ一已て、本発明による共有結合固定化α
−キ′Ｆ：ｌリプシンを得た。

この固定化酵素のα−キモトリプシンの固定化２量は、重合体粒子１ｇ当り４．０■であり、活性収率は
９０％であった。ここに、活性収率は、０．０５ｍＭの
Ｎ−アセデル−し−チロシンエチルエステルを基質とし
て３０°Ｃで固定化酵素を反応さセ、アルカリ滴定によ
りカルボキシル基の生成速度（μモル／分）から求めた
。

実施例３実施例１と同し重合体芯を実施例１と同様にして形成し
た後、これを含む水分散液に第２の単量体組成として、
ジメヂルアミノエヂルメククリレー１ト４ｇ、アクリロ
ニトリル４ｇ、アクリル酸エチル５．５ｇ及びトリエチ
レングリコールジメククリレー）　０．５　ｇを添加し
た以外は、実施例１と全く同様にして重合体殻部を形成
させ、固形分２０％、平均粒径０．３μの重合体粒子の
水分散液を得た。

遠心分離により沈降した重合体粒子を０．１　Ｍ　＋、
１ン酸塩緩衝液（ｐＨ７、０）　　１００　ｍｌに固形
分１０重量％となるように分散させ、これにウレアーゼ
５００ｍｇを加え、５°Ｃで２４時間攪拌して、ウレア
４ −ゼをイオン結合にて重合体粒子に固定化した。

この後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を」二と同じ
緩衝液で洗蒔して、未固定のウレアーゼを除去し、再び
同じ緩衝液に分散させて、本発明による固定化ウレアー
セを得た。

この固定化酵素におりるウレアーセの固定化量は、重合
体粒子１ｇ当り４５呵であり、活性収率は９５％であっ
た。活性収率は、０．０３　Ｍの尿素水溶液を基質とし
、３５°Ｃで１０分間固定化酵素を反応させ、生成した
アンモニア量＜１１モル／分）を塩酸滴定で求めて活性
を測定し、これと等しい活性を有する′ＭＩｉｉｌｔの
酵素量を酵素固定化量−ζ除して求めた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１のエチレン性単量体組成物の重合体からなる
５０〜９８重量％の重合体芯部と、イオン交換性基又は
官能基を有するエチレン性単量体を含む第２の単量体組
成物の重合体からなる２〜５０重量％の重合体殻部とよ
り構成される水分散性高分子重合体粒子に、上記イオン
交換性基又は官能基を介して酵素が固定化されているこ
とを特徴とする固定化酵素。
（２）第１の単量体組成物が（ａｌアクリロニトリル及
び／又はメククリロニトリル１〜８０重量％、（ｂｌ多
官能性内部架橋用ｔＲ量体０〜２０重量％、及び（Ｃ）
アクリル酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキルエ
ステル及びスチレンから選ばれる少なくとも１種の単量
体２０〜９９重量％とからなることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の固定化酵素。
（３）第２の単量体組成物が＋８１イオン交換性基又は
官能基を有する単殴体１〜７０重量％、（ｈｌアクリロ
ニトリル及び／又はメタクリｒ：Ｉニトリル１〜８０重
量％、（Ｃ１多官能性内部架橋用単量体０へ・２０重量
％、及び＋ｄ）アクリル酸アルキルエステル、メタクリ
ル酸アルキルエステル及びスチレンから選ばれる少なく
とも１種のＲ量体２０〜９９重量％止からなることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。
（４）第２のエチレン性単量体組成物におりる官能基が
第１級アミノ基、水ＷＪ、基、グリシジル基及びカルボ
キシル基から選ばれる少なくとも１種であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。
（５）第２のエチレン性単量体組成物におりるイオン交
換性基がカルボキシル基、スルポン酸基及びリン酸から
選ばれる少なくともＩ挿の酸性基であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。
（６）第２のエチレン性単量体組成物におりる・イオン
性基が第３級アミノ基及び第４級アミノ基、リン酸から
選ばれる少なくとも１種の塩基性基であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。
（７）水分散性高分子重合体粒子が０．０５〜２μの平
均粒１￥を有することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の固定化酵素。
（８）第１のエチレン性単量体組成物を水媒体中で乳化
共重合させて水分散性高分子重合体粒子からなる重合体
芯部を形成した後、水媒体中でこの重合体芯部の存在下
にイオン交換性基又は官能基を有するエチレン性単量体
を含む第２の単量体組成物を乳化共重合させて、上記重
合体芯部の上に重合体殻部を有する水分散性高分子重合
体粒子を形成させ、次いで、この重合体粒子に上記イオ
ン交換性基又は官能基を介して酵素を固定化することを
特徴とする固定化酵素の製造方法。
（９）第１の単量体組成物が（ａ）アクリロニトリル及
び／又はメタクリコニトリル１〜８０重量％、（ｂ）多
官能性内部架橋用単量体０〜２０重量％、及びｆｃ）ア
クリル酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキルエス
テル及びスチレンから選ばれる少なくとも１種の単量体
２０〜９９重量％とからなることを特徴とする特許請求
の範囲第８項記載の固定化酵素の製造方法。
（１０）第２の単量体組成物が（ａ）イオン交換性基又
は官能基を有する単量体１〜７０重量％、ｆｂｌアクリ
ロニトリル及び／又はメタクリロムトリル１〜８０重景
％、ｆｃｌ多官多官能性内部架橋量中量体０〜２０重量
％び（ｄｌアクリル酸アルキルエステル、メタクリル酸
アルキルエステル及びスチし／ンから選ばれる少なくと
も１種の単量体２０へ・９８重量％とからなることを特
徴とする特許請求の範囲第８項記載の固定化酵素の製造
方法。
（１１）第２のエチレン性単量体組成物にお番３る官能
基が第１級アミノ基、水酸基、クリシジル基及びカルボ
キシル基から選ばれる少なくとも１種であることを特徴
とする特許請求の範囲第８項記載の固定化酵素の製造方
法。
（１２）第２のエチレン性単量体組成物におけるイオン
交換性基がカルボキシル基、スルホン酸基及びリン酸か
ら選ばれる少なくとも１種の酸性基であることを特徴と
する特許請求の範囲第８項記載の固定化酵素の製造方法
。
（１３）第２のエチレン性単量体組成物におけるイオン
性基が第３級アミノ基及び第４級アミノ基、リン酸から
選ばれる少なくとも１種の塩基性基であることを特徴と
する特許請求の範囲第８項記載の固定化酵素の製造方法
。（Ｉ４）水分散性高分子重合体粒子が０．０５〜２μの
平均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第８
項記載の固定化酵素の製造方法。