JPS58149682A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も行なわれているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、水溶液中で反応を行なわせている。しかし、こ
のような方法によれば、反応条件を一定に維持しつつ、
新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失活さ
せることな（、生成物と酵素を分離することが非常に困
難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、反応
が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するため、既に種々の方法にて酵
素を担体に固定化し、この固定化酵素に基質を反応させ
ることが提案されている。このような酵素の固定化方法
の一つとして、水不溶性の担体く酵素を共有結合、イオ
ン結合又は物理吸着にて結合させる担体結合法が知られ
ている。しかし、従来、この方法Ｋｍいて用いられてい
る担体は、通常、セルロース、デキストラン、アガロー
ス等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔
性ガラス等の径１−乃至散開の粒子であり、このような
粒子に酵素が固定化された固定化酵素は通常、カラムに
充填され、固定きれて、基質溶液と接触されるので、基
質が高分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反
応に長時間を要すると共に反応収率が低いという問題が
ある。

本発明は上記した間層を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散が殆ど問
題Ｋｔらない高活性の固定化酵素を提供することを目的
とする。

本発明による固定化酵素は、（５Ｉ）水酸基を有するラ
ジカル重合性単量体０．２〜１０１１量襲、（ロ）この
単量体と共重合し得る第一のラジカル重合性単量体ｌＯ
〜９５重家計、（Ｃ）多官能性内部集積用単量体１〜２
０重量％、及び（ｄ）第二のラジカル共重合性単量体と
してのアクリロニトリル又はメタクリロ二トリル１〜６
０１ｆｉ量２を乳化共重合させて得られる水分散型高分
子重合体粒子に酵素か共有結合によって固定化されてい
ることを特徴とする。

本発明において用いる水酸基を有する単量体は好ましく
は一般式 ％式％） （但し、Ｒ１は水素又はメチル基、Ｒ１は一０ＨＩ−、
イ［、ＯＨ，０−１−０Ｈｓ　ＯＨ（ＯＨｓ）０−又は
−ＯＨ（ＯＨｓ　）ＯＨｓＯ−を示し、ｎは１〜１０、
好ましくは１〜６の整数を示す、） で表わされ、好ましい具体例として２−ヒドロキシエチ
ルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート
、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキ
シエチルメタクリレート等を挙げることかできる。

上記のような水酸基を有する単量体と共重合される第一
のラジカル重合性単量体は、後述する第二のラジカル重
合性単量体であるアクリロニトリル及びメタクリロニト
リルを除いて、水酸基を有する単量体とラジカル臭重合
性を有する限りは特に制限されないか、好ましくはエチ
レン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオ
ン酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステ
ル、スチレン、メチルスチレン、ビニルトルエン、ブタ
ジェン、インプレン、アクリルアミド、メタクリルアミ
ド等の一種又は二種以上が用いられる。

特に、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル又は
スチレンが好ましく用いられる。これらの共重合性単量
体は、得られる共重合体が酵素反応の行なわれる温度よ
り高いガラス転移点を有するように選ばれる。

また、多官能性内部架橋用ラジカル重合性単量体として
は多価アルコールのポリ（メタノアクリレートが好まし
く、具体的にはエチレングリコールジメタクリレート、
トリエチレングリコールジメタクリレート、ジプロピレ
ングリコールジメタクリレー）、１．３−ブチレングリ
コールジメタクリレート、トリエチレングリコールジア
クリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレー
ト、トリメチロールプロパントリアクリレ、−ト、テト
ラメチロールメタンテトラアクリレート等が用いられる
。ジビニルベンゼンも用いられる。

更に、本発明においては、水分散型高分子重合体粒子は
、前記したように、第二の共重合性単量体成分としてア
クリロニトリル、及び／又はメタクリロニトリルを含有
することか必須である。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は上記
各単量体を水媒体中にて通常の方法で乳化共重合させる
ことにより得ることができるが、得られる重合体粒子中
に乳化剤が混在すると、酵素が失活する等の有害な影響
があられれることかあるので、乳化重合に際しては乳化
剤を用いないのが好ましい。本発明にあける単量体組成
によれば、特に乳化剤を要せずして安定に乳化共重合さ
せることかできるからである。但し、乳化剤が酵素に対
して有害な影響を与えなければ乳化剤を必要に応じて用
いてもよい。

本発明において乳化共重合させる単量体組成は、水酸基
を有する単量体０．２〜１０重量％、好ましくは０．５
〜８重量襲家計一の単量体１０〜９５０〜９５重量％く
は２０〜９００〜９０重量％橋剤１〜２０１１１％、好
ましくは２〜１０重量％、及びアクリロニトリル又はメ
タクリロニトリル１〜６０重家計、好ましくは５〜４０
重量％である。

水酸基を有する単量体の量は、得られる共重合体粒子へ
の酵素の固定化量とも関連し、少なすぎるときは酵素を
十分な量にて固定化することができず、一方、多すぎる
ときは、得られる重合体粒子に酵素を固定化する際に酵
素の失活か起こりやすくなる０で好ましくない。

次に、一般に、水酸基を有する単量体とこれに共重合性
を有する単量体とを乳化共重合すると、前者の単量体の
親水性が高いために水媒体相中に遊離の水溶性重合体か
生じることか多い。このような水溶性重合体が生じると
、一部は水不溶性の高分子重合体粒子の表面に吸着され
て残り、これを担体として酵素を固定化すると、この水
溶性重合体にも酵素が固定化される。このように水溶性
重合体を含む担体に酵素が固定化された固定化酵素は、
酵素反応の際に水不溶性の水分、散型高分子重合体粒子
から溶出し、固定化酵素自体の活性の経時低下が著しい
うえに、基質や反応生成物と混合するので、反応後にそ
の分離を要する等の種々の不都合が生じる。

しかしながら、本発明に従って、水酸基を有する単量体
と内部架橋用単量体とアクリロニトリル及び／又はメタ
クリロニトリルとを乳化共重合させることにより、重合
の安定性・か確保されると共に、望ましくない水溶性重
合体の生成が抑止される。このような結果が得られる理
由は明確ではないか、重合初期に生じる水酸基を存する
単量体を主成分とする水溶性低分子量重合体にアクリロ
ニトリル又はメタクリロニトリルと内部架橋用単量体が
有効に共重合して水不溶化す−と共に、重合が安定化す
るのであろう。従って、アクリロニトリル又はメタクリ
ロニトツルの量が上記範囲より少なすぎるとき、又は多
すぎるとぎは、重合の安定性が損なわれる。また−内部
架橋用単量体か少なすぎるときは水溶性重合体の一副生
□か多くなり、一方、多すぎるときは重合が安定性に欠
けるようになる。

本発明において水分散型高分子重合体粒子の平均粒径は
０．０３〜２ｐ、好ましくは０．０７〜１μである。粒
径が小さすぎると、固定化酵素を水中に分散させて酵素
反応を行なわせた後の回収が困難となり、一方、粒径か
大きすぎ今と、単位体積当りの粒子表面積か小さくなり
、酵素の固定化量か少なくなると共に１水中に分散させ
るのが困難となるので好ましくない。

水酸基を有する水分散型高分子重合体粒子に酵素を共有
結合により固定化するには、特に制限されることなく、
従来より知られている任意の方法によることかできる。

例えば、一つの方法として、重合体粒子の有する水酸基
をエピクロロヒドリンによりエポキシ化した後、このエ
ポキシ基に酵素のアミノ基を反応させてアミド基を形成
させることにより、酵素を重合体粒子に結合させること
ができる。このエポキシ化は従来知られている通常の条
件の下で行なわれ、例えば水分散金高分子重合体粒子の
有する水酸基の１〜１０倍当量のエビクロロヒドリンを
用い、アルカリ水溶液中、室温で反応させる。このエポ
キシ基への酵素の固定化も従来の普通の条件下に行なわ
れる。

第二の方法として、高分子重合体粒子の有する水酸基に
ハロゲン化トリアジンを反応させて、水酸基をハロゲン
化し、このハロゲン基に酵素のアミノ基を反応させ、共
有結合を形成させることかできる。ハロゲン化トリアジ
ンとしてはカルボキシメチルアミノトリアジン、カルボ
キシメチルトリアジン、シアヌルクロライド等が用いら
れ、重合体粒子の有する水酸基の１〜１０倍当量のこれ
らのハロゲン化トリアジンを用い、アルカリ水溶液中、
０℃乃至４０℃程度の温度で重合体粒子の水酸基をハロ
ゲン筐換した後、中性で４０″ｃ１！！１度の温度で酵
素と反応させる。

また、第三の方法として、重合体粒子の有する水酸基を
シランカップリング剤により活性化し、これに酵素を反
応させて固定化することもできる。

シランカフプリング剤は好ましくは一般式％式％ ） し、ｍ、ｐ％ｑ及びｒはそれぞれｏＮｌｏの整数を示す
。Ｊを示し、Ｘはアルコキシ基を示す。）で表わされ、
好ましい具体例として、３−アミノプロピルトリメトキ
シシラン、γ−（２−アミノエチルンーアミノプロビル
トリメトキシシラン、ｒ−クロロプロピルトリメトキシ
シラン、ｒ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシ
ラン、インシアネートプロピルトリエトキシシラン、ｐ
−アミノフェニルトリメトキシシラン等が挙げられるが
、特に３−アミノプロピルトリメトキシシランか好まし
く用いられる。この方法により酵素を固定化するには、
通常、重合体粒子の有する水酸基の１−１０倍当量のシ
ランカフプリング剤を室温で一日反応させると共に、酵
素をそのアミノ基と反応し得る水溶性カルボジイミド等
、の試薬により活性化し、上記活性化された重合体粒子
に反応させ、固定化する。

以上のようにして酵素を重合体粒子に共有結合させた後
、用いた反応試薬や固定化されていない酵素を遠心分離
、膜分離等によって除去すれば、本発明の固定化酵素か
得られる。

本発明の固定化酵素は分散液として用いられ、基質と接
触される。固定化酵素の使用量は、固定化酵素の粒径や
酵素の固定化量、必要とする反応速度、基質濃度等によ
り適宜に決定される。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素でよく、
菌体外酵素でもよい。また、酵素は必らずしも高度に精
製されている必要はなく、抽出液や部分精製品も用いら
れる。更に、本発明に従って単一の酵素を固定化しても
よいか、複数の酵素を固定化してもよい、酵素の具体例
としては、アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、牛サン
チンオキシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ、チトクロム０オキシダーゼ、チロシナー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、６−ホ
スホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼのような酸化還元酵素、アスパラギン酸アセチル
トランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフ
ェラーゼ、グリシンアミノトランスフェラーゼ、グルタ
ミン酸−オキザロ酢酸アミノトランスフェラーゼ、グル
タミン酸−ビルピン酸アミノトランスフェラーゼ、クレ
アチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトランスフェ
ラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキナーゼ、ヘキ
ソキナーゼ％　−一リジンアセチルトランスフェラーゼ
、ロイシンアミノペプチダーゼのような転移酵素、アス
パラギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミノア
シラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニン
ディミナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、トロ
ンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダーゼ、パパイン
、ヒャウロニダ、−ゼ、フラスミン、ペクチナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、ペプシン、ペクチナーゼ、ペニシリンア
ミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクター
ゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加
水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、アス
パルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカルポ
牛シラーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、フェニル
アラニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フマール酸
ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ
、アスパラギナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコ
ースホス７エートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマー
ゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼのような異
性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタチオンシン
ターゼ、ピルビン酸シンターゼのようなりガーゼ等を挙
げることができる。

本発明による固定化酵素は、以上のように、水酸基を有
する水分散型高分子重合体粒子に酵素が共有結合にて固
定化されており、従来のセルロース誘導体担体粒子等の
場合と興なり、固定化酵素自体が遊離の酵素と同様に反
応系内を自由に移動できるため、基質の拡散が反応に殆
ど影響を与えず、従って、高分子量の基質の場合にも遊
離の酵素と同様の高い反応速度で酵素反応を行なわせる
ことかできる。しかも、酵素は担体に固定化され、てい
るため、酵素反応後には遠心分離、塩析、凝集剤を用い
る凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によって容易に回
収でき、長期間にわたって繰返して使用することができ
る。

更に、本発明に右いて用いる担体としての水分散性高分
子重合体粒子は、その製造面からみれば、乳化剤を用い
ることなく、且つ、望ましくない水溶性重合体の生成な
（、安定に乳化共重合にて得ることができる。また、ア
クリロニトリル又はメタクリレートリルと内部架橋用単
量体を併用することにより、得られる水分散型高分子重
合体粒子は強度が大きいと共に、粒子相互の粘着も起ら
ない。

実施例１ ２−ヒドロキシエチルアクリレ−）、３ｙ　、メチルメ
タクリレート８０ｇ、　　トリエチレングリコールジメ
タクリレート２ｆ　及びアクリロニトリル１５ｙを蒸留
水２３０１／に加え、過硫酸カリウム０．３１　を水１
０．に溶解した重合開始剤水溶液を７０°Ｃの温度で窒
素気流下に加え、１２０Ｔ−で攪拌しつつ８時間重合さ
せて、固形分３０％、平均粒径０．３０μの重合体粒子
の水分散液を得た。重合は非常に安定に行なわれて、凝
集物は０，０２％であった。

この重合体粒子の水分散液１０　ｄに５Ｎ力性ソーダ水
溶液２ｄとエピクロロヒドリン１ｍを加え、室温で１時
間反応させた後、水洗した。こうして得たエポキシ基を
有する重合体粒子をリン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ７
，０）　Ｋ再分散させ、ａ−アミラーゼの同じ緩衝液溶
液を加え、４℃の温度で１７時間反応させて、α−７文
ラーゼを重合体粒子に固定化した。

この後、遠心分離によって沈降した重合体粒子を緩衝液
で洗滌し、未固定のα−アミラーゼを除去した後、再び
緩衝液中に分散させて、本発明による固定化α−アミラ
ーゼを得た。

この固定化酵素のα−アミラーゼ固定化量は、重合体粒
子１ｆ当り２０ｓ９であり、また、活性収率は５０％で
あった。

尚、活性収率とは固定化された酵素の活性の理論量に対
する実際の活性の割合を意味する。ここでは、１％デン
プン水溶液を基質として固定化酵素を３５℃で１０分間
反応させ、ヨウ素デンプン反応からデンプンの分解量を
求めることにより、固定化酵素の活性、デンプン分解速
度（”９／分ンを得、これと等しい活性を有する遊離の
酵素量を酵素固定化量で除して求めた。

このようにして反応後の固定化酵素を遠心分離し、再度
、同様にして基質と反応させたところ、最初の反応とほ
ぼ同様の活性を示した。

比較例１ ２−ヒドロキシエチルアクリレート３１　、メチルメタ
クリレート８２ｆ及びアクリロニトリル１５ｙを実施例
１と同様にして乳化共重合させ、固形分２９％、平均粒
径０．３０μの重合体粒子の水分散液を得た。凝集物は
１％であった。この重合体粒子分散液に実施例１と同様
にしてα−アミラーゼを固定化したところ、その活性収
率は４５％であった。

反応後の固定化酵素を遠心分離により回収し、再び基質
と反応させたところ、その活性は最初のほぼ７０％に低
下していた。

比較例２ ２−ヒドロキシエチルアクリレート３ｆ１メチルメタク
リレート９５２及びトリエチレングリコールジメタクリ
レート２ｆを実施例１と同様に乳化共重合させ、固形分
２８％、平均粒径０．３２μの爾合体粒子の水分散液を
得た。重合は不安定であって、凝集物は６％であった。

実施例２ 実施例１で得られた重合体粒子分散液１０−に５Ｎ力性
ソーダ２ｙｄとシアヌルクロライドの３％アセトン溶液
１０−を加え、室温で１時間反応させた後、アセトン水
溶液で洗滌した。こうして得た活性化重合体粒子とウレ
アーゼ２００１１１９をリン酸緩衝液（０，１Ｍ％ｐＨ
７，０７中、４０℃で１７時間反応させ、ウレアーゼを
重合体粒子に固定化した。

反応後、遠心分離して沈降した重合体粒子を緩衝液で沙
臀し、緩衝液に再分散させて本発明による固定化ウレア
ーゼを得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合体粒子ｌ
、当り２５　”９であり、活性収率は６０％であった。

活性収率は、０．０３Ｍの尿素水溶液を基質とし、３５
℃で１０分間固定化酵素を反応させ。

生成したアンモニア量（μモル／分）を塩酸滴定で求め
て活性を測定し、これと等しい活性を有する遊離の酵素
量を酵素固定化量で除して求めた。

実施例３ 実施例１で得られた重合体粒子水分散液１０　ｄを遠心
分離し、沈降した重合体粒子をジオ牛す７１０ｍに分散
させた。これに３−アミノプロピルトリエトキシシラン
１ｄを加え、室温で一日反応させた後、メタノール水溶
液、次に蒸留水で洗滌した。次に、この重合体粒子を蒸
留水１０　ｄに分散させ、これに１−シクロヘキシル−
３−（２−モルホリノエチルλカルボジイミド−、メト
−ｐ　−トルエンスルホン酸２１とα−アミラーゼ０．
２５ｇとを加え、ｐＨを５．５に保持しなから、５℃の
温度で２４時間反応させた。遠心分離して沈降した重合
体粒子を緩衝液で洗滌し、未固定のα−アミラーゼやカ
ルボジイミドを除去して、本発明の固定化ｄ−アミラー
ゼを得た。実施例１と同様にして求めた固定化酵素の活
性収率は５０　％であった。

実施例４ ポリプロピレングリコールモノメタクリレート５ｆ、メ
チルメタクリレート７８ｙ、　　トリエチレングリコー
ルジメタクリレー）　２ｇ及びアクリロニトリル１５ｙ
を蒸留水Ｌ３０１１に加え、過硫酸カリウム０．３　　
を水１０ｙに溶解した重合開始剤水溶液を７０℃の温度
で窒素気流下に加え、１２０ｒｐｍで攪拌しつつ８時間
重合させて、固形分３０％、平均粒径０．３０声の重合
体粒子の水分散液を得た。重合は非常に安定に行なわれ
た。

この重合体粒子の水分散液ＩＱｓｌに５Ｎ力性ソ一ダ水
溶液２ｍｌとエビクロロヒドリン１−を加え、室温で１
時間反応させた後、水洗した。こうして得たエポキシ基
を有する重合体粒子をリン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ
７，０）に再分散させ、−一アミラーゼの同じ緩衝液溶
液を加え、４℃の温度で１７時間反応させて、−一ア文
ラーゼを重合体粒子に固定化した。

この後、遠心分離によって沈降した重合体粒子を緩衝液
で洗滌し、未固定のα−アミラーゼを除去した後、再び
緩衝液中に分散させて、本発明による固定化α−アミラ
ーゼを得た。この固定化酵素のα−アミラーゼ固定化量
は重合体粒子１ｆ当りＩｓ　ｌ”９であり、実施例１と
同様にして求めた活性収率は４３％であった。

特許出願人　　　日東電気工業株式会社−代理人　弁理
士牧野逸部

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１）　　（ａ）水酸基を有するラジカル重合性単量体
   ０．２〜１０首置％装（ｂ）この単量体と共重合し得る
   第一のラジカル重合性重量体ｌＯ〜９５重家計、（Ｃ）
   多官能性内部架橋用単量体１〜２０重量襲、家計（ｄ）
   第二のラジカル共重合性単量体としてのアクリロニトリ
   ル又はメタクリロニトリル１〜６０重量％を乳化共重合
   させて得られる水分散型高分子重合体粒子に酵素か共有
   結合によって同定化されていることを特徴とする固定化
   酵素。 （２）水酸基を有する単量体か一般式 ％式％） （但し、Ｒ１は水素又はメチル基、Ｒ１は一０Ｈｓ−１
   −０Ｈｓ　ＯＨｓ　０−１−０ＨｓＯＨ（ＯＨｓ　）０
   −　又は−ＯＨ（ＯＨｓ　Ｊ　ＯＨｓ　Ｏ−を示し、ｎ
   は１〜ｌＯの整数を示す。］ で表わされること船特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の固定化酵素。 （３）水分散型高分子重合体粒子か０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の固定化酵素。 （４）第一の単量体がアクリル酸エステル、メタクリル
   酸エステル又はスチレンであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の固定化酵素。 （５）多官能性内部架橋用単険体か多価アルコールのポ
   リアクリレート又はポリメタクリレートであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。