JPS6153036B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化酵素の製造方法に関する。
酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部
工業的にも行なわれているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、水溶液中で反応を行なわ
せている。しかし、このような方法によれば、反
応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を補給し
たり、また反応後に酵素を失活させることなく、
生成物と酵素を分離することが非常に困難であ
り、酵素が不経済に消費される。そのうえ、反応
が回分式であるから生産性に劣る。
工業的にも行なわれているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、水溶液中で反応を行なわ
せている。しかし、このような方法によれば、反
応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を補給し
たり、また反応後に酵素を失活させることなく、
生成物と酵素を分離することが非常に困難であ
り、酵素が不経済に消費される。そのうえ、反応
が回分式であるから生産性に劣る。
このような問題を解決するため、既に種々の方
法にて酵素を担体に固定化し、この固定化酵素に
基質を反応させることが提案されている。このよ
うな酵素の固定化方法の一つとして、水不溶性の
担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理吸着
にて結合させる担体結合法が知られている。しか
し、従来、この方法において用いられている担体
は、通常、セルロース、デキストラン、アガロー
ス等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲ
ル、多孔性ガラス等の径1mm乃至数mmの粒子であ
り、このような粒子に酵素が固定化された固定化
酵素は通常、カラムに充填され、固定されて、基
質溶液と接触されるので、基質が高分子量の場
合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に長時間
を要すると共に反応収率が低いという問題があ
る。
法にて酵素を担体に固定化し、この固定化酵素に
基質を反応させることが提案されている。このよ
うな酵素の固定化方法の一つとして、水不溶性の
担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理吸着
にて結合させる担体結合法が知られている。しか
し、従来、この方法において用いられている担体
は、通常、セルロース、デキストラン、アガロー
ス等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲ
ル、多孔性ガラス等の径1mm乃至数mmの粒子であ
り、このような粒子に酵素が固定化された固定化
酵素は通常、カラムに充填され、固定されて、基
質溶液と接触されるので、基質が高分子量の場
合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に長時間
を要すると共に反応収率が低いという問題があ
る。
本発明は上記した問題を解決するためになされ
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素の製造方法を提供することを目的とする。
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素の製造方法を提供することを目的とする。
本発明による固定化酵素の製造方法は、(a)アク
リロニトリル及び/又はメタクリロニトリル1〜
60重量%、(b)多官能性内部架橋用単量体1〜20重
量%、及び(c)これらの単量体と共重合し得るラジ
カル重合性単量体10〜98重量%とを、末端に酵素
の固定化に利用し得る官能基を有する水溶性重合
開始剤によつて水媒体中で乳化共重合させて水分
散型高分子重合体粒子を得、次にこの重合体粒子
がその末端に有する重合開始剤からの上記官能基
に酵素を結合することを特徴とする。
リロニトリル及び/又はメタクリロニトリル1〜
60重量%、(b)多官能性内部架橋用単量体1〜20重
量%、及び(c)これらの単量体と共重合し得るラジ
カル重合性単量体10〜98重量%とを、末端に酵素
の固定化に利用し得る官能基を有する水溶性重合
開始剤によつて水媒体中で乳化共重合させて水分
散型高分子重合体粒子を得、次にこの重合体粒子
がその末端に有する重合開始剤からの上記官能基
に酵素を結合することを特徴とする。
本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子の調製に当つては、単量体組成としてアクリロ
ニトリル及び/又はメタクリロニトリル1〜60重
量%、好ましくは5〜40重量%を後述する他のラ
ジカル重合性単量体と乳化共重合させる。
子の調製に当つては、単量体組成としてアクリロ
ニトリル及び/又はメタクリロニトリル1〜60重
量%、好ましくは5〜40重量%を後述する他のラ
ジカル重合性単量体と乳化共重合させる。
本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子の乳化重合においては、得られる重合体粒子に
乳化剤が混入していると、酵素が失活する等の有
害な影響があらわれることがあるので、乳化剤を
用いないのが好ましい。このように乳化剤を用い
ずに乳化共重合を行なつた場合、重合は水相中で
開始される。即ち、水溶性重合開始剤が水に溶解
している少なくとも一部の単量体を重合させ、こ
こに生じた低分子量の重合体ラジカルが高分子化
し、水不溶化して粒子を形成し、この粒子に単量
体が吸着されて重合の場が形成され、ここで重合
が進行して水分散型高分子重合体粒子が生じる。
この場合に、重合初期の水溶性の低分子量重合体
が系に残存するときは、一部は水不溶性の高分子
重合体粒子の表面に吸着されて残り、これを担体
として酵素を固定化すると、この水溶性重合体に
も酵素が固定化される。このように水溶性重合体
を含む担体に酵素が固定化された固定化酵素は、
酵素反応の際に水不溶性の水分散型高分子重合体
粒子から溶出し、固定化酵素自体の活性の経時低
下が著しいうえに、基質や反応生成物と混合する
ので、反応後にその分離を要する等の種々の不都
合が生じる。
子の乳化重合においては、得られる重合体粒子に
乳化剤が混入していると、酵素が失活する等の有
害な影響があらわれることがあるので、乳化剤を
用いないのが好ましい。このように乳化剤を用い
ずに乳化共重合を行なつた場合、重合は水相中で
開始される。即ち、水溶性重合開始剤が水に溶解
している少なくとも一部の単量体を重合させ、こ
こに生じた低分子量の重合体ラジカルが高分子化
し、水不溶化して粒子を形成し、この粒子に単量
体が吸着されて重合の場が形成され、ここで重合
が進行して水分散型高分子重合体粒子が生じる。
この場合に、重合初期の水溶性の低分子量重合体
が系に残存するときは、一部は水不溶性の高分子
重合体粒子の表面に吸着されて残り、これを担体
として酵素を固定化すると、この水溶性重合体に
も酵素が固定化される。このように水溶性重合体
を含む担体に酵素が固定化された固定化酵素は、
酵素反応の際に水不溶性の水分散型高分子重合体
粒子から溶出し、固定化酵素自体の活性の経時低
下が著しいうえに、基質や反応生成物と混合する
ので、反応後にその分離を要する等の種々の不都
合が生じる。
しかしながら、本発明に従つて、アクリロニト
リル及び/又はメタクリロニトリルを多官能性架
橋用単量体と、これらと共重合性を有するラジカ
ル重合性単量体と共に、水溶性開始剤を用い、乳
化剤の不存在下に水媒体中で乳化共重合させる
と、重合の安定性が確保されると共に、望ましく
ない水溶性低分子量重合体の生成が抑止される。
このような結果が得られる理由は明確ではない
が、重合初期に生じる水溶性の重合体ラジカルに
アクリロニトリル又はメタクリロニトリルと多官
能性架橋用単量体が有効に共重合して水不溶化す
ると共に、重合を安定化させるのであろう。従つ
て、アクリロニトリル又はメタクリロニトリルの
量が上記範囲より少なすぎるとき、又は多すぎる
ときは、重合の安定性が損なわれる。
リル及び/又はメタクリロニトリルを多官能性架
橋用単量体と、これらと共重合性を有するラジカ
ル重合性単量体と共に、水溶性開始剤を用い、乳
化剤の不存在下に水媒体中で乳化共重合させる
と、重合の安定性が確保されると共に、望ましく
ない水溶性低分子量重合体の生成が抑止される。
このような結果が得られる理由は明確ではない
が、重合初期に生じる水溶性の重合体ラジカルに
アクリロニトリル又はメタクリロニトリルと多官
能性架橋用単量体が有効に共重合して水不溶化す
ると共に、重合を安定化させるのであろう。従つ
て、アクリロニトリル又はメタクリロニトリルの
量が上記範囲より少なすぎるとき、又は多すぎる
ときは、重合の安定性が損なわれる。
本発明においては、上記したように乳化重合に
際して乳化剤を用いないのが好ましい、また、乳
化剤の不存在下に安定に乳化重合させることがで
きるが、しかし、乳化剤が酵素に対して有害な影
響を与えなければ乳化剤を必要に応じて用いても
よい。
際して乳化剤を用いないのが好ましい、また、乳
化剤の不存在下に安定に乳化重合させることがで
きるが、しかし、乳化剤が酵素に対して有害な影
響を与えなければ乳化剤を必要に応じて用いても
よい。
本発明の方法においては、更に水分散型高分子
重合体粒子を得るに際して、ラジカル重合性多官
能性内部架橋用単量体を単量体組成において1〜
20重量%、好ましくは2〜10重量%用いられる。
多官能性内部架橋用単量体としては多価アルコー
ルのポリ(メタ)アクリレートが好ましく、具体
的にはエチレングリコールジメタクリレート、ト
リエチレングリコールジメタクリレート、ジプロ
ピレングリコールジメタクリレート、1,3―ブ
チレングリコールジメタクリレート、トリエチレ
ングリコールジアクリレート、トリメチロールプ
ロパントリメタクリレート、トリメチロールプロ
パントリアクリレート、テトラメチロールメタン
テトラアクリレート等が用いられる。ジビニルベ
ンゼンも用いられる。前記した理由から、内部架
橋用単量体が少なすぎるときは水溶液重合体の副
生が多くなり、一方、多すぎるときは重合が安定
性に欠けるようになる。
重合体粒子を得るに際して、ラジカル重合性多官
能性内部架橋用単量体を単量体組成において1〜
20重量%、好ましくは2〜10重量%用いられる。
多官能性内部架橋用単量体としては多価アルコー
ルのポリ(メタ)アクリレートが好ましく、具体
的にはエチレングリコールジメタクリレート、ト
リエチレングリコールジメタクリレート、ジプロ
ピレングリコールジメタクリレート、1,3―ブ
チレングリコールジメタクリレート、トリエチレ
ングリコールジアクリレート、トリメチロールプ
ロパントリメタクリレート、トリメチロールプロ
パントリアクリレート、テトラメチロールメタン
テトラアクリレート等が用いられる。ジビニルベ
ンゼンも用いられる。前記した理由から、内部架
橋用単量体が少なすぎるときは水溶液重合体の副
生が多くなり、一方、多すぎるときは重合が安定
性に欠けるようになる。
更に、本発明の方法においては、単量体組成と
して、アクリロニトリル、メタクリロニトリル及
び上記多官能性内部架橋用単量体と共重合し得る
ラジカル重合性単量体が10〜98重量%、好ましく
は20〜90重量%用いられる。このラジカル重合性
単量体としてはアクリロニトリル、メタクリロニ
トリル及び内部架橋用単量体と共重合性を有する
限りは特に制限されることなく、種々の単量体が
用いられるが、好ましくはエチレン、プロピレ
ン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステ
ル、スチレン、メチルスチレン、ビニルトルエ
ン、ブタジエン、イソプレン、アクリルアミド、
メタクリルアミド等の一種又は二種以上が用いら
れる。特に、アクリル酸エステル、メタクリル酸
エステル又はスチレンが好ましく用いられる。こ
れらの共重合性単量体は、得られる共重合体が酵
素反応の行なわれる温度より高いガラス転移点を
有するように選ばれる。
して、アクリロニトリル、メタクリロニトリル及
び上記多官能性内部架橋用単量体と共重合し得る
ラジカル重合性単量体が10〜98重量%、好ましく
は20〜90重量%用いられる。このラジカル重合性
単量体としてはアクリロニトリル、メタクリロニ
トリル及び内部架橋用単量体と共重合性を有する
限りは特に制限されることなく、種々の単量体が
用いられるが、好ましくはエチレン、プロピレ
ン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステ
ル、スチレン、メチルスチレン、ビニルトルエ
ン、ブタジエン、イソプレン、アクリルアミド、
メタクリルアミド等の一種又は二種以上が用いら
れる。特に、アクリル酸エステル、メタクリル酸
エステル又はスチレンが好ましく用いられる。こ
れらの共重合性単量体は、得られる共重合体が酵
素反応の行なわれる温度より高いガラス転移点を
有するように選ばれる。
本発明において用いる水溶性重合開始剤は、そ
の末端に酵素の固定化に利用し得る官能基を有す
ることを要する。このような官能基としては例え
ばスルホン酸基、アミノ基、カルボキシル基等を
挙げることができ、スルホン酸基を有する水溶性
重合開始剤として過硫酸カリウム、過硫酸アンモ
ニウム等の過硫酸塩、アミノ基を有する水溶性重
合開始剤として2,2′―アゾビスイソブチルアミ
ジウム塩酸塩、カルボキシル基を有する水溶性重
合開始剤として4,4′―アゾビスシアノバレリア
ン酸を挙げることができる。重合開始剤の使用量
は、通常、乳化共重合させる全単量体100重量部
当り0.05〜2重量部、好ましくは0.1〜1.0重量部
であり、重合温度は用いる重合開始剤に応じて適
宜に選ばれる。
の末端に酵素の固定化に利用し得る官能基を有す
ることを要する。このような官能基としては例え
ばスルホン酸基、アミノ基、カルボキシル基等を
挙げることができ、スルホン酸基を有する水溶性
重合開始剤として過硫酸カリウム、過硫酸アンモ
ニウム等の過硫酸塩、アミノ基を有する水溶性重
合開始剤として2,2′―アゾビスイソブチルアミ
ジウム塩酸塩、カルボキシル基を有する水溶性重
合開始剤として4,4′―アゾビスシアノバレリア
ン酸を挙げることができる。重合開始剤の使用量
は、通常、乳化共重合させる全単量体100重量部
当り0.05〜2重量部、好ましくは0.1〜1.0重量部
であり、重合温度は用いる重合開始剤に応じて適
宜に選ばれる。
本発明による方法においては、前記単量体組成
により好ましくは乳化剤を用いることなく、上記
のような水溶性重合開始剤を用いて乳化共重合さ
せると、前記したように重合は水相で開始され、
生じた重合体末端はその開始剤に由来する極性の
官能基により、主として重合体粒子の表面に局在
化する。本発明の方法は、重合開始剤に由来する
この官能基がその表面に局在して存在する水分散
型高分子重合体粒子を担体とし、これに酵素を固
定化する。
により好ましくは乳化剤を用いることなく、上記
のような水溶性重合開始剤を用いて乳化共重合さ
せると、前記したように重合は水相で開始され、
生じた重合体末端はその開始剤に由来する極性の
官能基により、主として重合体粒子の表面に局在
化する。本発明の方法は、重合開始剤に由来する
この官能基がその表面に局在して存在する水分散
型高分子重合体粒子を担体とし、これに酵素を固
定化する。
本発明において水分散型高分子重合体粒子の平
均粒径は0.03〜2μ、好ましくは0.07〜1μであ
る。粒径が小さすぎると、固定化酵素を水中に分
散させて酵素反応を行なわせた後の回収が困難と
なり、一方、粒径が大きすぎると、単位体積当り
の粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化量が少
なくなると共に、水中に分散させるのが困難とな
るので好ましくない。
均粒径は0.03〜2μ、好ましくは0.07〜1μであ
る。粒径が小さすぎると、固定化酵素を水中に分
散させて酵素反応を行なわせた後の回収が困難と
なり、一方、粒径が大きすぎると、単位体積当り
の粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化量が少
なくなると共に、水中に分散させるのが困難とな
るので好ましくない。
重合開始剤に由来する官能基への酵素の固定化
は、その官能基の種類に応じて、イオン結合又は
共有結合のいずれでも採用できる。
は、その官能基の種類に応じて、イオン結合又は
共有結合のいずれでも採用できる。
表面に上記官能基を有する水分散型高分子粒子
に酵素をイオン結合するには、酵素の失活が起こ
らない温度、PH等適当な条件で重合体粒子の分散
液と酵素溶液とを混合すればよい。例えば、PHは
酵素の等電点、極性の官能基の種類等に応じて適
宜に定められるが、一般的には5〜8が好まし
い。このようにして酵素を重合体粒子にイオン結
合した後、固定されていない酵素を遠心分離、膜
分離等によつて除去すれば、本発明による固定化
酵素が得られる。
に酵素をイオン結合するには、酵素の失活が起こ
らない温度、PH等適当な条件で重合体粒子の分散
液と酵素溶液とを混合すればよい。例えば、PHは
酵素の等電点、極性の官能基の種類等に応じて適
宜に定められるが、一般的には5〜8が好まし
い。このようにして酵素を重合体粒子にイオン結
合した後、固定されていない酵素を遠心分離、膜
分離等によつて除去すれば、本発明による固定化
酵素が得られる。
一方、共有結合により酵素を水分散型高分子重
合体粒子に固定化する場合にも、重合体粒子の有
する官能基の種類に応じ、従来より知られている
任意の方法によることができる。例えば、一つの
方法として、水溶性カルボジイミドを用いて、酵
素のアミノ基と水分散型高分子重合体粒子表面の
カルボキシル基とを直接アミド結合を形成させる
ことにより結合させることができる。水溶性カル
ボジイミドとしては、例えば1―エチル―3―
(3―ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
塩酸塩、1―シクロヘキシル―3―(2―モルホ
リノエチル)カルボジイミド―メト―p―トルエ
ンスルホン酸等を挙げることができる。このよう
な水溶性カルボジイミドを用いる酵素固定化は従
来知られている通常の条件の下で行なわれ、例え
ば水分散型高分子重合体粒子の有するカルボキシ
ル基の3〜50倍当量のカルボジイミドを用い、5
℃程度の温度、PHを4.5〜6.0に保持して酵素を一
夜混合反応させればよい。
合体粒子に固定化する場合にも、重合体粒子の有
する官能基の種類に応じ、従来より知られている
任意の方法によることができる。例えば、一つの
方法として、水溶性カルボジイミドを用いて、酵
素のアミノ基と水分散型高分子重合体粒子表面の
カルボキシル基とを直接アミド結合を形成させる
ことにより結合させることができる。水溶性カル
ボジイミドとしては、例えば1―エチル―3―
(3―ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
塩酸塩、1―シクロヘキシル―3―(2―モルホ
リノエチル)カルボジイミド―メト―p―トルエ
ンスルホン酸等を挙げることができる。このよう
な水溶性カルボジイミドを用いる酵素固定化は従
来知られている通常の条件の下で行なわれ、例え
ば水分散型高分子重合体粒子の有するカルボキシ
ル基の3〜50倍当量のカルボジイミドを用い、5
℃程度の温度、PHを4.5〜6.0に保持して酵素を一
夜混合反応させればよい。
第二の方法として、水分散型高分子重合体粒子
表面のカルボキシル基にN―ヒドロキシスクシン
イミドをカルボジイミドの存在下に反応させた
後、酵素のアミノ基を反応させ、共有結合を形成
させることができる。更に、第三の方法として、
水分散型高分子重合体粒子表面のカルボキシル基
にジアミンを作用させて、重合体粒子表面にアミ
ノ基を導入し、このアミノ基により酵素を共有結
合で固定化することもできる。例えば、前記した
カルボジイミドを用いて、酵素のカルボキシル基
を重合体粒子表面のアミノ基に反応させることが
でき、また、グルタルアルデヒドのような架橋試
薬を用いて、酵素のアミノ基を重合体粒子に結合
させることができる。ジアルデヒドを架橋試薬と
して用いる場合には、重合体粒子の有するアミノ
基に対して過剰量を反応させ、重合体粒子に一方
のアルデヒド基により結合したジアルデヒドの他
方の遊離アルデヒド基に酵素のアミノ結合を反応
させる。
表面のカルボキシル基にN―ヒドロキシスクシン
イミドをカルボジイミドの存在下に反応させた
後、酵素のアミノ基を反応させ、共有結合を形成
させることができる。更に、第三の方法として、
水分散型高分子重合体粒子表面のカルボキシル基
にジアミンを作用させて、重合体粒子表面にアミ
ノ基を導入し、このアミノ基により酵素を共有結
合で固定化することもできる。例えば、前記した
カルボジイミドを用いて、酵素のカルボキシル基
を重合体粒子表面のアミノ基に反応させることが
でき、また、グルタルアルデヒドのような架橋試
薬を用いて、酵素のアミノ基を重合体粒子に結合
させることができる。ジアルデヒドを架橋試薬と
して用いる場合には、重合体粒子の有するアミノ
基に対して過剰量を反応させ、重合体粒子に一方
のアルデヒド基により結合したジアルデヒドの他
方の遊離アルデヒド基に酵素のアミノ結合を反応
させる。
また、第四の方法としてジアゾカツプリング法
によることもできる。例えば、アミノ基を導入し
た重合体粒子にp―ニトロベンズアルデヒドを反
応、結合させ、次にニトロ基を通常の方法、例え
ば水素化ホウ素ナトリウムと亜二チオン酸ナトリ
ウムによつてアミノ基に還元しこのアミノ基を亜
硝酸ナトリウムによつてジアゾニウム基とし、こ
れを酵素のアミノ基とジアゾカツプリングさせる
のである。
によることもできる。例えば、アミノ基を導入し
た重合体粒子にp―ニトロベンズアルデヒドを反
応、結合させ、次にニトロ基を通常の方法、例え
ば水素化ホウ素ナトリウムと亜二チオン酸ナトリ
ウムによつてアミノ基に還元しこのアミノ基を亜
硝酸ナトリウムによつてジアゾニウム基とし、こ
れを酵素のアミノ基とジアゾカツプリングさせる
のである。
以上のようにして酵素を重合体粒子に共有結合
させた後、用いた反応試薬や固定化されていない
酵素を遠心分離、膜分離等によつて除去すれば、
本発明の固定化酵素が得られる。
させた後、用いた反応試薬や固定化されていない
酵素を遠心分離、膜分離等によつて除去すれば、
本発明の固定化酵素が得られる。
本発明の固定化酵素は分散液として用いられ、
基質と接触される。固定化酵素の使用量は、固定
化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要とする反応
速度、基質濃度等により適宜に決定される。
基質と接触される。固定化酵素の使用量は、固定
化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要とする反応
速度、基質濃度等により適宜に決定される。
本発明において固定化される酵素は菌体内酵素
でよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必ら
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵素
を固定化してもよい。酵素の具体例としては、ア
ミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオ
キシダーゼ、グルコース、オキシダーゼ、グルコ
ース―6―リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン
酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムCオキシダー
ゼ、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペル
オキシダーゼ、6―ホスホグルコン酸デヒドロゲ
ナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化
還元酵素、アスパラギン酸アセチルトランスフエ
ラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフエラー
ゼ、グリシンアミノトランスフエラーゼ、グルタ
ミン酸―オキザロ酢酸アミノトランスフエラー
ゼ、グルタミン酸―ピルビン酸アミノトランスフ
エラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミ
ンメチルトランスフエラーゼ、ピルビン酸キナー
ゼ、フラクトキナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ―リ
ジンアセチルトランスフエラーゼ、ロイシンアミ
ノペプチダーゼのような転移酵素、アスパラギナ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミノアシ
ラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ、L―アルギ
ニンデイミナーゼ、インベルターゼ、ウレアー
ゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、
β―ガラクトシダーゼ、カリクレイン、キモトリ
プシン、トリプシン、トロンビン、ナリンギナー
ゼ、ヌクレオチダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダ
ーゼ、プラスミン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナ
ーゼ、ペプシン、ペニシリナーゼ、ペニシリンア
ミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラ
クターゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニ
ンのような加水分解酵素、アスパラギン酸デカル
ボキシラーゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアー
ゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジ
ンアンモニアリアーゼ、フエニルアラニンアンモ
ニアリアーゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラタ
ーゼ、リンゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、
アラニンラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、
グルコースホスフエートイソメラーゼ、グルタミ
ン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラ
セマーゼのような異性化酵素、アスパラギンシン
ターゼ、グルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シ
ンターゼのようなリガーゼ等を挙げることができ
る。
でよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必ら
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵素
を固定化してもよい。酵素の具体例としては、ア
ミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオ
キシダーゼ、グルコース、オキシダーゼ、グルコ
ース―6―リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン
酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムCオキシダー
ゼ、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペル
オキシダーゼ、6―ホスホグルコン酸デヒドロゲ
ナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化
還元酵素、アスパラギン酸アセチルトランスフエ
ラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフエラー
ゼ、グリシンアミノトランスフエラーゼ、グルタ
ミン酸―オキザロ酢酸アミノトランスフエラー
ゼ、グルタミン酸―ピルビン酸アミノトランスフ
エラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミ
ンメチルトランスフエラーゼ、ピルビン酸キナー
ゼ、フラクトキナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ―リ
ジンアセチルトランスフエラーゼ、ロイシンアミ
ノペプチダーゼのような転移酵素、アスパラギナ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミノアシ
ラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ、L―アルギ
ニンデイミナーゼ、インベルターゼ、ウレアー
ゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、
β―ガラクトシダーゼ、カリクレイン、キモトリ
プシン、トリプシン、トロンビン、ナリンギナー
ゼ、ヌクレオチダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダ
ーゼ、プラスミン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナ
ーゼ、ペプシン、ペニシリナーゼ、ペニシリンア
ミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラ
クターゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニ
ンのような加水分解酵素、アスパラギン酸デカル
ボキシラーゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアー
ゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジ
ンアンモニアリアーゼ、フエニルアラニンアンモ
ニアリアーゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラタ
ーゼ、リンゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、
アラニンラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、
グルコースホスフエートイソメラーゼ、グルタミ
ン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラ
セマーゼのような異性化酵素、アスパラギンシン
ターゼ、グルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シ
ンターゼのようなリガーゼ等を挙げることができ
る。
本発明による固定化酵素は、以上のように、用
いた重合開始剤に由来する官能基を粒子表面に有
する水分散型高分子重合体粒子に上記官能基を介
して酵素が共有結合又はイオン結合にて固定化さ
れており、従来のセルロース誘導体担体粒子等の
場合と異なり、固定化酵素自体が遊離の酵素と同
様に反応系内を自由に移動できるため、基質の拡
散が反応に殆ど影響を与えず、従つて、高分子量
の基質の場合にも遊離の酵素と同様の高い反応速
度で酵素反応を行なわせることができる。しか
も、酵素は担体に固定化されているため、酵素反
応後には遠心分離、塩析、凝集剤を用いる凝集沈
殿、多孔性膜による膜分離等によつて容易に回収
でき、長期間にわたつて繰返して使用することが
できる。
いた重合開始剤に由来する官能基を粒子表面に有
する水分散型高分子重合体粒子に上記官能基を介
して酵素が共有結合又はイオン結合にて固定化さ
れており、従来のセルロース誘導体担体粒子等の
場合と異なり、固定化酵素自体が遊離の酵素と同
様に反応系内を自由に移動できるため、基質の拡
散が反応に殆ど影響を与えず、従つて、高分子量
の基質の場合にも遊離の酵素と同様の高い反応速
度で酵素反応を行なわせることができる。しか
も、酵素は担体に固定化されているため、酵素反
応後には遠心分離、塩析、凝集剤を用いる凝集沈
殿、多孔性膜による膜分離等によつて容易に回収
でき、長期間にわたつて繰返して使用することが
できる。
更に、本発明において用いる担体としての水分
散型高分子重合体粒子は、その製造面からみれ
ば、乳化剤を用いることなく、且つ、望ましくな
い水溶性重合体の生成なく、安定に乳化共重合に
て得ることができる。また、アクリロニトリル又
はメタクリロニトリルと内部架橋用単量体を併用
することにより、得られる水分散型高分子重合体
粒子は強度が大きいと共に、粒子相互の粘着も起
らない。
散型高分子重合体粒子は、その製造面からみれ
ば、乳化剤を用いることなく、且つ、望ましくな
い水溶性重合体の生成なく、安定に乳化共重合に
て得ることができる。また、アクリロニトリル又
はメタクリロニトリルと内部架橋用単量体を併用
することにより、得られる水分散型高分子重合体
粒子は強度が大きいと共に、粒子相互の粘着も起
らない。
実施例 1
アクリロニトリル15g、トリエチレングリコー
ルジメタクリレート2g及びメチルメタクリレー
ト83gを蒸留水230gに加え、2,2′―アゾビス
イソブチルアミジウム塩酸塩0.2gを水10gに溶
解した重合開始剤水溶性液を60℃の温度で窒素気
流下に加え、120rpmで撹拌しつつ8時間重合さ
せて、固形分30%、粒子表面に開始剤に由来する
アミノ基を有する平均粒径0.4μの重合体粒子の
水分散液を得た。
ルジメタクリレート2g及びメチルメタクリレー
ト83gを蒸留水230gに加え、2,2′―アゾビス
イソブチルアミジウム塩酸塩0.2gを水10gに溶
解した重合開始剤水溶性液を60℃の温度で窒素気
流下に加え、120rpmで撹拌しつつ8時間重合さ
せて、固形分30%、粒子表面に開始剤に由来する
アミノ基を有する平均粒径0.4μの重合体粒子の
水分散液を得た。
この重合体粒子の水分散液100mlにグルタルア
ルデヒドの2%水溶液30mlを加え、室温で2時間
反応させた後、遠心分離により精製し、アルデヒ
ド基を有する水分散型高分子重合体粒子を得た。
この重合体粒子を水100mlに再分散させ、ウレア
ーゼ2gを緩衝液20mlに溶解した酵素水溶液を加
え、5℃の温度で24時間反応させて、ウレアーゼ
を重合体粒子に固定化した。反応終了後、遠心分
離して沈降した重合体粒子を0.1Mリン酸水素二
カリウム及び0.1Mリン酸二水素カリウムから調
製した緩衝液(PH7.0)で洗滌し、未固定のウレ
アーゼを除去し、再び緩衝液に分散させて、本発
明による固定化酵素を得た。
ルデヒドの2%水溶液30mlを加え、室温で2時間
反応させた後、遠心分離により精製し、アルデヒ
ド基を有する水分散型高分子重合体粒子を得た。
この重合体粒子を水100mlに再分散させ、ウレア
ーゼ2gを緩衝液20mlに溶解した酵素水溶液を加
え、5℃の温度で24時間反応させて、ウレアーゼ
を重合体粒子に固定化した。反応終了後、遠心分
離して沈降した重合体粒子を0.1Mリン酸水素二
カリウム及び0.1Mリン酸二水素カリウムから調
製した緩衝液(PH7.0)で洗滌し、未固定のウレ
アーゼを除去し、再び緩衝液に分散させて、本発
明による固定化酵素を得た。
この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合
体粒子1g当り22mgであり、活性収率は35%であ
つた。
体粒子1g当り22mgであり、活性収率は35%であ
つた。
尚、活性収率とは固定化された酵素の活性の理
論量に対する実際の活性の割合を意味する。ここ
では、活性収率は0.03Mの尿素水溶液を基質と
し、35℃で10分間固定化酵素を反応させ、生成し
たアンモニア量(μモル/分)を塩酸滴定で求め
て活性を測定し、これと等しい活性を有する遊離
の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。
論量に対する実際の活性の割合を意味する。ここ
では、活性収率は0.03Mの尿素水溶液を基質と
し、35℃で10分間固定化酵素を反応させ、生成し
たアンモニア量(μモル/分)を塩酸滴定で求め
て活性を測定し、これと等しい活性を有する遊離
の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。
実施例 2
アクリロニトリル20g、ジビニルベンゼン2
g、メチルメタクリレート35g及びスチレン43g
を蒸留水230gに加え、4,4′―アゾビスシアノ
バレリアン酸0.3gを水20mlに溶解した重合開始
剤水溶液を窒素気流下70℃の温度で加え、
120rpmで撹拌しつつ8時間重合させて、固形分
30%、粒子表面に開始剤に由来するカルボキシル
基を有する平均粒径0.4μの重合体粒子の水分散
液を得た。
g、メチルメタクリレート35g及びスチレン43g
を蒸留水230gに加え、4,4′―アゾビスシアノ
バレリアン酸0.3gを水20mlに溶解した重合開始
剤水溶液を窒素気流下70℃の温度で加え、
120rpmで撹拌しつつ8時間重合させて、固形分
30%、粒子表面に開始剤に由来するカルボキシル
基を有する平均粒径0.4μの重合体粒子の水分散
液を得た。
この分散液100mlにα―キモトリプシン2gを
0.05Mリン酸水素二ナトリウムと0.05Mリン酸水
素二ナトリウムから調製した緩衝液(PH7)50ml
に溶解した酵素溶液を加え、5℃で24時間放置
後、遠心分離した。沈降した重合体粒子を緩衝液
にて洗滌して未固定のα―キモトリプシンを除去
し、再び緩衝液に分散させて本発明による固定化
酵素を得た。
0.05Mリン酸水素二ナトリウムと0.05Mリン酸水
素二ナトリウムから調製した緩衝液(PH7)50ml
に溶解した酵素溶液を加え、5℃で24時間放置
後、遠心分離した。沈降した重合体粒子を緩衝液
にて洗滌して未固定のα―キモトリプシンを除去
し、再び緩衝液に分散させて本発明による固定化
酵素を得た。
この固定化酵素のα―キモトリプシンの固定化
量は重合体粒子1g当り25mgであり、活性収率は
90%であつた。活性収率は、0.05mMのN―アセ
チル―L―チロシンエチルエステルを基質として
30℃で酵素を反応させ、アルカリ滴定によるカル
ボキシル基生成速度(μモル/分)から求めた。
量は重合体粒子1g当り25mgであり、活性収率は
90%であつた。活性収率は、0.05mMのN―アセ
チル―L―チロシンエチルエステルを基質として
30℃で酵素を反応させ、アルカリ滴定によるカル
ボキシル基生成速度(μモル/分)から求めた。
実施例 3
アクリロニトリル30g、トリメチロールプロパ
ントリメタクリレート5g及びメチルメタクリレ
ート65gを蒸留水230gに加え、過硫酸アンモニ
ウム0.3gを水10gに溶解した重合開始剤水溶液
を70℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで撹
拌しつつ8時間重合させて、固形分30%、粒子表
面に開始剤に由来するスルホン酸基を有する平均
粒径0.3μの重合体粒子の水分散液を得た。
ントリメタクリレート5g及びメチルメタクリレ
ート65gを蒸留水230gに加え、過硫酸アンモニ
ウム0.3gを水10gに溶解した重合開始剤水溶液
を70℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで撹
拌しつつ8時間重合させて、固形分30%、粒子表
面に開始剤に由来するスルホン酸基を有する平均
粒径0.3μの重合体粒子の水分散液を得た。
この分散液100mlに、トリプシン2gを0.1Mリ
ン酸水素二カリウムおよび0.1Mリン酸二水素カ
リウムから調製した緩衝液(PH7.0)50mlに溶解
した酵素溶液を加え、5℃で24時間放置し、トリ
プシンをイオン結合により固定した後、遠心分離
した。沈降した重合体粒子を緩衝液にて洗滌して
未固定のトリプシンを除去し、再び緩衝液に分散
させて本発明による固定化酵素を得た。
ン酸水素二カリウムおよび0.1Mリン酸二水素カ
リウムから調製した緩衝液(PH7.0)50mlに溶解
した酵素溶液を加え、5℃で24時間放置し、トリ
プシンをイオン結合により固定した後、遠心分離
した。沈降した重合体粒子を緩衝液にて洗滌して
未固定のトリプシンを除去し、再び緩衝液に分散
させて本発明による固定化酵素を得た。
この固定化酵素のトリプシンの固定化量は重合
体粒子1g当り15mgであり、活性収率は90%であ
つた。尚、1%カゼイン水溶液を基質として酵素
を35℃で10分間反応させた後、5%トリクロル酢
酸により高分子量タンパク質を沈殿させ、遊離の
非タンパク性分解質量を280nmの吸光度から求
め、この吸光度を1分間に1.0増加させる活性を
1単位として、活性収率を求めた。
体粒子1g当り15mgであり、活性収率は90%であ
つた。尚、1%カゼイン水溶液を基質として酵素
を35℃で10分間反応させた後、5%トリクロル酢
酸により高分子量タンパク質を沈殿させ、遊離の
非タンパク性分解質量を280nmの吸光度から求
め、この吸光度を1分間に1.0増加させる活性を
1単位として、活性収率を求めた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 (a)アクリロニトリル及び/又はメタクリロニ
トリル1〜60重量%、(b)多官能性内部架橋用単量
体1〜20重量%、及び(c)これらの単量体と共重合
し得るラジカル重合性単量体10〜98重量%とを、
末端に酵素の固定化に利用し得る官能基を有する
水溶性重合開始剤によつて水媒体中で乳化共重合
させて水分散型高分子重合体粒子を得、次にこの
重合体粒子がその末端に有する上記重合開始剤か
らの官能基に酵素を結合することを特徴とする固
定化酵素の製造方法。 2 水溶性重合開始剤がその末端に官能基として
アミノ基を有することを特徴とする特許請求の範
囲第1項記載の固定化酵素の製造方法。 3 水溶性重合開始剤がその末端に官能基として
カルボキシル基を有することを特徴とする特許請
求の範囲第1項記載の固定化酵素の製造方法。 4 水溶性重合開始剤がその末端に官能基として
スルホン酸基を有することを特徴とする特許請求
の範囲第1項記載の固定化酵素の製造方法。 5 水溶性重合開始剤が2,2′―アゾビスイソブ
チルアミジウム塩酸塩であることを特徴とする特
許請求の範囲第2項記載の固定化酵素の製造方
法。 6 水溶性重合開始剤が4,4′―アゾビスシアノ
バレリアン酸であることを特徴とする特許請求の
範囲第3項記載の固定化酵素の製造方法。 7 水溶性重合開始剤が過硫酸塩であることを特
徴とする特許請求の範囲第4項記載の固定化酵素
の製造方法。 8 水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平
均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲
第1項記載の固定化酵素の製造方法。 9 ラジカル重合性単量体がアクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル又はスチレンであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の固定
化酵素の製造方法。 10 多官能性内部架橋用単量体が多価アルコー
ルのポリアクリレート又はポリメタクリレートで
あることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載
の固定化酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3268682A JPS58149681A (ja) | 1982-03-01 | 1982-03-01 | 固定化酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3268682A JPS58149681A (ja) | 1982-03-01 | 1982-03-01 | 固定化酵素の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58149681A JPS58149681A (ja) | 1983-09-06 |
JPS6153036B2 true JPS6153036B2 (ja) | 1986-11-15 |
Family
ID=12365750
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3268682A Granted JPS58149681A (ja) | 1982-03-01 | 1982-03-01 | 固定化酵素の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS58149681A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7243675B2 (en) * | 2004-04-30 | 2007-07-17 | Delaware Capital Formation, Inc. | Drop tube segments adapted for use with a liquid reservoir |
JP4911280B2 (ja) * | 2005-10-07 | 2012-04-04 | Jsr株式会社 | 有機ポリマー粒子およびその製造方法 |
JP2007326892A (ja) * | 2006-06-06 | 2007-12-20 | Daito Kasei Kogyo Kk | ラジカル重合開始剤固定化粉体、高分子量化合物固定化粉体並びにそれを用いる塗料、インキ、化粧料および充填剤 |
-
1982
- 1982-03-01 JP JP3268682A patent/JPS58149681A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS58149681A (ja) | 1983-09-06 |
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