JPS58152486A - 酵素反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素反応方法に関し、詳しくは固定化Ｍ素の分
散液を用いて酵素反応を速やかに行なわせると共に、酵
素の分離回収を容易にした酵素反応方法に関する。

酵素反応は、その基質特異性や常温常圧での高反応性の
ために、食品、医薬品の製造の過程で利用きれているか
、従来は水溶液中で反応を行なわせている。しかし、こ
のような方法によれば、反応条件を一定に維持しつつ、
新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失活さ
せることな（、生成物と酵素を分離することか非常に困
難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、反応
が回分式であるから生産性に劣る。このような問題を解
決するため、既に種々の方法にて酵素を担体に固定化し
た固定化酵素を用いで基讐゛と連続的に反応させること
が提案されている。しかし、従来の方法は、多くの場合
、粒状固定化酵素を反応容器に充填し、この反応容器に
基質溶液を供給するものであり、固定化酵素が反応系内
で固定されているため、特に基質が高分子等であるとき
、基質の拡散性か悪（、反応に長時間を要すると共に、
固定化酵素の充填層か目詰まりを起こしやすい問題があ
る。

１万、遊離の酵素を再利用しつつ酵素反応を行なわせる
方法として、例えば、酵素と基質とを反応させた後、限
外濾過膜により反応生成物と遊離の酵素とを分離し、こ
の分離回収した酵素に再び酵素反応を行なわせる方法が
提案されている（特開昭５３−２９９９４号公報ン、シ
かし、このような方法によれば、用いる酵素と反応生成
物の大きさを同時に考慮して、酵素は透過させないか、
反応生成物は透過させるように、比較的限定された範囲
の小さな孔径を有する限外−過膜を用いざるを得す、従
って、遊離の酵素と反応生成物との限外濾過による分離
操作において実用的な大きい透過液量を得ようとすれば
、自ら処理圧力か高くなり、この結果、酵素の膜表面へ
の付着か促進され、透過液量ほか膜性能が速やかに低下
し、長期間にわたって安定して高い透過液量を維持しつ
つ、限外ｐ過処理すること−こより酵素と反応生成物と
を分離することが困難である。また、遊離の酵素を用い
る限りは、反応生成物中への酵素の混入か避けられない
と共に、酵素活性か漸次失なわれるので、酵素反応を長
期間にわたって安定して行ない得ない。更に、反応生成
物が高分子量である場合、遊離の酵素との分離が困難で
ある。

本発明は上記した種々の問題を解決するためになされた
ものであって、酵素反応を速やかに行なわせることがで
きると共に、生成物に酵素か混入せず、しかも、反応生
成物と酵素との分離か容易且つ確実てあって、更に酵素
か安定化されているため、酵素を繰返し使用することが
できる酵素反応方法を提供することを目的とする。

本発明による酵素反応方法は、水分散型高分子重合体粒
子に酵素を固定化酵素の分散液を基質溶液と混合して酵
素反応を行なわせた後、この固定化酵素を透過させない
透過膜にて固定化酵素を分離することを特徴とする。

本発明において用いられる固定化酵素は水分散型高分子
重合体粒子（以下、単に粒子又は担体粒子ということも
ある。］に酵素か固定化された固定化酵素であり、酵素
は共有結合法、イオン結合法又は物理吸着法のいずれか
で担体粒子に固定化されている。従って、担体粒子は、
酵素を共有結合にて固定化させる場合にはそのための官
能基を有することを要し、酵素をイオン結合にて固定化
させる場合１こけそのためのイオン交換基を有すること
を要する。しかし、酵素を物理吸着させる場合には、粒
子は何ら特別な官能基やイオン交換基を必要とせず、任
意の組成の水分散型高分子重合体粒子を用いることがで
きる。

官能基又はイオン交換基を有する水分散型高分子重合体
粒子は、官能基又はイオン交換基を有するラジカル重合
性単量体を、好ましくはこれらとラジカル共重薔可能な
共重合性単量体と乳化共重合させることによって得られ
る。

酵素を共有結合させるための官能基としては、具体的に
はカルボキシル基、水酸基、アミ７基、ヒドラジド基、
グリシジル基等を挙げることができる。かかる官能基を
有する単量体として、具体的には、アクリル酸、メタ２
クリル酸、イタコン酸のようなカルボキシル基を有する
単量体、とドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエ
チルメタクリレートのような水酸基を有する単量体、グ
リシジルメタクリレートのようなグリシジル基を有する
単量体を挙げることができる。このような単量体を他の
共重合性単量体と乳化共重合させることＫよって、カル
”ホキシル基、水酸基又はグリシジル基を有する水分散
型高分子重合体粒子を得ることができる。

また、アミノ基やヒドラジド基を有する水分散型高分子
重合体粒子は、アクリルアミドのようｔアミド基を有す
る単量体及びアクリル峻メチル、メタ２リル酸メチルの
ようなメチルエステル基を有する単量体をそれぞれ好ま
しくは他の単量体と共に乳化共重合し、得られた共重合
体中の上記アミド基をホフマン転移させ、また、メチル
エステル基にヒドラジンを作用させることによって得る
ことかできる。アクリル酸エステルのようなエステル基
を有する単量体を乳化共重合させた後、エステル基を加
水分解することによっても、官能基としてカルボキシル
基を含む水分散型高分子重合体粒子を得ることかできる
。尚、カルボキシル基は次に説明するように、イオン交
換基としても機能する。

次に、イオン交換基としては、スルホン酸基、カルボキ
シル基、リン酸基等の酸基、第３級アミノ基、第４級ア
ミノ基等の塩基性基等を挙げることができ、このような
イオン交換基を有する単量体の具体例としてスチレンス
ルホン酸、スルホプロピルメタクリレートのようなスル
ホン酸基を有する単量体、アクリル酸、メタクリル酸、
イタコン酸のようなカルボキシル基を有する単量体、ア
シッドホスホキシエチルメタフタレート、３−クロロ−
２−アシフドホスホキシプａビルメタクリレートのよう
なリン酸基を有する単量体、ジメチルアミノエチルメタ
クリレート、ジメチルア文ノプロピルメタクリルア主ド
のような第３級アミノ基を有する単量体、メタクリルア
ミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、メタ
クリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロラ
イドのようなｓ４級アミノ基を有する単量体を挙げるこ
とができる。

また、グリシジル基を有する単量体を他の単量体と共に
予め乳化重合させて水分散型高分子重合体粒子を得、こ
の共重合体に第３級アミノを反応させると、第４級アミ
ノ基をイオン交換基とじて有する重合体が得られる。

官能基又はイオン交換基を有する単量体番こ共重合させ
る共重合性単量体は、共重合性を有する限りは特に制限
されないが、好會しくはエチレン、プロピレン、塩化ビ
ニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリル酸エ
ステル、メタクリル酸エステル、スチレン、メチリスチ
レン、ブタジェン、インプレン、アクリルアミド、アク
リロニトリル、メタクリロニトリル等の一種又は二種以
上が用いられる。これらの共重合性単量体は、得られる
共重合体が酵素反応の行なわれる温度より高いガラス転
移点を有するように選ばれる。

本発明においては、官能基又はイオン交換基を有する単
量体とこれに共重合可能な上記単量体に加えて、更に内
部架橋剤としてのラジカル重合性多官能性単量体を乳化
共重合させて、水分散型高分子重合体粒子を得ることも
できる。内部架橋剤は得られる重合体粒子のガラス転移
点を高めると共に、イオン交換基を有する単量体の乳化
共重合に際して、望ましくない水溶性重合体の生成を抑
制する。このような内部架橋剤の具体例として、エチレ
ングリコールジメタタリレート、トリエチレングリコー
ルジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメタク
リレート、１．３−ブチレングリコールジメタクリレー
ト、トリエチレングリコールジアクリレート、トリメチ
ロールプロパントリメタクリレート、トリメチロールプ
ロパン）　ＩＪアクリレート等のような多価アルコール
のポリ（メタ）アクリレートやジビニルベンゼンが挙げ
られる。内部架橋剤は、また、重合の安定性を高めるの
にも役立つ。

本発明においては、官能基又はイオン交換基を有する単
量体０．２〜３０重量襲と、これに共重合性を有する単
量体９９．８〜７０重量第とを乳化重合させて、水分散
型高分子重合体粒子を得るのか好ましい。内部架橋剤を
併用する場合には、全単量体の２０重ｔ％までの範囲で
共重合させるのがよい。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、上
記のような単量体を乳化共重合することＫよって得られ
るが、重合体粒子中に乳化剤か混在すると、酵素の固定
化時にこれらか失活する等の有害な影響があられれるこ
とがあるので、乳化重合に際しては乳化剤を用いないの
が好ましい。

しかし、乳化剤が酵素に対して有害な影響を与えないと
きは、安定に水分散型高分子重合体粒子を得るために用
いてよいのは勿論である。

また、本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子
は、平均粒径が０．０３〜２μ、好ましくは０．０７〜
１μである。平均粒径か小さすぎると、透過膜として微
孔孔径の小さいものを用いなければならず、この結果、
反応生成物か嘆を透過し難くなり、反応生成物の取得に
長時間を要することとなり、一方、大きすぎると、単位
体積当りの粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化量が
少なくなり、大きい活性を有する固定化酵素か得難い。

また、水分散型高分子重合体粒子の有する官能基又はイ
オン交換基の量は、重合体粒子１．当り０．００１〜５
ミリ当量、好ましくは０．０１〜２ミリ当量である。こ
の量が少なすぎるときは、十分な量の酵素を固定化する
ことができず、一方、多すぎるときは、酵素が固定化時
に失活する傾向があるので好ましくない。

水分散型高分子重合体粒子に酵素を共有結合、イオン結
合又は物理吸着させる方法は特に制限されず、従来より
一般に知られている方法が適宜に採用される。例えば、
共有結合させる場合には、具体的にはジアゾ法、カルボ
ジイミド法、臭化シアン法、アジド法等を採用すること
ができるが、これらに限定されるものではない。また、
本発明においては、必要ならば、重合体粒子にヘキサメ
チレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、グリシルグ
リシルグリシン等のスペーサを介して酵素を結合させ、
固定化された酵素の担体上での自由運動節回を拡大する
ことができる。

更に、本発明によれば、前記したような官能基を有する
−又は二以上の単量体に予め酵素を固定化し、これを他
の共重合性単量体と共に乳化共重合させることによって
も、酵素が固定化された水分散型高分子重合体粒子が得
られる。

水分散型高分子粒子に酵素をイオン結合するには、酵素
の失活が起こらない温度、ｐＨ等適当な条件で重合体粒
子の分散液と酵素溶液とを混合すればよい。例えば、ｐ
Ｈは酵素の等電点、イオン交換基のＮ＠等に応じて適宜
に定められるが、一般的にはＳ〜Ｂが好ましい。

本発明において水分散型高分子重合体粒子に固定化され
る酵素は菌体内酵素でもよく、菌停外酵素でもよい。更
に、酵素は必らずしも高度に精製されている必要はな（
、抽出液や部分精灸品も用いられる。更に、本発明に従
って単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵素を同
定化してもよい。酵素の具体例としては、アミノ酸オキ
シダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グル
コース・オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロ
ムＣオキシダーゼ、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ、ペルオキシダーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロ
ゲナーゼ、リンゴ岬デヒドロゲナーゼのような酸化還元
酵素、アスパラギン酸アセチルトランスフェラーゼ、ア
スパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グリシンアミ
ノトランスフェラーゼ、ダルタ電ン酸−オキザロ酢酸ア
之ノドランス７エラーゼ、グルタミン酸−ビルピン酸ア
ミノトランスフェラーゼ、タレアチンホスホキナーゼ、
ビスタ文ンメチルトランス７エラーゼ、ピルビン陵キナ
ーゼ％７ラクトキナーゼ、ヘキソキナーゼ、−一りジン
アセチルトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダ
ーゼのような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコ
リンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、ア
ルギナーゼ、Ｌ−アラニンラセマ−ゼ、インベルターゼ
、ウレアーゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラー
ゼ、！−ガラクトシダーゼ、カリクレイン、牛モト呼プ
シン、トリプシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌタ
レオチダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミ
ン、ペタチナーゼ、ヘキソキナーゼ、ペプシン、ペニシ
リナー賃、ペニシリンア突ダーゼ、ホスホリパーゼ、ホ
スホリパ−ゼ、シンターゼ、リパーゼ、リボヌクレアー
ゼ、レンニンのような加水分解酵素、アスパラギン酸デ
カルボキシラーゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ
、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモ
ニアリアーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、
フマラーゼ、７マール酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテ
ターゼのようなリアーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコ
ースインメラーゼ、グルコースホスフェートインメラー
ゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオ
ニンラセマーゼのような異性化酵素、アスパラギンシン
ターゼ、グルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンター
ゼのようなりガーゼ等を挙げることかできる。

次に、本発明において用いられる透過膜は、水分散型高
分子重合体粒子に酵素を固定化した固定化酵素が透過し
ない孔径の微孔を有するように選ばれるが、遊離の酵素
を透過させない孔径と興なり、比較的大きくてもよい利
点かある。実際には、用いる重合体粒子の粒径や反応生
成物の種類に応じて適宜に選ばれる。透過膜の素材は特
に制限されず、例えば酢酸セルロース、ニトロセルロー
ス、ポリアクリロニトリル、ボリアミド、ボリイ電ド、
ポリスルホン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレ
ン−酢酸ビニル共重合体ケン化物等が用いられる０例え
ば、エチレン含量８０モル襲以下のエチレン−酢酸ビニ
ル共重合体ケン化物からなる透過膜はタンパク質が膜に
付着し難（、目詰まりが少ないために好ましく用いられ
る。

図面番ζ本発明による酵素反応の一実施例を示す。

水分散型高分子重合体粒子に酵素を固定した固定化酵素
の水分散液と基質溶液を酵素反応容器ｌに導き、攪拌下
に定められた温度やｐＨ条件下に媒体中で酵素反応を行
なわせる。

用いる透過膜の形吠は特に制限されないが、中空繊維膜
や管状膜が好都合である０例えば、中空繊維膜を透過膜
として用いる場合、中空繊維膜は１ 図示したようなモジエールに組込んで用いるのが好都合
である。そジェールは管状のケーシング２の両端部近傍
にシール材３が配設され、このシール材間に中空繊維膜
４が多数平行Ｋ１１ｌ定されており、軸方向両端に開口
する。ケーシングは軸方向両端に開口廊及び６を有し、
シール材間に側管７を有する。

酵素反応容器で酵素反応を行なった後、固定化酵素の分
散液と反応生成物と場合によっては未反応の基質とから
なる反応混合物は開口５から嘆モジエール内の中空繊維
膜内に供給され、反応生成物は膜を透過し、膜透過液と
して開ロアから流出する。一方、固定化酵素は粒径の大
きい水分散型高分子重合体粒子からなるために透過膜を
透過し得ず、開口６から排出されるので、このようにし
て反応生成物から分離回収した固定化酵素は好ましくは
酵素反応容器に循環され、再使用される。

本発明においては、固定化酵素の膜分離に際し、好まし
くは固定化−素が媒体中に尚分散されている程度まで反
応生成物及び媒体を透過させ、一部の反応生成物、を含
有したままで、媒体と共に固定化酵素を反応容器に戻す
。しかし、反応生成物をすべて透過液中に得るために、
適宜に水や緩衝液等の媒体を補充しつつ、多段に膜処理
を行なうこともできる。また、必要に応じて膜透過液の
一部を回収した固定化酵素分散液と共に反応容器に戻し
てもよい。

また、膜構造にもよるが、固定化酵素と反応生成物とを
含有する反応混合物を中空繊維膜の外側に供給し、中空
繊維膜内から透過液として反応混合物を得ることもでき
る。

更に、本発明の方法によれば、酵素反応後の反応混合物
に基質が尚残存している場合、基質と反応生成物との間
に大きい分子量差があれば、用いる透過膜を選択するこ
とにより、反応生成物のみを分離し、基質を固定化酵素
の分散液と共に反応容器に戻して、再び酵素反応を行な
わせることもできる。

以上のように、本発明の方法によれば、酵素は水分散型
高分子重合体粒子に固定化され、この粒子の分散液とし
て反応系に供されるため、遊離の酵素と同様に反応系で
自由に移動することかでき、従って、固定化酵素が反応
系で固定されている従来の酵素反応方法と興なり、基質
が高分子量である場合にも基質は容易に拡散することが
でき、酵素反応は速やかに行なわれる。しかも、本発明
の方法においては、酵素は基質や反応生成物と比べれば
格段に大きい水分散型重合体粒子に固定化されているた
めに、遊離の酵素を用いる場合と興なって、比較的大き
い孔径を有する透過膜によって固定化酵素を反応生成物
から完全に分離することができると共に、透過液量を大
きく維持することができるので、固定化酵素と反応生成
物の分離を効率よく行なうことができる。更に、遊離の
酵素を用いる場合と異なり、酵素が重合体粒子に固定化
されているので、酵素か反応生成物中に溶出して失なわ
れることもなく、また、酵素自体か安定に保たれ、何度
でも繰返して使用できるので、酵素反応の経済性も著し
く改善される。

以下に実施例を挙げて本発明の詳細な説明するか、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 カルボ牛シル基を有する単量体としてアクリル酸３ｆと
、これに共重合可能な単量体としてメチルメタクリレー
ト９７ｆを蒸留水３００ｆに加え、過硫酸アンモニウム
０．３　　を水１０ｙに溶解した重合開始剤水溶液７０
℃で窒素気流下に加え、１２０ｒｐｍで攪拌しつつ８時
間重合させて、平均粒径０．２５μの水分散型高分子重
合体粒子の分散液を得た。この分散液１００ｆを遠心分
離し、水溶性重合体及び開始剤による電解質を含む上澄
を除去した後、沈降粒子を再び蒸留水ＩＱ□ｇＪで分散
させた。

Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−【β−（Ｎ−メチルモルフ
ォリノ］エチル〕カルボジイミド−ｐ−トルエンスルホ
ネート２．０．　　を水６０　ｄに溶解し、塩酸でｐＨ
５，０に調整したカルボジイミド水溶液を上記水分散液
に加え、更に、−一ア窒ラーゼ１．Ｏｆを水５０　ｄに
溶解し、塩酸でｐｕ　ｓ、ｏに調整した酵素溶液を加え
、５℃の温度で２４時間反応させた。反応後、分散液を
遠心分離して、未反応のカルボジイミドと未固定の酵素
を含有する上澄を除いて、ａ−アミラーゼが共有結合に
て固定化されている水分散型高分子重合体粒子を得た。

この固定化酵素におけるα−アミラーゼの固定化量は重
−合体粒子１１当り２０１ｑであった。

この固定化酵素を塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及び
酢酸カルシウムをそれぞれ０．１Ｍ、　０．０２Ｍ及び
０．００１　Ｍになるように溶解し、ｐＨを７．０に調
整した緩衝液１００１１ｊに分散させ、緩衝液に溶解し
た４襲パレイシＷデンプン水溶液１１に上記固定化酵素
の分散液を加え、反応容器中、攪拌下に５０℃で１時間
反応させた後、膜処理により固定化酵素を反応混合物か
ら分離した。

透過膜としてエチレン含量３０モル囁のエチレン−酢酸
ビニル共重合体ケン化物からなる長さ２０備の中空繊維
膜（微孔孔径０．１μ、外径１０００μ、膜厚１５０　
ｐ）　５００本を図示したようにモジュールに組込んだ
。このモジュールの開口５に反応混合物を２００１Ｌ７
７分の割合で０．５？／−の圧力で供給し、約２時間循
環し、固定化酵素を含む膜部透過液が２００−にまで濃
縮されたときに膜処理を終え・た。この間の透過液量は
平均で１０　Ｍｌ１分であった。

このようにして回収した固定化酵素により新しく調製し
た４襲バレイシーデンプン水溶液の酵素反応を行なった
後、再び同様にして固定化酵素、を膜分離により回収し
た。このような操作を５回繰返して行なったが、この間
、固定化酵素の活性の低下は認められず、しかも、膜透
過液中には遊離の酵素か全（認められなかった。また、
膜透過液についてフェノール硫酸法で全糖量を測定した
結果、酵素反応に供したデンプン溶液とほぼ同じ値が得
られると共に、ヨウ素による発色が全（認められないこ
とから、反応に供したデンプンはすべて酵素により分解
され、その全量か膜透過液中に得られたことか判明した
。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の方法の一実施例として、中空繊維膜モジ
ュールにより酵素反応混合物から重合体粒子に酵素を固
定した固定化１ＩＩＡを分離する装置構成を示す。 ｌ・−・酵素反応容器、２・・・ケーシング、３・・・
シール材、４・・・中空繊維膜、５．６−・開口、７・
・・側管。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）水分散型高分子重合体粒子に酵素を固定した固定
   化酵素の分散液を基質溶液と混合して酵素反応を行なわ
   せた後、この固定化酵素を透過させない透過膜にて固定
   化酵素を分離することを特徴とする酵素反応方法。
2. （２）　　水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μ
   の粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲４１１
   項記載の酵素反応方法。