JPS58149681A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素のＩＩ造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も行なわれているか、従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、水溶液中で反応を行なわせている。しかし、こ
のような方法によれば、反応条件を一定に維持しつつ、
新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失活さ
せることな（、生成物と酵素を分離することか非常に困
難であり、酵素か不経済に消費される。そのうえ、反応
か仲１分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するため、既に種々の方法にて酵
素を担体に固定化し、この固定化酵素に職質を反応させ
ることか提案されている。このような酵素の固定化方法
の一つとして、水不溶性の担体に酵素を共臀結合、イオ
ン結合又は物理吸着にて結合させる担体結合法か知られ
ている。しかし、従来、この方法において用いられてい
る担体は、通常、セルロース、デキストラン、アガロー
ス等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔
性ガラス等の径１謔乃至数■の粒子であり、このような
粒子暑ζ酵素が固定化された固定化酵素は通常、カラム
に充填され、固定されて、基質溶液と接触されるので、
基質か高分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し難（、
反応に長時間を要すると共に反応収率か低いという問題
かある。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散か殆ど問
題にならない高活性の固定化酵素の製造方法を提供する
ことを目的とする。

本発明による固定化酵素の製造方法は、（ａ）アクリロ
ニトリル及び／又はメタクリロートリル１〜６０重置襲
、（ｂ）多官能性内部架橋用単量体１〜２゜重家計、及
び（Ｃ）これらの単量体と共重合し得るラジカル重合性
単量体１０〜９８重量２とを、末端に酵素の固定化に利
用し得る官能基を有する水溶性重合開始剤によ１て水媒
体中で乳化共重合させて水分散型高分子重合体粒子を得
、次にこの重合体粒子がその末端に有する重合開始剤か
らの上記官能基に酵素を結合することを特徴とする。

本発明に寥いて用いる水分散型高分子重合体粒子の調製
に当っては、単量体組成としてアクリロニトリル及び／
又はメタクリロニトリル１〜６０＊＊％、好ましくは５
〜４０１ｒ！％を後述する他のラジカル重合性単量体と
乳化共重合させる。　″本発明において用いる水分散型
高分子重合体粒子の乳化重合においては、得られる重合
体粒子に乳化剤が混入していると、酵素か失活する等の
有害な影響かあられれることがあるので、乳化剤を用い
ないのが好ましい。このように乳化剤を用いずに乳化共
重合を行なった場合、重合は水相中で開始される。即ち
、水溶性重合開始剤が水に溶解している少なくとも一部
の単量体を重合させ、ここに生じた低分子量の重合体ラ
ジカルか高分子化し、水不溶化して粒子を形成し、この
粒子に単量体が吸着されて重合の場か形成され、ここで
重合か進行して水分散型高分子重合体粒子が生じる。

この場合に、重合初期の水溶性の低分子量重合体が系に
残存するときは、一部は水不溶性の高分子重合体粒子の
表面に吸着されて残り、これを担体として酵素を固定化
すると、この水溶性重合体にも酵素が固定化される。こ
のように水、溶性重合体を含む担体番ζ酵素か固定化さ
れた固定化酵素は、酵素反応の際に水不溶性の水分散型
高分子重合体粒子から溶出し、固定化酵素自体の活性の
経時低下が着しいうえに、基質や反応生成物と混合する
ので、反応後にその分離を要する等の檀々の不都合が生
じる。

し゛かしなから、本発明に従って、アクリロニトリル及
び／又はメタクリロニトリル′を多官能性架橋用単量体
と、これらと共重合性を有するラジカル重合性単量体と
共に、水溶性開始剤を用い、乳化剤の不存在下に水媒体
中で乳化共重合させると、重合の安定性が確保されると
共に、望ましくない水溶性低分子量重合体の生成が抑止
される。このような結果か得られる理由は明確ではない
か、重合初期に生じる水溶性の重合体ラジカルにアクリ
ロニトリル又はメタクリロニトリルと多官能性架橋用用
量体が有効に共重合して水不溶化すると共に、重合を安
定化させるのであろう。従って、アクリロニトリル又は
メタクリロニトリルの量が上記範囲より少なすぎるとき
、又は多すぎるときは、重合の安定性か損なわれる。

本発明においては、上記したように乳化重合に際して乳
化剤を用いないのか好ましく、また、乳化剤の不存在下
に安定に乳化重合させることができるか、しかし、乳化
剤が酵素に対して有害な影響を与えなければ乳化剤を必
要に応じて用いてもよい。

本発明の方法においては、更に水分散型高分子重合体粒
子を得るに際して、ラジカル重合性多官能性内部架橋用
単量体を単量体組成において１〜２０ｔｆｒ％、好まし
くは２〜ｌＯ重量襲用いられる。

多官能性内部架橋用単量体としては多価アルコールのポ
リ（メタノアクリレートか好ましく、具体的にはエチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコー
ルジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメタク
リレ−）、１．３−ブチレングリコールジメタクリレー
ト、トリエチレングリコールジアクリレート、トリメチ
ロールプロパントリメタクリレート、トリメチロールプ
ロパントリアクリレート、テトラメチロールメタンテト
ラアクリレート等が用いられる。ジビニルベンゼンも用
いられる。前記した理由から、内部架橋用単量体が少な
すぎるときは水溶性重合体の副生が多（なり、一方、多
すぎるときは重合が安定性に欠けるようになる。

更に、本発明の方法においては、単量体組成として、ア
クリロニトリル、メタクリロニトリル及び上記多官能性
内部架橋用単量体と共重合し得るラジカル重合性単量体
か１０〜９８ｔ１％、好ましくは２０〜９０８１１％用
いられる。このラジカル重合性単竜体としてはアクリロ
ニトリル、メタクリロニトリル及び内部架橋用単量体と
共重合性を有する限りは特に制限されることな（、種々
の単量体か用いられるが、好ましくはエチレン、プロピ
レン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン峻ビニル、
アクリル峻エステル、メタクリル酸エステル、スチレン
、メチルスチレン、ビニルトルエン、ブタジェン、イソ
プレン、アクリルア業ド、メタクリルアミド等の一種又
は二種以上が用いられる。特に、アクリル峻エステル、
メタクリル酸エステル又はスチレンが好ましく用いられ
る。これらの共重合性単量体は、得られる共重合体か酵
素反応の行なわれる温度より高いガラス転移点を有する
ように選ばれる。

本発明において用いる水溶性重合開始剤は、その末端に
酵素の固定化に利用し得る官能基を有することを要する
。このような官能基としては例えはスルホン酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基等を繕げることができ、スルホン
酸基を有する水溶性重合開始剤として過硫酸カリウム、
過硫酸アンモニウム等の過硫峻塩、アミノ基を有する水
溶性重合開始剤として２，２′−アゾビスイソブチルア
ミジウム塩酸塩、カルボキシル基を有する水溶性重合開
始剤として４．４′−アゾビスシアノパレリアン峻を挙
げることかできる。重合開始剤の使用量は、通常、乳化
共重合させる全単量体１００重量部当り０．０５〜２重
量部、好ましくは０．１〜１．０重量部であり、重合温
度は用いる重合開始剤に応じて適宜に選ばれる。

本発明による方法においては、前記単量体組成により好
ましくは乳化剤を用いることな（、上記のような水溶性
重合開始剤を用いて乳化共重合させると、前記したよう
に重合は水相で開始され、生じた重合体末端はその開始
剤に由来する極性の官能基により、主として重合体粒子
の表面に局在化する。本発明の方法は、重合開始剤に由
来するこの官能基がその表面に局在して存在する水分散
型高分子重合体粒子を担体とし、これに酵素を固定化す
る。

本発明において水分散型高分子重合体粒子の平均粒径は
０．０３〜２μ、好ましくは０１０７〜ｌＰである。粒
径が小さすぎると、固定化酵素を水中に分散させて酵素
反応を行なわせた後の回収が困難となり、−万、粒径が
大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積が小さくなり
、酵素の固定化量が少なくなると共に、水中に分散させ
るのか困難となるので好まシフない。

重合開始剤に由来する官能基への酵素の固定化は、その
官能基の種類に応じて、イオン結合又は共有結合のいず
れでも採用できる。

表面に上記官能基を有する水分散型高分子粒子に酵素を
イオン結合するには、酵素の失活が起こらない温度、ｐ
Ｈ等適当な条件で重合体粒子の分散液と酵素溶液とを混
合すればよい。例えば、ｐＨは酵素の等重点、極性の官
能基の種類等に応じて適宜に定められるか、一般的には
５〜８か好ましい。

このようにして酵素を重合体粒子にイオン結合した後、
固定されていない酵素を遠心分離、膜分離等によって除
去すれば、本発明による固定化酵素か得られる。

一方、共有結合により酵素を水分散型高分子重合体粒子
に固定化する場合にも、重合体粒子の有する官能基の種
類に応じ、従来より知られている任意の方法によること
ができる。例えば、一つの方法として、水溶性カルボジ
イミドを用いて、酵素のアミノ基と水分散型高分子重合
体粒子表面のカルボキシル基とを直接アミド結合を形成
させること＋Ｃより結合させることができる。水溶性カ
ルボジイミドとしては、例えば１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸Ｌ　　１
−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カル
ボジイミド−メト−１）−）ルエンスルホン酸等を挙げ
ることかできる。このような水溶性カルボジイミドを用
いる酵素固定化は従来知られている通常の条件の下で行
なわれ、例えば水分散型高分子重合体粒子の有するカル
ボキシル基の３〜５０倍当童のカルボジイミドを用い、
５℃程度の温度、ｐＨを４．５〜６．０に保持して酵素
を一夜混合反応させればよい。

第二の方法として、水分散型高分子重合体粒子表面のカ
ルボキシル基にＮ−ヒドロキシスクシンイミドをカルボ
ジイミドの存在下に反応させた後、酵素のアミノ基を反
応させ、共有結合を形成させることができる。更に、第
三の方法として、水分散型高分子重合体粒子表面のカル
ボキシル基にジアミンを作用させて、重合体粒子表面に
アミノ基を導入し、このアミノ基により酵素を共有結合
で固定化することもできる０例えば、前記したカルボジ
イミドを用いて、酵素のカルボキシル基を重合体粒子表
面のアミノ基に反応させることかでき、また、グルタル
アルデヒドのような架橋試薬を用いて、酵素のアミノ基
を重合体粒子に結合させることかできる。ジアルデヒド
を架橋試薬として用いる場合には、重合体粒子の有する
アミノ基に対して過剰量を反応させ、重合体粒子に一方
のアルデヒド基により結合したジアルデヒドの他方の遊
離アルデヒド基に酵素のアミノ結合を反応させる。

また、第四の方法としてジアゾカフプリング法によるこ
ともできる。例えば、アミ７基を導入した重合体粒子に
ｐ−ニトロベンズアルデヒドを反応、結合させ、次にニ
トロ基を通常の方法、例えば水素化ホウ素ナトリウムと
亜ニチオン酸ナトリウムによってアミノ基に還元しこの
アミノ基を亜硝酸ナトリウムによってジアゾニウム基と
し、これを酵素のアミノ基とジアゾカフプリングさせる
のである。

以上のようにして酵素を重合体粒子に共有結合させた後
、用いた反応試薬や固定化されていない酵素を遠心分離
、膜分離等によって除去すれば、本発明の固定化酵素が
得られる。

本発明の固定化酵素は分散液として用いられ、基質と接
触される。固定化酵素の使用量は、固定化酵素の粒径や
酵素の固定化量、必要とする反応速度、基質濃度等によ
り適宜に決定され・°る。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素でよ（、
菌体外酵素でもよい。また、酵素は必らずしも高度に精
製されている必、要はなく、抽出液や部分精製品も用い
られる。更に、不発明に従って単一の酵素を固定化して
もよいか、複数の酵素を同定化してもよい。酵素の具体
例としては、アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、キサ
ンチンオ牛シダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、グル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン間デ
ヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、子ロシナ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、６−
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーセ、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのような酸化連光酵素、アスパラギン酸アセチ
ルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランス
フェラーゼ、グリシンアミノトランスフェラーゼ、グル
タミン酸−オキザロ酢酸アミノトランスフェラーゼ、グ
ルタミン酸−ピルビン酸アミノトランスフェラーセ、ク
レアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトランスフ
ェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、δ−リジンアセチルトランスフェラーゼ
、ロイシンアミノペプナダーゼのような転移酵素、アス
パラギナーゼ、ｒセチルコリンエステラーゼ、アミノア
シラーゼ、ｒミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アラニンラ
セマ−ゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、
ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−がラクトシダーゼ、
カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、トロンビ
ン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダーゼ、パパイン、ヒ
ヤウロニダーゼ、プラスミン、ペクチナーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、ペプシン、ペクチナーゼ、ペニシリンアミダー
ゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、ラクターゼ、リ
パーゼ、す求ヌクレアーゼ、レンニンのヨウ１Ｎ加水分
解酵素、アスパラギン酸デカルボ牛シラーゼ、アスパル
ターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカルボキシ
ラーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、フェニルアラ
ニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フマール峻ヒド
ラターゼ、リンコ酸シンテターゼのようなリアーゼ、ア
ラニンラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコー
スホスフェートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ
、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼのような異性
化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタチオンシンタ
ーゼ、ピルビン酸シンターゼのようなりガーゼ等を挙げ
ることかできる。

本発明による固定化酵素は、以上のように、用いた重合
開始剤に由来する官能基を粒子表面に有する水分散型高
分子重合体粒子に上記官能基を介して酵素か共有結合又
はイオン結合にて固定化されており、従来のセルロース
誘導体担体粒子等の場合と興なり、固定化酵素自体か遊
離の酵素と同様に反応系内を自由に移動できるため、基
質の拡敞が反応に殆ど影響を与えず、従って、高分子量
の基質の場合にも遊離の酵素と同様の高い反応速度で酵
素反応を行なわせることかできる。しかも、酵素は担体
に固定化されているため、酵素反応後には遠心分離、塩
析、凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等
によって容易に回収でき、長期間にわたって繰返して使
用することができる。

更に、本発明において用いる担体としての水分散性高分
子重合体粒子は、その製造面からみれば、乳化剤を用い
ることなく、且つ、望ましくない水溶性重合体の生成な
く、安定に乳化共重合にて得ることができる。また、ア
クリロニトリル又はメタクリレートリルと内部架橋用単
量体を併用することにより、得られる水分散型高分子重
合体粒子は強度か大きいと共に、粒子相互の粘着も起ら
ｆｊい。

実施例１ アクリロニトリル１５ｇ、　　）リエチレングリコール
ジ〆タクリレート２ｆ及びメチルメタクリレート８３ｇ
を蒸留水２３０Ｆに加え、２．２′−アゾビスイソブチ
ルアミジウム塩酸塩０．２ｇを水ｌｏｇに溶解した重合
開始剤水溶液を６０”Ｃの温度で窒素気流下に加え、１
２０ｒＤＩで攪拌しつつ８時間重合させて、固形分３０
％、粒子表面に開始剤に由来するアミノ基を有する平均
粒径０．４μの重合体粒子の水分散液を得た。

この重合体粒子の水分散液１００１１／にグルタルアル
デヒドの２％水溶液３０Ｍ１を加え、室温で２時間反応
させた後、遠心分離により精製し、アルデヒド基を有す
る水分散型高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子を水１００−に再分散させ、ウレアーゼ
２ｆを緩衝液２０ｄに溶解した酵素水溶液を加え、５℃
の温度で２４時間反応させて、ウレアーゼを重合体粒子
に固定化した。反応終了後、遠心分離して沈降した重合
体粒子を０．１　Ｍ　ＩＪン酸水素二カリウム及び０．
１Ｍリン酸二水素カリウムから調製した緩衝液（ｐＨ７
，０３で洗滌し、未固定のウレアーゼを除去し、再び緩
衝液に分散させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合体粒子１
ｆ当り２２ＩＩＩＩＩＰであり、活性収率は３５％であ
った。

尚、活性収率とは固定化された酵素の活性の理論量に対
する実際の活性の割合を意味する。ここでは、活性収率
は０．０３Ｍの尿素水溶液を基質とし、３５℃で１０分
間固定化酵素を反応させ、生成したアンモニア量（μ七
ル／分］を塩酸滴定で求めて活性を測定し、これと等し
い活性を有する遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求
めた。

実施例２ アクリロニトリル２０ｇ、ジビニルベンゼン２ｇ　。

メチルメタクリレート３５１及びスチレン４３Ｉを蒸留
水２３０ｆに加え、４．４’−アゾビスシアノパレリア
ン酸０．３１を水２０　ｄに溶解した重合開始剤水溶液
を窒素気流下７０℃の温度で加え、１２０ｎｍで攪拌し
つつ８時間重合させて、固形分３０％、粒子表面に開始
剤に由来するカルボキシル基を有する平均粒径０．４μ
の重合体粒子の水分散液を得た。

この分散液１００履Ｉにα−キモトリプシン２ｆを０．
０５Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．０５　Ｍリン酸水
素二カリウムから調製した緩衝液（ｐＨ７７５０ｄに溶
解した酵素溶液を加え、５℃で２４時間放置後、遠心分
離した。沈降した重合体膣、子を緩衝液にて洗滌して未
固定のα−キモトリプシンを除去し、再び緩衝液に分散
亭せて本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のα−キモトリプシンの固定化量は重合
体粒子１１当り２５■であり、活性収率は９０％であっ
た。活性収率は、０．０５　ｍＭのＮ−アセチルーＬ−
チロシンエチルエステルを基質として３０℃で酵素を反
応させ、アルカリ滴定によるカルボキシル基生成速度（
μモル／分Ｊから求めた。

実施例３ アクリロニトリル３０ｙ、　　）リメチロールプロパン
トリメタクリレート５ｆ及びメチルメタクリレ）　６５
１を蒸留水２３０ｇに加え、過硫酸アンモニウム０．３
ｆを水１０ｙに溶解した重合開始剤水溶液を７０℃の温
度で窒素気流下に加え、１２０ｒＤＩで攪拌しつつ８時
間重合させて、固形分３０％、粒子表面に開始剤に由来
するスルホン駿基を有する平均粒径０．３μの重合体粒
子の水分散液を得た。

この分散液１００−に、トリプシン２ｆを０．１Ｍリン
酸水素二カリウムおよび０．１Ｍリン酸二水素カリウム
から調製した緩衝液（ｐＨ７，ＯＪ　５０　ｔ／に溶解
した酵素溶液を加え、５℃で２４時間放置し、トリプシ
ンをイオン結合により固定した後、遠心分離した。沈降
した重合体粒子を緩衝液にて洗滌して未固定のトリプシ
ンを除去し、再び緩衝液に分散させて本発明による固定
化酵素を得た。

この固定化酵素のトリプシンの固定化量は重合体粒子１
ｆ当り１５岬であり、活性収率は９０％であった。尚、
ｌｔｓカゼイン水溶液を基質として酵素を３５°Ｃで１
０分間反応させた後、５囁トリクロル酢酸により高分子
量タンパク質を沈殿させ。

遊離の非タンパク性分解質量を２８０面の吸光度から求
め、この吸光度を１分間に１．０増加させる活性を１単
位として、活性収率を求めた。

特許出願人　　　日東電気工業株式会社代理人　弁理士
牧野逸部

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１１　　（ａ）アクリロニトリル及び／又はメタクリ
   ロニトリル１〜６０重量第、（６）多官能性内部架橋用
   単量体１〜２０重量囁、及び（ｃ）これらの単量体と共
   重合し得るラジカル重合性単量体ｌＯ〜９８重家計とを
   、末端に酵素の固定化に利用し得る官能基を有する水溶
   性重合開始剤によって水媒体中で乳化共重合させて水分
   散型高分子重合体粒子を得、次にこの重合体粒子がその
   末端に有する上記重合開始剤からの官能基に酵素を結合
   することを特徴とする固定化酵素の製造方法。 （２）水溶性重合開始剤がその末端に官能基としてアミ
   ノ基を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の固定化酵素の製造方法。 （３）　　水溶性重合開始剤がその申端に官能基として
   カルボキシル基を有することを特徴とする特＃ｔ−請求
   の範囲第１項記載の固定化酵素の製造方法。 （４）水溶性重合開始剤かその末端に官能基としてスル
   ホン酸基を頁することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の固定化酵素の製造方法。 （５）水溶性重合開始剤が２，２′−アゾビスイソブチ
   ルアミジウム塩酸塩であることを特徴とする特許請求の
   範囲第２項記載の固定化酵素の製造方法。 （６）水溶性重合開始剤か４，４′−アゾビスシアノバ
   レリアン酸であることを特徴とする特許請求の範囲第３
   項記載の固定化酵素の製造方法。 （７）水溶性重合開始剤が過硫酸塩であることを特徴と
   する特許請求の範囲第４項記載の固定化酵素の製造方法
   。 （８）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の固定化酵素の製造方法。 （９）　　ラジカル重合性単量体がアクリル酸エステル
   、メタクリル酸エステル又はスチレンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製造方
   法。 叫　多官能性内部架橋用単量体が多価アルコールのポリ
   アクリレート又はポリメタクリレートであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製造方
   法。