JPH0412952B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水に不溶の蛋白質物、その製法及び
酵素反応を行うためこの物質の使用に関する。

酵素を結合し又は酵素を固定するための担体は
既知である（デヘマ・モノグラフイ84巻、フエル
ラークヘミー1979年版145頁以下；「イムモビライ
ズド・エンザイムス」ジヨン・ウイリー・アンド
サンズ社1978年版参照）。従来酵素の吸着のため
実際には、生体高分子又は変性生体高分子を基礎
とする担体、たとえばDEAE−セルロース又は
DEAE−セフアロースが用いられた（エンツイモ
ロギア31巻、214頁1969年；バイオテクノロジ
ー・アンド・バイオエンジニアリング９巻、603
頁1967年参照）。しかしこれらの担体は、機械的
安定性が低く流体力学上の性質も悪く、さらにそ
の製造は多額の費用を要しかつ煩雑である。これ
らは結局容易に微生物に侵されて変質する。

したがつて本発明の課題は、前記の欠点をほと
んど除かれた重合物と活性蛋白質とからの結合体
を提供することであつた。

本発明者らは、Ｎ−ビニルイミダゾール及び／
又は置換Ｎ−ビニルイミダゾール及びこれと共重
合しうる単量体からの共重合物を基礎とする水に
不溶で水中に膨潤する共重合物に、蛋白質を結合
して含有させるとき、水に不溶の担体上の生物学
的に活性の蛋白質から成る、水に不溶で膨潤可能
な蛋白質物により、前記の課題が解決されること
を見出した。

蛋白質物のための担体として役立つ共重合物
は、10重量％以上好ましくは30重量％以上のＮ−
ビニルイミダゾール又は置換Ｎ−ビニルイミダゾ
ールを含有する。置換Ｎ−ビニルイミダゾールと
しては、特に２−メチル−、４−メチル−、２−
エチル−、２−プロピル−、２−イソプロピル−
及び２−フエニル−１−ビニルイミダゾールが用
いられる。

重合体の水不溶性は特に、Ｎ−ビニルイミダゾ
ールの又は対応する誘導体のビニル基と共重合し
うるオレフイン性不飽和結合を２個以上有する単
量体を、１〜70重量％好ましくは３〜20重量％添
加することにより達成される。下記の単量体が特
に適している。２個又はそれ以上のビニル基を含
有するベンゾール誘導体好ましくはジビニルベン
ゾール、アクリル酸又はメタクリル酸の多官能性
エステルたとえばブタンジオールジアクリレー
ト、２個以上の不飽和基を有する尿素誘導体たと
えばジビニルエチレン尿素又はジビニルプロピレ
ン尿素、又はビスアクリルアミドたとえばメチレ
ンビスアクリルアミド又はエチレンビスアクリル
アミド。

Ｎ−ビニルイミダゾール及びジニルベンゾール
と共重合しうる他の単量体を、89重量％までの量
で重合含有させることも可能である。これらは場
合により架橋しないでも実際上の目的に役立つ充
分な水不溶性（水に不溶であるだけで、他の溶剤
に不溶ではない）を与えうる。この種の単量体
は、たとえばスチロール、（C₁〜C₄−アルキル）
−スチロール、アクリル酸もしくはメタクリル
酸、それらのアルキルエステル、特に親水性エス
テルたとえばヒドロキシアルキルエステル又はア
ミノアルキルエステル、他のビニル複素環化合物
たとえばＮ−ビニルピロリド及びビニルピリジン
である。もちろん20％を越える量でのコモノマー
の添加は、多くの場合に吸着性の減少を来たす。
ジビニルベンゾールを他の架橋剤たとえばブタン
ジオールジアクリレート、ジビニルエチレン尿素
又はメチレンビスアクリルアミドで置き換える
と、良好な結果を多少減少することがある。

蛋白質を吸着するため好適な前記種類の担体
は、ラジカル重合により入手できる。たとえば単
量体の混合物を、多孔質にするが重合しない添加
物質を場合により添加し、好適なラジカル生成剤
たとえばアゾ化合物又は過酸化物により、高めら
れた温度で重合させる。この種の重合はたとえば
西ドイツ特許出願公告2506085号明細書に記載さ
れている。重合を溶剤中で（ビニルイミダゾール
の場合は特に水中で）同時に水溶性の開始剤を使
用して行なうと、重合物がゲルとして得られる
（米国特許2878183号明細書）。溶剤に単量体のみ
が可溶で重合体は可溶でない溶液中の重合（沈殿
重合）も用いられる。粒状重合又は懸濁重合は、
この方法により重合物が使用に特に適する小粒状
で得られるので、好適である。この場合は単量体
混合物を好ましくは有機添加物質と一緒に、適当
な助剤（たとえば高分子のポリビニルピロリド
ン）を用いて水中で乳化し、単量体混合物中に溶
存するラジカル生成剤により重合させる。ビニル
イミダゾールが部分的に水に可溶であるため、水
相への塩の添加が好ましい（西ドイツ特許出願公
告1929501号明細書）。水性単量体相が不活性の外
相たとえば炭化水素の中で懸濁されている逆転懸
濁液による方法も、効果的に適用できる（西ドイ
ツ特許出願公開2324204号明細書）。

下記の実施例Ａ〜Ｈは、好適な重合体の製造を
説明するものである。

実施例 Ａ ラウロイルパーオキシド12部が溶解されてい
る、２−メチル−１−ビニルイミダゾール200部、
工業用ジビニルベンゾール（ジビニルベンゾール
50％、エチルビニルベンゾール50％から成る）
100部及び酢酸ブチル300部からの混合物を、ポリ
ビニルピロリドン（Ｍ＝10⁶）３部を含有する、
水2500部中のNa₂SO₄・10H₂O500部の溶液に分
散させ、８時間攪拌しながら80℃に加熱する。小
粒状の重合物を別し、水及びアセトンで洗浄し
たのち真空乾燥する。

実施例 Ｂ アゾイソブチロニトリル６部が溶解されている
Ｎ−ビニルイミダゾール100部、工業用ジビニル
ベンゾール50部及び酢酸エチル150部からの混合
物を、ポリビニルピロリドン（Ｍ＝10⁶）３部を
含有する、水1500部中のNa₂SO₄・10H₂O250部
の溶液に分散させ、実施例Ａと同様に重合を行
う。

実施例 Ｃ アゾイソブチロニトリル３部を含有する、Ｎ−
ビニルイミダゾール50部、工業用ジビニルベンゾ
ール31部及び酢酸エチル75部からの混合物を、
Na₂SO₄・10H₂O125部及びポリビニルピロリド
ン（Ｍ＝10⁶）２部が溶解された水1500部に分散
させ、実施例Ａと同様に重合を行う。

実施例 Ｄ ベンゾイルパーオキシド10部を含有する、２−
メチル−１−ビニルイミダゾール100部、Ｎ−ビ
ニルピロリドン100部、工業用ジビニルベンゾー
ル100部及びトルオール400部からの混合物を、水
2500部中の食塩500部及びポリビニルピロリドン
（Ｍ＝10⁶）３部の溶液に分散させ、実施例Ａと同
様に重合を行う。

実施例 Ｅ ベンゾイルパーオキシド４部を含有する、２−
メチル−１−ビニルイミダゾール45部、２−ヒド
ロキシエチルメタクリレート45部、工業用ジビニ
ルペンゾール10部及びｎ−オクタン100部からの
混合物を、水750部中の食塩200部及びポリビニル
ピロリドン（Ｍ＝10⁶）１部の溶液に分散させ、
実施例Ａと同様に重合を行う。

実施例 Ｆ ラウロイルパーオキシド４部を含有する、２−
メチル−１−ビニルイミダゾール90部、Ｎ，
N′−ジビニルエチレン尿素10部及び酢酸エチル
100部からの混合物を、水750部中のキサンタン１
部及び食塩200部の溶液に分散させ、実施例Ａと
同様に重合を行う。

実施例 Ｇ 水40部中のＮ−ビニルイミダゾール40部、メチ
レンビスアクリルアミド20部及びカリウムパーオ
キソジスルフアート５部の溶液を、窒素雰囲気下
で70℃に７時間加熱する。得られたゲルを粉砕
し、アセトンで洗浄したのち真空乾燥する。

実施例 Ｈ アゾイソブチロニトリル１部を含有する、Ｎ−
ビニルイミダゾール100部、工業用ジビニルベン
ゾール50部及び酢酸エチル150部からの混合物を、
窒素中で70℃に３時間加熱する。得られた重合物
を粉砕し、アセトンで洗浄したのち真空乾燥す
る。

重合物は、乾燥物１ｇ当り約２ないし25ml以上
の湿潤容積の水中膨潤能を有する。蛋白質受容は
一般によりよく膨潤しうる共重合物では、比較可
能な膨潤能の劣るものより高い。しかし蛋白質受
容と膨潤能との間に直接の関係はない。

ビニルイミダゾール含有共重合物の蛋白質受容
能力は、組成と架橋密度によつて変わる。そのほ
かそれは蛋白質の種類によつて種々異なる。蛋白
質によつて重合体の製造に際して、単量体が可溶
で重合体が不溶である不活性有機溶剤、たとえば
リグロイン、オクタン、トルオール、酢酸エチル
又は酢酸ブチルを重合混合物に添加することがで
き、それは吸着能力を改善する。この種の好適な
添加物質は、任意選択試験により容易に求めるこ
とができる。特に有利な場合には、乾燥重合物１
ｇ当り結合蛋白質５ｇ以上の吸着値に到達しう
る。

蛋白質による重合体吸着物質の負荷又は溶液か
らの蛋白質の除去は、蛋白質溶液に重合体を攪拌
混合すること又はたとえばカラム内で重合体に蛋
白質溶液を連続導通することにより行われる。吸
着された蛋白質が酵素であると、これは吸着され
た状態で一般に少なくとも最初の活性の一部を保
持する。このことは、対応する酵素反応を行うた
めにそれを不均一系触媒として用いることを可能
にする。たとえば酵素インベルターゼは、ビニル
イミダゾール含有重合体に吸着されたのち、約20
％の残留活性を有する。吸着された酵素の安定性
を高めるために、担体上の酵素を架橋することが
有利である。この目的に適合する試薬はたとえば
グルタルジアルデヒドである。生物学的に活性な
蛋白質とは主として酵素を意味する。

ビニルイミダゾールを含有する重合体に吸着さ
れうる酵素は、好ましくはインベルターゼ、グル
コースイソメラーゼ、アミログルコシダーゼ、α
−及びβ−アミラーゼ、アミノ酸アシラーゼ、ペ
ニシリンアシラーゼ及びヒダントインアーゼであ
る。さらに下記のものも適する。オキシドレダク
ターゼ類たとえばアルコールデヒドロゲナーゼ、
ラクテートデヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、サク
シネートデヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒド
ロゲナーゼ、ウリカーゼ、フエノールオキシダー
ゼ、カテコールオキシダーゼ、モノアミノオキシ
ダーゼ、リポキシゲナーゼ、ルシフエラーゼ、ニ
トラートレダクターゼ、ニトリツトレダクター
ゼ、クロルパーオキシダーゼ、アセトアルデヒド
デヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシゲナーゼ、
ジアホラーゼ、コレステリンオキシダーゼ、グル
タルチオレダクターゼ、ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ドパ
ミンヒドロキシラーゼ、チトクロームオキシダー
ゼ、モノアミノオキシダーゼ、ジアセチルレダク
ターゼ、スーパオキシドジスムターゼ、リモナー
トデヒドロゲナーゼ；トランスフエラーゼ類たと
えばポリヌクレオシドホスホラーゼ、デキストラ
ンスクラーゼ、ホスホリラーゼ、カルバメートキ
ナーゼ、アミノトランスフエラーゼ、トランスア
ルドラーゼ、メチルトランスフエラーゼ、ピルバ
ートキナーゼ、カルバモイルトランスフエラー
ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、デキストランシン
テターゼ；ヒドロラーゼ類たとえばリパーゼ、エ
ステラーゼ、ラクターゼ、リゾチーム、セルラー
ゼ、ウレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、
グルタミナーゼ、アスパラギナーゼ、パパイン、
フイチン、ペプシン、ロイシンアミノペプチダー
ゼ、カルボキシペプチダーゼＡ＋Ｂ、ナリンギナ
ーゼ、ブロメライン、スブチリシン、ホスホリフ
アーゼ、イソアミラーゼ、セフアホスポリンアミ
ダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ペニシリナー
ゼ、マルターゼ、デキストラナーゼ、デソキシリ
ボヌクレアーゼ、スルフアターゼ、プルラナー
ゼ、ホスフアターゼ、α−ガラクトシダーゼ、デ
キストラナーゼ、β−グルカナーゼ；リアーゼ類
たとえばトリプトフアナーゼ、チロシンデカルボ
キシラーゼ、オキシニトリルラーゼ、フエニルア
ラニンデカルボキシラーゼ、フエニルアラニンア
ンモニウムラーゼ、アミノ酸デカルボキシラー
ゼ、ピルバートデカルボキシラーゼ、フマラー
ゼ、エノラーゼ、アスパルターゼ、アミノレブリ
ンデヒドラターゼ、カルボアンヒドラターゼ；イ
ソメラーゼ類たとえばアミノ酸ラセマーゼ、トリ
オースフオスフアトイソメラーゼ；リガーゼ類た
とえばグルタチオンシンセターゼ。

本発明の製品は特に蛋白質の高含量を有し、そ
して良好な流体力学的性状と優れた機械的安定性
を示す。そのほかこれは製造が簡単である。

下記の実施例は蛋白質物の製造を説明するもの
である。

実施例 １ 実施例Ａにより製造された重合物（粒径250〜
500μｍ）100mgを、0.01％ヘモグロビン水溶液100
ml中で攪拌し、この溶液におけるヘモグロビンの
減少を光度計により追跡する。20分後に蛋白質の
15％が、60分後にはその47％が重合体に吸着され
る。

実施例 ２ 実施例Ｂにより製造された重合体（粒径250〜
500μｍ）100mgを、PH6.0の0.005M酢酸ナトリウ
ム緩衝液中の、α−アミラーゼ100mg（130単位／
mg）の溶液20mlの中で、４℃で64時間振動する。
次いで担体を、PH6.0の0.05M酢酸ナトリウム緩
衝液各50mlの中で、それぞれ室温で５分間ずつ２
回、及び１時間ずつ２回洗浄する。固定された酵
素活性を求めるために、担体を0.016Mの酢酸ナ
トリウム緩衝液（PH6.0）中の、ズルコウスキー
による澱粉（メルク社製）５ｇの溶液50mlの中で
30℃で30分間振動する。生じたオリゴサツカライ
ドを、ベレンフエルト法（メソツヅ・イン・エン
ザイモロジー１巻149頁、アカデミツク出版社
1955年）により３，５−ジニトロサリチル酸を用
いて定量する。担体の活性は、１ｇ及び１時間に
つき加水分解された澱粉3.0ｇである。

実施例 ３ 実施例Ｃにより製造された重合体（粒径250〜
500μｍ）200mgを、0.05M酢酸ナトリウム緩衝液
（PH4.8）中の、β−アミラーゼ（28単位／mg）
100mgの溶液20mlの中で、４℃で64時間振動する。
次いでPH4.8の0.05M酢酸ナトリウム緩衝液各50
mlの中で、担体を室温で５分間ずつ２回及び１時
間ずつ２回洗浄する。固定された酵素活性を求め
るために、担体を0.016M酢酸ナトリウム（PH
4.8）中のズルコウスキーによる澱粉（メルク社
製）５ｇの溶液50mlの中で、30℃で30分間振動す
る。生じたマルトースを、ベレンフエルト法（前
掲）により３，５−ジニトロサリチル酸を用いて
測定する。担体の活性は、１ｇ及び１時間につき
生成したマルトース2.3ｇである。

実施例 ４ 実施例Ｂにより製造された重合体（粒径250〜
500μｍ）200mgに、アミログルコシダーゼを実施
例２に記載の方法と同様にして結合させる。担体
の活性は、１ｇ及び１時間につき生成したグルコ
ース15.3ｇである。

実施例 ５ 実施例Ｄにより製造された重合体25mgを、イン
ベルターゼ（150単位／mg）250mgの溶液と共に４
℃で64時間振動する。次いで重合体を0.0025M酢
酸ナトリウム緩衝液（PH5.3）各100mlの中で、５
分間ずつ２回及び１時間１回洗浄する。この重合
体を、0.001M酢酸ナトリウム緩衝液（PH5.3）中
のしよ糖17.5ｇの溶液50mlの中で、10分間振動
し、加水分解度を施光計により測定する。担体の
活性は、１ｇ及び１時間につきしよ糖275ｇ、そ
して結合酵素量は、重合体１mg当り2.4mgである。

実施例 ６ 実施例５と同様にして、実施例Ｅにより製造さ
れた重合体25mgにインベルターゼを負荷する。担
体の活性は、１ｇ及び１時間につきしよ糖300ｇ、
そして結合酵素量は重合体１mg当り1.3mgである。

実施例 ７ 実施例５と同様にして、実施例Ｆにより製造さ
れた重合体25mgにインベルターゼを負荷する。重
合物の活性は、１ｇ及び１時間につきしよ糖194
ｇ、そして結合酵素量は重合体１mg当り1.5mgで
ある。

実施例 ８ 実施例５と同様にして、実施例Ｇにより得られ
た重合体25mgにインベルターゼを負荷する。その
活性は１ｇ及び１時間につきしよ糖150ｇである。

実施例 ９ 実施例５と同様にして、実施例Ｈにより得られ
た重合体25mgにインベルターゼを負荷する。その
活性は１ｇ及び１時間につきしよ糖６ｇである。

実施例 10 実施例Ｃにより製造された重合体１ｇに、実施
例５と同様にしてインベルターゼを負荷する。次
いで重合体をカラムに充填し、30℃の恒温にお
く。カラムを通じて、しよ糖640ｇ／のPH5.3に
調節した溶液を、100ml／時間の流速によりポン
プ循環させる。しよ糖の加水分解を施光計により
追跡する。１日後の加水分解度は92％、20日後は
38％である。

実施例 11 実施例10と同様にして負荷した担体を、0.1％
グルタルジアルデヒド水溶液20mlにより使用に先
立つて処理する。これによると１日後の加水分解
度は95％、20日後は85％である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｎ−ビニルイミダゾール又は置換Ｎ−ビニル
   イミダゾール少なくとも１種少なくとも10重量％
   及びこれと共重合しうる単量体１〜70重量％を含
   有する水不溶性共重合物に、蛋白質を結合して含
   有することを特徴とする、水に不溶の担体上の生
   物学的に活性な蛋白質から成る、水に不溶の蛋白
   質物。 ２ 共重合物として粒状重合物を含有することを
   特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の蛋白
   質物。 ３ 担体が共重合可能な単量体として、オレフイ
   ン性不飽和結合を２個以上有する成分を重合含有
   していることを特徴とする、特許請求の範囲第１
   項又は第２項記載の蛋白質物。 ４ 担体の不飽和結合を２個以上有する成分が、
   ジビニルスチロール、アクリル酸もしくはメタク
   リル酸の多官能性エステル、不飽和結合を２個以
   上有する尿素誘導体又はそのような酸アミドであ
   ることを特徴とする、特許請求の範囲第３項記載
   の蛋白質物。 ５ 担体が他のコモノマーとしてスチロール、
   C₁〜C₄−アルキル−スチロール、アクリル酸、
   メタクリル酸又はこれらのアルキルエステル又は
   アミノアルキルエステル又はビニル複素環化合物
   を重合含有していることを特徴とする、特許請求
   の範囲第４項記載の蛋白質物。