JP2007100035A - 有機ポリマー粒子およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の有機ポリマー粒子は、スチレン系重合体と、p−トルエンスルホニル基を有し、メタクリル酸メチル及びトリメチロールプロパントリメタクリレートを含有する重合性化合物の共重合体、とを含み、数平均粒径が0.1〜15μmである有機ポリマー粒子である。
【選択図】なし
Description
本発明の有機ポリマー粒子の数平均粒径(以下、単に「粒径」という。)は、通常、0.1〜15μmであり、好ましくは0.3〜10μmであり、より好ましくは1〜10μmである。粒径は、レーザ回折・散乱法により求める。ここで、粒径が0.1μm未満の場合、遠心分離などを用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため、目的外の分子(例えば、タンパク質などの生理活性物質)の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が15μmを超えると、表面積が小さくなり、ターゲットとするタンパク質などの生理活性物質の捕捉量が少ない場合がある。
本発明の有機ポリマー粒子は、(1)(A)ポリスチレン又はスチレン系共重合体と、(B’)メタクリル酸メチル、トリメチロールプロパントリメタクリレート及びグリシジル基を有する重合性モノマーを含有する重合性化合物の共重合体とを含んでなるベース粒子(以下、「有機ポリマー粒子1」ともいう。)を合成する工程、(2)有機ポリマー粒子1を硫酸処理して水酸基を有する粒子(以下、「有機ポリマー粒子2」ともいう。)を合成する工程、及び(3)有機ポリマー粒子2とp−トルエンスルホン酸塩とを反応させて、p−トルエンスルホニル基を有する本発明の有機ポリマー粒子(以下、「有機ポリマー粒子3」ともいう。)を合成する工程とを有する製造方法により得られる。以下に、各工程について、具体的に説明する。
磁性体を含有しない場合には、有機ポリマー粒子1は、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、懸濁重合などの定法を用いて製造が可能である。より具体的には、有機ポリマー粒子は、例えば、上記ビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることができる。例えば、有機ポリマー粒子1は、特公昭57−24369号公報記載のシード粒子を用いる二段膨潤重合法、ジャーナル・オブ・ポリマーサイエンス・ポリマーレター・エディション,937頁,第21巻,1963年(J. Polym. Sci., Polymer Letter Ed. 21,937(1963))記載の重合方法、特開昭61−215602号公報、特開昭61−215603号公報、および特開昭61−215604号公報記載の方法によって作製することができる。
工程(2)有機ポリマー粒子2の合成
有機ポリマー粒子1を硫酸処理することにより、有機ポリマー粒子1が有するグリシジル基が水酸基となる。すなわち、工程(2)は、有機ポリマー粒子1を構成する共重合体(B)が有するグリシジル基を開環して、水酸基とする工程である。硫酸処理は、例えば、0.05〜0.3mol/Lの硫酸中に有機ポリマー粒子1を分散し、室温〜80℃で1〜24時間反応させることにより行う。以上により、有機ポリマー粒子2が得られる。反応後の有機ポリマー粒子2の分散液は、蒸留水に分散し、遠心分離法等により洗浄を繰り返し、有機ポリマー粒子2の水分散体とした後、凍結乾燥法により水を実質的に除去することが好ましい。
有機ポリマー粒子2をp−トルエンスルホン酸塩とを反応させることにより、有機ポリマー粒子2が有する水酸基が、p−トルエンスルホニル基となる。p−トルエンスルホン酸塩としては、特に限定されないが、p−トルエンスルホン酸クロライド等を挙げることができる。工程(3)は、典型的には、有機ポリマー粒子2をピリジン等の有機溶剤に分散した後、有機ポリマー粒子100重量部当たり1〜50重量部のp−トルエンスルホン酸クロライドを添加し、室温で1〜6時間反応させることにより行う。以上により、有機ポリマー粒子3が得られる。反応後の有機ポリマー粒子3の分散液は、遠心分離法等により、アセトン洗浄と水洗を繰り返し、有機ポリマー粒子3の水分散体とすることが好ましい。
本発明の有機ポリマー粒子は、ターゲット分子の検出又は分離、特に、創薬分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として利用できる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、本実施例において、「%」および「部」は重量基準である。
合成例1:(磁性体を含有しない有機ポリマー粒子3の合成)
有機ポリマー粒子1を、シード粒子を用いる二段膨潤重合法で作製した。シード粒子として、ソープフリー重合で重合した粒子径0.98μmのポリスチレン粒子を用い、このポリスチレン粒子を水500gに窒素雰囲気下で分散させて水分散体(固形分量5.0g)を調製した。このシード粒子を用いて、二段膨潤重合法を用いて有機ポリマー粒子1を合成した。すなわち、このシード粒子に、一段目として有機溶剤(シェルゾールTK0.1g)、二段目としてメタクリル酸メチル(以下、「MMA」という。)50g、トリメチロールプロパントリメタクリレート(以下、「TMP」という。)10g、およびグリシジルメタクリレート(以下、「GMA」という。)40g)を加えてそれぞれ吸収させた後、AIBN(アゾビスイソブチロニトリル)を2g添加して75℃で24時間ゆっくり撹拌した。次に、この反応液を冷却した後、500メッシュ金網でろ過したところ、99%が通過し、良好な重合安定性であった。重合収率は99%であった。得られた有機ポリマー粒子1(以下A−1とする)の粒子径は2.64μmであり、粒子径の変動係数は2%であった。
合成例2:(磁性体を含有する有機ポリマー粒子3の合成)
75%ジ(3,5,5−トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド溶液(日本油脂製「パーロイル355−75(S)」2質量部を1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液20質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径0.77μmのポリスチレン粒子13質量部と水41質量部の入ったリアクターに入れ、25℃で12時間攪拌した。別の容器でスチレン96質量部、ジビニルベンゼン4質量部を0.1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液400質量部に乳化し、前記リアクターに入れ、40℃で2時間攪拌した後、75℃に昇温して8時間重合した。室温まで冷却後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これをコア粒子(以下、B−1とする。)とする(コアの作製)。数平均粒径は1.5μmであった。
合成例3:(抗体分子を感作した、磁性体を含有しない有機ポリマー粒子3の合成)
合成例1で得られた有機ポリマー粒子3(A−3)10mgをホウ酸緩衝液(0.1mol/L、pH9.5)溶液1.0mlに分散し、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン(以下、「AFP」という。)に対する抗体(以下、「抗AFP抗体」という。コスモ・バイオ株式会社製)100μgを加え18時間室温で反応した。反応後、粒子を遠心分離し、洗浄液(25mmol/L Tris−HCl,pH7.4、0.01%Tween20含有)で繰り返し洗浄した後、粒子濃度0.5%になるように洗浄液で希釈し、抗AFP抗体を感作した有機ポリマー粒子3(以下、A−4とする。)を得た。
合成例4:(抗体分子を感作した、磁性体を含有する有機ポリマー粒子3の合成)
有機ポリマー粒子(A−3)に替えて、合成例2で得られた、磁性体を含有する有機ポリマー粒子3(B−5)を用いた他は、実施例1と同様に、抗AFP抗体を感作した有機ポリマー粒子3(以下、B−6とする。)を得た。
比較合成例1:(抗体分子を感作した、磁性体を含有しない有機ポリマー粒子1の合成)
合成例1で得られたグリシジル基含有ポリマー粒子(A−1)10mgを1mol/L硫酸アンモニウム含有ホウ酸緩衝液(0.1mol/L、pH9.5)溶液1.0mlに分散し、抗AFP抗体100μgを加え18時間室温で反応した。反応後、粒子を遠心分離し、洗浄液(25mmol/L Tris−HCl,pH7.4、0.01%Tween20含有)で繰り返し洗浄した後、粒子濃度0.5%になるように洗浄液で希釈し、抗AFP抗体を感作した有機ポリマー粒子1(以下、C−1とする。)を得た。
比較合成例2:(抗体分子を感作した、磁性体を含有する粒子の合成)
カルボキシル基含有磁性粒子として、Dynabeads M270 Carboxylic Acid(粒子径2.7μm;DYNAL BIOTECH社)10mgをテストチューブに取り、1.0mlのMES緩衝溶液(5mmol/L,pH5.0)に分散させた。この磁性粒子分散液に、EDC塩酸塩(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩)2mgを加え、25℃で30分間転倒混和した。
(比較例1)
有機ポリマー粒子3(A−4)に替えて、比較合成例1で得られた、抗体分子を感作した、磁性体を含有しない有機ポリマー粒子1(C−1)を用いた他は、実施例1と同様にしてAFP感度曲線を作成した。結果は図1に示した。
(比較例2)
有機ポリマー粒子3(A−4)に替えて、比較合成例2で得られた、抗体分子を感作した、磁性体を含有する粒子(D−1)を用いた他は、実施例1と同様にしてAFP感度曲線を作成した。結果は図1に示した。
評価方法:
[AFPの感度曲線の作成]
抗AFP抗体を感作した各実施例・比較例の有機ポリマー粒子10μl(粒子50μg相当)をテストチューブに取り、ウシ胎児血清(FCS)で段階希釈したAFP抗原(日本バイオテスト社製)の標準検体50μlと混合し、37℃で10分間反応した。遠心して粒子を分離し上清を除いた後、2次抗体としてアルカリフォスファターゼ(以下、「ALP」という。)で標識した抗AFP抗体(富士レビオ株式会社製、ルミパルスAFP−Nに付属の試薬を使用)40μlを添加し、37℃で10分間反応した。遠心して粒子を分離し上清を除いた後、PBSで3回遠心洗浄を繰り返し、粒子を50μlの0.01%Tween20に分散し、新しいチューブに移し替えた。ALPの基質液(ルミパルス基質液:富士レビオ株式会社製)100μlを加え、37℃で10分間反応した後、化学発光量を測定した。化学発光の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置、Lumat LB9507を用いた。
[粒径]
レーザ回折式粒度分布測定装置((株)島津製作所製)SALD−200Vにより数平均粒径とその変動係数を測定した。
Claims (4)
- (A)ポリスチレン又はスチレン系共重合体と、(B)p−トルエンスルホニル基を有し、メタクリル酸メチル及びトリメチロールプロパントリメタクリレートを含有する重合性化合物の共重合体、とを含んでなる有機ポリマー粒子であって、レーザ回折・散乱法により求めた数平均粒径が0.1〜15μmである有機ポリマー粒子。
- 磁性体を含有する、請求項1に記載の有機ポリマー粒子。
- 請求項1又は2に記載の有機ポリマー粒子に、該有機ポリマー粒子の有するp−トルエンスルホニル基を介してリガンド分子を結合した、アフィニティー担体。
- (1)(A)ポリスチレン又はスチレン系共重合体と、(B’)メタクリル酸メチル、トリメチロールプロパントリメタクリレート及びグリシジル基を有する重合性モノマーを含有する重合性化合物の共重合体とを含んでなる有機ポリマー粒子1を合成する工程、
(2)有機ポリマー粒子1を硫酸処理して水酸基を有する有機ポリマー粒子2を得る工程、及び
(3)有機ポリマー粒子2とp−トルエンスルホン酸塩とを反応させて、p−トルエンスルホニル基を有する有機ポリマー粒子3を合成する工程
とを有することを特徴とする、レーザ回折・散乱法により求めた数平均粒径が0.1〜15μmである有機ポリマー粒子3の製造方法。
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