WO2006123686A1 - 担体ポリマー粒子およびその製造方法ならびに特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法 - Google Patents

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Tetsuo Fukuta
Kiyoshi Kasai
Toshihiro Ogawa
Satoshi Katayose
Kouji Tamori
Kinji Yamada
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    • Y10T428/2998—Coated including synthetic resin or polymer

Definitions

  • Carrier polymer particles and production method thereof, magnetic particles for specific capture and production method thereof are Carrier polymer particles and production method thereof, magnetic particles for specific capture and production method thereof
  • the present invention relates to carrier polymer particles in which the surface of organic polymer particles is coated with saccharides, a method for producing the same, magnetic particles for specific capture, and a method for producing the same.
  • affinity resin a porous gel such as agarose is generally used.
  • a phenomenon called so-called non-specific adsorption occurs, in which molecules other than the target substance are adsorbed to the affinity resin, resulting in difficulty in separation and purification of the target substance.
  • a certain proportion of the probe molecules bind to the inside of the porous gel, and as a result, such probe molecules have insufficient interaction with the target substance, resulting in a problem that the capture efficiency of the target substance is lowered.
  • carboxy group-modified polystyrene particles are widely used as bio-related substance carrier polymer particles to be sensitized by the chemical bonding method.
  • this polystyrene-based particle generally has a large adsorption (non-specific adsorption) of other non-target biological substances present in the test sample, which impairs the performance of the sensitized particle. This is a major obstacle to the use of particles.
  • the blocking method is used in which the remaining particle surface is first adsorbed with a less harmful protein such as urine serum albumin (BSA). It is difficult to sufficiently prevent nonspecific adsorption.
  • the polystyrene particles may have a styrene sulfonate or a polyalkylene oxide represented by the general formula (CH 2 CH 2 O) or (CH 2 CHCH 2 O).
  • An object of the present invention is to provide carrier polymer particles and a method for producing the same, in which non-specific adsorption of biological substances such as proteins is extremely small.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing carrier polymer particles with very little non-specific adsorption of biologically related substances such as proteins and high capture efficiency of the target substance.
  • an object of the present invention is to provide a magnetic particle for specific capture with very little non-specific adsorption of biologically relevant substances such as proteins, peptides, nucleic acids, and cells, and a method for producing the same.
  • the carrier polymer particles of the first aspect of the present invention include
  • Organic polymer particles having a particle size of 0.1-20 / ⁇ ⁇ ,
  • the organic polymer particles and the saccharide are chemically bonded.
  • the saccharide may be a polysaccharide.
  • the saccharide is carboxymethylated.
  • the chemical bond may be a bonding group including at least one of an amide bond and an ester bond.
  • a method for producing carrier polymer particles according to the second aspect of the present invention comprises:
  • the organic polymer particle when the chemical bonding is performed, the organic polymer particle has a first functional group, and the saccharide has a second functional group. And the said organic polymer particle and the said saccharide
  • the first functional group is at least one selected from a carboxyl group, an epoxy group, an amino group, and a tosyl group.
  • the method for producing carrier polymer particles according to the third aspect of the present invention comprises:
  • Organic polymer particles having a particle size of 0.1 to 20 ⁇ m and having a functional group having reactivity with a carboxyl group and an organic polymer particle having a carboxyl group are chemically bonded to the organic polymer particle. Coating the surface with the saccharide,
  • the saccharide may be a polysaccharide.
  • the chemical bond may be a bonding group including at least one of an amide bond and an ester bond.
  • the functional group having reactivity with the carboxyl group is at least one functional group selected from amino group, hydroxyl group and epoxy group power. Can do.
  • the method for producing carrier polymer particles may further include a step of chemically binding a probe for specifically capturing a target substance to the saccharide.
  • the magnetic particle for specific capture according to the fourth aspect of the present invention comprises:
  • the magnetic particles and the saccharide are chemically bonded, and a probe for specifically capturing the target substance is chemically bonded to the saccharide.
  • the saccharide may be a polysaccharide.
  • the saccharide may be carboxymethylated in the magnetic particles for specific capture.
  • the chemical bond of the magnetic particle and the saccharide can be based on a linking group containing at least one of an amide bond and an ester bond.
  • the magnetic particle is a core particle including a core particle and a magnetic layer formed on the surface of the core particle.
  • the polymer layer is formed by polymerization, and the magnetic layer is formed of Fe 2 O and Fe 2 O.
  • the probe may be at least one selected from a protein, a peptide, a nucleic acid, a sugar chain compound, and a synthetic chemical substance force.
  • the method for producing the magnetic particle for specific capture according to the fifth aspect of the present invention comprises:
  • the magnetic particles have a first functional group;
  • the saccharide has a second functional group;
  • the magnetic particles and the saccharide can be bound to each other.
  • the first functional group is at least one functional group selected from a force-loxyl group, an epoxy group, an amino group, and a tosyl group. Can be.
  • the carrier polymer particle the organic polymer particle having a particle size of 0.1 to 20 ⁇ m and the saccharide covering the surface of the organic polymer particle, the organic polymer particle and Since the saccharide is chemically bonded, it has a feature of low non-specific adsorption. Thereby, the target molecule can be easily separated and purified.
  • organic polymer particles having a particle size of 0.1 to 20 ⁇ m and having a functional group reactive with a carboxyl group, and a carboxyl group A step of coating the surface of the organic polymer particles with the saccharide by chemically bonding with the saccharide having, and a step of treating the organic polymer particles having the surface coated with the saccharide with a basic solution.
  • the magnetic particle for specific capture the magnetic particle having a particle size of 0.1 to 20 ⁇ m and a saccharide, the magnetic particle and the saccharide are chemically bonded, and
  • the probe for specifically capturing the target substance is chemically bonded to the saccharide, it has a feature that non-specific adsorption is small. Thereby, separation and purification of the target substance can be performed easily and with high accuracy.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing an example of a method for producing carrier polymer particles according to the first and second embodiments of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing an example of carrier polymer particles according to the first and second embodiments of the present invention.
  • Fig. 3 shows the specificity of the probe-bound particles obtained in Experimental Examples 8 and 9 and Comparative Example 4. 6 is a photograph showing the result of evaluation of capture ability (electrophoretic pattern of protein adsorbed on probe-bound particles).
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of evaluation of specific capture properties of the probe-bound particles obtained in Experimental Examples 10 and 11 and Comparative Example 7 (electrophoresis pattern of proteins adsorbed on the probe-bound particles).
  • the carrier polymer particles according to the first embodiment of the present invention include organic polymer particles having a particle size of 0.1 to 20 m and saccharides that coat the surface of the organic polymer particles.
  • organic polymer particles and saccharides are chemically bonded.
  • the chemical bond is preferably a bond group including at least one of an amide bond and an ester bond.
  • the carrier polymer particles according to the present embodiment can be used as they are, but in order to efficiently react with the compound, it may be used as a dispersion dispersed in a dispersion medium.
  • a dispersion medium include water, methanol, ethanol, propanol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, isobutyl alcohol, alcohols such as sec-butyl alcoholone, tert-butyl alcohol, ethylene glycolol, ethylene glycolol monomethyl.
  • Ethylene glycol monoethylenole etherenole Ethylene glycol nole monopropinore etherenore, Ethylene glycol nole monobutenoate ethere, Ethylene glycol monoethyl ether acetate, Diethylene glycol mononomonomethylenole
  • Ethylene glycol derivatives such as ether, diethylene glycol monoethyl ether, diethylene glycolo-resin methylol ether, diethylene glycol jetyl ether, propylene glycolo , Propylene glycol monomethyl ether, propylene glycol monomethyl E Chino les ether Honoré, propylene glycol Honoré monopropylate Honoré ether Honoré, propylene glycol Honoré monobutyl Honoré ether, professional such as propylene glycol Honoré mono-methylol Honoré ether Honoré acetate Pyrendalicol derivatives, ketones such as acetone, methyl
  • the particle size of the carrier polymer particles according to this embodiment is preferably 0.1 to 17 m, and more preferably 1 to 10 ⁇ m.
  • the particle size is less than 0.1 ⁇ m, it takes a long time for separation using centrifugal separation or the like, and the separation between the washing solvent such as water and the particles becomes insufficient. There may be cases where the removal of (for example, biological substances such as proteins) is insufficient and sufficient purification cannot be performed.
  • the particle diameter exceeds 17 m the surface area becomes small, and the amount of target substances such as proteins to be captured may be small.
  • the average particle diameter of the organic polymer particles used in the present embodiment is preferably 0.1 to 20 ⁇ m, more preferably 0.3 to 15 ⁇ m, and most preferably 1 to 10 ⁇ m.
  • the coefficient of variation of the organic polymer particles used in the present invention is usually 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less.
  • the organic polymer particles can be used as the base particles of the carrier polymer particles according to the present embodiment.
  • Organic polymer particles are suitable as base particles because they can be easily coated on the surface with saccharides bonded by chemical bonds.
  • magnetic particles can be used as the organic polymer particles.
  • the carrier polymer particles according to the present embodiment are dispersed in a solvent, if the organic polymer particles are dissolved in the dispersion medium or the organic polymer particles are swollen by the solvent, proteins or the like Non-specific adsorption of biological substances increases. For this reason, it is desirable that the organic polymer particles are not dissolved in the dispersion medium.
  • an aqueous medium can be used as the dispersion medium.
  • the aqueous medium is water or a mixture of water and a solvent that dissolves in water (for example, alcohols, alkylene glycol derivatives, etc.).
  • the polymer constituting the organic polymer particles is particularly preferably a bull polymer.
  • the bull monomers that constitute the bull polymers include aromatic bull monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, halogenated styrene, and dibylbenzene, bull esters such as vinyl acetate and blu propionate, and acrylonitrile.
  • Unsaturated-tolyl methyl acrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, butyl acrylate, butyl methacrylate, 2-ethyl hexyl acrylate, 2-ethyl hexyl methacrylate, Ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl esters such as lauryl acrylate, lauryl methacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, ethylene glycol diatalate, ethylene glycol dimethacrylate, trimethylol propanate teratalyl , Having a functional group such as polyfunctional (meth) atrelate such as trimethylolpropane trimetatalylate, glycidyl attalylate, glycidyl metatalylate, 2-hydroxyethyl talylate, 2-hydroxyethyl methallylate ( Examples include (meta) acryl
  • This bulle polymer may be a homopolymer or a copolymer composed of two or more monomers selected from the above beer monomer power! /.
  • the above butyl monomers and conjugated diolefins such as butadiene and isoprene, acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, acrylamide, methacrylamide, ⁇ -methylol acrylamide, ⁇ -methylol methacrylamide, diallyl phthalate, allyl acrylate.
  • a copolymer with a copolymerizable monomer such as a rate or aryl methacrylate can also be used.
  • the magnetic particles are known particulate substances that can be collected with a magnet, and contain magnetic fine particles.
  • the organic polymer particles used in the present embodiment are magnetic particles
  • the carrier polymer particles according to the present embodiment can be used as magnetic particles that can be used for applications described later, for example.
  • the particle size of the magnetic particles is less than 0.1 ⁇ m, it may take a long time for separation and purification by magnetic force, and if it exceeds 20 / zm, the surface area becomes small, and the target protein or other living body There may be a small amount of related substances trapped.
  • the internal composition of the magnetic particles may be homogeneous, the homogeneous magnetic particles in the preferred particle size range described above can be separated by repeated separation and purification by magnetic force with a large number of paramagnetic substances. Redistribution to quality may be difficult. For this reason, it is more preferable that the magnetic particles have a heterogeneous internal composition including magnetic fine particles with little residual magnetization.
  • the internal structure of magnetic particles having such an inhomogeneous internal composition includes a structure in which magnetic fine particles are dispersed in a continuous phase of a non-magnetic material such as a polymer, a polymer with a secondary aggregate of magnetic fine particles as a core, etc.
  • a structure in which a non-magnetic material such as a polymer (non-magnetic nuclei) is used as a core and a secondary aggregate of magnetic fine particles is used as a shell a structure in which a non-magnetic material such as a polymer (non-magnetic nuclei) is used as a core and a secondary aggregate of magnetic fine particles is used as a shell.
  • the polymer contained in the magnetic particles may be, for example, the above-mentioned polymers listed as constituting organic polymer particles.
  • a non-magnetic material non-magnetic core particle
  • a secondary aggregate of magnetic fine particles it is preferable to form a polymer layer on the outermost layer.
  • the polymer of the outermost layer for example, the above-mentioned polymers listed as constituting organic polymer particles used for the base particles may be used.
  • the organic polymer particles can be produced using a conventional method such as emulsion polymerization, soap-free polymerization, suspension polymerization, or the like.
  • the organic polymer particle when it is a magnetic particle, it can be produced, for example, by mixing non-magnetic core particles and magnetic fine particles and physically adsorbing the magnetic fine particles on the surface of the non-magnetic core particles.
  • “physical adsorption” means adsorption without chemical reaction. The principle of “physical adsorption” includes, for example, hydrophobic Z hydrophobic adsorption, melt bonding or adsorption, fusion bonding or adsorption, hydrogen bonding, van der Waals bonding, and the like.
  • the organic polymer particles can be obtained, for example, by suspension polymerization of the above-mentioned bull monomers or pulverization of a polymer nozzle.
  • organic polymer particles are prepared by the two-stage swelling polymerization method using seed particles described in Japanese Examined Patent Publication No. 57-24369, Journal 'Ob' Polymer Science 'Polymer Letter' edition, page 937, page 21, 1 Polymerization method described in 963 (J. Polym. Sci., Polymer Letter Ed. 21, 937 (1963)), JP 61-215602, JP 61-215603, and JP 61 — It can be produced by the method described in Japanese Patent No. 2156 04.
  • the magnetic particles can be produced by a method utilizing hydrophobic Z hydrophobic adsorption.
  • the surface of nonmagnetic core particles and the surface of magnetic particles are hydrophobic.
  • a method in which the solvent is volatilized under mixing conditions after sufficiently dispersing in a solvent such as toluene or hexane a solvent such as toluene or hexane.
  • the magnetic particles can also be produced by a method that realizes a composite of non-magnetic nuclei particles and magnetic fine particles by applying a physically strong force from the outside.
  • a physically strong force for example, a mortar, an automatic mortar, a ball mill, a blade pressurization type powder compression method, a mechanochemical effect such as a mechanofusion method, a jet mill, a hybridizer or the like is used.
  • the one using the impact method in high-speed air current can be mentioned. It is desirable that the physical adsorption force is strong in order to carry out the composite sheet efficiently and firmly.
  • the method may be carried out in a vessel equipped with a stirring blade at a peripheral speed of the stirring blade of preferably 15 mZ seconds or more, more preferably 30 mZ seconds or more, and even more preferably 40 to 150 mZ seconds. If the peripheral speed of the stirring blade is lower than 15 mZ seconds, it may not be possible to obtain sufficient energy to adsorb the magnetic fine particles on the surface of the nonmagnetic core particles.
  • the upper limit of the peripheral speed of the stirring blade is not particularly limited, but is naturally determined from the viewpoints of the equipment used and energy efficiency.
  • saccharide used in the carrier polymer particles according to the present embodiment examples include furanoses such as fructose, arabinose, xylose, ribose and deoxyribose, bilanoses such as glucose, mannose and galactose, and septanoses.
  • Monosaccharides trenorose, lactose, cordose, -gerose, manoleose, isomanoleose, sophorose, laminarios, cellobiose, gentibiose, etc., starch, amylose, amylopectin, dextrin, glycogen, cyclodextrin And polysaccharides such as cellulose, agarose, alginic acid, inulin, darcomannan, chitin, chitosan and hyaluronic acid. High molecular weight polysaccharides are preferred from the viewpoint of coating efficiency in order to bond organic polymer particles and saccharides together to cover the surface of organic polymer particles.
  • the saccharide is a functional group (for example, hydroxyl group, amino group, carboxyl group) in the saccharide molecule described above, such as carboxymethylcellulose and carboxymethyldextran.
  • the base may be converted at least partially, and the conversion may be performed in multiple stages as necessary. More preferably, saccharides that are carboxymethylated, such as carboxymethylcellulose and carboxymethyldextran, are used as saccharides.
  • the organic polymer particles having a particle size of 0.1 to 20 / zm and the saccharide are chemically bonded to each other to coat the surface of the organic polymer particles with the saccharide.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing an example of a method for producing carrier polymer particles according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing an example of carrier polymer particles according to the present embodiment.
  • FIG. 2 shows carrier polymer particles 10 according to the present embodiment produced by the process shown in FIG.
  • the organic polymer particle 11 used when producing the carrier polymer particle according to this embodiment has a plurality of functional groups (first functional groups) 13 on its surface.
  • the first functional group 13 may be a functional group introduced at the time of forming the particle shape of the organic polymer particle 11 or a functional group obtained by converting the functional group after forming the particle shape. But you can. At that time, the functional group may be converted a plurality of times as necessary.
  • the functional group introduced when the particle shape of the organic polymer particle 11 is formed is an epoxy group, a large excess of ammonia or an appropriate diamine compound is allowed to act on the epoxy group.
  • the amino group can be used as the first functional group.
  • the functional group introduced when the particle shape of the organic polymer particle 11 is formed is a hydroxyl group
  • the hydroxyl group is converted into a tosyl group.
  • an amino group generated by allowing a large excess of an appropriate diamine compound to act on the tosyl group can be used as the first functional group 13.
  • the first functional group 13 can be an amino group.
  • the saccharide 12 used when producing the carrier polymer particles according to the present embodiment may have a plurality of functional groups (second functional groups) 14 in one molecule. Gus functional group may be a saccharide functional group converted.
  • Examples of functional groups that can be used as the first functional group 13 and Z or the second functional group 14 include a carboxyl group, a hydroxyl group, an epoxy group, an amino group, a mercapto group, a vinyl group, an aryl group, and an acrylic group. Group, methacryl group, tosyl group, azide group and the like.
  • the first functional group 13 and the second functional group 14 are reactive with each other.
  • the second functional group 14 can be an amino group
  • the first functional group 13 is an amino group.
  • the second functional group 14 can be a carboxyl group.
  • the first functional group 13 and the second functional group 14 react to allow the organic polymer particle 11 and the saccharide 12 to be chemically bonded (see FIG. 2). .
  • the carrier polymer particle 10 according to the present embodiment can be obtained.
  • the pH is adjusted as necessary, and then the surface is subjected to a purification treatment such as dialysis / ultrafiltration'centrifugation. Can be used as carrier particles.
  • the carrier polymer particle according to the present embodiment can be used as a compound carrier particle in the field of drug discovery and a chemical bond carrier particle for a diagnostic agent.
  • the carrier polymer particles according to the present embodiment include a protein such as an antibody 'antigen' enzyme 'hormone, a nucleic acid substance such as DNA' RNA, or a biologically related sugar chain compound (hereinafter referred to as "biologically related" It can be used as a biological substance-supporting polymer particle that sensitizes the substance “, u) to the particle surface by a chemical bonding method.
  • biologically related a biologically related sugar chain compound
  • the use of the carrier polymer particles according to the present embodiment is not limited to the compound carrier particles in the drug discovery field and the chemical bond carrier particles for the diagnostic agent described above. It can be used in a wide range of fields, such as paint, paper, electrophotography, cosmetics, pharmaceuticals, agricultural chemicals, food, and catalysts.
  • the method for producing carrier polymer particles according to the second embodiment of the present invention includes organic polymer particles having a particle size of 0.1 to 2 O / zm and having a functional group reactive with a carboxyl group, A step of coating the surface of the organic polymer particles with the saccharide by first chemically bonding with a saccharide having a group (first step); and the organic polymer particles having the surface coated with the saccharide. A step of treating with a basic solution (second step).
  • the functional group having reactivity with the carboxyl group present in the organic polymer particle is at least one functional group selected from an amino group, a hydroxyl group, and an epoxy group, Preferably at least selected from an amino group and a hydroxyl group power
  • One type of functional group more preferably an amino group.
  • a known chemical reaction without particular limitation can be used as a method for chemically bonding the organic polymer particles and the saccharide.
  • the chemical bond can be by a linking group containing at least one of an amide bond and an ester bond.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining a first step of the method for producing carrier polymer particles according to the present embodiment
  • FIG. 2 is a schematic example of the carrier polymer particles obtained by the first step.
  • the organic polymer particle 11 used in the production of the carrier polymer particle according to the present embodiment has a functional group 13 having reactivity with a carboxyl group.
  • the functional group 13 having reactivity with the carboxyl group may be introduced when the particle shape of the organic polymer 11 is formed, or a predetermined functional group is converted after the particle shape is formed. You may obtain it. At that time, the functional group may be converted a plurality of times as necessary.
  • the functional group introduced when forming the particle shape of the organic polymer 11 is an epoxy group, an amino group generated by allowing a large excess of ammonia or a suitable diamine compound to act on the epoxy group.
  • the functional group 13 having reactivity with a carboxyl group can be used, or, for example, when the functional group introduced when the particle shape of the organic polymer 11 is formed is a hydroxyl group, the hydroxyl group is converted to a tosyl group. After the conversion, the amino group generated by allowing a large excess of an appropriate diamine compound to act on the tosyl group can be converted into a functional group 13 having reactivity with a carboxyl group.
  • the functional group 13 having reactivity with a carboxyl group is an amino group.
  • the saccharide 12 used when producing the carrier polymer particles according to the present embodiment may have one or a plurality of carboxyl groups 14 in one molecule.
  • the group 14 may be obtained by converting a predetermined functional group in the saccharide 12.
  • Examples of the functional group that can be used as the functional group 13 having reactivity with a carboxyl group include an amino group. As described above, this amino group may be converted from a functional group (for example, a hydroxyl group or an epoxy group) introduced when the particle shape of the organic polymer 11 is formed. In this case, the functional group 13 that is reactive with the carboxyl group and the force group 14 are reactive with each other. Although not limited thereto, for example, when the functional group 13 reactive with a carboxyl group is at least one selected from an amino group, a hydroxyl group, and an epoxy group, the functional group 13 is reactive with a carboxyl group 14. .
  • the organic polymer particle 11 and the saccharide 12 can be chemically bonded by the reaction of the functional group 13 having reactivity with the carboxyl group and the carboxyl group 14.
  • a known chemical reaction without particular limitation can be used as a method for chemical bonding.
  • a group having reactivity with a carboxyl group is an epoxy group
  • an ester bond can be formed by direct reaction.
  • the group having reactivity with the carboxyl group is a hydroxyl group
  • a method of esterification using various condensing agents 4th edition Experimental Chemistry Course 22, p45-47, 1992
  • the group having reactivity with the carboxyl group is an amino group
  • a method of amidation using various condensing agents in organic synthesis (4th edition Experimental Chemistry Course 22, pl39-144, 1992), For peptide synthesis!
  • various methods used for peptide bond formation (4th edition Experimental Chemistry Course 22, p259-271, 1992).
  • the organic polymer particles 11 whose surface is coated with the saccharide 12 obtained in the first step are treated with a basic solution, whereby the organic polymer is obtained in the first step.
  • the saccharide physically adsorbed on the surface of the particle 11 can be extracted into the solution in the form of a salt or the like.
  • the organic polymer particle 11 is treated with a sufficient amount of basic solution, so that only the saccharide 12 (see FIG. 2) chemically bonded to the surface of the organic polymer particle 11 is finally obtained.
  • the remaining problems caused by the physically adsorbed sugars as described above can be solved.
  • the physically adsorbed saccharide is Carrier polymer particles 10 including the removed organic polymer particles 11 and saccharides 12 covering the surfaces of the organic polymer particles 11 are obtained.
  • the basic solution used here is not particularly limited as long as it can extract the physically adsorbed saccharides.
  • a sodium hydroxide aqueous solution a potassium hydroxide aqueous solution, a hydroxide aqueous solution, Lithium aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, sodium hydrogen carbonate aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, potassium hydrogen carbonate aqueous solution, lithium carbonate aqueous solution, aqueous
  • the concentration of the basic solution used here is usually 0.001M or more.
  • the treatment temperature is usually 0 to 50 ° C, preferably 0 to 30 ° C.
  • the saccharide physically adsorbed can also be extracted by treating the basic solution with an appropriate electrolyte solution that is inferior in efficiency.
  • the method for producing carrier polymer particles according to the present embodiment may further include a step (third step) of chemically binding a probe for specifically capturing a target substance to the saccharide.
  • a probe for specifically capturing a target substance is chemically bonded to a saccharide.
  • saccharide and probe are, for example, O bond, S bond, -SO bond, -SO bond, CO- bond, -CO bond, NR 1 -bond (where R 1 is
  • the saccharide and the probe can be chemically bonded by chemically reacting the functional group contained in the saccharide with the functional group contained in the probe by a known method.
  • the functional group contained in the saccharide and the functional group contained in the probe are not particularly limited, and examples thereof include a hydroxyl group, an acyl group, a mercapto group, an amino group, an aminoacyl group, a carbonyl group, and a formyl group. , Carboxyl group, amide group, sulfonic acid group, phosphoric acid group, epoxy group, tosyl group, azide group, bur group, aryl group and the like.
  • the “target substance” refers to a substance to be captured using the probe binding particles according to the present embodiment. Examples of the target substance include biological substances.
  • biologically related substance refers to all substances related to a living body. Examples of the biological substance include substances contained in the living body, substances derived from substances contained in the living body, and substances that can be used in the living body.
  • the biological substance is not particularly limited, and examples thereof include proteins (for example, enzymes, antibodies, receptors, etc.), peptides (for example, dartathione, RGD peptides, etc.), nuclear acids (for example, DNA And RNA), carbohydrates, lipids, and other cells or substances (for example, various blood-derived substances including various blood cells such as platelets, erythrocytes, leukocytes, and various floating cells).
  • proteins for example, enzymes, antibodies, receptors, etc.
  • peptides for example, dartathione, RGD peptides, etc.
  • nuclear acids for example, DNA And RNA
  • carbohydrates for example, lipids, and other cells or substances
  • other cells or substances for example, various blood-derived substances including various blood cells such as platelets, erythrocytes, leukocytes, and various floating cells.
  • the probe when the probe is a protein, by reacting a functional group in the protein (eg, amino group, carboxyl group) and a functional group in the saccharide (eg, carboxyl group, hydroxyl group, amino group),
  • a functional group in the protein eg, amino group, carboxyl group
  • a functional group in the saccharide eg, carboxyl group, hydroxyl group, amino group
  • the probe and saccharide can be chemically bonded.
  • the probe and the saccharide can be bound via an amide bond or an ester bond.
  • the probe and the saccharide are allowed to react with each other by reacting a functional group (for example, a phosphate group) in the nucleic acid with a functional group (for example, a hydroxyl group) in the saccharide.
  • a functional group for example, a phosphate group
  • a functional group for example, a hydroxyl group
  • the probe and the saccharide can be bound via a phosphodiester bond.
  • Probes that can be used in the particle for specific capture according to the present embodiment are not particularly limited.
  • proteins for example, antibodies, antigens, enzymes, receptors, hormones, etc.
  • peptides for example, nucleic acids (for example, DNA, RNA, etc.), sugar chain compounds, and synthetic chemicals (eg, drug candidates).
  • the target substance when the probe is an antibody (or antigen), can be an antigen (or antibody) that specifically binds to the antibody (or antigen).
  • the target substance when the probe is a nucleic acid, can be a nucleic acid that specifically binds to the nucleic acid.
  • the target substance when the probe is an enzyme, receptor, or hormone, can be a compound that specifically binds to the enzyme, the receptor, or the hormone. 2-1 -4. Substances Used in Production of Carrier Polymer Particles According to this Embodiment Next, each substance used in the production of carrier polymer particles according to this embodiment will be described in detail.
  • the average particle diameter of the organic polymer particles used in the production of the carrier polymer particles according to this embodiment is preferably 0.1 to 20 111, more preferably 0.3 to 15 / ⁇ ⁇ , and most preferably 1 to: LO / zm.
  • the variation coefficient of the organic polymer particles used in the present embodiment is usually 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less.
  • the organic polymer particles can be used as base particles of carrier polymer particles produced according to the present embodiment.
  • Organic polymer particles are suitable as base particles because the surface can be easily coated with sugars bonded by chemical bonds.
  • magnetic particles can be used as the organic polymer particles.
  • the carrier polymer particles produced according to the present embodiment are dispersed in a solvent, if the organic polymer particles are dissolved in the dispersion medium or if the organic polymer particles are swollen by the solvent, Nonspecific adsorption of biological substances such as proteins increases. For this reason, it is desirable that the organic polymer particles are not dissolved in the dispersion medium.
  • an aqueous medium can be used as the dispersion medium.
  • the aqueous medium refers to water or a mixture of water and a solvent that dissolves in water (for example, alcohols, alkylene glycol derivatives, etc.).
  • organic polymer particles those exemplified as the polymer constituting the organic polymer particles in the first embodiment described above can be used, and the organic polymer particles are manufactured by the method exemplified in the first embodiment described above. can do.
  • the polymer constituting the organic polymer particles a vinyl polymer is particularly preferable.
  • the magnetic particles described in the first embodiment can be used.
  • sugar having a carboxyl group used in the production of the carrier polymer particles of the present embodiment examples include fructose, arabinose, xylose, ribose, and deoxyribo.
  • Furanoses such as glucose
  • biranoses such as glucose
  • mannose and galactose monosaccharides
  • monosaccharides such as septanoses, trehalose, ratatoses, cordose, gelose, manoleose, isomaltose, sophorose, laminorose, cellobiose, gentibiose, etc.
  • Functional groups in the saccharide molecule such as saccharides, starch, amylose, amylopectin, dextrin, glycogen, cyclodextrin, cellulose, agarose, inulin, darcomannan, chitin, chitosan, etc.
  • Group having a carboxyl group introduced by chemical modification for example, carboxymethylcellulose, carboxymethyldextran, or a polysaccharide originally having a carboxyl group (for example, arginyl group)).
  • Acid such as hyaluronic acid
  • a method for introducing a carboxyl group by chemical modification of a saccharide a known chemical reaction without limitation can be used, and the chemical modification can be performed in multiple stages as necessary. It may be what was done. Further, in order to cover the surface of the organic polymer particle by chemically bonding the organic polymer particle and the saccharide, a high molecular weight polysaccharide is preferable in terms of coating efficiency. Particularly preferred saccharides containing a carboxyl group are carboxymethylcellulose and carboxymethyldextran.
  • the particle size of the carrier polymer particles produced according to this embodiment is preferably 0.1 to 17 m, and more preferably 1 to 10 ⁇ m.
  • the particle size is less than 0.1 ⁇ m, it takes a long time for separation using centrifugation or the like, and the separation between the washing solvent such as water and the particles becomes insufficient. There may be cases where (for example, biological substances such as proteins) are insufficiently removed and sufficient purification cannot be performed.
  • the particle size exceeds 17 m, the surface area becomes small, and the amount of target substances such as proteins to be captured may be small.
  • carrier polymer particles produced according to the present embodiment are produced by the production method described above, pH adjustment is performed as necessary, followed by purification treatment such as dialysis 'ultrafiltration' centrifugation, etc. After the surface is washed by, it can be used as carrier particles.
  • the carrier polymer particles produced according to the present embodiment can be used as they are, but in order to efficiently react with the compound, a dispersion liquid dispersed in a dispersion medium is used. Can also be used. As the powerful dispersion medium, those exemplified as the dispersion medium in the first embodiment described above can be used.
  • the carrier polymer particles according to the present embodiment may be probe-bound particles in which a probe for specifically capturing the target substance is chemically bound to a saccharide! /.
  • This probe can be chemically bound to the saccharide by the third step described above.
  • the particle size of the probe binding particles is preferably 0.1 to 20 111, more preferably 0.3 to 17 / ⁇ ⁇ , and even more preferably 0.5 to LO / z m.
  • the carrier polymer particles produced according to the present embodiment can be used as particles for compound carriers in the field of drug discovery and particles for chemical binding carriers for diagnostic agents.
  • the chemical substance to be analyzed (analyzed chemical substance) is immobilized by a chemical bond, and a specific interaction with the chemical substance to be analyzed is performed. It is possible to select and purify target substances (protein substances, etc.) having
  • the carrier polymer particles produced according to this embodiment include proteins such as antibody 'antigen' enzyme 'hormone, nucleic acid substances such as DNA'RNA, or biologically related sugar chain compounds (hereinafter referred to as "biological body”). It can be used as a biological substance-supporting polymer particle that sensitizes a related substance “t”) to the particle surface by a chemical bonding method.
  • the use of the carrier polymer particles produced according to the present embodiment is not limited to the compound carrier particles in the drug discovery field and the chemical bond carrier particles for diagnostic agents described above. It can be used in a wide range of fields such as chemicals, paints, paper, electrophotography, cosmetics, pharmaceuticals, agricultural chemicals, foods and catalysts.
  • the magnetic particle for specific capture according to the third embodiment of the present invention includes magnetic particles and sugars.
  • the saccharide may coat the surfaces of the magnetic particles.
  • the magnetic particles and the saccharide are chemically bonded.
  • the chemical bond between the magnetic particles and the saccharide is preferably a bond group containing at least one of an amide bond and an ester bond.
  • a probe for specifically capturing a target substance is chemically bonded to the saccharide.
  • force saccharides and probes that are not particularly limited include, for example, O bond, S bond, SO bond, -SO-
  • R 2 and R 3 are each independently an alkyl group or H), bonded via chemical bonds such as —NHCO bond, —PO— bond, etc. be able to.
  • the saccharide and the probe can be chemically bonded by chemically reacting the functional group contained in the saccharide with the functional group contained in the probe by a known method.
  • the functional group contained in the saccharide and the functional group contained in the probe are not particularly limited, and examples thereof include a hydroxyl group, an acyl group, a mercapto group, an amino group, an aminoacyl group, a carbonyl group, and a formyl group. , Carboxyl group, amide group, sulfonic acid group, phosphoric acid group, epoxy group, tosyl group, azide group, bur group, aryl group and the like.
  • the “target substance” refers to a substance to be captured using the specific capture magnetic particles according to the present embodiment.
  • the target substance include biological substances.
  • the “biologically related substance” refers to all substances related to the living body. Examples of the biological substance include substances contained in the living body, substances derived from substances contained in the living body, and substances that can be used in the living body.
  • the biological substance is not particularly limited.
  • proteins eg, enzymes, antibodies, receptors, etc.
  • peptides eg, dartathione, RGD peptide, etc.
  • nuclear acids eg, DNA And RNA
  • carbohydrates e.g, lipids, and other cells or substances (for example, various blood-derived substances including various blood cells such as platelets, erythrocytes, leukocytes, and various floating cells).
  • the probe is a protein
  • a functional group in the protein eg, amino group, carboxyl group
  • a functional group in the saccharide eg, carboxyl group, hydroxyl group, amino group
  • the probe and the saccharide can be chemically bonded to the probe and the saccharide.
  • the probe and the saccharide can be bound via an amide bond or an ester bond.
  • the probe when the probe is a nucleic acid, a functional group in the nucleic acid (for example, a phosphate group), By reacting with a functional group (for example, a hydroxyl group) in the saccharide, the probe and the saccharide can be chemically bonded. In this case, the probe and the saccharide can be bound via a phosphodiester bond.
  • a functional group in the nucleic acid for example, a phosphate group
  • the probe that can be used in the particle for specific capture according to the present embodiment is not particularly limited.
  • a protein eg, antibody, antigen, enzyme, receptor, hormone, etc.
  • peptide eg, nucleic acid (eg, DNA, RNA, etc.), sugar chain compounds, and synthetic chemicals (eg, drug candidates).
  • the target substance when the probe is an antibody (or antigen), can be an antigen (or antibody) that specifically binds to the antibody (or antigen).
  • the target substance when the probe is a nucleic acid, can be a nucleic acid that specifically binds to the nucleic acid.
  • the probe when the probe is an enzyme, receptor, or hormone, the target substance can be a compound that specifically binds to the enzyme, the receptor, or the hormone.
  • the specific capture magnetic particles according to the present embodiment can be used as they are, but in order to efficiently react with the compound, they can be used as a dispersion liquid dispersed in a dispersion medium. Is possible.
  • the powerful dispersion medium those exemplified as the dispersion medium in the first embodiment described above can be used.
  • the particle diameter of the magnetic particles for specific capture according to the present embodiment is 0.1 to 20 ⁇ m, preferably 0.3 to 17 111, and more preferably 0.5 to LO. / zm.
  • the particle size is less than ⁇ ⁇ . ⁇ ⁇
  • separation using magnetic separation or the like takes a long time, and separation between washing solvent such as water and particles becomes insufficient. In some cases, the removal of these substances becomes insufficient and sufficient purification is not possible.
  • the particle size exceeds 20 m the surface area becomes small, and the trapped amount of the target substance may be small.
  • the average particle diameter of the magnetic particles used in the present embodiment is preferably 0.1 to 20 / ⁇ ⁇ , more preferably 0.3 to 17 / ⁇ ⁇ , more preferably 0.5 to: LO / zm. is there.
  • Magnetic particle size is 0 If it is less than 1 m, it may take a long time for separation and purification by magnetic force, and if it exceeds, the surface area will be small and the target substance may be trapped in a small amount.
  • the internal composition of the magnetic particles used in the present embodiment may be homogeneous! / ⁇ , but the homogeneous magnetic particles in the above preferred particle size range have many paramagnetic substances. Repeated separation and separation by magnetic force may make it difficult to redisperse in the medium. For this reason, it is more preferable that the magnetic particles used in the present embodiment have a heterogeneous internal composition including magnetic fine particles having a small residual magnetization.
  • the internal structure of magnetic particles having such an inhomogeneous internal composition includes (i) a structure in which magnetic fine particles are dispersed in a continuous phase of a non-magnetic material such as a polymer, and (ii) secondary aggregation of magnetic fine particles.
  • a non-magnetic material such as a polymer (non-magnetic core particle) as a core, and a magnetic layer (secondary aggregation of magnetic fine particles).
  • the polymer that can be used as the core may be, for example, the following polymers listed as polymers constituting the magnetic particles.
  • the magnetic fine particles are preferably at least one of Fe 2 O and Fe 2 O.
  • non-magnetic core particle such as a polymer as a core and a magnetic layer (secondary aggregate of magnetic fine particles) as a shell.
  • a polymer layer is further formed on the magnetic layer.
  • the polymer layer is formed on the magnetic layer by polymerization on the surface of the mother particle including the core particle (core) and the magnetic layer (shell) formed on the surface of the core particle.
  • the magnetic layer (shell) includes magnetic fine particles containing at least one of Fe 2 O and Fe 2 O.
  • the polymer layer may be, for example, a polymer described later listed as a polymer constituting the magnetic particle.
  • the magnetic particles are obtained by, for example, mixing nonmagnetic core particles and magnetic fine particles and physically adsorbing the magnetic fine particles on the surface of the nonmagnetic core particles.
  • Magnetism A sex layer can be produced.
  • “physical adsorption” means adsorption without chemical reaction. Examples of the principle of “physical adsorption” include hydrophobic Z hydrophobic adsorption, melt bonding or adsorption, fusion bonding or adsorption, hydrogen bonding, van der Waals bonding, and the like.
  • the magnetic particles can be obtained by, for example, suspension polymerization of the above-mentioned bulle monomers or pulverization of a polymer nozzle.
  • a magnetic particle is a two-stage swelling polymerization method using seed particles described in Japanese Patent Publication No. 57-24369, Journal 'Ob' Polymer Science 'Polymer Letter' edition, 937, 21st year, 1963 (J. Polym. Sci., Polymer Letter Ed. 21, 937 (1963), polymerization method described in JP-A-61-215602, JP-A-61-215603, and JP-A-61-215604 Can be produced.
  • the magnetic particles can be produced by a method utilizing hydrophobic Z hydrophobic adsorption.
  • the surface of the non-magnetic core particles and the surface of the magnetic fine particles are selected to be hydrophobic or hydrophobized, and these non-magnetic core particles and magnetic fine particles are dry blended, or A method of sufficiently dispersing in a well-dispersed solvent (for example, toluene, hexane) without attacking both the nonmagnetic core particles and the magnetic particles and then volatilizing the solvent under the mixing conditions can be mentioned.
  • a well-dispersed solvent for example, toluene, hexane
  • magnetic particles can also be produced by a method in which a physically strong force is externally applied and the magnetic fine particles are adsorbed on the surface of the nonmagnetic core particles.
  • a method of applying a physically strong force for example, a mortar, an automatic mortar, a ball mill, a blade pressurizing powder compression method, a method using a mechanochemical effect such as a mechanofusion method, a jet mill, or a hybridizer is used.
  • a method using a mechanochemical effect such as a mechanofusion method, a jet mill, or a hybridizer is used.
  • those using the impact method in high-speed airflow it is desirable that the physical adsorption force is strong in order to carry out the composite sheet efficiently and firmly.
  • the method may be carried out in a vessel equipped with a stirring blade at a peripheral speed of the stirring blade of preferably 15 mZ seconds or more, more preferably 30 mZ seconds or more, and even more preferably 40 to 150 mZ seconds.
  • a peripheral speed of the stirring blade preferably 15 mZ seconds or more, more preferably 30 mZ seconds or more, and even more preferably 40 to 150 mZ seconds.
  • the upper limit of the peripheral speed of the stirring blade is not particularly limited, but the apparatus used It is naturally determined in terms of energy efficiency.
  • Examples of the polymer constituting the magnetic particles used in the present embodiment include those exemplified as the polymer constituting the organic polymer particles in the first embodiment described above.
  • Examples of the saccharide used in the magnetic particles for specific capture according to this embodiment include those exemplified as the saccharide in the first embodiment described above.
  • the method for producing specific capture magnetic particles includes a step of chemically bonding a magnetic particle having a particle size of 0.1 to 20 m and a saccharide, and a process for specifically capturing a target substance. Chemically bonding the lobe and the saccharide.
  • the surface of the magnetic particle can be coated with saccharide by chemically bonding the magnetic particle and saccharide.
  • the magnetic particles used when producing the magnetic particles for capturing a specific feature according to the present embodiment may have a plurality of functional groups (first functional groups) on the surface thereof.
  • the first functional group may be a functional group introduced at the time of forming the particle shape of the magnetic particle, or may be a functional group obtained by converting the functional group after forming the particle shape. At that time, the functional group may be converted a plurality of times as necessary.
  • the functional group introduced when forming the particle shape of the magnetic particle is an epoxy group
  • a large excess of ammonia or an appropriate diamine compound is allowed to act on the epoxy group.
  • the group can be the first functional group.
  • the functional group introduced when forming the particle shape of the magnetic particle is a hydroxyl group
  • the hydroxyl group is converted to a tosyl group
  • An amino group generated by reacting a large excess of an appropriate diamine compound with a tosyl group can be used as the first functional group.
  • the first functional group can be an amino group.
  • the saccharide used when producing the magnetic particles for specific capture according to the present embodiment has a plurality of functional groups (second functional groups) in one molecule.
  • its functional group is sugar Even if the functional group of the class is converted.
  • Examples of functional groups that can be used as the first functional group and the Z or second functional group include a carboxyl group, a hydroxyl group, an epoxy group, an amino group, a mercapto group, a vinyl group, an aryl group, and an acrylic group. Methacryl group, tosyl group, azide group and the like.
  • the first functional group and the second functional group are reactive with each other.
  • the first functional group is an epoxy group
  • the second functional group can be an amino group and, for example, if the first functional group is an amino group,
  • the second functional group can be a carboxyl group.
  • the magnetic particles and the saccharide can be bound chemically. Thereby, the magnetic particles for specific capture according to the present embodiment can be obtained.
  • a known chemical reaction with no particular limitation can be used as a method for chemically bonding the magnetic particles and the saccharide.
  • the probe and the saccharide can be chemically bonded by performing an ionic reaction between the functional group contained in the probe and the functional group contained in the saccharide.
  • Specific examples of the functional group contained in the probe and the functional group contained in the saccharide are as described above.
  • the pH is adjusted as necessary, and then the surface is subjected to purification treatment such as dialysis / ultrafiltration 'centrifugation. Can be used as carrier particles.
  • the concentration of the carrier polymer particles obtained in each experimental example or comparative example described later is lwt%. As described above, it was diluted and dispersed in pure water to prepare a dispersion. Next, the dispersion 5001 is placed in a microcentrifuge tube (trade name: Safelock tube, manufactured by Eppendorf) and centrifuged with a centrifugal separator (MX-150, manufactured by Tommy Seiki Co., Ltd.). (Rotational speed 15,000 rpm, 15 ° C, 10 minutes), the supernatant was removed. Next, PBS (—) buffer 500 ⁇ l was poured into the tube containing the sediment, and the particles were dispersed by applying vibration with a touch mixer.
  • a microcentrifuge tube trade name: Safelock tube, manufactured by Eppendorf
  • MX-150 centrifugal separator
  • PBS (—) buffer 500 ⁇ l was poured into the tube containing the sediment, and the particles were dispersed by applying vibration with a touch mixer.
  • the tube was centrifuged, the supernatant was removed, 10 mM HEPESlml was poured, and the particles were dispersed by shaking with a touch mixer. After the same treatment was repeated twice more, the contents were transferred to another unused microcentrifuge tube, centrifuged, and the supernatant was removed.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • sample buffer Dissolve 2 mercaptoethanol (hereinafter referred to as “sample buffer”) so that the concentration in the Neorad premix sample buffer is 2 wt%, and collect 201 of this in a microcentrifuge tube. did. This was mixed with 20 ⁇ 1 of the supernatant collected in the above peeling step and heated with a tube heater at 100 ° C. for 5 minutes.
  • PBS (—) solution of lwt% BSA with 2% SDS solution as a control 5,000 times, 10,000 times, 20,000 times.
  • the mixture was mixed with Sampno Renoffer 20 1 and heated with a tube heater at 100 ° C for 5 minutes. These are called reference dilution BSA.
  • laser diffraction particle size distribution analyzer manufactured by Shimadzu Corporation
  • SALD 200V
  • laser scattering particle size distribution analyzer Model name: LS 13 320 (manufactured by Beckman Coulter, Inc.) was used to measure the particle size.
  • Organic polymer particles A-1 were prepared by a two-stage swelling polymerization method using seed particles.
  • polystyrene particles polymerized by soap-free polymerization and having a particle size of 0.98 ⁇ m were used.
  • the polystyrene particles were dispersed in 500 g of water in a nitrogen atmosphere to obtain an aqueous dispersion (solid content 5. Og).
  • the resulting organic polymer particles A-1 had a particle size of 2.71 ⁇ m, a coefficient of variation of the particle size of 2%, and were monodisperse particles.
  • organic polymer particles A-2 with a particle size of 2.64 / zm and a coefficient of variation of 2% Got.
  • organic polymer particles A with a particle size of 2.61 ⁇ m and a coefficient of variation of 2.1% — Got three.
  • Dextran T500 (average molecular weight 500, 0) manufactured by Pharmacia AB 00) was added to 0.5 g of sodium hydroxide (0.72 g) and bromoacetic acid (1.04 g), and the mixture was stirred for several minutes until uniform. Next, this solution is kept at 40 ° C. for 60 hours, and then ice-cooled. Then, dilute hydrochloric acid is added until the pH of the solution becomes 2 or less, and the solution is dialyzed and freeze-dried to obtain carboxy. Methyl dextran CMD-1 was obtained. When carboxylic acid contained in CMD-1 was quantified by titration, CMD-1 contained an average of 0.4 carboxylic acid groups per glucose unit.
  • Dispersion force of organic polymer particles A-1 Polymer particles isolated by centrifugation were dispersed in gasoline, centrifuged and washed three times, and then dried. Next, 0.50 g of these particles are placed in a 100 ml flask, and 25 g of ethylenediamine is prepared. After indirect ultrasonic irradiation for 10 minutes to disperse, the mixture is heated at 50 ° C for 6 hours in a nitrogen atmosphere. After stirring, the particles were isolated by centrifugation. Next, the particles were washed twice with methanol and three times with a water-Z methanol mixture (3 Zl, volume ratio) and then dried to obtain 0.54 g of organic polymer particles Am-1 as a white powder.
  • the organic polymer particle Am-1 increased in weight compared to the organic polymer particle A-1. Furthermore, compared with the infrared absorption spectrum before the ethylenediamine treatment (the infrared absorption spectrum of the organic polymer particle A-1), the infrared absorption spectrum of the organic polymer particle Am-1 (after the ethylenediamine treatment) , in an infrared absorption space Tuttle organic polymer particles A- 1 disappeared and a peak derived from the observed epoxy group near 900 cm _1, and, near the typical peak 3300 cm _1 to primary Amin and 3500cm near _1 Newly observed. From the above results, it was confirmed that the organic polymer particle Am-1 was obtained by introducing an amino group into the organic polymer particle A-1. That is, in the organic polymer particle Am-1, the first functional group 13 is an amino group.
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured according to the above evaluation method, and as a result, it was a very low value of 0.08 ngZmg.
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured according to the above evaluation method, and as a result, it was a very low value of 0.05 ngZmg.
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured according to the above evaluation method, and as a result, it was a very low value of 0.02 ngZmg.
  • carrier polymer particles P- 4 In the infrared absorption spectrum, the pre-reaction in addition to a peak derived from the organic polymer particles Am- 1, newly derived carboxymethyldextran 3400 cm _1 and near 1600 cm _1 near Peaks were observed. From the above results, it was confirmed that the saccharide (carboxymethyl dextran) was bonded to the organic polymer particle Am-1 in the carrier polymer particle P-4.
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured according to the above evaluation method, and as a result, it was as low as 0.0 ngZmg particle.
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured according to the above evaluation method, and as a result, it was a very low value of 0.05 ngZmg particle.
  • the dispersion force of the organic polymer particles A-5 was also dispersed three times by dispersing polymer particles isolated by centrifugation, washing them by centrifugation, and drying.
  • the organic polymer particle Am-5 increased in weight compared to the organic polymer particle A-5. Furthermore, compared with the infrared absorption spectrum before the ethylenediamine treatment (the infrared absorption spectrum of the organic polymer particle A-5), the infrared absorption spectrum of the organic polymer particle Am-5 (after the ethylenediamine treatment) the intensity of the peak derived from the observed epoxy group near 900 cm _1 weakness rounding in an infrared absorption space Tuttle organic polymer particles A- 5, and typical peak primary Amin is near 3300 cm _ 1 Peaks derived from hydroxyl groups were newly observed near 3500 cm_1 .
  • the organic polymer single particle Am-5 was obtained by introducing an amino group into the organic polymer particle A-5.
  • the reaction rate of the epoxy group present in the organic polymer particle A-5 was estimated to be about 30%.
  • the particles were washed 3 times with water, 1 time with 0.01N sodium hydroxide aqueous solution and 5 times with water, and then dried to give 102 mg of particles.
  • the infrared absorption spectrum of the organic polymer particle Am-5 before the reaction In comparison with, the intensity of the peak derived from the epoxy group observed in the infrared absorption spectrum of the organic polymer particle Am-5 before sulfuric acid treatment in the vicinity of 900 cm _1 disappears, and the vicinity of 3500 cm _1 derived from the hydroxyl group disappears. The peak has strengthened. From this result, it was confirmed that the epoxy group in the organic polymer particle Am-5 was hydrolyzed.
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured according to the above evaluation method. As a result, it was below the detection limit (less than 0. OlngZmg particles).
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured by the above evaluation method, and as a result, it was a very low value of 0.05 ngZmg.
  • Laser diffraction particle size distribution analyzer (made by Shimadzu Corporation) SALD—200V for particles with a diameter of 1 ⁇ m or more, and laser scattering diffraction for particles with a diameter of less than 1 ⁇ m
  • the particle size was measured by a method particle size distribution analyzer (model name: LS 13 320, manufactured by Beckman Coulter, Inc.).
  • styrene Z divinylbenzene 96Z4 copolymer particles (average particle size 1. was prepared, and after the polymerization, only the particles were removed by further washing with water. This was dried and pulverized and used as core particles (a-1) (preparation of the core).
  • aqueous dispersion of polymer-coated magnetic particles was subjected to magnetic purification and gravity sedimentation purification, and then an aqueous dispersion of magnetic particles A-6 having a solid content concentration of 1% was obtained.
  • the average particle diameter of the magnetic particles A-6 was 2.
  • the magnetic particles obtained in Synthesis Example 8 were dispersed in acetone from the aqueous dispersion of magnetic particles A-6, and the operation of magnetic separation and washing was repeated 5 times, and then dispersed again in acetone. The supernatant was removed by centrifugation and then dried. Next, 0.50 g of these particles are placed in a 100 ml flask, and 25 g of ethylenediamine is placed. After indirect ultrasonic wave irradiation for 20 minutes to disperse, the mixture is heated and stirred at 50 ° C. for 6 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, the particles were isolated by centrifugation.
  • aminated particles Am-6 were then washed 5 times with methanol and dried to obtain 0.49 g of aminated particles Am-6 as a brown powder. Furthermore, in comparison with the infrared absorption spectrum before the ethenylenediamine treatment (the infrared absorption spectrum of the magnetic particle A-6), the infrared absorption spectrum of this aminated particle Am-6 (after the ethylenediamine treatment) is 1 typical peak was newly observed in the vicinity of and 3400cm- around 1 3300cm- 1 to grade Amin. From the above results, it was confirmed that the aminated particle Am-6 was obtained by introducing an amino group into the magnetic particle A-6.
  • the carrier polymer particles obtained in Experimental Example 8 were diluted and dispersed in pure water so as to have a concentration of 1 wt% to prepare an aqueous dispersion.
  • the aqueous dispersion 500 1 is placed in a microcentrifuge tube (Eppendorf, trade name: Safe-Lock tube), magnetically separated by a magnetic stand (Magical Trapper, Toyobo Co., Ltd.), and the supernatant Was removed. After washing 3 times with 50 mM MES -Na OH pH6 (Buffer— 1), it was dispersed in Buffer 1 of 500 1 and N-hydroxysuccinimide (NHS) O.
  • 100 ⁇ L of the probe-bound particle dispersion was placed in a separate tube and magnetically separated to remove the supernatant.
  • pour human serum solution 500 1 containing 200 ngZmL of the target substance protein (human ⁇ -fetoprotein (AFP)) and vibrate with a touch mixer. After the particles were dispersed, the mixture was mixed by rotating at room temperature for 2 hours.
  • human serum solution 500 1 containing 200 ngZmL of the target substance protein (human ⁇ -fetoprotein (AFP)
  • AFP human ⁇ -fetoprotein
  • the tube was magnetically separated, the supernatant was removed, 10 mM HEPESlml was poured, and the particles were dispersed with a touch mixer. After the same treatment was repeated twice more, the contents were transferred to another unused microcentrifuge tube, subjected to magnetic separation, and the supernatant was removed.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • sample buffer Dissolve 2 mercaptoethanol (hereinafter referred to as “sample buffer”) so that the concentration in the Neorad premix sample buffer is 2 wt%, and collect 201 of this in a microcentrifuge tube. did. This was mixed with 20 ⁇ 1 of the supernatant collected in the above peeling step and heated with a tube heater at 100 ° C. for 5 minutes.
  • AFPZPBS 20 mg of lmgZmL of AFPZPBS (—) diluted 100-fold, 200-fold, or 500-fold with SDS solution was taken, mixed with Sampnorenov 201, and 100 ° C using a block heater. For 5 minutes. These are referred to as reference dilution AFP.
  • the gel was prepared using the Neorad vertical electrophoresis system “Miniprotian 3”, BioRad precast polyacrylamide gel “Ready Gel J (15%)”, and BioRad premix electrophoresis buffer. 20 1 was applied per lane and electrophoresis was performed. Staining was performed by a standard method using a BioStad Silver Stin Plus kit. The stained gel was scanned and imaged with a BioRad densitometer “GS-700”, and the product of the concentration and area of the AFP band in the gel was quantified using the analysis software “Multi-Analyst”. .
  • probe (antibody) -binding particles were obtained by performing the same probe binding step as in the above Experimental Example 8. The specific binding ability of this probe-bound particle was evaluated according to the same method as in Experimental Example 8 above.
  • Comparative Example 4 the same probe binding step as in Experimental Example 8 was performed using magnetic particles (trade name “MAG2101”) manufactured by JSR Corporation to obtain probe-bound particles. Next, the specific capture property of this probe-bound particle was evaluated according to the same method as in Experimental Example 8. The magnetic particles used in Comparative Example 4 are not coated with saccharide on the surface.
  • FIG. 3 is a photograph showing the evaluation results of the specific capture properties of the probe-bound particles obtained in Experimental Examples 8 and 9 and Comparative Example 4 (electrophoretic pattern of proteins adsorbed on the probe-bound particles).
  • lane 1 is a plug formed using the carrier polymer particles P-9 of Experimental Example 8.
  • the protein captured by the lobe-bound particles is shown
  • lane 2 shows the protein captured by the probe-bound particles formed using the carrier polymer particle P-10 of Example 9
  • lane 3 is that of Comparative Example 4. Proteins captured by probe-bound particles formed using magnetic particles are shown.
  • Lane 4 shows 20 ng of the target substance (AFP) as a control
  • Lane 5 shows 50 ng of the target substance (AFP) as a control
  • Lane 6 shows the target substance (AFP) lOOng, which is the control
  • Lane 7 shows the molecular weight marker.
  • a dispersion was prepared by diluting and dispersing in pure water so that the concentration of the carrier polymer particles obtained in each experimental example or comparative example described later was lwt%.
  • the dispersion 5001 is placed in a microcentrifuge tube (trade name: Safelock tube, manufactured by Eppendorf) and centrifuged with a centrifugal separator (MX-150, manufactured by Tommy Seiki Co., Ltd.). (Rotation speed 15,000rpm, 15 ° C, 10 minutes), the supernatant was removed.
  • PBS (—) buffer 500 ⁇ l was poured into the tube containing the sediment, and the particles were dispersed by applying vibration with a touch mixer.
  • the tube was centrifuged, and the supernatant was removed. Then, lOmM HEPESlml was poured, and the particles were dispersed by shaking with a touch mixer. After the same treatment was repeated twice more, the contents were transferred to another unused microcentrifuge tube, centrifuged, and the supernatant was removed.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • sample buffer Dissolve 2 mercaptoethanol (hereinafter referred to as “sample buffer”) so that the concentration in the Neorad premix sample buffer is 2 wt%, and collect 201 of this in a microcentrifuge tube. did. This was mixed with 20 ⁇ 1 of the supernatant collected in the above peeling step and heated with a tube heater at 100 ° C. for 5 minutes.
  • the carrier polymer particles obtained in each of the experimental examples and comparative examples described later were diluted and dispersed in pure water so that the concentration became lwt% to prepare an aqueous dispersion.
  • this aqueous dispersion 500 / zl was taken in a microcentrifuge tube, centrifuged, and the supernatant was removed. After washing 3 times with 50 mM MES-Na OH pH6 (Buffer-1), it was dispersed in 500-1 Buffer-1, and N-hydroxysuccinimide (NHS) O. 8 mg and 1-ethyl-3- (3-dimethyla Minopropyl) Carpopositimide (EDC) O.
  • protein anti-a-phenol
  • AFP target substance--fetoprotein
  • PBS (-) buffer 500 1 containing 1% ethanolamine was added and stirred at room temperature for 2 hours.
  • PBS ( ⁇ ) buffer the particles were dispersed with PBS ( ⁇ ) buffer 5001 to obtain a dispersion of probe (antibody) -bound particles.
  • probe-bound particle dispersion 100 ⁇ L of the probe-bound particle dispersion was placed in a separate tube and centrifuged to remove the supernatant.
  • a human serum solution 500 1 containing 200 ng ZmL of the target substance protein (human ⁇ -fetoprotein (AFP)) is poured into this, and the particles are dispersed by shaking with a touch mixer, and then at room temperature. Mix by inversion for an hour.
  • AFP human ⁇ -fetoprotein
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • sample buffer Dissolve 2 mercaptoethanol (hereinafter referred to as “sample buffer”) so that the concentration in the Neorad premix sample buffer is 2 wt%, and collect 201 of this in a microcentrifuge tube. did. This was mixed with 20 ⁇ 1 of the supernatant collected in the above peeling step and heated with a tube heater at 100 ° C. for 5 minutes.
  • AFPZPBS 20 mg of lmgZmL of AFPZPBS (—) diluted 100-fold, 200-fold, or 500-fold with SDS solution was taken, mixed with Sampnorenov 201, and 100 ° C using a block heater For 5 minutes. These are referred to as reference dilution AFP.
  • laser diffraction particle size distribution analyzer manufactured by Shimadzu Corporation
  • SALD 200V
  • laser scattering particle size distribution analyzer Type name: LS 13 320, grained by Beckman Coulter Co.
  • Organic polymer particles A-8 were produced by a two-stage swelling polymerization method using seed particles.
  • polystyrene particles polymerized by soap-free polymerization and having a particle size of 0.98 ⁇ m were used.
  • the polystyrene particles were dispersed in 500 g of water in a nitrogen atmosphere to obtain an aqueous dispersion (solid content 5. Og).
  • an organic solvent Shellsol TKO.lg
  • a monomer TMP as the second stage.
  • the organic polymer particle Hy-1 increased in weight compared to the organic polymer particle A-8. Furthermore, compared to the infrared absorption spectrum before the sulfuric acid treatment (infrared absorption spectrum of the organic polymer particle A-8), the infrared absorption spectrum of the organic polymer particle Hy-1 (after the sulfuric acid treatment) ⁇ In the infrared absorption spectrum of organic polymer particle A-8, the peak derived from the epoxy group observed around 900 cm _1 becomes weaker, and the width around 3500 cm _1 derived from the hydroxyl group becomes wider. New peaks were observed. From the above results, it was confirmed that the organic polymer particle Hy-1 was obtained by partially hydrolyzing the epoxy group of the organic polymer particle A-8 and introducing a hydroxyl group.
  • the organic polymer particle Am-8 increased in weight compared to the organic polymer particle Hy-1. Furthermore, compared with the infrared absorption spectrum before the ethylenediamine treatment (infrared absorption spectrum of the organic polymer particle Hy-1), the organic polymer particle Am-8 (after the ethylenediamine treatment) has an infrared absorption spectrum. is to peak derived from the epoxy group was observed at 900cm vicinity _1 in the infrared absorption spectrum of the organic polymer particles Hy-1 disappeared, and a typical peak in the vicinity of 3300 cm _1 and near 3500 cm _1 to primary Amin Newly observed. From the above results, it was confirmed that the organic polymer particle Am-8 was obtained by introducing an amino group into the organic polymer particle Hy-1.
  • N-hydroxysuccinate was added to 3 g of a 1% aqueous solution of CMC-1 obtained in Synthesis Example 14 above. 6 mg of acid imide was added and stirred at room temperature for 10 minutes. Next, this solution was ice-cooled, 20 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride was added, and the mixture was stirred for 30 minutes under ice-cooling. Next, 30.lmg of the organic polymer particle Am-8 was added to this solution and dispersed by irradiating with indirect ultrasonic waves for 20 minutes, followed by stirring for 12 hours under ice cooling. Subsequently, the particles were isolated by centrifugation, dispersed in pure water, centrifuged and washed 10 times, and then dried to give 35. Omg carrier polymer particle precursor pre-P— I got 11.
  • this carrier polymer particle precursor pre-P-11 (20. 2 mg) was dispersed in 2 ml of 0.01 M aqueous sodium hydroxide solution and isolated by centrifugation three times, followed by pure water. The procedure of dispersing in 2 ml and isolating by centrifugation was repeated three times, followed by drying to obtain 18.6 mg of carrier polymer particles P-11.
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured by the above evaluation method, and as a result, it was below the detection limit (0. OlngZmg).
  • Dispersion force of organic polymer particles A-9 The polymer particles isolated by centrifugation were dispersed in gasoline, centrifuged and washed three times, and then dried. Next, 0.50 g of these particles are placed in a 100 ml flask, and 25 g of ethylenediamine is prepared. After indirect ultrasonic irradiation for 10 minutes to disperse, the mixture is heated at 50 ° C for 6 hours in a nitrogen atmosphere. After stirring, the particles were isolated by centrifugation. Next, the particles were washed 4 times with methanol and dried to obtain 0.61 g of organic polymer particles Am-9 as white powder.
  • the nonspecific adsorption property of the protein was measured by the above evaluation method, and as a result, it was a very low value of 0.0ngZmg.
  • FIG. 4 shows the evaluation of the specific capture properties of the carrier polymer particles (P-11 and P12) obtained in each of Experimental Examples 10 and 11 and the carrier polymer particle precursor pre-P11 of Comparative Example 7 by the above method.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of measurement according to (electrophoretic pattern of protein adsorbed on probe-bound particles).
  • lane 1 shows the protein captured by the probe-bound particles formed using the carrier polymer particle P-11 of Experimental Example 10
  • lane 2 shows the carrier polymer particle P— of Experimental Example 11.
  • 12 shows proteins captured by probe-bound particles formed using lane 12
  • lane 3 captured by probe-bound particles formed using carrier polymer particle precursor pre-P-11 of Comparative Example 7.
  • Protein is shown
  • lane 4 shows 20 ng of the target substance (AFP) as a control
  • lane 5 shows 50 ng of the target substance (AFP) as a control
  • lane 6 shows a molecular weight marker.

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Description

明 細 書
担体ポリマー粒子およびその製造方法ならびに特異捕捉用磁性粒子お よびその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、有機ポリマー粒子の表面が糖類で被覆されている担体ポリマー粒子お よびその製造方法ならびに特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法に関する。 背景技術
[0002] 近年、創薬などの分野で、分子間相互作用を利用して、ある特定の分子に特異的 な相互作用を有する分子を探索する試みが盛んに行われている。具体的には、相互 作用を有する片方の分子 (プローブ分子)を担体に固定し、特異的相互作用を利用 してもう片方の分子 (目的物質)を捕捉、精製することが広く行われている。
[0003] 例えば、ァフィユティー榭脂を用いた免疫抑制剤 FK506の細胞内結合タンパク質 FKBP12の発見（Nature, 341, 758, 1989)などが知られている。このようなァフィ-テ ィー榭脂としては、ァガロースなどの多孔質ゲルが一般的に用いられている。しかし ながら、多孔質ゲルを用いる場合、目的物質以外の分子がァフィユティー榭脂に吸 着する、いわゆる、非特異吸着と呼ばれる現象が生じ、目的物質の分離、精製が困 難であるという問題が生じる。また、プローブ分子のうちある割合は多孔質ゲル内部 に結合し、このようなプローブ分子は目的物質との相互作用が不十分になる結果、目 的物質の捕捉効率が低くなるという問題も生じる。
[0004] 力かる非特異吸着の解決策として、表面がグリシジルメタタリレートで覆われたスチ レンーグリシジルメタタリレート重合体にスぺーサを介して生体関連物質を結合したミ クロスフィァ (特許第 3086427号公報および特許第 3292721号公報）、粒子表面に 親水性のスぺーサを導入した粒子（WO 2004/025297 A1号公報および WO 2004/040305 A1号公報）などが提案されている。しかしながら、これらはいずれ も非特異吸着の低減効果が充分ではなぐさらに非特異吸着の少ない担体用粒子 が求められている。また、これらの粒子においても目的物質の捕捉効率は十分と言え ない。 [0005] 一方、化学結合法で感作させる生体関連物質担体ポリマー粒子として、主にカル ボキシル基変性ポリスチレン粒子が広く使用されている。し力しながら、このポリスチ レン系の粒子は一般に、試験検体中に存在する目的としない他の生体関連物質等 の吸着 (非特異吸着)が大きぐこれにより感作粒子の性能が阻害されるため、粒子を 使用する上での大きな障害になっている。これに対して、粒子表面に目的の生体関 連物質を感作させた後、残りの粒子表面をゥシ血清アルブミン (BSA)等の害の少な いタンパクを先に吸着させるブロッキングの手法が用いられている力 非特異吸着を 充分に防止することは困難である。また、ポリスチレン粒子にスチレンスルホン酸塩も しくは一般式（CH CH O) または（CH CHCH O) で表されるポリアルキレンォキ
2 2 η 2 3 m
シド側鎖を有するアクリルエステルを共重合させたり、あるいは粒子の乳化重合後に アルカリ性水溶液中で加熱処理して粒子に結合した過硫酸塩系開始剤の断片を加 水分解させたりすることにより、生体関連物質担体粒子としての性能を向上させること が知られている力 非特異吸着を充分に防止するには至っていない。また、これらの 粒子においても、 目的物質の捕捉効率は十分と言えない。
発明の開示
[0006] 本発明の目的は、タンパク質などの生体物質の非特異吸着が極めて少な 、担体ポ リマー粒子およびその製造方法を提供することである。
[0007] また、本発明の目的は、タンパク質などの生体関連物質の非特異吸着が極めて少 なぐかつ、 目的物質の捕捉効率が高い担体ポリマー粒子の製造方法を提供するこ とである。
[0008] さらに、本発明の目的は、タンパク質、ペプチド、核酸、細胞などの生体関連物質 の非特異吸着が極めて少ない特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法を提供する ことである。
[0009] 本発明の第 1の態様の担体ポリマー粒子は、
粒径が 0. 1〜20 /ζ πιの有機ポリマー粒子と、
前記有機ポリマー粒子の表面を被覆する糖類と、
を含み、
前記有機ポリマー粒子および前記糖類が化学結合している。 [0010] ここで、上記担体ポリマー粒子において、前記糖類が多糖類であることができる。
[0011] ここで、上記担体ポリマー粒子において、前記糖類はカルボキシメチルイ匕されてい ることがでさる。
[0012] ここで、上記担体ポリマー粒子にぉ 、て、前記化学結合は、アミド結合およびエス テル結合の少なくとも一方を含む結合基によることができる。
[0013] 本発明の第 2の態様の担体ポリマー粒子の製造方法は、
粒径が 0. 1〜20 mの有機ポリマー粒子および前記糖類をィ匕学結合させることに より、前記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程を含む。
[0014] ここで、上記担体ポリマー粒子の製造方法にぉ 、て、前記化学結合させる際、前記 有機ポリマー粒子は、第 1の官能基を有し、前記糖類は、第 2の官能基を有し、前記 第 1の官能基と前記第 2の官能基とを反応させることにより、前記有機ポリマー粒子と 前記糖類とを結合させることができる。
[0015] ここで、上記担体ポリマー粒子の製造方法にお!、て、前記第 1の官能基は、カルボ キシル基、エポキシ基、アミノ基、およびトシル基カゝら選ばれる少なくとも 1種以上の官 能基であることができる。
[0016] 本発明の第 3の態様の担体ポリマー粒子の製造方法は、
粒径が 0. 1〜20 μ mで、かつ、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する 有機ポリマー粒子と、カルボキシル基を有する糖類とをィ匕学結合させることにより、前 記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程と、
前記表面が前記糖類で被覆された前記有機ポリマー粒子を塩基性溶液で処理す る工程と、を含む。
[0017] ここで、上記担体ポリマー粒子の製造方法にぉ 、て、前記糖類が多糖類であること ができる。
[0018] ここで、上記担体ポリマー粒子の製造方法にぉ 、て、前記化学結合は、アミド結合 およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基によることができる。
[0019] ここで、上記担体ポリマー粒子の製造方法にお!、て、カルボキシル基と反応性を有 する官能基がアミノ基、水酸基およびエポキシ基力 選ばれる少なくとも 1種以上の 官能基であることができる。 [0020] ここで、上記担体ポリマー粒子の製造方法において、目的物質を特異的に捕捉す るためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程をさらに含むことができる。
[0021] 本発明の第 4の態様の特異捕捉用磁性粒子は、
粒径が 0. 1〜20 mの磁性粒子と、糖類と、を含み、
前記磁性粒子および前記糖類が化学結合しており、かつ、目的物質を特異的に捕 捉するためのプローブが前記糖類に化学結合している。
[0022] ここで、上記特異捕捉用磁性粒子にお!、て、前記糖類は多糖類であることができる
[0023] ここで、上記特異捕捉用磁性粒子にお!ヽて、前記糖類はカルボキシメチル化され ていることができる。
[0024] ここで、上記特異捕捉用磁性粒子にお!ヽて、前記磁性粒子および前記糖類の前 記化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基による ことができる。
[0025] ここで、上記特異捕捉用磁性粒子にお!ヽて、前記磁性粒子は、核粒子と、前記核 粒子の表面に形成された磁性体層とを含む母粒子の前記磁性体層上に、ポリマー 層を重合により形成することにより得られ、前記磁性体層は、 Fe Oおよび Fe Oの
2 3 3 4 少なくとも一方を含むことができる。
[0026] ここで、上記特異捕捉用磁性粒子にお!、て、前記プローブは、タンパク質、ぺプチ ド、核酸、糖鎖化合物、および合成化学物質力 選ばれる少なくとも 1種であることが できる。
[0027] 本発明の第 5の態様の特異捕捉用磁性粒子の製造方法は、
粒径が 0. 1〜20 μ mの磁性粒子と糖類とを化学結合させる工程と、
目的物質を特異的に捕捉するためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程と を含む。
[0028] ここで、上記特異捕捉用磁性粒子の製造方法にお!ヽて、前記磁性粒子と前記糖類 とをィ匕学結合させる際、
前記磁性粒子は、第 1の官能基を有し、 前記糖類は、第 2の官能基を有し、
前記第 1の官能基と前記第 2の官能基とを反応させることにより、前記磁性粒子と前 記糖類とを結合させることができる。
[0029] ここで、上記特異捕捉用磁性粒子の製造方法において、前記第 1の官能基は、力 ルポキシル基、エポキシ基、アミノ基、およびトシル基カゝら選ばれる少なくとも 1種以上 の官能基であることができる。
[0030] 上記担体ポリマー粒子によれば、粒径が 0. 1〜20 μ mの有機ポリマー粒子と、前 記有機ポリマー粒子の表面を被覆する糖類と、を含み、前記有機ポリマー粒子およ び前記糖類が化学結合していることにより、非特異吸着が少ないという特徴を有する 。これにより、目的とする分子の分離および精製を容易に行なうことができる。
[0031] また、上記担体ポリマー粒子の製造方法によれば、粒径が 0. 1〜20 μ mで、かつ 、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する有機ポリマー粒子と、カルボキシ ル基を有する糖類とをィ匕学結合させることにより、前記有機ポリマー粒子の表面を前 記糖類で被覆する工程と、前記表面が前記糖類で被覆された前記有機ポリマー粒 子を塩基性溶液で処理する工程と、を含むことにより、非特異吸着が少なぐかつ目 的物質の捕捉効率が高い担体ポリマー粒子を得ることができる。これにより、目的と する分子（目的物質)の分離および精製を容易に行なうことができる。
[0032] さらに、上記特異捕捉用磁性粒子によれば、粒径が 0. 1〜20 μ mの磁性粒子と、 糖類と、を含み、前記磁性粒子および前記糖類が化学結合しており、かつ、目的物 質を特異的に捕捉するためのプローブが前記糖類に化学結合していることにより、非 特異吸着が少ないという特徴を有する。これにより、目的物質の分離および精製を容 易にかつ高精度にて行なうことができる。
図面の簡単な説明
[0033] [図 1]図 1は、本発明の第 1および第 2の実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造方 法の一例を模式的に示す図である。
[図 2]図 2は、本発明の第 1および第 2の実施形態に係る担体ポリマー粒子の一例を 模式的に示す図である。
[図 3]図 3は、実験例 8, 9および比較例 4において得られたプローブ結合粒子の特異 捕捉性評価結果 (プローブ結合粒子に吸着したタンパク質の電気泳動パターン)を 示す写真である。
[図 4]図 4は、実験例 10, 11および比較例 7において得られたプローブ結合粒子の 特異捕捉性評価結果 (プローブ結合粒子に吸着したタンパク質の電気泳動パターン) を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
[0034] 以下、本発明の担体ポリマー粒子およびその製造方法ならびに特異捕捉用磁性 粒子およびその製造方法について、詳細に説明する。
[0035] 1.第 1の実施形態
1 - 1.担体ポリマー粒子
本発明の第 1の実施形態に係る担体ポリマー粒子は、粒径が 0. 1〜20 mの有機 ポリマー粒子と、有機ポリマー粒子の表面を被覆する糖類と、を含む。また、本実施 形態に係る担体ポリマー粒子においては、有機ポリマー粒子および糖類が化学結合 している。限定されないが、化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも 一方を含む結合基によるものが好まし 、。
[0036] 本実施形態に係る担体ポリマー粒子はそのままで使用することも可能であるが、化 合物との反応を効率的に行なうために、分散媒に分散させた分散液として使用する ことも可能である。力かる分散媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、 イソプロピルアルコール、 n—ブチルアルコール、イソブチルアルコール、 sec-ブチル ァノレコーノレ、 tert—ブチルアルコールなどのアルコール類、エチレングリコーノレ、ェ チレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、エチレングリコーノレモノェチノレエーテノレ、ェチ レングリコーノレモノプロピノレエーテノレ、エチレングリコーノレモノブチノレエーテノレ、ェチ レングリコールモノェチルエーテルアセテート、ジエチレングリコ一ノレモノメチノレエー テル、ジエチレングリコールモノェチルエーテル、ジエチレングリコーノレジメチノレエ一 テル、ジエチレングリコールジェチルエーテルなどのエチレングリコール誘導体、プロ ピレングリコーノレ、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノ ェチノレエーテノレ、プロピレングリコーノレモノプロピノレエーテノレ、プロピレングリコーノレ モノブチノレエーテル、プロピレングリコーノレモノメチノレエーテノレアセテートなどのプロ ピレンダリコール誘導体、アセトン、メチルェチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチ ルアミルケトン、ジイソプチルケトン、シクロへキサノンなどのケトン類、酢酸ェチル、酢 酸ブチル、酢酸イソブチル、乳酸ェチル、 y ブチルラタトンなどのエステル類、 N, N ジメチルホルムアミド、 N, N ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなどのァ ミド類、ジメチルスルホキシド、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素などが挙げ られる。
[0037] 本実施形態に係る担体ポリマー粒子の粒径は、好ましくは 0. 1〜17 mであり、よ り好ましくは 1〜10 μ mである。ここで、粒径が 0. 1 μ m未満の場合、遠心分離などを 用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため 、目的外の分子 (例えば、タンパク質などの生体関連物質)の除去が不十分になり、 充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が 17 mを超えると、表面積が小さく なり、ターゲットとするタンパク質などの生体関連物質の捕捉量が少ない場合がある。
[0038] 次に、本実施形態に係る担体ポリマー粒子の構成要素について詳細に説明する。
[0039] 1 - 1 - 1.有機ポリマー粒子
本実施形態で使用する有機ポリマー粒子の平均粒子径は好ましくは 0. 1〜20 μ m、さらに好ましくは 0. 3〜15 μ m、もっとも好ましくは 1〜10 μ mである。また、本発 明で使用する有機ポリマー粒子の変動係数は、通常 30%以下、好ましくは 20%以 下、より好ましくは 10%以下である。
[0040] 本実施形態にぉ 、て、有機ポリマー粒子は、本実施形態に係る担体ポリマー粒子 のベース粒子として使用することができる。有機ポリマー粒子は、化学結合によって 結合された糖類で表面を被覆することが容易であるため、ベース粒子として適して!/ヽ る。また、有機ポリマー粒子として、磁性粒子を用いることができる。
[0041] 上述したように、本実施形態に係る担体ポリマー粒子を溶媒に分散させる場合、分 散媒に有機ポリマー粒子が溶解したり、あるいは溶媒によって有機ポリマー粒子が膨 潤したりすると、タンパク質などの生体関連物質の非特異吸着が増加する。このため 、有機ポリマー粒子は、分散媒に溶解しないことが望ましい。ここで、分散媒としては 、例えば、水系媒体を用いることができる。ここで、水系媒体とは、水、または水と水に 溶解する溶剤（例えば、アルコール類、アルキレングリコール誘導体など）との混合物 をいう。
[0042] 有機ポリマー粒子を構成するポリマーとしては、特に、ビュル系ポリマーが好ましい 。ビュル系ポリマーを構成するビュル系モノマーとしては、スチレン、 α—メチルスチ レン、ハロゲン化スチレン、ジビュルベンゼンなどの芳香族ビュル単量体、酢酸ビ- ル、プロピオン酸ビュルなどのビュルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和-トリ ル、メチルアタリレート、ェチルアタリレート、ェチルメタタリレート、ブチルアタリレート、 ブチルメタタリレート、 2—ェチルへキシルアタリレート、 2—ェチルへキシルメタクリレ ート、ラウリルアタリレート、ラウリルメタタリレート、シクロへキシルアタリレート、シクロへ キシルメタタリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル、エチレン グリコールジアタリレート、エチレングリコールジメタタリレート、トリメチロールプロパント リアタリレート、トリメチロールプロパントリメタタリレートなどの多官能性 (メタ)アタリレー ト、グリシジルアタリレート、グリシジルメタタリレート、 2—ヒドロキシェチルアタリレート、 2—ヒドロキシェチルメタタリレートなどの官能基を有する (メタ)アタリレートなどを例示 することができる。このビュル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビ- ル系モノマー力 選ばれた 2種以上のモノマーからなる共重合体であってもよ!/、。ま た、上記ビュル系モノマーとブタジエン、イソプレンなどの共役ジォレフイン、アクリル 酸、メタクリル酸、ィタコン酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、 Ν—メチロールアクリル アミド、 Ν—メチロールメタクリルアミド、ジァリルフタレート、ァリルアタリレート、ァリルメ タクリレートなどの共重合可能なモノマーとの共重合体も使用することができる。
[0043] 磁性粒子は、磁石で集めることが可能な公知の粒子状物質であり、磁性体微粒子 を含有する。本実施形態において使用される有機ポリマー粒子が磁性粒子である場 合、本実施形態に係る担体ポリマー粒子は、例えば後述する用途に使用可能な磁 性粒子として使用することができる。
[0044] 磁性粒子の粒径が 0. 1 μ m未満であると、磁力による分離精製に長時間を要する ことがあり、 20 /z mを超えると表面積が小さくなり、ターゲットとするタンパク質などの 生体関連物質の捕捉量が少な ヽ場合がある。
[0045] 磁性粒子の内部組成は均質であってもよいが、上記の好ましい粒径範囲にある均 質な磁性体粒子は、常磁性である物質が多ぐ磁力による分離精製を繰り返すと媒 質への再分散が困難になる場合がある。このため、磁性粒子は、残留磁化の少ない 磁性体微粒子を含む、不均質な内部組成を有することがより好ましい。このような不 均質な内部組成を有する磁性粒子の内部構造としては、磁性体微粒子をポリマーな どの非磁性体の連続相中に分散した構造、磁性体微粒子の 2次凝集体をコアとして ポリマーなどの非磁性体をシェルとする構造、ポリマーなどの非磁性体 (非磁性核粒 子)をコアとして磁性体微粒子の 2次凝集体をシェルとする構造などが挙げられる。こ こで、磁性粒子に含まれるポリマーとしては、例えば、有機ポリマー粒子を構成するも のとして列記された上記ポリマーであってもよ 、。ポリマーなどの非磁性体 (非磁性核 粒子)をコアとして磁性体微粒子の 2次凝集体をシェルとする内部構造の場合、最外 層にさらにポリマー層を形成することが好ましい。最外層のポリマーとしては、例えば 、ベース粒子に使用する有機ポリマー粒子を構成するものとして列記された上記ポリ マーであってもよい。
[0046] 本実施形態にぉ 、て、有機ポリマー粒子は、例えば、乳化重合、ソープフリー重合 、懸濁重合などの定法を用いて製造が可能である。また、有機ポリマー粒子が磁性 粒子の場合、例えば、非磁性核粒子と磁性体微粒子とを混合し、非磁性核粒子の表 面に磁性体微粒子を物理的に吸着させることにより製造が可能である。なお、本実施 形態において、「物理的吸着」とは、化学反応を伴わない吸着を意味する。「物理的 吸着」の原理としては、例えば、疎水 Z疎水吸着、溶融結合または吸着、融着結合ま たは吸着、水素結合、ファンデルワールス結合などが挙げられる。
[0047] より具体的には、有機ポリマー粒子は、例えば、上記ビュル系モノマーの懸濁重合 、あるいはポリマーノ レクの粉砕によって得ることができる。例えば、有機ポリマー粒 子は、特公昭 57— 24369号公報記載のシード粒子を用いる二段膨潤重合法、ジャ 一ナル'ォブ'ポリマーサイエンス 'ポリマーレタ一'エディション， 937頁，第 21卷， 1 963年 (J. Polym. Sc i., Polymer Letter Ed. 21, 937 (1963) )記載の重合方法、特 開昭 61— 215602号公報、特開昭 61— 215603号公報、および特開昭 61— 2156 04号公報記載の方法によって作製することができる。
[0048] また、磁性粒子は、上述したように、疎水 Z疎水吸着を利用する方法によって作製 することができる。例えば、非磁性核粒子の表面および磁性体微粒子の表面が疎水 性のものあるいは疎水化処理されたものを選択し、これらの非磁性核粒子および磁 性体微粒子をドライブレンドするか、あるいは、非磁性核粒子および磁性体微粒子の 双方を侵すことなく良分散性の溶剤 (例えばトルエン、へキサン）中で充分分散させ た後、混合条件下で溶剤を揮発させる方法が挙げられる。
[0049] あるいは、磁性粒子を、物理的に強い力を外部からカ卩えることにより、非磁性核粒 子および磁性体微粒子の複合ィ匕を実現させる方法により作製することもできる。物理 的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレー ド加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの 、あるいはジェットミル、ハイブリダィザ一など高速気流中衝撃法を利用するものが挙 げられる。効率よくかつ強固に複合ィ匕を実施するには、物理的吸着力が強いことが 望ましい。その方法としては、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは 15 mZ秒以上、より好ましくは 30mZ秒以上、さらに好ましくは 40〜150mZ秒で実施 することが挙げられる。撹拌翼の周速度が 15mZ秒より低いと、非磁性核粒子の表 面に磁性体微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがあ る。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、 エネルギー効率などの点から自ずと決定される。
[0050] 1— 1— 2.糖類
本実施形態に係る担体ポリマー粒子に用いられる糖類としては、例えば、フルクト ース，ァラビノース，キシロース，リボース，デォキシリボースなどのフラノース類、グル コ一ス，マンノース，ガラクトースなどのビラノース類、セプタノース類などの単糖類、ト レノヽロース，ラクトース， コージオース， -ゲロース， マノレトース，イソマノレトース，ソホロ ース,ラミナリオース，セロビオース，ゲンチビオースなどの二糖類、デンプン，アミ口 ース,アミロぺクチン，デキストリン，グリコーゲン，シクロデキストリン，セルロース，ァ ガロース，アルギン酸，ィヌリン，ダルコマンナン，キチン，キトサン，ヒアルロン酸など の多糖類を挙げることができる。有機ポリマー粒子と糖類とをィ匕学結合させて、有機 ポリマー粒子の表面を覆うためには、被覆効率の点で高分子量の多糖類が好ま ヽ
。なお、糖類は、例えばカルボキシメチルセルロースやカルボキシメチルデキストラン のように、上述した糖類の分子内の官能基 (例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル 基など）の少なくとも一部が変換されたものであってもよぐその変換は必要に応じて 多段階施されたものであってもよい。より好ましくは、糖類として、例えばカルボキシメ チルセルロースやカルボキシメチルデキストランのように、カルボキシメチル化されて いるものを用いる。
[0051] 1 - 2.担体用ポリマー粒子の製造方法
本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造方法は、粒径が 0. l〜20 /z mの有機 ポリマー粒子および前記糖類をィ匕学結合させることにより、前記有機ポリマー粒子の 表面を糖で被覆する工程を含む。
[0052] 本実施形態において、有機ポリマー粒子と糖類とをィ匕学結合させるための手法とし ては特に制限がなぐ公知の化学反応を用いることができる。
[0053] 図 1は、本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造方法の一例を模式的に示す図 である。図 2は、本実施形態に係る担体ポリマー粒子の一例を模式的に示す図であり
、図 1に示される工程により作製された本実施形態に係る担体ポリマー粒子 10を示し ている。
[0054] 例えば、図 1に示されるように、本実施形態に係る担体ポリマー粒子を作製する際 に使用する有機ポリマー粒子 11は、その表面に複数の官能基 (第 1の官能基） 13を 有していてもよい。ここで第 1の官能基 13とは、有機ポリマー粒子 11の粒子形状形成 時に導入された官能基でもよ!ヽし、あるいはその官能基を粒子形状形成後に変換す ることによって得られた官能基でもよい。その際、官能基の変換は必要に応じて複数 回行なってもよい。限定されないが、例えば有機ポリマー粒子 11の粒子形状を形成 した際に導入された官能基がエポキシ基である場合、そのエポキシ基に大過剰のァ ンモユアあるいは適当なジァミンィ匕合物を作用させて生じるアミノ基を第 1の官能基と することができるし、また例えば、有機ポリマー粒子 11の粒子形状を形成した際に導 入された官能基が水酸基である場合、その水酸基をトシル基に変換した後、そのトシ ル基に大過剰の適当なジァミンィ匕合物を作用させて生じるアミノ基を第 1の官能基 1 3とすることができる。例えば、後述する実験例 1〜3および実験例 5〜6でそれぞれ 得られる有機ポリマー粒子 Am— 1〜5においては、第 1の官能基 13がァミノ基である ことができる。 [0055] また、本実施形態に係る担体ポリマー粒子を作製する際に使用する糖類 12は、そ の 1分子中に複数個の官能基 (第 2の官能基） 14を有していてもよぐその官能基は 糖類の官能基が変換されたものであってもょ 、。
[0056] 第 1の官能基 13および Zまたは第 2の官能基 14として使用可能な官能基としては 、例えば、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基、ビニル基、 ァリル基、アクリル基、メタクリル基、トシル基、アジド基などが挙げられる。この場合、 第 1の官能基 13および第 2の官能基 14は互いに対して反応性を有する。限定されな いが、例えば、第 1の官能基 13がエポキシ基である場合、第 2の官能基 14はァミノ基 であることができるし、また例えば、第 1の官能基 13がァミノ基である場合、第 2の官 能基 14はカルボキシル基であることができる。
[0057] 図 1において、第 1の官能基 13と第 2の官能基 14とが反応することにより、有機ポリ マー粒子 11と糖類 12とが化学的に結合することができる（図 2参照)。これにより、本 実施形態に係る担体ポリマー粒子 10を得ることができる。
[0058] 本実施形態に係る担体ポリマー粒子は、上述した工程によって作製された後、必 要に応じて、 pH調整を行ない、次いで、透析 ·限外ろ過'遠心分離等の精製処理に よって表面を洗浄してから、担体粒子として使用できる。
[0059] 1 - 3.用途
本実施形態に係る担体ポリマー粒子は、創薬分野での化合物担体用粒子および 診断薬用の化学結合担体用粒子として利用できる。
[0060] より詳しくは、本実施形態に係る担体ポリマー粒子を用いて、解析対象の化学物質
(被解析化学物質)を化学結合で固定化し、タンパク物質等との分子間相互作用を 用いて当該相互作用を解析および Zまたは測定することによって、被解析ィ匕学物質 と特異的な相互作用を有するタンパク物質などを選別し、精製することが可能である
[0061] また、本実施形態に係る担体ポリマー粒子は、抗体'抗原 '酵素'ホルモン等のタン パク質、 DNA'RNA等の核酸物質、あるいは生体関連糖鎖化合物（以下、これらを「 生体関連物質」 、う）を粒子表面に化学結合法で感作させる生体関連物質担体ポ リマー粒子として利用できる。 [0062] なお、本実施形態に係る担体ポリマー粒子の用途は、上述した創薬分野での化合 物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子に限定されるわけではなぐ 例えば、生化学分野、塗料、紙、電子写真、化粧品、医薬品、農薬、食品、触媒など 広い分野で利用できる。
[0063] 2.第 2の実施形態
2- 1.担体ポリマー粒子の製造方法
本発明の第 2の実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造方法は、粒径が 0. 1〜2 O /z mで、かつ、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する有機ポリマー粒子 と、カルボキシル基を有する糖類とをィ匕学結合させることにより、前記有機ポリマー粒 子の表面を前記糖類で被覆する工程 (第 1の工程)と、前記表面が前記糖類で被覆 された前記有機ポリマー粒子を塩基性溶液で処理する工程 (第 2の工程)と、を含む
[0064] 本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造方法の第 1および第 2の工程について
、順次、詳細に説明する。
[0065] 2— 1 1.第 1の工程
本実施形態に係る第 1の工程において、有機ポリマー粒子に存在するカルボキシ ル基と反応性を有する官能基は、アミノ基、水酸基およびエポキシ基から選ばれる少 なくとも 1種の官能基であり、好ましくはァミノ基および水酸基力 選ばれる少なくとも
1種の官能基であり、さらに好ましくはァミノ基である。
[0066] 本実施形態に係る第 1の工程において、有機ポリマー粒子と糖類とを化学結合させ るための手法としては特に制限がなぐ公知の化学反応を用いることができる。ここで
、化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基による ことができる。
[0067] 図 1は、本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造方法の第 1の工程を説明する 図であり、図 2は、第 1の工程により得られた担体ポリマー粒子の一例を模式的に示 す図である。
[0068] 例えば、図 1に示されるように、本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造に使用 される有機ポリマー粒子 11は、カルボキシル基と反応性を有する官能基 13をその表 面に有する。ここで、カルボキシル基と反応性を有する官能基 13は、有機ポリマー 1 1の粒子形状を形成する際に導入されてもよいし、あるいは、粒子形状を形成した後 に所定の官能基を変換することによって得てもよい。その際、官能基の変換は、必要 に応じて複数回行なってもよい。例えば、有機ポリマー 11の粒子形状を形成した際 に導入された官能基がエポキシ基である場合、そのエポキシ基に大過剰のアンモ- ァあるいは適当なジァミンィ匕合物を作用させて生じるアミノ基を、カルボキシル基と反 応性を有する官能基 13とすることができるし、あるいは、例えば有機ポリマー 11の粒 子形状を形成した際に導入された官能基が水酸基である場合、その水酸基をトシル 基に変換した後、そのトシル基に大過剰の適当なジァミンィ匕合物を作用させて生じる アミノ基を、カルボキシル基と反応性を有する官能基 13とすることができる。例えば後 述する実験例 1〜3および実験例 5〜6でそれぞれ得られる有機ポリマー粒子 Am— 1〜5においては、カルボキシル基と反応性を有する官能基 13がァミノ基である。
[0069] また、本実施形態に係る担体ポリマー粒子を製造する際に使用される糖類 12は、 その 1分子中に 1個または複数個のカルボキシル基 14を有していてもよぐそのカル ボキシル基 14は、糖類 12中の所定の官能基を変換することにより得られたものであ つてもよい。
[0070] カルボキシル基と反応性を有する官能基 13として使用可能な官能基としては、例 えば、ァミノ基が挙げられる。このアミノ基は上述したように、有機ポリマー 11の粒子 形状を形成した際に導入された官能基 (例えば、水酸基、エポキシ基)から変換され たものであってもよい。この場合、カルボキシル基と反応性を有する官能基 13と、力 ルポキシル基 14とは、互いに対して反応性を有する。限定されないが、例えば、カル ボキシル基と反応性を有する官能基 13がァミノ基、水酸基およびエポキシ基力 選 ばれる少なくとも 1種である場合、この官能基 13はカルボキシル基 14と反応性を有す る。
[0071] 図 1において、カルボキシル基と反応性を有する官能基 13とカルボキシル基 14と が反応することにより、有機ポリマー粒子 11と糖類 12とが化学的に結合することがで きる。
[0072] 化学結合させるための手法は特に制限がなぐ公知の化学反応を用いることができ る力 例えば、カルボキシル基と反応性を有する基がエポキシ基である場合は、直接 に反応させることによりエステル結合を形成させることができる。また、カルボキシル基 と反応性を有する基が水酸基である場合は、例えば、種々の縮合剤を用いてエステ ル化する手法 (第 4版実験化学講座 22, p45〜47, 1992)などを挙げることができる。ま た、カルボキシル基と反応性を有する基がアミノ基である場合は、有機合成において 種々の縮合剤を用いてアミド化する手法 (第 4版実験化学講座 22, pl39〜144, 1992) や、ペプチド合成にお！、てペプチド結合形成に用いられる種々の手法 (第 4版実験 化学講座 22, p259〜271, 1992)などを挙げることが出来る。
[0073] このように、有機ポリマー粒子 11と糖類 12とが化学的に結合して、有機ポリマー粒 子 11の表面が糖類 12で被覆された後（図 2参照）、反応系中に過剰に存在する糖類 (図示せず） 1S 有機ポリマー粒子 11と化学的に結合した糖類 12に対して、カルボキ シル基 カルボキシル基、および Zまたはカルボキシル基一水酸基、および Zまた は水酸基—水酸基間の水素結合等により物理的に吸着することがある。有機ポリマ 一粒子 11の表面が化学結合した糖類 12で十分に被覆されるためには、過剰の糖類 を反応に用いる必要があるため、糖類 12の物理的吸着が多少なりとも起こることは避 けられない。このように、糖類が物理的に吸着したままの有機ポリマー粒子 11を用い て、目的物質の分離および精製を行なうと、カルボキシル基 14の利用効率が低下し たり、粒子 10の表面が部分的に多孔質ィ匕することにより非特異吸着が増カロしたり、い つたん捕捉した目的物質が分離'精製の操作中に、物理的に吸着した糖類ととも〖こ 脱離したりする等の問題が生じることがある。
[0074] 2— 1 2.第 2の工程
本実施形態に係る第 2の工程において、第 1の工程で得られた、表面が糖類 12で 被覆された有機ポリマー粒子 11を塩基性溶液で処理することにより、第 1の工程で有 機ポリマー粒子 11の表面に物理的に吸着した糖類を塩等の形態で溶液中に抽出す ることができる。第 2の工程において、十分な量の塩基性溶液を用いて有機ポリマー 粒子 11を処理することにより、最終的には、有機ポリマー粒子 11の表面に化学結合 した糖類 12 (図 2参照）のみが残り、上述したような物理的に吸着した糖類に起因し て生じる問題を解消することができる。以上の工程により、物理的に吸着した糖類が 除去された、有機ポリマー粒子 11と、有機ポリマー粒子 11の表面を被覆する糖類 12 とを含む担体ポリマー粒子 10が得られる。
[0075] ここで使用される塩基性溶液は、物理的に吸着した糖類を抽出できるものであれば 特に限定されないが、例えば水酸ィ匕ナトリウム水溶液、水酸ィ匕カリウム水溶液、水酸 ィ匕リチウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸カリウム 水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、炭酸リチウム水溶液、アンモニア水、水酸化テトラ メチルアンモ-ゥム水溶液等のアルカリ性水溶液、水溶性有機アミン類の水溶液等 を挙げることができる。
[0076] ここで使用される塩基性溶液の濃度は、通常 0. 001M以上である。また処理温度 は、通常 0〜50°C、好ましくは 0〜30°Cである。
[0077] また、塩基性溶液には効率の点で劣る力 適当な電解質溶液で処理することによつ ても物理的に吸着した糖類を抽出することができる。
[0078] 2— 1 3.第 3の工程
本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造方法は、 目的物質を特異的に捕捉す るためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程 (第 3の工程)をさらに含むことが できる。この第 3の工程により得られる粒子（以下、「プローブ結合粒子」とする。）には 、 目的物質を特異的に捕捉するためのプローブが糖類に化学結合している。ここで、 特に限定されないが、糖類とプローブとは、例えば、 O 結合、 S 結合、 -SO 結合、 -SO 結合、 CO—結合、 -CO 結合、 NR1—結合 (ここで、 R1は
2 2
、アルキル基または H)、— N+R 3 結合 (ここで、 R2、 R3はそれぞれ独立に、アル キル基または H)、 一 NHCO 結合、 -PO 一結合などの化学結合を介して結合し
2
ていることができる。例えば、糖類に含まれる官能基とプローブに含まれる官能基とを 公知の方法により化学反応させることにより、糖類とプローブとをィ匕学結合させること ができる。
[0079] ここで、糖類に含まれる官能基およびプローブに含まれる官能基は特に限定されな いが、例えば、水酸基、ァシル基、メルカプト基、アミノ基、アミノアシル基、カルボ二 ル基、ホルミル基、カルボキシル基、アミド基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、 トシル基、アジド基、ビュル基、ァリル基などの基が挙げられる。 [0080] また、本実施形態にぉ 、て、「目的物質」とは、本実施形態に係るプローブ結合粒 子を用いた捕捉の対象となる物質をいう。 目的物質としては、例えば生体関連物質 が挙げられる。本実施形態において「生体関連物質」とは、生体に関わるすべての物 質をいう。生体関連物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物 質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。
[0081] より具体的には、生体関連物質は特に限定されないが、例えば、タンパク質 (例え ば、酵素、抗体、受容体等）、ペプチド (例えばダルタチオン、 RGDペプチド等）、核 酸 (例えば、 DNAや RNA等）、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質 (例え ば、血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮 遊細胞等）が挙げられる。
[0082] 例えば、プローブがタンパク質である場合、タンパク質中の官能基 (例えば、アミノ基 、カルボキシル基)と、糖類中の官能基 (例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基)と を反応させることにより、プローブと糖類とをィ匕学結合させることができる。この場合、 プローブと糖類とをアミド結合またはエステル結合を介して結合させることができる。
[0083] また、例えば、プローブが核酸である場合、核酸中の官能基 (例えば、リン酸基）と、 糖類中の官能基 (例えば水酸基)とを反応させることにより、プローブと糖類とをィ匕学 結合させることができる。この場合、プローブと糖類とをホスホジエステル結合を介し て結合させることができる。
[0084] 本実施形態に係る特異捕捉用粒子で使用可能なプローブは、特に限定されない 力 例えば、タンパク質 (例えば、抗体、抗原、酵素、受容体、ホルモンなど）、ぺプチ ド、核酸 (例えば、 DNA, RNAなど）、糖鎖化合物、および合成化学物質 (例えば、 薬物候補物質)であることができる。
[0085] 例えば、プローブが抗体 (または抗原)である場合、 目的物質は前記抗体 (または 前記抗原)と特異的に結合する抗原 (または抗体)であることができる。
[0086] また、例えば、プローブが核酸である場合、 目的物質は前記核酸と特異的に結合 する核酸であることができる。あるいは、例えば、プローブが酵素、受容体、またはホ ルモンの場合、 目的物質は前記酵素、前記受容体、または前記ホルモンと特異的に 結合する化合物であることができる。 [0087] 2- 1 -4.本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造で使用される物質 次に、本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造で使用される各物質について詳 細に説明する。
[0088] 2— 1— 4A.有機ポリマー粒子
本実施形態に係る担体ポリマー粒子の製造で使用される有機ポリマー粒子の平均 粒子径は好ましくは 0. 1〜20 111、さらに好ましくは0. 3〜15 /ζ πι、もっとも好ましく は 1〜： LO /z mである。また、本実施形態で使用する有機ポリマー粒子の変動係数は 、通常 30%以下、好ましくは 20%以下、より好ましくは 10%以下である。
[0089] 本実施形態において、有機ポリマー粒子は、本実施形態により製造される担体ポリ マー粒子のベース粒子として使用することができる。有機ポリマー粒子は、化学結合 によって結合された糖類で表面を被覆することが容易であるため、ベース粒子として 適している。また、有機ポリマー粒子として、磁性粒子を用いることができる。
[0090] 上述したように、本実施形態により製造される担体ポリマー粒子を溶媒に分散させ る場合、分散媒に有機ポリマー粒子が溶解したり、あるいは溶媒によって有機ポリマ 一粒子が膨潤したりすると、タンパク質などの生体関連物質の非特異吸着が増加す る。このため、有機ポリマー粒子は、分散媒に溶解しないことが望ましい。ここで、分 散媒としては、例えば、水系媒体を用いることができる。ここで水系媒体とは、水、また は水と水に溶解する溶剤（例えば、アルコール類、アルキレングリコール誘導体など） との混合物をいう。
[0091] 有機ポリマー粒子としては、上述の第 1の実施形態で有機ポリマー粒子を構成する ポリマーとして例示したものを用いることができ、また、上述の第 1の実施形態で例示 した方法にて製造することができる。有機ポリマー粒子を構成するポリマーとしては、 特に、ビニル系ポリマーが好ましい。
[0092] また、磁性粒子としては、上述の第 1の実施形態で説明した磁性粒子を用いること ができる。
[0093] 2— 1 4B.糖類
本実施形態の担体ポリマー粒子の製造で使用される、カルボキシル基を有する糖 類としては、例えば、フルクトース，ァラビノース，キシロース,リボース，デォキシリボ ースなどのフラノース類、グルコース，マンノース，ガラクトースなどのビラノース類、セ プタノース類などの単糖類、トレハロース，ラタトース，コージオース， -ゲロース，マ ノレトース，イソマルトース，ソホロース，ラミナリオース，セロビオース，ゲンチビオース などの二糖類、デンプン，アミロース，アミロぺクチン，デキストリン，グリコーゲン，シク ロデキストリン，セルロース，ァガロース，ィヌリン，ダルコマンナン，キチン，キトサンな どの多糖類、などの糖類の分子内の官能基 (例えば、水酸基，アミノ基など）の少なく とも一部をィ匕学修飾してカルボキシル基を導入したもの（例えば、カルボキシメチル セルロース，カルボキシメチルデキストランや、カルボキシル基を元来有する多糖類（ 例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸など）などを挙げることができる。
[0094] ここで、糖類をィ匕学修飾してカルボキシル基を導入するための手法としては特に制 限がなぐ公知の化学反応を用いることができ、その化学修飾は必要に応じて多段 階施されたものであってもよい。また、有機ポリマー粒子と糖類とをィ匕学結合させて、 有機ポリマー粒子の表面を覆うためには、被覆効率の点で高分子量の多糖類が好ま しい。カルボキシル基を含有する糖類として、特に好ましいのは、カルボキシメチルセ ルロースおよびカルボキシメチルデキストランである。
[0095] 2— 1 5.担体ポリマー粒子
本実施形態により製造される担体ポリマー粒子の粒径は、好ましくは 0. 1〜17 m であり、より好ましくは 1〜10 μ mである。ここで、粒径が 0. 1 μ m未満の場合、遠心 分離などを用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分 になるため、 目的外の分子 (例えば、タンパク質などの生体関連物質)の除去が不十 分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が 17 mを超えると、表面 積が小さくなり、ターゲットとするタンパク質などの生体関連物質の捕捉量が少ない場 合がある。
[0096] 本実施形態により製造される担体ポリマー粒子は、上述の製造方法によって作製さ れた後、必要に応じて、 pH調整を行ない、次いで、透析'限外ろ過'遠心分離等の 精製処理によって表面を洗浄してから、担体粒子として使用できる。
[0097] 本実施形態により製造される担体ポリマー粒子は、そのままで使用することも可能 であるが、化合物との反応を効率的に行なうために、分散媒に分散させた分散液とし て使用することも可能である。力かる分散媒としては、上述の第 1の実施形態にて分 散媒として例示したものを用いることができる。
[0098] また、本実施形態に係る担体ポリマー粒子には、上述の目的物質を特異的に捕捉 するためのプローブが糖類に化学結合されたプローブ結合粒子であってもよ!/、。この プローブは上述の第 3の工程によって糖類に化学結合させることができる。プローブ 結合粒子の粒径は好ましくは 0. 1〜20 111でぁり、ょり好ましくは0. 3〜17 /ζ πιであ り、さらに好ましくは 0. 5〜： LO /z mである。
[0099] 2- 2.用途
本実施形態により製造される担体ポリマー粒子は、創薬分野での化合物担体用粒 子および診断薬用の化学結合担体用粒子として利用できる。
[0100] より詳しくは、本実施形態により製造される担体ポリマー粒子を用いて、解析対象の 化学物質 (被解析化学物質)を化学結合で固定化し、被解析化学物質と特異的な相 互作用を有する目的物質 (タンパク物質など)を選別し、精製することが可能である。
[0101] また、本実施形態により製造される担体ポリマー粒子は、抗体'抗原 '酵素'ホルモ ン等のタンパク質、 DNA'RNA等の核酸物質、あるいは生体関連糖鎖化合物（以下 、これらを「生体関連物質」 t 、う）を粒子表面に化学結合法で感作させる生体関連 物質担体ポリマー粒子として利用できる。
[0102] なお、本実施形態により製造される担体ポリマー粒子の用途は、上述した創薬分野 での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子に限定されるわけで はなぐ例えば、生化学分野、塗料、紙、電子写真、化粧品、医薬品、農薬、食品、 触媒など広 ヽ分野で利用できる。
[0103] 3.第 3の実施形態
3- 1.特異捕捉用磁性粒子
本発明の第 3の実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子は、磁性粒子と、糖類と、を 含む。ここで、糖類は、磁性粒子の表面を被覆していてもよい。
[0104] また、本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子にお!ヽては、磁性粒子および糖類 が化学結合している。ここで、特に限定されないが、磁性粒子と糖類との化学結合は 、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基によるものが好ま ヽ [0105] さらに、本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子においては、 目的物質を特異的に 捕捉するためのプローブが前記糖類に化学結合している。ここで、特に限定されない 力 糖類とプローブとは、例えば、 O 結合、 S 結合、 SO 結合、 -SO -
2 結合、—CO 結合、 -CO—結合、 NR 結合（ここで、 Rは、アルキル基または
2
H)、— N+R2R3 結合 (ここで、 R2、 R3はそれぞれ独立に、アルキル基または H)、 - NHCO 結合、 -PO—結合などの化学結合を介して結合していることができる。
2
例えば、糖類に含まれる官能基とプローブに含まれる官能基とを公知の方法により化 学反応させることにより、糖類とプローブとをィ匕学結合させることができる。
[0106] ここで、糖類に含まれる官能基およびプローブに含まれる官能基は特に限定されな いが、例えば、水酸基、ァシル基、メルカプト基、アミノ基、アミノアシル基、カルボ二 ル基、ホルミル基、カルボキシル基、アミド基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、 トシル基、アジド基、ビュル基、ァリル基などの基が挙げられる。
[0107] また、本実施形態において、「目的物質」とは、本実施形態に係る特異捕捉用磁性 粒子を用いた捕捉の対象となる物質をいう。 目的物質としては、例えば生体関連物 質が挙げられる。本実施形態において「生体関連物質」とは、生体に関わるすべての 物質をいう。生体関連物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる 物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。
[0108] より具体的には、生体関連物質は特に限定されないが、例えば、タンパク質 (例え ば、酵素、抗体、受容体等）、ペプチド (例えばダルタチオン、 RGDペプチド等）、核 酸 (例えば、 DNAや RNA等）、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質 (例え ば、血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮 遊細胞等）が挙げられる。
[0109] 例えば、プローブがタンパク質である場合、タンパク質中の官能基 (例えば、ァミノ 基、カルボキシル基）と、糖類中の官能基 (例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基
)とを反応させることにより、プローブと糖類とをィ匕学結合させることができる。この場合 、プローブと糖類とをアミド結合またはエステル結合を介して結合させることができる。
[0110] また、例えば、プローブが核酸である場合、核酸中の官能基 (例えば、リン酸基）と、 糖類中の官能基 (例えば水酸基)とを反応させることにより、プローブと糖類とをィ匕学 結合させることができる。この場合、プローブと糖類とをホスホジエステル結合を介し て結合させることができる。
[0111] 本実施形態に係る特異捕捉用粒子で使用可能なプローブは、特に限定されない 力 例えば、タンパク質 (例えば、抗体、抗原、酵素、受容体、ホルモンなど）、ぺプチ ド、核酸 (例えば、 DNA, RNAなど）、糖鎖化合物、および合成化学物質 (例えば、 薬物候補物質)であることができる。
[0112] 例えば、プローブが抗体 (または抗原)である場合、目的物質は前記抗体 (または 前記抗原)と特異的に結合する抗原 (または抗体)であることができる。
[0113] また、例えば、プローブが核酸である場合、目的物質は前記核酸と特異的に結合 する核酸であることができる。あるいは、例えば、プローブが酵素、受容体、またはホ ルモンの場合、目的物質は前記酵素、前記受容体、または前記ホルモンと特異的に 結合する化合物であることができる。
[0114] 本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子はそのままで使用することも可能であるが 、化合物との反応を効率的に行なうために、分散媒に分散させた分散液として使用 することも可能である。力かる分散媒としては、上述の第 1の実施形態にて分散媒とし て例示したものを用いることができる。
[0115] 本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子の粒径は、 0. 1〜20 μ mであり、好ましく は 0. 3〜17 111でぁり、ょり好ましくは0. 5〜： LO /z mである。ここで、粒径力 ^Ο. Ι μ ηι 未満の場合、磁気分離などを用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子 との分離が不十分になるため、目的物質以外の物質の除去が不十分になり、充分な 精製ができない場合がある。一方、粒径が 20 mを超えると、表面積が小さくなり、 目的物質の捕捉量が少ない場合がある。
[0116] 次に、本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子の構成要素について詳細に説明す る。
[0117] 3— 1— 1.磁性粒子
本実施形態で使用する磁性粒子の平均粒子径は好ましくは 0. 1〜20 /ζ πι、より好 ましくは 0. 3〜17 /ζ πι、さらに好ましくは 0. 5〜： LO /z mである。磁性粒子の粒径が 0 . 1 m未満であると、磁力による分離精製に長時間を要することがあり、 を超 えると表面積が小さくなり、目的物質の捕捉量が少ない場合がある。
[0118] 上述したように、本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子を溶媒に分散させる場合 、分散媒に磁性粒子が溶解したり、あるいは溶媒によって磁性粒子が膨潤したりする と、目的物質の非特異吸着が増加する。このため、磁性粒子は、分散媒に溶解しな いことが望ましい。
[0119] 本実施形態で使用する磁性粒子の内部組成は均質であってもよ!/ヽが、上記の好ま しい粒径範囲にある均質な磁性体粒子は、常磁性である物質が多ぐ磁力による分 離精製を繰り返すと媒質への再分散が困難になる場合がある。このため、本実施形 態で使用する磁性粒子は、残留磁化の少ない磁性体微粒子を含む、不均質な内部 組成を有することがより好まし 、。このような不均質な内部組成を有する磁性粒子の 内部構造としては、 (i)磁性体微粒子をポリマーなどの非磁性体の連続相中に分散 した構造、（ii)磁性体微粒子の 2次凝集体をコアとして、ポリマー層など力もなる非磁 性体をシェルとする構造、 (iii)ポリマーなどの非磁性体 (非磁性核粒子）をコアとして 、磁性体層 (磁性体微粒子の 2次凝集体)をシェルとする構造などが挙げられる。ここ で、コアとして使用できるポリマーとしては、例えば、磁性粒子を構成するポリマーとし て列記された後述のポリマーであってもよい。また、（i)〜(m)において、磁性体微粒 子としては、 Fe Oおよび Fe Oの少なくとも一方であることが好ましい。
2 3 3 4
[0120] 上述の (m)の場合、すなわち、ポリマーなどの非磁性体 (非磁性核粒子）をコアとし て、磁性体層 (磁性体微粒子の 2次凝集体)をシェルとする内部構造の場合、磁性体 層上にポリマー層がさらに形成されていることが好ましい。また、この場合、ポリマー 層は、核粒子 (コア）と、前記核粒子の表面に形成された磁性体層（シェル）とを含む 母粒子の表面に、重合により前記磁性体層上に形成することができる。ここで、磁性 体層（シェル）は、 Fe Oおよび Fe Oの少なくとも一方を含む磁性体微粒子を含む
2 3 3 4
ことができる。なお、この場合、ポリマー層としては、例えば、磁性粒子を構成するポリ マーとして列記された後述のポリマーであってもよい。
[0121] また、上述の (iii)の場合、磁性粒子は、例えば、非磁性核粒子と磁性体微粒子とを 混合し、非磁性核粒子の表面に磁性体微粒子を物理的に吸着させることにより、磁 性体層を製造することができる。なお、本実施形態において、「物理的吸着」とは、化 学反応を伴わない吸着を意味する。「物理的吸着」の原理としては、例えば、疎水 Z 疎水吸着、溶融結合または吸着、融着結合または吸着、水素結合、ファンデルヮー ルス結合などが挙げられる。
[0122] さらに、上述の（m)の場合、磁性粒子は、例えば、上記ビュル系モノマーの懸濁重 合、あるいはポリマーノ レクの粉砕によって得ることができる。例えば、磁性粒子は、 特公昭 57— 24369号公報記載のシード粒子を用いる二段膨潤重合法、ジャーナル 'ォブ 'ポリマーサイエンス 'ポリマーレタ一'エディション， 937頁，第 21卷， 1963年（ J. Polym. Sci., Polymer Letter Ed. 21, 937(1963》記載の重合方法、特開昭 61— 215602号公報、特開昭 61—215603号公報、および特開昭 61—215604号公報 記載の方法によって作製することができる。
[0123] また、上述の（iii)の場合、磁性粒子は、疎水 Z疎水吸着を利用する方法によって 作製することができる。例えば、非磁性核粒子の表面および磁性体微粒子の表面が 疎水性のものあるいは疎水化処理されたものを選択し、これらの非磁性核粒子およ び磁性体微粒子をドライブレンドするか、あるいは、非磁性核粒子および磁性体微粒 子の双方を侵すことなく良分散性の溶剤 (例えばトルエン、へキサン）中で充分分散 させた後、混合条件下で溶剤を揮発させる方法が挙げられる。
[0124] あるいは、上述の (m)の場合、物理的に強い力を外部力 加えて、非磁性核粒子 の表面に磁性体微粒子を吸着させる方法により、磁性粒子を作製することもできる。 物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブ レード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用する もの、あるいはジェットミル、ハイブリダィザ一など高速気流中衝撃法を利用するもの が挙げられる。効率よくかつ強固に複合ィ匕を実施するには、物理的吸着力が強いこ とが望ましい。その方法としては、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは 15mZ秒以上、より好ましくは 30mZ秒以上、さらに好ましくは 40〜150mZ秒で実 施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が 15mZ秒より低いと、非磁性核粒子の 表面に磁性体微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことが ある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置 、エネルギー効率などの点から自ずと決定される。
[0125] 本実施形態で使用する磁性粒子を構成するポリマーとしては、例えば、上述の第 1 の実施形態で有機ポリマー粒子を構成するポリマーとして例示されたものが挙げられ る。
[0126] 3- 1 - 2. m
本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子に用いられる糖類としては、例えば、上述 の第 1の実施形態で糖類として例示されたものが挙げられる。
[0127] 3- 2.特異捕捉用磁性粒子の製造方法
本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子の製造方法は、粒径が 0. 1〜20 mの磁 性粒子と、糖類とを化学結合させる工程と、目的物質を特異的に捕捉するためのプ ローブと糖類とを化学結合させる工程と、を含む。ここで、磁性粒子と、糖類とを化学 結合させることにより、磁性粒子の表面を糖類で被覆することができる。
[0128] 本実施形態において、磁性粒子と糖類とをィ匕学結合させるための手法としては特 に制限がなぐ公知の化学反応を用いることができる。例えば、本実施形態に係る特 異捕捉用磁性粒子を作製する際に使用する磁性粒子は、その表面に複数の官能基 (第 1の官能基)を有していてもよい。ここで第 1の官能基とは、磁性粒子の粒子形状 形成時に導入された官能基でもよ ヽし、あるいはその官能基を粒子形状形成後に変 換することによって得られた官能基でもよい。その際、官能基の変換は必要に応じて 複数回行なってもよい。限定されないが、例えば磁性粒子の粒子形状を形成した際 に導入された官能基がエポキシ基である場合、そのエポキシ基に大過剰のアンモ- ァあるいは適当なジァミンィ匕合物を作用させて生じるアミノ基を第 1の官能基とするこ とができるし、また例えば、磁性粒子の粒子形状を形成した際に導入された官能基が 水酸基である場合、その水酸基をトシル基に変換した後、そのトシル基に大過剰の 適当なジァミンィ匕合物を作用させて生じるアミノ基を第 1の官能基とすることができる。 例えば、後述する実験例 8、 9でそれぞれ得られる磁性粒子 Am— 6〜7においては、 第 1の官能基がアミノ基であることができる。
[0129] また、本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子を作製する際に使用する糖類は、そ の 1分子中に複数個の官能基 (第 2の官能基)を有して 、てもよく、その官能基は糖 類の官能基が変換されたものであってもょ 、。
[0130] 第 1の官能基および Zまたは第 2の官能基として使用可能な官能基としては、例え ば、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基、ビニル基、ァリル 基、アクリル基、メタクリル基、トシル基、アジド基などが挙げられる。この場合、第 1の 官能基および第 2の官能基は互いに対して反応性を有する。限定されないが、例え ば、第 1の官能基がエポキシ基である場合、第 2の官能基はァミノ基であることができ るし、また例えば、第 1の官能基がアミノ基である場合、第 2の官能基はカルボキシル 基であることができる。
[0131] 第 1の官能基と第 2の官能基とが反応することにより、磁性粒子と糖類とをィ匕学的に 結合させることができる。これにより、本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子を得る ことができる。
[0132] また、本実施形態において、磁性粒子と糖類とをィ匕学結合させるための手法として は特に制限がなぐ公知の化学反応を用いることができる。例えば、上述したように、 プローブに含まれる官能基と糖類に含まれる官能基とをィ匕学反応させることにより、 プローブと糖類とをィ匕学結合させることができる。プローブに含まれる官能基および 糖類に含まれる官能基の具体例は、上述した通りである。
[0133] 本実施形態に係る特異捕捉用磁性粒子は、上述した工程によって作製された後、 必要に応じて、 pH調整を行ない、次いで、透析 ·限外ろ過'遠心分離等の精製処理 によって表面を洗浄してから、担体粒子として使用することができる。
[0134] 4.実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する力 本発明はこれらによって 制限されるものではない。なお、本実施例において、「％」および「部」は重量基準で ある。
[0135] 4 1.実施例 1
4- 1 - 1.評価方法
4- 1 - 1A.非特異吸着性の評価 1 (タンパク吸着）
4- 1 - 1A- 1.前洗浄工程
後述する各実験例または比較例で得られた担体ポリマー粒子の濃度が lwt%にな るように純水に希釈分散し、分散液を調製した。次に、この分散液 500 1を微量遠 心用チューブ（エツペンドルフ社製、商品名：セーフ ロックチューブ）に取り、遠心分 離機 (MX— 150,トミー精機 (株)製）にて遠心分離し（回転数 15,000rpm, 15°C, 10分間）、上澄みを除去した。次いで、沈降物を含むチューブに PBS (—）緩衝液 5 00 μ 1を注ぎ、タツチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた。
[0136] 4 1 1A— 2.蛋白吸着反応工程
引き続きこのチューブに、 lwt%BSA (ゥシ血清アルブミン）の PBS (—）溶液 500 1を注ぎ、さらにタツチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた後、常温にて 2時間回転倒混和させた。
[0137] 4 1 1A— 3.洗浄工程
引き続きこのチューブを遠心分離した後、上澄みを除去し、 10mMの HEPESlml を注いでタツチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに 2回繰り返した後、内容物を別の未使用の微量遠心用チューブに移し、遠心分離を 行なった後、上澄みを除去した。
[0138] 4 1 1A— 4.剥離工程
引き続きこのチューブに 0. 5%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液 50 1を注い でタツチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。 10分間放置した後 、遠心分離を行ない、上澄みの 20 1を採取した。
[0139] 4—1— 1A—5.サンプリング工程
ノィォラッド社製プレミックスサンプルバッファ一中での濃度が 2wt%になるように 2 メルカプトエタノールを溶解させ（以下、これを「サンプルバッファー」とする）、このう ち 20 1を微量遠心用チューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み 20 μ 1を混ぜ、チューブヒーターにて 100°Cで 5分間加熱した。
[0140] 一方、コントロールとして、 lwt%の BSAの PBS (—）溶液を 2%SDS溶液で 5, 00 0倍、 10, 000倍、 20, 000倍【こ希釈したちのを 20 1取り、サンプノレノ ッファー 20 1と混ぜ、チューブヒーターにて 100°Cで 5分間加熱した。これらを参照用希釈 BSAと 呼ぶ。
[0141] 4 1 1A— 6.電気泳動（SDS— PAGE) ノィォラッド社製縦型電気泳動システム「ミニプロティアン 3」、バイオラッド社製プレ キャストポリアクリルアミドゲル「レディーゲル J (15%)」、およびバイオラッド社製プレミ ックス泳動バッファーを用いて、ゲル 1レーンあたり 20 1をアプライし、電気泳動を行 つた。染色はバイオラッド社製シルバースティンプラスキットを用いて標準的な手法で 行った。染色されたゲルはバイオラッド社製デンシトメ一ター「GS - 700」でスキャン して画像化し、解析ソフトウェア「Multi— Analyst」を用いて、ゲルにおける BSAの バンドの濃度と面積との積を定量した。
[0142] 参照用希釈 BSAにおいて、ゲル 1レーンあたりに流れる BSAの重量が既知である ため、バンド濃度と面積との積力も検量線を引き、この検量線に基づいて、前記粒子 力も剥離した BSAの重量を重量単位で換算した。なお、この重量は、粒子 lmgあた りに吸着して 、た BSAの重量に相当する。
[0143] 4—1— IB.粒径
直径 1 μ m以上の粒子については、レーザ回折式粒度分布測定装置 ( (株）島津製 作所製) SALD— 200Vにより、直径 1 μ m未満の粒子についてはレーザ散乱回折 法粒度分布測定装置 (型名： LS 13 320, (株)ベックマン'コールター製）により粒 径を測定した。
[0144] 4 1 1C.赤外吸収スペクトル
フーリエ変換赤外分光光度計（日本電子株式会社 ¾iIR— 5500)を用い、 KBr法 により赤外吸収スペクトルを測定した。
[0145] 4—1— 2.合成例
4- 1 - 2A.合成例 1 (有機ポリマー粒子 A— 1の合成）
有機ポリマー粒子 A— 1は、シード粒子を用いる二段膨潤重合法で作製した。
[0146] シード粒子として、ソープフリー重合で重合した粒子径 0. 98 μ mのポリスチレン粒 子を用い、このポリスチレン粒子を水 500gに窒素雰囲気下で分散させて水分散体（ 固形分量 5. Og)を調製し、これに二段膨潤重合法 (特公昭 57— 24369号公報記載 の方法に準拠)でシード粒子に、一段目として有機溶剤（シェルゾール TKO. lg)、 二段目としてモノマー（MMA (メタクリル酸メチル） 70g、 TMP (トリメチロールプロパ ントリメタタリレート） 10g、および GMA (グリシジルメタタリレート） 20g)をカ卩えて吸収さ せた後、 AIBN (ァゾビスイソブチ口-トリル）を 2g添カ卩して 75°Cで 24時間ゆっくり撹 拌した。次に、この反応液を冷却した後、 500メッシュ金網でろ過したところ、 99%が 通過し、良好な重合安定性であった。重合収率は 99%であった。得られた有機ポリ マー粒子 A— 1の粒子径は 2. 71 μ mであり、粒子径の変動係数は 2%で、単分散粒 子であった。
[0147] 4- 1 - 2B.合成例 2 (有機ポリマー粒子 A— 2の合成）
モノマーとして MMA50g、 TMP10g、および GMA40gを使用した以外は、上記 合成例 1と同様の方法を用いることにより、粒子径が 2. 64 /z mであり、変動係数が 2 %の有機ポリマー粒子 A— 2を得た。
[0148] 4- 1 - 2C.合成例 3 (有機ポリマー粒子 A— 3の合成）
モノマーとして MMA30g、 TMP10g、および GMA60gを使用した以外は、上記 合成例 1と同様の方法を用いることにより、粒子径が 2. 61 μ mであり、変動係数が 2. 1 %の有機ポリマー粒子 A— 3を得た。
[0149] 4—1— 2D.合成例 4 (有機ポリマー粒子 A— 4の合成）
シード粒子として粒径 2. 6 mのポリスチレン粒子を使用した以外は、上記合成例 3と同様の方法を用いることにより、粒子径が 7. 05 mであり、変動係数が 2. 3%の 有機ポリマー粒子 A - 4を得た。
[0150] 4- 1 - 2E.合成例 5 (有機ポリマー粒子 A— 5の合成）
モノマーとして TMP 10gおよび GMA90gを使用した以外は、上記合成例 1と同様 の方法を用いることにより、粒子径が 2. 58 mであり、変動係数が 2. 3%の有機ポリ マ一粒子 A— 5を得た。
[0151] 4— 1— 2F.合成例 6 (糖類 CMC— 1の合成）
日本製紙ケミカル株式会社製カルボキシメチルセルロースナトリウム塩 APP— 84 ( 平均分子量 17, 000でグルコース単位 1個当たり平均 0. 7個のカルボキシル基を含 有)の水溶液に液の pHが 2以下になるまで希塩酸を加え、この液を透析した後、濃縮 することによりカルボキシメチルセルロース CMC— 1の 2. 5%水溶液を得た。
[0152] 4— 1— 2G.合成例 7 (糖類 CMD— 1の合成）
フアルマシア AB (Pharmacia AB)社製デキストラン T500 (平均分子量 500, 0 00)の 10wt%水溶液 2. 5gに水酸化ナトリウム 0. 72gおよびブロモ酢酸 1. 04gを加 え、均一になるまで数分間攪拌した。次に、この溶液を 40°Cに 60時間保持した後、 氷冷し、次いで、液の pHが 2以下になるまで希塩酸を加え、この液を透析した後、凍 結乾燥することにより、カルボキシメチルデキストラン CMD— 1を得た。滴定により、 C MD— 1に含まれるカルボン酸を定量したところ、 CMD—1は、グルコース単位 1個 当たり平均 0. 4個のカルボン酸基を含有していた。
[0153] 4 1 3.実験例 1
有機ポリマー粒子 A—1の分散液力 遠心分離により単離した重合体粒子をァセト ンに分散させ、遠心分離して洗浄する操作を 3回繰り返した後、乾燥させた。次に、こ の粒子 0. 50gを 100mlフラスコに入れ、エチレンジァミン 25gをカ卩えた後、間接超音 波を 10分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で 50°Cにて 6時間加熱攪拌し、 その後、遠心分離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子をメタノールで 2回、 水 Zメタノール混合物（3Zl、容積比)で 3回洗浄した後、乾燥させることにより、有 機ポリマー粒子 Am— 1を白色粉末として 0. 54g得た。
[0154] この有機ポリマー粒子 Am— 1は、有機ポリマー粒子 A— 1と比較して重量が増加し た。さらに、エチレンジァミン処理前の赤外吸収スペクトル (有機ポリマー粒子 A—1 の赤外吸収スペクトル）と比較して、この有機ポリマー粒子 Am— 1 (エチレンジァミン 処理後）の赤外吸収スペクトルにお 、ては、有機ポリマー粒子 A— 1の赤外吸収スぺ タトルにおいて 900cm_1付近に観測されたエポキシ基に由来するピークが消失し、 かつ、 1級ァミンに典型的なピークが 3300cm_1付近および 3500cm_1付近に新た に観測された。以上の結果から、有機ポリマー粒子 Am— 1は、有機ポリマー粒子 A —1にァミノ基が導入されたものであることが確認された。すなわち、有機ポリマー粒 子 Am— 1では、第 1の官能基 13がァミノ基である。
[0155] 次に、上記合成例 6で得た CMC— 1の 2. 5%水溶液 1. 2gに、有機ポリマー粒子 Am— 1を 30. 6mgカ卩え、間接超音波を 30分間照射して分散させた。次いで、この 分散液を氷冷し、塩酸 1ーェチルー 3—（3 ジメチルァミノプロピル)カルポジイミド の 10wt%水溶液 0. 30gをカ卩え、氷冷下で 12時間攪拌した。続いて、遠心分離によ り粒子を単離し、純水に分散させ遠心分離して洗浄する操作を 10回繰り返した後、 乾燥させることにより、 33. 6mgの担体ポリマー粒子 P— 1を得た。
[0156] 担体ポリマー粒子 P— 1の赤外吸収スペクトルにおいては、反応前の有機ポリマー 粒子 Am— 1に由来するピークに加えて、新たにカルボキシメチルセルロースに由来 する 3400cm_1付近および 1600cm_1付近のピークなどが観測された。以上の結果 から、担体ポリマー粒子 P—1においては、有機ポリマー粒子 Am— 1に糖類 (カルボ キシメチルセルロース）が結合して 、ることが確認された。
[0157] 担体ポリマー粒子 P— 1について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にし たがって測定した結果、 0. 08ngZmgと非常に低い値であった。
[0158] 4 1 4.実験例 2
有機ポリマー粒子 A— 2の分散液を用いた以外は、上記実験例 1と同様の操作を 行なうことにより、 0. 57gの有機ポリマー粒子 Am— 2を得た。次いで、有機ポリマー 粒子 Am— 2 (29. 6mg)および CMC—1の 2. 5%水溶液（1. 2g)を用いた以外は、 上記実験例 1と同様の操作を行なうことにより、カルボキシメチルセルロース結合粒子 (担体ポリマー粒子） P— 2を 34. Omg得た。
[0159] 担体ポリマー粒子 P— 2について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にし たがって測定した結果、 0. 05ngZmgと非常に低い値であった。
[0160] 4 1 5.実験例 3
有機ポリマー粒子 A— 3の分散液を用いた以外は、上記実験例 1と同様の操作を 行なうことにより、 0. 6 lgの有機ポリマー粒子 Am— 3を得た。次いで、有機ポリマー 粒子 Am— 3 (29. 9mg)および CMC—1の 2. 5%水溶液（1. 2g)を用いた以外は、 上記実験例 1と同様の操作を行なうことにより、カルボキシメチルセルロース結合粒子 (担体ポリマー粒子） P— 3を 36. 2mg得た。
[0161] 担体ポリマー粒子 P— 3について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にし たがって測定した結果、 0. 02ngZmgと非常に低い値であった。
[0162] 4 1 6.実験例 4
上記合成例 7で得られた CMD— 1の 150mgを純水 6gに溶解し、ここに上記実験 例 1で得られた有機ポリマー粒子 Am— 1を 150. 5mgカ卩え、間接超音波を 30分間 照射して分散させた。次に、この分散液を氷冷し、塩酸 1ーェチルー 3—（3 ジメチ ルァミノプロピル)カルポジイミドの 5wt%水溶液 1. 40gをカ卩え、氷冷下で 12時間攪 拌した。次いで、遠心分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ遠心分離して洗 浄する操作を 10回繰り返した後、乾燥させること〖こより、 156. 2mgの担体ポリマー粒 子 P— 4を得た。
[0163] 担体ポリマー粒子 P— 4の赤外吸収スペクトルにおいては、反応前の有機ポリマー 粒子 Am— 1に由来するピークに加えて、新たにカルボキシメチルデキストランに由来 する 3400cm_1付近および 1600cm_1付近のピークなどが観測された。以上の結果 から、担体ポリマー粒子 P— 4においては、有機ポリマー粒子 Am— 1に糖類 (カルボ キシメチルデキストラン）が結合して 、ることが確認された。
[0164] 担体ポリマー粒子 P— 4について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にし たがって測定した結果、 0. 07ngZmg粒子と非常に低い値であった。
[0165] 4 1 7.実験例 5
有機ポリマー粒子 A— 4の分散液を用いた以外は上記実験例 1と同様の操作を行 なうこと〖こより、 0. 62gの有機ポリマー粒子 Am— 4を得た。この有機ポリマー粒子 A m— 4 (29. 9mg)および CMC—1の 2. 5%水溶液（1. 2g)を用いた以外は、実験 例 1と同様の操作を行なうことにより、カルボキシメチルセルロース結合粒子 (担体ポリ マー粒子） P— 5を 36. lmg得た。
[0166] 担体ポリマー粒子 P— 5について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にし たがって測定した結果、 0. 05ngZmg粒子と非常に低い値であった。
[0167] 4 1 8.実験例 6
有機ポリマー粒子 A— 5の分散液力も遠心分離により単離した重合体粒子を、ァセ トンに分散させ遠心分離して洗浄する操作を 3回繰り返した後、乾燥させた。
[0168] 次に、この粒子 0. 50gを 100mlフラスコ〖こ入れ、ジメチルスルホキシド 46. 5gを加 え、間接超音波を 10分間照射して分散させてから 10wt%エチレンジァミン溶液 (溶 媒:ジメチルスルホキシド） 3. 5gをカ卩えた後、窒素雰囲気下で 50°Cにて 4時間加熱 攪拌し、その後、遠心分離により粒子を単離した。この粒子をメタノールで 2回、水 Z メタノール混合物（3Zl、容積比）で 3回洗浄した後、乾燥させることにより、 0. 55g の白色粉末として有機ポリマー粒子 Am— 5を得た。 [0169] この有機ポリマー粒子 Am— 5は、有機ポリマー粒子 A— 5と比較して重量が増加し た。さらに、エチレンジァミン処理前の赤外吸収スペクトル (有機ポリマー粒子 A— 5 の赤外吸収スペクトル）と比較して、この有機ポリマー粒子 Am— 5 (エチレンジァミン 処理後）の赤外吸収スペクトルにお 、ては、有機ポリマー粒子 A— 5の赤外吸収スぺ タトルにおいて 900cm_1付近に観測されたエポキシ基に由来するピークの強度が弱 まり、かつ、 1級ァミンに典型的なピークが 3300cm_ 1付近に、水酸基に由来するピ ークが 3500cm_1付近にそれぞれ新たに観測された。以上の結果から、有機ポリマ 一粒子 Am— 5は、有機ポリマー粒子 A— 5にァミノ基が導入されて得られたものであ ることが確認された。また、エチレンジァミン処理前後におけるエポキシ基に由来する ピーク強度変化から、有機ポリマー粒子 A— 5に存在するエポキシ基の反応率は約 3 0%と推定された。
[0170] 次いで、ここで得られた有機ポリマー粒子 Am— 5の lOOmgを、 lwt%硫酸 15gお よびアセトン 1. 5gの混合液に加え、間接超音波を 10分間照射して分散させてから、 50°Cで 9時間加熱攪拌し、その後、遠心分離により前記粒子を単離した。
[0171] この粒子を水で 3回、 0. 01規定水酸ィ匕ナトリウム水溶液で 1回、水で 5回洗浄した 後、乾燥させること〖こより、 102mgの粒子を得た。
[0172] 次 、で、ここで得られた粒子の赤外吸収スペクトル (硫酸処理後に得られた粒子の 赤外吸収スペクトル）においては、反応前の有機ポリマー粒子 Am— 5の赤外吸収ス ベクトルと比較して、硫酸処理前の有機ポリマー粒子 Am— 5の赤外吸収スペクトル で 900cm_1付近に観測されたエポキシ基に由来するピークの強度が消失し、かつ、 水酸基に由来する 3500cm_1付近のピークが強まった。この結果から、有機ポリマー 粒子 Am— 5中のエポキシ基が加水分解されたことが確認された。
[0173] 次いで、ここで得られた粒子 30. 3mgを用いた以外は実験例 1と同様の操作を行 なうことにより、カルボキシメチルセルロース結合粒子（担体ポリマー粒子） P— 6を 33 . lmg /こ。
[0174] 担体ポリマー粒子 P— 6について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にし たがって測定した結果、検出限界以下 (0. OlngZmg粒子以下)であった。
[0175] 4 1 9.実験例 7 日本製紙ケミカル株式会社製カルボキシメチルセルロースナトリウム塩 APP - 84を 水溶液にして透析した後、凍結乾燥することにより精製した。この精製 APP— 84 (33 mg)および有機ポリマー粒子 Am— 7 (29. 8mg)を用いた以外は、上記実験例 1と 同様の反応操作を行なった。続いて、遠心分離により粒子を単離し、純水に分散さ せ遠心分離して洗浄する操作を 5回、 0. 01規定塩酸に分散させ遠心分離 Wオン 交換する操作を 3回、さらに純水に分散させて遠心分離して洗浄する操作を 5回繰り 返した後乾燥させることにより、カルボキシメチルセルロース結合粒子 (担体ポリマー 粒子） P— 7を 33. 7mg得た。
[0176] 担体ポリマー粒子 P— 7について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にし たがって測定した結果、 0. 05ngZmgと非常に低い値であった。
[0177] 4 1 10.比較例 1
有機ポリマー粒子 A—1へのタンパク質の非特異吸着性を上記方法にしたがって 測定した結果、 1. 3ngZmgと高い値であった。
[0178] 4 1 11.比較例 2
市販の標準ポリスチレン粒子（STADEX SC200S、 JSR株式会社製）を純水で 充分洗浄してから、非特異吸着性を上記方法にしたがって測定した結果、 20ngZm gと極めて高 、値であった。
[0179] 4 1 12.比較例 3
CMC— 1の 2. 5%水溶液の代わりに両末端カルボン酸変性ポリエチレングリコー ル (エチレンオキサイド単位の平均繰返し数 10)の 2. 5%水溶液を用いた以外は、 上記実験例 1と同様の操作を行なうことにより、ポリエチレングリコールで表面が被覆 された粒子 P— 8を得た。 P 8の非特異吸着性を上記方法にしたがって測定した結 果、 0. 3ngZmgであった。
[0180] 4- 2.実施例 2
4- 2- 1.物性評価方法
4- 2- 1A.粒径
直径 1 μ m以上の粒子については、レーザ回折式粒度分布測定装置 ((株）島津製 作所製) SALD— 200Vにより、直径 1 μ m未満の粒子についてはレーザ散乱回折 法粒度分布測定装置 (型名： LS 13 320, (株)ベックマン'コールター製）により粒 径を測定した。
[0181] 4 2— 1B.赤外吸収スペクトル
フーリエ変換赤外分光光度計（日本電子株式会社 ¾iIR— 5500)を用い、 KBr法 により赤外吸収スペクトルを測定した。
[0182] 4- 2- 2.合成例
4- 2- 2A.合成例 8 (磁性粒子 A— 6の合成）
特開平 7— 238105号公報記載の重合方法を参考に、スチレン Zジビニルベンゼ ン = 96Z4共重合体粒子 (平均粒子径 1. を作製し、重合後遠心分離により 粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これをコア粒子 (a— 1)とす る (コアの作製)。
[0183] 次に、油性磁性流体 (商品名：「EXPシリーズ」， （株)フェローテック製）にアセトンを 加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面 を有するフェライト系の磁性体微粒子 (平均一次粒子径： 0. 02 m)を得た。
[0184] 次いで、コア粒子 (a— 1) 15gおよび上記疎水化された磁性体微粒子 15gをミキサ 一でよく混合し、この混合物をノヽイブリダィゼーシヨンシステム NHS— 0型 (奈良機械 製作所 (株)製)を使用して、羽根 (撹拌翼)の周速度 lOOmZ秒 (16200rpm)で 5分 間処理し、平均数粒子径が 2. 0 mの磁性体微粒子 (M—1)カゝらなる磁性体層を 表面に有する粒子（1)を得た (磁性体層の作製)。
[0185] 次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 0. 25重量％およびノ-オン性乳化剤
(商品名：「ェマルゲン 150」，花王 (株)製) 0. 25重量％を含む水溶液 375gを、 500 mLセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を表面に有する粒子（1) 15 gを投入し、ホモジナイザーで分散した後、 60°Cに加熱した。ドデシルベンゼンスル ホン酸ナトリウム 0. 25重量％およびノ-オン性乳化剤（商品名：「ェマルゲン 150」， 花王 (株）製） 0. 25重量0 /0を含む水溶液 150gに、 MMA (メタクリル酸メチル )27g、 T MP (トリメチロールプロパントリメタタリレート) 3g、およびジ（3, 5, 5—トリメチルへキサ ノィル)パーオキサイド（日本油脂社製;パーロィル 355) 0. 6gを入れて分散させたプ レエマルジヨンを、 60°Cにコントロールした前記 500mLセパラブルフラスコに 1時間 3 0分かけて滴下した (以上、ポリマー層形成のための 1段目の重合)。
[0186] 滴下終了後、 60°Cに保持し 1時間攪拌した後、次にドデシルベンゼンスルホン酸 ナトリウム 0. 25重量％およびノ-オン性乳化剤（商品名：「ェマルゲン 150」，花王（ 株)製) 0. 25重量％を含む水溶液 75gに、 MMA7. 5g、 GMA (グリシジルメタクリレ ート) 6g、TMPl. 5g、およびジ (3, 5, 5—トリメチルへキサノィル)パーオキサイド（日 本油脂社製；パーロィル 355)0. 3gを入れて分散させたプレエマルジヨンを、 60°Cに コントロールした上記 500mLセパラブルフラスコに 1時間 30分かけて滴下した (以上 、ポリマー層形成のための 2段目の重合)。その後 75°Cに昇温した後さらに 2時間重 合を続けて、反応を完了させた。得られたポリマー被覆磁性粒子の水分散液を磁気 精製および重力沈降精製してから、固形分濃度 1%の磁性粒子 A— 6の水分散液を 得た。この磁性粒子 A— 6の平均数粒子径は 2. であった。
[0187] 4- 2- 2B.合成例 9 (磁性粒子 A— 7の合成）
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 0. 5重量％を含む水溶液 225gを、 500mL セパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する粒子（l) 9gを投入し、 ホモジナイザーで分散した後、 60°Cに加熱した。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ ゥム 0. 5重量％を含む水溶液 90gに、 MMA16. 2g、TMPl. 8g、およびジ（3, 5, 5—トリメチルへキサノィル)パーオキサイド（日本油脂社製;パーロィル 355) 0. 36g を入れて分散させたプレエマルジヨンを、 60°Cにコントロールした前記 500mLセパラ ブルフラスコに 1時間 30分かけて滴下した (以上、ポリマー層形成のための 1段目の 重合)。
[0188] 滴下終了後、 60°Cに保持して 1時間攪拌し、次にドデシルベンゼンスルホン酸ナト リウム 0. 5重量％を含む水溶液 45gに、 GMA8. lg、 TMPO. 9g、およびジ（3, 5, 5—トリメチルへキサノィル)パーオキサイド（日本油脂社製;パーロィル 355) 0. 18g を入れて分散させたプレエマルジヨンを、 60°Cにコントロールした上記 500mLセパラ ブルフラスコに 1時間 30分かけて滴下した (以上、ポリマー層形成のための 2段目の 重合)。その後 75°Cに昇温した後さらに 2時間重合を続けて、反応を完了させた。得 られたポリマー被覆磁性粒子の水分散液を磁気精製および重力沈降精製してから、 固形分濃度 1%の磁性粒子 A— 7の水分散液を得た。この磁性粒子 A— 7の平均数 粒子径は 2. 6 μ mであった。
[0189] 4- 2- 2C.合成例 10 (糖類 CMC— 1の合成）
日本製紙ケミカル株式会社製カルボキシメチルセルロースナトリウム塩 APP— 84 ( 平均分子量 17, 000でグルコース単位 1個当たり平均 0. 7個のカルボキシル基を含 有)の水溶液に液の pHが 2以下になるまで希塩酸を加え、この液を透析した後、濃縮 することによりカルボキシメチルセルロース CMC— 1の 1%水溶液を得た。
[0190] 4- 2- 2D.合成例 11 (糖類 CMD— 1の合成）
フアルマシア AB (Pharmacia AB)社製デキストラン T500 (平均分子量 500, 0 00)の 10wt%水溶液 2. 5gに水酸化ナトリウム 0. 72gおよびブロモ酢酸 1. 04gを加 え、均一になるまで数分間攪拌した。次に、この溶液を 40°Cに 60時間保持した後、 氷冷し、次いで、液の pHが 2以下になるまで希塩酸を加え、この液を透析した後、凍 結乾燥することにより、カルボキシメチルデキストラン CMD— 1を得た。滴定により、 C MD— 1に含まれるカルボン酸を定量したところ、 CMD—1は、グルコース単位 1個 当たり平均 0. 4個のカルボン酸基を含有していた。
[0191] 4- 2- 3.実験例 8
4- 2- 3A.担体ポリマー粒子の作製
合成例 8で得られた磁性粒子 A— 6の水分散液カゝら遠心分離により単離した粒子を アセトンに分散させ、磁気分離して洗浄する操作を 5回繰り返した後、再びアセトンに 分散させ、遠心分離により上清を除去した後、乾燥させた。次に、この粒子 0. 50gを 100mlフラスコに入れ、エチレンジァミン 25gをカ卩えた後、間接超音波を 20分間照射 して分散させてから、窒素雰囲気下で 50°Cにて 6時間加熱攪拌し、その後、遠心分 離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子をメタノールで 5回洗浄した後、乾燥 させることにより、 0. 49gのァミノ化粒子 Am— 6を茶色粉末として得た。さらに、ェチ レンジァミン処理前の赤外吸収スペクトル (磁性粒子 A— 6の赤外吸収スペクトル）と 比較して、このアミノ化粒子 Am— 6 (エチレンジァミン処理後）の赤外吸収スペクトル においては、 1級ァミンに典型的なピークが 3300cm— 1付近および 3400cm— 1付近 に新たに観測された。以上の結果から、アミノ化粒子 Am— 6は、磁性粒子 A— 6にァ ミノ基が導入されて得られたものであることが確認された。 [0192] 次に、上記合成例 10で得た CMC— 1の 1 %水溶液 3. 75gに上記アミノ化粒子 A m— 6を 150mg加え、氷冷しながら間接超音波を 20分間照射して分散させた。次い で、この分散液に塩酸 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル)カルボジイミドを 25. 05mg加え氷冷下で 20時間攪拌した。続いて、磁気分離により粒子を単離し、 純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を 5回繰り返した後、再び純水に分散さ せ遠心分離により上清を除去した後、乾燥させることにより、 147mgの担体ポリマー 粒子 P— 9を得た。
[0193] 4 - 2 - 3B.プローブ結合粒子の作製
実験例 8で得られた担体ポリマー粒子を、濃度が lwt%になるように純水に希釈分 散して、水分散液を調製した。次に、この水分散液 500 1を微量遠心用チューブ (ェ ッペンドルフ社製、商品名：セーフ—ロックチューブ)に取り、磁気スタンド (Magical Trapper,東洋紡 (株)製)にて磁気分離し、上澄みを除去した。 50mM MES -Na OH pH6(Buffer— 1)にて 3回洗浄後、 500 1の Buffer— 1に分散し、 N—ヒドロキ シコハク酸イミド (NHS)O. 8mgおよび 1 -ェチル— 3— (3—ジメチルァミノプロピル） カルボジイミド (EDC)O. 88mgをカ卩ぇ撹拌した後、 目的物質（α—フエトプロテイン， 以下「AFP」ともいう)を特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質 (抗 aーフ エトプロテイン抗体)を 0. 05mgを添加し、室温下 2時間撹拌を行った。反応終了後、 磁気分離して上澄みを除去した。次いで、 1 %エタノールアミンを含む PBS (—)緩衝 液 500 1を加え、室温で 2時間撹拌を行った。さら〖こ、 PBS (-)緩衝液にて 5回洗浄 した後、 PBS (-)緩衝液 500 1で粒子を分散させることにより、プローブ (抗体)結合 粒子の分散液を得た。
[0194] 4 - 2 - 3C.特異捕捉性評価
本実験例で得られたプローブ結合粒子にっ 、て、特異捕捉性の評価を下記に示 す方法にしたがって行なった。
[0195] 4 - 2 - 3C - 1. 目的物質 (タンパク質）吸着反応工程
上記プローブ結合粒子の分散液 100 μ Lを別のチューブに取り磁気分離して上澄 みを除去した。これに、 目的物質であるタンパク質 (ヒト α—フエトプロテイン (AFP) ) 200ngZmLを含むヒト血清溶液 500 1を注ぎ、さらにタツチミキサーで振動を与え て前記粒子を分散させた後、常温にて 2時間回転倒混和させた。
[0196] 4- 2- 3C- 2.洗浄工程
引き続きこのチューブを磁気分離した後、上澄みを除去し、 10mMの HEPESlml を注いでタツチミキサーで前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに 2回繰り返し た後、内容物を別の未使用の微量遠心用チューブに移し、磁気分離を行なった後、 上澄みを除去した。
[0197] 4 2— 3C— 3.剥離工程
引き続きこのチューブに 0. 5%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液 50 1を注い でタツチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。 10分間放置した後 、磁気分離を行ない、上澄みの 20 1を採取した。
[0198] 4— 2— 3C— 4.電気泳動（SDS— PAGE)
ノィォラッド社製プレミックスサンプルバッファ一中での濃度が 2wt%になるように 2 メルカプトエタノールを溶解させ（以下、これを「サンプルバッファー」とする）、このう ち 20 1を微量遠心用チューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み 20 μ 1を混ぜ、チューブヒーターにて 100°Cで 5分間加熱した。
[0199] 一方、コントロールとして、 lmgZmLの AFPZPBS (—）溶液を SDS溶液で 100 倍、 200倍、 500倍に希釈したものを 20 1取り、サンプノレノ ッファー 20 1と混ぜ、 ブロックヒーターにて 100°Cで 5分間加熱した。これらを参照用希釈 AFPと呼ぶ。
[0200] ノィォラッド社製縦型電気泳動システム「ミニプロティアン 3」、バイオラッド社製プレ キャストポリアクリルアミドゲル「レディーゲル J (15%)」、およびバイオラッド社製プレミ ックス泳動バッファーを用いて、ゲル 1レーンあたり 20 1をアプライし、電気泳動を行 つた。染色はバイオラッド社製シルバースティンプラスキットを用いて標準的な手法で 行った。染色されたゲルはバイオラッド社製デンシトメ一ター「GS - 700」でスキャン して画像化し、解析ソフトウェア「Multi—Analyst」を用いて、ゲルにおける AFPの バンドの濃度と面積との積を定量した。
[0201] 参照用希釈 AFPにおいては、ゲル 1レーンあたりに流れる AFPの重量が既知であ るため、参照用希釈 AFPを用いた場合におけるバンド濃度と面積との積力も検量線 を作成し、この検量線に基づいて、前記粒子から剥離した AFPの重量を重量単位で 換算した。なお、この重量は、粒子 0. 2mgあたりに吸着していた AFPの重量に相当 する。
[0202] 4- 2-4.実験例 9
4- 2-4A.担体ポリマー粒子の作製
磁性粒子 A— 7を用いた以外は上記実験例 8と同様の操作を行なうことにより、 0. 4 8gのァミノ化粒子 Am— 7を得た。次に、上記合成例 11で得られた CMD—l (150m g)を純水 6gに溶解し、ここにアミノ化粒子 Am— 7を 150. 5mgカ卩え、間接超音波を 2 0分間照射して分散させた。次いで、この分散液を氷冷し、塩酸 1ーェチルー 3— (3 ージメチルァミノプロピル)カルボジイミドの 5wt%水溶液 1. 40gを加え、氷冷下で 1 2時間攪拌した。続いて、磁気分離により粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離し て洗浄する操作を 5回繰り返した後、再び純水に分散させ遠心分離により上清を除 去した後、乾燥させることにより、 147mgの担体ポリマー粒子 P— 10を得た。
[0203] 4- 2-4B.プローブ結合粒子の作製および特異捕捉性評価
本実験例で得られた担体ポリマー粒子 P— 10を用いて、上記実験例 8と同様のプ ローブ結合工程を行なうことにより、プローブ (抗体)結合粒子を得た。このプローブ 結合粒子について、特異捕捉性の評価を上記実験例 8と同様の方法にしたがって行 なった。
[0204] 4- 2- 5.比較例 4
比較例 4にお 、ては、 JSR (株)製磁性粒子（商品名「MAG2101」）を用いて上記 実験例 8と同様のプローブ結合工程を行ない、プローブ結合粒子を得た。次いで、こ のプローブ結合粒子について、特異捕捉性の評価を上記実験例 8と同様の方法にし たがって行なった。なお、比較例 4で用いた磁性粒子は、表面が糖類で被覆されて いない。
[0205] 4- 2-6.特異捕捉性評価結果
図 3は、実験例 8, 9および比較例 4それぞれにおいて得られたプローブ結合粒子 の特異捕捉性の評価結果 (プローブ結合粒子に吸着したタンパク質の電気泳動バタ ーン)を示す写真である。
[0206] 図 3において、レーン 1は実験例 8の担体ポリマー粒子 P— 9を用いて形成されたプ ローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン 2は実験例 9の担体ポリ マー粒子 P— 10を用いて形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク 質を示し、レーン 3は比較例 4の磁性粒子を用いて形成されたプローブ結合粒子によ つて捕捉されたタンパク質を示し、レーン 4はコントロールである目的物質 (AFP) 20 ngを示し、レーン 5はコントロールである目的物質（AFP) 50ngを示し、レーン 6はコ ントロールである目的物質 (AFP) lOOngを示し、レーン 7は分子量マーカを示す。
[0207] 図 3を参照すると、実験例 8のポリマー結合粒子 P— 9を用いて形成されたプローブ 結合粒子からは、目的物質である AFPのバンドのみが血清中から回収され、その回 収量は粒子 0. 2mg当たり l ingであった。また、実験例 9のポリマー結合粒子 P— 10 を用いて形成された抗体結合粒子からは、目的物質である AFPのバンドのみが血清 中から回収され、その回収量は粒子 0. 2mg当たり 15ngであった。一方、比較例 4の 粒子からは、非特異的に回収された血清タンパク質のバンドが多数確認されたが、 目的物質である AFPのバンドを確認することは困難であった。
[0208] 以上により、実験例 8, 9のプローブ結合粒子は、タンパク質の非特異吸着が少な いことが確認された。この結果から、実験例 8, 9のプローブ結合粒子によれば、表面 が糖類で被覆されており、かつ、目的物質を特異的に捕捉するためのプローブが前 記糖類に化学結合しているため、非特異吸着が少ないことが理解できる。一方、比較 例 4の磁性粒子は、タンパク質の非特異吸着が多力つた。このことから、比較例 4の粒 子のように、表面が糖類で被覆されていないと、非特異吸着が多いことが理解できる
[0209] 4- 3.実施例 3
4- 3- 1.評価方法
4- 3- 1A.非特異吸着性の評価 1 (タンパク質の非特異吸着性評価)） 4- 3- 1A- 1.前洗浄工程
後述する各実験例または比較例で得られた担体ポリマー粒子の濃度が lwt%にな るように純水に希釈分散し、分散液を調製した。次に、この分散液 500 1を微量遠 心用チューブ（エツペンドルフ社製、商品名：セーフ ロックチューブ）に取り、遠心分 離機 (MX— 150,トミー精機 (株)製）にて遠心分離し（回転数 15,000rpm、 15°C、 10分間）、上澄みを除去した。次いで、沈降物を含むチューブに PBS (—）緩衝液 5 00 μ 1を注ぎ、タツチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた。
[0210] 4 3— 1A— 2.蛋白吸着反応工程
引き続きこのチューブに、 lwt%BSA (ゥシ血清アルブミン）の PBS (—）溶液 500 1を注ぎ、さらにタツチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた後、常温にて 2時間回転倒混和させた。
[0211] 4 3— 1A— 3.洗浄工程
引き続きこのチューブを遠心分離した後、上澄みを除去し、 lOmMの HEPESlml を注いでタツチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに 2回繰り返した後、内容物を別の未使用の微量遠心用チューブに移し、遠心分離を 行なった後、上澄みを除去した。
[0212] 4 3— 1A— 4.剥離工程
引き続きこのチューブに 0. 5%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液 50 1を注い でタツチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。 10分間放置した後 、遠心分離を行ない、上澄みの 20 1を採取した。
[0213] 4— 3— 1A—5.サンプリング工程
ノィォラッド社製プレミックスサンプルバッファ一中での濃度が 2wt%になるように 2 メルカプトエタノールを溶解させ（以下、これを「サンプルバッファー」とする）、このう ち 20 1を微量遠心用チューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み 20 μ 1を混ぜ、チューブヒーターにて 100°Cで 5分間加熱した。
[0214] 一方、コントロールとして、 lwt%の BSAの PBS (—)溶液を 2%SDS溶液で 5, 000 倍、 10, 000倍、 20, 000倍【こ希釈したちのを 20 1取り、サンプノレノッファー 20 1 と混ぜ、チューブヒーターにて 100°Cで 5分間加熱した。これらを参照用希釈 BSAと 呼ぶ。
[0215] 4— 3— 1A— 6.電気泳動（SDS— PAGE)
ノィォラッド社製縦型電気泳動システム「ミニプロティアン 3」、バイオラッド社製プレ キャストポリアクリルアミドゲル「レディーゲル J (15%)」、およびバイオラッド社製プレミ ックス泳動バッファーを用いて、ゲル 1レーンあたり 20 1をアプライし、電気泳動を行 つた。染色はバイオラッド社製シルバースティンプラスキットを用いて標準的な手法で 行った。染色されたゲルはバイオラッド社製デンシトメ一ター「GS - 700」でスキャン して画像化し、解析ソフトウェア「Multi— Analyst」を用いて、ゲルにおける BSAの バンドの濃度と面積との積を定量した。
[0216] 参照用希釈 BSAにおいて、ゲル 1レーンあたりに流れる BSAの重量が既知である ため、バンド濃度と面積との積力も検量線を引き、この検量線に基づいて、前記粒子 力も剥離した BSAの重量を重量単位で換算した。なお、この重量は、粒子 lmgあた りに吸着して 、た BSAの重量に相当する。
[0217] 4-3-1B.特異捕捉性評価
4-3-1B-1.プローブ結合粒子の作製
後述する各実験例または比較例で得られた担体ポリマー粒子を、濃度が lwt%に なるように純水に希釈分散して、水分散液を調製した。次に、この水分散液 500/zlを 微量遠心用チューブに取り、遠心分離し、上澄みを除去した。 50mM MES-Na OH pH6 (Buffer— 1)にて 3回洗浄後、 500 1の Buffer— 1に分散し、 N—ヒドロ キシコハク酸イミド（NHS)O. 8mgおよび 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピ ル)カルポジイミド (EDC)O. 88mgをカ卩ぇ撹拌した後、 目的物質 —フエトプロティ ン，以下「AFP」とも 、う）を特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質 (抗 a —フエトプロテイン抗体)を 0. 05mgを添加し、室温下 2時間撹拌を行った。反応終 了後、遠心分離して上澄みを除去した。次いで、 1%エタノールアミンを含む PBS ( -)緩衝液 500 1をカ卩え、室温で 2時間撹拌を行った。さらに、 PBS (-)緩衝液にて 5回洗浄した後、 PBS (-)緩衝液 500 1で粒子を分散させることにより、プローブ（ 抗体)結合粒子の分散液を得た。
[0218] 4-3-1B-2. 目的物質 (タンパク質）吸着反応工程
上記プローブ結合粒子の分散液 100 μ Lを別のチューブに取り遠心分離して上澄 みを除去した。これに、 目的物質であるタンパク質 (ヒト α—フエトプロテイン (AFP)) 200ngZmLを含むヒト血清溶液 500 1を注ぎ、さらにタツチミキサーで振動を与え て前記粒子を分散させた後、常温にて 2時間回転倒混和させた。
[0219] 4— 3— 1B— 3.洗浄工程 引き続きこのチューブを遠心分離した後、上澄みを除去し、 10mMの HEPESlml を注いでタツチミキサーで前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに 2回繰り返し た後、内容物を別の未使用の微量遠心用チューブに移し、遠心分離を行なった後、 上澄みを除去した。
[0220] 4 3— 1B— 4.剥離工程
引き続きこのチューブに 0. 5%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液 50 1を注い でタツチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。 10分間放置した後 、遠心分離を行ない、上澄みの 20 1を採取した。
[0221] 4— 3— 1B— 5.サンプリング工程
ノィォラッド社製プレミックスサンプルバッファ一中での濃度が 2wt%になるように 2 メルカプトエタノールを溶解させ（以下、これを「サンプルバッファー」とする）、このう ち 20 1を微量遠心用チューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み 20 μ 1を混ぜ、チューブヒーターにて 100°Cで 5分間加熱した。
[0222] 一方、コントロールとして、 lmgZmLの AFPZPBS (—）溶液を SDS溶液で 100 倍、 200倍、 500倍に希釈したものを 20 1取り、サンプノレノ ッファー 20 1と混ぜ、 ブロックヒーターにて 100°Cで 5分間加熱した。これらを参照用希釈 AFPと呼ぶ。
[0223] 4 3— 1B— 6.電気泳動（SDS— PAGE)
AFPを BSAの代わりに用いた以外は、 4. 1. 1Fと同様の操作で電気泳動を行なつ た。
[0224] 参照用希釈 AFPにおいては、ゲル 1レーンあたりに流れる AFPの重量が既知であ るため、参照用希釈 AFPを用いた場合におけるバンド濃度と面積との積力も検量線 を作成し、この検量線に基づいて、前記粒子から剥離した AFPの重量を重量単位で 換算した。なお、この重量は、粒子 0. 2mgあたりに吸着していた AFPの重量に相当 する。
[0225] 4— 3— 1C.粒径
直径 1 μ m以上の粒子については、レーザ回折式粒度分布測定装置 ( (株）島津製 作所製) SALD— 200Vにより、直径 1 μ m未満の粒子についてはレーザ散乱回折 法粒度分布測定装置 (型名： LS 13 320, (株)ベックマン'コールター製）により粒 径を測定した。
[0226] 4 3— ID.赤外吸収スペクトル
フーリエ変換赤外分光光度計（日本電子株式会社 ¾iIR— 5500)を用い、 KBr法 により赤外吸収スペクトルを測定した。
[0227] 4- 3- 2.合成例
4- 3- 2A.合成例 12 (有機ポリマー粒子 A - 8の合成）
有機ポリマー粒子 A— 8は、シード粒子を用いる二段膨潤重合法で作製した。
[0228] シード粒子として、ソープフリー重合で重合した粒子径 0. 98 μ mのポリスチレン粒 子を用い、このポリスチレン粒子を水 500gに窒素雰囲気下で分散させて水分散体（ 固形分量 5. Og)を調製し、これに二段膨潤重合法 (特公昭 57— 24369号公報記載 の方法に準拠)でシード粒子に、一段目として有機溶剤 (シェルゾール TKO. lg)、二 段目としてモノマー TMP (トリメチロールプロパントリメタタリレート) 10g、および GMA( グリシジルメタタリレート) 90g)をカ卩えて吸収させた後、 AIBN (ァゾビスイソブチ口-トリ ル)を 2g添加して 75°Cで 24時間ゆっくり撹拌した。次に、この反応液を冷却した後、 500メッシュ金網でろ過したところ、 99%が通過し、良好な重合安定性であった。重 合収率は 99%であった。得られた有機ポリマー粒子 A— 8の粒子径は 2. 58 mで あり、粒子径の変動係数は 2. 3%であり、単分散粒子であった。
[0229] 4- 3- 2B.合成例 13 (有機ポリマー粒子 A— 9の合成）
モノマーとして MMA30g、 TMP10g、および GMA60gを使用した以外は、上記 合成例 12と同様の方法を用いることにより、粒子径が 2. 61 μ mであり、変動係数が 2.1%の有機ポリマー粒子 A— 9を得た。
[0230] 4- 3- 2C.合成例 14 (糖類 CMC— 1の合成）
日本製紙ケミカル株式会社製カルボキシメチルセルロースナトリウム塩 APP - 84 (平均分子量 17, 000でグルコース単位 1個当たり平均 0. 7個のカルボキシル基を 含有)の水溶液に液の pHが 2以下になるまで希塩酸を加え、この液を透析した後、濃 縮することによりカルボキシメチルセルロース CMC— 1の 1%水溶液を得た。
[0231] 4- 3- 3.実験例 10
4- 3- 3A.担体ポリマー粒子 P— 11の作製 有機ポリマー粒子 A— 8の分散液力 遠心分離により単離した重合体粒子をァセト ンに分散させ、遠心分離して洗浄する操作を 3回繰り返した後、乾燥させた。次に、こ の粒子 0. 50gを 200mlフラスコに入れ、アセトン 5gおよび 1%硫酸 75gを加えた後、 間接超音波を 20分間照射して分散させてから、 60°Cにて 2時間加熱攪拌し、その後 、遠心分離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子を水で 3回洗浄した後、乾 燥させることにより、 0. 51gの有機ポリマー粒子 Hy— 1を白色粉末として得た。
[0232] この有機ポリマー粒子 Hy— 1は、有機ポリマー粒子 A— 8と比較して重量が増加し た。さらに、硫酸処理前の赤外吸収スペクトル (有機ポリマー粒子 A— 8の赤外吸収ス ベクトル）と比較して、この有機ポリマー粒子 Hy— 1 (硫酸処理後）の赤外吸収スぺク トルにぉ 、ては、有機ポリマー粒子 A— 8の赤外吸収スペクトルにお!/、て 900cm_1 付近に観測されたエポキシ基に由来するピークが弱くなり、かつ、水酸基に由来する 3500cm_1付近の幅広なピークが新たに観測された。以上の結果から、有機ポリマ 一粒子 Hy— 1は、有機ポリマー粒子 A— 8のエポキシ基が部分的に加水分解され水 酸基が導入されて得られたものであることが確認された。
[0233] 次に、 0. 50gの有機ポリマー粒子 Hy—1を 100mlフラスコに入れ、エチレンジアミ ン 25gを加えた後、間接超音波を 10分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で 50°Cにて 6時間加熱攪拌し、その後、遠心分離により前記粒子を単離した。次いで、 この粒子をメタノールで 4回洗浄した後、乾燥させること〖こより、 0. 61gの有機ポリマ 一粒子 Am— 8を白色粉末として得た。
[0234] この有機ポリマー粒子 Am— 8は、有機ポリマー粒子 Hy— 1と比較して重量が増加 した。さらに、エチレンジァミン処理前の赤外吸収スペクトル (有機ポリマー粒子 Hy— 1の赤外吸収スペクトル）と比較して、この有機ポリマー粒子 Am— 8 (エチレンジアミ ン処理後）の赤外吸収スペクトルにお 、ては、有機ポリマー粒子 Hy— 1の赤外吸収 スペクトルにおいて 900cm_1付近に観測されたエポキシ基に由来するピークが消失 し、かつ、 1級ァミンに典型的なピークが 3300cm_1付近および 3500cm_1付近に新 たに観測された。以上の結果から、有機ポリマー粒子 Am— 8は、有機ポリマー粒子 Hy— 1にァミノ基が導入されて得られたものであることが確認された。
[0235] 次に、上記合成例 14で得られた CMC— 1の 1%水溶液 3gに N—ヒドロキシコハク 酸イミドを 6mgカ卩えて室温で 10分間撹拌した。次いで、この溶液を氷冷し、塩酸 1— ェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル）カルボジイミドを 20mg加え、氷冷下で 30 分間攪拌した。次いで、この溶液に上記有機ポリマー粒子 Am— 8を 30. lmg加え、 間接超音波を 20分間照射して分散させた後、氷冷下で 12時間攪拌した。続いて、 遠心分離により粒子を単離し、純水に分散させ遠心分離して洗浄する操作を 10回繰 り返した後、乾燥させることにより、 35. Omgの担体ポリマー粒子前駆体 pre— P— 11 を得た。
[0236] 担体ポリマー粒子前駆体 pre— P— 11の赤外吸収スペクトルにおいては、反応前 の有機ポリマー粒子 Am— 8に由来するピークにカ卩えて、新たにカルボキシメチルセ ルロースに由来する 3400cm_1付近および 1600cm_1付近のピークなどが観測され た。以上の結果から、担体ポリマー粒子前駆体 pre— P— 11においては、有機ポリマ 一粒子 Am— 8に糖類 (カルボキシメチルセルロース）が結合していることが確認され た。
[0237] 次にこの担体ポリマー粒子前駆体 pre— P— 11 (20. 2mg)を 0. 01M水酸化ナトリ ゥム水溶液 2mlに分散させ遠心分離により単離する操作を 3回、続いて純水 2mlに 分散させ遠心分離により単離する操作を 3回繰り返した後、乾燥させることにより 18. 6mgの担体ポリマー粒子 P— 11を得た。
[0238] 担体ポリマー粒子 P— 11の赤外吸収スペクトルにおいては、反応前の担体ポリマ 一粒子前駆体 pre— P— 11と比較すると弱くなつたものの、依然としてカルボキシメチ ルセルロースに由来する 3400cm_1付近および 1600cm_1付近のピークなどが観測 された。以上の結果から、担体ポリマー粒子 P— 11においては、有機ポリマー粒子 A m— 8に糖類 (カルボキシメチルセルロース）が結合していることが確認された。また、 この担体ポリマー粒子 P— 11を 0. 01M水酸化ナトリウム水溶液でさらに処理しても 重量減少は 0. lmg未満であり無視できる程度であった。
[0239] 4- 3- 3B.タンパク質の非特異吸着性評価結果
担体ポリマー粒子 P— 11につ 、て、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法に したがって測定した結果、検出限界以下 (0. OlngZmg)であった。
[0240] 4- 3-4.実験例 11 4- 3-4A.担体ポリマー粒子 P— 12の作製
有機ポリマー粒子 A— 9の分散液力 遠心分離により単離した重合体粒子をァセト ンに分散させ、遠心分離して洗浄する操作を 3回繰り返した後、乾燥させた。次に、こ の粒子 0. 50gを 100mlフラスコに入れ、エチレンジァミン 25gをカ卩えた後、間接超音 波を 10分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で 50°Cにて 6時間加熱攪拌し、 その後、遠心分離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子をメタノールで 4回洗 浄した後、乾燥させることにより、有機ポリマー粒子 Am— 9を白色粉末として 0. 61g 得た。次に、上記合成例 14で得られた CMC— 1の 1%水溶液 3gに上記有機ポリマ 一粒子 Am— 9を 29. 9mg加え、間接超音波を 20分間照射して分散させた。次いで 、この分散液を氷冷し、塩酸 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル)カルボジ イミドの 20mgを加え、氷冷下で 12時間攪拌した。続いて、上記実験例 10と同様に 単離、乾燥の操作を行なうことにより、 36. 2mgの担体ポリマー粒子前駆体 pre— P —12を得た。次いで、上記実験例 10の担体ポリマー粒子前駆体 pre— P— 11の代 わりに、担体ポリマー粒子前駆体 pre— P— 12 (20. 3mg)を用いた以外は上記実験 例 10と同様の操作を行なうことにより、担体ポリマー粒子 P— 12を 17. 9mg得た。
[0241] 4- 3-4B.非特異吸着性評価結果
担体ポリマー粒子 P— 12について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法に したがって測定した結果、 0. 02ngZmgと非常に低い値であった。
[0242] 4- 3- 5.比較例 5
有機ポリマー粒子 A— 8へのタンパク質の非特異吸着性を上記方法にしたがって 測定した結果、 1. IngZmgと高い値であった。
[0243] 4- 3-6.比較例 6
市販の標準ポリスチレン粒子 (STADEX SC200S、 JSR株式会社製)を純水で充 分洗浄してから、非特異吸着性を上記方法にしたがって測定した結果、 20ngZmg と極めて高い値であった。
[0244] 4- 3- 7.比較例 7
担体ポリマー粒子前駆体 pre— P— 11へのタンパク質の非特異吸着性を上記方法 にしたがって測定した結果、 0. 02ngZmgと非常に低い値であつたが検出限界以下 となった担体ポリマー粒子 P— 11には及ばなかった。
[0245] 4- 3-8.特異捕捉性評価結果
図 4は、実験例 10, 11それぞれにおいて得られた担体ポリマー粒子（P— 11およ び P 12)、および比較例 7の担体ポリマー粒子前駆体 pre— P 11の特異捕捉性 評価を上記方法にしたがって測定した結果 (プローブ結合粒子に吸着したタンパク 質の電気泳動パターン)を示す写真である。
[0246] 図 4において、レーン 1は実験例 10の担体ポリマー粒子 P— 11を用いて形成され たプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン 2は実験例 11の担 体ポリマー粒子 P— 12を用いて形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタ ンパク質を示し、レーン 3は比較例 7の担体ポリマー粒子前駆体 pre— P— 11を用い て形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン 4はコン トロールである目的物質 (AFP) 20ngを示し、レーン 5はコントロールである目的物質 (AFP) 50ngを示し、レーン 6は分子量マーカを示す。
[0247] 図 4を参照すると、実験例 10の担体ポリマー粒子 P— 11を用いて形成されたプロ一 ブ結合粒子からは、目的物質である AFPのバンドのみが血清中から回収され、その 回収量は粒子 0. 2mg当たり 16ngであった。また、実験例 11の担体ポリマー粒子 P 12を用いて形成された抗体結合粒子からは、目的物質である AFPのバンドのみ が血清中から回収され、その回収量は粒子 0. 2mg当たり 12ngであった。一方、比 較例 7の粒子からは、目的物質である AFPのバンドを確認することは困難であった。
[0248] 以上により、実験例 10, 11の担体ポリマー粒子を用いて形成されたプローブ結合 粒子は、タンパク質の非特異吸着が少なぐかつ、目的物質を特異的に捕捉できるこ とが確認された。一方、比較例 7の磁性粒子は、タンパク質の非特異吸着は少なかつ たものの、目的物質を特異的に捕捉することはできな力つた。このことから、比較例 7 の粒子のように、表面が糖類で被覆された上にさらに糖類が物理的に吸着して 、ると 、目的物質の特異的捕捉を十分には行なうことができないことが理解できる。

Claims

請求の範囲
[1] 粒径が 0. 1〜20 /ζ πιの有機ポリマー粒子と、
前記有機ポリマー粒子の表面を被覆する糖類と、
を含み、
前記有機ポリマー粒子および前記糖類が化学結合して!/ヽる、担体ポリマー粒子。
[2] 請求項 1において、
前記糖類は多糖類である、担体ポリマー粒子。
[3] 請求項 1または 2において、
前記糖類はカルボキシメチルイ匕されて 、る、担体ポリマー粒子。
[4] 請求項 1ないし 3のいずれかにおいて、
前記化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基に よる、担体ポリマー粒子。
[5] 粒径が 0. 1〜20 μ mの有機ポリマー粒子および前記糖類をィ匕学結合させることに より、前記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程を含む、担体ポリマ 一粒子の製造方法。
[6] 請求項 5において、
前記化学結合させる際、
前記有機ポリマー粒子は、第 1の官能基を有し、
前記糖類は、第 2の官能基を有し、
前記第 1の官能基と前記第 2の官能基とを反応させることにより、前記有機ポリマー 粒子と前記糖類とを結合させる、担体ポリマー粒子の製造方法。
[7] 請求項 5または 6において、
前記第 1の官能基は、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、およびトシル基から 選ばれる少なくとも 1種以上の官能基である、担体ポリマー粒子の製造方法。
[8] 粒径が 0. 1〜20 μ mで、かつ、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する 有機ポリマー粒子と、カルボキシル基を有する糖類とをィ匕学結合させることにより、前 記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程と、
前記表面が前記糖類で被覆された前記有機ポリマー粒子を塩基性溶液で処理す る工程と、
を含む、担体ポリマー粒子の製造方法。
[9] 請求項 8において、
前記糖類が多糖類である、担体ポリマー粒子の製造方法。
[10] 請求項 8または 9において、
前記化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基に よる、担体ポリマー粒子の製造方法。
[11] 請求項 8な!、し 10の!、ずれかにお 、て、
前記カルボキシル基と反応性を有する官能基がアミノ基、水酸基およびエポキシ基 力 選ばれる少なくとも 1種の官能基である、担体ポリマー粒子の製造方法。
[12] 請求項 8な!、し 11の!、ずれかにお 、て、
目的物質を特異的に捕捉するためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程を さらに含む、担体ポリマー粒子の製造方法。
[13] 粒径が 0. 1〜20 μ mの磁性粒子と、糖類と、を含み、
前記磁性粒子および前記糖類が化学結合しており、かつ、目的物質を特異的に捕 捉するためのプローブが前記糖類に化学結合して 、る、特異捕捉用磁性粒子。
[14] 請求項 13において、
前記糖類は多糖類である、特異捕捉用磁性粒子。
[15] 請求項 13または 14において、
前記糖類はカルボキシメチル化されて ヽる、特異捕捉用磁性粒子。
[16] 請求項 13な!、し 15の!、ずれかにお 、て、
前記磁性粒子および前記糖類の前記化学結合は、アミド結合およびエステル結合 の少なくとも一方を含む結合基による、特異捕捉用磁性粒子。
[17] 請求項 13な!、し 16の!、ずれかにお 、て、
前記磁性粒子は、核粒子と、前記核粒子の表面に形成された磁性体層とを含む母 粒子の前記磁性体層上に、ポリマー層を重合により形成することにより得られ、 前記磁性体層は、 Fe Oおよび Fe Oの少なくとも一方を含む、特異捕捉用磁性
2 3 3 4
粒子。
[18] 請求項 13な!、し 17の!、ずれかにお 、て、
前記プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖化合物、および合成化学物質 カゝら選ばれる少なくとも 1種である、特異捕捉用磁性粒子。
[19] 粒径が 0. 1〜20 μ mの磁性粒子と糖類とを化学結合させる工程と、
目的物質を特異的に捕捉するためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程と を含む、特異捕捉用磁性粒子の製造方法。
[20] 請求項 19において、
前記磁性粒子と前記糖類とをィ匕学結合させる際、
前記磁性粒子は、第 1の官能基を有し、
前記糖類は、第 2の官能基を有し、
前記第 1の官能基と前記第 2の官能基とを反応させることにより、前記磁性粒子と前 記糖類とを結合させる、特異捕捉用磁性粒子の製造方法。
[21] 請求項 19または 20において、
前記第 1の官能基は、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、およびトシル基から 選ばれる少なくとも 1種以上の官能基である、特異捕捉用磁性粒子の製造方法。
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