JP5656339B2 - タンパク質固定化担体およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、固定化用担体にタンパク質が効率良く固定化することができるタンパク質固定化担体の製造方法、ならびに、タンパク質が固定化されたタンパク質固定化担体に関する。

タンパク質が固定化された担体は、そのタンパク質をプローブとして生体物質や化学物質を精製したり検出したりする目的で使用されている。例えば、抗体分子と親和性を有するタンパク質であるプロテインＡやプロテインＧを固定した担体は、抗体のアフィニティー精製用に使用されている。また、抗体が固定化された担体は、抗原抗体反応を利用して、その抗原を検出・定量するための診断薬として用いられている。

そのような精製や検出にタンパク質を固定化した担体を用いる場合、一般に、その担体の性能の指標である精製容量や検出感度を向上させるためには、タンパク質の固定化量を増やすことが必要である。

タンパク質を固定化用担体に結合する方法としては、カルボキシル基あるいはトシル基などの活性官能基を有する固定化用担体と、タンパク質分子中のアミノ基とをカップリングすることが一般的である。しかし、タンパク質の分子種によっては、アミノ基を有するアミノ酸の含有率が少ない、あるいは、担体と接触し易いタンパク質の立体構造の表面に存在するアミノ基の数が少ないといった理由により、十分な量のタンパク質が固定化できない場合がある。また、担体に固定化されたタンパク質においても、タンパク質の機能・活性発現において重要な役割を果たしているアミノ基が担体との結合に消費されることによって、機能・活性が失われてしまう場合がある。

さらに近年、タンパク質固定化担体の用途として、各種のタンパク質や抗体が網羅的に固定化されたタンパク質チップや抗体チップを使って、検査対象である患者由来の生体材料や医薬品候補の低分子化合物と相互作用する分子種とその強度を評価する手法が開発されている。タンパク質チップ・抗体チップの製造においては、得られるシグナルの解析を容易するために、各種タンパク質の間で固定化量のバラツキを少なくすることが求められている。

本発明の目的は、従来、固定化用担体に十分な量を固定化することが困難であったタンパク質であっても、担体に効率良く固定化させることにより、固定化量を増加させることができるタンパク質固定化担体の製造方法、ならびに、上記製造方法により得られるタンパク質固定化担体を提供することである。

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、塩基性アミノ酸分子を含むタグ配列を有するタンパク質を用いることにより、例えば、従来、固定化反応の効率が悪く、固定化量が十分でなかったタンパク質であっても、タンパク質固定化量を増大できることを見出し、この研究を完成させるに至った。

本発明の一態様に係るタンパク質固定化担体の製造方法は、
塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列を含むタグ配列を有するタンパク質を担体に固定化する工程を含む。

上記タンパク質固定化担体の製造方法において、前記塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンのいずれか１種であることができる。

上記タンパク質固定化担体の製造方法において、前記タグ配列はヒスチジンタグであることができる。

上記タンパク質固定化担体の製造方法において、前記固定化用担体はカルボキシル基、エポキシ基、およびトシル基から選ばれる少なくとも１種の官能基を有することができる。

上記タンパク質固定化担体の製造方法において、前記固定化用担体は磁性粒子であることができる。

本発明の一態様に係るタンパク質固定化担体は、上記タンパク質固定化担体の製造方法により得られる。

上記タンパク質固定化担体の製造方法によれば、例えば、従来、固定化反応の効率が悪く、固定化量が十分得られなかったタンパク質であっても、タンパク質固定化量を増やすことができる。したがって、上記タンパク質固定化担体の製造方法により得られる上記タンパク質固定化担体は、タンパク質の固定化量が大きい。

以下、本発明の一実施形態に係るタンパク質固定化担体およびその製造方法について説明する。

１．タンパク質固定化担体およびその製造方法
本発明の一実施形態に係るタンパク質固定化担体の製造方法は、塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列を含むタグ配列を有するタンパク質（以下、「タグタンパク質」ともいう。）を担体に固定化する工程を含む。

本発明の一実施形態に係るタンパク質固定化担体は、タグタンパク質と固定化担体とが、タグ配列に結合する官能基（例えば、イミノ基、アミド結合）を介して化学結合されている。

１．１．タグタンパク質
本実施形態に係るタンパク質固定化担体の製造方法において、固定化用担体に固定化させるタグタンパク質は、塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列を含むタグ配列を含む。

タグ配列のアミノ酸の数は３個以上であり、長さの上限に制限は無いが、タンパク質の性質への影響を抑えるために、通常５〜３０個が好適である。

タグ配列は、その一部または全部が塩基性アミノ酸からなるのが好ましく、リジン、アルギニン、およびヒスチジンから選択される塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列からなるのがより好ましく、リジン、アルギニン、およびヒスチジンのうちいずれか１種のアミノ酸が３個以上連続する配列を含むことがさらに好ましく、上記いずれか１種のアミノ酸が３〜１０個連続する配列のみからなるのが特に好ましい。

タグ配列がリジン、アルギニン、およびヒスチジンのいずれか１種類のアミノ酸のみからなる場合、これらのタグ配列はそれぞれオリゴリジン、オリゴアルギニン、オリゴヒスチジンである。また、５量体または６量体からなるオリゴヒスチジンは、一般に、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）と呼ばれるタグである。タグ配列としてヒスチジンタグを用いるのは、市販の発現ベクターを使用でき、容易に組み換えタンパク質を構築できる点で好ましい。

タンパク質にタグ配列を付加する方法としては、例えば、タンパク質の一次配列にタグ配列を組み込む方法や、タンパク質のアミノ酸残基にタグ配列をグラフト状に付加させる方法が挙げられる。

タンパク質の一次配列にタグ配列を組み込む場合、タンパク質の性質に与える影響を最小限にするために、タンパク質分子の末端であるＮ末端あるいはＣ末端にタグ配列を付加するのが好ましいが、タンパク質の内部配列にタグ配列を組み込んでもよい。この場合、タグタンパク質は、例えば、タンパク質をコードする遺伝子およびタグ配列をコードする遺伝子を、読み取り枠を一致させた状態で融合した配列を組み込んだ発現ベクターを調製し、その発現ベクターで形質転換した大腸菌等を培養し、発現したタグタンパク質を該大腸菌から分離精製することで調製することができる。

タンパク質のアミノ酸残基にタグ配列をグラフト状に付加させる場合、例えば、ポリペプチドの固層合成法等を用いて調製したタグ配列を、精製されたタンパク質とカップリングすることで調製することができる。タンパク質とタグ配列とのカップリング方法としては、例えば、タンパク質とタグ配列とを混合した状態で、N−ethyl−N’−(dimethilaminopropyl) carbodiimide（ＥＤＣ）などのカルボジイミド試薬を用いて処理することにより、タンパク質のアミノ基および／またはイミノ基とタグ配列の末端カルボキシル基との間、タンパク質のカルボキシル基とタグ配列のアミノ基および／またはイミノ基との間、あるいはその両方で、タンパク質とタグ配列とをカップリングすることができる。

１．２．固定化用担体
タグタンパク質を固定化させる固定化用担体は、タグタンパク質と化学結合する官能基を有することが好ましい。そのような官能基は、例えば、カルボキシル基、エポキシ基、およびトシル基から選ばれる少なくとも１種であるのが好ましい。タグ配列には塩基性アミノ酸が含まれるため、固定化用担体が有する官能基がこれらの官能基からなることにより、タグ配列中の塩基性アミノ酸に含まれるアミノ基および／またはイミノ基と上記官能基とが効率良く反応する結果、タグ配列を介してタンパク質と固定化担体とが化学結合することにより、タグタンパク質を固定化用担体に効率良く固定化することができることが、固定化量の増大に寄与していると考えられる。

また、タグ配列は、塩基性アミノ酸が３分子連続した配列を含む。塩基性アミノ酸はアミノ基およびイミノ基もしくはいずれか一方を有するため、タグ配列では、塩基性アミノ酸に含まれるアミノ基および／またはイミノ基の密度が高く、後述するように、該アミノ基および／またはイミノ基の反応性が高い。これにより、タグタンパク質のうちタグ配列以外の部位に存在するアミノ基等よりも、タグ配列中の塩基性アミノ酸に含まれるアミノ基および／またはイミノ基を優先的に固定化担体の官能基と反応させることができるため、タンパク質自体の性質に与える影響を少なくすることができることが、固定化したタンパク質の性質の維持に寄与していると考えられる。上記方法により、タグタンパク質と固定化担体にタグタンパク質が高効率で化学結合したタンパク質固定化担体を得ることが出来る。

固定化用担体に含まれる官能基は、固定化用担体を作成する際に、例えば、共重合、グラフト重合、カップリング、プラズマ処理等の操作によって、化学的に導入することができるほか、固定化用担体に対して練り込み、コーティング等の操作によって物理的に導入することもできる。官能基の導入効率を考えれば、官能基は化学的に導入することが好ましい。

１．３．タグタンパク質と固定化用担体との固定化
タグタンパク質と固定化用担体との結合方法としては、例えば、固定化用担体中の官能基と、タグタンパク質中のアミノ基および／またはイミノ基とを反応させることにより、タグタンパク質と固定化用担体とを化学結合させる方法が挙げられる。

例えば、固定化用担体にカルボキシル基が存在する場合、該カルボキシル基とタグタンパク質中のアミノ基および／またはイミノ基とを、ＥＤＣなどのカルボジイミド試薬を用いてアミンカップリング法により結合することができる。

本実施形態に係るタンパク質固定化担体の製造方法において、固定化させるタンパク質として、塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列を含むタグ配列を含むタグタンパク質を用いる場合、固体化用担体中の官能基とのカップリング効率を飛躍的に増大させることができるため、固定化用担体へのタンパク質の固定化量を大幅に増やすことができる。その結果、従来、固定化用担体へ十分な量を固定化することが困難であったタンパク質（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧやＰｒｏｔｅｉｎ Ａ）であっても、固定化用担体に効率良く固定化することができる。

さらに、本実施形態に係るタンパク質固定化担体の製造方法において、タグ配列として、リジン、アルギニン、およびヒスチジンのいずれか１種のアミノ酸が３個以上連続する配列を用いることにより、固定化用担体中の官能基とのカップリング効率をさらに増大させることができる。その原因としては、同一のアミノ酸が連続してクラスター状に存在すると、これらのアミノ酸残基の反応性が増大することが考えられる。この現象の発現の要因は定かでないが、リジン、アルギニン、およびヒスチジンのいずれか１種のアミノ酸が３個以上連続するタグ配列を用いることにより、反応に関与するアミノ基やイミノ基の密度が局所的に高くなるため、反応相手である固定化用担体の官能基との相互作用が増大すること、ならびに、タグ配列のアミノ酸の立体的配座が反応に適した位置になることなどが考えられる。

また、本実施形態に係るタンパク質固定化担体の製造方法において、固定用担体が、カルボキシル基、エポキシ基、およびトシル基から選ばれる少なくとも１種の官能基を有する場合（特に、エポキシ基およびトシル基またはいずれか一方である官能基を有する場合）、固定化用担体へのタンパク質の固定化量を増大させることができる。この場合、タグタンパク質と固定化用担体との結合は、両者を適当な溶媒に分散したのち、一定時間混合することにより達成することができる。

固定化用担体の材質は特に限定するものではなく、例えば、有機、無機、ガラス、金属、またはこれらの複合体であってもよい。

固定化用担体の形態としては、例えば、粒子状、膜状、スライド状、ディスク状、プレート状、繊維状、チューブ状が挙げられる。

固定化用担体が粒子状である場合、固定化用担体は磁性粒子であることが好ましい。この場合、固定化用担体は粒子の内部または表面に磁性体を含有することができる。固定化用担体が磁性粒子である場合、磁性体は該粒子の内部のみに含有され、表面に露出していないことが好ましい。固定化用担体が磁性粒子であることにより、磁気作用を用いて粒子を固液分離することができる。

磁性粒子の内部組成は均質であってもよく、あるいは不均質であってもよいが、残留磁化が少ない、超常磁性の磁性体微粒子を含む不均質な粒子であるのが好ましい。また、磁性粒子は、低比重にすることにより水中での沈降を遅らせ、水への分散が容易になるため、有機物が含まれていることが好ましい。

不均質な内部組成を有する磁性粒子の内部構造としては、（Ｉ）有機ポリマーなどの非磁性の有機物からなる連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子、（ＩＩ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、有機ポリマーなどの非磁性の有機物をシェルとする粒子、（ＩＩＩ）有機ポリマーなどの非磁性体からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の２次凝集体層（磁性体層）と、磁性体層の外層である有機ポリマー層とを有する粒子などが挙げられる。これらの中では、（ＩＩＩ）超常磁性微粒子の２次凝集体層を含む核粒子（以下、「超常磁性体微粒子の２次凝集体層を含む核粒子」を「母粒子」と表す）の外層に、有機ポリマー層を有する粒子が好ましい。有機ポリマー層は２層以上のポリマー層から構成されていてもよい。

なお、各種粒子に用いられる有機ポリマーは、コア・シェル型粒子のコア部分を除いて、粒子最表面を形成するポリマーがカルボキシル基、エポキシ基、およびトシル基から選ばれる少なくとも１種の官能基を有しているのが好ましい。また、核粒子とその外層（磁性体層）との界面、ならびに磁性体層とその外層（有機ポリマー層）との界面は、両層の成分が混在した状態であっても構わない。

上記（Ｉ）の粒子の好ましい製造方法としては、例えば、特開平９−２０８７８８号公報で開示された方法が挙げられる。また、上記（ＩＩＩ）の粒子の好ましい製造方法としては、例えば、特開２００４−２０５４８１号公報で開示された方法が挙げられる。

磁性体としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ_２Ｏ_３）等の各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属またはこれら金属の合金などを用いることができる。平均粒子径が３０ｎｍ以下の磁性体を用いることにより、実質的に超常磁性である固定化用担体を得ることができる。

磁性体の含有量は、粒子全体の重量に占める割合が１０重量％以上であるのが好ましく、２０〜８０重量％であることがより好ましい。ここで、粒子全体の重量に占める割合が１０重量％以下であると、良好な磁気分離性が得られず、分離するために相当に長い時間を要するので好ましくない。一方、粒子全体の重量に占める割合が８０重量％以上であると、粒子表面に露出する磁性体が多くなるので好ましくない。

固定化用担体が粒子状である場合、粒子（固定化用担体粒子）の粒子径は、特に制限されるものではなく、通常１０ｎｍ〜１０ｍｍである。粒子径は、レーザ回折・散乱法により求める。また、上記粒子の形状は球状である必要はなく、針状等の異形粒子であってもよい。

本実施形態に係るタンパク質固定化担体の一例として、セファロース製ゲルなどの固定化用担体に、抗体分子と親和性を有するタンパク質であるプロテインＡやプロテインＧを固定化させた担体が挙げられる。この担体は、従来の担体に比較してプロテインＡやプロテインＧの固定化量が多いため、抗体の精製容量を増大することができる。

また、本実施形態に係るタンパク質固定化担体の製造方法において、固定化させるタンパク質が抗体であって、ポリマーラテックス等の微粒子を固定化用担体として用い、該微粒子に抗体を結合させて得られた固定化担体をサンドイッチエライザ法等の免疫診断用担体として用いる場合、抗体の固定化量を増加させることができる。これにより、分析対象の抗原の測定限界濃度が低濃度側および高濃度側ともに広がるため、測定対象の濃度のダイナミックレンジが広く、かつ、短時間で検査が可能な診断薬を作製することができる。

さらに、各種のタンパク質や抗体を網羅的にチップ上に固定化させて、タンパク質チップや抗体チップを作成する場合、各種タンパク質間において固定化量のバラツキが少なく、精度の高い評価が可能なチップを作製することができる。

２．実施例
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

２．１．合成例１（カルボキシル基を有する固定化用担体（磁性粒子）の合成）
７５％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（日本油脂製「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」２質量部を１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒子径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３質量部および水４１質量部の入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間攪拌した。別の容器にて、スチレン９６質量部およびジビニルベンゼン４質量部を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００質量部で乳化させた液を前記リアクターに入れ、４０℃で２時間攪拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥および粉砕してコア粒子を得た。コア粒子の数平均粒子径は１．５μｍであった。

次に、油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。

次いで、上記コア粒子１５ｇおよび上記磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する数平均粒子径が２．０μｍの母粒子を得た。

次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液（以下、「分散剤水溶液」という）３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する母粒子１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。分散剤水溶液１５０ｇに、メチルメタクリレート２７ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）３ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．６ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。

滴下終了後、６０℃に保持し１時間攪拌した後、分散剤水溶液７５ｇに、シクロヘキシルメタクリレート１３．５ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。

次いで、前記セパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。以上により、カルボキシル基を有する磁性粒子を得た（以下、「Ａ粒子」とする）。

２．２．合成例２（エポキシ基を有する固定化用担体（磁性粒子）の合成）
合成例１で、シクロヘキシルメタクリレート１３．５ｇおよびメタクリル酸１．５ｇの代わりにＧＭＡ１３．５ｇおよびＴＭＰ１．５ｇを用いた以外は合成例１と同様の手順を行なうことにより、エポキシ基を有する粒子（以下、「粒子Ｂ」とする）を得た。

２．３．合成例３（トシル基を有する固定化用担体（磁性粒子）の合成）
凍結乾燥により得た粒子Ｂ ５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに取り、１ｍｏｌ／Ｌ 硫酸６０ｍｌを入れ、６０℃で６時間撹拌した。次いで、前記セパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。

以上により、２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する磁性粒子を得た。この粒子を凍結乾燥して得られた乾燥粒子１．０ｇを８ｍｌのピリジンに分散させた後、ｐ−トシルクロライド０．２ｇを加えて室温で２時間撹拌した。反応後、磁気を用いて粒子を分離し、アセトンで４回、続いて蒸留水で４回洗浄して、２，３−ジヒドロキシプロピル基がトシル化された磁性粒子（以下、「粒子Ｃ」とする）を得た。この磁性粒子（粒子Ｃ）の数平均粒子径は２．９μｍであった。

２．４．実施例１
以下の４種類のタンパク質につき、カルボキシル基を有する粒子Ａへの固定化量を評価した。４種類のタンパク質は、（ｉ）Ｎ末端にヒスチジン分子が６個連続した６ヒスチジンタグを有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(Ｈｉｓ６−ＧＳＴ、アップステイト・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）社製、カタログＮｏ．１２−３５０、分子量２７ｋＤａ)、（ｉｉ）同じくＮ末端に６ヒスチジンタグを有するＡｋｔ１（Ｈｉｓ６−Ａｋｔ１、アップステイト・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）社製、カタログＮｏ．１４−２７９、分子量５９ｋＤａ）、（ｉｉｉ）同じくＮ末端に６ヒスチジンタグを有するユビキチン(Ｈｉｓ６−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ、アフィニティー・リサーチ・プロダクツ・リミテッド（AFFINITI Research Products Ltd）社製、カタログＮｏ．ＵＷ８６１０、分子量９．４ｋＤａ)、（ｉｖ）Ｎ末端にヒスチジン分子が１０個連続した１０ヒスチジンタグを有するユビキチン(Ｈｉｓ１０−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ、Ｒ＆Ｄシステムズ・インク（R&D Systems, Inc）社製、カタログＮｏ．７０１−ＵＢ、分子量１０ｋＤａ)であった。

まず、それぞれのタンパク質の溶媒を限外濾過によりリン酸ナトリウム緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）に置換し、吸光度により濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。これらタンパク質の粒子Ａへの固定化量を以下のように評価した。

粒子Ａ分散液からの粒子１ｍｇ分をテストチューブに取り、テストチューブ用の磁気スタンドを用いて粒子を分離した後、上清を除去し、次に１００μＬの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．０）に分散した。そこにＥＤＣのＭＥＳ溶液（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）５μＬを加え、２５℃で３０分反応させた。磁気スタンドを用いて粒子を分離し溶媒を捨て、新たにＭＥＳ緩衝溶液１００μＬ加えた。そこに、タンパク質溶液を２０μＬ加え、２５℃で３時間振とう反応した。最後に粒子を０．５ｍＬの洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０界面活性剤含有ＰＢＳ緩衝液）で４回洗浄して、タンパク質固定化磁性粒子を得た。

このタンパク質固定化量を、タンパク質定量法であるＢＣＡアッセイ法を用いて定量した。濃度は測定対象であるタンパク質溶液を標準物質として算出した。その結果を表１に示す。

２．５．比較例１
実施例１の比較例として、以下の４種類のタンパク質につき、粒子Ａへの固定化量を、実施例１で用いた方法と同様の方法により測定した。４種類のタンパク質は、（ｉ）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ、シグマ社製、プロダクトＮｏ．Ｇ５６６３、分子量２６ｋＤａ)、（ｉｉ）ＧＳＴタグを有するＡｋｔ１(ＧＳＴ−Ａｋｔ１、アボヴァ・コーポレーション（Abnova corporation）製、カタログNo.H00000207−P01、分子量７９ｋＤａ)、（ｉｉｉ）ユビキチン(ユビキチン、ノバス・バイオロジカル・インク（Novus Biologicals,Inc）社製、カタログNo.NB800−PC40、分子量８．５ｋＤａ)、（ｉｖ）Ｎ末端にＧＳＴタグを有するユビキチン（ＧＳＴ−ユビキチン、ノバス・バイオロジカル・インク（Novus Biologicals,Inc）社製、カタログNo.NB800−PC42、分子量３５ｋＤａ）である。

各タンパク質は、限外濾過により溶媒をリン酸ナトリウム緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）に置換し、吸光度により濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに調製して使用した。得られた結果を表１に示す。

２．６．実施例２
本実施例では、実施例１で使用した４種のタンパク質につき、エポキシ基を有する粒子Ｂへの固定化量を評価した。粒子Ｂ分散液から粒子１ｍｇ分をテストチューブに取り、テストチューブ用の磁気スタンドを用いて粒子を分離した後、上清を除去し、次に０．１Ｍホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．５）に分散した。そこに、タンパク質溶液を２０μＬ加え、３７℃で２４時間振とう反応した。最後に粒子を０．５ｍＬの洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０界面活性剤含有ＰＢＳ緩衝液）で４回洗浄してタンパク質固定化磁性粒子を得た。このタンパク質固定化量を、実施例１で用いた方法と同様の方法で測定した。その結果を表２に示す。

２．７．比較例２
本比較例では、実施例２の比較例として、比較例１で使用した４種のタンパク質につき、エポキシ基を有する粒子Ｂへの固定化量を、実施例２で用いた方法と同様の方法で測定した。その結果を表２に示す。

２．８．実施例３
本実施例では、粒子として粒子Ｂの代わりにトシル基を有する粒子Ｃを使用した他は、実施例２と同様の材料および方法にて、各タンパク質を粒子に固定化する処理を行なった後、タンパク質の固定化量を測定した。その結果を表３に示す。

２．９．比較例３
本比較例では、実施例３の比較例として、粒子として粒子Ｂの代わりにトシル基を有する粒子Ｃを使用した他は、比較例２と同様の材料および方法にて、各タンパク質を粒子に固定化する処理を行なった後、タンパク質の固定化量を測定した。その結果を表３に示す。

２．１０．実施例４
本実施例では、タンパク質としてプロテインＧを用いて、固定化用担体への固定化量におけるタグ配列の効果を検討した。プロテインＧは文献、Bengt Guss et al. (1986) The EMBO Journal. 5(7) 1567−1575に記載の分子を改変して使用した。

文献中のプロテインＧのアミノ酸番号１９０番から３８４番の配列に対して、そのＮ末端にリジン分子が６個連続した６リジンタグ（以下「Ｌｙｓ６」と表記）を融合したリジンタグ融合タンパク質を作成した。文献に記載の方法に従い、アミノ酸番号１９０番から３８４番の配列をコードする遺伝子を取得し、そのアミノ末端側の６アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とリジン分子６分子分をコードするＤＮＡ分子とが結合したＤＮＡを化学合成し、これとＣ末端の１２アミノ酸をコードするＤＮＡとをＰＣＲプライマーとして用い、ＰＣＲ法で増幅することにより、６リジンタグをコードするＤＮＡを融合させた、プロテインＧをコードする遺伝子を作成し、これを発現ベクターに導入し、大腸菌で発現させた後、該大腸菌を分離精製することにより、目的のタグ配列（リジンタグ）を有するタグタンパク質（Ｌｙｓ６−プロテインＧ）を調製した。

実施例１で用いた方法と同様の方法により、このＬｙｓ６−プロテインＧを、カルボキシル基を有する粒子Ａに固定化し、その固定化量を測定した。その結果を表４に示す。

また、このＬｙｓ６−プロテインＧ固定化粒子のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）固定化量を測定した。Ｌｙｓ６−プロテインＧ固定化粒子の分散液から、粒子１ｍｇ分をテストチューブに取り、テストチューブ用の磁気スタンドを用いて粒子を分離した後、上清を除去し、次に５０μＬの０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）に分散した。そこに、ヒトＩｇＧ(シグマ社製、商品番号Ｉ４５０６)の０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝溶液(１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０)を１０μＬ加え、２５℃で１時間振とう反応した。未反応のヒトＩｇＧを０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）で数回洗浄した後、粒子に捕捉されたヒトＩｇＧを５０μＬの０．１Ｍクエン酸緩衝溶液（ｐＨ２．０）で溶出し、回収されたＩｇＧ量を吸光度により計算した。得られた粒子１ｍｇ当たりのＩｇＧ結合容量を表４に示す。

２．１１．比較例４
実施例４で挙げた文献中のプロテインＧのアミノ酸番号１９０番から３８４番の配列に相当するプロテインＧ分子を作成した。文献に記載の方法に従い、プロテインＧのアミノ酸番号１９０番から３８４番の配列をコードする遺伝子を取得し、それを発現ベクターに導入して大腸菌で発現させた後、分離精製することにより目的のプロテインＧを調製した。

実施例１で用いた方法と同様の方法により、このプロテインＧを、カルボキシル基を有する粒子Ａに固定化し、その固定化量を測定した。その結果を表４に示す。

また、実施例４で用いた方法と同様の方法によりヒトＩｇＧの結合容量を測定した。その値を表４に示す。

表１〜４に示されるように、塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列を含むタグ配列をタンパク質してタグタンパク質を調製し、このタグタンパク質を固定化用担体に固定化することにより、固定化用担体へのタンパク質の固定化量を増大することができることが確認された。

表１は、カルボキシル基含有粒子Ａの１ｍｇあたりのタンパク質の固定化量を示している。表１によれば、何れのタンパク質を用いた場合においても、固定化用担体（カルボキシル基含有粒子）への固定化量は、タグ配列（Ｈｉｓタグ）を有しないタンパク質よりも、タグ配列（Ｈｉｓタグ）を有するタンパク質のほうが多かった。

表２は、エポキシ基含有粒子Ｂの１ｍｇあたりのタンパク質の固定化量を示している。表２によれば、何れのタンパク質を用いた場合においても、タグ配列（Ｈｉｓタグ）を有しないタンパク質よりも、タグ配列（Ｈｉｓタグ）を有するタンパク質のほうが多かった。

表３は、トシル基含有粒子Ｃの１ｍｇあたりのタンパク質の固定化量を示している。表３によれば、何れのタンパク質を用いた場合においても、固定化用担体（トシル基含有粒子）への固定化量は、タグ配列（Ｈｉｓタグ）を有しないタンパク質よりも、タグ配列（Ｈｉｓタグ）を有するタンパク質のほうが多かった。

表４は、カルボキシル基含有粒子１ｍｇあたりのプロテインＧおよびＬｙｓ６−プロテインＧ固定化量ならびにヒトＩｇＧ結合容量を示している。表４によれば、固定化用担体（カルボキシル基含有粒子）へのプロテインＧの固定化量は、プロテインＧにＬｙｓ６タグを融合させたタグタンパク質を用いることによって向上した。また、タグタンパク質（Ｌｙｓ６−プロテインＧ）を固定化させた粒子のＩｇＧ結合容量は、Ｌｙｓ６タグを有さないタンパク質（プロテインＧ）を固定化させた粒子のＩｇＧ結合容量と比較して大きいことから、タンパク質（プロテインＧ）にタグ配列（Ｌｙｓ６タグ）を融合させて得られたタグタンパク質（Ｌｙｓ６−プロテインＧ）を用いることにより、タンパク質固定化担体の性能を向上できることが明らかになった。

また、表４に示されるように、タンパク質としてプロテインＧを用いた場合、固定化量が増大する結果、ＩｇＧ結合容量で示されるタンパク質固定化担体の性能を向上させることができることが確認された。

Claims (5)

1. 塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列を含むタグ配列を有するタンパク質を磁性粒子に、キレートを用いることなく、前記タグ配列に結合するイミノ基またはアミノ基を介して、化学結合により固定化する工程を含み、
   前記磁性粒子は、非磁性体からなる有機ポリマー層を外層に有し、
   前記化学結合は、前記有機ポリマー層にある官能基と、前記イミノ基または前記アミノ基との結合である、タンパク質固定化磁性粒子の製造方法。
2. 請求項１において、
   前記塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンのいずれか１種である、タンパク質固定化磁性粒子の製造方法。
3. 請求項１または２において、
   前記タグ配列はヒスチジンタグである、タンパク質固定化磁性粒子の製造方法。
4. 請求項１〜３のいずれかにおいて、
   前記官能基はカルボキシル基、エポキシ基、およびトシル基から選ばれる少なくとも１種である、タンパク質固定化磁性粒子の製造方法。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質固定化磁性粒子の製造方法により得られたタンパク質固定化磁性粒子。