JP3274743B2 - 診断用キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原−抗体反応を利用
したＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬から構成され
る診断用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原と抗体の特異的な反応を利用した免
疫学的測定方法は特異性が高く、測定感度が高いことか
ら臨床検査の分野で広く用いられている。

【０００３】臨床検査で用いられている免疫学的測定方
法には放射性物質を用いたラジオイムノアッセイ、酵素
標識抗体を用いた酵素免疫測定法、抗原抗体反応による
濁度の変化を利用した免疫比濁法、ラテックス粒子を利
用したラテックス凝集法、あるいは赤血球等に抗原ある
いは抗体を吸着し抗原抗体反応によりマイクロタイター
プレート上で管底凝集像を形成させるマイクロタイター
法等がある。これらのうち、ラテックス凝集法及びマイ
クロタイター法等の担体を用いた免疫学的凝集反応試薬
は簡便、迅速且つ正確に判定を行うことができるので臨
床検査で広く利用されている。該免疫学的凝集反応試薬
は担体粒子に固定化した抗原あるいは抗体（以下、担体
粒子上に固定化する抗原あるいは抗体を感作物質ともい
う）が、被検体に含まれる被測定抗体あるいは被測定抗
原（以下、検出しようとする抗原あるいは抗体を測定目
的物質ともいう）と抗原抗体反応をすることにより患者
の疾病の診断を行う診断薬である。

【０００４】免疫学的凝集試薬においては他の免疫診断
薬と同様に正確な早期診断を行うことが必須条件であ
る。すなわち、１）抗原抗体反応によらない凝集反応
（以下、非特異的凝集反応ともいう）がないこと、２）
被検体中の測定目的物質の微量検出が可能（以下、高感
度化ともいう）なこと、の２点を満足することが必須で
ある。

【０００５】免疫学的凝集反応試薬における非特異的凝
集反応の原因は以下のことが考えられる。すなわち、被
検体中の夾雑成分が担体粒子自体と抗原抗体反応によら
ない非特異的な結合をすることが一因である。このよう
な非特異的凝集反応は担体粒子上に感作物質を担持した
のちに該担体粒子上の間隙を免疫学的に不活性なブロッ
キング剤で担持する（以下、このような操作をブロッキ
ングともいう）ことにより低減できる。もう一つの非特
異的凝集反応の原因として、被検体中に測定目的物質以
外の夾雑物質が感作物質と非特異的な結合を起こすこと
が考えれる。そこで該夾雑物質を吸収除去する物質（以
下、吸収剤ともいう）を検体希釈液中に添加することで
非特異的凝集反応を低減することができる。ブロッキン
グ剤と検体希釈液中に添加する吸収剤の検討が免疫学的
凝集反応試薬の非特異的凝集反応の防止の要因であると
言える。

【０００６】非特異的凝集反応を回避できる免疫学的凝
集反応試薬を調製するための公知の手法として、感作物
質を担持した担体粒子（以下、感作物質を担持した担体
粒子を感作粒子ともいう）を牛血清アルブミン（以下、
ＢＳＡとも略記する）でブロッキングし、検体希釈液に
吸収剤として正常ウサギ血清を用いることが有効と考え
られ、実際に使用されているが、未だ非特異的凝集反応
の回避の点で十分ではなかった。

【０００７】他方、免疫学的凝集反応試薬では疾病の早
期発見が重要であり、そのためには微量な測定目的物質
を検出できること、すなわち、高感度化が必要不可欠で
ある。例えばウイルス感染症のような疾病では感染初期
に測定目的物質の量が少なく、感染初期に診断を行うに
は高感度であることが重要である。免疫学的凝集反応試
薬を高感度化する方法として、できるだけ多くの感作物
質を担体粒子に担持させることが唯一の方法である。し
かしながら、感作物質を過剰に担体粒子に担持させると
感度が向上する一方、感作物質同士が相互的結合を起こ
して該感作物質のうち測定目的物質との抗原抗体反応に
有効な領域（以下、活性部位ともいう）が潰れて測定目
的物質の測定ができなくなるといった現象が生じる。従
って、免疫学的凝集反応試薬の調製するために不溶性担
体に担持できる感作物質の量には上限があり、ある一定
量以上の感作物質を担持して高感度化を図ることは不可
能であり、未だ高感度化の具体的方法は見い出されてい
ない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】非特異的凝集反応を防
止するために、ブロッキング剤や検体希釈液に添加する
吸収剤として多種多様な物質が検討されてきたが、未だ
適切なブロッキング剤、吸収剤は見い出されていない。
さらに高感度化を行う具体的な方法を検討してきたが、
未だ適切な方法は見い出されていない。そこで非特異的
凝集反応の少ない且つ測定目的物の微量検出の可能な免
疫学的凝集反応試薬から構成される診断用キットを調製
するために適切な方法の開発が望まれていた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記技術課
題を解決すべく鋭意研究を行ってきた。その結果、抗原
としてＣ型肝炎ウイルス遺伝子由来の抗原タンパクを用
いる場合には、ブロッキング剤としてカゼインを使用
し、且つ検体希釈液にもカゼインを添加すれば、１）非
特異的凝集反応の防止、２）測定目標物質の微量検出可
能という２つの要件を満足するＣ型肝炎診断用免疫学的
凝集反応試薬を用いたＣ型肝炎診断用キットとなること
を見い出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】即ち、本発明は、不溶性担体にＣ型肝炎ウ
イルス遺伝子由来の抗原タンパク及びカゼインを担持し
てなるＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬と、カゼイ
ン及び緩衝液を含んでなる検体希釈液とから構成される
Ｃ型肝炎診断用キットである。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１２】本発明における不溶性担体粒子としては公
知の免疫学的凝集反応法の診断試薬に用いることができ
る担体が制限なく使用できる。例えば、核部となる無機
質化合物に染料を被覆させた高比重複合粒子（特開昭６
２ー１１５３６６参照、以下、ＨＤＰとも略記する）、
羊赤血球、ポリスチレン粒子、ゼラチン粒子等が挙げら
れる。中でもＨＤＰ及び赤血球は抗原あるいは抗体の吸
着量が多く好適に用いられる。特に人工担体であるとこ
ろのＨＤＰは表面官能基を人工的に付加することがで
き、抗原あるいは抗体の種類に応じて表面状態を変化さ
せることができるので免疫学的凝集反応試薬の担体粒子
としてはさらに好適に用いることができる。

【００１３】また、不溶性担体の粒子径も、免疫学的凝
集反応法診断試薬として用いうる公知の範囲から特に制
限されなく採用されるが、担体粒子重量当りの比表面積
が上げることにより感作物質の吸着量を向上させること
ができるので、通常、粒子径０．０１μｍから３μｍま
でのものが好適に用いられる。

【００１４】不溶性担体の比重は１．０以上であればよ
いが、特に沈降反応を利用したマイクロタイター試薬用
担体粒子は比重が大きい程、沈降速度が速く判定時間が
短縮化できるので１．５以上のものが好適に用いられ
る。

【００１５】本発明では抗原として、Ｃ型肝炎ウイルス
遺伝子由来の抗原タンパクを用いる。

【００１６】本発明でいうＣ型肝炎ウイルス遺伝子由来
の抗原タンパク（以下、ＨＣＶ抗原とも略記する）とは
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子によりコードされるタンパクの
ことである。該Ｃ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶとも略
記する）遺伝子とは特開平４−１４４６８６及び特開平
４ー１７９４８２に記載されている塩基配列を有する全
長約１０ｋｂ（約１万ヌクレオチド）のＲＮＡである。
ＨＣＶはＲＮＡウイルスであるが、ＨＣＶ由来のＲＮＡ
より逆転写酵素により作り出されたｃＤＮＡも該Ｃ型肝
炎ウイルス遺伝子に該当する。

【００１７】該Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子は、輸血後非Ａ
非Ｂ肝炎患者の血清からウイルス遺伝子を分離して作製
したｃＤＮＡライブラリーから得ることが出来る。例え
ば、まず患者血清から超遠心によりＣ型肝炎ウイルスを
分離し、次いでウイルスから遺伝子ＲＮＡを調製し、該
ＲＮＡに対して逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成
し、しかるのちに該ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクター
あるいはファージベクターに挿入して、ｃＤＮＡライブ
ラリーを調製する。次いで、該ｃＤＮＡライブラリー
を、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者の血清（抗ＨＣＶ抗体を含
有する血清）を用いイムノスクリーニングすることによ
り、目的の遺伝子を得ることが出来る。また公知のＨＣ
Ｖ遺伝子の塩基配列をもとにＤＮＡプローブを合成し
て、ｃＤＮＡライブラリーをＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダ
イゼーションによりスクリーニングしてもよい。また別
の方法としては Proceedings of the Japan Academy, V
ol.65, Ser.B, No.9, pp.219〜223(1989).に示される方
法、即ち逆転写酵素とＰＣＲ法とを組み合わせたＲＴ−
ＰＣＲ法により狙った領域を遺伝子増幅させて、その増
幅させた遺伝子断片をクローニングする方法も有効であ
る。

【００１８】該ＨＣＶ抗原は、通常知られている遺伝子
発現系、即ち、大腸菌のホスト・ベクター系、枯草菌の
ホスト・ベクター系、酵母のホスト・ベクター系、昆虫
細胞あるいは昆虫のホスト・ベクター系、動物細胞のホ
スト・ベクター系等を利用して発現が可能である。この
うち、大腸菌は好適に利用出来る。大腸菌を用いて該抗
原タンパクを発現するには、まず大腸菌で発現可能なベ
クターにＨＣＶの遺伝子を挿入し組換えベクターを作製
する。ベクターは特に限定されず、大腸菌のベクターと
して通常用いられるベクターならば如何なるベクターで
も利用できるが、特に遺伝子発現が高頻度で起こるベク
ターは好適に利用される。例えば、一連のｐＵＣベクタ
ー（宝酒造(株)製品）、一連のｐＴＶベクター（宝酒造
(株)製品）、一連のｐＴＺベクター（東洋紡績(株)製
品）、一連のｐＥＴ（Methods in enzymology,Vol.185
に示される）などが利用できる。また、一連のｐＵＥＸ
ベクター（アマシャム・ジャパン(株)製品）、一連のｐ
ＥＸベクター（ベーリンガー・マンハイム山之内(株)製
品）を利用すれば、抗原タンパクをβ−ガラクトシダー
ゼとの融合ポリペプチドとして発現させることができ
る。大腸菌で発現可能なベクターには、通常は大腸菌内
で働く遺伝子発現のためのプロモーターや、それをコン
トロールするオペレーターが附属している。このような
ベクターのプロモーターの下流にある適当な制限酵素部
位を利用してＨＣＶ遺伝子を挿入することにより、組換
えベクターが作製される。このようにして作製される組
換えベクターの中でも、特にｐＵＥＸベクターを用いて
作製される組換えベクターは、遺伝子発現によって得ら
れるポリペプチドの収率がよく、精製が容易であること
などから好適に選択される。組換えベクターにより大腸
菌を形質転換し、該形質転換大腸菌を培養し挿入された
遺伝子を発現させることにより抗原タンパクが生産され
る。

【００１９】組換えベクターで遺伝子発現を行う場合
は、ポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端にランダムな
配列のアミノ酸が複数個付加する場合がある。しかしな
がら、このようなＮ末端、あるいはＣ末端に付加された
複数個のアミノ酸はランダムなアミノ酸であるから、抗
原抗体反応には無関係であり、抗原抗体反応を用いた測
定には影響はない。

【００２０】該ＨＣＶ抗原は、上記形質転換大腸菌を培
養し得られた菌体を超音波処理などの方法で破砕し、こ
の菌体破砕物より公知の方法により分離される。該ＨＣ
Ｖ抗原の精製方法は公知の方法ならばいずれでもよく塩
析、イオン交換樹脂吸着、ゲル濾過等々である。好まし
くは上記方法の組合せが有効である。また、精製された
該ＨＣＶ抗原はどのような溶液に分散されていてもよい
が、好ましくは０．８７％塩化ナトリウム水溶液（以
下、生理食塩水とも略記する）あるいは０．８７％塩化
ナトリウム含有、２０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．２（以
下、ＰＢＳとも略記する）に分散されていることが望ま
しい。試薬感度は不溶性担体の単位表面積当りに担持さ
れる該ＨＣＶ抗原のエピトープ数に依存するため、不溶
性担体の単位表面積当りに担持される該ＨＣＶ抗原のエ
ピトープ数を増加させるために精製純度は高いほど望ま
しい。

【００２１】該ＨＣＶ抗原は抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体
（以下、抗ＨＣＶ抗体とも略記する）に対する免疫学的
反応性を有するポリペプチドである。すなわち、被検体
中の抗体に対するエピトープ部位を有し、抗原抗体反応
により患者血清及び血漿中の抗体と特異的に結合する特
性を有する。

【００２２】該ＨＣＶ抗原のポリペプチド鎖の長さは抗
ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応で認識できる長さであればよ
く、一般に抗原抗体反応で抗体が抗原部位として認識で
きるとされている３アミノ酸残基以上であればよい。さ
らに該ＨＣＶ抗原は不溶性担体粒子に担持するので担体
粒子への吸着効率を考慮すると３０００アミノ酸残基以
下が好適に用いられる。

【００２３】本発明で用いるブロッキング剤とは、感作
粒子上の感作物質の間隙を覆う為に用いる免疫的に不活
性な物質のことを言う。感作粒子を該ブロッキング剤で
覆う目的は１）夾雑物質の影響の回避、２）感作物質同
士の相互吸着の防止の２点にある。 本発明では、該ブ
ロッキング剤として、カゼインを用いる。

【００２４】ブロッキング剤としてカゼインを用いた場
合、感作物質同士の非特異的な結合が防止でき、より多
くの感作物質を不溶性担体に担持することができる。し
たがって高感度化を可能とするほか、他のブロッキング
剤を用いたときと比較して被検体中の夾雑物質の影響に
よる非特異的凝集反応を防止できる。ブロッキング剤と
してカゼイン以外の、例えばＢＳＡを用いた場合、不溶
性担体のＨＣＶ抗原同士が相互吸着を起こして健常者検
体、Ｃ型肝炎患者検体ともに非特異的凝集反応を起こし
てしまう。またブロッキング剤として正常ウサギ血清を
用いた場合は被検体中の夾雑物質の影響を受けやすく健
常者検体に於ける測定で非特異的な感度上昇を生じてし
まうため適当でない。

【００２５】本発明におけるカゼインは公知のものなら
ば特に限定なく用いられる。該カゼインとしては乳タン
パク質の主体をなすもので乳に酸を加えてｐＨ４．６に
する等電点沈澱することにより調製される酸性カゼイン
が好適に用いられる。該酸性カゼインは一般に電気泳動
的にα、β、γの３成分に分離できるがα、β、γのい
ずれでもよくまた２種類以上の混合物として用いること
も可能である。さらに加熱、加圧等の物理的分解、酸・
アルカリ等での化学的分解、タンパク質分解酵素での酵
素的分解により低分子化したものも同様に用いることが
できる。

【００２６】本発明でいう担持とは、不溶性担体に感作
物質としてのＨＣＶ抗原、ブロッキングのためのカゼイ
ン等（以下、これらの不溶性担体に担持する物質を吸着
物質ともいう）を吸着させることである。

【００２７】ＨＣＶ抗原及びカゼインを不溶性担体粒子
に担持する順序は特に制限なく以下の方法の何れかが採
用される。

【００２８】１）不溶性担体にＨＣＶ抗原を担持したの
ちカゼインを担持する方法、２）不溶性担体にカゼイン
を担持したのちにＨＣＶ抗原を担持する方法、３）不溶
性担体にＨＣＶ抗原とカゼインを同時に担持する方法で
ある。いずれの方法でも本発明の効果は十分に発揮され
るが、ＨＣＶ抗原を優先的に担持するために１）の不溶
性担体にＨＣＶ抗原を担持したのちカゼインを担持する
方法が好適に用いられる。

【００２９】上記１）の担持工程を概説すれば、ＨＣＶ
抗原を溶解した緩衝溶液中に不溶性担体を分散、混合し
てＨＣＶ抗原を不溶性担体に担持した後余剰のＨＣＶ抗
原を遠心洗浄で除去し、次いでカゼインを同様にして担
持する方法が挙げられる。

【００３０】不溶性担体にＨＣＶ抗原を担持する方法と
しては疎水吸着法等の物理的吸着法、塩化クロム法等の
化学的吸着法等の公知の方法が採用されるが、ＨＣＶ抗
原は不溶性担体に担持されたのち被検体中の抗ＨＣＶ抗
体と抗原抗体反応により結合をするため該ＨＣＶ抗原は
できるだけ穏やかな条件で担持することが必要であり、
そのため疎水的吸着法が特に好適に用いられる。

【００３１】上記疎水的吸着法による担持は、緩衝作用
のある緩衝液中に不溶性担体と吸着物質を分散させた状
態で行う。該緩衝液は燐酸緩衝液、グリシン緩衝液、ト
リス緩衝液、酢酸緩衝液等など緩衝作用のあるものなら
ば制限なく用いることができる。緩衝液のｐＨについて
は、一般に中性領域ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が望まし
い。不溶性担体に吸着物質を担持させる時間は吸着物質
が均一的に不溶性担体表面に担持されるのに十分な時間
であればよいが、例えば該ＨＣＶ抗原をＨＤＰの疎水吸
着法で行う場合は３０分間以上で十分である。さらに温
度に関しても担持する吸着物質が熱変性を受けない範囲
即ち１℃以上８０℃以下が採用される。

【００３２】続いての不溶性担体へのカゼインの担持も
上述の感作物質の担持と同様の方法を採用することがで
きる。

【００３３】例えば、本発明のＣ型肝炎診断用免疫学的
凝集反応試薬においては、ＨＣＶ抗原を担持した不溶性
担体（以下、ＨＣＶ抗原感作担体ともいう）を遠心洗浄
で余剰のＨＣＶ抗原を除去した後、該ＨＣＶ抗原感作担
体をブロッキング剤であるカゼインを０．１〜５（ｗ／
ｖｏｌ）％となるように中性付近のｐＨ６．０〜ｐＨ
８．０で緩衝作用のある緩衝液に溶解した溶液中に感作
粒子濃度０．０００１〜３０（ｗ／ｗ）％となるように
分散してブロッキング剤の担持を行う。

【００３４】本発明のＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応
試薬とは、上記したとおりの被検体（血清、血漿、尿、
便等）中に存在する抗ＨＣＶ抗体を免疫学的凝集反応で
検出するために不溶性担体にＨＣＶ抗原及び免疫学的に
不活性なブロッキング剤としてカゼインを担持した診断
用試薬である。

【００３５】該免疫学的凝集反応試薬は通常診断に利用
される凝集反応法が何ら制限なく適用される。例えば、
定性診断の平板法、半定量診断のマイクロタイター法及
び定量診断のラテックス凝集法、粒子数計測法等であ
る。そのうち、特にマイクロタイタ−法に適用する場
合、本発明の効果が特に顕著である。

【００３６】上記Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬
は水性溶媒に懸濁して使用されるが、長期に保存する場
合はこれを凍結乾燥することが好ましい。凍結乾燥方法
は限定的ではなく通常の方法で行えばよい。例えば感作
赤血球の凍結乾燥法に採用される方法及び条件が用いら
れる。好ましくは上記該免疫学的凝集反応試薬を水性溶
媒に懸濁状態でバイアル瓶等に入れ、液体窒素等に浸漬
して急速予備凍結し次いで真空凍結乾燥する方法が採用
される。

【００３７】真空凍結乾燥方法の条件は特に限定される
ものではないが、上記感作粒子の浮遊液の入ったバイア
ル等を急速予備凍結したのち、予め−４０〜−６０℃に
冷却した凍結乾燥機のチャンバ−内に置き２４〜７２時
間かけて徐々に昇温し真空凍結乾燥する方法が好適であ
る。この時のチャンバー内の圧力５０〜２００μｍＨ
ｇ、最終乾燥温度は２０〜５０℃が適当である。ついで
真空状態、または不活化ガスを充填して封栓して凍結乾
燥免疫学的凝集反応試薬（以下、凍結乾燥試薬ともい
う）とする。

【００３８】該凍結乾燥試薬は、吸収剤を含む緩衝液
（以下、粒子溶解液ともいう）に懸濁、分散した後測定
に供される。粒子溶解液中に懸濁、分散された凍結乾燥
試薬は凍結乾燥を施す前の免疫学的凝集反応試薬と何ら
変わりない性能を示す。なお、凍結乾燥を行わない場合
にも粒子溶解液に免疫学的凝集反応試薬を懸濁、分散し
て測定に供する。

【００３９】本発明のＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応
試薬を用いて実際に被検体中の抗ＨＣＶ抗体を検出する
には、被検体を測定レンジ内の適当濃度まで希釈する検
体希釈液が必要である。該検体希釈液は吸収剤を含む緩
衝液から構成される。

【００４０】検体希釈液は吸収剤および緩衝液を主成分
とするものであるが、検体希釈液に含有されている吸収
剤として上記免疫学的凝集反応試薬のブロッキング剤と
して不溶性担体に担持されている物質と同じくカゼイン
を使用することが必須である。

【００４１】免疫学的凝集反応試薬に担持されたカゼイ
ンは、ブロッキング剤として、一般に感作したＨＣＶ抗
体同士の相互吸着の防止、被検体中の夾雑物質の不溶性
担体表面への吸着防止のために用いられるが、不溶性担
体に担持した該カゼインと被検体中の夾雑物質が非特異
的吸着を起こすと新たな非特異的凝集反応の原因とな
る。

【００４２】そこで検体希釈液に、上記ブロッキング剤
と同じくカゼインを吸収剤として添加することにより、
不溶性担体に担持した該カゼインと非特異的吸着を起こ
す被検体中の夾雑物質を予め吸着除去する。免疫学的凝
集反応試薬に担持されているカゼインと異なる物質を検
体希釈液の中に添加した場合、被検体中に含まれる免疫
学的凝集反応試薬に担持されたカゼインと非特異的吸着
を起こす夾雑物質は吸収除去されず、非特異的凝集反応
を起こし易い。

【００４３】検体希釈液及び粒子溶解液に用いる緩衝液
は、公知の緩衝液が特に限定されず用いられる。例え
ば、燐酸緩衝液、トリス緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩
衝液、グリシン緩衝液等である。該緩衝液のｐＨは特に
限定されないが、不溶性担体自身が凝集を起こさないよ
うに中性から弱アルカリ性域のｐＨ７〜ｐＨ１０が好適
に用いられる。従って中性から弱アルカリ性で緩衝作用
のある燐酸緩衝液、トリス緩衝液等が好適に用いられ
る。また、該緩衝液の濃度も緩衝作用のある領域であれ
ば任意のものを用いることができ、５ｍＭ〜５００ｍＭ
が好適に用いられる。

【００４４】さらに検体希釈液及び粒子溶解液には塩が
存在してもよい。塩の種類、濃度については特に限定は
されないが、抗原抗体反応が好適に進行する条件、例え
ば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウ
ム等で濃度は１ｍＭから１Ｍ程度が好適に用いられる。
また、腐敗を防止するために０．１（ｗ／ｖｏｌ）％程
度のアジ化ナトリウム等を添加してもよい。

【００４５】調製された検体希釈液や粒子溶解液は１５
℃以下の冷蔵保存で通常２年間程度の保存が可能であ
る。

【００４６】本発明において検体希釈液の代表的な調製
方法は、緩衝液にカゼインを０．０００１〜３０（ｗ／
ｖｏｌ）％となるように添加、溶解したのち、必要に応
じて酸、またはアルカリを加えて緩衝液のｐＨを微調整
して検体希釈液とする。さらに必要に応じて塩化ナトリ
ウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム等を添加、溶解
する。

【００４７】粒子溶解液には、管底凝集像の安定化のた
めに多糖類等を添加する場合がある。

【００４８】上記Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬
と検体希釈液からなる診断用キットをマイクロタイター
試薬として使用するときは通常、マイクロタイタープレ
ート上で反応を行う。定性試験を行うときは、被検体を
規定希釈倍率まで検体希釈液で希釈したのち、粒子溶解
液に懸濁した上記免疫学的凝集反応試薬を滴下すること
によって測定を行う。

【００４９】

【作用】不溶性担体にＨＣＶ抗原及びカゼインを担持さ
せることで被検体中の夾雑物質の不溶性担体表面への吸
着防止が可能となる。しかしながら、不溶性担体に担持
した該カゼインと被検体中の夾雑物質が非特異的吸着を
起こすと新たな非特異的凝集反応が生じる可能性があ
る。そこで検体希釈液にもカゼインを添加することによ
り、不溶性担体に担持した該カゼインと非特異的吸着を
起こす被検体中の夾雑物質を吸着除去し、上記非特異的
凝集反応を防止する。

【００５０】他方、不溶性担体にＨＣＶ抗原及びカゼイ
ンを担持することによりＨＣＶ抗原同士の相互的結合を
起こさず、過剰のＨＣＶ抗原を不溶性担体に担持でき
る。従って、ＨＣＶ抗原同士の相互作用を防止でき、よ
り多くの活性部位を効率的に担体粒子表面に露出させる
ことで高感度化が可能となるが、さらに、検体希釈液中
に上記カゼインを添加することにより被検体に含まれる
夾雑物質を予め吸着除去することで夾雑物質とＨＣＶ抗
原による非特異的凝集反応の防止ができるため、ＨＣＶ
抗原と測定目的物質との真の免疫学的凝集反応のみが起
こり、結局免疫学的凝集反応試薬の高感度化が可能とな
る。

【００５１】

【発明の効果】不溶性担体にＨＣＶ抗原及びカゼインを
担持し、さらに検体希釈液にもカゼインを用いること
で、ＨＣＶ抗原と非特異的凝集反応を起こす夾雑物質、
及びカゼインと非特異的凝集反応を起こす夾雑物質を共
に吸収除去できた。その結果、非特異的凝集反応を回避
し且つ被検体中の測定目的物質の微量検出、即ち高感度
化を高度に実現することが可能となった。

【００５２】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、これらの実施例により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。

【００５３】参考例 Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子由来の抗
原タンパクの調製 Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子由来の抗原タンパクとしてはＣ
ｏｒｅ抗原、ＮＳ−３抗原、ＮＳ−４抗原、ＮＳ−５抗
原の４種類を用いた。以下のようにして４種類の抗原タ
ンパクを調製した。遺伝子操作実験の手法は、サムブロ
ックらの方法［Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniat
is, T., Molecular Cloning, 2nd ed.,Cold Spring Har
bor Laboratory Press, New York (1989).］に従って行
った。なお、制限酵素は宝酒造（株）製品を使用した。 （Ｃｏｒｅ抗原の調製） ＨＣＶのＣｏｒｅ領域遺伝子（Ｎ末端から1番目から168
番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列）をpUEX2（A
mersham社製）に挿入したpHCX01を持つ組換え大腸菌HB1
01［pHCX01］（特願平4-198806、微工研菌寄第13056
号）をＬＢ＋Ａｍｐ培地［Bacto tryptone 1.0%, Yeast
extract 0.5%, NaCl 0.5%, アンヒ゜シリン(Amp)50μg
／ml］で30℃で一晩培養し、最終濃度が15％となるよう
にグリセリンを添加して−80℃で凍結保存した。

【００５４】組換え大腸菌HB101［pHCX01］を培養し遺
伝子発現を行うことにより、Ｃｏｒｅ抗原はβ−ガラク
トシダーゼとの融合ポリペプチドとして生産される。組
換え大腸菌HB101［pHCX01］の凍結保存菌体１mlを、１
リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地に接種し30℃にて一晩培養
した。続いてこの培養物を、20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ
培地に植菌し30℃でＯＤ540が1.5となるまで培養し、培
養温度を42℃に上昇させて引き続き３時間培養した。培
養後、遠心分離により集菌し57gの湿菌体を得た。菌体
を２リットルの、0.6M尿素を含むTNE緩衝液（50mM Tris
・HCl(pH8.3),100mM NaCl, 1mM EDTA）に懸濁し、超音
波処理により破砕した。この菌体破砕物を10,000g、20
分間の遠心分離により、Ｃｏｒｅ抗原を含む不溶性顆粒
を沈澱画分に回収した。この沈澱を、再び２リットルの
0.6M尿素を含むTNE緩衝液に懸濁して不溶性顆粒を洗浄
し、遠心分離することにより沈澱を回収した。更にこの
沈澱を、２リットルの3M尿素を含むTNE緩衝液に懸濁
し、室温で30分間攪はんすることにより不溶性顆粒を十
分洗浄した後、遠心分離することにより不溶性顆粒を沈
澱画分に回収した。この不溶性顆粒の沈澱に、200mlの8
M尿素を含むTNE緩衝液を加え沈澱を可溶化した。これを
16,000g、20分間の遠心分離により上清を分取し、TNE緩
衝液に対して透析した。透析後、16,000g、20分間の遠
心分離により上清を分取しＣｏｒｅ抗原を得た。20リッ
トルの培養液からＣｏｒｅ抗原を980mg得た。

【００５５】（ＮＳ−３抗原の調製） ＮＳ−３領域遺伝子（Ｎ末端から1323番目から1533番目
のアミノ酸配列をコードする塩基配列）を含むプラスミ
ドpHCV07を持つ組換え大腸菌E. coli HCV7（特開平4-17
9482、微工研菌寄第11831号）からpHCV07を単離してEco
RIとStuIで消化し、ｃＤＮＡの５’側の338bp断片を得
た。この338bp断片はさらにHinfIで部分消化後、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ Klenow fragmentにより末端を平滑化
し、263bp断片を得た。またpHCV7をStuIで消化し、CIP
処理した後、PstI消化し、ｃＤＮＡの３’側の400bp断
片を得た。一方pUEX1をSmaIとPstIで消化し、CIP処理し
た。このpUEX1とｃＤＮＡの５’側の263bp断片、ｃＤＮ
Ａの３’側の400bp断片のライゲーション反応を行い、
組換えベクターpCI07を得た。この組換えベクターpCI07
には、ＨＣＶのＮ末端から数えて、1323番目から1533番
目のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれる。次
に、組換えベクターpCI07で宿主大腸菌HB101を形質転換
し、組換え大腸菌HB101［pCI07］を得た。組換え大腸菌
HB101［pCI07］をＬＢ＋Ａｍｐ培地で30℃で一晩培養
し、最終濃度が15％となるようにグリセリンを添加して
−80℃で凍結保存した。

【００５６】組換え大腸菌HB101［pCI07］を培養し遺伝
子発現を行うことにより、ＮＳ−３抗原はβ−ガラクト
シダーゼとの融合ポリペプチドとして生産される。Ｃｏ
ｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌HB101［pCI
07］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチドの分離精製
を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地にて培養し、
ＮＳ−３抗原を1,000mg得た。

【００５７】（ＮＳ−４抗原の調製） ＮＳ−４領域遺伝子（Ｎ末端から1605番目から1798番目
のアミノ酸配列をコードする塩基配列）を含むプラスミ
ドpHCV10を持つ組換え大腸菌E. coli HCV10（特開平4-1
79482、微工研菌寄第11834号）からpHCV10を単離してAv
aIIで消化後、ＤＮＡポリメラーゼＩ Klenow fragment
により末端を平滑化し、さらにBamHIで消化して583bp断
片を単離した。一方pUEX3をSmaIで消化し、CIP処理し、
さらにBamHIで消化した。その後、電気泳動を行い目的
の断片を分離した。これらをライゲーションし、組換え
ベクターpCI10を作製した。この組換えベクターpCI10に
は、ＨＣＶのＮ末端から数えて、1605番目から1798番目
のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれる。次
に、組換えベクターpCI10で宿主大腸菌HB101を形質転換
し、組換え大腸菌HB101［pCI10］を得た。組換え大腸菌
HB101［pCI10］をＬＢ＋Ａｍｐ培地で30℃で一晩培養
し、最終濃度が15％となるようにグリセリンを添加して
−80℃で凍結保存した。

【００５８】組換え大腸菌HB101［pCI10］を培養し遺伝
子発現を行うことにより、ＮＳ−４抗原はβ−ガラクト
シダーゼとの融合ポリペプチドとして生産される。Ｃｏ
ｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌HB101［pCI
10］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチドの分離精製
を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地にて培養し、
ＮＳ−４抗原を720mg得た。

【００５９】（ＮＳ−５抗原の調製） ＮＳ−５領域遺伝子（Ｎ末端から2111番目から2270番目
のアミノ酸配列をコードする塩基配列）を含むプラスミ
ドpHCV14を持つ組換え大腸菌E. coli HCV14（特願平4-1
79482、微工研菌寄第11838号）からpHCV14を単離してPs
tI及びXbaIで消化後、blunting kitにより末端を平滑化
し、484bpを含む断片を単離した。一方pUEX2をSmaIで消
化し、CIP処理した。その後、電気泳動を行い目的の断
片を分離した。これらをライゲーションし、組換えベク
ターpCI14を作製した。この組換えベクターpCI14には、
ＨＣＶのＮ末端から数えて、2111番目から2270番目のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれる。次に、組
換えベクターpCI14で宿主大腸菌HB101を形質転換し、組
換え大腸菌HB101［pCI14］を得た。組換え大腸菌HB101
［pCI14］をＬＢ＋Ａｍｐ培地で30℃で一晩培養し、最
終濃度が15％となるようにグリセリンを添加して−80℃
で凍結保存した。

【００６０】組換え大腸菌HB101［pCI14］を培養し遺伝
子発現を行うことにより、ＮＳ−５抗原はβ−ガラクト
シダーゼとの融合ポリペプチドとして生産される。Ｃｏ
ｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌HB101［pCI
14］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチドの分離精製
を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地にて培養し、
ＮＳ−５抗原を750mg得た。

【００６１】比較例１ カゼインをブロッキング剤とし
て用いたＣ型肝炎診断用免疫学的凝集 反応試薬の調製 （感作） 直径１．８μｍのＨＤＰ（徳山曹達(株)製品）をＰＢＳ
で５（ｗ／ｗ）％になるように懸濁し、ＨＤＰ懸濁液と
した。上記参考例で調製した４種類のＨＣＶ抗原タンパ
クを各５０、１００、２００μｇ／ｍｌで混合して混合
抗原溶液とした。上記ＨＤＰ懸濁液１ｍｌと混合抗原溶
液１ｍｌを試験管内で混合して室温で１時間放置してＨ
ＤＰ表面に疎水的に担持させた（以下、この吸着操作を
感作ともいう）。

【００６２】（洗浄操作） その後、余剰のＨＣＶ抗原タンパクを除去するために、
上記混合液に２，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離を施
し、遠心上清を除去した。その遠心沈澱物に洗浄のた
め、ＰＢＳ２ｍｌを添加、懸濁後２，５００ｒｐｍ、５
分間遠心後上清を除去した。上記ＨＣＶ抗原タンパクを
吸着させたＨＤＰをＨＣＶ抗原感作粒子とした。

【００６３】（ブロッキング操作） 該ＨＣＶ抗原感作粒子（５０ｍｇ）に１％カゼイン、５
ｍｌを添加して３７℃で３時間ブロッキングを行った。
ブロッキング後、上記懸濁液に２、５００ｒｐｍ、５分
間遠心分離を施し、遠心上清を除去した。上記操作でブ
ロッキング操作を完了し、Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集
反応試薬（以下、Ｃ型肝炎診断試薬ともいう）を調製し
た。このＣ型肝炎診断試薬を３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％正
常ウサギ血清含有ＰＢＳ（以下、Ａ液とも略記する）に
０．５（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸濁して以下の測
定操作に供した。

【００６４】（測定操作） 一方、検査に用いる検体をＡ液で２倍より順次倍数希釈
した。次に、検体の希釈液を９６穴マイクロタイタープ
レートに各々２５μｌずつ１穴から１８穴まで滴下し
た。ついで、上記でＣ型肝炎診断試薬懸濁液をを各穴２
５μｌを滴下した。滴下後、プレートミキサーで振とう
して３０分間静置したのち、管底凝集像を観察した。

【００６５】（結果） 上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能評価を健
常者検体５検体、Ｃ型肝炎患者検体５検体を用いて行っ
た。結果を表１に示した。健常者検体はいずれも８倍希
釈までしか、陽性像が検出されなかったのに対してＣ型
肝炎患者検体ではいずれも感作濃度２００μｇ／ｍｌで
３２，７６８倍希釈以上でも陽性像が検出できた。

【００６６】

【表１】

【００６７】実施例１ カゼインをブロッキング剤とし
て用いたＣ型肝炎診断試薬とカゼインを添加した検体希
釈液からなるＣ型肝炎診断用キット （感作） 比較例１と同様である。

【００６８】（洗浄操作） 比較例１と同様である。

【００６９】（ブロッキング操作） 該ＨＣＶ抗原感作粒子に１％カゼイン、５ｍｌを添加し
て３７℃で３時間ブロッキングを行った。ブロッキング
後、上記懸濁液に２、５００ｒｐｍ、５分間遠心分離を
施し、遠心上清を除去した。上記操作でブロッキング操
作を完了し、Ｃ型肝炎診断試薬を調製した。１（ｖｏｌ
／ｖｏｌ）％カゼイン含有ＰＢＳ（以下、Ｂ液とも略記
する）に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸濁して
以下の測定操作に供した。

【００７０】（測定操作） 一方、検査に用いる検体をＢ液で２倍より順次倍数希釈
した。次に、検体の希釈液を９６穴マイクロタイタープ
レートに各々２５μｌずつ１穴から１８穴まで滴下し
た。ついで、上記Ｃ型肝炎診断試薬懸濁液を各穴２５μ
ｌを滴下した。滴下後、プレートミキサーで振とうして
３０分間静置したのち、管底凝集像を観察した。試薬感
度は力価で表示する。 （結果） 上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能評価を健
常者検体５検体、Ｃ型肝炎患者検体５検体を用いて行っ
た。結果を表２に示した。健常者検体はいずれも４倍希
釈までしか、陽性像が検出されなかったのに対してＣ型
肝炎患者検体では感作濃度２００μｇ／ｍｌで３２，７
６８倍希釈以上でも陽性像が検出できた。健常者検体を
比較例１と比較するとさらに非特異的凝集反応を低減で
きることがわかり検体希釈液への添加成分としてのカゼ
インの効果が確認された。

【００７１】

【表２】

【００７２】比較例２ カゼインによるブロッキングを
行わないＣ型肝炎診断試薬 （感作） 比較例１と同様に行った。

【００７３】（洗浄操作） 比較例１と同様に行った。

【００７４】（ブロッキング操作） 比較例１で行ったブロッキング操作は比較例２では省略
した。感作、洗浄操作で調製したＣ型肝炎診断試薬を３
％正常ウサギ血清を含有するＡ液に０．５（ｗ／ｖｏ
ｌ）％になるように懸濁して以下の測定操作に供した。

【００７５】（測定操作） 検査に用いる検体をＡ液で２倍より順次倍数希釈した。
次に、検体の希釈液を９６穴マイクロタイタープレート
に各々２５μｌずつ１穴から１８穴まで滴下した。つい
で、上記Ｃ型肝炎診断試薬懸濁液を各穴２５μｌを滴下
した。滴下後、プレートミキサーで振とうして３０分間
静置したのち、管底凝集像を観察した。試薬感度は力価
で表示する。 （結果） 上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能評価を比
較例１と同様に健常者検体５検体、Ｃ型肝炎患者検体５
検体を用いて行った。結果を表３に示した。カゼインブ
ロッキングを行った場合は健常者検体、Ｃ型肝炎患者検
体いずれも非特異的凝集反応が起こらなかった２００μ
ｇ／ｍｌ感作で非特異的凝集反応を起こしてしまった。
このことよりカゼインブロッキングを行うことでより多
くの抗原を感作することができ、免疫学的凝集反応試薬
の高感度化が可能であるが証明された。また、健常者検
体ではブロッキングを行うことにより非特異的感度上昇
の防止が可能となる。

【００７６】

【表３】

【００７７】比較例３ カゼインによるブロッキングを
行わないＣ型肝炎診断試薬とカゼインを添加した検体希
釈液からなるＣ型肝炎診断用キット （感作） 比較例２と同様に行った。

【００７８】（洗浄操作） 比較例２と同様に行った。

【００７９】（ブロッキング操作） 比較例３でも比較例１で行ったブロッキング操作は省略
した。感作、洗浄操作で調製したＣ型肝炎診断試薬を１
％カゼインを含有するＢ液に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％に
なるように懸濁して以下の測定に供した。

【００８０】（測定操作） 検査に用いる検体を１％カゼイン含有したＢ液で２倍よ
り順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を９６穴マイ
クロタイタープレートに各々２５μｌずつ１穴から１８
穴まで滴下した。ついで、上記Ｃ型肝炎診断試薬懸濁液
を各穴２５μｌを滴下した。滴下後、プレートミキサー
で振とうして３０分間静置したのち、管底凝集像を観察
した。試薬感度は力価で表示する。 （結果） 上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能評価を比
較例１と同様に健常者検体５検体、Ｃ型肝炎患者検体５
検体を用いて行った。結果を表４に示した。カゼインブ
ロッキングを行った場合は健常者検体、Ｃ型肝炎患者検
体いずれも非特異的凝集反応が起こらなかった２００μ
ｇ／ｍｌ感作で非特異的凝集反応を生じてしまった。こ
のことより検体希釈液の添加成分としてのカゼインはブ
ロッキング剤としてカゼインと使用することによっては
じめて効果を発揮すること判明した。

【００８１】

【表４】

【００８２】比較例４〜６ カゼイン以外のブロッキン
グ剤（ＢＳＡ、正常ウサギ血清、グリシン）を用いたＣ
型肝炎診断試薬とカゼインを添加した検体希釈液からな
るＣ型肝炎診断用キット （感作） 比較例１と同様である。ただし、感作するＨＣＶ抗原濃
度は２００μｇ／ｍｌのみで行った。

【００８３】（洗浄操作） 比較例１と同様である。

【００８４】（ブロッキング操作） 該Ｃ型肝炎診断用感作粒子（５０ｍｇ）に１％ＢＳＡ、
１％正常ウサギ血清又は１％グリシンをそれぞれ５ｍｌ
添加して３７℃で３時間ブロッキングを行った。ブロッ
キング後、上記懸濁液に２、５００ｒｐｍ、５分間遠心
分離を施し、遠心上清を除去した。上記操作でブロッキ
ング操作を完了し、３種類のＣ型肝炎診断試薬を調製し
た。各々のＣ型肝炎診断試薬を１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％
カゼイン含有ＰＢＳである液に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％
になるように懸濁し、それぞれのＣ型肝炎診断試薬を調
製して以下の測定操作に供した。

【００８５】（測定操作） 一方、検査に用いる検体をＢ液で２倍より順次倍数希釈
した。次に、検体の希釈液を９６穴マイクロタイタープ
レートに各々２５μｌずつ１穴から１８穴まで滴下し
た。ついで、３種類の上記Ｃ型肝炎診断試薬懸濁液を各
穴２５μｌを滴下した。滴下後、プレートミキサーで振
とうして３０分間静置したのち、管底凝集像を観察し
た。試薬感度は力価で表示する。 （結果） 上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能評価を健
常者検体５検体、Ｃ型肝炎患者検体５検体を用いて行っ
た。結果を表５に示した。ブロッキング剤としてＢＳＡ
又はグリシンを用いた場合はすべて非特異的凝集反応を
示し、正常ウサギ血清については健常者検体が非特異的
な感度上昇が見られた。従って、Ｃ型肝炎診断試薬のブ
ロッキング剤としてのカゼインの有効性が確認された。

【００８６】

【表５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 平４−354500（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−142230（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−142231（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−68563（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−19562（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/531 A61K 39/29 C12N 15/09 G01N 33/543 581 G01N 33/576 C12N 15/09 C12R 1:19

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不溶性担体にＣ型肝炎ウイルス遺伝子由
   来の抗原タンパク及びカゼインを担持してなるＣ型肝炎
   診断用免疫学的凝集反応試薬と、カゼイン及び緩衝液を
   含んでなる検体希釈液とから構成されるＣ型肝炎診断用
   キット。