JP3095478B2 - 免疫学的凝集反応粒子の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的凝集反応粒子
の製造方法に関する。より詳しくは、非生物学的粒子に
抗原又は抗体を感作する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野では、近年種々の疾患を
血清学的に診断することが重要視されている。そして、
この診断のためには、抗原あるいは抗体を正確、迅速且
つ簡便に定量することが極めて重要な課題となってい
る。そこで、抗原あるいは抗体を不溶性担体に感作して
抗体あるいは抗原を検出する凝集反応が、操作が簡単で
あることに加え、反応が肉眼的に観察し易いことから臨
床検査や研究分野で広く用いられている。

【０００３】かかる凝集反応は原理的には一種類である
が、不溶性担体の種類によって分類される。即ち、不溶
性担体としては、ラテックス、カオリン、炭末、シリ
カ、有機無機複合粒子などの非生物学的粒子、動物赤血
球、細菌菌体などの生物学的粒子、等が用いられる。

【０００４】生物学的粒子は、同種類の生物を用いても
個体間差がみられ、又、例えば、動物赤血球に於いて
は、赤血球表面に固有の抗原を有しており、非特異的反
応を起こして目的とする凝集反応に誤りを与える可能性
が大きい。

【０００５】したがって、最近では化学的に安定で、そ
れ自身抗原活性を有しない等の利点のある非生物学的粒
子を使用する傾向にあるが、生物学的粒子を用いた場合
と同程度の凝集像が得られにくいという欠点がある。例
えば、不溶性担体として非生物学的粒子を用いた場合、
生物学的粒子を用いた場合と同程度の凝集像を得ようと
すると、抗原抗体複合物に補体が結合したときに起こる
免疫粘着効果、抗原量あるいは抗体量、抗原抗体の結合
力など種々の検討を行う必要があった。

【０００６】ところで、非生物学的粒子に抗原あるいは
抗体を感作する時の塩の存在については従来関心がもた
れず、無添加かあるいは０．１５Ｍの生理食塩濃度で行
われていたに過ぎない。この場合、非特異的反応や感度
の低下がみられるが、あえて検討される事はなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、凝集反
応試薬の不溶性担体として非生物学的粒子を用いた場
合、生物学的粒子を用いた場合と同程度の凝集像を得る
ことを目的として鋭意研究を重ねた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】その結果、抗原あるいは
抗体の非生物学的な不溶性担体への感作において、特定
の塩を特定の濃度で存在させて感作を行うことにより生
物学的粒子を用いた場合と同程度の凝集像を得ることを
見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００９】 即ち、本発明は、非生物学的粒子に抗原
または抗体を担持した免疫学的凝集反応粒子の製造方法
において、感作液中に無機塩およびアスパラギン酸ナト
リウム、グルタミン酸ナトリウムのアミノ酸塩から選ば
れた少なくとも１種を０．０５〜０．１Ｍの濃度で存在
させて抗原または抗体を感作することを特徴とする免疫
学的凝集反応粒子の製造方法である。

【００１０】本発明において用いられる非生物学的粒子
は、一般に非生物学的粒子に分類されているものであれ
ば特に限定されず、具体的には次のものが例示される。
例えば、ポリスチレン粒子、ポリアクリルアミド粒子等
のラテックス粒子；カオリン、炭末、並びにシリカ、ア
ルミナ、チタニア、ジルコニア或いはこれらを主成分と
する複合酸化物等の無機粒子；前記シリカなどの無機粒
子表面を有機物で処理して該有機化合物が粒子表面に化
学的、叉は物理的に結合した有機無機複合粒子；、ゼラ
チン粒子などが挙げられる。特に、有機無機複合粒子は
人工担体であるため表面を目的に応じて化学的処理で
き、また、非特異的反応が極めて起こりにくいので好適
に用いられる。

【００１１】かかる非生物学的粒子に感作する物質とし
ては、免疫学的凝集反応を起こす抗原叉は抗体が用いら
れる。抗原は、抗体を産生させて、体液性免疫や細胞性
免疫を誘発する物質であれば特に制限されず例えば、蛋
白、糖蛋白、脂質蛋白、脂質、核酸等が挙げられる。抗
体は、抗原と特異的に結合する活性を持つものであれば
特に制限されずＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，Ｉｇ
Ｅ等が挙げられる。

【００１２】抗原又は抗体を非生物学的粒子上へ感作し
て得る免疫学的凝集反応粒子の製造は、一般に、リン酸
緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等の緩衝液中に
前記非生物学的粒子と、担体１ｇ当たり０．０１〜５０
ｍｇの抗原あるいは抗体を混合、感作して行われる。具
体的には、通常、感作は室温で約１時間放置すればよい
が、４〜５６℃の広い温度範囲で感作が可能である。

【００１３】上記免疫学的凝集反応粒子の製造にあた
り、抗原又は抗体の非生物学的粒子への感作を、感作液
中の塩濃度０．０５〜０．１Ｍで行うことが必要であ
る。塩濃度が０．０５Ｍより低ければ、免疫学的凝集反
応試薬としたときに特異的な反応が得られにくくなる。
０．１Ｍを超えると免疫学的凝集反応試薬としたときに
感度の低下を招いてしまう。

【００１４】更に、本発明においては、感作液中に存在
させる塩として無機塩及び／叉はアミノ酸塩を使用する
事が必須である。これら以外の塩、例えば酢酸ナトリウ
ム等の有機酸塩では本発明の効果が発現しない。無機塩
としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等
が、同じくアミノ酸塩としては、アスパラギン酸ナトリ
ウム、グルタミン酸ナトリウム等が挙げられ、これらは
１種類、又は２種類以上混合しても何等問題なく用いら
れる。

【００１５】上記方法で製造された免疫学的凝集反応粒
子を蛋白質、塩等とともに水媒体中に分散し、これら全
成分を含有した分散液を、免疫学的凝集反応試薬（以
下、凝集反応試薬とも言う）と言い、診断薬に供され
る。

【００１６】凝集反応試薬中の凝集反応粒子の濃度は、
通常０．３〜１重量％である。下限値より小さいと、凝
集像が不鮮明となり判定できない。上限値より大きいと
感度が悪くなる。

【００１７】凝集反応試薬中の蛋白質は、凝集反応を起
こすために必要な成分であり、抗原抗体反応を阻害しな
いものであれば特に制限されない。例えば、牛血アルブ
ミン、ヤギ血清、ウサギ血清、ゼラチン、スキムミルク
等が挙げられる。 凝集反応試薬中の塩には、一般的
に、無機塩あるいはアミノ酸塩が用いられ、該無機塩と
しては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリ
ウム等が挙げられる。また、該アミノ酸塩としては、ア
スパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム等が
挙げられる。

【００１８】凝集反応試薬に使用する水は、超純水ある
いは蒸留水を使用することが好ましく、更には、例えば
リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、生理食
塩水などのｐＨ４〜９の緩衝液を用いるほうが、抗原抗
体反応が速やかに進行するのでより好ましい。

【００１９】凝集反応粒子を、より長期にわたって保存
するためには乾燥状態で保存する。乾燥方法としては、
何ら制限されないが凍結乾燥方法が好適である。

【００２０】かかる乾燥した凝集反応粒子は、臨床検査
に用いる前に、分散液を用いて、分散状態に復元され
る。

【００２１】

【作用及び効果】非生物学的粒子に抗原又は抗体を感作
するに当たり、感作時に無機塩及び／叉はアミノ酸塩を
用い且つこれらの塩の濃度を０．０５〜０．１Ｍとする
ことで、より特異性の高い、且つ高感度の診断試薬を得
ることができた。

【００２２】感度及び特異性が向上した理由は明確では
ないが、非生物学的粒子表面の電気二重層に、塩の種類
および塩濃度が大きく影響を与えているとためと考えら
れる。

【００２３】

【実施例】本発明を以下に示す実施例により具体的に説
明するが、本発明は、これら実施例により何ら限定され
るものではない。

【００２４】実施例１ 凝集反応試薬として、免疫学的大腸癌診断薬を作成する
為に、ウサギ由来の抗ヒトヘモグロビン抗体（カッペル
社製）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．０５
Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解させた。次いで、このヒ
トヘモグロビン抗体を含んだ塩化ナトリウム水溶液に、
０．０５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．２）にモノフェニルトリエトキシシラン
およびエチレンジアミン三酢酸ナトリウムで表面処理し
たシリカ粒子である有機無機複合粒子（徳山曹達株式会
社製、商品名：イムノティクルスＨＤＰ）０．５重量％
を分散させた液を等量加えて１時間放置し、次いで、
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄し、
凍結乾燥して、抗ヒトヘモグロビン抗体が感作された有
機無機複合粒子からなる凝集反応粒子を調製した。その
後、３ヶ月間、４℃で放置した。前記期間保存した凝集
反応粒子を凝集反応試薬基準で０．５重量％濃度となる
ように蒸留水で溶解して凝集反応試薬を調合した。

【００２５】次に、この免疫学的大腸癌診断薬の性能を
以下に示すように測定した。

【００２６】被検液として大腸癌患者便３ｍｇを０．０
１重量％のデオキシコール酸ナトリウムを含む０．０１
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させたものを用
い、該被検液を原液として、倍数希釈法に従って上記グ
リシン緩衝液を用いて希釈を行い、各希釈液をマイクロ
タイタープレートのウェル中に２５μｌずつ加えた。次
いで、前記調合した凝集反応試薬を該ウェル中に２５μ
ｌずつ加えて行き、１分間の攪拌の後室温で放置した。
３０分後、粒子の凝集状態を観察し、被検液で粒子リン
グが明らかに大きく、且つリング内に凝集粒子が一様に
広がっているのが認められるウェルに於ける希釈液の最
高希釈倍数を求め感度を評価した。 同様に、上記の方
法に従って、被検液として健常者便を希釈したものを用
い、感度を評価した。表１にこれらの結果を示した。

【００２７】実施例２ 実施例１において、感作時に坑ヒトヘモグロビン坑体溶
液中に０．０７５Ｍとなるように塩化ナトリウムを加
え、更に有機無機複合粒子溶液中にも０．０７５Ｍの塩
化ナトリウムを加えた以外はすべて実施例１と同様に行
った。結果を表１に示す。

【００２８】実施例３ 実施例１において、感作時に坑ヒトヘモグロビン坑体溶
液中に０．１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加え、更
に有機無機複合粒子溶液中にも０．１Ｍの塩化ナトリウ
ムを加えた以外はすべて実施例１と同様に行った。結果
を表１に示す。 比較例１ 実施例１で、感作時に抗ヒトヘモグロビン抗体溶液中に
も有機無機複合粒子溶液中にも塩化ナトリウムを加えな
いこと以外はすべて同様に行った。結果を表１に示す。

【００２９】比較例２ 実施例１において、感作時に坑ヒトヘモグロビン坑体溶
液中に０．０２５Ｍとなるように塩化ナトリウムを加
え、更に有機無機複合粒子溶液中にも０．０２５Ｍの塩
化ナトリウムを加えた以外はすべて実施例１と同様に行
った。結果を表１に示す。

【００３０】比較例３ 実施例１において、感作時に坑ヒトヘモグロビン坑体溶
液中に０．１５Ｍとなるように塩化ナトリウムを加え、
更に有機無機複合粒子溶液中にも０．１５Ｍの塩化ナト
リウムを加えた以外はすべて実施例１と同様に行った。
結果を表１に示す。

【００３１】比較例４ 塩として、塩化ナトリウムに代えて酢酸ナトリウムを用
いた以外は実施例１と同様に行い、結果を表１に示し
た。

【００３２】

【表１】

【００３３】表１の結果から、本発明の塩濃度範囲で感
作した場合には十分な感度及び特異的凝集が起こるのに
対して、本発明の塩濃度範囲をはずれると非特異的凝集
が起こったり或いは感度が低下したりして、凝集反応試
薬として適しないことがわかる。また、無機塩叉はアミ
ノ酸塩以外の塩を用いた場合にも本発明の効果が発現し
ない事が認められる。 実施例４ 凝集反応試薬として、免疫学的梅毒診断薬を作成する為
に、まず梅毒の病原菌であるトレポネーマ・パリダム１
×１０⁹個を１ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に
分散させた。次いで、このトレポネーマ・パリダムが分
散した塩化ナトリウム水溶液を超音波破砕器により２０
０Ｗで３０分間破砕した。この破砕されたトレポネーマ
・パリダムを含んだ塩化ナトリウム水溶液に、０．１Ｍ
の塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）にブロモスチレン粒子（日本合成ゴム株式会社
製）２．５重量％を分散させた液を等量加えて１時間放
置し、次いで、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
で２回洗浄し、凍結乾燥して、トレポネーマ・パリダム
由来の抗原が感作された有機無機複合粒子からなる凝集
反応粒子を調製した。その後、６ヶ月間、４℃で放置し
た。０．０２Ｍリン酸緩衝液に、５重量％になるように
牛血アルブミンを加えて粒子溶解液を調製した。この粒
子溶解液に、前記期間保存した凝集反応粒子を凝集反応
試薬基準で０．５重量％濃度となるように溶解して凝集
反応試薬を調合した。

【００３４】次に、この免疫学的梅毒診断薬の性能を以
下に示すように測定した。

【００３５】被検液として梅毒患者血清を用い、該血清
の１０倍希釈液を原液として、倍数希釈法に従って上記
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて希釈を行い、各希
釈液をマイクロタイタープレートのウェル中に２５μｌ
ずつ加えた。次いで、前記調合した凝集反応試薬を該ウ
ェル中に２５μｌずつ加えて行き、１分間の攪拌の後、
室温で放置した。３０分後、粒子の凝集状態を観察し、
被検液で粒子リングが明らかに大きく、且つリング内に
凝集粒子が一様に広がっているのが認められるウェルに
於ける希釈液の最高希釈倍数を求め感度を評価した。同
様に、上記の方法に従って、被検液として健常者血清を
希釈したものを用い、感度を評価した。表２にこれらの
結果を示した。

【００３６】比較例５ 実施例４で、破砕されたトレポネーマ・パリダムを含ん
だ溶液に、０．１５Ｍとなるように塩化ナトリウムを加
え、更に、有機無機複合粒子溶液中にも０．１５Ｍとな
るように塩化ナトリウムを加えて感作を行ったこと以外
はすべて同様に行った。また、感度の評価のための梅毒
患者血清及び健常者血清は、実施例４で用いたものを使
用した。表２にこれらの結果を示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】表２の結果から、梅毒診断用の凝集反応試
薬においても、感作時の塩濃度が０．１Ｍを越えると感
度が大幅に低下する事がわかる。

【００３９】実施例５ 凝集反応試薬として、免疫学的成人Ｔ細胞白血病診断薬
を作成する為に、成人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗原
を０．１重量％のドデシル硫酸ナトリウムおよび０．０
７５Ｍのグルタミン酸ナトリウム（以下ＧＬＵＮａとい
う）を含む水溶液に１ｍｌ当り１００μｇ溶解した。該
溶解液に、０．０７５ＭのＧＬＵＮａを含む０．０２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にポリスチレン粒子（徳山
曹達株式会社製商品名：イムノティクルスＨＳＰ）２．
５重量％を分散させた液を等量加えて１時間放置し、次
いで０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄
して成人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗原が感作された
有機無機複合粒子からなる凝集反応粒子を調製した。
０．０２Ｍリン酸緩衝液に、１重量％になるように牛血
アルブミンを加えて粒子溶解液を調製した。この粒子溶
解液に、前記凝集反応粒子を凝集反応試薬基準で０．５
重量％濃度となるように溶解して凝集反応試薬を調合し
た。

【００４０】次に、この免疫学的成人Ｔ細胞白血病診断
薬の性能を以下に示すように測定した。

【００４１】被検液として成人Ｔ細胞白血病患者血清を
用い、該血清を原液として、倍数希釈法に従って上記リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて希釈を行い、各希釈
液をマイクロタイタープレートのウェル中に２５μｌず
つ加えた。次いで、前記調合した凝集反応試薬を該ウェ
ル中に２５μｌずつ加えて行き、１分間の攪拌の後室温
で放置した。３０分後、粒子の凝集状態を観察し、被検
液で粒子リングが明らかに大きく、且つリング内に凝集
粒子が一様に広がっているのが認められるウェルに於け
る希釈液の最高希釈倍数を求め感度を評価した。同様
に、上記の方法に従って、被検液として健常者血清を希
釈したものを用い、感度を評価した。表３にこれらの結
果を示した。

【００４２】比較例６ 実施例５において、成人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗
原溶液に、０．０１ＭとなるようにＧＬＵＮａを加え、
更にポリスチレン粒子溶液にも０．０１Ｍとなるように
ＧＬＵＮａを加えて感作を行った以外はすべて同様に行
った。また、感度の評価のための患者血清及び健常者血
清は実施例５で用いたものを使用した。結果を表３に示
した。

【００４３】

【表３】

【００４４】表３の結果から、成人Ｔ細胞白血病診断用
の凝集反応試薬においても、感作時の塩濃度が０．０５
Ｍより低い場合は非特異的凝集が起こる事がわかる。

【００４５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−75063（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−213673（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/531

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非生物学的粒子に抗原又は抗体を担持し
   た免疫学的凝集反応粒子の製造方法において、感作液中
   に塩化ナトリウム、塩化カリウムの無機塩およびアスパ
   ラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウムのアミノ
   酸塩から選ばれた少なくとも１種を０．０５〜０．１Ｍ
   の濃度で存在させて抗原または抗体を感作することを特
   徴とする免疫学的凝集反応粒子の製造方法。