JPS63231265A - 凝集反応試薬及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は凝集反応試薬及びその製造方法に関する。この
試薬は免疫及び診断分析操作に於て有用である。

〔先行技術〕

抗原−抗体反応は、全ての免疫学的試験方法の基礎であ
る。抗体として知られている成帯白質は、抗原、即ち他
の蛋白質又は炭水化物である異質の物質の存在に反応（
ｒｅｓｐｏｎｓｅ）　Ｌ／て、哺乳動物により産出され
る。この異質物質に対する正常生体反応（ｎｏｒｍａｌ
　ｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、種々の疾病、疾患
及び生理学的障害を診断するために使用される多くの技
術の開発を導いた。一般的な意味で、抗体−抗原反応の
一つの成分は、免疫反応性種として定義され、一方それ
と錯体化する対応する成分は、レセプターと考えられる
。

予想される蛋白質の存在のためのインビトロ試験に於て
、生物学的試料中の抗原又は抗体は、該生物学的試料に
免疫学的対部分を添加することによって運び出される。

もし予想される物質が存在するならば、その結果である
抗原−抗体反応は、抗原−抗体錯体の沈澱によって示さ
れる。この反応錯体は、一般的に肉眼で検出することは
困難である。この理由のために、抗体又は抗原の何れか
はしばしば不溶性粒子、例えば、ポリマーラテックス粒
子に結合し、そうして、錯体が生成したとき、それは凝
集物の存在を観察するか、又は該粒子に付随する検出し
得るトレーサーによって、結果としての凝集反応から容
易に検出できる。次いで凝集反応は、粒子の）懸濁物か
ら粒子の凝集物により特徴付けられる。公知の凝集反応
方法の更に詳細なことは、米国特許第４，４１９，４５
３号及び同第４．４５９，３６１号に開示されている。

種々の検体のために分析される生物学的試料には、免疫
反応性種と対応するレセプターとの非特異的反応（又は
相互作用）を起こす物質が含まれている。これらの非特
異的反応は、偽の陽性を示すか又は高いバンクグラウン
ドを与えることによって分析結果に望ましくない影響を
与え、そのために真の陽性結果を検出することが困難で
ある。

更に、免疫反応性種又はレセプターが結合するポリマー
粒子は、表面電荷のために互いに相互作用する。更に、
該粒子に結合した種又はレセプターも同様に互いに相互
作用し、望ましくない凝集反応と不正確な結果を引き起
こす。

〔発明が解決すべき課題〕

分析ｐＨの調節及び結合した蛋白質を変性するための物
質の添加を含む種々の方法が、非特異的反応を減少する
ために提案されている。このような一つの方法は、米国
特許第４，５９１．５７１号に記載されている。この文
献には、キャリアー粒子に吸着された抗体を有する凝集
反応試薬が記載されている。結合に先立って、該抗体は
アシル化剤によって化学的に変性されている。このよう
な処理は非特異的反応を減少すると言われる。

′免疫反応性種が、米国特許第４，５９１，５７１号の
教示を使用して、即ちビーズに結合させる前にスクシニ
ル化によって抗体を変性することによって製造されると
き、シグナルは得られながった（下記例６参照）。

〔課題を解決するための手段〕

先行技術の試薬及び方法に伴う上記問題点は、免疫反応
性種をポリマー粒子に共有結合せしめ、そして、結合し
た反応性種の遊離の第一及び第二アミノ基をアシル化剤
、アルキル化剤又はスルホニル化剤によって化学的に変
性することからなる凝集反応試薬の製造方法によって克
服される。

凝集反応試薬は、共有結合でポリマー粒子に結合した免
疫反応性種からなり、結合した反応性種がアシル化剤、
アルキル化剤又はスルホニル化剤によって化学的に変性
された遊離筒−及び第二アミノ基を有する。

〔実施態様］ 本発明は、非常に短時間、即ち１０分間未満で、複雑な
装置を使用することなく、実施することができる、免疫
反応性種（単−又は多価）のための診断検査で有用な凝
集反応試薬を提供する。これは、診療所又は家庭で検査
を行なうことを許容し、医師又は家庭のユーザーが検査
の結果を非常に速く知ることを可能にする。この検査は
、咽喉からのスワブ標本、尿標本又は他の水性液体の試
料のような生物学的試料中の種の存在を検出する。この
ような生物学的試料は、望ましくない残骸（ｄｅｂｒｉ
ｓ）又は干渉物（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔｓ）を除くた
めの前処理（例えば、濾過）をしたり又はすること無し
に検査できる。

本発明の試薬は、広範囲の種々の免疫反応性種のあらゆ
・るものを検出及び定量するために使用できる。定義の
目的で、測定すべき免疫反応性種は、本明細書中でリガ
ンドと定義する。このようなりガントは、一般に、蛋白
質、医薬、ステロイド、糖蛋白質、糖脂質、炭水化物又
は対応するレセプター、例えば抗原のための対応する抗
体と錯体化するための１個又は２個以上のサイトを有す
る関連の他の生物学的又は化学的化合物である。また、
リガンドは対応する抗原又は抗体と反応性の１個又は２
個以上の錯体化サイトを有する抗体とすることができる
。本発明の試薬によって検出できるリガンドには、スト
レプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ）　Ａ
抗原、クラミジル及び淋菌有機体からの抗原、ＨＴＬＶ
又はＨＩＶ　（ヒト免疫欠如症ビールス）又はそれらへ
向けられる抗体のようなレトロビールスからの抗原、ヒ
ト絨毛性性腺刺激ホルモン、ロイチナイズ化（ｌｅｕｔ
ｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン（ＬＨ）、ヘルペスビールス
、医薬、［ｌｉ質並びに他のホルモン性、細菌性、又は
ビールス性抗体及び抗原が含まれるが、これらに限定さ
れるものではない。ある例に於て、リガンドは生物学的
標本中に見出される有機体又はビールスから抽出しなけ
ればならない。他の例に於て、リガンドは反応性形態中
に既にあり、分析の前に抽出操作を必要としない。与え
られたリガンドのための抽出方法は、当業者に公知であ
る。ストレプトコッカスＡ抗原のための典型的抽出方法
を、下記に記載する。更に他の例で、リガンドは抽出工
程無しに有機体又はビールスの一部として検出できる。

好ましくは、該試薬は次の実施態様及び下記例１に示さ
れるように、ストレプトコッカスＡ抗原を検出するため
に使用される。ストレプトコッカスＡ抗原に関する本発
明のこの態様は、例示する目的で示されるものであるが
、本発明の範囲をそのように限定するものでないと理解
されるであろう。抗原を含有すると考えられる生物学的
試料は、あらゆる適当な手段で患者から集めることがで
きる。続いて、もし必要ならば、抗原は適当な方法で有
機体から抽出される。好ましい抽出方法には、スワブを
単独又は組合せで試料中の有機体、標本細胞及び他の組
織片からストレプトコッカスＡ抗原を放出する１種又は
２種以上の試薬を含む適当な抽出組成物中に浸漬するこ
とが含まれる。

ストレプトコッカスＡ抗原のための当該技術で公知の有
用な抽出組成物には、ヨーロッパ特許公報筒１５０，５
６７号に記載されたような、亜硝酸塩と氷酢酸の混合物
、及び米国特許第４，６１８，５７６号に記載されたよ
うな細菌ストレプトマイセスアルプス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｓ）から誘導された酵素が含まれ
る。好ましい抽出組成物は、亜硝酸塩（例えば、亜硝酸
ナトリウム又は亜硝酸カリウム）と有機酸（例えば、琥
珀酸マロン酸、またはクエン酸）との、結合物質を含む
か又は含まない混合物である。

リガンド、例えばストレプトコッカスＡ抗原の存在は、
粒子に共有結合で結合している他の免疫反応性種（リガ
ンドのためのレセプターである）を有する水不溶性キャ
リアー粒子からなる本発明の凝集反応を使用して検出さ
れる。リガンドとレセプターとの間の反応（又は免疫化
学的結合）は、次いで粒子同士が結合する結果となり、
それらは凝集し、懸濁液から沈澱する。この凝集反応は
、粒子に付随するトレーサー物質を使用して適当に検出
できる。

試薬に於て有用である適当な粒子は、水不溶性で、適当
な方法でそれに共有結合で結合した免疫反応性種を有し
得る天然又は合成の粒子で有り得る。有用なキャリアー
粒子の例には、フェリチン結晶、アガロース（ａｇａｒ
ｏｓｅ）粒子、ガラスピーズ、ラテンクス粒子のような
ポリマー粒子、及び当該技術で公知の免疫反応性種との
共有結合反応のために粒子の表面上に反応性基を有する
他のものが含まれる。次の文献には代表的な有用な粒子
が記載されている。米国特許第３，７００，６０９号、
同第３．８５３，９８７号、同第４，１０８，９７２号
、同第４，４０１１７６０号、同第４，４１９，４５３
号、同第４，４５９，３６１号、同第４．４７８，９４
６号、及び同第４．５９１．５７１号。本発明に於て有
用な粒子は、一般に非常に小さく、即ち直径が２μｍ未
満である。好ましくは、０．１〜１μｍの平均直径を有
する。

該粒子は、その外面に免疫反応性種と共有結合を形成し
得る基を有していなくてはならない。このような基には
、カルボキシル、アミン、エポキシ、アルデヒド、ハロ
アルキル、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニルス
ルホニル、ビニルスルホニルアルキレン及び当該技術で
公知の他のものが含まれるが、これらには限定されない
。これらの基は、適当な方法で、例えば、製造の間又は
免疫反応性種の結合の直前に、粒子中に導入される。ハ
ロアルキル、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニル
スルホニル、及びビニルスルホニルアルキレン基が好ま
しい。

特に有用な粒子は、ポリマーラテックス粒子であり、更
に好ましべは、コアーシェルポリマーラテックス粒子と
して当該技術分野で公知のものである。広範囲の種々の
モノマーが、粒子が水不溶性である限りこのような粒子
の製造に使用できる。

ポリマー化学に於ける当業者は、適当なラテックス粒子
を設計し製造できる。本発明の実施で使用される好まし
いコアーシェルポリマーラテックス粒子は、下記例１及
び２に記載されている。これらの粒子は、スチレン又は
トレーサー物質（後記する）に対し高い親和性を有する
他のモノマーのホモ−又はコポリマーから成るコアと、
免疫反応性種との反応に無関係な所望の反応性基を有す
るホモ−又はコポリマーから成るシェルを有する。

本発明の実施に於て有用な粒子は、好ましくは、凝集体
又は非凝集残留物質中のトレーサーの量からリガンドの
定量的測定をするために、それと−緒になる十分なトレ
ーサー分子を存している。トレーサー分子は、適当には
粒子の外表面に付いているか、又は、好ましくは、粒子
内に分布している。凝集体を検出する如何なるトレーサ
ー物質も使用できる。もし、フェリチン結晶が粒子とし
て使用されるならば、トレーサー分子はそれらの結晶中
に元々ある鉄の分子である。他の天然又は合成粒子は、
トレーサーとしてラジオアイソトープ、比色染料、蛍光
物質、バイオルミネッセンス化合物、化学ルミネッセン
ス化合物、燐光化合物及び当該技術で公知の他の検出し
得る物質を有し得る。

好ましくは、トレーサーは、ラジオアイソトープ、比色
染料又は蛍光物質（例えば、蛍光染料又は希土類キレー
ト）である。当業者は、適切なトレーサーを使用される
特定の粒子と組み合わせることができる。

一つの実施態様に於て、トレーサーは例えば、米国特許
第４．２５９，３１３号に記載されているユーロピウム
キレートのような蛍光希土類キレートである。他の好ま
しい実施態様に於て、トレーサーは凝集体中で容易に検
出される比色化合物である。

有用な染料は当該技術で公知である。或染料は、粒子を
製造する時粒子中に導入される。また、染料は、浸出さ
れないような方法で前成形された粒子中に吸収される。

トレーサーは、適当な方決で粒子中に分布される。例え
ば、トレーサーは例えば、米国特許第３．８５３，９８
７号に示されているようにして、均一に分布できる。好
ましくは、トレーサー分子は粒子の限定され−た領域、
例えば表面付近又は内部に優位に位置される。好ましい
コアーシェル粒子に於て、トレーサーはコア又はシェル
いずれかにあるが、最も好ましくは、実質的にその全部
が粒子のコアにある。

免疫反応性種（即ち、リガンドと反応性のレセプター分
子）は、公知の方法及び必要ならば試薬を使用する適当
な手段で、粒子の外側表面に共有結合によって結合して
いる。結合した種が抗体であるとき、モノクローナル又
はポリクローナルの何れも使用できる。抗体は、商業的
に入手できるか又は公知技術を使用して製造できる。抗
体全体又はその一部の何れもが使用できる。

結合した免疫反応性種は、もしリガントが抗体であるな
らば、抗原である。一つのこのような試薬は、ヒトレト
ロビールス抗原に対する検出抗体、例えばＨＴＬＶ−，
１又はＨＴＶ−１抗原に対する抗体のために有用な凝集
反応試薬である。

結合の後、免疫反応性種は、第一及び第二アミン基を変
性し得る適当な変性剤で化学的に変性される。このよう
な変性剤の例には、アシル化剤、アルキル化剤、及びス
ルホニル化剤が含まれ、それらのあるものは、例えば、
　Ｅｎｚｙｍｅ−１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ。

Ｍａｇｇｉｏ　（Ｅｄ、）＋ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｉｎ
ｃ、、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ。

Ｆｌｏｒｉｄａ、　１９８０．　ｐｐ、７２−７７に記
載されている。

代表的有用なアシル化剤は、米国特許第４，５９１．５
７１号に記載されている。好ましいアシル化剤は、ジカ
ルボキシル酸及びポリカルボキシル酸（３個又は４個以
上の酸基）カフら誘導される無水物、アシルハライド、
及びエステルから成る群から選択される。無水琥珀酸の
ような無水物が最も好ましい。

ブロモ酢酸、クロロ酢酸、フルオロニトロベンゼン、ブ
ロモマロン酸、ブロモプロピオン酸、ｍ−（クロロスル
ホニル）安息香酸及びｐ−（クロロスルホニル）安息香
酸のような代表的アルキル化剤及びスルホニル化剤もま
た有用であり、ブロモ酢酸が最も好ましい。

本発明の方法の化学的変性工程は、−ｉ的に、免疫反応
性種を粒子上に最初共有結合で固定化することによって
行なわれる。カゼインもまた同時にその上に固定化され
る。次いで、固定化された種は、適当なアシル化剤、ア
ルキル化剤又はスルホニル化剤によって、使用する変性
剤に適切な条件下に変性される。このような条件は、当
業者に公知である。代表的な方法を、下記例１．４及び
５に記載する。

変性方法に於て、変性される固定化された免疫反応性種
の遊離筒−及び第二アミノ基の数は、媒体のｐＨ１試薬
の濃度及び免疫反応性種に依存する。しかし、充分な変
性は、本明細書に与えられた教示を使用して当業者によ
って達成できる。一般に、使用される変性剤の量は、存
在する種の量の少なくとも１０重量％である。

一度凝集体が分析で生成すると、凝集した物質を当該技
術で公知の適当な方法で非凝集物質から分離する。一般
に、分離は濾過技術によって達成される。分離に続いて
、凝集物質又は非凝集物質の何れかを、公知の方法を使
用して測定する。

本発明はそのように限定されるものではないが、リガン
ドの分析は、微孔性膜からなる適当な試験装置を使用し
て行なうことができる。このような装置は、リガンドを
含有する標本が凝集反応試薬の表面上で種と反応のため
に添加される１個又は２個以上の窪みを有する。試薬は
分析の間に装置に添加できるか、又は製造時にその中に
含有させることができる。一度凝集体が生成されると、
非凝集残留物質は、洗浄溶液によって膜を通して膜の下
の分離した容器中に洗出される。

本例は、本発明の凝集反応試薬の製造及びストレプトコ
ッカスＡ抗原を決定するためのその使用を示す。

コア中にレッド染料（Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　ＥＧＮ）を含有
するコアーシェルポリマーラテックス粒子を、コア／シ
ェル重合法を使用して製造した粒子中に染料を固定化す
ることによって製造した。染料をベルギー特許第８４．
３，６４７号に記載された方法を使用して含有させた。

粒子のコアは、ポリ　（スチレン−共＝２−アセトアセ
トキシエチルメタクリレート）（７０４３０重量比）か
ら成り、一方シエルはポリ（ｍ、ｐ−クロロメチルスチ
レン）から成った。

該粒子の平均直径は、約０．４５μｍであった。ストレ
プトコンカスＡ抗原に対するモノクロナール抗体とカゼ
インを次のようにしてこれらの粒子上に共有結合で固定
化した。即ち、５０ミリモル濃度のホウ酸塩緩衝液（ｐ
ｔｌ　８．５）０．６ｍｆに、抗５ｔｒｅｐ　Ａ（ａｎ
ｔｉ−５ｔｒｅｐ　Ａ　）抗体（ＰＢＳとして公知の燐
酸塩緩衝塩溶液中の２．９ｍｇ／ｄ溶液）とカゼイン（
１０ｍｇ／ｄ水）との１０＝１混合物からなる全蛋白質
０．１　ｍｇを添加した。混合の後、ポリマーラテック
ス粒子の５％懸濁液４１．５μｌを添加しく０．３％固
体にする）、得られた溶液を３７°Ｃで２４時間垂直方
向に（ｅｎｄ−ｏνｅｒ−ｅｎｄ）回転し、抗体及びカ
ゼインの粒子への共有結合を起こさせ、凝集反応試薬を
形成した。

無水琥珀酸の溶液（１０ｍｇ／成ジメチルスルホキシド
）を上記凝集反応試薬の、翫濁液に、無水物１部：全蛋
白質１部の重量比で添加した。得られた懸濁液を２５゛
Ｃで４時間混合し、次いで７０００ｒｐｍで５分間遠心
分離し、得られたペレットを０．１モル濃度グリシン緩
衝液（ｐＨ８，５）中に０．３％固体の濃度に再！３濁
した。この方法で、粒子に結合した蛋白質の第一及び第
二アミノ基を化学的に変性した。

ストレプトコッカスＡ抗原を、地方の病院から得られた
分離物から２５°Ｃで１分間亜硝酸ナトリウム（８モル
濃度）及びクエン酸（０，２モル濃度）の等容量の溶液
を使用して抽出した。次いで該溶液を、等容量の、エチ
レンジアミンテトラ酢酸（７５ミリモル）を含有する３
−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（２
モル濃度、ｐＨ７，５）で中和した。

ナイロン６６微孔性膜（５μｍ平均孔サイズ）をディス
ポーザブルな試験装置の試験窪み内に導入した。

塩化ナトリウム（８０μ２．１モル濃度）、上記凝集反
応試薬懸濁液（４０μｆ２）及び約４．２　ＸＩＯ３コ
ロニー形成単位を含有する抽出抗原（８０μｆ！、）の
混合物を、膜を含有する試験装置の試験窪みに添加し、
その中で２分間２５°Ｃでインキュベートした。次いで
液体を膜の下の室に流し、股上の凝集体をイオン強度０
．２５を有する洗液を１５０μ２で洗浄した。

洗浄工程の後、膜上の凝集体内の染料の量を、反射率測
定装置を使用して５４０ｎｍで測定した。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ変換器（Ｊ、　０ｐ
ｔｉｃａｌ　Ｓｏｃ、　Ａｍ、＋４３、　ｐ、５９５．
１９５３）を、変換濃度値（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ
ｄｅｎｓｔｉｙ　ｖａｌｕｅ）を計算するために使用し
た。膜上の凝集体は、容易に観察することができ、バッ
クグラウンド対照よりも著しく大きい濃度値（その差は
０．１４８であった）を有していた。これらのデータは
、本発明の凝集試薬が生物学的試料からストレプトコッ
カスＡ抗原を測定するために有用であることを示してい
る。

±１工琳育叫楡査 本例は、淋病の検査のための本発明の凝集試薬の使用を
示す。本例で使用した凝集試薬は、ベルギー特許第８４
３，６４７号に記載された方法に従った、ユウロピウム
（■）（テノイルトリフルオロアセトン）、とトリオク
チルホスフィンオキサイドとをキレート１部対オキサイ
ド２部の比で５重量％固定化したポリ（スチレン−共−
ｍ、ｐ−クロロメチルスチレン−共−２−ヒドロキシエ
チルアクリレート）　　（７６：２３：１重量比）から
成るラテックス粒子から成った。この粒子は、約０．４
５μｍの平均直径を有していた。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａ（またＰＩＢ
抗原として当該技術で公知である）の血清群Ｂ　（ｓｅ
ｒｏｇｒｏｕｐ　Ｂ）のＰＩ抗原に対するモノクロナー
ル抗体を、下記のようにして上記の粒子上に共有結合的
に固定化した。即ち、５０ミリモル濃度のホウ酸塩緩衝
液（ｐＨ８，５）１．３　ｍｌに、燐酸塩緩衝塩（ＰＢ
Ｓ）のＬＯ８＠ｇ／ｍｆｆ１抗体溶液０．１５ｄを添加
した。添加の際に、カゼインの１■／戚水溶液０．３２
ｄを、カゼインを同様に粒子上に固定化するために添加
した。

混合の後、上記のポリマーラテックス粒子の５％懸濁液
４１．５μｌを添加し、得られた溶液を３７°Ｃで２４
時間混合した。無水琥珀酸の溶液（１０ｍｇ／ｆｉジメ
チルスルホキシド溶液０．１７４　ｍ）を添加し、得ら
れた溶液を、結合した蛋白質のアミン基を変性するため
に２２°Ｃで４時間混合した。次いで、この溶液を１０
分間遠心分離し、得られたペレットを０．１モル濃度グ
リシン（ｐＨ８，５）に再懸濁させ、凝集試薬の０．３
％固体を含有する混合物を得た。

ＰＩＢ抗原を、１％エタノールアミン及び１０ミリモル
濃度エチレンジアミンテトラ酢酸の混合物を使用してＮ
ｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａの標本から抽出
し、次いで超音波処理及び濾過した。

５μｍの平均孔サイズを有するナイロン６６微孔性膜を
、２％カゼイン溶液中に浸漬することによって前処理し
た。塩化ナトリウム（５０μ！、６モル濃度）、特定量
の抗原（ナノグラム）を有する抗原溶液（５０μｌ）及
び上記°凝集反応指示薬溶液（５０ｕｌ）の混合物を試
験管に添加し、２２℃で３０分間インキエベートし、次
いで処理された微孔性膜を通して濾過した。膜上の得ら
れた凝集体を１モル濃度トリシン緩衝液（ｐＨ８，６）
　０．１５μ！で洗浄した。凝集体の量は標準表面蛍光
測定装置（励起３４２ｎｍ、放射６１０ｎｍ）を使用し
て凝集体中の蛍光の量を測定することによって決定した
。異なる抗原（即ち、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ
ｒｈｅａの血清群ＡのＰＩ抗原、またＰＩＡ抗原として
公知である）の抽出物の特定量を含有する対照溶液を、
ＰＩＢ抗原に対する抗体の非特異的反応を測定するため
と同じ方法で処理した。下記第１表は、これらの試験の
結果を示す。本発明の分析が、特定の淋病の血清群の所
望の抗原を測定するために使用できることが明らかであ
る。

本例は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＣ，）の測
定のための本発明の実施を示す。

コア／シェルポリマー粒子を、公知の方法に従ってＯｉ
ｌ　Ｒｅｄ　ＥＧＮ染料で固定化した。粒子のコアは、
ポリ（スチレン−共−２−アセトアセトキシエチルメタ
クリレート）（８５：１５重量比）から成り、粒子のシ
ェルはポリ（ｍ、ｐ−クロロメチルスチレン−共−メタ
クリル酸）　　（９９，８：０．２重量比）から成った
。該粒子の平均直径は、約０．３２μｍであった。

ｈＣＧの二つの異なったエビトビツクサイト（ｅｐｉｔ
ｏｐｉｃ　５ｉｔｅ）に対するモノクロナール抗体とカ
ゼインを、次のようにしてこれらの粒子上に共有結合的
に固定化した。即ち、５０ミリモル濃度のホウ酸塩緩衝
液（ｐＨ８，５）　０．６ｍｌに、ｈｃｃ抗体（２，９
ｍｇ／ｍＡ燐酸塩緩衝塩溶液）とカゼイン（１０ｍｇ／
　ｍｌ水）との１０：１部合物０．１■を添加した。混
合の後、上記ポリマーラテックス粒子の５％懸濁液４１
．５μ２を添加し、得られた溶液を３７°Ｃで２４時間
垂直方向に回転し、抗体及びカゼインの粒子への共有結
合を起こさせ、凝集反応試薬を、形成した。

無水琥珀酸の溶液（１０ｍｇ／ｍｊ！ジメチルスルホキ
シド）を、上記凝集反応試薬の懸濁液に、無水物１部：
全蛋白質１部の重量比で添加し、得られた懸濁液を２５
°Ｃで４時間混合し、結合した蛋白質のアミン基を化学
的に変性するために７０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
た。得られたベレット０．１モル濃度グリシン（ｐＨ８
，５）中に０．３％固体の濃度に再懸濁した。

種々の量のｈｃｃ（ミリ１．　Ｕ、　／ｒｒｄｌ）を、
０．５％ウシ血清アルブミンを含有する燐酸塩緩衝塩溶
液（０，１モル濃度の燐酸ナトリウム及び０，１５５モ
ル濃の塩化ナトリウム）に添加した。約５μｍ平均孔サ
イズを有するナイロン６６微孔性膜を、上記例１に記載
したのと同様なディスポーザブルな試験装置の試験窪み
内に導入した。この膜は、スクシニル化カゼインの１％
水溶液２滴で洗浄した。

ミリ１．Ｕ、Ｔ：（ＤｈＣＧ濃度は、５０００ミリ１．
　Ｕ、が精製ｈｃｃｉμｇに相当するとして定義する。

４モル濃度の塩化ナトリウム６０μ！、１モル濃度のト
リシン緩衝液（ｐＨ８，６）、上記凝集反応試薬の懸濁
液６０μ２及び上記のｈＣＧ溶液２４０μｌの混合物を
試験管に添加し、ゆっくり混合し、２５°Ｃで１０分間
インキュベートした。各溶液（３００μりの一部を膜を
含有する試験窪みに添加し、膜を通過して流した。しか
しながら、膜上に形成した凝集体は、流出しなかった。

凝集体を１モル濃度の塩化ナトリウム溶液３００μｌで
洗浄し、凝集体中の染料の量を、実施例１に記載したよ
うにして５４０ｎｍで測定した。これらの測定の結果を
上記第■表に変換濃度（Ｄ？　）として示す。これは、
本発明の分析がｈＣＧを測定するために使用できること
を示している。

第−Ｕ ｈｃｃ″′　　ミリ１．　ｔｌ、　　　成　　−ｆｆニ
ー０　　　　　０．０４３ ５００　　　　　０．０４７ １０００　　　　　０．１３３ １４：アルキル化剤Ｕを　　する欄−応与；・の！ｌｊ
告この例は、本発明の試薬を製造するために、３個の異
なるアルキル化剤：クロロ酢酸、ブロモ酢酸及びブロモ
プロピオン酸を使用する固定化抗体の変性を示す。

例１に記載した方法を使用して、ポリ（スチレン−共−
アセトアセトキシエチルメタクリレート）（７０：３０
モル比）のコアとポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン
）のシェルから成るコアーシェルポリマーラテックスビ
ーズを製造し、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　ＥＧＮ染料の２．５％
アセトニトリル溶液で固定化した。

染料したビーズを、０．１％アジドナトリウムを含有す
る０、０５５モル濃のホウ酸ナトリウム緩衝液（ρ）ｌ
　８．５　）に懸濁させ、０．３％固体の懸濁液を得た
。

５ｔｒｅｐ　Ａ抗原に対するモノクロナール抗体及びカ
ゼインを、例１に記載したようにしてビーズ上に固定化
した。

固定化抗体混合物（０，０１２ｍｊりを、適切なアルキ
ル化剤（１０ｍｇ／ｍ１ジメチルスルホキシド溶液０　
、　Ｏｌ　２　ｍｌ　）　と混合し、３７°Ｃで１８時
間加熱し、次いで７０００ｒｐｍで５分間遠心分離した
。得られたベレットを０．１モル濃度グリシン緩衝液（
＋）！１８．５　）中に懸濁させ、０．３％固体懸濁液
として凝集反応試薬を得た。

例１に記載したようにして、ポリ（スチレン−共−アセ
トアセトキシエチルメタクリレート）（８５：１５モル
比）のコアとポリ［スチレン−共−ｍ＆ｐ−（２−クロ
ロエチルスルホニルメチル）スチレン］　　（９５，５
：４．５モル比）のシェルから成るコアーシェルポリマ
ーラテックスビーズを製造し、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　ＥＧＮ
染料の３．５％アセトニトリル溶液で固定化した。ビー
ズを、０．１％アジドナトリウムを含有する０、０５５
モル濃のホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５）に懸濁
させ、０．３％固体の懸濁液を得た。

５ｔｒｅｐ　Ａ　［０，１％アジドナトリウムを含有す
る０、０５５モル濃のホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，５）中
の３．８ｍｇ／ｍｆ溶液の０．０２６ｍｆコに対するモ
ノクロナール抗体及びカゼイン（水中の１　ｍｇ　／　
ｍｌ溶液のｏ、ｏｉ　ｍｉ＞　を約０．９ｒｄのホウ酸
塩緩衝液中で一緒に混合した。

ビーズ（１，７３％緩衝懸濁液０．１７３ｍｊりを添加
し、混合物を約２５°Ｃで２４時間ずっと（ｅｎｄ−ｏ
ｖｅｒ−ｅｎｄ　）混合した。無水琥珀酸（１０■／Ｉ
ｄジメチルスルホキシド溶液０．０１　ｍｌ）を添加し
、混合物を３時間揺り動かした。混合物を遠心分離し、
浮遊物を傾瀉し、ペレットを０．１％アジドナトリウム
を含有する　０．１規定グリシン（ｐＨ，８，５）中に
懸濁させ０．３％固体懸濁液を得た。

１６：ストレプトコ・・カスＡのノ 本例は、本発明の方法により製造した凝集反応試薬を米
国特許第４，５９１．５７１号に教示された方法によっ
て製造した凝集反応試薬と比較したＳ　ｔｒｅｐ　Ａの
分析を示す。

本発明の凝集反応試薬は、次のようにして製造し、５ｔ
ｒｅｐ　Ａ分析において試験した。

例１に記載したようにして、ポリ（スチレン−２共−ア
セトアセトキシエチルメタクリレート）（９５：５モル
比）のコアとポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−共
−メタクリル酸）（９８：２モル比）のシェルから成る
コアーシェルポリマーラテックスビーズを製造し、Ｏｉ
ｌ　Ｒｅｄ　ＥＧＮ染料の２％アセトニトリル溶液で固
定化した。

染色したビーズを０．１％アジドナトリウムを含有する
０、０５５モル濃のホウ酸すトリウム緩衝液（ｐＨ８，
５）に懸濁させ、０．３％固体の懸濁液を得た。

例１に記載したようにして、５ｔｒｅｐ　Ａ抗原に対す
るモノクロナール抗体およびカゼインをこれらのビーズ
上に共有結合で固定化し、無水琥珀酸による処理によっ
て変性した。

５ｔｒｅｐ　Ａ抗原を、地方の病院から得られた分離物
から２５”Ｃで１分間１．２モル濃度クエン酸（１０μ
ｌ）及び８モル濃度亜硝酸ナトリウム（１２０μりから
成る溶液を使用して抽出し、次いで１モル濃度トリシン
、ｐＨ８，５（１２０μりで中和した。

スクシニル化カゼインを１．０７ｇ／％含有するナイロ
ン６６微孔性膜（５Ｂ　ｍ　Ｂｉｏｄｙｎｅ＠Ａ）をデ
ィスポーザブルな試験装置内に導入した。

ビーズ組成物（２滴、約９０μりをディスポーザブルな
試験装置に添加し、抽出された抗原１滴　　−（約４０
μりを添加した。２分後、溶液を膜を通して流出させ、
次いで１モル濃度の塩化ナトリウム（２滴、９０μりの
洗浄溶液を添加した。次いで膜上の染料を反射率によっ
て読み取り、値を変換濃度（Ｄ７）に転換した。第１図
に示したデータのプロットは、本発明を使用する改良を
示している。

対照凝集反応試薬を、固定化に先立って抗体アシル化す
るために米国特許第４．５９Ｌ３７１号の教示を使用し
て製造した。変性した抗体を粒子に共有結合できる試み
を、上記と同様の条件を使用して成した。得られた試薬
を５ｔｒｅｐ　Ａ分析で試験した。

更に特に、対照試薬のために、５ｔｒｅｐ　Ａ抗原に対
するモノクロナール抗体を、次のように無水琥珀酸で処
理することによって先ず変性した。抗体（０，３３■）
を０．１％アジドナトリウムを含有する０．０５５モル
濃のホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，５（０，９ｍｆ
ｆ１）中に溶解し、無水琥珀酸の溶液（１０ｍｇ／　ｍ
ｎジメチルスルホキシド溶液０．３３　ｍｌ１）を添加
した。次いで混合物を室温で３時間撹拌し、次いで０．
０５５モル濃のホウ酸塩緩衝液に対して４°Ｃで約１６
時間透析した。

スクシニル化抗体（０，３３ｍｇ／戒ホウ酸塩緩衝溶液
０．５ｍｆｆ１）及びカゼインの溶液（１ｍｇ／ｍｊ２
溶液０．００８７ｍｆ！、）を、０．１％アジドナトリ
ウムを含有する０、５モル濃度のホウ酸塩緩衝液、ｐｉ
＋　８．５　（０，７ｍり中に混合した。次いで染色し
たコアーシェルビーズ懸濁）夜（０，１７４ｍｉ　）を
、抗体／カゼイン１昆合物に添加し、変性した抗体に共
有結合的に付ける試みで３７°Ｃで２４時間垂直方向に
回転した。混合物を遠心分離し、浮遊している液体を傾
瀉した。

ペレツトを０．１％アジドナトリウムを含有する０、１
モル濃度グリシン（ｐｌ＋　８．５　）中に懸？蜀させ
０．３％固体懸濁液を得た。

対照５ｔｒｅｐ　Ａ分析を上記のように行った。データ
のプロットを図に示す。プロットしたデータから、非常
に少撥の凝集体が対照試薬で観察された　−ことが明ら
かである。明らかに、結合の前の抗体の変性は著しい量
の抗体の共有結合を起こさせない。

〔発明の効果］ 本発明は、減少した非特異的相互作用を示す凝集反応試
薬を提供し、該試薬は対象の検体に対し高感度である。

これらの有利性は、対象の検体にとってレセプターであ
る免疫反応性種をポリマー粒子に最初共有結合で結合さ
せ、次いで第一及び第二アミン基を化学的に変性するた
めのアシル化剤、アルキル化剤又はスルホニル化剤によ
る化学的変性によって達成される。これは米国特許第４
．５９１５７１号の教示とは直接的に相反する。この特
許の教示を使用して製造した試薬は診断分析に於て効果
がなく、他方本発明の試薬はこのような分析に於て非常
に有用であることが、上記例６で示される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の試薬について、米国特許第４．５９１
，５７１号によって製造した対照試薬と比較して、吸光
度対ストレプトコッカスＡ抗原濃度のグラフプロットを
示す。この比較は、上記例６に詳細に記載されている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫反応性種をポリマー粒子に共有結合で結合せし
   め、そして、結合した反応性種の遊離の第一及び第二ア
   ミノ基をアシル化剤、アルキル化剤又はスルホニル化剤
   によって化学的に変性することからなる凝集反応試薬の
   製造方法。 ２、アシル化剤、アルキル化剤又はスルホニル化剤によ
   って化学的に変性された遊離第一及び第二アミノ基を有
   する免疫反応性種を共有結合でポリマー粒子に結合せし
   めて成る凝集反応試薬。