JP3403520B2 - 抗りん脂質抗体測定用試薬の製造方法 - Google Patents

抗りん脂質抗体測定用試薬の製造方法

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JP3403520B2 JP24152794A JP24152794A JP3403520B2 JP 3403520 B2 JP3403520 B2 JP 3403520B2 JP 24152794 A JP24152794 A JP 24152794A JP 24152794 A JP24152794 A JP 24152794A JP 3403520 B2 JP3403520 B2 JP 3403520B2
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【発明の詳細な説明】 【0001】 【産業上の利用分野】本発明は、簡便かつ高感度な抗り
ん脂質抗体測定用試薬の製造方法に関する。 【0002】 【従来の技術】病気の診断等のために、血清、血しょ
う、脳脊髄液等を検体として、この検体中に含まれてい
るカルジオライピン、フォスファチジルコリン、コレス
テロール等のりん脂質に対応する抗りん脂質抗体を測定
する方法が知られている。 【0003】このような抗りん脂質抗体を測定する方法
としては、例えば、炭素粒子りん脂質抗原懸濁液を使用
したRPR(Rapid Plasma Reagi
n)カード試験法(以下「RPR法」という)、VDR
L(Venereal Disease Resear
ch Lab)法、RST(Reagin Scree
ning Test)法等の迅速性、操作性に優れたも
のが知られていた。しかし、これらの方法は、目視判定
法であるので、実施者、測定日等により結果が異なる等
の精度上の問題を有するものであった。 【0004】近年、りん脂質をラテックス粒子等の不溶
性担体に固定化し、このものを緩衝液等に懸濁分散させ
て試薬とする方法が提案されている。このような試薬に
おいて、りん脂質のラテックス粒子等の不溶性担体への
固定化方法としては、従来、例えば、クリニカル・アン
ド・エクスペリメンタル・イミュノロジー(Clin.
Exp.Immunol.)、68巻、215〜222
頁、(1987年)及び特表平4−503865号公報
には、マイクロタイタープレートのウェル又は磁性体粒
子にりん脂質の有機溶媒溶液を加え、溶媒を蒸発させて
プラスチックプレートの表面又は磁性体粒子表面に物理
吸着させる方法が開示されている。 【0005】しかし、この方法を用いた場合、洗浄時に
プレート壁や磁性体粒子に吸着したりん脂質が剥がれ落
ちやすいので、得られた試薬は測定値がばらつき検出感
度が低くなる問題があり、また、りん脂質の種類により
分子の大きさや極性が異なるので、複数のりん脂質を抗
原として使用した場合、温度やpH等の微細な条件の変
動でラテックス等の表面への吸着状況が変化し、安定し
た試薬の製造が困難であった。更に、この方法において
は、ラテックス粒子等の水性溶媒に懸濁されている不溶
性担体を使用した場合、物理吸着後に有機溶媒を蒸発さ
せると、粒子自体が変性して自己凝集を引き起こすの
で、得られたラテックス粒子等は診断用試薬として不適
当なものであった。 【0006】特表昭63−501928号公報及び特表
平4−503865号公報には、スペーサーを介した化
学結合方法が開示されており、特開昭58−61466
号公報にはメチル化タンパクを介した化学結合方法が開
示されている。しかし、これらの方法は、ラテックス粒
子を変性させることなくりん脂質を固定化することがで
きるが、化学修飾されたりん脂質を使用するので、りん
脂質の抗原としての反応性が低下する欠点を有してお
り、また、化学結合の反応条件の設定が複雑である等の
製造上の困難性が存在するものであった。 【0007】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、高感度に測定できる抗りん脂質抗体測定用試薬を簡
易にかつ大量に製造する方法を提供することを目的とす
る。 【0008】 【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、カルジ
オライピン、フォスファチジルコリン及びコレステロー
ルのそれぞれを抗原として溶解させたそれぞれの抗原液
を、ラテックス粒子を懸濁した液に順次添加することに
より、上記抗原を上記ラテックス粒子に固定化させるこ
とよりなる抗りん脂質抗体測定用試薬の製造方法におい
て、上記抗原液のうちカルジオライピンの抗原液又はフ
ォスファチジルコリンの抗原液を最初に添加するところ
にある。 【0009】本発明の抗りん脂質抗体測定用試薬の測定
対象となるりん脂質は、カルジオライピン、フォスファ
チジルコリン及びコレステロールである。カルジオライ
ピンは、ウシの心筋から抽出精製されるジホスファチジ
ルグリセロールであり、広く生体内に分布している。ま
た、カルジオライピンは、梅毒血清反応の抗原物質であ
って、ワッセルマン抗原の本態として知られており、血
液の凝固を促進する作用がある。 【0010】フォスファチジルコリンは、動植物、微生
物等生体に広く分布し、特に脳、肝臓、卵黄、大豆等に
多く含まれているりん脂質である。ヒトの血清中には6
1%(全りん脂質中)、卵黄では約70%(全りん脂質
中)含まれ、動脈硬化症の治療、予防にも使われる。 【0011】コレステロールは、ほとんどの動植物に含
まれるりん脂質で、工業的には畜牛の脳や脊髄また魚
油、羊毛脂の不けん化物を再結晶するか更に二臭化物を
得て精製することにより得られる。 【0012】本発明においては、3種の上記りん脂質を
それぞれ有機溶媒に溶解させてそれぞれの抗原液とす
る。上記有機溶媒としては、りん脂質を可溶化しかつ担
体を溶解又は変性させないものであれば特に限定され
ず、例えば、メタノール、エタノール、エーテル等が挙
げられる。 【0013】本発明で使用されるラテックス粒子は、液
中に懸濁し、ここに上記抗原液を順次添加する。本発明
においては、カルジオライピン、フォスファチジルコリ
ン及びコレステロールの3種類のりん脂質抗原液を、上
記ラテックス粒子溶液に添加する順番は、カルジオライ
ピン抗原液又はフォスファチジルコリン抗原液を最初に
する。コレステロール抗原液を最初に添加すると、ラテ
ックス粒子に結合したコレステロールが、次に結合して
くるカルジオライピン、フォスファチジルコリンの結合
を阻害することにより高感度の測定が不可能となるの
で、コレステロール抗原液は最初に添加しない。コレス
テロール抗原液を最初に添加しない限り、カルジオライ
ピン抗原液及びフォスファチジルコリン抗原液のうちの
1種を、又は、その両方を同時に最初に添加してもよ
い。 【0014】上記ラテックス粒子としては特に限定され
ず、例えば、ポリスチレンラテックス、合成によって得
られるラテックス粒子、ゼラチン粒子、動物の赤血球、
カオリン、炭素末等が挙げられるが、ポリスチレンの共
重合体が特に好適に用いられる。本発明で使用されるラ
テックスの粒子の粒径は、0.05μm〜10μmが好
ましい。0.05μm未満であったり、10μmを超え
ると、均一な凝集が起こりにくくなる。より好ましくは
0.1μm〜1μmである。 【0015】上記で得た溶液は、常法に従って、適宜ブ
ロッキング用緩衝液等を添加して、緩衝液交換をした
後、牛血清アルブミン等を添加して抗原固定化ラテック
ス粒子を得、ラテックス保存用緩衝液に分散させて本発
明の抗りん脂質抗体測定用試薬を得ることができる。 【0016】上記抗りん脂質抗体測定用試薬は、通常の
緩衝液及び懸濁液状態で長期間安定に保存でき、凍結乾
燥状態でも保存可能である。緩衝液の成分としてはりん
酸等の既知のものが使用でき、緩衝液のpH及びイオン
強度は通常の生理学的な条件で使用できる。また、非特
異反応を抑制するとされていたり、抗原抗体反応を促進
するとされている既知の物質についても併用できる。凍
結乾燥状態で保存する場合には、凍結乾燥時の安定剤と
して使用されている一般的な薬剤との併用も可能であ
る。 【0017】本発明の抗りん脂質抗体測定用試薬による
測定時に凝集度を検出する手段としては、目視で判定す
る方法、反応液の吸光度の変化を機械により測定する方
法等いずれも使用することができる。 【0018】 【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 【0019】実施例1 ポリスチレンラテックス液(固形分10%(W/V)、
平均粒径0.400μm、積水化学工業社製)0.1m
lをポリカーボネートチューブ中で攪拌させながら、カ
ルジオライピンのエタノール溶液(シグマ社製、試薬特
級、5mg/ml)0.033mlを添加し、10分後
フォスファチジルコリン(ナカライテスク社製、試薬特
級)をエタノール(ナカライテスク社製、試薬特級、9
9%)に溶解して10mg/mlとしたもの0.167
mlとコレステロール(ナカライテスク社製、試薬特
級)をエタノール(ナカライテスク社製、試薬特級、9
9%)に溶解して10mg/mlとしたもの0.050
mlとの混合液0.217mlを添加した。 【0020】引き続き室温で1時間攪拌した後、100
mMのりん酸一水素ナトリウム(Na2 HPO4 (12
水和物))及び100mMのりん酸二水素ナトリウム
(NaH2 PO4 (2水和物))を混合してpHを7.
40に調整したりん酸緩衝液(以下「100mMりん酸
緩衝液」という)に、牛血清アルブミン(Bovine
Serum Albumin、フラクション V、マイ
ルズ社製、試薬特級、以下「BSA」という)を1%
(W/V)、アジ化ナトリウム(ナカライテスク社製、
試薬特級)を0.1%(W/V)になるように調整した
ブロッキング用緩衝液2.0mlを一気に添加し、1.
5時間、室温で攪拌した。次に、高速冷却遠心機(日立
HR26型)を用いて、19000×g、10℃で30
分間遠心洗浄を行った。 【0021】100mMりん酸緩衝液にBSAを1%
(W/V)、アジ化ナトリウム0.1%(W/V)、E
DTA(ナカライテスク社製、試薬特級)を10mM及
び塩化コリン(ナカライテスク社製、試薬特級)を50
0mMになるように調整したものをラテックス保存用緩
衝液とし、この液5.0mlを、上記で得られたラテッ
クスの沈渣に添加し、タッチミキサーにてよく攪拌した
後、高速冷却遠心機を用いて、19000×g、10℃
で30分間遠心洗浄を行った。この洗浄操作を3回繰り
返した。 【0022】最終的に得られた沈渣に上記ラテックス保
存用緩衝液2.0mlを添加し、タッチミキサーにてよ
く攪拌し、超音波破砕機(マイクロチップ、出力目盛
3、50%サイクル、アストラソン社製)にて氷浴中、
1分間ソニケートして分散させた。さらに上記ラテック
ス保存用緩衝液6.0mlを添加し、タッチミキサーで
充分混合させた後、固形分0.125%(W/V)のラ
テックス懸濁液として4℃にて保存した。この操作を5
回繰り返してそれぞれロット1〜5の計5ロットの試薬
を調製した。 【0023】梅毒陽性検体としては、正常家兎に梅毒菌
を接種し、梅毒にしたものより採取された血清で、RP
R法(化学及び血清療法研究所社製)及びセロディアT
PHAキット(富士レビオ社製)の両方により陽性と判
断された梅毒家兎血清のうちRPR法で8倍を示したも
のを、生理食塩水(0.9%NaCl水溶液)にて、2
倍、4倍に希釈し、4倍、2倍を示すものとしたものを
用いた。梅毒陰性検体としては、正常家兎より採取され
た血清で、RPR法(化学及び血清療法研究所社製)及
びセロディアTPHAキット(富士レビオ社製)の両方
により陰性と判定されたものを用いた。 【0024】検体中の抗りん脂質抗体を測定する方法
は、全自動生化学分析装置(日立7150形、日立製作
所社製)により、各ロットの試薬を用いて下記の条件で
行った。結果は表1に示した。 測定モード;Original Abs パラメータ;検体量20μl、抗りん脂質抗体測定用試
薬量50μl、検体希釈用緩衝液量350μl 測定波長;570nm 測定時間;検体分注後、ただちに検体希釈用緩衝液量が
添加、混合され、その後ラテックス試薬が添加、混合さ
れて、試薬の添加後80秒後〜320秒後の吸光度の変
化量を求め、これを反応量とした。 検体;調製した梅毒陽性血清の希釈系列及び生理食塩
水、梅毒陰性血清をそれぞれn=5で測定した。 なお、検体希釈用緩衝液は100mMりん酸緩衝液にグ
ルコシルエチルメタクリレートのホモポリマー(平均分
子量27万、日本精化社製)を1%(W/V)、BSA
を0.25%(W/V)及びアジ化ナトリウムを0.1
%(W/V)になるように添加したものを用いた。 CV値;変動係数を表す。 【0025】実施例2 添加する抗原液の順番を、カルジオライピン、その10
分後にフォスファチジルコリン、さらに10分後にコレ
ステロールにした以外は実施例1と同様の操作を行っ
た。結果を表1に示した。 【0026】実施例3 添加する抗原液の順番を、フォスファチジルコリン、そ
の10分後にカルジオライピンとコレステロールとの混
合液にした以外は実施例1と同様の操作を行った。結果
を表1に示した。 【0027】実施例4 添加する抗原液の順番を、フォスファチジルコリン、そ
の10分後にカルジオライピン、さらに10分後にコレ
ステロールにした以外は実施例1と同様の操作を行っ
た。結果を表1に示した。 【0028】比較例1 添加する抗原液の順番を、コレステロール、その10分
後にカルジオライピン、さらに10分後にフォスファチ
ジルコリンにした以外は実施例1と同様の操作を行っ
た。結果を表2に示した。 【0029】比較例2 添加する抗原液の順番を、コレステロール、その10分
後にフォスファチジルコリン、さらに10分後にカルジ
オライピンにした以外は実施例1と同様の操作を行っ
た。結果を表2に示した。 【0030】比較例3 添加する抗原液の順番を、コレステロール、その10分
後にフォスファチジルコリンとカルジオライピンとの混
合液にした以外は実施例1と同様の操作を行った。結果
を表2に示した。 【0031】実施例5 平均粒径0.191μmのポリスチレンラテックス(積
水化学工業社製、固形分10%(W/V))を使用し、
添加する抗原液量を各々実施例1の4倍容量にした以外
は実施例1と同様の操作を行った。結果を表3に示し
た。 【0032】実施例6 平均粒径0.191μmのポリスチレンラテックス(積
水化学工業社製、固形分10%(W/V))を使用し、
添加する抗原液量を各々実施例1の4倍容量にした以外
は実施例2と同様の操作を行った。結果を表3に示し
た。 【0033】実施例7 平均粒径0.191μmのポリスチレンラテックス(積
水化学工業社製、固形分10%(W/V))を使用し、
添加する抗原液量を各々実施例1の4倍容量にした以外
は実施例3と同様の操作を行った。結果を表3に示し
た。 【0034】実施例8 平均粒径0.191μmのポリスチレンラテックス(積
水化学工業社製、固形分10%(W/V))を使用し、
添加する抗原液量を各々実施例1の4倍容量にした以外
は実施例4と同様の操作を行った。結果を表3に示し
た。 【0035】比較例4 平均粒径0.191μmのポリスチレンラテックス(積
水化学工業社製、固形分10%(W/V))を使用し、
添加する抗原液量を各々実施例1の4倍容量にした以外
は比較例1と同様の操作を行った。結果を表4に示し
た。 【0036】比較例5 平均粒径0.191μmのポリスチレンラテックス(積
水化学工業社製、固形分10%(W/V))を使用し、
添加する抗原液量を各々実施例1の4倍容量にした以外
は比較例2と同様の操作を行った。結果を表4に示し
た。 【0037】比較例6 平均粒径0.191μmのポリスチレンラテックス(積
水化学工業社製、固形分10%(W/V))を使用し、
添加する抗原液量を各々実施例1の4倍容量にした以外
は比較例3と同様の操作を行った。結果を表4に示し
た。 【0038】 【表1】【0039】 【表2】 【0040】 【表3】【0041】 【表4】 【0042】 【発明の効果】本発明は、りん脂質をラテックス粒子に
固定化する時に抗原液のうちカルジオライピンの抗原液
又はフォスファチジルコリンの抗原液を最初に添加する
ので、抗原成分を安定性よく抗体に固定化することがで
き、感度が高い抗りん脂質抗体測定用試薬を効率よく、
大量に提供することができる。

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項1】 カルジオライピン、フォスファチジルコ
    リン及びコレステロールのそれぞれを抗原として溶解さ
    せたそれぞれの抗原液を、ラテックス粒子を懸濁した液
    に順次添加することにより、前記抗原を前記ラテックス
    粒子に固定化させることよりなる抗りん脂質抗体測定用
    試薬の製造方法において、前記抗原液のうちカルジオラ
    イピンの抗原液又はフォスファチジルコリンの抗原液を
    最初に添加することを特徴とする抗りん脂質抗体測定用
    試薬の製造方法。
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