JP4376747B2 - 脂質抗原感作ラテックス試薬の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)前記脂質抗原を有機溶媒に溶解して脂質抗原溶液を調製する工程、
(2)前記工程(1)で調製した脂質抗原溶液とラテックス粒子懸濁液とを混合する工程、
(3)前記工程(2)で得られた混合液中の有機溶媒を留去する工程、及び
(4)前記工程(3)の後に、アルブミン溶液を加えて懸濁し、撹拌する工程、
を含むことを特徴とする、前記製造方法により解決することができる。
本発明の製造方法の好ましい態様によれば、
(5)前記工程(4)の後、ラテックス粒子を分離し、緩衝液に懸濁する工程
を更に含む。
また、本発明の製造方法の別の好ましい態様によれば、前記脂質抗原として、更にレシチン又はコレステロールを使用する。
また、本発明は、前記製造方法で製造された、脂質抗原感作ラテックス試薬に関する。
レシチンは、動植物、微生物等生体に広く分布し、特に脳、肝臓、卵黄、大豆等に多く含まれているリン脂質で、動脈硬化症の治療及び/又は予防にも使われる。
更に、コレステロールは多くの動植物に含まれており、牛の脳や魚油、羊毛脂の不ケン化物から得られる。
(1)脂質抗原溶液調製工程:
本工程では、脂質抗原を有機溶媒に溶解して脂質抗原溶液を調製する。
本発明の製造方法では、前記脂質抗原として、少なくともカルジオリピンを使用する。また、所望により、前記カルジオリピンと共に、例えば、レシチン及び/又はコレステロールを使用することができる。
例えば、有機溶媒としてエタノールを用いる場合、カルジオリピン濃度は、通常、0.05〜2.0mg/mL、好ましくは0.2〜0.8mg/mLであり、レシチン濃度は、通常、0.0〜2.0mg/mL、好ましくは0.5〜1.5mg/mLであり、コレステロール濃度は、通常、0.0〜1.0mg/mL、好ましくは0.1〜0.5mg/mLである。
本工程は、室温(例えば、20〜40℃)で行うことができる。
本工程では、前記脂質抗原溶液調製工程で調製した脂質抗原溶液とラテックス粒子懸濁液とを混合し、所望により撹拌することにより、ラテックス粒子への脂質抗原の感作を実施することができる。
本工程は、室温(例えば、20〜40℃)により、所定時間(例えば、数秒〜10時間、好ましくは2秒〜2時間)行うことができる。
脂質抗原溶液とラテックス粒子懸濁液との混合量又は混合比は、感作反応が充分に達成される濃度である限り、特に限定されるものではない。例えば、感作反応系におけるラテックス粒子濃度及び脂質抗原濃度は、通常の公知ラテックス製造方法で用いる濃度範囲で実施することもできるが、本発明の製造方法によれば、ラテックス粒子への脂質抗原の固定化量が向上するため、通常の濃度範囲よりも低濃度で実施することも可能である。感作反応系における脂質抗原濃度は、その総量として、例えば、0.1〜2mg/mLであることが好ましく、0.25〜1mg/mLであることがより好ましく、0.5mg/mLであることが特に好ましい。
本発明で使用されるラテックスの粒子の粒径は、通常の公知ラテックス製造方法で用いられる粒子径であれば特に限定されるものではない。例えば、後述の実施例1に記載の調製及び評価方法と同じ条件下において実施した粒径範囲、具体的には、0.31〜0.6nmの範囲において、全て、良好なラテックス試薬を調製可能であることを確認している。
本工程では、前記感作工程で得られた混合液中の有機溶媒を留去することにより、脂質抗原感作ラテックス粒子残さを得ることができる。
本発明の製造方法において、有機溶媒を留去する方法としては、周知の手段、例えば、常圧下加熱又は減圧下蒸発を用いることができる。常圧下で加熱する場合、例えば、混合液の入った容器を有機溶媒が蒸発する程度の温度に加温(例えば、40〜60℃の水浴中に放置)することにより、有機溶媒を留去することができる。減圧下蒸発の場合、例えば、混合液をフラスコに移してエバポレーターを用いて減圧下におくことにより、あるいは、シャーレに移した混合液を、デシケーターに入れ、減圧下におくことにより、有機溶媒を留去することができる。
本発明の製造方法では、本工程に続いて、以下の工程を実施することが好ましい。
本工程では、前記有機溶媒留去工程の後に、アルブミン溶液を加えて懸濁し、撹拌する。
本発明の製造方法で用いるアルブミン溶液におけるアルブミンとしては、天然アルブミン若しくはリコンビナントアルブミン、又はそれらの変性アルブミンを挙げることができる。天然アルブミンとしては、例えば、ヒト血清アルブミン又はウシ血清アルブミンを用いることができ、ウシ血清アルブミンが好ましい。変性アルブミンとしては、アルブミンを熱又はアルカリで変性させたものを用いることができる。
アルブミン溶液中のアルブミン濃度は、0.05〜2.0%であることが好ましく、0.1〜0.5%であることがより好ましい。
これらの操作も室温(例えば、20〜40℃)で行うことができる。
本工程では、前記アルブミン溶液処理工程の後、ラテックス粒子を分離し、緩衝液に懸濁することにより、脂質抗原感作ラテックス試薬を調製することができる。
ラテックス粒子の分離は、例えば、フィルトレーション、デカンテーション、又は遠心分離等の公知の手法を用いることにより実施することができる。分離したラテックス粒子は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、又はトリス緩衝液等で数回洗浄し、その緩衝液に再懸濁(粒子が分散しやすいように、撹拌又は超音波処理を行うことが好ましい)することにより、脂質抗原感作ラテックス試薬を調製することができる。
ラテックス試薬中のラテックス粒子濃度は、通常のラテックス試薬と同様の濃度に設定することができ、例えば、0.01〜2.0%であることが好ましく、0.1〜1.0%であることがより好ましい。
これらの操作も室温(例えば、20〜40℃)で行うことができる。
(1)脂質抗原感作ラテックスの調製
本実施例では、脂質抗原として、カルジオリピン、レシチン、及びコレステロールの各種混合物を使用し、以下の手順に従って脂質抗原感作ラテックスを調製した。
2mL容のプラスチックチューブに、表1に示す濃度となるように調製した各種脂質抗原のエタノール溶液1.2mLと、平均粒径0.45μmのポリスチレンラテックス懸濁液[10%懸濁液,G24103(日本合成)]0.12mLとを添加し、撹拌した。その混液1.1mLをナス形フラスコに分取し、エバポレーターで減圧し、エタノールを留去した。ここに0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液2mLを加え、懸濁しながら超音波処理(15秒間)した後、室温で30分間撹拌した。再び超音波処理した後、遠心分離(1600rpm,10℃,30分間)により上清を除去した。残さに10mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0)1mLを加えて洗浄し、遠心分離(1600rpm,10℃,30分間)により上清を除去した。この洗浄操作を再度繰り返した後、10mmol/Lリン酸緩衝液(pH8.0)4mLを加え、脂質抗原ラテックス試薬(0.25%懸濁液)を調製した。
カルジオリピン レシチン コレステロール
試験1 0.2-0.4mg/mL 1mg/mL 未添加
試験2 0.2mg/mL 0-1.5mg/mL 未添加
試験3 0.1-0.3mg/mL 1mg/mL 200μg
前記実施例1(1)で調製した脂質抗原感作ラテックス試薬を用いて、ラテックス近赤外線免疫比濁法による凝集反応の測定を実施した。前記反応は、全自動免疫血清検査システム(LPIA−200;三菱化学)により反応速度の平均値を以下の方法によって測定した。
キュベットに、
サンプルとして標準血清の希釈列30μL、
0.1%アジ化ナトリウム(NaN3)を含有する10mmol/L−Tris緩衝液(pH8.0)50μL、
0.1%NaN3及び0.5%BSAを含有する10mmol/L−Tris緩衝液(pH8.0)180μL、並びに
脂質抗原感作ラテックス試薬40μL
を、この順序で添加した。そして、この混合溶液を1回/12秒で10分間測定し、50プロット記録した。
なお、標準血清として、試験1及び試験2では、市販のRPR(Rapid Plasma Reagin)陽性ヒト血清[RPR標準血清;極東製薬工業(発売)、積水化学工業(製造)]を使用し、試験3ではウサギ血清を使用した。
図1において、曲線a、b、c、及びdは、それぞれ、カルジオリピン濃度が0.40mg/mL、0.30mg/mL、0.25mg/mL、及び0.20mg/mLの場合の結果である。RPR標準血清における単位「R.U.」は、抗脂質抗体価の単位「RPR UNITS」の略称である。
図2において、曲線a、b、c、及びdは、それぞれ、レシチン濃度が1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、及び0mg/mLの場合の結果である。
図3において、曲線a、b、c、及びdは、それぞれ、カルジオリピン濃度が0.30mg/mL、0.20mg/mL、0.15mg/mL、及び0.10mg/mLの場合の結果である。
図1〜図3に示すように、充分な反応速度が観察され、ラテックス粒子への脂質抗原の感作が充分に達成されていることが確認された。
また、データは具体的に示さないが、同様の調製及び評価方法により、カリジオリピン濃度として0.1〜0.4mg/mL、レシチン濃度として0〜1.5mg/mL、コレステロール濃度として0〜0.5mg/mLの濃度範囲において、全て、良好なラテックス試薬を調製可能であったことが確認された。
本実施例では、カットオフ値近辺の測定感度が、公知ラテックス試薬と比較して良好であることを示すために、実施例1(1)においてカルジオリピン濃度が0.2mg/mL、レシチン濃度が1.0mg/mLである脂質抗原エタノール溶液を用いて調製した脂質抗原感作ラテックス試薬と、比較用の市販の梅毒検査用ラテックス試薬[メディエースRPR;極東製薬]とを用いて、実施例1(2)に記載の測定を実施した。
なお、梅毒検査用ラテックス試薬は、抗原としてカルジオリピン及びレシチンが感作されている。
本実施例では、実施例2で用いた脂質抗原感作ラテックス試薬を用いて、健常者及び抗脂質抗体患者由来の血清の測定を実施した。測定は、実施例1(2)に記載の方法により実施した。結果を表2に示す。なお、表2に記載の従来法としては、炭末凝集法(ヤトロン)を使用した。表2に示すとおり、陽性検体と陰性検体について、良好な結果が得られた。
検体 従来法による判定 脂質抗原感作ラテックス試薬
による測定値(R.U.)
1 陽性 5.8
2 陽性 4.0
3 陽性 6.1
4 陰性 0.1
5 陰性 0.7
Claims (4)
- 脂質抗原として少なくともカルジオリピンを固定化した脂質抗原感作ラテックス試薬の製造方法であって、
(1)前記脂質抗原を有機溶媒に溶解して脂質抗原溶液を調製する工程、
(2)前記工程(1)で調製した脂質抗原溶液とラテックス粒子懸濁液とを混合する工程、
(3)前記工程(2)で得られた混合液中の有機溶媒を留去する工程、及び
(4)前記工程(3)の後に、アルブミン溶液を加えて懸濁し、撹拌する工程、
を含むことを特徴とする、前記製造方法。 - (5)前記工程(4)の後、ラテックス粒子を分離し、緩衝液に懸濁する工程
を更に含む、請求項1に記載の製造方法。 - 前記脂質抗原として、更にレシチン又はコレステロールを使用する、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法で製造された、脂質抗原感作ラテックス試薬。
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