JPH0560759A - スクシンイミド含有ポリマー由来の生物学的活性試薬の製造方法及びそれを含んでなる分析要素並びにその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高活性スクシンイミド基を担持するコポリマ
ー粒子を含んでなる生物学的活性試薬の製造方法を提供
する。 【構成】 生物学的活性物質、例えば抗体を、粒子表面
上の高活性スクシンイミド基の置換によりアミド基を介
して直接もしくは間接的に、粒子に対して共有結合させ
ることにより上記試薬を製造する。これらの試薬は、分
析要素、特異的バインディングリガンド（例えば、免疫
学的種）の検出方法、イムノアッセイ並びに精製方法
（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）に有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポリマー粒子を用いる
生物学的活性試薬の製造方法に関する。また、本発明
は、このような生物学的活性試薬を含有する分析要素に
関し、そしてそれらを使用するイムノアッセイ及び特異
的バインディング分析方法に関する。さらに、本発明
は、上記試薬を用いる分析的精製方法に関する。この発
明は、各種の臨床、診断、医学及び研究の目的に使用さ
れうる。

【０００２】

【従来の技術】医療及び研究上、並びに分析及び診断方
法において、生物学的流体のような各種の流体中に存在
する化学的及び生物学的物質の迅速かつ正確な検出につ
いてのニーズが、絶えず存在する。特異的バインディン
グ反応は、反応体の少なくとも１種が固体支持体上に固
定化されているような反応体類を使用することによる方
法の１つとして提供される。一般的にはこの方法は、水
溶性未反応材料を水不溶性反応生成物から分離する。更
に、このような固定化された反応体は、望ましい生物学
的活性材料をこのような材料の混合物より取り出すため
に、アフィニティークロマトグラフィーで使用されう
る。

【０００３】ある場合では、特異的バインディング反応
に使用される特定の支持体が、それらの外表面上に活性
基を提供するように作成される。これは、生物学的物質
を粒子の外表面と反応させるためである。上記特定の支
持体がポリマーである場合には、それは適当な活性基を
担持するモノマーより製造されうることが多い。米国特
許第５，０３０，６９７号明細書は、水溶性コポリマー
を担持するポリマー結合性色素、それに共有結合される
色素及びポリマー色素が生物学的材料と共有結合するの
を可能にする官能基に関する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】望ましくない非特異的
タンパク質吸着が、分析及び診断方法での固体支持体と
してポリマー材料を用いる場合に、絶えず問題を起こし
てきた。非特異的タンパク質吸着は望ましくないバック
グラウンドを発生し、かつ真の結果を不明瞭にするた
め、望ましくない。

【０００５】また、ポリマー表面の親水性が考慮すべき
研究課題である。親水性の増強が、他のものではないが
若干のタンパク質の吸着を低減する。材料が、水不溶
性、未架橋、非孔質であり、化学的及び生物学的材料に
対して結合可能であるような、固体支持体が製造されう
る材料について産業上ニーズが存在する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記課題は、下記を反応
させる工程を含んでなる生物学的活性試薬の製造方法を
用いて解決される。 （Ｉ)(ａ）１種以上のエチレン系不飽和重合性親油性モ
ノマー８０〜９９．９モルパーセント、 (ｂ）スクシンイミドオキシカルボニル基を担持する１
種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー０．１〜２０
モルパーセント、及び (ｃ）１種以上の別の親水性エチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜１０モルパーセント、より誘導される繰り返
し単位を有する未架橋コポリマーの水不溶性非孔質粒
子、並びに （II）上記スクシンイミドオキシカルボニル基のスクシ
ンイミドオキシ部分の置換によりアミド基を介して粒子
に共有結合された生物学的活性物質。

【０００７】また、本発明は、１つ以上の反応区画を内
部に担持する流体浸透性支持体を含んでなり、少なくと
も１つの上記区画に上述のような生物学的活性試薬を含
有する分析要素を提供する。

【０００８】更に、本発明は、以下の順序で流体と接触
するように表面上に下記のものを担持する非孔質支持体
を含んでなる分析要素を提供する。アッセイの際に酵素
と反応して検出可能なシグナルを提供するための試薬を
１種以上含有する試薬層、非孔質支持体上のいずれかの
層に存在させた酵素に対する標識リガンド類似体、並び
に下記を含んでなる生物学的活性試薬を含有する孔質展
開層 （Ｉ）上述のような粒子、及び （II）スクシンイミドオキシカルボニル基のスクシンイ
ミドオキシ部分の置換によりアミド基を介して粒子に共
有結合されたリガンド用レセプター。

【０００９】更に、本発明は、下記工程を含んでなる特
異的バインディングリガンドの検出方法を提供する。 Ａ．上記試薬と、水不溶性特異的バインディングリガン
ドを含有すると推測される被検体を接触させ、レセプタ
ーとリガンドの水不溶性特異的バインディング複合体を
形成させる工程、並びに Ｂ．被検体中のリガンドの存在もしくは不在の指標とし
て複合体の存在を検出する工程。

【００１０】その上更に、本発明は、下記工程を含んで
なる特異的バインディングリガンドの検出方法を提供す
る。 Ａ．下記を含んでなる上述のような試薬と、水溶性特異
的バインディングリガンドを含有すると推測される被検
体を接触させる工程、 （Ｉ）上述のような粒子、及び （II）スクシンイミドオキシカルボニル基のスクシンイ
ミドオキシ部分の置換によりアミド基を介して粒子に共
有結合されたリガンド分子、 Ｂ．工程Ａにおける接触の前に、もしくはそれと同時に
又はそれに続いて、被検体をリガンド用レセプターと接
触させて、水溶性リガンドとレセプターとで水溶性特異
的バインディング複合体を形成させ、そして水不溶性リ
ガンドとレセプターとで水不溶性特異的バインディング
複合体を形成させる工程、 Ｃ．水不溶性複合体を水溶性材料より分離する工程、並
びに Ｄ．被検体中のリガンドの存在もしくは不在の指標とし
て水不溶性複合体の存在を検出する工程。

【００１１】また、本発明は、下記工程を含んでなる免
疫学的種の検出方法を提供する。 Ａ．下記を含んでなる試薬と、免疫学的種を含有すると
推測される被検体を接触させ、 （Ｉ）上述のような粒子、及び （II）スクシンイミドオキシカルボニル基のスクシンイ
ミドオキシ部分の置換によりアミド基を介して粒子に共
有結合された上記種のレセプター、レセプターと上記種
の水不溶性免疫学的複合体を形成させる工程、 Ｂ．水溶性材料を複合体より除去する工程、並びに Ｃ．被検体中の免疫学的種の存在もしくは不在の指標と
して複合体の存在を検出する工程。

【００１２】さらに本発明は、下記工程を含んでなる分
析的精製方法を提供する。 Ａ．下記を含んでなるアフィニティークロマトグラフィ
ー試薬に、生物学的活性物質の混合物を含有する被検体
を通過させる工程、 （Ｉ）上述のような粒子、及び （II）スクシンイミドオキシカルボニル基のスクシンイ
ミドオキシ部分の置換によりアミド基を介して上記粒子
に共有結合された特異的バインディング物質であって、
上記特異的バインディング物質が、上記生物学的活性物
質の被検体混合物中１つ以上の予め決めた生物学的活性
物質に対して特異的である特異的バインディング物質、
並びに Ｂ．試薬上の１つ以上の予め決めた生物学的活性物質を
採集する工程。

【００１３】

【具体的な態様】本発明方法に有用なコポリマー類は、
Ｓｕｔｔｏｎ他の同時係属中の特許出願（特願平４−９
３６０号）明細書に詳細に記載されている。上記出願で
より詳細に記載されるように、コポリマーは下記から誘
導される必須の繰り返し単位を有する。 （ａ）上記コポリマーに疎水性を提供する１種以上のエ
チレン系不飽和重合性親油性モノマーであって、上記モ
ノマーがいずれも架橋性モノマー、すなわち３次元架橋
ポリマー網状構造を形成するために重合可能な２つ以上
の更なる重合性ビニル基を担持するモノマーではないこ
とを条件とするモノマー８０〜９９．９、より好ましく
は９０．０〜９９．９及び最も好ましくは９５〜９９．
９モルパーセント、 （ｂ）スクシンイミドオキシカルボニル基を担持する１
種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー０．１〜２
０、より好ましくは０．１〜１０、最も好ましくは０．
１〜５モルパーセント、並びに （ｃ）イオン性もしくは極性親水性モノマーのような、
１種以上の別の未架橋エチレン系不飽和重合性モノマー
０〜１０、好ましくは０〜５、より好ましくは０〜３モ
ルパーセント。好ましくは、コポリマーが、次式により
示される上記モノマー（ｂ）を含んでなる。

【００１４】

【化１】

【００１５】上式中、Ｒは、水素、炭素原子数１〜３個
のアルキル、もしくはハロであり、Ｌは、連結鎖中に少
なくとも２個の炭素原子を有する連結基であって、必然
的に炭素原子数１〜８個のアルキレン基、炭素原子数６
〜１２個のアリーレン基、ヘテロ原子もしくはヘテロ原
子含有基の少なくとも２つの組み合わせからなり、ｍ
は、０もしくは１であり、ｎは、１もしくは２であり、
そしてｐは、０もしくは１であって、ｎが２である場合
には、アルキレン基及びアリーレン基の１つが、必然的
に三価であることを条件とする。

【００１６】より詳細には、上式中、Ｒが水素、炭素原
子数１〜３個のアルキル（例えば、メチル、エチル、イ
ソプロピル及びｎ−プロピル）、もしくはハロ（例え
ば、クロロもしくはブロモ）である。好ましくは、Ｒが
水素、メチルもしくはクロロである。より好ましくは、
Ｒが水素もしくはメチルである。

【００１７】また、Ｌは、連結鎖中に少なくとも２個の
炭素原子を有する有機連結基であり、そして（１）炭素
原子数１〜８個のアルキレン基（例えば、メチレン、エ
チレン、トリメチレン、プロピレン、ペンタメチレンも
しくは２，２−ジメチル−１，３−プロピレン)(２）炭
素原子数６〜１２個のアリーレン基（例えば、フェニレ
ン、トリレン、キシリレンもしくはナフタレン）並びに
（３）二価のヘテロ原子〔例えば、酸素原子（オキシ）
及び硫黄原子（チオ）〕もしくはヘテロ原子含有基〔例
えば、カルボニル、スルホニル、イミノ（−ＮＲ¹ 、式
中Ｒは、水素もしくは炭素原子数１〜６個の低級アルキ
ル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペン
チル及びヘキシル))〕、の少なくとも２つの組み合わせ
である。

【００１８】アルキレン基は、炭素原子を１〜８個有し
てもよく、そして分枝、直鎖もしくは環状であってもよ
く、１つ以上のアルキル基（好ましくは炭素原子数１〜
８個、例えばメチル、エチル、イソプロピル、ヘキシル
及びオクチル）、アルコキシ（好ましくは炭素原子数１
〜１２個、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔ
−ブトキシ及びオクチルオキシ）、シクロアルキル（好
ましくは炭素原子数４〜６個、例えばシクロブチル、シ
クロヘキシル及びシクロペンチル）、アリール（好まし
くは炭素原子数６〜１２個、例えばフェニル、トリル、
キシリル、ナフチル、４−メトキシフェニル及びクロロ
フェニル）で置換されていても置換されていなくてもよ
い。このような基を形成または合成することは、合成化
学分野の技術者には難しいことではない。アリーレン基
は、６〜１２個の核炭素原子を有してもよく、そして上
記アルキレン基について先に記載される置換基を有して
もよい。

【００１９】また、ｍは０もしくは１であり、ｎは１も
しくは２であり、そしてｐは０もしくは１であって、ｎ
が２である場合には、上記アルキレン及びアリーレンの
１つが必然的に三価である。最も好ましくは、ｐ及びｍ
が両方共０である。

【００２０】好ましくは、モノマー（ｂ）がスチレンも
しくはスチレン誘導体、又はアクリル酸もしくはメタク
リル酸のエステルである。より好ましくは、Ｎ−アクリ
ロイルオキシスクシンイミド、４−（２−スクシンイミ
ドオキシカルボニルエチルチオメチル）スチレン、４−
〔１，２−ビス（スクシンイミドオキシカルボニル）エ
チルチオメチル〕スチレン、もしくは４−（２−スクシ
ンイミドオキシカルボニルフェニルチオメチル）スチレ
ンが挙げられる。

【００２１】上記モノマー（ｂ）は重合されてホモポリ
マーを形成するとはいえ、好ましくは、それらは１種以
上の更なるエチレン系不飽和重合性モノマーとコポリマ
ーを製造するのに用いられる。例えば、モノマー（ａ）
として先に特定される親油性モノマー類は、得られるコ
ポリマーに疎水性もしくは水不溶性の性質を提供するの
に有用である。所望であれば、このようなモノマーの混
合物が用いられうる。限定されるものではないが、
（ａ）が誘導されうるモノマーとしては、ビニル芳香族
類（例えば、スチレン及びスチレン誘導体類、例えば、
４−ビニルトルエン、α−メチルスチレン、２，５−ジ
メチルスチレン、４−ｔ−ブチルスチレン及び２−クロ
ロスチレン）、アクリル酸及びメタクリル酸のエステル
類並びにアミド類（例えば、メチルアクリレート、メチ
ルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、２−エチ
ルヘキシルメタクリレート、ベンジルアクリレート及び
Ｎ−フェニルアクリルアミド）、ブタジエン、アクリロ
ニトリル、ビニルアセテート、ビニルベンジルアセテー
ト、臭化ビニル及び塩化ビニリデンが挙げられる。好ま
しいモノマー（ａ）は、ビニル芳香族であり、スチレン
が最も好ましい。

【００２２】さらに、モノマー（ａ）もしくは（ｂ）に
ついて先に記載されたもの以外のエチレン系不飽和重合
性モノマー（ｃ）は、所望の性質を与えるために共重合
されうる。例えば、このようなモノマーとしては、２−
アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、３−
メタクリロイルオキシプロパン−１−スルホン酸及びｐ
−スチレンスルホン酸並びにそれらの塩を包含するスル
ホン酸基もしくはそれらの塩を含むアニオン性モノマー
が挙げられる。また、グループ（ｃ）に包含されるモノ
マーとしては、非イオン性親水性モノマー、例えば、ア
クリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルア
クリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２
−ヒドロキシエチルメタクリレート、ペンタエチレング
リコールモノメタクリレート及びＮ−ビニル−２−ピロ
リドン並びに当業者に容易に見い出せるものが挙げられ
る。さらに、２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
トのような活性メチレン基を担持するモノマーが用いら
れうる。

【００２３】本発明のコポリマー類は、例えば、Ｓｏｒ
ｅｎｓｏｎ他のＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ｎｄ
Ｅｄ．（１９６８）、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，及びＳｔｅｖｅｎｓのＰｏｌｙｍｅ
ｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｏｎｄｏｎ，１９７５に記載される
ような標準の乳化重合法もしくは懸濁重合法を用いて製
造されうる。

【００２４】本明細書に記載されるコポリマー類は、本
発明の試薬を製造するのに、比較的粒状で用いられる。
平均粒度は、試薬の用途によって多様に変化できる。一
般的には、平均粒度が０．０１〜２０mmであり、好まし
くは０．０１〜１０mmであり、そしてより好ましくは
０．０５〜５mmである。

【００２５】本発明方法により製造される試薬類は、粒
子の外表面上の活性スクシンイミドエステル基の置換に
よりアミド基を介してポリマー粒子に共有結合された１
つ以上の生物学的活性物質を有する。本発明で用いられ
る「生物学的活性物質」の語は、生体に見い出される
か、又は細胞もしくは生体の診断、処理もしくは遺伝子
工学に有用であり、そして別の生物学的材料もしくは化
学的材料との相互作用の可能性を有するいずれかの有機
化合物を含有することを意味する。このような物質は、
生物学的流体中の天然物であっても、天然物でなくても
よい。このような材料は、活性スクシンイミドオキシ基
の置換により粒子に結合可能でなければならない。従っ
て、一般的には、生物学的活性物質が反応可能なアミノ
基もしくはスルフヒドリル基を有することを、これは意
味する。

【００２６】限定されるものではないが、試薬の用途に
関与する生物学的活性物質としては、アミノ酸類、ペプ
チド類、ポリペプチド類、タンパク質類（抗体類、Ｃ−
活性タンパク質及びアビジン並びにそれらの誘導体を包
含する）、リポタンパク質類、糖タンパク質類、ホルモ
ン類、薬剤類（例えば、ジゴキシン、フェニトイン、フ
ェノバルビタール、チロキシン、トリヨードチロニン、
ゲンタマイシン、カルバマゼピン及びテオフィリン）、
ステロイド類、ビタミン類、多糖類、糖脂質類、アルカ
ロイド類、微生物類、ウイルス類、原生生物類、菌類、
寄生体類、リケッチア、カビ、血液成分、組織成分、臓
器成分、医薬品類、ハプテン類、レクチン類、トキシン
類、核酸類（一本鎖及び二本鎖のオリゴヌクレオチドを
包含する）抗原材料（タンパク質及び炭水化物を包含す
る）、アビジンもしくはそれらの誘導体、ビオチンもし
くはそれらの誘導体並びに先に列挙されるいずれかの材
料の成分が挙げられる。

【００２７】本発明方法により製造される特に有用な試
薬類は、生物学的活性物質が目的のリガンドに対して特
異的なレセプター分子であるものである。従って、試薬
を含む特異的バインディング反応体が、各種の方法で使
用されうる（以下に、より詳細に記載されている）。限
定されるものではないが、リガンド−レセプター複合体
（すなわち、リガンド及びレセプターの反応生成物）の
具体例としては、抗体−抗原、抗体−ハプテン、アビジ
ン−ビオチン、糖−レクチン、ゼラチン−フィブロネク
チン及びプロテインＡ−ＩｇＧの複合体類が挙げられ
る。本発明の目的としては、また、相補的核酸（すなわ
ち、相補鎖のハイブリッド生成物）が、特異的バインデ
ィング材料として考慮される。このような相補的核酸
（少なくとも２個の塩基を有するオリゴヌクレオチドを
包含する）は、すべての塩基対で相補的である必要はな
く、また核酸配列中すべての位置で適合する塩基を存在
させなくてもよい。すなわち、鎖の１本がもう１本より
も長くてもよく、あるいは１本鎖が、異なる配列である
がそれに対して大部分が相補的なオリゴヌクレオチドを
有してもよい。

【００２８】最も有用な生物学的活性物質は、下記を含
む免疫活性種として当該技術分野で既知であるものであ
る。（１）免疫適格ホストに対して存在させる場合、そ
の物質とバインディング可能な特異的抗体の生成に起因
するであろういずれかの物質、又は（２）免疫学的反応
に関与する化合物より生成される抗体。従って、免疫学
的種は、抗原材料もしくは抗体（抗抗体及び自己抗体を
包含する）でありうる。モノクローナル及びポリクロー
ナルの両抗体が有用であり、そして粒子上の活性スクシ
ンイミドオキシカルボニル基との反応に関する活性部位
を少なくとも１つそれらが有する限り、完全な分子であ
ってもそれらの各種のフラグメントであってもよい。

【００２９】特に有用な生物学的活性物質としては、ス
トレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ａ、
ＨＩＶ−Ｉ、歯周疾患に関与する微生物、カルバマゼピ
ン、チロキシン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、フェノバ
ルビタール、フェニトイン、ジゴキシンもしくはＣ−活
性タンパク質に向けられた抗体類が挙げられる。

【００３０】特定の態様では、免疫学的種が結合用の活
性基を有する酵素である。限定されるものではないが、
代表的な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、アルパルテートアミノトランスアミナーゼ、ア
ラニンアミノトランスアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ、クレアチンホスホキナーゼ、γグルタミルトランス
フェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファ
ターゼ及び前立腺酸性ホスファターゼが挙げられる。

【００３１】別の態様、例えば、薬剤もしくは妊娠の検
出をするための競合バインディングアッセイでは、生物
学的活性物質がヒト絨毛性ゴナドトロピン、フェノバル
ビタール、フェニトインもしくはジゴキシンに向けられ
た抗体である。

【００３２】所望であれば、生物学的活性物質は、結合
用の連結部分を提供することも含めて、結合用の活性基
を提供するために変性又は化学的に変化されうる。本発
明の試薬を製造するための、ポリマー粒子に対して生物
学的活性物質を結合させる方法は、一般的には下記のと
おりである。

【００３３】生物学的活性物質対ポリマーの重量比０．
１：１０００から１：１、好ましくは１：１０００から
１００：１０００並びにpH７〜１０、好ましくはpH８．
５〜９．５で、ポリマー粒子の水性懸濁液を生物学的活
性材料の緩衝液もしくは懸濁液で直接処理し、上記生物
学的活性物質をポリマー粒子に対して共有結合させた。
その混合物を、反応が完了するまで充分な時間、すなわ
ち、一般的には２〜２８時間が適当であるが、数時間程
混合した。必要であれば、その反応をウシ血清アルブミ
ンで停止させ、次いで粒子を単離し（好ましくは遠心に
より単離し）、そして緩衝溶液に再懸濁した。上記単離
工程及び再懸濁工程を１回以上繰り返し、そして最終分
散液を０．１〜４０、好ましくは１〜１０重量パーセン
ト固体に調製して保存した（好ましくは０．０２％マー
シオレートで保存）。この方法は、特に時間、温度、緩
衝液、安定剤もしくは別の試薬、並びに同様の結果を伴
う単離処理もしくは停止処理に変更してもよい。

【００３４】試薬を調製する際の反応混合物の粒子の％
固体は、一般的には０．０１〜４０％であり、好ましく
は１〜１０％である。一般的には生物学的活性物質の量
は、物質対コポリマーの重量比０．１：１０００〜１：
１好ましくは１：１０００〜１００：１０００に設定さ
れる。しかしながら、すべての物質が粒子に対して共有
結合する訳ではないことは、理解されるであろう。事
実、少量は吸着されるであろうが、若干は全く結合しな
いかもしれない。

【００３５】生物学的活性物質と粒子の混合は、温度５
〜５０℃、好ましくは１８℃〜４０℃で２〜２８時間、
好ましくは４〜２４時間実施した。時間の長さは、温
度、生物学的活性物質及び所望の吸着量により変化する
であろう。いずれか適する緩衝液が用いられるが、４−
（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノプロパンス
ルホン酸が好ましい。

【００３６】各種の試薬を製造するための代表的な方法
が、下記具体例に詳細に示されている。核酸試薬が上述
の別の試薬と同様に都合良く調製されるが、より詳細に
は平均粒度０．０１〜１０mmのポリマー粒子を、少なく
とも１％固体、好ましくは５％〜２５％固体の懸濁液に
存在させる。本発明の利点は、サイトメガロウイルスＤ
ＮＡのアッセイでより高いシグナルを示す試薬を製造す
ることである。

【００３７】一般的には、核酸試薬の製造方法は、下記
工程を含んでなる。粒子を少なくとも１％固体で存在さ
せた平均粒度０．０５〜１０mmのスクシンイミド含有ポ
リマー粒子の水性懸濁液を、スクシンイミドオキシカル
ボニル活性基と反応する活性アミン基もしくはスルフヒ
ドリル基を担持するオリゴヌクレオチドと接触させて、
粒子とオリゴヌクレオチドとの間に共有結合を形成させ
る工程。

【００３８】オリゴヌクレオチドが必須の活性アミン基
もしくはスルフヒドリル基と担持しない場合には、既知
方法及び反応体を用いてそれらを付加してもよい。本発
明の分析もしくは診断方法では、反応体は、そこに存在
するレセプター分子に対するいずれかの特異的バインデ
ィングリガンドを検出するのに用いることができる。本
発明の試薬の生物学的活性物質は、リガンドもしくはそ
のレセプターのどちらかに特異的に活性でありうる。リ
ガンド検出は、溶液もしくはドライフォーム（下記）
で、水性流体（例えば、生物学的流体）の被検体又は組
織もしくは細胞の溶液を用いて実施され、定量的かつ定
性的でありうる。特に、本発明は動物、ヒトもしくは植
物の生物学的流体をアッセイするのに使用できるが、好
ましくは、ヒトの流体として、全血、血清、血漿、リン
パ液、胆汁、尿、脊髄液、痰、涙、汗、綿棒採取試料、
組織培養液、便分泌物、細胞液、膣分泌物及び精液が挙
げられる。また、ヒトもしくは動物の組織、例えば、骨
格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄もしくは皮膚の流体調
製物をアッセイすることができる。

【００３９】リガンドとしては、１つ以上の同一もしく
は異なるレセプター分子との複合部位を１つ以上有する
薬剤、ハプテン、ホルモン、抗原材料（多糖類もしくは
タンパク質）又は抗体が挙げられる。本発明のイムノア
ッセイでは、リガンドとして、薬剤（例えば、ジゴキシ
ン、フェニトイン及びカルバマゼピン）、ホルモン（例
えば、甲状腺刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン、黄体形成ホルモン及びチロキシン）、レトロウイル
ス成分もしくはレトロウイルスに対する抗体（例えば、
ＨＩＶ−Ｉ成分もしくはそれの抗体）、菌感染体もしく
はそれの成分又はそれらの抗体（例えば、ストレプトコ
ッカスＡ抗原、クラミジアもしくは淋菌の抗原又は抗
体）、ウイルスもしくはそれらの成分（例えば、肝炎ウ
イルス、サイトメガロウイルスもしくはヘルペスウイル
スの抗原）又はそれらの抗体、発癌性物質又はＣ−活性
タンパク質が挙げられる。また、リガンドとしてビオチ
ンもしくはその誘導体が、そしてレセプターとしてアビ
ジンもしくはその誘導体が挙げられる。

【００４０】別の態様では、リガンドが、核酸（一般的
には一本鎖状）であってもよく、その量もしくは存在
が、レセプター分子として相補的一本鎖核酸を用いて検
出される。核酸検出用の多種多様なアッセイフォーマッ
トが存在する。ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ、β−グロビンＤＮ
ＡもしくはサイトメガロウイルスＤＮＡの検出が、本発
明の実施に際して特に目的とするものである。

【００４１】リガンドは、抗原材料、ハプテンもしくは
薬剤が好ましい。レセプターは、上記抗原材料、ハプテ
ンもしくは薬剤に対する抗体が好ましい。前述のような
競合バインディングアッセイが使用され、それらは溶液
状態で実施できる。溶液アッセイとは、試薬及び目的の
リガンドを含有すると推測される被検体との懸濁液の状
態で、試薬が使用されるアッセイのことである。結合
（すなわち複合）もしくは未結合（すなわち未複合）材
料が上記アッセイで検出できる。所望であれば、結合及
び未結合材料の物理的分離が、いずれかの適当な分離方
法を用いて実施できる。分析要素（下記）を用いる場
合、垂直状もしくは平面上に分離できる。結合リガンド
は、光散乱法、比濁分析法、放射分析法もしくは分光光
度法を用いて検出できる。

【００４２】競合バインディングアッセイでは、一般的
に試薬は、ポリマー粒子上の免疫学的種（すなわち、レ
セプター）及び目的のリガンドの量により特定の濃度で
存在させる。また、リガンド類似体（検出できるように
標識されたリガンド）が、リガンド及び反応可能なレセ
プターの量が既知であるリガンド類似体との間で競合さ
せるために用いられる。一般的にはアッセイは、複合化
させるために、適当な容器中で試薬、リガンド類似体及
び被検体を物理的に接触並びに混合することにより実施
される。複合化並びに複合体の検出に必要とされるいず
れかの化学的もしくは生物学的反応（例えば色素生成）
を促進するために、インキュベーションが行われてもよ
い。

【００４３】より詳細には、上記リガンドが免疫学的種
である。リガンドとレセプターの反応は、水溶性（未複
合）材料が複合体より除去されれば（例えば、濾過もし
くは遠心）検出可能である免疫学的複合体を、形成す
る。これは、被検体中の種の存在もしくは不在を示す。

【００４４】また、本発明方法は、乾式分析要素を用い
て実施されうる。最も簡便な要素は、吸着剤、流体浸透
性支持体（例えば、自己支持吸着剤の薄いシート）もし
くは吸水性材料（例えば、フィルターペーパーもしくは
ペーパーストリップ）から構成されうる。この支持体
は、化学的、生物学的もしくは特異的バインディング反
応を生じさせるための反応区画を１つ以上担持する。本
発明の試薬は、それらの区画の少なくとも１つに配置さ
れる。別の任意の区画が、別の試薬類、例えば色素類、
色素提供化合物類、不純物除去剤類、抗酸化剤類、酵素
基質類もしくは緩衝剤類を含有できる。このような要素
は、試験ストリップ、分析要素、スライドもしくはディ
ップスティックとして当該技術分野で既知である。

【００４５】要素を製造するのに有用な吸着材料として
は、セルロース系材料（例えば、孔質ペーパー類）、孔
質ポリマーフィルム類、ガラスファイバーのマット類、
織物もしくは組織並びに当業者に既知である別の材料が
挙げられる。好ましい支持体は、孔質展開層である。

【００４６】好ましい要素は、そのすべての層が適当な
ポリマー、セルロース系もしくは金属性の材料から成る
非孔質流体非浸透性支持体（それは透明であっても透明
でなくてもよい）上に積み重ねられている、１つ以上の
積載された流体浸透性層を含む。それらの層は、反応区
画、下塗り区画、試薬区画、障壁区画及び輻射線遮断区
画並びに当該技術分野で周知の別の用途を初めとする各
種の目的に使用できる。所望であれば、試薬及び緩衝剤
はアッセイを実施する際に望まれる反応で層の間を移動
することができ、そして検出可能な生成物並びに結合及
び未結合材料の分離を提供する。

【００４７】本発明の試薬が使用の際に要素に組み入れ
られることが好ましいとはいえ、アッセイの際に被検体
と同時に試薬を要素に添加できるので、これは臨界的で
はない。好ましくは、しかしながらリガンド類似体及び
本発明の試薬（適当なレセプターを含有する）が、尚早
に複合しないように要素内の異なる区画に配置される。

【００４８】好ましくは、リガンド類似体が、酵素（例
えば下記のようなもの）で標識されており、リガンド
が、抗原材料、ホルモン、ハプテンもしくは薬剤であ
り、そしてレセプターが、対応する抗体もしくは免疫反
応体である。このような要素は、カルバマゼピン、チロ
キシン、フェノバルビタール、フェニトインもしくはジ
ゴキシンの検出に特に有用である。最も好ましくは、そ
れらはフェノバルビタール、フェニトインもしくはジゴ
キシンの検出に有用である。

【００４９】アッセイ方法によって、多種多様な要素が
本発明により製造されうる。それらはいずれか所望の幅
の延伸テープ類、シート類、スライド類もしくはチップ
類を包含する各種の形状に形成されうる。

【００５０】本発明の溶液もしくは乾式アッセイは、手
動又は自動化されうる。一般的には、乾式要素の使用に
際して、供給ロール、チップパケットもしくは他の供給
源から要素を取り、それを被検体の試料と物理的に接触
させることにより、分析的検出が行われる。この方法
は、要素内の被検体と試薬を１つ以上の試験区画で混合
させるものである。このような接触は、いずれか適する
方法、例えば、要素を試料中へ浸漬するか浸すことによ
り、又好ましくは適当な分配手段で要素に一滴の被検体
を滴下することにより達成できる。また、洗浄流体が、
アッセイに使用できる。

【００５１】アッセイ生成物は、一般的には可視的に又
は適当な検出装置を用いて要素中の検出可能な分光光度
の変化を観測することにより検出される。

【００５２】本発明の別の態様は、凝集アッセイであ
る。従って、リガンドが本発明の試薬と複合して検出可
能な粒子の凝集体もしくは凝集性を形成する。得られた
凝集体は、各種の方法、例えば、可視的又は適当な光散
乱検出装置を用いて検出できる。

【００５３】好ましくは、凝集アッセイが多様な方法で
検出可能に標識された本発明の試薬を用いて実施され
る。標識としては、粒子もしくはそれに結合させた生物
学的活性物質のラジオアイソトープ、又は粒子と組み合
わさった比色定量用色素もしくは蛍光測定用色素が挙げ
られる。最も好ましくは、色素が粒子の内部に存在す
る。これは、生物学的活性物質もしくはその複合体の結
合の干渉を防止する。このような粒子は、シェルコポリ
マーが色素を含まない場合には、コアポリマー内に色素
を担持するコア−シェル粒子でありうる。コアーシェル
ポリマー粒子では、シェルコポリマーが、必要な活性ス
クシンイミドオキシカルボニル基を担持する組成物を有
する。しかしながら、コアポリマーは、異なるものであ
ってもよく、活性基を有することを必要としない。

【００５４】本発明による免疫学的種は、抗原材料及び
それらの抗体であるレセプターでありうる。別の免疫学
的種としては、抗体及びそれらに特異的な抗原材料であ
るレセプターが挙げられる。

【００５５】本発明の試薬は、イムノメトリックアッセ
イに使用できる。このようなアッセイでは、レセプター
分子の１つが不溶性であるか不溶性になりうるものであ
り（例えば、アビジン−ビオチン結合を介するもの）そ
して他のものが水溶性であり適当に標識されている（例
えば、ラジオアイソトープ、酵素、化学発光部分もしく
は当該技術分野で既知の別のマーカーで標識）ような２
種以上のレセプター分子（同一もしくは異なる）と、目
的のリガンドが複合化される。例えば、ヒト絨毛性ゴナ
ドトロピンのようなリガンドについてのイムノメトリッ
クアッセイは、試薬の抗体とは異なるエピトープ部位で
複合するであろうゴナドトロピンに対する酵素標識抗体
と組み合わせて、ホルモンに対する抗体を有する本発明
の試薬を用いて実施できる。得られるサンドウイッチ複
合体は、不溶性で検出可能であり、そして未複合材料よ
り分離可能である（例えば、微細孔濾過膜を用いる）。
好ましい態様では、本発明の試薬が目的のリガンドに対
するレセプターを有し、そして膜に固定化されている。

【００５６】好ましくは、サンドウイッチアッセイで
は、本発明の試薬との水不溶性複合体の形成前に、もし
くは形成と同時に又は形成後に、目的のリガンドをそれ
らに対して特異的に活性である水不溶性特異的バインデ
ィング成分と反応させる。

【００５７】限定されるものではないが、本発明のサン
ドウイッチアッセイで検出可能な別のリガンドとして
は、ストレプトコッカス抗原、歯周疾患を伴う微生物よ
り抽出される抗原、肝炎抗原、ＨＩＶ−Ｉ及び別のレト
ロウイルス抗原が挙げられる。

【００５８】サンドウイッチアッセイでは、例えば、リ
ガンドが抗原であり、そして試薬がそれに対する抗体を
含んでなる場合には、本発明の試薬が目的のリガンドと
直接反応できる。あるいは、試薬がリガンドと間接的
に、すなわち中間連結部分を介して複合化される。

【００５９】本発明の別の態様は、標的核酸が相補的プ
ローブを用いて検出されるハイブリダイゼーションアッ
セイである。プローブの１つが適当に標識され、そして
もう一方が固定化されているかあるいは固定化されうる
ものである。本発明の試薬は、このようなアッセイで固
定化されたプローブとして使用できる。またこれらの試
薬は、ポリメラーゼチェーン反応増幅後に固定化された
プローブとして用いてもよい。増幅された核酸は、本発
明の試薬を用いてハイブリダイゼーションにより固定化
される。

【００６０】好ましいハイブリダイゼーションアッセイ
では、本発明の試薬で捕捉する前に、目的の核酸が適当
な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ類及び
プライマー類）を用いるポリメラーゼチェーン反応によ
って増幅される。ＨＩＶ−ＩＤＮＡ、サイトメガロウイ
ルスＤＮＡ及びβ−グロビンＤＮＡが、本発明による増
幅及び検出を用いて容易に検出される。ある態様では、
プライマーの１つがビオチニル化されており、そして増
幅された核酸の検出がアビジン及び酵素の結合体を用い
て達成される。ハイブリッド生成物が、膜のような微孔
質支持体もしくは自蔵式反応パウチの区画室を含む数タ
イプの支持体上に結合又は定着されていてもよい試薬を
用いて捕捉されうる。

【００６１】本発明の分析サンドウイッチ及びハイブリ
ダイゼーションアッセイは、複合もしくはハイブリッド
生成物が濾過、遠心もしくは別の手段により未複合材料
より捕捉又は分離されるように、適当な装置及び方法を
用いて実施されうる。好ましくは、このようなアッセイ
が、微孔質濾過膜を含む使い捨て試験デバイス（例え
ば、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．市販のもの及びＥａｓｔｍａ
ｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．よりＳｕｒｅＣｅｌｌ（商標）
試験デバイスとして市販のもの）を用いて実施されう
る。

【００６２】本発明の分析分離方法は、１つ以上の目的
の分析体を生物学的材料混合物より単離するのに使用で
きる。従って、一般的には本発明の試料（もしくは粒子
に結合した異なる支持体を有する数種の試薬）は、生物
学的材料の混合物を含む流体が注入されるカラムに配置
され、その試薬が単離したいものをそれら流体材料より
抽出する。これはアフィニティークロマトグラフィーで
既知の核酸類、酵素類、炭水化物類、タンパク質類、脂
質類、ビタミン類、ステロイド類、抗体類、ペプチド類
もしくはホルモン類の精製に有用であるであろう。

【００６３】また、アフィニティークロマトグラフィー
は、精製タンパク質からそれらの変性体を取り除くため
にタンパク質の濃厚及び希薄溶液に使用してもよく、そ
して特異的化学的変形に由来するタンパク質及びペプチ
ドの成分の分離並びに分割に使用してもよい。本方法の
別の用途は、核酸、例えばポリメラーゼチェーン反応増
幅によって得られるものの精製である。

【００６４】本発明の試薬は、単一材料としていずれか
所望の方法に適用してもよく、又は上述の分析要素に適
用してもよく、あるいは診断試験キットに別の試薬類、
試験デバイス類及び装置と組み合わせて適用してもよ
い。また、精製方法では、試薬がアフィニティークロマ
トグラフィーカラムに適用されていてもよい。

【００６５】ある精製方法の態様では被検体混合物中の
１つ以上の予め決められた生物学的活性物質が試薬によ
り捕捉される。原液の溶出液は廃棄され、捕捉された物
質は、その物質のバインディング特性を変化させてそれ
らを未複合状態にする溶剤を用いてカラムより取り除か
れる。このような溶剤としては、多様なpHの緩衝剤、複
合体のイオン性を変える塩溶液もしくは試薬に対して特
異的に結合して捕捉された物質を置換するであろう二次
反応種を含む溶液が挙げられる。

【００６６】あるいは、試薬により捕捉される予め決め
られた物質を廃棄して、原液の溶出液中に残存する別の
化学的もしくは生物学的材料が採集される。

【００６７】

【実施例】すべてのパーセンテージは、別に特定されな
い限り重量パーセントである。

【００６８】例１ 本発明のポリマービーズ上の抗フェノバルビタール抗体
の固定化並びに抗体活性の保持 下記コポリマービーズを評価した。 試料 組成物 １ ポリ（スチレン−コ−Ｎ−アクリロイルオキシス
クシンイミド)(モル比９６．８３／３．１７、重量比８
５／５） ２ ポリ（スチレン−コ−エチレンジメタクリレー
ト)(モル比９９／１）のコア並びにポリ（スチレン−コ
−ｍ−及びｐ−（６０／４０）−（２−クロロエチルス
ルホニルメチル）スチレン−コ−エチレンジメタクリレ
ート)(モル比９４．５／４．５／１）のシェルを担持す
るコア／シェルポリマー ３ ポリ（スチレン−コ−ｍ及びｐ（６０／４０）−
２−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン−
コ−メタクリル酸)(モル比８９．１４／４．１６／６．
３４）

【００６９】上記ビーズをすべて同一条件下で処理し
た。０．１モル緩衝液＃１〔Ｎ−（２−ヒドロキシエチ
ル）−ピペラジン−Ｎ′−（３−プロパン−スルホン
酸）〕、pH８．５、最終容量１．５mL中、抗フェノバル
ビタール抗体１．９ ０．３mg及びビーズ（乾燥重量）
３０mgを含むように反応分散系を調製して、試験管に入
れた。反応混合物を入れてあるふたをした試験管を室温
で４時間転倒回転した。その反応を１００mg／Ｌのウシ
血清アルブミン溶液０．３mLの添加により停止させた。
その試験管をさらに１６時間室温で転倒回転した。その
反応混合物を遠心にかけて上清を除去し、そしてそのビ
ーズをリン酸緩衝溶液、pH７．４ １mLに再懸濁した。
この工程をさらに３回繰り返した。最終再懸濁処理をリ
ン酸緩衝溶液１．８mLで行い、そしてマーシオレート
（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）を最終濃度０．０２％とな
るように添加した。

【００７０】同様の反応を ¹²⁵Ｉ−標識ウシガンマグロ
ブリンを用いて実施した。表面に吸着された抗体の総質
量を算定するために、これらの反応を実施した。下記の
ように分析を行った。反応混合物の０．１８mLに、次い
で更なるウシ血清アルブミン停止処理を行い、そして放
射能をモニターした。抗体ビーズの場合は、そのビーズ
を遠心にかけ、試料の上清０．１８mLを採取して放射能
をモニターした。上清の残りを除去してビーズをリン酸
緩衝溶液１mLに再懸濁した。そのビーズをもう一度遠心
し次いでそのビーズを１％ドデシル硫酸ナトリウム１mL
に再懸濁して放射能をモニターした。反応混合物の最初
の放射能に対する洗浄されたビーズの放射能の比は、標
識グロブリンの量を計算するのに使用し、それによって
ビーズ表面上に吸着された抗体の量を類推した。

【００７１】抗体ビーズ分散系の連続希釈系が、一定濃
度の２種の抗体（フェノバルビタール−酵素標識もしく
は ³Ｈフェノバルビタール）のうちの１種と混合される
アッセイで、製剤中の活性抗体の相対量を測定した。希
釈された抗体ビーズ分散系と酵素標識との間の反応を、
０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液中で
一定に攪拌しながら、室温で１時間インキュベーション
した。インキュベーションに続いて、そのビーズを心遠
し、そして試料の上清を除去して溶液に残存する抗体の
濃度を測定した。抗体の５０％を結合するのに必要とさ
れる抗体バインディング部位を計算した。結果を以下に
要約する。

【００７２】

【表１】

【００７３】これらの結果は、試料１のビーズ上に固定
化された抗体が、固定化された抗体の濃度がより低濃度
でより多くのフェノバルビタール酵素結合体もしくはフ
ェノバルビタール薬剤を結合することができることを示
し、また上記ビーズ上に固定化された抗体が、別のビー
ズ上に固定化された場合よりも多くの活性を保持するこ
とを示している。

【００７４】例２ 本発明のコポリマービーズ上への抗フェニトイン抗体の
固定化並びに活性の保持 下記コポリマービーズを評価した。 試料 組成物 １ モル比が９６．８３／３．１７ではなく８７．３
２／１２．６８である以外は例１、試料１と同様のポリ
マー ２ 例１、試料２と同様のポリマー ３ ポリ（スチレン−コ−ｍ−及びｐ−（６０／４
０）−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン
−コ−エチレンジメタクリレート)(モル比９４．５／
４．５／１） ４ ポリ（スチレン−コ−アクリル酸)(モル比９７．
５／２．５） ５ ポリ（スチレン−コ−ｍ−及びｐ−（６０／４
０）−（４−カルボキシブチリルオキシメチル）スチレ
ン)(モル比９７．８４／２．１６） ６ ポリ（スチレン−コ−４−カルボキシブチリルオ
キシエチルメタクリレート)(モル比９７．８４／２．１
６） ７ ポリ（スチレン−コ−４−カルボキシブチリルポ
リ（オキシエチレン）メタクリレート)(モル比９８．７
１／２．１９）

【００７５】抗体のリジン残基とコポリマー４〜７のカ
ルボン酸基との反応の活性剤は、１−（１−ピロリジニ
ルカルボニル）ピリジニウムクロリドであり、以下「活
性剤」と称する。

【００７６】上記ビーズをすべて同一条件下で処理し
た。反応分散系を、抗フェニトイン抗体０．３mg及び乾
燥ビーズ３０mgを含み、最終容量１．５mLとなるように
調製した。ビーズ１〜３については、０．１モル緩衝液
＃１、pH８．５を用いた。ビーズ４〜７については、
０．１モル２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸緩
衝液＃２を用いて、ビーズ１ｇ（０．０１５ミリモル）
当り活性剤０．５ミリモルを添加した。ビーズを担持す
る抗体を下記のように製造した。

【００７７】ビーズ３０mg（乾燥重量）を含むポリマー
粒子分散系のアリコートを２mLのマイクロ試験管に入れ
た。適当な緩衝液を加えて各試験管の容量を１．５mLに
調製した。そのビーズを１０分間１３，０００rpm で遠
心して上清を廃棄した。ビーズ１〜３を緩衝液＃１、
１．３９３mLに再懸濁した。ビーズ４〜７を緩衝液＃
２、１．０９３mLに再懸濁した。活性剤の溶液（緩衝液
＃２中、０．０５モルの溶液０．３mL）を試験管４〜７
に添加して、その試験管にフタをし、そして１０分間転
倒回転させた。抗フェニトイン抗体のアリコート（２．
８２mg／mLで０．１０７mL）を各試験管に添加してその
試験管にフタをし、そして４時間転倒回転した。

【００７８】その反応を１００mg／mLのウシ血清アルブ
ミン０．３mLの添加により停止させた。その試験管をさ
らに１６時間室温で転倒回転した。その反応混合物を遠
心にかけて上清を取り出して分析用に保存し、そしてビ
ーズをリン酸緩衝溶液１mLに再懸濁した。この工程を３
回繰り返した。最終再懸濁処理をリン酸緩衝溶液１．８
mLで行い、そしてマーシオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａ
ｔｅ）を最終濃度０．０２％となるように添加した。

【００７９】反応混合物由来の上清を、総抗体濃度につ
いてＥＬＩＳＡにより分析した。表面上に結合された抗
体量をこの結果より算出した。

【００８０】抗体ビーズ分散系の連続希釈系が、一定濃
度の下記３種の異なる抗原の中の１種と混合されるアッ
セイで、調製物中の活性抗体の相対量を測定した（３種
の異なる抗原：２種の異なるハプテン、（５，５−ジフ
ェニルヒダントイン−３−１−吉草酸（ハプテン＃１）
及び５−エチル−５−フェニルヒダントイン−３−１−
吉草酸（ハプテン＃２）を用いて調製されるハプテン−
酵素結合体類並びに ³Ｈ−フェニトイン）。希釈された
抗体ビーズ分散系と各種抗原との間の反応を、１．０％
ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液中で一定に攪
拌しながら室温で１時間インキュベーションした。遠心
後に溶液中に残存する酵素−標識もしくは ³Ｈフェニト
インの量を測定し、そして抗体の５０％を結合させるの
に必要とされるバインディング部位の理論値を算出し
た。結果を下記に示す。

【００８１】

【表２】

【００８２】これらの結果は、試料１のビーズ上に固定
化された抗フェニトイン抗体が、いずれか別のビーズ上
に固定化された抗体よりも低い固定化バインディング部
位の濃度で、ハプテン＃２をバインディングすることを
示している。これは、本発明のビーズ上に固定化された
場合の方が、別のビーズ上に固定化された場合よりも多
くのハプテン＃２バインディング部位を抗フェニトイン
抗体が保持することを示している。抗フェニトイン抗体
は、試料１のビーズ上に固定化された場合の方がビーズ
上のいずれかのカルボン酸基上に固定化された場合より
も抗原に対してより多くの活性を保持している。試料１
のビーズ上に固定化された場合のハプテン＃１及び ³Ｈ
−フェニトインに対する抗体活性は、クロロエチルスル
ホニル基を有する型のビーズ上に固定化された抗体の活
性と同様である。

【００８３】例３ 例１、試料１の粒子と ³Ｈ−ＢＧＧ（ウシガンマグロブ
リン）との反応 ポリマー１５mg（乾燥重量）を含む例１、試料１の固体
（９３μＬ、１２．６％）の一部分を、１０mg／mLの標
識（トリチウム化）ウシガンマグロブリン２７μＬ
（０．２７３mg）と混合して、マイクロ遠心管中最終容
量１．５mLとなるように緩衝液＃１、pH８．５を用いて
調製した。角度４５°に設定された回転台にその試験管
を取り付けて３０〜３５rpm で試験管を転倒回転させる
ことにより、室温で２４時間反応させた、例１、試料１
のもう一部分を、３７℃で反応を実施した外は上述のと
おりに処理した。

【００８４】上記反応時間の最後に、各反応を過剰のウ
シ血清アルブミン（１００mg／mLで２５０μＬ）の添加
により停止させ、さらに４時間回転させた。

【００８５】標識グロブリン結合の総量を、下記を測定
することにより測定した。ａ）反応混合物のアリコート
２５０μＬのｃｐｍ（１分間当りのカウント数）；ｂ）
反応混合物の試料１mLを１０分間、１４，０００rpm で
遠心後の上清のアリコート２５０μＬのｃｐｍ；並びに
ｃ)(ｂ）で得られたペレットを繰り返し洗浄した後のラ
テックスに結合した材料のｃｐｍ。ラテックスに共有結
合されたグロブリンのフラクションは、緩衝液＃１ ４
００mL及び１０％ドデシル硫酸ナトリウム１００mLの存
在下、３７℃で２０時間転倒回転させて反応させたラテ
ックス５００mLをインキュベーションした後、測定し
た。標識グロブリン結合の総量の検出について先に記載
された方法と同一の方法を用いて、共有結合生成量を測
定した。結果を表Ｉ及びIIに示す。

【００８６】

【表３】

【００８７】これらの反応の結果は、およそ等量の標識
グロブリンが、どちらの温度でも共有結合されることを
示している。

【００８８】

【発明の効果】本発明は、多種多様な分析、診断及び精
製方法に有用な試薬を提供するものである。本発明の利
点は、スクシンイミド基を担持する特定のコポリマー類
が、より容易かつ完全に水不溶性ラテックス粒子に組み
入れられ、それらを利用することによりタンパク質もし
くは別の生物学的化合物の結合をより容易に促進するこ
とである。更に、本発明に有用なコポリマー類は、下記
利点を有する。（１）水不溶性、（２）水中での膨潤耐
性、（３）生化学的固定化に対するコロイド安定性、
（４）界面活性剤不含有、（５）ポリマー保護コロイド
不含有、（６）非孔質、（７）未架橋、並びに（８）単
分散性。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザン ジーン ダニエルソン アメリカ合衆国，ニユーヨーク 14609， ロチエスター，ラクロワ コート ドライ ブ ９，アパートメント ケー (72)発明者 マーシヤ ベイル エニツク アメリカ合衆国，ニユーヨーク 14610， ロチエスター，サン ガブリエル ドライ ブ 44

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ｉ)(ａ）１種以上のエチレン系不飽和
   重合性親油性モノマー８０〜９９．９モルパーセント、 (ｂ）スクシンイミドオキシカルボニル基を担持する１
   種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー０．１〜２０
   モルパーセント、及び (ｃ）１種以上の別のエチレン系不飽和重合性モノマー
   ０〜１０モルパーセント、より誘導される繰り返し単位
   を有する未架橋コポリマーの水不溶性非孔質粒子、並び
   に （II）生物学的活性物質、を反応させる工程であって、 ここで（Ｉ）及び（II）が、上記スクシンイミドオキシ
   カルボニル基のスクシンイミドオキシ部分の置換により
   アミド基を介して共有結合される工程を含んでなる生物
   学的活性試薬の製造方法。
2. 【請求項２】 （Ｉ)(ａ）１種以上のエチレン系不飽和
   重合性親油性モノマー８０〜９９．９モルパーセント、 (ｂ）スクシンイミドオキシカルボニル基を担持する１
   種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー０．１〜２０
   モルパーセント、及び (ｃ）１種以上の別のエチレン系不飽和重合性モノマー
   ０〜１０モルパーセント、より誘導される繰り返し単位
   を有する未架橋コポリマーの水不溶性非孔質粒子、並び
   に （II）上記スクシンイミドオキシカルボニル基のスクシ
   ンイミドオキシ部分の置換によりアミド基を介して上記
   粒子に共有結合された生物学的活性物質、を含んでなる
   生物学的活性試薬を含有し、そして流体浸透性支持体を
   含んでなる分析要素。
3. 【請求項３】 Ａ（Ｉ)(ａ）１種以上のエチレン系不飽
   和重合性親油性モノマー８０〜９９．９モルパーセン
   ト、 (ｂ）スクシンイミドオキシカルボニル基を担持する１
   種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー０．１〜２０
   モルパーセント、及び (ｃ）１種以上の別のエチレン系不飽和重合性モノマー
   ０〜１０モルパーセント、より誘導される繰り返し単位
   を有する未架橋コポリマーの水不溶性非孔質粒子、並び
   に （II）上記イミドオキシカルボニル基のスクシンイミド
   オキシ部分の置換によりアミド基を介して上記粒子に共
   有結合された上記リガンド用レセプター、を含んでなる
   試薬と試料を接触させ、上記レセプターと上記リガンド
   の水不溶性特異的バインディング複合体を形成させる工
   程、並びに Ｂ．上記複合体の存在を検出する工程、を含んでなる特
   異的バインディングリガンドの検出方法。
4. 【請求項４】 Ａ．（Ｉ)(ａ）１種以上のエチレン系不
   飽和重合性親油性モノマー８０〜９９．９モルパーセン
   ト、 (ｂ）スクシンイミドオキシカルボニル基を担持する１
   種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー０．１〜２０
   モルパーセント、及び (ｃ）１種以上の別のエチレン系不飽和重合性モノマー
   ０〜１０モルパーセント、より誘導される繰り返し単位
   を有する未架橋コポリマーの水不溶性非孔質粒子、並び
   に （II）上記イミドオキシカルボニル基のスクシンイミド
   オキシ部分の置換によりアミド基を介して上記粒子に共
   有結合された特異的バインディング物質であって、上記
   特異的バインディング物質が、上記生物学的活性物質の
   被検体混合物中１つ以上の予め決めた生物学的活性物質
   に対して特異的である特異的バインディング物質、を含
   んでなるアフィニティークロマトグラフィー試薬に、生
   物学的活性物質の混合物を含有する被検体を通過させる
   工程、並びに Ｂ．上記試薬上の上記１つ以上の予め決めた生物学的活
   性物質を採集する工程、を含んでなる分析的精製方法。